JP5851391B2 - 抗体固定化担体、抗体固定化担体の製造方法および当該抗体固定化担体の利用 - Google Patents
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Description
本発明にかかる抗体固定化担体は、少なくとも重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、少なくとも軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、をそれぞれ別々に固定化した抗体固定化領域を独立して1以上備え、上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来であればよく、その他の具体的な構造、材料、形態等の構成は特に限定されるものではない。
本発明にかかる抗体固定化担体の製造方法は、重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体とを、それぞれ別々に担体に固定化して抗体固定化領域を作製する固定化工程を有し、上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来であればよく、その他の工程、条件、材料等については、従来公知のものを利用でき、特に限定されるものではない。また、より好適には、上記固定化工程は、上記抗体固定化領域を独立して2以上備えるように複数回行われるものであることが好ましい。本製造方法は、上記<1>欄で述べた抗体固定化担体を製造する方法と換言できるため、上記<1>欄の説明と重複する部分は上記説明を適宜援用できる。それゆえ、重複する説明は省略し、製造方法に特化した部分について説明する。
本発明にかかる抗体のスクリーニング方法は、上述した抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識する重鎖低分子抗体および/または軽鎖低分子抗体をスクリーニングする工程を有していればよく、その他の工程、条件、材料等については、従来公知のものを利用でき、特に限定されるものではない。本発明のスクリーニング方法によって選択された重鎖低分子抗体および/または軽鎖低分子抗体を再クローニングすることで完全長抗体を取得することができる。
(1)インクルージョンボディ可溶化用solubilization buffer(pH7.5)
6M 塩酸グアニジン、10mM 2−メルカプトエタノール、2×PBS
(2)Fab精製用Binding buffer(pH7.5)…A液
8M 尿素、20mM イミダゾール、2×PBS
(3)Fab精製用Elution Buffer(pH7.5)…B液
8M 尿素、400mM イミダゾール、2×PBS
(4)固相リフォールディング用親水性ポリスチレン担体(PSプレート)
組織培養用96ウェルマイクロプレート(AGC Technoglass #3861−096)。
(5)ELISA用発色液
ABTS(Invitrogen:#00−2001)100μlを0.1M クエン酸buffer(pH4.0)、0.03%H2Oで100倍希釈して使用した。
(6)Fab発現用ベクター:pET22 (Novagen)
(7)発現用宿主:大腸菌Rosetta(DE3)(Novagen)
<2.使用した抗体遺伝子の文献>
(1)抗RNase抗体
Katakura Y, Kobayashi E, Kurokawa Y, Omasa T, Fujiyama K, Suga K.
Cloning of cDNA and Characterization of Anti-RNase A Monoclonal Antibody 3A21
Journal of Fermentation and Bioengineering. 82, 312-314 (1996)
(2)抗CRP抗体
Dong Hwan Choi, Katakura Y, Ninomiya K, Shioya S.
Rational Screening of Antibodies and Design of Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay on the Basis of a Kinetic Model
Journal of Bioscience and Bioengineering.105, 261-272 (2008)
(3)抗ED−B抗体および抗IFNG抗体
Alessandro Pini, Francesca Viti, Annalisa Santucci, Barbara Carnemollai, Luciano Zardii, Paolo Neri, and Dario Neri
Design and Use of a Phage Display Library
The Journal of Biological Chemistry. 273, 21769−21776 (1998)
<3.低分子抗体(FabおよびPS−tag融合Fab)の調製>
上記文献はいずれもscFv遺伝子に関する文献である。このため、本実施例ではFab遺伝子についてはscFv遺伝子からVH,VLドメイン部分に相当する遺伝子をPCRで単離し、CH1ドメインおよびCkドメインの遺伝子と融合して調製した。実施例で使用したFabおよびPS−tag融合Fabのアミノ酸配列は以下の通りである。なお、使用したFabおよびPS−tag融合FabのN末端部は開始コドンであるメチオニン(M)とした。また、PS−tagなしの場合はC末端部にpET22由来の配列の末尾にヒスチジンタグ(H×6)を、またPS−tag有りの場合はpET22由来の配列の間にPS−tag配列を加え、C末端部分にヒスチジンタグ(H×6)を付加した。
・マウス抗RNase抗体由来のFab−H(Fab H)…配列番号1
・PS−tag融合マウス抗RNase抗体由来のFab−H(Fab H−PS)…配列番号2
・マウス抗RNase抗体由来のFab−L(Fab L)…配列番号3
・PS−tag融合マウス抗RNase由来のFab−L(Fab L−PS)…配列番号4
・PS−tag融合マウス抗CRP抗体由来のFab−H(Fab H−PS)…配列番号5
・PS−tag融合マウス抗CRP抗体由来のFab−L(Fab L−PS)…配列番号6
・PS−tag融合ヒト抗ED−B抗体由来のFab−H(Fab H−PS)…配列番号7
・PS−tag融合ヒト抗ED−B抗体由来のFab−L(Fab L−PS)…配列番号8
・PS−tag融合ヒト抗IFNG抗体由来のFab−H(Fab H−PS)…配列番号9
・PS−tag融合ヒト抗IFNG抗体由来のFab−L(Fab L−PS)…配列番号10
具体的な低分子抗体(FabおよびPS−tag融合Fab)の調製方法は以下の通りである。
まず、2×YT培地(Amp、Cm含有)10mlに組換え大腸菌を植菌し、37℃で一晩、前培養した。次いで、OvernightExpress培地(Novagen)(Amp、Cm含有)50mlに前培養液をOD600=0.1になるように加え、37℃、200rpmで24時間培養した。最後に、培養後、遠沈管に培養液を移して20分間遠心分離し、上清を取り除いた。なお、抗生物質Amp及びCmの濃度についてAmpは50μg/ml、Cmは34μg/mlになるよう培地に添加した。
まず、ペレット状の菌体にBugBuster(Novagen)2.5ml、リゾチーム1mg/ml、BenzonaseNuclease(Novagen) 2.0μl加えてvortexした。次いで、エッペンチューブに分注し、遠心分離した(4℃、20000×g、20分間)。次に、上清を除去し、蒸留水を800μl添加後、vortexして再び遠心分離した(4℃、20000×g、20分)。続いて、上清を除去後、インクルージョンボディを回収した。最後に、solubilizationbufferを5ml加え、インクルージョンボディを溶解した。
以下の手順で可溶化した低分子抗体を変性状態で精製した。まず、A液、B液を調製した。次に、クロマトグラフィーシステム(AKTA)を起動し、LineA、BにA液、B液をセットした。LineA、BをそれぞれA液、B液で置換し、His TrapTM HPカラム(GE HealthCare)を取り付けた。次いで、A液を流速1ml/minでカラムに供給し、カラム内を平衡化した。可溶化した低分子抗体を流速1ml/minで供給し、カラムに吸着させた。A液を流速1ml/minでカラムに供給し、洗浄した。続いて、B液を流速1ml/minでカラムに供給し、FabおよびPS−tag融合Fabを回収した。回収後、低分子抗体を8M尿素−1×PBSに対して一晩透析した。
まず、抗原(1mg/ml)を1×PBS 1Lに対して透析した。次に、ビオチンアミドカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを1mg量り取り、N,N−ジメチルホルムアミド 10μl加え、溶解させた(C溶液)。透析後の抗原をサンプル瓶に移し、C溶液を10μl加えて室温で1時間、ゆるやかに撹拌した。その後、1×PBS 1Lに対して一晩透析した。
マウス抗RNase抗体由来の低分子抗体を、親水性PSプレート上に固相リフォールディング法により固定化した。具体的には、まず低分子抗体Fab H、Fab H−PS (またはFab L、Fab L−PS)の終濃度が100μg/ml、尿素の終濃度が4M、Tween20の終濃度が1%となるように希釈し、室温で10分間インキュベートした。次いで、親水性PSプレートに100μl添加し、25℃で1時間インキュベートした。その後、0.1% PBSTで5回洗浄し、Fab Hを親水性PSプレート上でリフォールディングさせた。Fab L、Fab L−PSおよびFab H−PSに対しても上記と同様の操作を行い、それぞれ親水性PSプレート上に固定化させた。
・Fab Hを固定化した担体(H)
・Fab Lを固定化した担体(L)
・Fab H−PSを固定化した担体(H−PS)
・Fab L−PSを固定化した担体(L−PS)
・Fab H−PSを担体に固定化した後、Fab L−PSを固定化した担体(H−PS/L−PS)
・Fab L−PSを担体に固定化した後、Fab H−PSを固定化した担体(L−PS/H−PS)
これらの抗体固定化担体を用いて、それぞれの抗原結合活性をELISA法により調べた。具体的には、まず低分子抗体を固定化したPSプレートに2% BSA−PBSTを300μl添加し、25℃で1時間インキュベートした。次にPBSTで5回洗浄後、0.2% BSA−PBSTで0〜5μg/mlに希釈したビオチン化抗原(マウスRNase)を100μl添加し、25℃で1時間インキュベートした。次いでPBSTで5回洗浄後、0.2% BSA−PBSTで5000倍希釈したHRP標識ストレプトアビジンを100μl添加し、25℃で1時間インキュベートした。最後にPBSTで5回洗浄後、発色液を100μl加えて25℃で30分間インキュベートし吸光度を測定した。結果を図2に示す。同図に示すように、L−PS/H−PSのみ抗原結合活性が得られた。
マウス抗RNase抗体由来の低分子抗体を親水性PSプレートに固定化する際の固相リフォールディング条件を検討した。具体的な方法は、低分子抗体(Fab H,Fab H−PS,Fab LまたはFab L−PS)の終濃度を5μg/mlとし、尿素の終濃度を4M、2M、1M、0.5Mとした以外は、上記<5>と同じ方法で親水性PSプレート上に固定化した。低分子抗体の組み合わせを変えて、操作を繰り返し、以下の5種類の抗体固定化担体を作製した。
・Fab Hを固定化した後、Fab L−PSを固定化した担体(H+L−PS)
・Fab L−PSを担体に固定化した後、FabHを固定化した担体(L−PS+H)
・Fab Lを担体に固定化した後、FabH−PSを固定化した担体(L+H−PS)
・Fab H−PSを担体に固定化した後、FabL−PSを固定化した担体(H−PS+L−PS)
・Fab L−PSを担体に固定化した後、FabH−PSを固定化した担体(L−PS+H−PS)
これらの抗体固定化担体を用いて、それぞれの抗原結合活性をELISA法により調べた。ELISA法は、用いたビオチン化抗原(マウスRNase)の濃度を1μg/mlとした以外は、上記<5>と同じ方法で行った。結果を図3に示す。
マウス抗CRP抗体、マウス抗RNase抗体、ヒト抗IFNG抗体およびヒト抗ED−B抗体由来の、Fab H−PS、Fab L−PSをそれぞれ単独または組み合わせて固定化した担体を作製した。まず各種Fab L−PSを親水性PSプレートに固定化した後、各種Fab H−PSを固定化した。固定化の方法は、各種Fab L−PS,Fab H−PSの終濃度を5μg/mlとし、尿素の終濃度を2Mとした以外は、上記<5>,<6>と同様の操作で行った。各種Fab L−PS,Fab H−PSの組み合わせを変えて操作を繰り返し、最終的に各種Fab L−PS,Fab H−PSの全ての組み合わせた16種類の抗体固定化担体と、各種Fab L−PSまたはFab H−PSのみを固定化した抗体固定化担体8種類を作製した。
マウス抗RNase抗体由来の、Fab H、Fab L、FabH−PS、Fab L−PSをそれぞれ単独または組み合わせて固定化した担体を作製するに際して、固定化方法の違いによる抗原結合活性の違いを検討した。具体的には、(i) 重鎖低分子抗体または軽鎖低分子抗体をそれぞれ単独で固定化した場合、(ii) 重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体を混合した状態で同時に固定化した場合、(iii) 重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体について逐次的に多段階で固定化した場合で比較した。具体的な方法は以下の通り。
まずFab H、Fab H−PS、Fab LまたはFab L−PSのいずれかについて、終濃度が200μg/ml、尿素の終濃度が4M、Tween20の終濃度が1%となるように希釈し、室温で10分間インキュベートした。次いで、親水性PSプレートに100μl添加し、25℃で1時間インキュベートした。その後、PBSTで5回洗浄し、Fab H、Fab H−PS、Fab LまたはFab L−PSのいずれかを親水性PSプレート上でリフォールディングさせた。抗原結合活性の結果を図8(a)に示す。
まずFab HまたはFab H−PSと、Fab LまたはFab L−PSとの組み合わせについて、それぞれの低分子抗体の終濃度が200μg/mlとし(組み合わせの合計で400μg/ml)、尿素の終濃度が4M、Tween20の終濃度が1%となるように希釈し、室温で10分間インキュベートした。次いで、親水性PSプレートに100μl添加し、25℃で1時間インキュベートした。その後、PBSTで5回洗浄し、低分子抗体の組み合わせを親水性PSプレート上でリフォールディングさせた。抗原結合活性の結果を図8(b)に示す。
低分子化抗体の終濃度を200μg/mlとした以外は、上記<5>と同様の操作にて固定化した。抗原結合活性の結果を図8(c)に示す。
まず、1次スクリーニングとして、抗原に親和性の重鎖(H鎖)および軽鎖(L鎖)のスクリーニングを行った。具体的な手順は、以下の通りである。
抗原として、肝がんの診断マーカーであるαフェトプロテイン(AFP)を用いた。AFP50μgをマウスに1週間おきに4回免疫し、5週目に脾臓を摘出した。脾臓中のTotal RNAを回収し、RT−PCRで抗体のFab HおよびFab L遺伝子群を増幅させた。Fab HおよびFab L遺伝子群をPS−tag融合タンパク質発現ベクターpET−PS19−6のNde I/Not Iサイトにライゲーションした。ライゲーション後のベクターで大腸菌BL21(DE3)Rosettaを形質転換し、LB−アンピシリンプレート上でシングルコロニー化させた。Fab H遺伝子群を導入した大腸菌をFab H−PS大腸菌ライブラリ(1×105コロニー)、FabL遺伝子群を導入した大腸菌をFab L−PS大腸菌ライブラリ(1×105コロニー)とした。
まず、96ウェルディープウェルプレート(グライナー社製、780271)の各ウェルに50μg/mlアンピシリンおよび34μg/mlクロラムフェニコールを含むOvernightExpress TB培地(メルク)を1ml加えた。これらを20プレート分用意した。次に、LB−アンピシリンプレート上でシングルコロニー化したFabH−PS大腸菌ライブラリからシングルコロニーを採取し、上述のディープウェルプレートの各ウェルに植菌した。次いで、Fab L−PS大腸菌ライブラリからも同様にシングルコロニーを植菌した。具体的には、Fab H−PS大腸菌ライブラリ、Fab L−PS大腸菌ライブラリそれぞれ10プレート(960コロニー)ずつ植菌した。その後、ディープウェルプレートを37℃、1,400rpmで24時間培養した。
ディープウェルプレートを5000rpm、20min遠心分離を行い、上清を除去した。次に、菌体破砕液(Bugbuster20ml,Lysozyme 20mg,benzonaze 6μl)を各ウェルに200μlずつ添加し、1800rpm、37℃で1時間振盪させた。次いで、5000rpm、20min遠心分離後、上清を除去し、イオン交換水を各ウェルに200μlずつ添加し、懸濁させた。この操作を2回繰り返した。その後、5000rpm、20min遠心分離した後、可溶化液(8M Urea PBS 50ml,メルカプトエタノール35μl)を各ウェルに500μlずつ加え、25℃、14000rpmで1時間振盪させた。続いて、5000rpm、20min遠心分離を行い、上清に含まれるFab H−PSおよびFab L−PSを以下のとおり精製した。
96ウェルフィルタープレート(ワットマン)に50%Ni Sepharose 4B(GE HealthCare)レジンを200μl/wellずつ添加した。400μl次いで、200μlのBindingBuffer 1(8M尿素−2×PBS、20μMイミダゾール)で平衡化した。各wellにディープウェルプレートから500μlのサンプルをフィルタープレートに添加した。ピペッティングで穏やかにレジンとサンプルを混和し、20分間インキュベートした。サンプル溶液をアスピレーターで吸引して除去し、400μlのBindingBuffer 1で1回、さらに200μlのBinding Buffer 1で2回洗浄した。さらに、200μlのBindingBuffer 2(8M尿素−1×PBS、20μMイミダゾール)で洗浄し、アスピレーターで溶液を除去した。
スクリーニング用96ウェルPS plateとして蛍光測定用Blackplate (BD Falcon#353241)を用いた。PS plateに30Wで1分間酸素プラズマを照射し、PS plateの表面を親水化した。1.33%Tween PBSを75μlずつ添加後、FabH−PSライブラリまたはマウスH鎖ライブラリを25μlずつ各ウェルに添加した。これを4℃で一晩インキュベートした。次いで、0.1%TweenPBSにて洗浄後、2%BSA−0.1%Tween PBSを各ウェルに270μl添加し、1時間ブロッキングした。次に、0.1%Tween PBSにて洗浄後、0.2%BSA−0.1%Tween PBSを用いて1μg/mlのAlexaFluor647標識AFPを作製し、各ウェルに100μlずつ添加後、遮光して1時間インキュベートした。0.1%Tween PBSにて洗浄後、蛍光プレートリーダー(TECAN infinite M200)を用いて蛍光強度を測定した(励起波長:645nm、蛍光波長:678nm)。
上記で選択したFab H−PSクローンを40種類、Fab L−PSクローンを30種類用いて、基板上に1200種類(H鎖:40種×L鎖:30種)の抗体ライブラリを作製し、抗原結合性を評価した(2次スクリーニング)。具体的な手順は以下の通りである。
In Vitro Domain Shuffling技術を用いて、キメラ抗体と同等かそれ以上の抗原特異性を有する完全ヒト抗体を取得することを目的として、以下の実験を行った。
ヒト脾臓Total RNA (クロンテック, #636525)から、RT-PCRでヒト抗体のFab HおよびFab L遺伝子群を増幅した。FabHおよびFab L遺伝子群をPS−tag融合タンパク質発現ベクターpET−PS19−6のNdeI/Not Iサイトにライゲーションした。ライゲーション後のベクターで大腸菌BL21(DE3)Rosettaを形質転換し、LB−アンピシリンプレート上でシングルコロニー化させた。Fab H遺伝子群を導入した大腸菌をFab H−PS大腸菌ライブラリ(1×106コロニー)、FabL遺伝子群を導入した大腸菌をFab L−PS大腸菌ライブラリ(1×106コロニー)とした。
96ウェルディープウェルプレート(グライナー社製、780271)の各ウェルに50μg/mlアンピシリンおよび34μg/mlクロラムフェニコールを含むOvernightExpress TB培地(メルク)を1ml加えた。これらを20プレート分用意した。LB−アンピシリンプレート上でシングルコロニー化したFabH−PS大腸菌ライブラリからシングルコロニーを採取し、上述のディープウェルプレートの各ウェルに植菌した。Fab L−PS大腸菌ライブラリからも同様にシングルコロニーを植菌した。(Fab H−PS大腸菌ライブラリ、FabL−PS大腸菌ライブラリそれぞれ10プレート(960コロニー)ずつ)。ディープウェルプレートを37℃、1,400rpmで24時間培養した。
ディープウェルプレートを5000rpm、20min遠心分離を行い、上清を除去した。次いで、菌体破砕液(Bugbuster 20ml、Lysozyme 20mg、 benzonaze 6μl)を各ウェルに200μlずつ添加し、1800rpm、37℃で1時間振盪させた。5000rpm、20min遠心分離後、上清を除去し、イオン交換水を各ウェルに200μlずつ添加し、懸濁させた。この操作を2回繰り返した。続いて、5000rpm、20min遠心分離後、可溶化液(8M Urea PBS 50ml、メルカプトエタノール 35μl)を各ウェルに500μlずつ加え、25℃、14000rpmで1時間振盪させた。次に、5000rpm、20min遠心分離を行い、上清に含まれるFab H−PSおよびFab L−PSを以下のとおり精製した。
96ウェルフィルタープレート(ワットマン)に50%Ni Sepharose 4B(GE HealthCare)レジンを200μl/wellずつ添加した。400μl次いで200μlのBindingBuffer 1(8M尿素−2xPBS、20μMイミダゾール)で平衡化した。各wellにディープウェルプレートから500μlのサンプルをフィルタープレートに添加した。ピペッティングで穏やかにレジンとサンプルを混和し、20分間インキュベートした。その後、サンプル溶液をアスピレーターで吸引して除去し、400μlのBindingBuffer 1で1回、さらに200μlのBinding Bufferで2回洗浄した。次に、200μlのBinding Buffer 2(8M尿素−1×PBS、20μMイミダゾール)で洗浄し、アスピレーターで溶液を除去した。
既に上市されているリツキサン(登録商標)をモデル抗体として、キメラ抗体と同等かそれ以上の抗原特異性を有する完全ヒト抗体の取得を試みた。なお、リツキサン(登録商標)は、CD20を標的とし、細胞性リンパ腫に適用される抗体医薬である。なお、抗原であるCD20抗原は、エピトープ部分が既に公開されている。このため、当該エピトープペプチドのみを固相合成法にて合成し、N末端部分にFITCを付加した蛍光標識エピトープペプチドを作製し、抗原として用いた。具体的な手順は以下の通りである。
上記選択したL鎖95クローンについて、キメラ抗体のH鎖との組み合わせ並びに単独の比活性を評価した。
次に、キメラ抗体のL鎖とヒトのH鎖ライブラリ(960種類)とを掛けあわせて、好適なヒトH鎖をスクリーニングした。
上記選択したH鎖94クローンについて、キメラ抗体のL鎖との組み合わせ並びに単独の比活性を評価した。
次に、上記(5)〜(8)において選別したヒトFab L−PSおよびヒトFab H−PSの中から抗原への結合能が高いクローンを、ヒトFab L−PS 5種類(クローンNo.1,2,3,11,12)、ヒトFab H−PS 8種類(クローンNo.1,2,3,4,11,32,48,85,91)を選択し、組み合わせた場合の抗原結合力を評価した。コントロールとして、リツキサン(登録商標)キメラFabL−PSおよびキメラFab H−PSも用いた。なお、ここで示すヒトFab L−PSのクローンNo.は、図11,図12に示すものと同一であり、またヒトFab H−PSのクローンNo.は図13,図14に示すものと同一である。具体的な手順は以下の通りである。
本実験では、上記(5)〜(8)において選別したヒトFab H−PSの中から抗原への結合能が高いクローンとして、ヒトFab H−PS 5種類(クローンNo.1,2,3,4,11)を選び、これらに対し、In Vitro Domain Shufflingを用いてヒトFab L−PSライブラリ960クローンを掛けあわせ、抗原に対する親和力を評価した。具体的な手順は以下の通りである。
同様に、上記(5)〜(8)において、高いシグナル強度が検出された上位5クローン(ヒトFab L−PS 5種類(クローンNo.1,2,3,11,12)に対し、In Vitro Domain Shufflingを用いてヒトFab H−PSライブラリ960クローンを掛けあわせ、抗原に対する親和力を評価した。具体的な手順は以下の通りである。
Claims (18)
- 重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、をそれぞれ別々に固定化した抗体固定化領域を独立して1以上備え、
上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来であり、
上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、1組のペアとして抗原と反応し得るよう固定化されており、
上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体は、C末端側が担体表面に対して結合するように固定化されたものであることを特徴とする抗体固定化担体。(ただし、上記重鎖低分子抗体は軽鎖の可変領域を含まない。また、上記軽鎖低分子抗体は重鎖の可変領域を含まない。) - 上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体は、それぞれ別々に担体表面の材料と結合する担体結合性ペプチドを介して担体に固定化されており、
上記担体結合性ペプチドは、重鎖低分子抗体において重鎖の可変領域のC末端側に、また軽鎖低分子抗体において軽鎖の可変領域のC末端側にそれぞれ配置されているものであることを特徴とする請求項1に記載の抗体固定化担体。 - 上記担体表面の材料は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサンまたはポリメタクリル酸メチルのプラスチック樹脂を変質させて親水化処理したものであることを特徴とする請求項2に記載の抗体固定化担体。
- 上記担体結合性ペプチドは、親水性のポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサンまたはポリメタクリル酸メチルに結合するペプチドであることを特徴とする請求項2または3に記載の抗体固定化担体。
- 上記重鎖低分子抗体は、重鎖の可変領域からなる重鎖低分子抗体、または重鎖の可変領域と重鎖第1定常領域とからなる重鎖低分子抗体であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体固定化担体。
- 上記軽鎖低分子抗体は、軽鎖の可変領域からなる軽鎖低分子抗体、または軽鎖の可変領域と軽鎖定常領域とからなる軽鎖低分子抗体であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体固定化担体。
- 重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体とを、それぞれ別々に担体に固定化して抗体固定化領域を作製する固定化工程を有し、
上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来であり、
上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、1組のペアとして抗原と反応し得るよう固定化され、
上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体は、C末端側が担体表面に対して結合するように固定化されることを特徴とする抗体固定化担体の製造方法。(ただし、上記重鎖低分子抗体は軽鎖の可変領域を含まない。また、上記軽鎖低分子抗体は重鎖の可変領域を含まない。) - 上記固定化工程は、上記抗体固定化領域を独立して2以上備えるように複数回行われるものであることを特徴とする請求項7に記載の抗体固定化担体の製造方法。
- 上記固定化工程は、
(a)上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体の不溶性凝集体をそれぞれ変性剤にて変性させた状態で担体表面に接触させ、担体に固定化する第1の工程と、
(b)上記固定化された変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体から変性剤を除去することにより、変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体をリフォールディングさせる第2の工程と、を有することを特徴とする請求項7または8に記載の抗体固定化担体の製造方法。 - 上記固定化工程における第1の工程および第2の工程は、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とについて別々に行われることを特徴とする請求項9に記載の抗体固定化担体の製造方法。
- 上記固定化工程は、軽鎖低分子抗体について第1の工程および第2の工程が行われた後、重鎖低分子抗体について第1の工程および第2の工程が行われることを特徴とする請求項10に記載の抗体固定化担体の製造方法。
- 上記第1の工程は、変性剤として0.5M〜4Mの尿素を用いることを特徴とする請求項9〜11のいずれか1項に記載の抗体固定化担体の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識する重鎖低分子抗体および/または軽鎖低分子抗体をスクリーニングする工程を有することを特徴とする抗体のスクリーニング方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体をスクリーニングする方法であって、
上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、
上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、
上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程(i)と、
上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固定化領域を検出する工程(ii)と、
上記工程(ii)において、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程(iii)と、
を有することを特徴とするスクリーニング方法。 - さらに、上記工程(iii)で候補として決定した軽鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、
上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程(iv)と、
上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固定化領域を検出する工程(v)と、
上記工程(v)において、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖の可変領域の候補として決定する工程(vi)と、
を有することを特徴とする請求項14に記載のスクリーニング方法。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体をスクリーニングする方法であって、
上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、
上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、
上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程(i)と、
上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固定化領域を検出する工程(ii)と、
上記工程(ii)において、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖領域の候補として決定する工程(iii)と、
を有することを特徴とするスクリーニング方法。 - さらに、上記工程(iii)で決定した重鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、
上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程(iv)と、
上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固定化領域を検出する工程(v)と、
上記工程(v)において、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程(vi)と、
を有することを特徴とする請求項16に記載のスクリーニング方法。 - 請求項14〜17のいずれか1項に記載のスクリーニング方法により、決定されたヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補と重鎖の可変領域の候補とを組み合わせて、ヒト抗体を製造する工程を有することを特徴とするヒト抗体の製造方法。
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