CN112940121B - 一种pd-l1抗体及其提取方法 - Google Patents

Abstract

一种PD‑L1抗体及其提取方法，涉及一种抗体及其提取方法。本发明PD‑L1抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PD‑L1抗体的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示；本发明提取方法为：采用人PD‑L1(程序性死亡配体1)全长蛋白为抗原对鲨鱼进行免疫，然后提取RNA，并采用逆转录试剂盒反转录为cDNA，PCR法扩增获得vNAR区编码基因，再经过筛选、表达和纯化得到PD‑L1抗体。本发明的PD‑L1分子量小，只有15KD，结构简单，抗体灵敏度达到1ng，极大提高了检测能力，而线性范围提高到1到300ng，很好的提高了适应检测能力范围，信号值大幅提高，从500多提高到2000多，本发明方法所得到的PD‑L1抗体(鲨鱼抗体)改进了传统抗体的检测能力，增加了检测的准确度。

Description

一种PD-L1抗体及其提取方法

技术领域

本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，尤其涉及一种抗体及其提取方法。

背景技术

抗体是结合抗原的受体，是指机体在抗原性物质的刺激下所产生的一种免疫球蛋白，它能与相应抗原发生特异性结合。抗体结构由两条重链(H链)与两条轻链(L链)构成(重链与轻链之间通过二硫键相连接)，每条链又可分为可变区(V区)与恒定区(C区)，其中可变区有三个区域的氨基酸组成和排列顺序高度可变，称为高变区(HVR)，由于高变区在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，因而高变区又称为互补决定区(CDR)，不同重链轻链的CDR组合决定了抗体对抗原的特异性。由于发现时间较早，这类抗体被称为传统抗体，来源包括鼠、兔、人以及其他物种。

传统抗体分子量较大，是150KD左右，它可以与细菌、病毒或毒素等异源性物质结合而发挥预防和治疗疾病的作用。作为一种及其重要的原材料，传统抗体在科研、医疗、农业、环境、食品、民用等诸多领域应用广泛，具有不可替代的科学以及经济价值。

以传统抗体在医疗领域中药物应用为例，近年来，抗体药物以其高特异性成为全球药品市场上炙手可热的药品，它是生物制药产业中最大类别的产品，如今已被成功用于治疗肿瘤、癌症等多种疾病领域。尤其是PD-L抗体，近年来在治疗肿瘤领域大放异彩。

再以传统抗体在医疗领域中体外诊断应用为例，体外诊断仅耗费了3％的医疗资源，但是提供了临床诊断超过70％的信息，被称为医生的“眼睛”。抗体是最重要的体外诊断原料之一，广泛用于酶联免疫分析、化学发光免疫分析、胶体金侧向层析、荧光免疫侧向层析等检测平台。PD-L1抗体在诊断领域也有很好的应用。

但是目前传统抗体为基础的PD-L1检测存在两个不足，首先其灵敏度仅为50ng左右，其次其线性范围比较窄，在50到200ng之间，目前的PD-L1抗体检测能力有限。

发明内容

本发明提供了一种PD-L1抗体及其提取方法。

本发明PD-L1抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PD-L1抗体的氨基酸序列SEQID NO.2所示。

上述PD-L1抗体的提取方法按照以下步骤进行：采用人PD-L1(程序性死亡配体1)全长蛋白为抗原对鲨鱼进行免疫，然后提取RNA，并采用逆转录试剂盒反转录为cDNA，PCR法扩增获得vNAR区编码基因，再经过筛选、表达和纯化得到PD-L1抗体。

本发明的PD-L1抗体用人PD-L1(程序性死亡配体1)全长蛋白作为目的抗原，利用条纹斑竹鲨噬菌体抗体库进行抗人PD-L1(程序性死亡配体1)蛋白的抗体筛选，成功获得PD-L1抗体。本发明的PD-L1分子量小，只有15KD，结构简单，抗体灵敏度达到1ng,极大提高了检测能力，而线性范围提高到1到300ng，很好的提高了适应检测能力范围，信号值大幅提高，从500多提高到2000多，本发明的PD-L1抗体(鲨鱼抗体)改进了传统抗体的检测能力，增加了检测的准确度。本发明的PD-L1抗体可以应用在抗体的酶联免疫(ELISA)的检测方法和抗体的免疫印迹(Western blot)的检测方法，以及抗体开发的治疗性、诊断性、检测性的应用。

附图说明

图1为鲨抗PD-L1抗体表达考染检测结果；

图2为鼠抗和鲨抗Western Blot比较检测结果图；

图3为不同组别鲨抗Western Blot检测结果图；

图4为本发明PD-L1抗体(鲨抗)与鼠抗(鼠的PD-L1抗体)比较结果图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式PD-L1抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PD-L1抗体的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。

具体实施方式二：本实施方式PD-L1抗体的提取方法按照以下步骤进行：采用人PD-L1(程序性死亡配体1)全长蛋白为抗原对鲨鱼进行免疫，然后提取RNA，并采用逆转录试剂盒反转录为cDNA，PCR法扩增获得vNAR区编码基因，再经过筛选、表达和纯化得到PD-L1抗体。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：PCR建库上游引物是：TCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCAACTTGAACAAACGGGCACC，建库下游引物是：

TGATGGTGCTGGCCGGCCTGGCCTTCATGGGTCAGAATCATGC。其他步骤及参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是PCR扩增反应条件：95℃2分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟，35个循环，72℃10分钟。其他步骤及参数与具体实施方式二相同。

实施例1 PD-L1抗体的提取方法按照以下步骤进行：

一、PD-L1抗原免疫鲨鱼：选择条纹斑竹鲨作为免疫对象，采用人PD-L1(程序性死亡配体1)全长蛋白为抗原对鲨鱼进行5次免疫，每次免疫间隔14天；完成免疫后，采集鲨鱼外周血淋巴细胞，通过TRIZOL法提取RNA，并采用逆转录试剂盒反转录为cDNA；根据条纹斑竹鲨vNAR保守序列设计引物，引物两端带有克隆进pComb3xss载体的SfiI酶切位点，PCR法扩增获得vNAR区编码基因，其中，建库上游引物(SEQ ID NO:3)：TCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCAACTTGAACAAACGGGCACC，建库下游引物(SEQ ID NO:4)：

TGATGGTGCTGGCCGGCCTGGCCTTCATGGGTCAGAATCATGC，PCR扩增反应条件：95℃2分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，28个循环，72℃10分钟。将构建好的pComb3xss质粒转化入大肠杆菌，在辅助噬菌体VCSM13系统扩增、包装下，将PD-L1抗体蛋白片段展示在噬菌体的表面，成为单域重链抗体库。

二、PD-L1抗体的筛选、富集

1)、VCSM噬菌体滴度测定

1、单菌落XL1-Blue(大肠杆菌菌株)接种于2×YT/Tet(15μg/ml)培养基，37℃过夜；

2、以1:100比例重新接种于新鲜2×YT培养基，37℃至OD600＝0.8；

3、将步骤一中的噬菌体(噬菌体储液)进行一系列10倍梯度稀释，溶于0.1ml分装的2×YT培养基中，每个梯度两份，以得到一个每毫升10³-10⁵噬菌体的浓度；

4、将2×YT上层琼脂融化，每份噬菌体稀释液至少3ml，冷却至50℃；

5、将10μl噬菌体液与500μl新鲜XL1-Blue细胞在一个10ml的培养试管中，孵育30分钟之后加入3ml上层琼脂，迅速混匀，立即将上层琼脂混合物倒至LB琼脂平板上，摇晃平板，让上层琼脂铺开，防止上层琼脂凝固，37℃静置过夜；

6、噬菌斑的数目乘以100乘以相应的稀释倍数，等于原始储液中的噬菌体的滴度。

2)、VCSM13的扩增

1、用枪头从过夜培养的平板上挑取一个单噬菌斑，在1ml新鲜XL1-Blue细胞中吹洗，37℃振荡培养1小时；

2、吸取100μl培养物在50μg/ml四环素的2×YT 50ml中，37℃振荡培养24小时；

3、将培养物转移到无菌管里，12000rpm，4℃，10分钟，上清液转移到新管中，1/5体积比例的40％PEG/NaCl溶液，强烈震动，冰浴15分钟；

4、14000rpm，4℃15分钟，尽量去除上清，用1/20体积的1×TE缓冲液重悬沉淀，15000rpm 4℃5分钟，上清转移到无菌管中，OD＝1.0对应每毫升5×10¹²个噬菌体。

3)、PD-L1初级抗体库的大量扩增

1、单菌落XL1-Blue，接种于2×YT/Tet(15μg/ml)培养基，37℃过夜；

2、以1:100比例重新接种于新鲜2×YT培养基，37℃至OD600＝0.4～0.5；

3、用10¹⁰-10¹¹数量级的噬菌体侵染50ml的XL1-Blue，37℃静置40分钟；

4、取100μl细胞悬液，在2×YT培养基里做10倍梯度稀释，取10μl的各稀释度的细胞液于LB-氨苄平板上涂布，30℃过夜；

5.剩下的培养物37℃继续培养1小时，然后加入500ml 2×YT培养基，37℃继续培养1小时；

6、用20倍的VCSM13(10¹³)100μL进行侵染，37℃静置40分钟；

7、6000rpm，室温15分钟，沉淀重新悬浮于1000ml 2×YT^AMP+KAN+GLU+，30℃，150rpm摇荡培养过夜；

8、将上清转移到无菌管里，14000rpm，4℃，10分钟，上清液转移到新管中，按照每400μl上清液加入100ul 40％PEG/NaCl溶液，强烈震动，冰浴15分钟；

9、14000rpm，4℃，15分钟，去掉上清，用4ml 1×TE缓冲液溶解，滴度为10⁷pfu/ul。

4)、PD-L1抗体的第一轮筛选、富集

1、称取前述制备的免疫原人PD-L1全蛋白30ug，溶于2ml的PBS溶液(pH＝7.2)中，加入容量为5ml的Nunc-ImmunoTM MaxisorpTM免疫试管中，4℃过夜；

2、Tris-HCl封闭免疫试管的未饱和的蛋白偶联位点。先用偶联液清洗免疫试管3次，尽量去除上清，加入4ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，室温静置2小时，以封闭活性位点；

3、BSA封闭潜在蛋白结合位点。4ml 3％BSA放入免疫试管中，室温缓慢摇动2小时，PBS清洗3次；

4、1ml噬菌体抗体库液，总共1010个噬菌体加入免疫试管，室温下，混合器缓慢摇晃30分钟，然后室温静置90分钟，PBST清洗免疫试管10次，PBS清洗免疫试管10次，甩干；

5、噬菌体洗脱。免疫试管中加入600μl的10mM HCl，缓慢摇晃，室温30分钟，然后加入100μl 0.1M Tris-HCl将pH调至7.5，加入2ml新鲜的OD＝7.0的XL1-Blue菌液，37℃静置50分钟，转移到50ml离心管中，加入5ml 2×YT，37℃摇荡30分钟；

6、加入1ul的10¹¹个VCSM13噬菌体，37℃静置50分钟，3000g，离心5分钟，去掉上清，沉淀溶于50ml的2×YT^AMP+KAN+GLU+培养基，30℃过夜；

7、PEG4000沉淀培养基上清液中噬菌体，14000rpm离心，2ml的1×TE溶解噬菌体，滴度约为10¹¹。

5)、第二、三轮PD-L1抗体的筛选、富集的步骤同第一轮

6)、ELISA检测抗体富集度

1、抗原包被：用人PD-L1全蛋白包被ELISA板，包被浓度为1μg/ml；

2、BSA封闭；

3、每个ELISA孔加入10¹⁰个不同富集度的抗体噬菌粒，稀释到PBST中，100μl/孔，静置1小时；

4、Anti-M13(噬菌体抗体，兔来源)，稀释度1:5000，100μl/孔，37℃，1小时；

5、羊抗兔IgG抗体(HRP)，稀释度1:10000，100μl/孔，37℃，1小时，随着一轮一轮的筛选的进行，能够特异性识别结合PD-L1的抗体逐渐被富集。

三、单克隆抗体菌落选取

ELISA法检测PD-L1的抗体富集度，在三级抗体库中随机选取60个抗体单菌落，分别用VCSM13辅助扩增，离心后的上清液直接作为抗体溶液做ELISA，选取光度值最高的单菌落作为单克隆抗体，根据单克隆抗体噬菌粒(Phage-VNAR)ELISA的结果，共挑取了3个阳性菌落测序，结果显示纳米抗体编码基因序列存在重复的现象，只有1种特异序列。

四、酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选

酶联免疫吸附实验(ELISA)可以用于：检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。其基本原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，滴加底物溶液后，出现颜色反应，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

1)、酶联免疫吸附实验步骤

1、包被抗原：用PBS包被缓冲液(pH＝7.2)溶解抗原人PD-L1全蛋白，使抗原浓度为5ug/ml，加100μl/孔到96孔酶标板，4℃放置过夜；

2、第二天弃去包被液后，用PBST洗涤3次，每孔加入150μl 1％BSA，37℃封闭1小时；

3、PBST洗涤3次后，每孔加入100μl待检抗体(1μg/mL)，并加入对照样品，37℃孵育2小时；

4、PBST洗涤3次后，加入100μl稀释后的HRP标记的二抗，37℃孵育1小时；

5、显色:PBST洗涤5次,轻轻拍干,每孔加入100μl显色剂,室温反应5～10min；

6、每孔中加入终止液100μl并混匀，终止显色反应；

7、用酶标仪在450nm处测定吸光值。

五、PD-L1抗体表达质粒的构建、抗体表达及纯化

1)、将步骤三中筛选得到的阳性克隆序列，通过NdeI和XhoI两个酶切位点一起连入Pet28a表达载体。

2)PD-L1抗体在BL21(DE3)细胞中的表达

1、将测序正确的步骤1获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0之间；

2、添加终浓度为0.5mM的IPTG溶液，25℃、200rpm振荡诱导表达12-18h；

3、诱导表达结束后，离心收集菌体，超声波将菌体破碎，离心分离上清和沉淀，SDS电泳鉴定目的蛋白主要存在于沉淀中，由此断定形成包涵体。

3)PD-L1抗体蛋白的纯化

1、包涵体透析复性：通过溶解试剂(8M尿素、20mM Tris-HCl pH8.0、20mM DTT)，按6-8mg包涵体/mL比例配置溶解包涵体，待完全溶解后，0.45μm滤膜过滤获得蛋白样品；将蛋白样品装入处理好的分子量合适的透析袋，浸入500ml的透析液(2M尿素，2mM GSH/0.2mMGSSG，50mM Tris-HCl，pH8.0)，4℃透析24h；

2、蛋白纯化：收集透析后的蛋白样品，0.45μm滤膜过滤后，通过常规His-tag亲和层析方法纯化抗体蛋白；

3、超滤浓缩：将纯化后的蛋白样品加入Millipore Amicon-Ultra-15超滤管，4000rpm，超滤离心30min，将收集管中剩余的液体回收，即为超滤浓缩后的蛋白样品(PD-L1抗体)。

六、将上述超滤浓缩后的蛋白样品(PD-L1抗体)进行检测

(一)鲨抗PD-L1抗体表达检测

检测结果如图1所示，图中1:原管离心沉淀，上样量2μL；2:原液离心上清，上样量2μL；3:稀释20倍，上样量8.3μL；4:样品3被过滤，上样量8.3μL；5:浓缩液1，上样量2μL；6:浓缩液2，上样量2μL；7:超滤后液体，上样量8.3μL；8:双蒸水清洗，上样量8.3μL。结果：鲨抗PD-1L抗体由尿素溶解形式经大体积缓冲液稀释复性，再经超滤管浓缩后，得到最终溶解在PBS缓冲液中的高纯度抗体。

(二)将上述超滤浓缩后的蛋白样品(PD-L1抗体)进行Western Blot检测，Westernblot步骤：

1、蛋白样品制备：将PD-L1抗原蛋白分别稀释为25ug/ml、50ug/ml和100ug/ml，上样量分别为250ng，500ng和1ug；

2、SDS-PAGE电泳：分离胶80V，20min；浓缩胶120V，80min；

3、半干转移法转膜：将蛋白转运至PVDF膜，PVDF膜用前在甲醇中浸泡超过15S，再浸入transfer buffer 15min；转膜条件：23V，30min；

4、5％(M/V)的脱脂奶粉封闭，37℃，2h；

5、TBST缓冲液震荡清洗膜，5次，每次3min；

6、将亲和纯化后的PD-L1抗体用的TBST稀释(稀释比例为1:1000)，37℃振荡孵育1h；

7、用TBST缓冲液清洗膜5次，每次5min；

8、37℃振荡孵育1h，二抗(His-Tag Mouse MonoclonalAntibody)的稀释倍数为1:2000；

9、用TBST缓冲液清洗膜5次，每次5min；

10、37℃振荡孵1h，三抗(山羊抗鼠IgG)的稀释倍数为1:5000；

11、将ECL化学发光液A液和B液等体积混合后淋于膜上，利用化学发光凝胶成像仪(BIORAD ChemiDoc XRS)进行曝光显色。

检查结果如图2和图3所示，图2是鼠抗和鲨抗Western Blot比较检测结果图，图2中无His标签PD-L1蛋白，1：500ng、2：250ng、3：125ng、4：500ng、5：250ng、6:125ng；图3是不同组别鲨抗Western Blot检测结果图，图3中ABC为含尿素鲨抗PD-L1抗体(1.2mg/mL)、D为去除尿素鲨抗PD-L1抗体(100μg/mL)。

从图2和图3可以看出有特异性条带，鲨抗能特异的识别PD-L1蛋白，抗体鲨抗PD-L1能发挥正常的功能，其中1：2000效果比较好；去除尿素的抗体效价更高。

(三)将上述超滤浓缩后的蛋白样品(PD-L1抗体)进行灵敏度检测

通过酶联免疫吸附实验(具体实验方法同步骤四：酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选)检测PD-L1抗体的灵敏度，将本发明的PD-L1抗体(鲨抗)与鼠抗(鼠的PD-L1抗体)进行比较，比较结果如图4所示，其中，

表示鼠抗，●表示鲨抗(本发明的PD-L1抗体)；本发明的PD-L1抗体灵敏度达到1ng，具有较高了检测能力；线性范围提高到1到300ng，很好的提高了适应检测能力范围；信号值大幅提高，从500多提高到2000多，增加了检测的准确度。

序列表

<110> 深圳海创生物技术有限公司

<120> 一种PD-L1抗体及其提取方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 486

<212> DNA

<213> 条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiasum)

<400> 1

aatattttct tgctttcgtt ccttttagcc tggttaccaa atgtcttcac tgcatgggtt 60

gaacaaacac cgacaacgac aacaaaggag gcaggcgaat cactggccat caattgcgtc 120

ctaaaaggtt ccatatattc attgtgtgac acgaactggt atttcacaaa aaagggcgca 180

acaaagaagg agagcttatc aaatggcgga cgatacgcgg aaacagtgaa caaggcatca 240

aagtcctttt ctttgcgaat tagtgaccta agagttgaag acagtggtac atatcgctgt 300

aaagcgtatc ggacagctgg gatgacgtgt gatacagggt atagctggat gggaggcggc 360

accattctga ctgtaaaacc tggcaaacag ccttctccac cagtcatcag tctacactat 420

tctgcaactg aagaacagag ggcaaatgga tttcttcagc tgatttgtct aattagcgga 480

tactat 486

<210> 2

<211> 162

<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨(Cihiloscyllium plagiasum)

<400> 2

Asn Ile Phe Leu Leu Ser Phe Leu Leu Ala Trp Leu Pro Asn Val Phe

1 5 10 15

Thr Ala Trp Val Glu Gln Thr Pro Thr Thr Thr Thr Lys Glu Ala Gly

20 25 30

Glu Ser Leu Ala Ile Asn Cys Val Leu Lys Gly Ser Ile Tyr Ser Leu

35 40 45

Cys Asp Thr Asn Trp Tyr Phe Thr Lys Lys Gly Ala Thr Lys Lys Glu

50 55 60

Ser Leu Ser Asn Gly Gly Arg Tyr Ala Glu Thr Val Asn Lys Ala Ser

65 70 75 80

Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Ser Asp Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly

85 90 95

Thr Tyr Arg Cys Lys Ala Tyr Arg Thr Ala Gly Met Thr Cys Asp Thr

100 105 110

Gly Tyr Ser Trp Met Gly Gly Gly Thr Ile Leu Thr Val Lys Pro Gly

115 120 125

Lys Gln Pro Ser Pro Pro Val Ile Ser Leu His Tyr Ser Ala Thr Glu

130 135 140

Glu Gln Arg Ala Asn Gly Phe Leu Gln Leu Ile Cys Leu Ile Ser Gly

145 150 155 160

Tyr Tyr

Claims (1)

1.一种PD-L1抗体，其特征在于PD-L1抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PD-L1抗体的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。

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