JPH10502333A

JPH10502333A - バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド

Info

Publication number: JPH10502333A
Application number: JP7526465A
Authority: JP
Inventors: ポール，サドハー; 靖子野田; ルビンシュタイン，イスラエル
Original assignee: プロティーンニックスカンパニー
Priority date: 1994-04-07
Filing date: 1995-04-07
Publication date: 1998-03-03
Also published as: US5770570A; CA2187322A1; WO1995027496A1; AU2380895A; EP0759768A1; EP0759768A4; AU709559B2

Abstract

(57)【要約】バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド（ＶＩＰ）リポソーム生成物を哺乳動物の標的組織に投与する方法を提供する。このＶＩＰはリポソーム上及び内に発現される。さらにコレステロール、ホスファチジルコリン及びホスファチジルグリセロールを含むＶＩＰリポソーム産生物を調製する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド発明の背景１．発明の分野本発明は、血管作動性腸管ポリペプチド（以後「ＶＩＰ」）を標的組織に送達する方法、リポソーム（liposome）上および中でＶＩＰが発現されるＶＩＰリポソーム産物、および生物学的有効性が向上し副作用が低下したＶＩＰリポソーム産物の製造方法に関する。２．関連技術の背景ＶＩＰは、２８アミノ酸の神経ペプチドであり、広範囲の生物学的作用を示し、多くのシグナル変換経路を活性化することが知られている。エス・アイ・セイド（Said，S．I.）（１９８４）Peptides ５，（増刊１）１４９−１５０、およびエス・ボールとエム・エバジ(Paul，S．and Ebadi，M.)（１９９３）Neuroc hem.Int. ２３，１９７−２１４を参照。 πらせんとしてのシファー−エドムナソン（Schiffer-Edmunason）投影は、らせんの反対側の面への非極性および極性残基の分離を明らかにし、この両親媒性はまた、ＶＩＰをひずんだαらせんのモデルと考えた時も明らかである。これは、ジー・エフ・ムッソ、エス・パッチ、ティー・シー・リスカンプ、エス・プロボウ、イー・ティー・カイザーおよびジー・ベリセレビ(Musso，G．F.，Patthi ，S.，Ryskamp，T．C.，Provow，S.，Kaiser，E．T．and Velicelebi，G.)(１９８８）Biochemistry ２７，８１７４−８１８１に報告されている。ＶＩＰ類似体のらせん形成傾向と生物学的活性の間の相関は、エム・ボダンズキー、エー・ボダンズキー、ワイ・エス・クラウスナーおよびエス・アイ・セイド(Bodanszky ，M ．Bodanszky．A.，Klausner，Y．S．and Said，S．l.)(１９７４)Bioorgan. Chem ．３，１３３−１４０に記載されている。純水中ではＶＩＰのスペクトル特性は、ランダムコイル(random coil)に一致する。しかし有機溶媒と陰イオン性脂質は、分子中でらせん情報を誘導する。アール・エム・ロビンソン、イー・ダブリュー・ドラケニー・ジュニアおよびダブリュー・エル・マチス（Robinson， R．M.，Dlakeney，Jr.，E．W．and Mattice，W．L.）（１９８２）Biopolymers ２１，１２１７−１２２８；エム・エム・ハメド、アール・エム・ロビンソン、およびダブリュー・エル・マチス(Hamed，M．M，Robinson，R．M．and Mattice, W．L.）（１９８３）Biopolymers ２２，１００３−１０２１；およびエム・ボダンズキー、エー・ボダンズキー、ワイ・エス・クラウスナーおよびエス・アイ・セイド（Bodanszky，M.，Bodanszky，A.，Klausner，Y．S．and Said，S．I.) （１９７４）Bioorganic ．Chem．３，１３３−１４０を参照。両親媒性らせんを形成することができる短いペプチドは、脂質二重層に結合し浸透することが知られている。イー・ティー・カイザーおよびエフ・ジェイ・ケジー（Kaiser，E．T．and Kezdy，F．J.）（１９８７）Annu ．Rev．Biophys.Bio physical Chem．１５，５６１−５８１；およびエム・エス・ピー・サンソム（S ancom，M．S．P.）（１９９１）Prog ．Biophys．Molec．Biol．５５，１３９− ２３５を参照。例としては、（Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−）₂のようなモデルペプチド（ダブリュー・エフ・デグラドおよびジェイ・ディー・リア（DeGrad o，W．F．and Lear，J．D.）（１９８５）J ．Am．Chem．Soc．１０７，７６８４ −７６８９に開示されている）と２６残基のハチ毒ペプチドであるメリチン（me littin）（シー・ワタタおよびケー・グオズジンスキー（Watata，C.and Gwozdz inski，K.）（１９９２）Chem-Biol ．Interactions ８２：１３５−１４９に開示されている）がある。可能な結合機序には、極性アミノ酸とリン脂質の頭の基との静電気的相互作用に介在される二重層の表面と平行のペプチドの配向、および部分的に疎水性作用により安定化される、非極性二重層核へのペプチド凝集物の挿入がある。エム・エス・ピー・サンソム(Sansom，M．S．P.)(１９９１)Prog ．Biophys．Molec.Bio l．５５，１３９−２３５を参照。ＶＩＰは相同ペプチドのファミリーに属し、この仲間には、ペプチドヒスチンイソロイシン（ＰＨＩ）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、下垂体アデニラーゼシクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、セクレチンおよびグルカゴンがある。相同ペプチドのファミリーの配列は、以下の通りである。ＶＩＰ配列の部分は、保存塩基性残基と同様に、下線で示してある。ＶＩＰと同様に、これらのペプチドは脂質二重層に結合できる両親媒性らせんを形成することができた。本発明において、モデルペプチドとしてＶＩＰを使用して、このペプチドのファミリーの生物学的有効性は、脂質二重層中およびその上での発現により上昇することを証明した。ＶＩＰとＧＲＦの生物学的作用は、細胞表面上で発現される蛋白受容体および細胞内受容体により介在されると考えられている。我々は、カルモジュリン（ca lmodulin）がＶＩＰの細胞内受容体である可能性を示した。ポール（Paul）ら、「血管作動性腸管ポリペプチド：カルモジュリンおよび触媒性抗体とのその相互作用」、Neurochem ．Int., Vol．２３，No.３，pp.１９７−２１４；スタールウッド(Stallwood)ら、「蛋白をカルモジュリンと結合させる膜結合性の血管作動性腸管ポリペプチド結合性ペプチドの本体」、J ．Biol．Chem.，Vol.２６７，（１９９２），pp.１９６１７−１９６２１；スタールウッド（Stallwood）ら、「カルモジュリンは神経ペプチド受容体か」、FASEB J.，Vol.7，（１９９３），p .１０５４（抄録）。これらの文献の内容は、参考のため本明細書に引用される。我々は、ＶＩＰのみまたはＶＩＰ−カルモジュリン混合物の送達は、ペプチドの細胞表面結合の必要がなく、従ってペプチドの生物学的作用が向上すると考えた。リポソームの脂質二重層は細胞の原形質膜と融合し、その内容物を細胞内コンパーオメントに送達することが知られているため、リポソーム中および上で発現されるペプチドの供給は細胞内送達を達成するであろう。ＶＩＰの治療への応用を制限する大きな要因は、ＶＩＰは蛋白分解を受けやすく多くのコンフォメーションをとることにより、標的組織での生物学的利用性が低下することである。発明の要約本発明の目的は標的組織に、従来法の問題を克服する、ＶＩＰ−ＧＲＦファミリーに属するペプチドの血管作動性腸管ポリペプチド（以後「ＶＩＰ」）を送達する方法を提供することである。本発明の別の目的は、ＶＩＰの有効性と持続時間を改良することである。本発明はまた、ＶＩＰがリポソームの上および中で発現されるＶＩＰリポソーム産物の生成工程、および標的組織に生物学的有効量のＶＩＰリポソーム産物を投与する工程を含んでなる、哺乳動物の標的組織の表面および細胞内コンパーオメントにＶＩＰを送達する方法に関する。本発明の別の実施態様は、コレステロール、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルグリセロールよりなるＶＩＰリポソーム産物に関する。本発明のさらなる実施態様は、得られるリポソームは、ＶＩＰリポソーム産物がコレステロール、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールを含んでなるリポソーム上および中で発現されるＶＩＰを含む条件下で、ＶＩＰリポソーム産物を生成する工程を含んでなる、生物学的有効性が向上し副作用が低下したＶＩＰリポソーム産物の製造方法に関する。「リポソームの上および中で発現される」とは、以下の意味を有する。「上」とは、ＶＩＰが外部溶媒に暴露され、例２で後述されるように脂質二重層の疎水性核中に挿入されて外表面に固定されることを意味する。「中」とは、リポソームの管腔スペース中およびリポソームの脂質二重層の管腔内表面上の可溶性ＶＩＰを意味する。このリポソーム作成体中のすべての型のＶＩＰは、脂質分子と複合体を形成して、らせんコンフォメーションである可能性がある。以下の説明および添付の請求の範囲を考慮することにより、本発明の他の目的、および特徴は明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、従来のＶＩＰ溶液に比較した、リポソーム（ＶＩＰリポソーム産物）上および中で発現されたＶＩＰのトリプシンによる分解を例示する。図２は、ＶＩＰリポソーム産物および従来のＶＩＰ溶液で処理したハムスターの平均動脈血圧の低下を例示する。図３は、ＶＩＰリポソーム産物と従来のＶＩＰ溶液の投与量を比較した、ハムスターの平均動脈血圧の変化を例示する。図４は、ＶＩＰのない溶液（黒丸）または過剰の非標識ＶＩＰの溶液（白丸）中への希釈による、結合ＶＩＰのうちリポソーム上に結合した（ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵ Ｉ）ＶＩＰの放出％の経時変化を例示する。図５は、非標識ＶＩＰによる、リポソーム上の（ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵Ｉ）ＶＩＰの結合の競合的阻害を例示する。図６は、非標識ＶＩＰを有することによる、リポソーム上の（ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵ Ｉ）ＶＩＰの結合の競合的阻害を例示する。図７は、リポソーム上の（ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵Ｉ）ＶＩＰの結合のpH依存性を例示する。図８は、従来のＶＩＰ溶液に比較した、リポソーム上に結合したＶＩＰの蛋白加水分解による分解を例示する。好適な実施態様の詳細な説明本発明の、ＶＩＰはリポソームの上および中で発現されるＶＩＰリポソーム産物の生成工程、および標的組織に生物学的有効量のＶＩＰリポソーム産物を投与する工程を含んでなる、哺乳動物の標的組織にＶＩＰを送達する方法に関する。生物学的有効量とは、ナノモル〜マイクロモル範囲ののＶＩＰ濃度を意味する。ＶＩＰリポソーム産物は、静脈内、経口または経皮的に投与して、哺乳動物の輸送系により標的組織にＶＩＰリポソーム産物を送達するか、または標的組織に直接ＶＩＰリポソーム産物を適用することができる。好ましくは、ＶＩＰリポソーム産物は静脈内投与により送達される。好ましくは、血管作動性腸管ポリペプチドは、コレステロール、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルグリセロールまたは他の適当な脂質（合成および非合成脂質を含む）を含んでなるリポソームの上および中で発現される。ＶＩＰとＧＲＦの細胞内受容体であるカルモジュリンを、リポソーム内にペプチドと一緒に含有させることもできる。これにより標的組織の細胞内へのＶＩＰ −カルモジュリンの送達が可能になり、こうしてペプチドの生物学的作用が向上する。血管作動性腸管ポリペプチドは例えば、HSDAVFTDNYTRLLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂ 、その断片もしくは類似体、またはＶＩＰと同族のペプチド（例えば、ＧＲＦ、ＰＨＩ、ＰＨＭ、ＰＡＣＡＰ、セクレチンおよびグルカゴン）でもよい。脂質二重層の上および中で発現されるペプチドの供給は、ペプチドが細胞内コンパーオメントに到達することを可能にし、こうして細胞表面受容体に結合する必要をなくし、ペプチドの生物学的有効性と効力が向上する。血管作動性腸管ポリペプチドは、リポソーム内でらせんコンフォメーションで結合することができる。好ましくは血管作動性腸管ポリペプチドは、受容体反応性コンフォメーションで結合しており、こうして血管作動性腸管ポリペプチドの生物学的有効性が向上する。ＶＩＰリポソーム産物は、従来のＶＩＰと比較して有意に低い投与レベルで投与されても、従来法で投与したＶＩＰと同等の効力を示すことができる。一般にＶＩＰの生物学的有効量は、カプセル型のＶＩＰの生物学的有効量より約５０〜７５重量％少ない。ＶＩＰの生物学的有効濃度は、ナノモル〜マイクロモルの範囲である。ＶＩＰに等モルのカルモジュリンを含めると、有効量は従来法で投与したペプチドを用いる場合に必要な量の１０％まで低下する。従来法で投与したＶＩＰの結果に一致するかまたはこれを越えるのに必要な生物学的有効量を決定するために、ＶＩＰリポソーム産物を試験する必要がある。例えば、従来の担体中のＶＩＰの通常量が２０mgである時、ＶＩＰリポソーム産物は同じ効果を、約１０mg〜約５mgで達成することができる。典型的には従来のＶＩＰの生物学的有効量は、ヒトで静脈内投与の場合１日に０．０１〜５０mgであり、腸溶コーティングカプセルの場合は０．１〜５００mgである。ＶＩＰリポソーム産物の効力はまた、従来のＶＩＰより約５０〜約１００％長く持続する。カプセル化ＶＩＰは、従来のＶＩＰより加水分解に対して有意に耐性があり、これがカプセル化ＶＩＰの寿命の延長に寄与している。ＶＩＰは、リポソーム内で可逆的に結合している。本発明はまた、コレステロール、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルグリセロールを含んでなるＶＩＰリポソーム産物に関する。ＶＩＰはらせんコンフォメーションでリポソーム中または上に結合できる。好ましくはＶＩＰは、受容体反応性コンフォメーションで結合して、こうしてＶＩＰの生物学的有効性が向上している。さらなる実施態様は、コレステロール、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルグリセロールを含んでなるＶＩＰリポソーム産物を生成する工程を含んでなる、生物学的有効性が向上し副作用が低下したＶＩＰの製造方法に関する。好ましくは、ＶＩＰは受容体反応性コンフォメーションでリポソームの上または中に結合する。別の実施態様は、コレステロール、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルグリセロールを含んでなるＶＩＰリポソーム産物の有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物の血圧を調節する方法に関する。ＶＩＰリポソーム産物は、例えば腸管の運動性の異常、消化性潰瘍、喘息を含む気管支痙攣、高血圧、インポテンツおよび虚血のような血管性症状、精神症状および血液流の不足による禿頭の治療に使用できる。本発明を以下の非限定例でさらに説明する。例１本発明のリポソームからのＶＩＰ放出と、リポソームの上および中に結合したＶＩＰの分解を試験し、ＶＩＰの従来溶液と比較した。次に本発明のＶＩＰリポソーム産物の降圧作用を、ハムスターを用いて従来のＶＩＰと比較した。トリエチルアミンホスフェート／アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／アセトニトリル溶媒系での調製Ｃ−１８カラムによる連続的逆相ＨＰＬＣにより精製した合成ＶＩＰ（フロリダ大学、ゲインズビル（Gainsville））を用いて、ＶＩＰリポソーム産物を作成した。精製したＶＩＰのペプチド含量は８２％であり、アミノ酸解析は全長ＶＩＰに一致した。ＶＩＰの放射ヨード化と（ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵Ｉ）ＶＩＰの精製は、エス・ポール、ディー・ジェイ・ボレ、シー・エム・ビーチ、ディー・アール・ジョンソン、エム・ジェイ・パウエル、およびアール・ジェイ・マッセイ(Paul，S.，Volle， D.J.，Beach，C．M.，Johnson，D．R.，Powell，M．J．and Massey，R．J.）（１９８９）Science２４４，１１５８−１１６２に記載されているように行なった。リポソームは、エフ・ゾカ・ジュニアおよびパパハジョポウロス(Szoka，Jr., F．and Papahadjopoulos）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ７５，pp.４１９４ −４１９８（１９７８）に開示されている方法を用いて、モル比１：４：５の卵黄ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルグリセロールおよびコレステロール（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.））の混合物から逆蒸発(reverseev aporation)を行って調製した。３mM合成ＶＩＰ、（tｙｒ¹⁰−¹²⁵Ｉ）ＶＩＰ（約１００，０００ＣＰＭ）と３mM非標識ＶＩＰの混合物、または０．２nMの放射性ペプチドのみを含有する３mlのジエチルエーテル中の各１２mMのリン脂質とコレステロール溶液を、１mlの５０mMヘペス、pH７．３、と混合して、超音波処理した。ジエチルエーテルを真空下で蒸発させて、溶液中でリポソームを生成させた。得られた懸濁物を１０mlの５０mMヘペスで希釈し、次に１２，５００×ｇで７分間遠心分離した。上澄液を捨て、ペレットを０．１５ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で３回洗浄した。１μmのポリカーボネートフィルタ（ヌクレオポア（Nuc leopore））を用いて、大きいリポソームを取った。この方法により、リポソームの表面およびリポソーム内でのＶＩＰの発現が可能になる。リポソームのリン脂質含量は、エム・ケーツ(Kates，M.)、「脂質学の技術」、pp．３５４−３５６，１９７２、エルセビア（Elsevier）、ニューヨーク、に記載のバートレット（Bartlett）の修飾マイクロ測定法を用いて、無機リン酸の比色定量法により測定した。リポソーム中のＶＩＰ含量は、２つの方法で測定した。最初の方法では、３mM の非標識ＶＩＰと混合した（ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵Ｉ）ＶＩＰ（０．２nM）を、リポソーム中にカプセル化し、最終リポソーム懸濁物の一定分割量の（ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵ Ｉ）ＶＩＰ放射能を計測した（計数効率７０％）。第２の方法では、非標識ＶＩＰを含有するリポソームをドデシル硫酸ナトリウム（１％ｗ／ｖ）で可溶化し、抽出物を０．１％ＴＦＡ水溶液で０．０１％ＳＤＳに希釈し、Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８カートリッジ（ウォーターズ（Waters））で抽出し、結合画分のＶＩＰ含量を、ジェイ・チョウ・ポールとイー・コボタ（Paul，J．Chou and E．Kobota) 、Life Sci., ４１，pp.２３７３−２３８０（１９８７）に記載のラジオイムノアッセイにより測定した。リポソーム中で結合したＶＩＰの分解を試験し、以下のように従来のＶＩＰ溶液と比較した。０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＲＩＡグレード；シグマ(Sigma)）を含有する５０mMのヘペス、pH７．３、中に溶解した、本発明のリポソーム中の（ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵Ｉ）ＶＩＰ、１７，７００cpm／０．６７μモルのリン脂質および等量の（ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵Ｉ）ＶＩＰを、ウシ膵臓（シグマ(Sigma)）のトリプシン３０nMで２３℃で処理した。トリトンＸ−１００(シグマ（Sigma）)を１％ｗ／ｖになるように加えてリポソームを可溶化した。界面活性剤濃度を緩衝液で０．２５％にした。図１に示すように、カプセル化した（ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵Ｉ）ＶＩＰ（黒丸）とトリプシンと２３℃で６０分間インキュベートしても、ほとんどまたは全くペプチドの加水分解は起きなかった。これと比較して、図１に示すように対照（ｔｙｒ¹⁰ −¹²⁵Ｉ）ＶＩＰの８０％溶液（白丸）は、トリプシンにより１０分以内に消化された。図１の値は、３重測定の平均±標準偏差である。エス・ポール(S．Paul)ら、J．Biol．Chem．２６７，pp．１３１４２−１３１４５（１９９２）に記載のように測定した時、ｐｒｏ−ｐｈｅ−ａｒｇ−メチルウマリンアミドのトリプシン触媒加水分解速度は、空のリポソームの非存在下および存在下で基本的に同じであった。従ってトリプシンによるカプセル化したＶＩＰの加水分解の低下は、リポソームの非特異的阻害作用によるものではなかった。加水分解によるペプチドの分解は、Science ２４４；１１５８−１１６２（１９８９）、同上、に記載のように、（ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵Ｉ）ＶＩＰのトリクロロ酢酸可能性放射能を定量することにより測定した。リポソームからのＶＩＰの放出は、以下のように測定した。０．０２％ＮａＮ₃を含有する５０mMヘペス、pH７．３、中で４℃に維持した（ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵Ｉ）ＶＩＰ(約２０，０００cpm)を含有するリポソームからのペプチドの放出は、懸濁物の一定分割量を１２，４０００×ｇで１５分間遠心分離し、上澄液の放射能を計測して測定した。緩衝液中で４℃において１４日間保存した後のリポソームからの（Ｔｙｐ¹⁰−¹²⁵ Ｉ）ＶＩＰの漏出は利用できる放射能の＜２％であって、無視できるものであった。顕微鏡検査は、この期間にわたるリポソームの分解を示さなかった。本発明によるＶＩＰリポソーム生成物の血圧低下効果を、雄ゴールデンシリアン種（Syrian）ハムスター（体重１２０〜１３０ｇ）を使用し、下記のとおりにして、慣用のＶＩＰと比較した。ハムスターは、先ずナトリウムペントバルビタール６mg／体重１００ｇの静脈投与により麻酔させることによって、準備した。次いで、気管支切開を施し、自発呼吸を強めた。必要に応じて、２〜４mg／体重１００ｇ／時間で、追加の麻酔剤を静脈投与した。血圧を追跡測定するために、大腿部動脈にカテーテルを挿入した。大腿部静脈には薬物および蛍光トレーサー投与用のカテーテルを付けた。動物は、実験期間中、加熱したパッド上に保持した。動脈血圧は、変圧器およびストライプ−チャート式記録計(モデル７７０２Ｂ、Hewlett-Packard)を用いて、連続的に記録した。ハムスターのチェックポーチの微小循環系は、内視鏡および蛍光物質、イソチオシアネート−デキストリン（分子量＝７０ＲＤ；シグマ社）のポストキャピラリイ細静脈からのクリアランスを使用して、目で見えるようにし、W．G．Mayhanおよび I．Rubinsteinにより J．Appl．Physiol.，７５，２７〜３３頁（１９９３）に記載されたとおりの測定を行なった。各ハムスターには、０．１５Ｍ塩化ナトリウム中に溶解したＶＩＰまたはリポソーム内に封入したＶＩＰ（１μmol ＶＩＰ／０．１２μmol リン脂質）を、増加する濃度で、各１mlづつ、７分間かけて、静脈注入した。対照ハムスターの体重（１２５±２ｇ）と被験ハムスターの体重（１２４±１ｇ）とは、実質的に同一であった。各濃度の当該ペプチドを投与する前、投与中および投与後の６０分の時点で、平均動脈血圧を記録した。初期実験において、０．１５Ｍ塩化ナトリウムまたは空のリポソームの注入は、平均動脈血圧にいずれの有意の変化ももたらさないことが見出された（データは示されていない）。チェックポーチ微小循環系の漏出部位の数を、W．G．Mayhanによる上記刊行物に記載のとおりにして、この実験期間全体にわたり、各分毎に測定した。このデータを平均値±ＳＥＭで表わす。非対称観測に対するスチューデンツｔ−テストを使用して、血管活性腸内ペプチド(vasoactive intestinal peptide)に対する応答を比較した。＜０．０５のｐ値は有意であると見做した。利用できるペプチド８．９％を含有するリポソーム内の３mM無標識ＶＩＰ（これは、０．００８mol ＶＩＰ／mol リン脂質の封入に相当する）およびトレーサー（Ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵Ｉ）ＶＩＰの溶液から調製された封入ＶＩＰを、放射性ペプチドの取り込みに基づいて測定した。この測定は、リポソームを塩類溶液で反復洗浄して、遊離のペプチドを除去し、次いでガンマカウンターで放射能を測定することによって行なった。無放射能の封入ＶＩＰのラジオイムノアッセイによる測定量は、実質的に同一の数値をもたらした。血圧に対する効果は、塩類溶液に溶解したＶＩＰまたはリポソーム内に封入したＶＩＰの注入後の経過時間の関数として、平均動脈血圧（ＭＡＰ）の減少の程度を測定することによって決定した。ハムスターは、溶解したＶＩＰまたは空のリポソームの注入期間中、検知できる有害な影響を示さなかった。さらにまた、これらのハムスターのチェックポーチ微小循環系に、漏出しやすい部位の形成は見られなかった。図２には、リポソーム内に封入されたＶＩＰ(０．００８ペプチド／リン脂質m ol)または塩類溶液に溶解されたＶＩＰの投与期間中おび投与後の経過時間の関数として、ＭＡＰの減少が示されている。投与量レベルは、封入ＶＩＰの場合および０．１５ＭＮａＣｌ（塩類）溶液中ＶＩＰの場合に、１．０nmolであった。ペプチド注入時間は７分間であった（中黒棒印）。塩類溶液中のＶＩＰで処置した動物に係るＭＡＰ値（中白円形印）またはリポソーム内のＶＩＰで処置した動物に係るＭＡＰ値（中黒円形印）は、９３．０mmHgおよび９３．４mmHgであったる。このデータは各群の５匹のハムスターの平均値（±ＳＥＭ）である。図２において、（^*）は、非対称観測の場合の片側ｔ−検定による、相当する時点における塩類溶液中ＶＩＰに対するｐ＜０．０５を示す。図２に示されているように、ＭＡＰの有意の減少が５分の時点で見出され（ｐ＜０．０５、片側ｔ−検定）、最大有意減少は３分〜７分の間の別の時点で見い出された（ｐ＜０．１）。ＭＡＰの最大減少の程度は、約３．５倍大きく、血圧低下効果の持続時間は、塩類溶液中ＶＩＰの場合よりもさらに延長されていた。１nmol／ハムスターの投与量において、塩類溶液に溶解したＶＩＰは弱く、かつまた一時的なＭＡＰ減少を誘発させたのみであった。このことは、図２に示されている。図２は、ＶＩＰの効果が、充分に可逆性であることを示しており、これは動脈血圧値が注入前の基礎値に戻ることにより証明されている（塩類溶液中に溶解したＶＩＰの場合は９分；ＶＩＰリポソーム生成物の場合は、１６分）。図３には、麻酔したハムスターにおける平均動脈血圧（ＭＡＰ）に対するＶＩＰリポソーム生成物（０．００８mol ペプチド／mol リン脂質：中黒棒印）が０ .１５ＭＮａＣｌに溶解したＶＩＰ（中白棒印）と比較して示されている。これらの数値は平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）である。塩類溶液中ＶＩＰに対する^*ｐ＞０．０５。上記データは、塩類溶液中のＶＩＰまたはリポソーム封入ＶＩＰの血圧低下効果が濃度依存性であることを示している。これらのデータはまた、リポソーム内ＶＩＰ０．５nmolまたは１nmolの注入後のＭＡＰの減少が、等量の塩類溶液中の対照ＶＩＰに比較して有意に大きいことを示している（ｐ＜０．０５）。３nmol ＶＩＰでは、対照の数値とペプチドリポソーム生成物との間の差違は有意ではなかった。これは、この投与量では飽和ペプチド濃度が生じるからである。この例は、ＶＩＰの血圧低下効果がリポソーム上のおよびリポソーム内のペプチドの存在によって、有意に増大されることを示している。これは、対照ＶＩＰ溶液と比較して、ＶＩＰリポソーム生成物を用いて見い出された、血圧低下効果の期間延長およびこの効果の程度の増大の両方によって証明されている。空のリポソームの投与は、平均動脈血圧に対して有意の効果を有していなかった。空のリポソームまたはＶＩＰリポソーム生成物の投与後の微小血管損傷は見られなかった。さらにまた、ＶＩＰ単独またはＶＩＰリポソーム生成物の血圧低下効果は充分に可逆性であった。総合して、これらのデータは、非特異性組織損傷がリポソーム内またはリポソーム上に含有されているＶＩＰの際立った血圧低下効果に関与する因子ではないことを示している。ＶＩＰリポソーム生成物の減少したトリプシン溶解性は、ＶＩＰの分解減少がハムスターにおける血圧低下効果の持続時間の増加を強めることを示している。ＶＩＰの両親媒性特性の観点から、本出願人は、脂質がＶＩＰに結合し、そしてレセプター反応性形態を安定化させることによって、その生物学的効力が増大されるものと信じる。これは、Y．Noda らにより FASE B．Journal ７，１０５３（１９９３）に記載されているように、ＶＩＰがタンパク質を含有していない二層系を透過するという発見および R．M．Robinson らにより Bipolymers,２１，１２１７〜１２２８頁（１９８２）に記載されたサーキュラージクロイズム（ci rcular dichroism）研究により検出されたペプチドにおけるラセンの形成がアニオン脂質様のホスファチジルグリセロールにより誘発されるという発見により支持されている。このＶＩＰ類縁体のラセン形成傾向とそれらの生物学的効力との相関関係は、G．F．Musso らにより Biochemistry,２７，８１７４〜８１８１（１９８８）に記載されている。例２脂質二層結合およびＶＩＰによる透過の証明本発明によるリポソームからのＶＩＰ放出およびリポソーム結合したＶＩＰの分解を試験し、慣用のＶＩＰ溶液と比較した。一層状リン脂質リポソームを、卵黄から精製したホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）（シグマ社）を使用して生成させた。シグマにより測定されたこのリン脂質の脂肪酸組成は次のとおりであった：（ＰＣ，Ｃ１６：０）、（３５％：Ｃ１８：０：１２％；Ｃ１８：１，３１％；Ｃ１８：２，１４％）；（ＰＧ，Ｃ１６：０，３０％；Ｃ１８：０，１３％；Ｃ１８：１，３０％；Ｃ１８：２，１６％）。この一層状リポソームは、クロロホルムに溶解したＰＧ／ＰＣ／ＣＨ（コレステロール）（モル比＝１：４：５）またはＰＣ／ＣＨ（１：１）の混合物から、 SzoKa，Jr.，F.および Papahadzopoulosにより Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，７５，４１９４〜４１９８（１９７８）に記載されているように、逆相蒸発によって調製した。上記脂質溶液を、回転蒸発器を用いて乾燥させ、次いでジエチルエーテル３ml に溶解した。リン脂質およびコレステロール（ＣＨ）の濃度はそれぞれ、１２mM であった。次いで５０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．３）１mlを、この懸濁液に添加し、この懸濁液を超音波処理浴(Branson)を用いて氷中で２分間、超音波処理した。この懸濁液を、２０〜２５℃で減圧の下に２０分間蒸発させ、５０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．３）１０mlで稀釈した。この懸濁液を次いで、１２，５００×ｇで７分間遠心分離し、この上清をすて、リポソーム含有ペレットをＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７．３）中に再懸濁した。この懸濁したリポソームを、０．０２％ナトリウムアジド含有緩衝液中で４℃ において保存し、調製して１０日以内に使用した。顕微鏡検査は、この期間にわたり、リポソームが凝集または崩壊しないことを示した。このリポソームのリン脂質含有量を、Kates，M．により Techniques in Lipid ology，３５４〜３５６頁（１９７２年）（Elsevier，New York）に記載されたバートレット（Bartlett）の修正微量分析法を用いる無機ホスフェート（Ｐ）の比色測定によって測定した。このリポソーム濃度はＰ．単位で表わす。５０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．３）中の等量の１％アンモニウムモリブデート（重量／容量）によって、リポソームを媒色着色させた後に、ホルムバール塗布したグリッド上で電子顕微鏡（Philips ４１０ＬＳ）により観察した結果、リポソームの９０％以上が２００nm〜１０００nm径で見出された。Johnson，S.M.,Ba ngham，A．D.，Hill，M．W．および Korn，E．D.による Biochem．Biphys．Acta ，２３３，８２０〜８２６参照。合成ＶＩＰ（HSDAVFTDNYTRLLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂：ペプチド含有量：８１％、Bachem）に、クロラミン−Ｔを用いて、¹²⁹Ｉの標識を付けた。この（Ｔｙｒ¹ ⁰ −¹²⁵Ｉ）ＶＩＰは、逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により分離し、例１に記載のＮ−末端ラジオセークエンシングにより同定した。このペプチドの比放射能は２０００Ci／molであった。フロリダ大学(Gainesville)で合成され、Ｃ−１８カラム上の調製ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製された未標識のＶＩＰを、若干の例で使用した。この調製物のペプチド含有量は８３％であり、その純度はネブラスカ大学の Protein Structure Core Facilityにおけるアミノ酸分析および自動Ｎ−末端配列決定により確認した。ペプチドは水溶液中でリポソーム表面に結合することができる。例１と同様の有機溶媒中において、このペプチドはリポソームの脂質膜の中および膜の上に現われる。このリポソームをペレット化した（１２，０００×ｇ、１０分間；Beckman Mi crofuge〔商品名〕）。その上清を吸引し、リポソーム−結合した放射能を７０％効率で測定した（Beckman モデル５５００ガンマカウンター）、上清中のリポソームの損失は最少であった。これは反応混合物中に存在する無機ホスフェートの９０％以上がペレットに回収されるからである。このリポソームを、２３℃で１０分間、２０％アセトニトリル（最終濃度）により可溶化し、ＣＦ蛍光を測定した（λem５２０nm、λex４９０nm；Perkin-Elm er ＬＳ５０蛍光測定計）。対照実験において、２０％アセトニトリルの存在または不存在の下に、既知濃度のＣＦと混合したリポソーム（２．３mM Ｐ）の蛍光強度が実質的に同一であることが見出された。リポソーム結合したＶＩＰおよび遊離（Ｔｙｒ¹⁰−¹²⁵Ｉ）ＶＩＰの加水分解に対する耐性を、ここに５０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．３）中のトリプシン（シグマ社）を添加することによって試験した。リポソームを遠心分離して、放出された放射能を分離し、２０％アセトニトリル中に溶解させた。キャリヤとして、ＢＳＡを０．１％（重量／容量）の量で加え、次いでＴＣＡ−不溶性放射能（未分解ＶＩＰ）をPaul，S.，Volle，D．J.，Beach，C．M.，Johnson，D.R.，Powell, M．J．および Massey，R．J.による Science，２４４，１１５８〜１１６２（１９８９）に従い測定した。この方法により測定されたＶＩＰの加水分解レベルは、Paul，S.，Mei，S.，M ody，B.，Eklund，S．H.，Beach，C．M.，Massey，R．J.および Hamel，F.により J．Biol．Chem.,２６６，１４１２８〜１６１３４（１９９１）に報告されているように、ＲＰ−ＨＰＬＣ（γ＞０．９）による反応混合物の分離によって見出されたレベルと相関関係を有していた。ｐｒｏ−ｐｈｅ−ａｒｇ−ＭＣＡ（Pe ptides International）の加水分解は、クマリン脱離性基の蛍光として測定した（λem４６０nm、λex３７０nm）。この結合性に係るデータは、平行インキュベーションで測定された反応管によるペプチド吸着に関して補正した。解離及び飽和データは Kinetic及び Enzfitter（Elsevier Biosoft）によって分析した。カルボキシフルオレセイン(ＣＦ；１００nM；Eastman Kodak)の結合は、ＶＩＰで用いたのと同じ実験条件で測定した。ＥＳＲは次のようにした得た。５−ドキシルステアリン酸（５−ＤＳ）又は１６−ドキシルステアリン酸（１６−ＤＳ）(Sigma)をリン脂質のエーテル溶液中に含有させてスピンラベル濃度０．２nM（スピン／リン脂質モル比：１．６０）とした以外は、前記と同様にして脂質リポソームを調製した。ラベル化リポソームは洗浄し、０．２ml ５０mM ＨＥＰＥＳ、pH７．３、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）中でＶＩＰとともに２３℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、ラベル化リポソームを１２，０００rpm で１５分間遠心分離し、得られるペレットを５０mM ＨＥＰＥＳ、pH７．３の１００μl 中に再懸濁した。ＪＥＳ−ＦＥＩＸＧＥＳＲスペクトロメーター(JOEL，Tokyo)を用いて、９．００６０GHz マイクロ波数、１００kHz 変調周波で０．２mT変調幅、応答時間０．３又は１．０秒、掃引時間１０mT／２分、マイクロ波電力８mWの機器パラメーターで、２７±０．５℃で、Hiramatsu，K．と Mori，A．（１９９３）Neur ochem．Res．１８，３１３−３１６に記載されたようにして、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトルを記録した。極性関連オーダーパラメータＳを、Hubbel．W ．L．と McConnel，N．M．（１９７１）J．Am．Chem．Soc．９３，３１４−３２６に記載の方法に従って微小解裂パターンから、回転相関時間に対応するモーションパラメーターと５−ＤＳスペクトルから、及び Eletr，S.とInesi，G．（１９７２）Biochem．Biophys．Acta．２９０，１７８−１８５に従い１６−ＤＳスペクトルから計算した。ＶＩＰのリポソームへの結合は次のようにして測定した。ユニラメラ脂質リポソームを逆相蒸発により調製し、前記したようして放射ラベル化ＶＩＰの結合についてアッセイした。ＢＳＡをアッセイ希釈液中に含有させて、脂質リポソーム及び反応チューブのポリプロピレン表面に非特異的ポリペプチド結合部位を飽和させた。前もって形成されたリポイドリポソームの上昇濃度（２．５−４５．６mMＰ₁ ）は、入手可能ペプチド（０．４２nM）５６．６％まで（Ｔｙｒ^10-125Ｉ）ＶＩＰの上昇結合を示した。結果は表１に示した。ＶＩＰについて用いたと同じ条件で、リポソームは極めて少量のカルボキシフルオレセインを取り込んだ。カルボキシフルオレセインは、脂質リポソームの完全性を調べるためにしばしば用いられる小極性分子（３７６ダルトン）である。これに対して、ＶＩＰとＣＦとの存在下で形成されたリポソームは、ＶＩＰよりもいくらか高い濃度のＣＦを含んでいた。後者の値は、リポソーム内へのＶＩＰとＣＦのカプセル内への取り込みを示している。これとともに、ＶＩＰとリポソームとの観察された結合は、リポソームの破壊と再シール化による包み込みを示すものではないことを、データは示している。表中の値は平均値±ｓ．ｄ．である。プローブ結合は、１００nM非ラベル化ペプチドと混合した１００nM ＣＦ又は０．２nM（Ｔｙｒ^10-125Ｉ）ＶＩＰと前もって形成されたリポソーム(２．３mM Ｐ₁)についての結合である。カプセル内への取り込みは、２．５μM非ラベル化ＶＩＰと混合した２．５μＭＣＦ又は１．７nM（Ｔｙｒ^10-125Ｉ）ＶＩＰを含む脂質溶液(２．６mM Ｐ₁)からリポソームを形成することによって行った。フリーのプローブは、０．５％ＢＳＡを含む５０mM ＨＥＰＳ、pH７．３で３回洗浄することによって除去した。ＣＦ値はリポソームを溶解化させた後に蛍光定量法により測定し、ＶＩＰ値はリポソーム関連放射活性を測定することによって決定した。最短時点（３０分）の検査で、過剰の非ラベル化ＶＩＰ（２mM）の存在下での（Ｔｙｒ^10-125Ｉ）ＶＩＰ−リポソーム複合体のインキュベーションにより最初のリポソーム結合ペプチドの約９０％が放出され安定状態が達成され、このことはペプチドは不可逆的に脂質二重層内に隔離されないことを示している。外因性の非ラベル化ペプチドの非存在下では、リポーソーム結合ペプチドの約５０％のゆっくりした遊離が図４に示したように２４時間にわたって観察された。脂質リポソームによるＶＩＰ結合の可逆性は次のようにして測定した。リポソーム（３．３nM Ｏ）を（Ｔｙｒ^10-125）ＶＩＰ（０．１１nM）でラベル化し、洗浄してフリーのペプチドを除去し、次いで各種の時間で２０℃で、２mM非ラベル化ＶＩＰの存在下（黒丸印）または非存在下（白丸印）で０．２mlバッファー中でインキュベートした。残ったリポソーム関連放射活性を測定し、最初の結合ペプチド（３５，４１０ＣＰＭ）の％として表わした。図５に示したように、（Ｔｙｒ^10-125Ｉ）ＶＩＰのリポソームへの分配は、非ラベル化ＶＩＰ（ＩＣ５０５６０μM；）の上昇濃度によって競争的に阻害された。結合ペプチド対入手可能なペプチドのプロットは、飽和等温式に典型的な直角双曲線の式〔ｙ＝（Ｂ_max・Ｘ）／（１／ｋ＋ｙ）、ここでＸ及びＹは、結合ペプチド及び入手可能なペプチドをそれぞれ示す〕に適用することができる。図５は、リポソーム（２．４mM Ｐ）による（Ｔｙｒ^10-125Ｉ）ＶＩＰの非ラベル化ＶＩＰ（１０nM−１mM）による競争的抑制の結果を説明している。データは、入手可能な放射ラベル化ペプチドの％として表わした平均値±ｓ．ｄを示している。図６は図５（実線）のデータから構成した飽和等温線を示す。点線は非飽和反応において期待される結合のレベルを示す。放射線標識されたペプチドの使用による入為結果の可能性を除外するために行った対照実験では、脂質リポソーム（２mM Ｐ）を非標識ＶＩＰ（０．２mM）に結合させ、リポソームを１％ＳＤＳで可溶化させ、Ｃ−１８カートリッジで抽出して、Paul，S.，Volle，D．J.，Beach，C．M.，Johnson，D．R.，Powell，M.J. 及び Massey，R．J．（１９８９）Science ２４４，１１８−１１６２にしたがって、Ｃ−１８カラムでＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。信頼すべきＶＩＰの特徴的な保持時間を示すペプチドピークが観察された。このピークで回収されたペプチドの量は、２１４nmの吸収によって評価すると、放射線標識されたＶＩＰ −結合実験から予想された値の７６％であった。ＰＣ／ＣＨ及びＰＧ／ＰＣ／ＣＨからそれぞれ調製された電気的に中性及び陰性のリポソームによるＶＩＰ（１００nM）の結合を比較した。各々の場合においてペプチド結合のレベルはリポソームの増加する濃度の範囲内で上昇した。結合したＶＩＰの％±ｓ．d．／μmol Ｐの値は、ＰＧ／ＰＣ／ＣＨリポソーム、２６．２＋３．４；ＰＣ／ＣＨリポソーム、１２．６±１．５であった。リン脂質の脂肪酸組成におけるわずかな差は干渉因子ではないものとして、このデータは、酸性脂質ヘッドグループとＶＩＰ（これはｌｙｓとａｒｇ残基に富む塩基性(b asic)ペプチドである）との間の静電気相互作用の安定化機能と一致している。D emel，R．A.及び DeKruyff，B．（１９８６）Biochim ．Biophys．Acta ４５７，１０９−１３２）に報告されているように、この研究で使用された温度で二重膜流動性を減少させることが期待される試薬であるコレステロールを包含していることは、リポソームによるＶＩＰの結合には影響を与えなかった（ＰＣ／ＰＧ／ＣＨ及びＰＣ／ＰＧリポソームにより結合したＶＩＰ／μモルＰ、それぞれ２６．２％及び２４．９％）。カプセル化したＶＩＰに対する溶媒効果は以下のように測定した。特に、脂質リポソーム（２．１mM Ｐ）による（Ｔｙｒ^10-125）ＶＩＰ（０．１４nM）のpH −依存性結合は、Ellis，K．J.及びMorrison，J．F.（１９８２）Meth.Enzymol. ８７，４０６−４２７に開示されているように、一定のイオン強度のバッファー（２５mMエタノールアミン、２５mMトリス、５０MMモルホリンエタンスルホン酸）中でいくつかのpH値で検定した。結果を表７に示す。この表は結合が極端なpH 値では低く、最適の結合が中性に近いpH（pH６−８）で観察されたことを示している。データは代表的な実験からの平均値±ｓ．ｄである。（Ｔｙｒ^10-125Ｉ）ＶＩＰ−リポソーム複合体を２５mM ＥＤＴＡ、１mM ＨＣｌ又は１ＭＮａＣｌで処理しても、表２に示すように、結合ペプチドの放出はほとんど又は全く起こらなかった。アルカリ性pH（１mM ＮａＯＩＩ）では、わずかではあるが有意の割合（１６）の結合放射能が再現性良く放出された。リポソームをＳＤＳで溶解すると上澄液にほとんど完全なペプチドの放出が起こった。これは、おそらくは混合デタージェント−脂質ミセルへのペプチドの取り込みを反映している。脂質リポソーム（４mM Ｐ）を（Ｔｙｒ^10-125Ｉ）ＶＩＰ（１nM）に結合させ、十分に洗浄して未結合放射能を除去し、次いで１mlの示された溶液で１０分間、２回処理した（２３℃）。放出された放射能は遠心処理により得られたプールした上澄液中で測定した。値は初期リポソーム結合放射能（７６，３００ＣＰＭ）の％であり、５０mM ＨＥＰＥＳ、pH７．３で行われた対照インキュベーションにおけるペプチド放出（４．２±３．４％）に関して補正した。ＶＩＰリポソーム生成物の分解を測定した。トリプシン濃度を増加させるにしたがい、４５分のインキュベーション後、遊離（Ｔｙｒ^10-125Ｉ）ＶＩＰの加水分解が上昇すること（利用可能なペプチドの８０％まで）は表８に示すように明らかであった。リポソーム結合（Ｔｙｒ^10-125Ｉ）ＶＩＰの場合には、放射能のほとんどは、１nM、５nM及び２６nMトリプシンで処理したリポソームと会合していた（それぞれ初期放射能の８２、８３及び７３％）。遊離のペプチドに比較して、ＴＣＡ可溶性だったのは、トリプシン処理後に回収したリポソーム会合放射能のより少ない方の部分であり、このことはタンパク質分解への感受性が低下していることを示唆している。酵素活性の非特異的な阻害を試験するために、塩基性(basic)ペプチドのメチルクマリンアミド（ＭＣＡ）共役体（ｐｒｏ−ｐｈｅ −ａｒｇ−ＭＣＡ）(１５μM)をリポソーム（１mM ｐ）の非存在下及び存在下で３０分間トリプシン（１０nM）でインキュベートし、次いで遠心処理によりリポソームを除去した。リポソームの存在下及び非存在下で蛍光強度の観察された増加は同様であった（それぞれ、８６８ＦＵ及び８８５ＦＵ）。図８は遊離ＶＩＰ（黒円）に比較してリポソーム結合ＶＩＰ（白抜円）のタンパク質分解性の加水分解が減少していることを示す。リポソーム（４．２mM Ｐ）を（Ｔｙｒ^10-125Ｉ）ＶＩＰ（０．３７nM）で標識し、バッファーで洗浄して遊離のペプチドを除去し、さまざまな濃度のトリプシンで５０mM ＨＥＰＥＳ、 pH７．３中、４５分間処理した。放出された放射能は遠心処理と上澄液の吸引により除去した。リポソームをアセトニトリル（３０％）で可溶化した。ＴＣＡを１０％に、ＢＡＳを０．１％になるように加え、酸可溶性の放射能を測定して加水分解の程度を決定した。データは初期リポソーム会合ペプチド（２８，２９０ＣＰＭ）の％として表現された平均値±ｓ．ｄであり、トリプシンの非存在下で観察されたＴＣＡ可溶性放射能に関して補正した。二重層流動性に対するＶＩＰの効果を測定した。まず、５−ＤＳおよび１６− ＤＳ標識脂質リポソームのＥＳＲスペクトルを得た。これらのスピン標識は通常脂質二層の表面（５−ＤＳ）および中心部（１６−ＤＳ）の近くの流動性を測定するために用いられる（たとえば、１１７．２２）。ＶＩＰ／脂質モル比が増大すると、段々にモーションパラメーター（motion p arameter)τ₀の値が減少することが表３に示すように１６−ＤＳ標識リポソームを用いて明らかになった。反対に、５−ＤＳプローブを用いて計算したオーダーパラメーター（order pa rameter)ＳはＶＩＰにさらすことにより増大する傾向がある。その効果は５００ μM ＶＩＰの濃度で統計的な有為差を示す。このデータは二層の疎水性中心部における著しいＶＩＰ誘導による流動性の増大と二層表面の近くの流動性における比較的小さいが有為な減少を示唆する。ＰＣ／ＰＧ／ＣＨリポソームの濃度は２．８mM Ｐ、（５−ＤＳ）および３．７mM Ｐ、（１６−ＤＳ）であった。５−ＤＳおよび１６−ＤＳ標識リポソームそれぞれのＳおよびτ₀の値は３回（５−ＤＳ）または４回（１６−ＤＳ）の実験からの平均値±ＳＤである。対照値（ペプチド無しのリポソーム）に対する ^* Ｐ＜０．０５はＡＮＯＶＡにより計算。この例から得られる一般的な結論はＶＩＰがモデル脂質二層の疎水性中心部に結合し、浸入することができるということである。その結合は中性pHで飽和かつ可逆性でありうる。結合等温線から誘導される分配常数の名目上の値（１．４× １０^-3Ｍ^-1）は他の両親媒性ペプチド、メリチン（melittin）について報告された値（Beschiaschvili，G.および Seeling，J．Biochemistry ２９，５２−５８）と同じ範囲内にある。飽和ＶＩＰ濃度におけるみかけの結合能は１モルＶＩＰ／１２．５モルリン脂質である。負に荷電したリポソームを含むＰＧによる観察されたＶＩＰ結合において多分静電的な相互反応が役割をはたしている。何となれば、ＶＩＰは塩基性ペプチドであるから。しかし、いくつか研究報告によれば、静電的な結合だけで観察された相互反応を説明することはできない。何となれば、（ａ）Mosior，M.およびMa Laughlin，S．（１９９２）Biochemistry ３１，１７６７−１７７３に報告されているように、他のいくつかの塩基性ペプチドが負に荷電したリポソームによってのみ結合されるという観察と対照的に、中性のリポソームもまたＶＩＰ結合活性を示す。（ｂ）ＰＧ／ＰＣ／ＣＨリポソームに結合したＶＩＰは酸、アルカリおよび高イオン強度溶媒により極微に放出されるかあるいは全く放出されない。（ｃ）負に荷電したリポソームによるＶＩＰ結合の至適pHは、Bergers，J．J. ，Vingerhoeds，M．H.，van Bloois，L.，Herron，J．N.，Janssen，L．H．M.， Fischer，M．J．E．および Crommelin，D．J．A．（１９９３）Biochemistry ３２，４６４１−４６４９に開示されているように、類似のリポソームによるリゾチームのような塩基性タンパク質の結合についてみられた最適なアルカリpHとは違い、中性範囲に存在する。および（ｄ）ＶＩＰによる処理は、脂質リポソームに取り込まれたイントロキシドスピン（introxide spin）−標識ステアリン酸プローブの可動性における有為な変化を引きおこした。これらの研究報告は、ＶＩＰのリン脂質頂部グループへの静電的な結合と二層への同ペプチドの疎水性領域の侵入との組合せの仮説と一致している。二層における種々の深さでの流動性の評価は脂肪酸プローブのカルボキシル基からの種々の距離においたスピン標識の動きを測定することにより得ることができる（たとえば、本研究で用いた５−ＤＳおよび１６−ＤＳ）。膜によるポリペプチドの結合は二層における種々の深さでの流動性に対する類似のもしくは逆の定性的な効果へ導く。Boggs，J．M．（１９８３），Membrane Fluidity in Biol ogy(Aloia，R．C．ed.)第II巻、８９−１３０頁、Academic Press，N．Y．参照。この例において、ＶＩＰとリポソームの結合は５−ＤＳのオーダーパラメーターＳにおける小さいが有為な増大、および１６−ＤＳのモーションパラメーター τ₀における著しい減少をもたらし、二層の表面の近くの減少した流動性およびその中心部における増大した流動性を示している。 Boggs，J．M.，Wood，D．D．および Moscarello，M．A．（１９８１）Biochem istry ２０，１０６５−１０７３に記載されているように、ミエリン塩基性タンパク質は、二層中心部と表面における流動性特性に同様の効果を生じると以前は記載されていた。ＶＩＰにさらした後５−ＤＳ可動性の減少はリン脂質頂部グループにおける静電的な結合から引き出されうる。ミエリン塩基性タンパク質について提案された機作と類似して、ＶＩＰの疎水性領域の二層への侵入は二層の中心部において、その表面に比べて、より大きな容量の増大を生ぜしめ、１６−ＤＳプローブに対する可動性の増大（減少したτ₀）を説明する。ＶＩＰの脂質結合性はその知られている構造特性からみて全く予期せざるものである。π−ヘリックス（４．４残基／ターン）またはねじれα−ヘリックス（ジー・エフ、ムッソ、エス・パッチィ、ティー・シー・リスカンプ、エス・プラバウ、イー・ティー・カイザーおよびジー・ベリセレビの Biochemistry ２７，８１７４−８１８１，１９８８）としてモデル化されているように、ＶＩＰのカチオン性および無極の残基がヘリックスの反対面に分離する。α−ヘリックス状のランフィフィリック（lamphiphilic）ペプチドが脂質二重層を結合することは周知である。サンソムの Prog．Biophys．Molec．Biol.，５５，１３９−２３５，１９９１）に報告されるように、例えば、実験条件により、リンメチやアラメチシンは脂質二重層の表面に沿って結合するかあるいは二重層スパン集合体を形成成する。同様に、α−ヘリックスの歪みにより無極および極性残基を分離させるペプチドは、カール、フリッペン−アンデルセン、ウマおよびバララムの(Pro c. Ntl．Acad．Sci．U.S.A．，８５，２９９−３０３，１９８８）に報告されるように、脂質二重層を結合することは知られている。ＶＩＰの場合、ロビンソン、ドレイクニーおよびマチスの Biopolymers，２１，１２１７−１２２８，１９８２；ヘームト、ロビンソンおよびマチスの Biopolymers，２２，１００３−１０２１，１９８３；およびエム・ボダンスキー、エイ・ボダンスキー、クラウスナーおよびセイドの Bioorganic Chem．３，１３３−１４０，１９７４に報告されるように、中心のセグメントスパン残基１２〜２１は無極性のものに点在するカチオン性残基を含み、また膜結合活性をもつペプチド凝集体を生成する上で重要である。ＶＩＰにおけるトリプシン感受性結合のすべてはこの領域（Ｒ¹²−Ｌ¹³ ，Ｒ¹⁴−Ｋ¹⁵，Ｋ¹⁵−Ｑ¹⁶Ｋ²⁰−Ｋ²¹，Ｋ²−Ｙ₂₂）に位置する。リポゾーム関連ＶＩＰのトリプシン分解の減少が観察されることは、このセグメントが脂質二重層に埋没することと一致する。ＶＩＰの生物学的作用はかなり様々であり、このニューロペプチドはセイドの Peptides ５，１４９−１５０，１９８４およびポールとエバディのNeurochem ．Int．２３，１９７−２１４，１９９３（補遣１）に報告されるように、無関係のシグナル形質導入系を活性化することは明らかである。ＶＩＰはシプナス伝達、平滑筋トーン、トランスメンブラン水やイオンフラックス、神経内分泌およびＴ−とＢ−リンパ球免疫活性の公知のモジュレータである。ＶＩＰ−脂質二重層反応が重要であるいくつかの方法がある。ＶＩＰのメカニズムあるいは除去や不活性に関する一定の証拠がない場合、タンパク分解はペプチドの生物効果の終了によることは通常想像された。この例では、この系の飽和性の限界内で、大きな割合の放射能ラベルしたＶＩＰ（６０％まで）は脂質リポソームにより結合していることが分かった。膜に分配することは細胞外液の可溶性ペプチドの利用性を支配する因子であることを指摘している。第２に、ＶＩＰを脂質粒子あるいは可溶性脂質により結合することにより、ペプチドを加水分解するのを安定化させ、別々のターゲット細胞に分配することができる。第３に、ＶＩＰを脂質二重層を分配すると、ペプチドを特定のコンホメーションに限定するから、膜リセプターとの相互反応を修飾する。最後に、ニューロン貯蔵リポソーム内および神経末端からの放出部位でＶＩＰが局部濃縮されると、二重層の流動性の変化を経て十分に膜機能を直接モジュレートすることができる。例３ＶＩＰやカルモジュリンのリポソーム含有混合物を例１に記載のように調製した。表４に記載の成分混合物の高血圧活性の測定は上記した方法で同じように行なった。以下に示す動脈血圧の読みは、成分混合物の注入開始後５分で計った。本発明を最も実際的でかつ望ましい態様であると現在考えられる点を考慮して記載したが、本発明は開示される態様に限定されるべきではなく、反対に、添付請求の範囲の精神と範囲内で包含される各種の変形や均等な変更をカバーするものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＣＪＡ６１Ｋ 37/02 ＡＣＤＡＣＬＡＣＪＡＤＤＡＣＬＡＧＺＡＤＤ 47/42 ＡＧＺ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ルビンシュタイン，イスラエルアメリカ合衆国 60035 イリノイ州ハイランドパーク，レキシントンストリート 2999

Claims

【特許請求の範囲】１．バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドを標的組織に運ぶ方法であって、下記のステップを含む方法；前記バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド（ＶＩＰ）がリポソーム上及び内に発現されるような条件下において、前記バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドリポソーム生成物を形成するステップ、及び前記ＶＩＰリポソーム生成物の生物学的有効量を前記標的組織に投与するステップ。２．前記の形成するステップが、さらに、コレステロール、ホスファチジルコリン及びホスファチジルグリセロールを含むリポソーム内及び上の前記バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドをカプセル化することを含む請求の範囲第１項記載の方法。３．前記の形成するステップが、さらに、前記バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドをレセプター応答性コンフォメーションで結合し、それによって前記バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドの生物学的活性を増強することを含む請求の範囲第２項記載の方法。４．前記の形成するステップが、さらに、前記バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドを前記リポソームにおいてらせんコンフォメーションで結合することを含む請求の範囲第２項記載の方法。５．前記生物学的有効量が、前記バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドのカプセル形態における治療上有効量よりも約１０−２０重量％少ない量である請求の範囲第２項記載の方法。６．ＶＩＰリポソーム生成物が高血圧の治療のために静脈内に投与される請求の範囲第２項記載の方法。７．前記の投与するステップが、ＶＩＰリポソーム生成物と共に生物学的有効量のカルモジュリンを投与することを含む請求の範囲第１項記載の方法。８．前記の投与するステップが、リポソーム内及び上で発現された、あらかじめ形成されたＶＩＰ−カルモジュリン混合物を用いて行われる請求の範囲第７項記載の方法。９．コレステロール、ホスファチジルコリン及びホスファチジルグリセロールを含むリポソーム内にカプセル化されたバソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドリポソーム生成物。 10．前記バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドは前記リポソームにレセプター応答性コンフォメーションで結合し、それによって前記バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドの生物学的活性が増強されている請求の範囲第９項記載のバソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド。 11．前記バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドは前記リポソームにおいてらせんコンフォメーションで結合する請求の範囲第９項記載のバソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド。 12．生物学的に有効量のＶＩＰリポソーム生成物とカルモジュリンとの混合物を含むバソアクティブ組成物。 13．ＶＩＰとカルモジュリンとの混合物とがリポソーム内及び上に発現されたものである請求の範囲第１２項記載のバソアクティブ組成物。 14．生物学的活性が増強され、副作用が軽減されたバソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドを製造する方法であって、下記のステップを含む方法；リポソーム中に前記バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドをカプセル化するステップ。 15．前記のカプセル化するステップが、さらに、コレステロール、ホスファチジルコリン及びホスファチジルグリセロールを含むリポソーム中にバソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドをカプセル化することを含む請求の範囲第１４項記載の方法。 16．前記のカプセル化するステップが、さらに、前記バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドをレセプター応答性コンフォメーションで結合することを含む請求の範囲第１５項記載の方法。 17．前記のカプセル化するステップが、さらに、前記バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチドを前記リポソームにおいてらせんコンフォメーションで結合することを含む請求の範囲第１６項記載の方法。 18．哺乳動物の血圧をコントロールする方法であって、下記のステップを含む方法；前記哺乳動物に請求の範囲第９項に記載のＶＩＰリポソーム生成物又は請求の範囲第１２項に記載の組成物を有効量投与するステップ。