RU2174843C2

RU2174843C2 - Липосомная композиция человеческого кальцитонинного генного пептида и способ ее получения

Info

Publication number: RU2174843C2
Application number: RU97119740/14A
Authority: RU
Inventors: Веихан ВО (CN); Веихан Во
Original assignee: Бейджин Ричина Биотекнолоджикал Ко., Лтд.
Priority date: 1996-11-29
Filing date: 1997-11-28
Publication date: 2001-10-20
Also published as: US5932244A; IL122329A0; DE69710996D1; CN1185974A; ATE214288T1; JPH10245346A; CN1055640C; EP0845269B1; DE69710996T2; EP0845269A3; EP0845269A2

Abstract

Изобретение относится к медицине. Фармацевтическая композиция ЧКГП содержит липосомы из натурального соевого фосфолипида при весовом соотношении ЧКГП с фосфолипидом 1-2 к 100-8000. Период полураспада композиции более 72 ч и она также имеет более продолжительную устойчивость. Композицию можно вводить внутривенно путем опрыскивания слизистой рта и носа в количестве 0,1-10 пг ЧКГП на килограмм веса тела для лечения гипертонии и застойной сердечной недостаточности. Биологическая доступность составляет приблизительно 80%. Изобретение обеспечивает эффективную профилактику и лечение сердечно-сосудистых заболеваний. 4 с. и 4 з.п. ф-лы, 8 табл.

Description

Изобретение относится к липосомному комплексу композиции человеческого кальцитонинного генного пептида (ЧКГП) и ее получению, в частности к продукту, полученному путем соединения фосфолипида с ЧКГП.

Человеческий кальцитонинный генный пептид α -типа (ЧКГП) является эндогенным нейромодулятором и до настоящего времени известен как самое эффективное сосудорасширяющее средство. Его продукт поставляется на мировой рынок. Но, как и другие пептиды, ЧКГП отличается неустойчивостью при хранении (in vitro, в водном растворе) и циркуляции (in vivo), его период полураспада составляет 9-12 мин и поэтому такой пептид трудно использовать в качестве лекарственного средства для клинического применения.

Чтобы повысить возможность использования ЧКГП как клинического лекарственного средства, в основу изобретения положена задача создания липосомного ЧКГП и способа его получения, чтобы за счет связи фосфолипидов с ЧКГП получить очень устойчивый и эффективный продукт. Липосомный ЧКГП может выделять ЧКГП из липосом постепенно, чтобы обеспечить продолжительное действие с периодом полураспада 72 мин in vivo, что позволяет эффективно использовать его для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Сущность изобретения
Для решения поставленной задачи предложена фармацевтическая композиция ЧКГП, содержащая липосомы, полученные из натуральных соевых фосфолипидов. Она отличается тем, что весовое отношение ЧКГП к соевым фосфолипидам составляет 1-2 к 100-8000, предпочтительно 1,5-2 к 2500-6000.

Наиболее предпочтительной является фармацевтическая композиция липосомного ЧКГП, содержащая 20-2000 пг ЧКГП на 5 мл композиции.

В указанную композицию липосомного ЧКГП можно добавить маннит, сорбит, изотонический физиологический раствор и декстрозу или другие пригодные для фармацевтических целей материалы.

Также предложен способ получения фармацевтической композиции липосомного ЧКГП, заключающийся в том, что
(1) добавляют стерилизованную дистиллированную воду для очистки и сушки соевых фосфолипидов при весовом отношении липида к воде более 1 к 1000, после чего выполняют разрушение ультразвуком для получения маленьких одномембранных пузырьков двухслойного липида;
(2) смешивают ЧКГП, растворенный в H₂O в соотношении пептида к H₂О 1: 1000-25000, с указанными соевыми фосфолипидами в соотношении пептида к липиду 1-2:100-8000, предпочтительно 1,5-2:2500-6000, выполняют разрушение ультразвуком и инкубируют при 37^oC в течение 30-60 мин для получения устойчивой композиции липосомного ЧКГП.

Полученную таким образом композицию липосомного ЧКГП можно дополнительно подвергнуть лиофилизации, а затем растворить в H₂О для получения водного раствора, содержащего 20-2000 пг ЧКГП на 5 мл раствора.

Также предложен способ лечения гипертонии и застойной сердечной недостаточности человека посредством назначения пациенту упомянутой выше фармацевтической композиции липосомного ЧКГП. Это способ включает в себя внутривенное введение и опрыскивание слизистой рта или носа. При внутривенном введении липосомного ЧКГП его доза составляет 0,1-10 пг ЧКГП на килограмм веса тела. Биологическая доступность липосомного ЧКГП составляет приблизительно 80%.

В дальнейшем изобретение описывается более подробно.

Теоретические основы приготовления липосомного комплекса ЧКГП
Аминокислотный состав и последовательность в ЧКГП характеризуется следующим:
(1) 8 из 37 аминокислот ЧКГП являются полярными аминокислотами с гидрофильными боковыми цепями, и 16 из 37 аминокислот являются аполярными с гидрофобными боковыми цепями;
(2) 4 из 8 полярных аминокислот являются основными аминокислотами с положительными зарядами в H₂О, и pI ЧКГП равно 10. Одна молекула ЧКГП содержит 2 аргининновых, 2 лизиновых (Lys) и 1 аспарагиновую (Asp) кислоту. При этом Arg и Lys имеют положительный заряд, a Asp - отрицательный при физиологическом уровне pH. ЧКГП с соотношением ( ∑ Lys + ∑ Arg)/( ∑ Glu + ∑ Asp) = 4 является очень сильным основным пептидом. При физиологическом уровнем pH ЧКГП положительно заряжен тремя положительными зарядами. ЧКГП содержит 16 гидрофобных аминокислот и 6 гидрофильных аминокислот и является типичной амфильной молекулой.

Путем анализа фосфолипидной композиции, в частности соевого фосфолипида, было установлено следующее:
(1) кислые липиды с отрицательными зарядами в головных группах в H₂O составляют более 40% всего фосфолипида,
(2) ненасыщенные жирные кислоты в соевых фосфоглицеридах составляют приблизительно 70% и обеспечивают защитный эффект против окисления и гидролизации,
(3) при предельно низкой концентрации липида (в весовом соотношении липид : H₂O < 1:100) термодинамически стабильным состоянием является дисперсия одностеночных пузырьков двухслойных соевых фосфолипидов. Размер этих пузырьков колеблется от 20 до 50 нм.

Согласно изобретению, компоненты соевых фосфолипидов анализировали путем тонкослойной хроматографии и газовой хроматографии, корректировали и количественно анализировали в сравнении со стандартными фосфолипидами (Sigma). Соевые фосфолипиды, используемые для клинических инъекций, содержат 44,9% кислотных фосфолипидов, содержащих фосфатидилсерин (17,2;), фосфатидилглицерин (8,1%), фофсфатидилиносил (15,2%) и кардиолипин (4,4%) с богатыми отрицательными зарядами в H₂O, линолевую кислоту (58,31%), пальмитиновую кислоту (24,36%), линоленовую кислоту (7,32%), олеиновую кислоту (5,9) и стеариновую кислоту (3,88%), состоящих из 71,53% ненасыщенных жирных кислот и 28,47% насыщенных жирных кислот (). Как отмечалось выше, липосомные структуры формируются спонтанно в H₂O фосфолипидными молекулами из множества разных фосфолипидов, и наиболее часто используемой композицией является натуральный фосфолипид, извлеченный из клеточной мембраны, такой как соевый фосфолипид (компании Imperial Chemical Industrial Ltd. and National Research Development Corporation, патент Великобритании 1523965, 1977). Маленькие одномембранные липосомы имеют диаметр приблизительно от 200

до 500

и состоят из одного липидного двухмолекулярного слоя, окружающего водную камеру. Маленькая одномембранная липосома характеризуется следующим:
(1) отсутствием осмотической чувствительности,
(2) около 70% всех липидов расположено в наружном лепестке пузырька,
(3) при предельно низкой концентрации липидов термодинамически стабильным состоянием является дисперсия одномембранных пузырьков двухслойных липидов (Gruler Н., Микроструктура и транспортные свойства пузырьков с одной оболочкой и монослойных липидных смесей и липидно-протеиновых соединений, Липосомные лекарственные средства и функции иммунокомпетентных клеток, под редакцией Клода Николу, 1981, 99 15-27);
(4) среда для больших липосом (MLV и LUV) быстро очищается в результате циркуляции после в/в приема, при этом маленькие однослойные липосомы обеспечивают потенциал для постепенного высвобождения лекарства в ток крови и поступление в ткани, кроме ретикулоэндотелиальных клеток. Особое внимание уделялось липосомам как модели биомембраны, которая обеспечивает возможность применения in vivo в медицине и исследованиях (Yang F.Y. Применение липосом в исследовании биомембран и в фармакологии, SHENWUHUAXUE YU SHENWUWULI JINZHAN (Биохимия и Биофизика, 1977, 6:36). Соевые фосфолипиды являются новыми липидами, содержащимися в биомембране, которые использовались для получения искусственных мембран, таких как липосомы (Группа по биомембранам. Институт биофизики, Китайская Академия Наук, SEHWUHUHUUAXUE YU SHENGGWU-WULI JINXHAN (Биохимия и биофизика, 1978 4:1).

С помощью разрушения ультразвуком и инкубации можно получить возможность за счет достаточного взаимодействия ЧКГП и молекул липидов расположить их полярные группы наружной поверхности мембраны в результате ионной связи с H₂O. Отрицательно заряженные группы из головы фосфолипида связаны с положительно заряженными группами из аминокислотных остатков ЧКГП. Аполярные группы располагаются в гидрофобной области мембраны за счет гидрофобной силы, включая хвосты фосфолипидов и гидрофобные аминокислотные остатки ЧКГП. При этом достигается термодинамическая стабильность липосомного ЧКГП с увеличением периода полураспада от 9-12 до 72 мин и возможность длительного хранения в водном растворе в течение двух лет (первоначальное время хранения было 15 дней). Существенно снижается эффективная доза липосомного ЧКГП (до 10^-5), которая может поглощаться при введении через слизистую рта, носа и прямой кишки, причем биологическая доступность составляет около 80%. Клинические испытания показали заметное терапевтическое воздействие липосомного ЧКГП на 200 пациентах с гипертонией и застойной сердечной недостаточностью, без каких-либо побочных эффектов.

Пример 1
Получение липосом из соевых фосфолипидов
25 г соевых фосфолипидов выпаривали с вращением (с помощью вращающегося выпаривателя модели XZ-6, Zhongkeyuan Kelong Corp. ) из раствора хлороформ/метила (с объемным соотношением 2:1) для получения тонкой пленки на позолоченных стенках колбы с круглым дном емкостью 1000 мл.

После удаления последних заметных следов растворителя проводили выпаривание с вращением в течение 15 мин, после чего сушили еще 15 мин в атмосфере азота. Липид суспендировали в 250 мл дистиллированной воды путем встряхивания с несколькими стеклянными шариками в шейкере (HZS-D, выпускаемый компанией Harbin Donglian Corp.), а затем обрабатывали ультразвуковым дезинтегратором (DF-6P3 c, выпускаемым Ningbo Xinyi Research Institute) в течение 30 мин.

Восстановление ЧКГП в липосомной мембране
10 мг ЧКГП растворяли в 250 мл дистиллированной воды и перемешивали в течение 5 мин. Раствор ЧКГП смешивали с описанным выше липосомным раствором (250 мл), перемешивали в течение 5 мин и подвергали разрушению ультразвуком в течение 2-3 мин, трижды с интервалом 3-5 мин (ультразвуковым дезинтегратором DF-6P3 c, выпускаемым Ningbo Xinyi Research Institute). Затем смесь инкубировали при 37^oC в течение 40 мин (используя звукового дезинтегратора на бане, выпускаемого компанией Harbin Donglian Corp.).

Осаждение липосомного ЧКГП
Восстановленный раствор осаждали с помощью ультрацентрифуги (400000 х г в течение 40 мин при 4^oC, VAC 602, WEB Лейпциг, Германия) и трижды промывали дистиллированной водой.

Лиофилизация и растворение
Осажденный липосомный ЧКГП подвергали лиофилизации с помощью лиофилизатора LGJ, выпускаемого Инструментальным заводом при Академии военно-медицинских наук (Китай)) и растворяли в дистиллированной воде (пропуская через 6 стерилизационных фильтров) (липид:H₂O = 1:1000), затем полученный раствор стерилизовали при 100^oC в течение 30 мин и закрывали.

Пример 2
Повторяли процедуру, описанную в примере 1, за исключением того, что использовали другие весовые соотношения пептид : липид. Сравнивали восстановление ЧКГП в мембране, эффективность восстановления и устойчивость готового продукта, как показано в таблице 1 в конце описания.

Методика: липосомный ЧКГП готовили в соответствии с процедурой, описанной в примере 1, при разных весовых соотношениях пептид:липид, после чего его центрифугировали и определяли содержание ЧКГП в надосадочной жидкости как свободный ЧКГП без восстановленного в мембране. После этого каждую группу образцов делили на две группы: одну хранили при -70^oC в азоте после стерилизации и герметизации в качестве контрольного образца, а вторую растворяли в воде в весовом соотношении липид:вода = 1:1000 и хранили при комнатной температуре после стерилизации и герметизации. Через 24 месяца измеряли сосудорасширяющий эффект образцов в % от контрольного образца. Каждый показатель является средним ± ДО (допустимым отклонением) для пяти независимых данных.

Из таблицы 1 видно, что если соотношение липид:пептид выше 1000, ЧКГП восстанавливается в мембране, отставляя небольшое количество свободного ЧКГП, а сосудорасширяющий эффект остается выше 95% после хранения в течение 2 лет.

Пример 3
В следующем испытании повторяли процедуру, аналогичную примеру 1, за исключением того, что использовали другую ионную силу для изучения влияния ионной силы в растворе на эффективность восстановления ЧКГП в липидной мембране. В таблице 2 в конце описания показано влияние ионной силы на восстановление ЧКГП.

Методика: в водном растворе NaCl разной концентрации восстанавливали ЧКГП в мембране соевого фосфолипида, после чего его центрифугировали и определяли содержание свободного ЧКГП в надосадочной жидкости, как % от общего количества ЧКГП. Весовое соотношение пептид:липид составляло 1:1000, причем каждый показатель является средним ± ДО для пяти независимых данных.

Из таблицы 2 видно, что эффективность восстановления уменьшалась с увеличением ионной силы в растворе. Очищенный раствор H₂O может обеспечить благоприятную среду для обеспечения взаимодействия и связи между липидами и пептидами.

Сравнительный пример 1
Повторяли процедуру примера 1, за исключением использования двух незаряженных липидов вместо соевых фосфолипидов.

Путем определения содержания свободного ЧКГП в надосадочной жидкости после центрифугирования и хроматографического анализа было доказано, что эффективность восстановления ЧКГП в мембране соевых фосфолипидов составляла 99,9, а в мембранах PC и PE только 21,2 и 30,3 соответственно, свидетельствуя тем самым, что отрицательный заряд фосфолипидов очень важен для успешного восстановления ЧКГП в мембране (табл.3, в конце описания).

Сравнительный пример 2
Для приготовление липосомного ЧКГП использовали три разных фосфолипида - соевый фосфолипид (SP), фосфатидилхолин (PC) и фосфатидилэтаноламин (PE) - и анализировали структурную целостность ЧКГП в трех липосомных мембранах при хранении в течение 24 месяцев с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР), как показано в таблице 4 в конце описания.

Методика: ЧКГП образца извлекали кислым раствором и анализировали с помощью ЖХВР с обратной фазой, при этом во время хроматографии регистрировали время удерживания и пиковую площадь ЧКГП. Каждый показатель является средним ± ДО для пяти независимых экспериментальных данных. Для коррекции времени удерживания использовался стандартный ЧКГП (BACHEM, Швейцария).

Результаты в таблице 4 показывают, что после хранения в течения 24 месяцев наблюдалось незначительное изменение чистоты ЧКГП на 1,4 %, что свидетельствовало о том, что ЧКГП, восстановленный в мембране соевого фосфолипида, очень устойчив при хранении, а мембраны PE и PC нестабильны и целостность ЧКГП оставалась только на уровне 64,4 и 65,1%.

Сравнительный пример 3
В следующем испытании для приготовления липосомного ЧКГП и сравнения с липосомным ЧКГП из соевых фосфолипидов использовали фосфатидилхолин (PC) и фосфатидилэтаноламин (PE). Определяли сосудорасширяющий эффект трех разных липосомных ЧКГП и сравнивали, как показано в таблице 5 в конце описания.

Методика: эксперименты выполняли на новозеландских белых кроликах весом 2,5-3,5 кг, которых анестезировали натрий пентобарбиталом (30 мг/кг, в/в).

Кроликов помещали в приспособление для фиксации головы и измеряли диаметр глазных сосудов (конъюнктиву) с помощью микроскопа, снабженного телекамерой, подключенной к видеомонитору. Изображения записывали в компьютер и впоследствии диаметры сосудов измеряли с помощью программного анализатора изображений. Системы для анализа микроциркуляции были приобретены в компании DAHNG Co. , Китай. В глаз кролика закапывали 10 мкл разжиженных образцов и изображения глазных сосудов записывали в компьютер.

Значения ED₅₀ (x10¹⁸ мг/мл) сосудорасширяющего эффекта липосомного ЧКГП измеряли во время хранения в течение 24 месяцев. Небольшие изменения соевых фосфолипидных мембран липосомного ЧКГП уменьшались в 100-1000 раз через 24 месяца, свидетельствуя, что отрицательные заряды в липидной мембране очень важны для стабильной связи между пептидом и липидом.

Эксперимент 1
Анализ комплекса ЧГКП с липосомами
Методика: липосомный ЧКГП и свободный ЧКГП анализировали по методу Берка (Берк Д и Марчинка К., Гель-хроматография в методах разделения. Изд. Дейлз, 1984, 217). Образцы ЧГКП восстанавливали с соевым фосфолипидом или без него (1,0 мл в 0,1 М три-HCl, при pH 8,8) помещали в тонкую колонку размером 1,5 х 46 см (сефадекс G-50) в 0,1М три-HCl, pH 8,8. Голубой декстран 2000 (Pharmacia) и ³²PO₄ (Англия) смешивали с отдельным образцом для метки Vo и Vi соответственно.

Свободный ЧКГП в тонкой колонке (сефадекс G-50) при хроматографии имел Kd = 0,52, а липосомный ЧКГП - Kd = 0,44, так же как и голубой декстран 2000, свидетельствуя, что образовался комплекс липосом-ЧКГП. Данные, полученные путем гель-фильтрации, показаны в таблице 5.

Каждый показатель представляет результат отдельного эксперимента.

Определение связи ЧКГП с соевым фосфолипидом показано в таблице 6 в конце описания.

Из таблицы 6 видно, что после восстановления ЧКГП с соевым фосфолипидом образовался гораздо больший комплекс ЧКГП с липидом, чем ЧКГП, т.е. свойства ЧГКП и соевого фосфолипида обеспечивают новые возможности для получения устойчивого липосомного ЧКГП.

Эксперимент 2
Анализ физической и химической стабильности липосомного ЧКГП
Ясно, что любая липосомная формула должна иметь соответствующую устойчивость в течение интервала времени между ее приготовлением и конечным использованием, чтобы быть фармацевтическим носителем. Поверхность липосомной мембраны, как уже отмечалось выше, имеет большое количество отрицательных зарядов, которые предотвращают изменение ее размера, вызванного слиянием липосом. В окружении большого количества воды отрицательно заряженные частицы находятся в термодинамически стабильном состоянии и большое количество ненасыщенных хвостов фосфолипида может снизить вероятность вхождения молекулы воды в двойной слой липида, предотвращая деградацию молекул липида и пептида в результате автогидролиза и самоокисления.

Фосфолипиды подвергаются гидролизу в водной среде, что приводит сначала к образованию соответствующего лизофосфолипида и жирной кислоты. При хранении предложенных липосом или липосомного ЧКГП содержание лизофосфолипида определяли как критерий химической устойчивости с помощью тонкослойной хроматографии (TLC), а размер липосом измеряли с помощью гель-фильтрации, наблюдая положение пика элюции как критерий физической стабильности (Szoka F., et al. Сравнение свойств и способы получения липидных пузырьков (липосом), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1980 9:467.5).

Анализ содержания LPC
Изменения содержания LPC в соевых фосфолипидных липосомах. Условия хранения: при 25^oC, образцы в H₂O, весовое соотношение липид : H₂O = 1:1000, стерилизация при 100^oC в течение 30 мин и герметизация.

Методика: aнализ содержания LPC в липосомах выполняли с помощью TLC, силикагель H (тип 60) был получен из компании E, Mere, Германия. Стандартный LPC поставлялся из компании Sigma в качестве контроля LPC в образцах, его значение Rf было 0,04 в экспериментальных условиях. После этого образцы стерилизовали при 100^oC в течение 30 мин, химическую устойчивость липосомной мембраны определяли с помощью анализа содержания LPC с интервалом 3 месяца в процессе хранения. Каждый показатель означает среднее при ± ДО для 5 независимых TLC (т.е. n=5). Смесь образцов и стандартного LPC использовали для коррективного анализа с помощью однонаправленной TLC и двунаправленной TLC, чтобы показать, что LPC в смеси был единственным компонентом на силикагеле.

В течение 24 месяцев хранения содержание LPC постепенно возрастало от 2,1±0,34% до 4,7±0,51% (p<0,01) для соевых фосфолипидных пузырьков и от 1,9±0,22% до 3,4±0,46% (p<0,01) для липосомного ЧКГП соответственно. Процент разложения фосфолипидных молекул был 2,6 и 1,5% для липосом и липосомного ЧКГП соответственно, свидетельствуя, что восстановленный ЧКГП может повысить стабильность мембраны за счет своих положительно заряженных групп, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными группами фосфолипида.

Размеры липосом определяли с помощью гель-фильтрации (Kd) в процессе хранения. Значения Kd не изменились ни для соевых фосфолипидных липосом, ни для восстановленных липосом с ЧКГП, свидетельствуя, что предложенные липосомы термодинамически стабильны в среде с весовым соотношением 1000:1 (H₂O : фосфолипид) в течение 24 месяцев хранения после стерилизации.

Эксперимент 3
Анализ устойчивости ЧКГП, восстановленного в липосомной мембране
Устойчивость ЧКГП, восстановленного в липосомной мембране, наблюдали с помощью (а) тонкой гель-фильтрации на сефадекс G-50 для измерения диссоциации ЧКГП от липосомы; и (б) системы наблюдения за микроциркуляцией, чтобы увидеть сосудорасширяющий эффект, а также в сравнении со свободным ЧКГП в процессе хранения.

A. Устойчивость связи ЧКГП с мембраной (таблица 8, в конце описания).

Методика: в процессе хранения восстановленной липосомы после стерилизации при 100^oC в течение 30 мин свободный ЧКГП, диссоциированный от липосомы, определяли с помощью гель-фильтрации через каждые 3 месяца. Абсорбция ЧКГП при ультрафиолетовом излучении 206 нм составляла 0,52 коэффициента распределения (Kd) при коррекции со стандартом ЧКГП. При этом значении Kd авторы смогли изучить, диссоциируется ли ЧКГП от восстановленной липосомы в процессе хранения. Была проведена тонкая гель-фильтрация на сефадекс G-50, каждый показатель является средним значением при ± ДО для трех независимых измерений.

При хранении в течение 24 месяцев ЧКГП, восстановленный в липосомной мембране, не диссоциировался в свободный ЧКГП при наблюдении абсорбции (при 206 нм) элюентного раствора при Kd=0,52. Этот результат показал, что ЧКГП может образовывать очень устойчивый комплекс с соевыми фосфолипидными пузырьками с помощью предложенной экспериментальной процедуры благодаря характеристикам их молекулярной структуры. Все образцы хранили при 25^oC после стерилизации и герметизации. Отношение липид : H₂O составляет 1:1000 в восстановленной липосоме соевого фосфолипида.

В. Измерение сосудорасширяющего эффекта ЧКГП
ЧКГП является эндогенным нейромодулятором и самым эффективным сосудорасширяющим средством, которое известно авторам изобретения. Была исследована эффективность ЧКГП, восстановленного в липосомной мембране соевого фосфолипида, и проведено сравнение со свободным ЧКГП в H₂O и плазме человека в процессе хранения (таблица 7,в конце описания).

Методика: эксперименты выполнялись на новозеландских белых кроликах весом 2,5-3,5 кг, которых анестезировали натрий пентабарбиталом (30 мг/кг, в/в). Кроликов помещали в приспособление для фиксации головы и измеряли диаметр глазных сосудов (конъюнктивы) с помощью микроскопа, снабженного телекамерой, подключенной к видеомонитору. Изображения записывали в компьютер и впоследствии диаметры сосудов измеряли с помощью программного анализатора изображений. Системы для анализа микроциркуляции были приобретены в компании DAHENG Co. , Китай. 10 мкл разжиженных образцов закапывали в глаз кролика и изображения глазных сосудов записывали в компьютер. Диаметр сосудов на изображениях анализировали с помощью микроциркулярной программы.

В H₂O сосудорасширяющий эффект ( % диаметра) свободного ЧКГП и ЧКГП, восстановленного в липосомной мембране соевого фосфолипида, изменялся от +187±8,9% до +83±12,4% (p<0,001, n=5) и от +198±16,4% до +196±14,3% соответственно, после хранения в течение 90 дней. В плазме человека их эффективность уменьшалась от +195±16,49% до +25±6,8% (p<0,001, n= 5) и от +198±19,2% до +184±6,1% соответственно, после инкубации в течение 48 ч. Эти результаты свидетельствуют, что восстановленный ЧКГП в липосомной мембране более устойчив по сравнению со свободным ЧКГП.

Терапевтический эксперимент 1
Роль липосомного ЧКГП в лечении пациентов с застойной сердечной недостаточностью (ЗСН)
Пациенты: исследования проводились на 16 пациентах с ЗСН - семи мужчинах и девяти женщинах, средний возраст 66,3 года (от 54 до 75 лет). Шесть из них имели IV стадию согласно Нью-Йоркской ассоциации здоровья (NYHA), семь - III стадию и три - II стадию (Bruce R.A.Mod. Concepts Cardiovasc. Dis. 1956, 25: 321-326). Все пациенты принимали липосомный ЧКГП, прекратив прием других лекарств, таких как дигоксин (digoxin) на три дня.

Лекарственные средства: липосомный ЧКГП, приготовленный в соответствии с примером 1, использовали для лечения пациентов, содержащий 20 пг ЧКГП на 5 мл раствора. Содержание лекарства 2000 BU/5 мл.

Способ применения:
Через слизистую: через слизистую рта и носа 40-80 BU (1-3 капли) три раза в день, через прямую кишку 2000 BU 3 раза в день.

Внутривенно: 2000-8000 BU (2-4 ампулы) липосомного ЧКГП добавляли к 5% GS или 100-250 мл 0,9% раствора NaCl, 1 раз в день.

Измерения: частота дыхания, везикулярный тон, частота и ритм сердечных сокращений, величина печени, степень набухания, вес, объем мочи и сердечную деятельность с помощью ЭКГ измеряли до и после приема лекарства. Ежедневно проводили ультразвуковую кардиографию.

Результат: липосомный ЧКГП имел устойчивый положительный эффект на пациентах с ЗСН (табл. 8). Большинство пациентов почувствовали симптоматическое улучшение на следующее утро. У 9 пациентов наблюдалось доминантное улучшение сердечной деятельности, у 6 - эффективное, и только у одного не было отмечено изменений. Ни один из пациентов не жаловался на побочные эффекты, такие как головная боль, приливы крови. Лекарство не вызывало гипотонии и не оказало воздействия на функцию печени или почек во время лечения.

Дискуссия: застойная сердечная недостаточность (ЗСН) обычно вызывается снижением минутного сердечного выброса в результате сужения миокарда, улучшение которого и является основной задачей при лечении пациентов с ЗСН. Кальцитонинный генный пептид (КГП) - это нейропептид, способный оказывать сосудорасширяющее, положительным хронотропным и ионотропным действием на сердце, что позволяет использовать его для лечения ЗСН. Недавние исследования доказали, что внутривенное введение КГП (8,0 нг/кг/мин) на 8 ч вызывает снижение давления в правой артерии, легочной артерии, легочно-артериальном клине также систолического давления.

При этом повышается минутный сердечный выброс, stroke volcermt, почечный кровоток и клубочковая фильтрация. Лечение 16 пациентов с ЗСН препаратом липосомного ЧКГП дало положительные результаты, которые можно охарактеризовать следующим:
(1) ЧКГП постепенно выделяется из липосом, обеспечивая продолжительный эффект, среднее время действия - 10 ч, что в 5 раз превышает известные из других источников результаты применения ЧКГП,
(2) легко абсорбируется слизистой рта, носа и прямой кишки,
(3) биологическая доступность липосомного ЧКГП в 10 раз превышает известную из других источников.

Терапевтический эксперимент 2
Роль липосомного ЧКГП в лечении пациентов с гипертонической болезнью
Материалы и методы:
Пациенты: 21 госпитализированный пациент с гипертонической болезнью, 10 мужчин и 11 женщин, средний возраст 62,2 года (от 45 до 73) с гипертонической болезнью, у одного также была альдостерома. Продолжительность заболевания колебалась от трех до 37 лет, клиническая информация давала ясный диагноз. Согласно диагностическому стандарту гипертонии WHO/ISN 1993 (Beijng Renmin Weigheng Chubanshe 1996, 227-228) 11 пациентов имело стадию (?), а 10 пациентов - третью стадию.

Лекарства и измерения: 16 пациентов прекратили прием других гипотензивных препаратов на две недели, пять получали мепрамидил (mepramidil) и карведилол (carvedilol). Липосомный ЧКГП, приготовленный как в примере 1, вводился всем пациентам внутривенно или через слизистую носа или рта.

А. Через слизистую: 0,05-0,10 мл липосомного ЧКГП, содержащего 0,2-0,4 пг ЧКГП, давали три раза в день в течение пяти дней.

Б. Внутривенно: одну ампулу липосомного ЧКГП, содержащую 20 пг ЧКГП в 5 мл водного раствора, вводили с 100-500 мл 0,9% раствора NaCl в день в течение пяти дней.

В. Измерения: артериальное давление (АД) измеряли через 15,30,60,120,180 мин после приема в первый день. В последующие дни АД измеряли 6 раз в день до и после приема.

Определение гипотензии:
Гипотензию липосомного ЧКГП определяли в соответствии с диагностическим стандартом 1979 г. кардиоваскулярной эпидемиологии (Henan, Zhen Zhou, Китай) (J. Cardivascular Diseases 1979, 7, (2),18).

Доминантный результат: снижение диастолического давления >100 мм рт.ст. и до нормального уровня, или только >20 мм рт.ст.

Эффективный результат: снижение диастолического давления на 10 мм рт.ст. и до нормального уровня или 10-19 мм рт.ст.

Отсутствие результата: диастолическое давление не понизилось до нормального уровня или снизилось на <10 мм рт.ст.

У пациентов, имевших только повышенное систолическое давление, гипотензию определяли по указанному выше стандарту плюс снижению систолического давления на 20 мм рт.ст.

Результаты: предложенный липосомный ЧКГП вводили 21 пациенту: 4 - через слизистую, 4 - внутривенно, 13 - комбинированно через слизистую и внутривенно, 2 - через слизистую прямой кишки, 2 - через слизистую рта и остальным - через слизистую носа.

Результат лечения: снижение систолического давления 20-105 мм рт.ст., в среднем на 17 мм рт.ст. (p>0,001, n=21).

Снижение диастолического давления на 5-25 мм рт.ст, в среднем на 17 мм рт.ст ((p>0,001, n=21). Липосомный ЧКГП дал доминантный результат у 13 пациентов, эффективный у 7 пациентов и без результата у 1 пациента. Гипотензия наступала через 5 (?) после приема и сохранялось в течение приблизительно 10 ч.

Побочные эффекты:
2 пациента с хроническим насморком почувствовали легкий дискомфорт при приеме через слизистую носа, после приема внутривенно этот симптом исчез. Во время приема липосомного ЧКГП не наблюдалось головной боли и приливов крови, а также патологических изменений печени и почек.

Дискуссия
1. КГП является эндогенным нейропептидом. Предложенный липосомный ЧКГП позволяет исключить быстрое разложение КГП и обеспечить продолжительный эффект за счет постепенного высвобождения ЧКГП in vivo, в результате чего он легко поглощается клетками ткани. При лечении гипертонии он действует быстро, эффективно и надежно. Из 21 пациента доминантный результат был у 61,9%, эффективный результат у 95,2% и только у одного пациента не было отмечено никакого результат. Существенной разницы между эффективностью лечения при введении липосомного ЧКГП внутривенно или через слизистые не наблюдалось.

2. В некоторых источниках отмечается зависимость гипотензивного эффекта КГП от дозы у животных, причем эффективность возрастает с увеличением дозы. Однако у 21 пациента в описанном эксперименте оптимальная эффективность гипотензии наблюдалась при приеме 40-80 BU липосомного ЧКГП через слизистые и дальнейшее увеличение дозы не приводило к улучшению результата, что может объясняться увеличением минутного сердечного выброса, вызванного положительным ионотропным действием ЧКГП на сердце.

3. Shekgar et al. (Shekhar YC et al, Влияние продолжительного вливания человеческого кальцитонинного генного альфа-пептида на гемодинамику, почечный кровоток и гормональный уровень при застойной сердечной недостаточности. Am J Cardiol 1991; 67:-733) сообщает, что внутривенное введение ЧКГП (8,0 нг/кг/мин) в течение 8 ч при общей дозе 3840 нг/кг вызывает гипотензию и снижает артериальное давление на 18% (p<0,05) через 30 мин после приема. В данном эксперименте гипотензивная доза составляла 8000 BU в день при содержании ЧКГП всего 780 пг, т.е. 0,8 пг ЧКГП на один килограмм веса тела, что составляет 2,0 х 10 ^-7 от дозы ЧКГП, о которой сообщают другие источники.

4. Отсутствуют существенные побочные эффекты, только 1 пациент почувствовал носовой дискомфорт после приема препарата через нос, возможно связанный с расширением сосудов носа. Поэтому пациентам с заболеваниями носа следует назначать другой способ приема липосомного ЧКГП.

Claims

1. Фармацевтическая композиция, обладающая сосудорасширяющим действием, на основе человеческого кальцитонинного генного пептида (ЧКГП), отличающаяся тем, что она выполнена в виде липосомы из натурального соевого фосфолипида и ЧКГП, причем весовое соотношение ЧКГП к соевому фосфолипиду составляет 1 - 2 к 100 - 8000.

2. Фармацевтическая композиция ЧКГП по п.1, отличающаяся тем, что весовое соотношение ЧКГП к соевому фосфолипиду составляет 1,5 - 2 к 2500 - 6000.

3. Фармацевтическая композиция ЧКГП по п.1, отличающаяся тем, что содержит 20 - 2000 пг ЧКГП в 5 мл композиции.

4. Способ получения фармацевтической композиции, обладающей сосудорасширяющим действием, на основе ЧКГП, отличающаяся тем, что на первом этапе добавляют стерилизованную дистиллированную воду к очищенному и высушенному соевому фосфолипиду при весовом соотношении липида к воде выше 1: 1000, после чего осуществляют разрушение ультразвуком для получения маленьких одномембранных пузырьков двухслойного липида, на втором этапе смешивают ЧКГП, растворенный в воде в соотношении пептид:вода, равном 1:1000-25000, с вышеуказанным соевым фосфолипидом, причем соотношение пептид:липид составляет 1-2: 100-8000, предпочтительно 1,5-2:2500-6000, осуществляют разрушение ультразвуком и инкубацию при 37^oC в течение 30 - 60 мин для получения устойчивой композиции липосомного ЧКГП.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что на втором этапе весовое соотношение ЧКГП к соевому фосфолипиду составляет 1,5-2 к 2500-6000.

6. Способ по п.4 или 5, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют лиофилизацию с последующим растворением липосомного ЧКГП в воде для получения водного раствора, содержащего 20-2000 пг ЧКГП на 5 мл раствора.

7. Способ лечения гипертонии человека посредством введения пациенту одной из фармацевтических композиций по пп.1 - 3 внутривенно, опрыскиванием слизистой рта, носа в количестве 0,1 - 10 пг ЧКГП на килограмм веса тела.

8. Способ лечения застойной сердечной недостаточности человека посредством введения пациенту одной из фармацевтических композиций по пп.1 - 3 внутривенно, опрыскиванием слизистой рта, носа в количестве 0,1 - 10 пг ЧКГП на килограмм веса тела.

Приоритет по пунктам:
29.11.1996 - по пп.1 - 6;
17.10.1997. - по пп.7 и 8.