CN1330374C - 制备包含人降钙素基因相关肽的纳米冻干粉末的方法以及由此制得的产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备包含人降钙素基因相关肽的纳米冻干粉末的方法，其包括以下步骤：在水中制备磷脂乳液，然后制成脂质体溶液；制备人降钙素基因相关肽的水溶液；混合所述脂质体溶液和人降钙素相关肽的水溶液，其中使磷脂与人降钙素基因相关肽的重量比为100∶1-10000∶1，并经冻融和超声处理后得到人降钙素基因相关肽—磷脂复合物；使该人降钙素基因相关肽—磷脂复合物与填充辅料的水溶液混合，然后冻干。本发明还涉及由此方法制得的纳米冻干粉末及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及制备包含人降钙素基因相关肽的纳米冻干粉末的方法以及由此制得的产品和应用。
背景技术
卒中是指一组急性脑血管疾病而言，是全世界范围内一种常见的疾病。例如，在我国的发病率每年为219/10万人，患病率我719/10万人，死亡率为116/10万人，占全部死因的第二位。因此，卒中己成为一个严重的公共卫生问题，已经引起各国政府的广泛重视。
人降钙素基因相关肽(hCGRP)广泛分布于中枢神经和外周神经系统中，是体内重要的神经调节物质，是体内最强的血管扩张剂，在脑组织中具有高密度分布的特异性受体，促进损伤神经组织的修复，在脑组织中具有抗缺氧保护作用，而且能够促进血管再生。因此，hCGRP对于卒中后的神经功能损害具有十分重要的治疗前景。但是它在体内极不稳定，半衰期短，仅为9-12分钟。由于以上原因，其临床效力受到非常大的影响，至今不能作为临床药物使用。
本申请的发明人在第ZL97119060.7号中国专利中公开了一种包含hCGRP以及天然大豆磷脂脂质体的药物组合物(以下称为hCGRP脂质体)，其中hCGRP嵌入所述脂质体膜中。但在临床试验中发现hCGRP脂质体的颗粒直径大，达到500-1000nm，并且带有大量的负电荷，使得该hCGRP脂质体颗粒不能穿透血脑屏障，达不到治疗脑损伤、特别是脑缺血的作用。
因此，本发明的目的是克服上述缺陷，提供一种能够透过血脑屏障的hCGRP药物组合物，实现对脑损伤(例如脑缺血)的治疗。
发明内容
根据本发明的一个方面，其提供一种制备包含人降钙素基因相关肽的纳米冻干粉末的方法，其包括以下步骤：
-在水中制备磷脂乳液，然后制成脂质体溶液；
-制备人降钙素基因相关肽的水溶液；
-混合所述脂质体溶液和人降钙素相关肽的水溶液，其中使磷脂与人降钙素基因相关肽的重量比为100∶1-10000∶1，并经冻融和超声处理后得到人降钙素基因相关肽-磷脂复合物；
-使该人降钙素基因相关肽-磷脂复合物与填充辅料的水溶液混合，然后冻干。
根据本发明的另一个方面，其提供一种由本发明的上述方法制得的包含人降钙素基因相关肽的冻干粉末。
根据本发明的再一个方面，其提供所述冻干粉末在制备用于治疗脑卒中的药物中的应用。
具体实施方式
在本发明的方法中，所用磷脂优选是注射用卵磷脂。该卵磷脂通常是包含多种磷脂的天然提取物，重要包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)，其中PC含量多少作为注射用卵磷脂的一个重要指标。PC是中性磷脂，在中性溶液中不带任何电荷，这对于本发明的方法是一个非常重要的因素，因为希望根据本发明方法制得的冻干粉末带有尽量少的负电荷。优选地，该磷脂例如由德国LIPOID公司售卖的Lipoid S45(PC含量为45％)、Lipoid S75(PC含量为75％)和Lipoid S100(PC含量为100％)，并最优选为Lipoid S75。
人降钙素基因相关肽-磷脂复合物可根据本领域技术人员已知的方法来制备，所述方法例如包括以下步骤：
卵磷脂与水混合，然后搅拌、均质乳化，制成卵磷脂乳液，
所述卵磷脂混悬溶液经超声器处理形成脂质体溶液，
将人降钙素基因相关肽的水溶液与上述脂质体溶液混合，经过超声、冻融、离心等处理形成人降钙素基因相关肽-卵磷脂复合物。
在混合所述脂质体溶液和人降钙素相关肽的水溶液时，应使磷脂与人降钙素基因相关肽的重量比为100∶1-10000∶1，优选为250∶1-10000∶1，更优选为2500∶1，由此能够充分保证人降钙素相关肽的包封率。
在本发明的方法中，在中间步骤中得到的人降钙素基因相关肽-磷脂复合物的80％以上颗粒是直径小于500nm、更优选小于200nm、最优选小于100nm的纳米颗粒。
可以在本发明方法中使用的填充辅料应能够保护所述复合物的结构在冻干和真空干燥脱水过程中不会受到破坏，例如包括葡萄糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、微晶纤维素、二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮等，其中优选甘露醇和山梨醇，更优选为甘露醇。该填充辅料在其水溶液中的浓度通常可以是2-20重量％，优选为5-10重量％。
本发明还提供一种由本发明的上述方法制得的包含人降钙素基因相关肽的冻干粉末。
根据本发明的冻干粉末通常是以水注射液的形式通过静脉途径进行使用，此时每5ml的水溶液中可包含20-2000pg的人降钙素基因相关肽。其剂量可根据具体的病症、所述病症的严重程度、以及患者的年龄、体重、性别等因素容易地确定。在静脉滴注时，人降钙素基因相关肽的有效使用剂量为0.1-10pg/kg体重。
最后，本发明涉及所述冻干粉末在制备用于治疗脑卒中的药物中的应用。
由于使用了含负电荷少的磷脂，而且人降钙素基因相关肽-磷脂复合物为80％以上的颗粒具有小于500nm、优选小于200nm、更优选小于100nm的直径，所以根据本发明制得的冻干粉末在使用时能够透过血脑屏障，有效地治疗卒中患者。
以下将通过实施例更为详细地说明本发明。
实施例1
人降钙素基因相关肽-磷脂复合物的制备
将5000mg的注射用卵磷脂Lipoid S45(LIPOID公司，德国)加入到500g的水中，经匀浆机匀浆5分钟，将固体卵磷脂在水中制成乳液。
将上述卵磷脂乳液加温到40℃，在8000rpm下用匀质机处理10分钟，再经超声波仪进行超声处理：800W，3分钟，间隔2分钟，超声30-60次，温度维持在40℃，由此制得卵磷脂脂质体溶液500g。
准确称量10mg的人降钙素基因相关肽，加水溶解、搅拌、定容至250ml，用西林瓶分装为0.5ml/瓶，并冻干。每瓶含20微克的人降钙素基因相关肽，在-70℃下密封保存。每次取1瓶，用2ml水溶解。
将所述卵磷脂脂质体溶液5g与2ml的人降钙素基因相关肽水溶液(包含20微克的hCGRP)混合，其中卵磷脂与hCGRP的重量比为2500∶1。充分搅拌5分钟，40℃下保温30分钟，冷却至4℃，在-70℃下冻融3次，再进行超声处理∶800W，3分钟，间隔2分钟，超声30-60次，温度维持在40℃。冷却后定容至100ml，得到100g的人降钙素基因相关肽-磷脂复合物溶液。
实施例2和3
使用不同的卵磷脂制备人降钙素基因相关肽-磷脂复合物
重复以上实施例1的步骤，但将实施例1中的卵磷脂Lipoid S45(LIPOID公司，德国)分别替换为Lipoid S75和Lipoid S100(LIPOID公司，德国)，由此得到实施例3和4的人降钙素基因相关肽-磷脂复合物。
实施例4
冻干粉的制备
将250g的甘露醇溶解在水中至2500g，制成10％的甘露醇水溶液。在该水溶液中添加在实施例1中得到的复合物溶液100g，加入搅拌器中进行搅拌10分钟，均质化后分装，放入冻干机中，最后得到人降钙素基因相关肽-磷脂复合物的冻干粉末。
测试实施例1
不同磷脂对hCGRP包封率的影响
根据“微囊、微球与脂质体制剂制导原则”(中国药典2000年版二部，附录XIX E)，用实施例1-3中制得的人降钙素基因相关肽-磷脂复合物测量不同PC含量的磷脂对hCGRP包封率的影响。所得结果见以下表1。
表1
| 实施例2 | 实施例1 | 实施例3 | |
| 磷脂 | Lipoid S45 | Lipoid S75 | Lipoid S100 |
| PC含量 | 45％ | 75％ | 100％ |
| 包封率(％) | 96.4±0.62* | 94.8±0.57* | 94.9±0.19* |
*：n＝3
从表1中的结果可以看出，PC含量对包封率无明显的影响。
测试实施例2
不同磷脂对hCGRP-磷脂复合物大小的影响
根据“粒度测定法”(中国药典2000年版二部，附录70IX E)，用实施例1-3中制得的人降钙素基因相关肽-磷脂复合物测量不同PC含量的磷脂对hCGRP-磷脂复合物大小的影响。所得结果见以下表2。
表2
| 实施例2 | 实施例1 | 实施例3 | |
| 磷脂 | Lipoid S45 | Lipoid S75 | Lipoid S100 |
| PC含量 | 45％ | 75％ | 100％ |
| 电子显微镜测量10-49nm50-99nm100-199nm200-500nm＞500nm | n＝10033.3％55.3％12.1％3.3％0％ | n＝10025.1％62.1％10.8％3.8％0.2％ | n＝10023.0％29.1％44.5％3.4％0％ |
| 激光散射检测＜100nm平均直径(nm) | 92.4％56.8±6.2 | 88.9％63.9±7.8 | 40.5％170.8±16.3 |
电子显微镜检查hCGRP-磷脂复合物形态和大小分布的结果证明，根据本发明的hCGRP-磷脂复合物呈圆形，而且80％以上颗粒的直径小于200nm，而且对于使用Lipoid S45和Lipoid S75的复合物而言，80％以上颗粒的直径更是小于100nm。
实施例5-7
制备不同hCGRP∶磷脂重量比的复合物
按照与实施例相同的步骤制备hCGRP-磷脂复合物，但改变hCGRP水溶液的浓度，使磷脂Lipoid S75与hCGRP的重量比分别是100∶1、500∶1和10000∶1，由此制得实施例5-7的具有不同hCGRP∶磷脂重量比的hCGRP-磷脂复合物。
测试实施例3
不同的hCGRP∶磷脂重量比对包封率和hCGRP-磷脂复合物大小的影响
按照测试实施例1和2中所述的方法测量实施例1和5-7中的hCGRP-磷脂复合物的包封率和粒径。结果见以下表3。
表3
| 实施例5 | 实施例6 | 实施例1 | 实施例7 | |
| 磷脂∶hCGRP重量比 | 100∶1 | 500∶1 | 2500∶1 | 10000∶1 |
| 包封率(％) | 62.3±8.2 | 91.1±7.3 | 94.9±7.3 | 95.4±4.5 |
| 激光散射检测％＜100 nm平均直径(nm) | 82.1±4.274.8±11.2 | 84.4±3.866.8±9.2 | 90.1±2.156.8±6.2 | 94.0±2.549.3±10.2 |
| n | 3 | 3 | 3 | 3 |
实施例8
由于hCGRP和磷脂是靠物理作用形成复合物的，将hCGRP-磷脂复合物溶液制成冻干粉末时，必须加入适当的填充辅料，保证复合物的结构在冰冻和真空干燥脱水过程中不会受到破坏。
为此，按照与实施例4相同的方法制备hCGRP-磷脂复合物的冻干粉末，但使用如以下表4中所示的填充辅料。另外，还测量所得的冻干粉末的在冻干前后的干燥失重、溶解时间(水溶解达到完全均匀乳液所需要的时间)、激光散射粒径检测以及包封率(后两者按照测试实施例1和2中所述的方法进行)。所得结果如以下表4所示。
表4
| 辅料 | 葡萄糖 | 山梨醇 | 甘露醇 | ||||||
| 含量(％) | 5 | 10 | 20 | 5 | 10 | 20 | 5 | 10实施例1 | 20 |
| 干燥失重平均值％SD | 3.450.25 | 3.670.33 | 3.960.41 | 2.420.14 | 2.560.15 | 2.740.21 | 1.780.13 | 1.590.16 | 1.690.14 |
| 溶解时间平均值(分)SD | 4.030.52 | 4.280.61 | 4.980.45 | 3.120.49 | 3.630.55 | 4.020.45 | 1.280.21 | 2.430.15 | 2.560.26 |
| 激光散射测量％＜nmSD | 61.13.0 | 42.32.8 | 33.16.1 | 84.37.5 | 57.36.2 | 44.15.5 | 88.03.1 | 72.12.9 | 53.59.6 |
| 包封率平均值％SD | 74.27.1 | 52.46.3 | 44.08.8 | 90.12.3 | 83.94.5 | 74.25.6 | 94.11.2 | 88.32.3 | 82.27.0 |
| n | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
从表4的结果可以看出，不同的填充辅料以及不同浓度的填充辅料对复合物的粒径以及包封率都有明显的影响，在冻干脱水和水再溶性(溶解时间)方面也有明显差别。为保证冻干粉末的稳定性以及使用时的方便，5-10％浓度的填充辅料溶液是优选的，而作为填充辅料则优选山梨醇和甘露醇，更优选是甘露醇。
测试实施例4
药理学试验：hCGRP、hCGRP脂质体和hCGRP-磷脂冻干粉末的药代动力学参数的比较
将12只雄性SD大鼠(由北京大学医学部试验动物中心提供，体重220-250g)随机分为3个组，每组4只。经氯胺酮-噻拉嗪麻醉后，分别给予125I-hCGRP、125I-hCGRP脂质体、用125I标记的根据实施例4制备的hCGRP-磷脂冻干粉末，注射剂量为每只大鼠5μCi，含10pmol的hCGRP。
血液动力学参数
静脉给药后，连续测量120分钟血浆中TCA沉淀的放射活性，依照线性回归以及单指数函数得到截距A和斜率k，然后参照Pardrige等人的方法(Pharma.Res.1994，11：738-746，1998，15：576-582)由A和k计算出血浆半衰期t1/2、血浆浓度曲线AUC、全身分布体积Vc、全身清除率Cl以及血浆平均保留时间MRT。具体的结果见以下表5。
脑吸收参数
注射60分钟后，检测脑放射活性，由全脑的放射活性测量值计算脑吸收参数：脑分布容积(VD)、血脑屏障通透面积(PS)和脑吸收比率(ID)。结果示于以下表6中
表5
| 参数 | hCGRP | hCGRP脂质体 | hCGRP磷脂冻干粉末 |
| A(％ID/ml)平均值±SD | 3.83±0.87 | 7.37±0.87 | 1.54±0.13 |
| k(min-1)平均值±SD | 0.067±0.006 | 0.0062±0.0013 | 0.015±0.001 |
| t1/2(min)平均值±SD | 10.1±1.6 | 121±22 | 49.4±6.4 |
| AUCt 0(％ID.min/ml)平均值±SD | 55.1±13 | 633±74 | 72.9±8.4 |
| AUCx 0(％ID.min/ml)平均值±SD | 65.8±17 | 1399±179 | 136±23 |
| Vc(ml/kg) | 82.0±14 | 41.0±4.3 | 139±17 |
| Cl(ml/min/kg) | 5.7±1.6 | 0.26±0.05 | 1.73±0.4 |
| MRT(min) | 16.0±3.5 | 162±24 | 78.8±11 |
表6
| 参数 | hCGRP | hCGRP脂质体 | hCGRP磷脂冻干粉末 |
| Vd(μl/g)平均值±SD | 76.5±25.9 | 20.9±3.7 | 199±17 |
| PS(μl/min/g)平均值±SD | 0.100±0.009 | 0.045±0.007 | 2.03±0.243 |
| ID(％ID/g)平均值±SD | 0.07±0.0007 | 0.028±0.003 | 0.129±0.013 |
从表5的结果可以看出，hCGRP脂质体和根据本发明的hCGRP-磷脂冻干粉末的血浆半衰期都比hCGRP明显增加，从10.1分钟分别增加至121和49.4分钟，说明这载体脂质体和纳米冻干粉末都能避免带有正电荷的hCGRP在肝脏被截留分解。血浆浓度曲线AUC、全身清除率Cl以及血浆平均保留时间MRT的数据也证明了这一点。虽然hCGRP纳米冻干粉末的t1/2、AUC、Cl和MRT值都明显低于hCGRP脂质体，但全身分布体积Vc明显增加(139v41ml/kg)，证明根据本发明的hCGRP冻干粉末非常容易透过血脑屏障，被脑组织吸收。
从表6的结果可以看出，hCGRP脂质体因其粒径较大，很难透过血脑屏障，脑分布体积VD、血脑屏障通透面积(PS)和脑吸收比率(ID)均低于hCGRP。但是本发明的hCGRP纳米冻干粉末却与hCGRP脂质体相反，因其颗粒小而且负电荷少，非常容易透过血脑屏障，并被脑组织吸收，其VD、PS和％ID值分别提高9.95、45.1和4.61倍。
测试实施例5
药效学试验
局灶性脑缺血模型
在本试验中使用54只成年健康雄性SD大鼠(由北京大学医学部试验动物中心提供，体重260-320g)。采用Longa颈外动脉线拴法(Stroke，1989，20.84-91)，经左侧颈外动脉插线建立大脑中动脉闭塞动物模型(MCAO)动物手术苏醒后，出现Homer症，提尾右前肢内收屈曲，爬行时向右侧划圈大鼠入选。入选MCAO大鼠神经功能打分在2分以上的共计27只，用于正式试验中。
MCAO大鼠随机分为安慰剂组(7只)、hCGRP脂质体组(11只)和hCGRP纳米冻干粉末组(9只)。MCAO后1小时经尾静脉一次注射，安慰剂组注射1.2ml/kg生理盐水，hCGRP脂质体组注射1.2ml/kg生理盐水溶解的hCGRP脂质体(4.0pg/kg hCGRP)，hCGRP纳米冻干粉末组注射1.2ml/kg生理盐水溶解的纳米冻干粉末(4.0pg/kg hCGRP)。
神经功能障碍评分
依据Liu等方法进行MCAO大鼠用药前筛选及用药后2h和24h的神经功能障碍评分(Acta Pharmac0l.Sin.，1999，20：277-331)，分0-5级评分。0为未见到神经功能障碍，1分为右前爪不能完全伸展，2分为间歇性转圈，3分为持续性转圈，4分不能自主行走伴有意识下降，5分为死亡。
梗塞体积的计算
最后一次评分后，将MCAO大鼠麻醉去头取脑，将脑组织进行冠状切片，厚度2.0mm。将切片浸于2％的TTC中，37℃保温30min，再用10％福尔马林/10mM磷酸缓冲溶液pH7.4固定，拍照(Epson model650数码相机)，用图像分析仪测定梗死面积(NIH图像软件，version1.61)，用10mm直径的玻璃环及12×12mm的玻璃方框校正。由于脑水肿造成的梗死面积误差用非缺血的对侧脑半球进行补偿校正。梗死体积用每片的梗死面积乘以片数、再乘以篇片厚2mm得到。
统计学分析
数据用每组动物测定值及其平均值±SD表示，每组动物梗塞体积的差异用t检验法分析，p＜0.05被认为有显著性差别。
试验结果
由表7的数据可以看到，安慰剂组的MCAO大鼠脑梗死体积为343±33(n＝7)hCGRP脂质体组的MCAO大鼠脑梗死体积为340±21(n＝7)，两者之间没有差别，说明hCGRP脂质体被脑组织吸收的太少，不足以起到治疗作用。但是，hCGRP纳米冻干粉末由于能够透过血脑屏障，对脑缺血有明显的治疗作用，鼠脑梗死体积降低到142±26(n＝9，p＜0.001)。
24小时神经功能评分的数据也有同样的结果，从症状表现证明hCGRP纳米冻干粉末对脑缺血有明显的治疗作用(1.4±0.3v 2.9±0.3，P＜0.05)。
表7
| 治疗药物 | 梗死体积(mm3) | 神经功能障碍评分 | |
| 2小时 | 24小时 | ||
| 载体 | 343±33 | 2.3±0.4 | 3.1±0.5 |
| hCGRP脂质体 | 340±21 | 2.4±0.3 | 2.9±0.3 |
| HCGRP纳米冻干粉末 | 142±26** | 1.9±0.3 | 1.4±0.3* |
**P＜0.001，*P＜0.05，hCGRP纳米冻干粉末vs hCGRP脂质体
Claims (14)
1、一种制备包含人降钙素基因相关肽的纳米冻干粉末的方法，其包括以下步骤：
-在水中制备磷脂乳液，然后制成脂质体溶液；
-制备人降钙素基因相关肽的水溶液；
-混合所述脂质体溶液和人降钙素相关肽的水溶液，其中使磷脂与人降钙素基因相关肽的重量比为100∶1-10000∶1，并经冻融和超声处理后得到人降钙素基因相关肽-磷脂复合物；
-使该人降钙素基因相关肽-磷脂复合物与填充辅料的水溶液混合，然后冻干，
其特征在于，所述磷脂主要由磷脂酰胆碱组成。
2、如权利要求1所述的方法，其中所述磷脂为Lipoid S75。
3、如权利要求1或2所述的方法，其中所述磷脂与人降钙素基因相关肽的重量比为250∶1-10000∶1。
4、如权利要求3所述的方法，其中所述磷脂与人降钙素基因相关肽的重量比为2500∶1。
5、如权利要求1或2所述的方法，其中人降钙素基因相关肽-磷脂复合物的80％以上颗粒是直径小于500nm的纳米颗粒。
6、如权利要求5所述的方法，其中人降钙素基因相关肽-磷脂复合物的80％以上颗粒是直径小于200nm的纳米颗粒。
7、如权利要求5所述的方法，其中人降钙素基因相关肽-磷脂复合物的80％以上颗粒是直径小于100nm的纳米颗粒。
8、如权利要求1或2所述的方法，其中所述填充辅料为葡萄糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、微晶纤维素、二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮。
9、如权利要求8所述的方法，其中所述填充辅料为甘露醇和山梨醇。
10、如权利要求8所述的方法，其中所述填充辅料为甘露醇。
11、如权利要求1或2所述的方法，其中所述填充辅料在其水溶液中的浓度为2-20重量％。
12、如权利要求11所述的方法，其中所述填充辅料在其水溶液中的浓度为5-10重量％。
13、根据如权利要求1-12之一所述的方法制得的包含人降钙素基因相关肽的纳米冻干粉末。
14、如权利要求13所述的冻干粉末在制备用于治疗脑卒中的药物中的应用。
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Legal Events
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Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1087926 Country of ref document: HK |
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Assignee: Jiangsu ruinian forward Pharmaceutical Co. Ltd. Assignor: Ruinian Group Co., Ltd. Contract fulfillment period: 2009.4.1 to 2018.12.31 Contract record no.: 2009320000952 Denomination of invention: Method for preparing nano freeze-dried powder comprising human-body calcitonin gene relative peptide and product made therefrom and use thereof Granted publication date: 20070808 License type: Exclusive license Record date: 20090518 |
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Free format text: EXCLUSIVE LICENSE; TIME LIMIT OF IMPLEMENTING CONTACT: 2009.4.1 TO 2018.12.31; CHANGE OF CONTRACT Name of requester: JIANGSU RUINIAN QIANJIN PHARMACEUTICAL CO., LTD. Effective date: 20090518 |
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Assignee: Jiangsu ruinian forward Pharmaceutical Co. Ltd. Assignor: Ruinian Group Co., Ltd. Contract record no.: 2009320000952 Date of cancellation: 20140516 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20060308 Assignee: Nanjing ruinian bestsunny Pharmaceutical Co. Ltd. Assignor: Ruinian Group Co., Ltd. Contract record no.: 2014320000524 Denomination of invention: Method for preparing nano freeze-dried powder comprising human-body calcitonin gene relative peptide and product made therefrom and use thereof Granted publication date: 20070808 License type: Exclusive License Record date: 20140625 |
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Granted publication date: 20070808 Termination date: 20200830 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |