WO2006054798A1 - 酸素同位体で標識したヘモグロビンを含む生体組織検査薬及びその製造方法 - Google Patents

酸素同位体で標識したヘモグロビンを含む生体組織検査薬及びその製造方法 Download PDF

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WO2006054798A1
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Yasuhisa Fujibayashi
Tetsuya Mori
Makoto Suematsu
Katsuji Ohta
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Oxygenix Co., Ltd.
University Of Fukui
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    • G01N33/721—Haemoglobin

Definitions

  • the present invention 15 0 biopsy agents including 2 in hemoglobin into labeled, and a method for producing the same. More particularly, the present invention is, i 5 0 2 labeled with hemoglobin causes and pathology of the disease by detecting the oxygen metabolism of the living tissue diagnosis child bright with
  • the present invention relates to a biopsy drug that can be used and a method for producing the same.
  • the present invention also relates to a method for detecting oxygen metabolism in a biological tissue.
  • PET Pulsitron Emission Tomography
  • inhaled 15 0 2 can not be quantitatively control the amount of migration into the blood, also i 5 0 2 use efficiency is low.
  • Human erythrocytes have individual differences such as the difference in the concentration of substances related to oxygen dissociation of hemoglobin such as 2,3-bisphosphoglyceric acid in cells, and the decrease in oxygen release capacity due to the glycation reaction of globin seen in diabetes.
  • a PET imaging carrier that requires high reproducibility.
  • the present inventors have used artificial oxygen carriers instead of autologous blood and red blood cell preparations, so that the burden of preparing autologous blood and the use of red blood cell preparations without causing viral infections such problems, it found that it is possible to detect the i 5 0 2 the dynamics of definitive to tissues and organs, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a biopsy drug comprising hemoglobin labeled with i 5 0 2 .
  • a biopsy drug comprising a hemoglobin-encapsulating ribosome encapsulating hemoglobin labeled with i 5 O 2 .
  • Detection method of oxygen metabolism in the living tissue which comprises using the hemoglobin at 150 2 to labeled.
  • oxygen metabolism in tissues and organs can be detected by a safe and efficient method. Therefore, the present invention can be widely used for diagnosing the cause and pathology of a patient.
  • Figure 1 is a red blood cells i 5 O 2 gas labeled as subject to Usagi, when each of the artificial oxygen carrier containing the hemoglobin to that 15 0 2 gas labeled were injected intravenously
  • Biopsy agents of the present invention is characterized in that it comprises a hemoglobin to that labeled with 1 5 Rei_2. Biopsy agents of the present invention are labeled to shall in patients with biological tissue or organ 15 0 2 is used to detect the oxygen metabolism in the living tissue or organ to diagnose the cause and pathology of the disease Is.
  • tissue usually means a cell population having the same function ⁇ form, but in this specification, it is used in a broad sense including organs composed of combinations thereof.
  • the hemoglobin used in the present invention is a heme protein having a function of reversibly binding and dissociating oxygen, and is derived from living red blood cells, blood donated human red blood cells, or domestic animals such as pigs, hedges, and lions. It can be obtained from red blood cells derived from the origin. For example, erythrocyte membrane (stroma) is removed from red blood cells by hypotonic hemolysis, and heat treatment is performed.
  • stroma erythrocyte membrane
  • Hemoglobin can be obtained by inactivating and purifying the virus (at about 60 ° C for about 1 hour). Further, as the hemoglobin used in the present invention, a recombinant hemoglobin can be purified and concentrated for use.
  • hemoglobin is used labeled with i 5 0 2.
  • the method for labeling hemoglobin is not particularly limited. Labeling of hemoglobin, for example, 5 0 2 -containing gas into the dispersion or suspension in hemoglobin can be easily performed by, for example, Paburingu a. It is also possible to label hemoglobin by using an artificial lung.
  • Duration of Paburingu if it is different depending on the 5 .theta.2 content or use an apparatus in the gas, for example ⁇ 5 ⁇ 2 content using a 5-20% of 0 2 -containing gas is usually 0 :! About 2 minutes, preferably about 60 seconds.
  • the method for producing i 5 O 2 gas will be described later.
  • the content of hemoglobin in the biopsy drug of the present invention is not particularly limited. Force Usually ranges from 3 to 50 g / dL, preferably 5 to 25 g / dL, more preferably 8 to 18 g / dL.
  • the amount of i 5 O 2 used to label hemoglobin is particularly limited. However, it is usually in the range of 3.7GBq to 18.5GBq, preferably 5GBq to lOGBq per hemoglobin lOg.
  • hemoglobin are those which are contained in the artificial oxygen carrier in 15 Rei_2 to labeled.
  • side effects caused by the physiological activity of hemoglobin can be suppressed.
  • the use of an artificial oxygen carrier can reduce the burden on the patient and the amount of work for the medical staff, and there is an advantage that there is no problem of virus incompatibility with the virus.
  • the artificial oxygen carrier used in the present invention is not particularly limited as long as it can reversibly absorb and desorb oxygen in vivo.
  • tissues or organs can labeled to Rukoto 0 2 gas.
  • a cell-type oxygen infusion solution in which hemoglobin is encapsulated inside the phospholipid vesicle can be used.
  • a cell-type oxygen infusion solution hemoglobin-encapsulated ribosome (hereinafter also referred to as “HbV”) in which hemoglobin is encapsulated in the inner layer of a liposome composed of a lipid bilayer membrane is preferably used.
  • the hemoglobin contained in the encapsulated hemoglobin Liposomes one arm was labeled with i 5 0 2.
  • the structure of the ribosome used in the present invention is not particularly limited, and may be a multilayer or a single-film ribosome.
  • the lipid constituting the phospholipid vesicle used in the present invention is not particularly limited, and known lipids can be used.
  • known lipids can be used.
  • Examples of the glycolipid used in the present invention include glyce oral glycolipid, sphingoglycolipid. Quality and so on.
  • Diglycatatoglycolipids include digalatatosyl diglycerides (such as digalata tosyl dilauroyl glyceride, digalactosyl dimyristoyl glyceride, digalactosyl dipalmitoyl glyceride or digalactosyl distearoyl glyceride), or galactosyl diglycerides.
  • glycosphingolipid examples include galactosyl cerebroside, lactosyl celebral mouthside or ganglioside.
  • the sterols used in the present invention include, for example, cholesterol, cholesterol hemisuccinate, 3 ⁇ — [ ⁇ - ( ⁇ ,, ⁇ , dimethylaminoethane) strength ruva moinole] cholesterol, enolegosterol or lanostero Nore and the like.
  • Examples of the phospholipid used in the present invention include phosphatidyl coli, phosphatidylethanolamine, phosphatidinoreserin, phosphatidic acid, phosphatidylglyceronorole, phosphatidinoreinositol, lysophosphatidinorecoli.
  • Natural or synthetic phospholipids such as sucrose, sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean lecithin or hydrogenated phospholipid.
  • these lipids may be used alone or in combination of two or more.
  • the mixing ratio of these lipids is not particularly limited, and a known mixing ratio can be used.
  • the compounding ratio of phospholipid / cholesterol / fatty acid is preferably 10/1 to 20 / 0.1 to 5 in terms of molar ratio, more preferably 10/6 to 12 / 1.5 to 2.5.
  • the total amount of lipid used in the phospholipid endoplasmic reticulum used in the biopsy agent of the present invention is about 0.:! -2.0 (unit: g / g).
  • the surface of the phospholipid endoplasmic reticulum may be modified with polyalkylene glycols.
  • Polyalkylene glycols are not particularly limited, but the alkylene chain is Those having about 1 to 6 carbon atoms are preferred.
  • the alkylene chain may be substituted with a substituent that does not hinder the present invention, for example, a hydroxyl group, a strong propyl group, an amino group, an alkoxy group, and the like.
  • a substituent that does not hinder the present invention for example, a hydroxyl group, a strong propyl group, an amino group, an alkoxy group, and the like.
  • polyethylene glycol, polypropylene glycol and the like can be used.
  • the molecular weight of the polyalkylene glycols is not particularly limited, but those having a molecular weight of about 2 to 4 million, preferably about 1,000 to 50,000 can be used.
  • the content of the polyalkylene glycols is not particularly limited, but is preferably about 0.1 to 30 mol% with respect to the total amount of lipid constituting the phospholipid vesicle.
  • the phospholipid vesicle used in the present invention can be prepared by a known method, for example, a reverse phase evaporation method, a high pressure extrusion method, a microfluidizer method or the like.
  • a method of modifying the surface of phospholipid endoplasmic reticulum with polyalkylene glycols is also known, and usually a bound lipid obtained by binding a non-phospholipid-type lipid and a polyalkylene glycol via a spacer or the like.
  • the surface of the phospholipid endoplasmic reticulum can be modified by using it as a constituent lipid of the phospholipid endoplasmic reticulum.
  • a method of adding hemoglobin labeled with ⁇ 2 can also be used. And ⁇ , considering that 150 2 half-life is short, it leaves a rough or Jimee hemoglobin containing ribosomes with hemoglobin to the unlabeled prepared, dispersion or suspension of hemoglobin encapsulated liposome to the time of use I 5 0 2 gas Paburingu, 1 5 0 2 labeling methods are preferred hemoglobin in.
  • the amount of biopsy agents of the invention, the patient's age, sex, body weight, symptom, the inspection unit position, administration (rapid, sustained) vary depending on, but not limited, ⁇ 5 0 normal throw Azukatoki
  • the radioactivity level of 2 is preferably 18.5 MBq to 740 MBq, more preferably 37 MBq to 370 MBq.
  • additives may be encapsulated inside the phospholipid vesicle by mixing with the constituent lipid components when preparing the phospholipid vesicle.
  • Examples of the electrolyte used in the present invention include sodium salts (for example, sodium chloride, sodium bicarbonate, sodium citrate, sodium lactate, sodium sulfate, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, acetic acid Sodium, sodium glycephosphate, sodium carbonate, amino acid sodium salt, sodium propionate, sodium hydroxybutyrate, sodium dulconate, power thulium salt (eg, potassium chloride, potassium acetate, potassium dalconate, hydrogen carbonate) Potassium, Potassium glycephosphate, Potassium sulfate, Potassium lactate, Potassium iodide, Potassium dihydrogen phosphate, Dipotassium hydrogen phosphate, Potassium citrate, Amino acid strength Rium salt, Potassium propionate, Hydroxybutyric acid Strength , Force Lucium salt (eg, calcium chloride, calcium dalconate, calcium lactate, calcium glycephosphate, calcium panto
  • sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, disodium hydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, sodium lactate, sodium lactate, sodium acetate, sodium taenoate, potassium acetate, glyceport phosphate Potassium, calcium dalconate, calcium chloride, magnesium sulfate, and zinc sulfate are preferred.
  • Examples of the saccharide used in the present invention include glucose, fructose, and xylose.
  • Examples include itolitol, sorbitol, mannitol, dextrin, glycerin, sucrose, trenorose, glycerol, maltose, lactose, erythritol.
  • glucose, fructose, xylitol, sorbitol, mannitol, dextrin, glycerin, and sucrose are particularly preferable.
  • amino acids used in the present invention include lysine, lysine hydrochloride, lysine acetate, asparagine, glutamine, aspartate, glutamate, serine, threonine, tyrosine, methionine, cystine, cysteine, cysteine hydrochloride, cysteine acidine, Homocystine, isoloicin, leucine, phenylalanine, tryptophan'an, valine, arginine, arginine hydrochloride, histidine, histidine hydrochloride, alanine, proline, aminoacetic acid and their salts.
  • lysine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid, serine, threonine, tyrosine, methionine, cystine, cysteine, homocystine, and aminoaminoacetic acid are particularly preferable.
  • antioxidant of the present invention examples include sodium bisulfite, sodium sulfite, sodium pyrosulfite (for example, sodium metabisulfite), longarit (CH 2 OHS0 2 Na), ascorbic acid, sodium ascorbate, erythrocyte. Sorbic acid, sodium erythorbate, cysteine, cysteine hydrochloride, homocystine, dartathione, thioglycerol, alphathioglycerin, sodium edetate, citrate, isopropyl catenate, potassium dichloroisocyanourate, sodium thiodalycolate , Sodium thiomalate, sodium pyrosulfite
  • 1,3-butylene glycol 1,3-butylene glycol, ethylenediamine amine acetic acid Ca 2 Na, ethylenediamine tetraacetic acid 2 Na, amino acid sulfites (eg L-lysine sulfite), butylhydroxydisole (BHA), dibutylhydroxytoluene (BHT) , Propyl gallate, ascorbyl palmitate, vitamin E and its derivatives • (eg d 1-a-tocopherol acetate, tocopherol acetate ⁇ /, natural vitamin £, d — ⁇ — tocopherol, concentrated mixed tocopherol, trolox), guayata Fat, nordihydro ayaretic acid (NDGA), L-corsorbic acid stearate, soy lecithin, panolemitic acid asconolevic acid, benzotriazolole, pentaerythro Slittilute trakis [3- (3,5-di
  • the pH adjuster for example, as the acid, adipic acid, strength sodium zein, hydrochloric acid, dilute hydrochloric acid, sulfuric acid, potassium aluminum sulfate, citrate, sodium dihydrogen citrate, glycine, dalconone ⁇ -latathone , Darconic acid, sodium dalconate, crystalline sodium dihydrogen phosphate, succinic acid, acetic acid, ammonium acetate, tartaric acid, D-tartaric acid, lactic acid, glacial acetic acid, monosodium fumarate, sodium propionate, boric acid, boric acid Ammonium, maleic acid, malonic acid, phosphoric acid, disodium phosphate anhydrous, methanesulfonic acid, phosphoric acid, dihydrogen phosphate (eg dihydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate) , Etc.
  • Alkali includes: aqueous ammonia, dry sodium carbonate, sodium citrate, sodium acetate, diisopropanolamine, L sodium tartrate, lactate (eg, calcium lactate, 'sodium lactate), borax, sodium maleate, malon Sodium acid, sodium malate, potassium hydroxide, calcium hydroxide, sodium hydroxide, magnesium hydroxide, sodium bicarbonate, sodium carbonate, triisopropanolamine, monoethanolamine, triethanolamine, anhydrous sodium acetate, anhydrous phosphorus Sodium monohydrogen acid, medamine, phosphate (eg, trisodium phosphate), sodium salt of parbital, hydrogen phosphate (eg, disodium hydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate), etc. It is. Of these, sodium acetate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate, trisodium phosphate, disodium hydrogen phosphate, and dipotassium hydrogen phosphate are particularly preferable.
  • Examples of the isotonic agent used in the present invention include aminoethylsulfonic acid, sodium hydrogen sulfite, potassium chloride, calcium chloride, sodium chloride, benzalkonium chloride, magnesium chloride, saccharides (for example, lactose, concentrated glycerin, Pud Sugar, fruit juice, xylitol, glycerin), sugar alcohol (eg D-sorbitol, D-mannitol), citrate, sodium citrate, crystalline sodium dihydrogen phosphate, calcium bromide, sodium bromide Sodium hydroxide, physiological saline, sodium tartrate dihydrate, sodium hydrogen carbonate, nicotinic acid, sodium lactate, propylene glycol nore, pendinole noreconole, boric acid, borax, anhydrous pyrroline Sodium phosphate, phosphoric acid, disodium hydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, macrogol 4000, and the like.
  • the biopsy drug of the present invention can be widely used in a test method using detection of oxygen metabolism in a living tissue or organ.
  • the biopsy specimen of the present invention is
  • the biopsy agent of the present invention By using the biopsy agent of the present invention, the problems caused by the conventional inhalation of i 5 O 2 gas from the nasal cavity can be solved, and the examination can be performed safely and efficiently.
  • the tissue or organ function of the patient is captured as a tomographic image, and the cause and condition of the disease can be accurately diagnosed. Therefore, the biopsy specimen of the present invention that can be used for this PET examination.
  • Diseases include cancer, ischemic circulatory disorder (cerebral infarction, myocardial infarction, anxiety cardiomyopathy, etc.), subarachnoid hemorrhage, moyamoya disease, cerebral hemorrhage, etc.
  • the biopsy of the present invention is useful for these diagnoses. Can be used.
  • Production method of the present invention involves labeling the hemoglobin contained in encapsulated hemoglobin ribosomes 0 2.
  • Methods for labeling hemoglobin 02 is as already mentioned, considering that the half-life of 15 Rei_2 short, after preparing the hemoglobin containing ribosomes to, dispersion or suspension in containing hemoglobin containing ribosomes to this It is preferable to bubble 0 2 gas and label hemoglobin with 15 0 2 .
  • the method for producing hemoglobin-encapsulated ribosome is also as described above, and can be produced according to a known method.
  • the biopsy agent of the present invention is preferably produced under aseptic conditions.
  • the biopsy agent produced by the production method of the present invention is capable of detecting oxygen metabolism. Widely used for inspection, especially suitable for PET inspection
  • the method for detecting oxygen metabolism of the present invention is characterized by using hemoglobin labeled with i 5 O 2 .
  • the present invention is 15 0 2 labeled hemoglobin in the artificial oxygen luck ⁇ using a connexion by the use of this labeled hemoglobin, i in a tissue or organ of a subject 5 O 2 dynamics can be detected. More preferably, the labeled hemoglobin is administered intravenously into the subject's body.
  • hemoglobin labeled with i 5 O 2 is introduced into a tissue or organ by being encapsulated in an artificial oxygen carrier, more preferably in a ribosome.
  • an artificial oxygen carrier more preferably in a ribosome.
  • the labeled hemoglobin in 0 2 for use in the present invention it is possible to use a biopsy agents of the present invention described above.
  • i 5 0 by using a hemoglobin-encapsulated liposome to that encloses a motor-globin to labeled Mr 2, to it is possible to suppress the adverse effects from Mog Robin.
  • the amount of hemoglobin to that labeled with i 5 0 2 in the detection method of the present invention is state, and are as described in the section of biopsy drug, content and hemoglobin hemoglobin used in labeling i 5 0 2 of Defined from usage.
  • the method of the present invention comprises (a) a step of producing 1 5 0 2 gas, (b) a step of labeling hemoglobin in an artificial oxygen carrier with i 5 O 2 gas, c) a step of administering hemoglobin labeled with i 5 O 2 into the body, and (d) a step of detecting i50 2 .
  • the nitrogen 14 is irradiated with a deuteron "N (d, n) i 5 O reaction Ru can be prepared by.
  • the nitrogen 14 by N 2 generator can be made by 15N (p, n) l50 reaction, 15N can be obtained by isotopic enrichment.
  • it can be purified 1 5 Rei_2 made by the above method.
  • molecular sieves By carrying out such purification process increases the i 5 0 2 concentration, radioactivity that will be detected increases.
  • i 5 0 2 is due to the short half-life, there is a case where radiation levels are reduced by purification treatment. For this reason, it is desirable to determine whether or not the purification process is performed according to the balance between the concentration efficiency and the processing time.
  • hemoglobin in artificial oxygen carriers using 2 gas is ⁇
  • the labeling of hemoglobin in artificial oxygen carriers using 2 gas is, for example, HbV
  • the amount used is not particularly limited, but is usually in the range of 3.7 GB (! To 18.5 GBq) with respect to the amount of lg used in hemoglobin.
  • the method of the present invention is compared with the inhalation method in i 5 O 2. Use efficiency is high.
  • the artificial oxygen carrier used in the present invention is not particularly limited as long as it can reversibly absorb and desorb oxygen in a living body, but a cell-type oxygen infusion in which hemoglobin is encapsulated inside a phospholipid endoplasmic reticulum is preferably used. it can. More preferably, HbV is suitably used.
  • the necessary amount can be prepared.
  • hemoglobin labeled with i 5 O 2 is administered into the body.
  • the artificial oxygen carrier containing the (b) step is i 5 0 2 labeled hemoglobin, for example, using a needle and syringe were taken, it is a child that is by intravenous injection.
  • 0 2 is detected.
  • detection is preferably performed using a PET apparatus.
  • the state of oxygen metabolism in each tissue can be detected and an ischemic state or the like can be diagnosed.
  • a known PET apparatus can be used.
  • the level of radioactivity that is routinely used in normal PET examinations is around 200-400 MBq.
  • the radioactivity level used in the labeling operation in the present invention is usually preferably in the range of 200 MBq to 2000 MBq.
  • radioactivity levels for example the following It changes as follows.
  • the present invention includes the steps (a) to (d) described above, thereby detecting the metabolic state of oxygen in each tissue (for example, the brain) and diagnosing an ischemic state or the like. can do.
  • the present invention uses an artificial oxygen carrier instead of autologous blood or red blood cell preparation as a physiologically active substance to be labeled. It is possible to detect the i 5 0 2 dynamics in tissues or organs of test subjects in a simple manner without giving burden on medical staff. Furthermore, the human oxygen carrier has no risk of blood group incompatibility and has no interaction with other blood components, so that it is possible to make a diagnosis by a simpler method without taking these into account. There is also. The fact that this artificial oxygen carrier can be stored at room temperature for a long period of time, and that oxygen metabolism imaging independent of red blood cells, which has great individual differences in function, can be carried out.
  • the whole blood volume was collected using a syringe needle and syringe connected by a line with the vial containing about 185MBq of radioactivity.
  • Radioactivity in the syringe was measured (18.5MBq) and immediately injected intravenously through a line placed in the rabbit ear, and PET data was collected for 10 minutes from the start of injection. The results are shown in the upper part of Fig. 1.
  • the PET device used was Advance made by GE.
  • the endoplasmic reticulum dispersion having a particle size of 1.8 ⁇ was obtained by repeating the freeze-thaw cycle in which the endoplasmic reticulum dispersion was frozen with liquid nitrogen and thawed at 25 ° C. four times. The dispersion was frozen with liquid nitrogen, mounted on a freeze dryer, and freeze-dried for 15 hours to obtain white dry vesicles.
  • Hemoglobin (40 g / dL) encapsulated in an artificial oxygen carrier was obtained by purifying red blood cells derived from donated blood. To adjust the allosteric effect, pyridoxanol 5, -phosphate (manufactured by Sigma Chemical) was added at a molar ratio of 2.5 to hemoglobin.
  • a hemoglobin solution 5 mL was added to the dried vesicle and stirred at 25 ° C. to obtain a hemoglobin vesicle dispersion.
  • the particle size of the endoplasmic reticulum was 540 nm, and the particle size before drying was almost retained.
  • EXTRUDER trade name, manufactured by NOF Liposome
  • pressurized (20kg / cm 2 ) at 14 ° C with a pore size of 3.0 ⁇ ⁇ , 0 ⁇ 8 ⁇ ⁇ , 0.65 zm
  • the solution was sequentially permeated through 0.45 ⁇ , 0.30 jum, 0.22 ⁇ m acetylenolose filter (manufactured by Fujifilm) to obtain a hemoglobin endoplasmic reticulum dispersion. This was passed through an ultrafiltration membrane to remove unencapsulated hemoglobin.
  • the hemoglobin vesicle dispersion was placed in an R-tube flask, and this was loaded into a rotary evaporator and rotated (56 rpm).
  • the liquid film thus formed was irradiated with visible light for 3 minutes under oxygen flow (lL / min) using a halogen lamp (500 W), and from moglobin (HbCO) to carbon monoxide bond (HbCO) to oxyhemoglobin ( Ligand exchange to HbO 2 ) was performed.
  • nitrogen gas saturated with water vapor was introduced into the bottle, and the dissolved oxygen was removed by publishing in the hemoglobin vesicle fluid to obtain a human oxygen carrier.
  • the present invention can be widely used in a test method for diagnosing a cause or a disease state of a patient by utilizing detection of oxygen metabolism in a patient tissue or organ.
  • the present invention is used in combination with iiC-flurodeoxyglucose, which is widely used in the detection of cancer foci, to enable qualitative diagnosis of cancer foci with active oxygen intake, thereby determining the presence or absence of radiosensitivity. It can also be applied to. According to the present invention, it is possible to use for diagnosis of an area in which there is room for recovery of treatment around nerve cell death after cerebral infarction.

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Abstract

本発明は、15O2で標識したヘモグロビンを含む生体組織検査薬及びその製造方法に関する。更に詳しくは、本発明は、15O2で標識したヘモグロビンを用いて生体組織中の酸素代謝を検出することによって病気の原因や病状を診断するための生体組織検査薬及びその製造方法に関する。また、本発明は、生体組織における酸素代謝の検出方法に関する。

Description

酸素同位体で標識したへモグロビンを含む生体組織検査薬及びその製造方法 技術分野
本発明は、 1502で標識したへモグロビンを含む生体組織検査薬及びその製造 方法に関する。 更に詳しくは、 本発明は、 i502で標識したヘモグロビンを用い て生体組織中の酸素代謝を検出することによって病気の原因や病状を診断するこ 明
とができる生体組織検查薬及びその製造方法に関する。 また、 本発明は、 生体組 織における酸素代謝の検出方法に関する。 背景技術 書
PET(Positron Emission Tomography： 陽電子放射断層撮影検査）は、 生理活 性物質を標識し、 その挙動を機能画像として捉え、 病気の原因や病状を診断する 最先端の医療技術である。
PET を用いて例えば脳を診断する場合、 従来は鼻腔から標識化された酸素ガ ス （1502) を吸入させることが行われてきた (例えば、 「クリニカル PET ハン ドブック」 2001年 10月 30 日初版発行、 編著者 鳥塚莞爾、 発行所 ㈱技術 経済研究所参照） 。 しかしこの方法では、 以下のような問題が指摘されていた。
1) 吸入された 1502が血液に移行する量を定量的に制御できず、 また i502の 使用効率も低い。
2) i502が通過する気管や肺で被曝を起こすため、 被曝量が大きい。
3) i502がガスの状態で使用されるため、 吸入されずに漏出する危険性が高い。 このような従来の投与方法に対し、 より安全で効率的な方法として注目されて いるのが注射による投与である。 これは i5O2を赤血球溶液に溶解し、 その溶液 を静脈注射する方法である。 この方法は高濃度の 1502を血液に直接投与できる ため、 以下の点で従来法よりも優れていると期待される。
1) 血流中への移行効率が良いため 1502使用量が少なくて済む。
2) 血液中の 02濃度や投与量を正確に調節できる。 3) 他の臓器での被曝が少ない。
このため、 近年、 吸入に代わる i502投与方法として 15O2溶解赤血球の技術開 発が進められている。 しかし、 この方法も赤血球溶液を使用する点において以下 の問題が懸念される。
1) 赤血球溶液として自己血を準備する必要があるため、 患者にとっては苦痛 となり、 医療スタッフにとっては作業量が多くなる。
2) 赤血球製剤を利用する場合、 ウィルス感染や型不適合の危険性がある。
3) 医療スタッフが血液を介してウィルスに感染する危険性がある。
4) ヒ ト赤血球は細胞内の 2,3-bisphosphoglyceric acid などのヘモグロビンの 酸素解離に関わる物質の濃度差や、 糖尿病などで見られるグロビンの糖化 反応などによる酸素放出能の低下などの個人差があり、 高い再現性が求め られる PETのイメージング担体として問題がある。
上記のような状況を考慮して、 より安全で効率的な方法で組織や器官に i5O2 を放出することができ、'高い再現性を有する生体組織検查薬の開発が求められて いる。
ところで、 Phillips WT, Lemen LD, Goins B et al. Amer J1 Physiol 1997には、 15O2で標識したへモグロビンの肺での取り込みと組織への伝達を定量したこと が記載されている。 しかしこの方法は、 酸素運搬能の測定に関するものであり、 リボソームに内包されたヘモグロビンの運搬能を各組織における i502を指標と して測定しているにすぎない。 努明の開示
本発明者らは、 かかる状況に鑑みて鋭意検討した結果、 自己血や赤血球製剤の 代わりに人工酸素運搬体を用いることにより、 自己血を準備する際の負担や赤血 球製剤を利用する場合のウィルス感染等の問題を生じることなく、 組織や器官に おける i502の動態を検出することができることを見出し、 本発明を完成するに 至った。
すなわち、 本発明は、 以下のとおりのものである。
(1) i502で標識したへモグロビンを含むことを特徴とする生体組織検査薬。 (2) i5O2で標識したヘモグロビンは人工酸素運搬体に内包されたものである、 上 記 (1)記載の生体組織検査薬。
(3) i5O2で標識したヘモグロビンはリボソームに内包されたものである、 上記 (1)または (2)記載の生体組織検査薬。
(4) i5O2で標識したヘモグロビンを内包したヘモグロビン内包リボソームを含む ことを特徴とする生体組織検査薬。
(5) 陽電子放射断層撮影検査用である、 上記 (1)から（4)のいずれか記載の生体組 織検査薬。
(6) ヘモグロビン内包リボソームに内包されるヘモグロビンを 5〇2で標識する ことを含む生体組織検査薬の製造方法。
(7) 生体組織検査薬は陽電子放射断層撮影検査用である、 上記 (6)記載の生体組 織検査薬の製造方法。
(8) 1502で標識したへモグロビンを用いることを特徴とする生体組織における酸 素代謝の検出方法。
(9) 1502で標識したヘモグロビンは-リボソームに内包されたものである、 上記 (8)記載の検出方法。
(10)生体組織における酸素代謝を検出するための i5O2で標識したへモグロビン の使用。
(11) 1502で標識したへモグロビンはリポソームに内包されたものである、 上記 (10)記載の使用。
本発明によれば、 安全で効率的な方法で組織や器官における酸素代謝を検出す ることができるので、 本発明は患者の病気の原因や病状の診断に広く活用するこ とができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 ゥサギを被検体として i5O2ガス標識された赤血球と、 1502ガス標識 されたへモグロビンを内包する人工酸素運搬体のそれぞれを静脈注射した場合の
PETの検査結果を示した図である。 発明を実施するための最良の形態 .
以下、 本発明を詳細に説明する。
1 . 生体組織検査薬及びその製造方法
本発明の生体組織検査薬は、 15〇2で標識したへモグロビンを含むことを特徴 とする。 本発明の生体組織検査薬は、 患者の生体組織又は器官を 1502で標識す るものであり、 生体組織又は器官における酸素代謝を検出して病気の原因や病状 を診断するのに用いられるものである。 ここで 「組織」 とは、 通常同一の機能 · ' 形態をもつ細胞集団を意味するが、 本明細書においてはそれらの組み合わせから なる器官をも含む広い意味で用いる。
本発明に用いられるヘモグロビンは、 酸素を可逆的に結合 ·解離する機能を有 するヘムタンパク質であり、 生体由来の赤血球、 献血由来のヒ ト赤血球、 あるい はブタ、 ヒッジ、 ゥシ等の家畜由来の赤血球などから入手することができる。 例 えば、 低張溶血法により赤血球から赤血球膜. （ス トローマ） を除去し、 加熱処理
(約 60°Cで 1 時間程度） によってウィルスを不活性化させ、 精製することによ つてへモグロビンを得ることができる。 また、 本発明に用いられるへモグロビン としては、 遺伝子組み換え型のヘモグロビンを精製、 濃縮して使用することもで きる。
本発明において、 ヘモグロビンは i502で標識して用いられる。 ヘモグロビン の標識方法は特に限定されるものではない。 ヘモグロビンの標識は、 例えば、 へ モグロビンの分散液もしくは浮遊液中に 502含有ガスをパブリングするなどし て容易に行うことができる。 また、 人工肺を用いることによって、 ヘモグロビン を標識することも可能である。
パブリングの所要時間は、 ガス中の 5θ2含有量や使用する装置などによって 異なるものであるが、 例えば ΐ5Ο2含有量が 5〜20%の 02含有ガスを使用する 場合は、 通常 0.：！〜 2分程度、 好ましくは 60秒程度である。 なお、 i5O2ガスの 作製方法については後述する。
本発明の生体組織検査薬におけるへモグロビンの含有量は、 特に限定されない 力 通常 3〜50g/dLの範囲であり、 好ましくは 5〜25g/dL、 より好ましくは 8〜 18g/dLである。 ヘモグロビンの標識に用いられる i5O2の使用量は、 特に限定さ れないが、 ヘモグロビン l.Og .当り、 通常 3.7GBq〜18.5GBqの範囲であり、 好 ましくは 5GBq〜 lOGBqである。
本発明において、 15〇2で標識したへモグロビンは人工酸素運搬体に内包され たものであることが好ましい。 これによつてへモグロビンの生理活性に起因する 副作用を抑制することができる。 また、 人工酸素運搬体を使用することによって、 患者の負担や医療スタッフの作業量を軽減することができ、 ウイルス感染ゃ型不 適合の問題がないといった利点も得られる。
本発明に用いられる人工酸素運搬体は、 生体内で酸素を可逆的に吸脱着できる ものであれば特に限定されない。 これにより組織又は器官を 02ガスで標識す ることができる。 本発明に用いられる人工酸素運搬体としては、 例えば、 リン脂 質小胞体内部にへモグロビンを内包したセル型酸素輸液が使用できる。 このよう なセル型酸素輸液としては、 脂質二分子膜からなるリポソームの内層にへモグロ ビンを内包したヘモグロビン内包リボソーム （以下 「HbV」 ということがあ る。 ） が好適に用いられる。 本発明においては、 このヘモグロビン内包リポソ一 ムに内包されたヘモグロビンの少なくとも一部を i502で標識したものが好まし く用いられる。 なお、 本発明に用いられるリボソームの構造は特に限定されるも のではなく、 多重層であってもよいし、 一枚膜のリボソームであってもよい。
本発明に用いられるリン脂質小胞体を構成する脂質は特に限定されるものでは なく、 公知の脂質を用いることができる。 例えば、 糖脂質、 ステロール類、 脂肪 酸、 リン脂質、 両親媒性アルキルアミノ酸誘導体、 ジアルキルジメチルァンモニ ゥム、 ポリグリセローノレアノレキルエーテノレ、 ポリオキシエチレンァノレキノレエーテ ル等 (Liposome Technology, 2nd edition, vol. 1, 141， 1993) 、 アルキルグリコ シ ド、 アルキルメチルダルカミ ド、 アルキノレシユークロースエステル等 (Liposome Technology, 2nd edition, vol. 1， 141， 1993) 、 ポリオキシエチレン 一ポリ乳酸等の両親媒性ブロック共重合体 （特表平 6-508831号公報） 、 長鎖ァ ルキルアミン類 （テトラデシルァミン、 へキサデシルァミン、 ステアリルアミン 等） 、 または長鎖脂肪酸ヒ ドラジド類 （ミリスチン酸ヒ ドラジド、 パルミチン酸 ヒ ドラジドもしくはステアリン酸ヒドラジド等） などを挙げることができる。
本発明に用いられる糖脂質としては、 例えばグリセ口糖脂質、 スフインゴ糖脂 質等が挙げられる。 グリセ口糖脂質としては、 ジガラタ トシルジグリセリ ド類 (ジガラタ トシルジラゥロイルグリセリ ド、 ジガラク トシルジミリストイルグリ セリ ド、 ジガラク トシルジパルミ トイルグリセリ ドもしくはジガラクトシルジス テアロイルグリセリ ド等） 、 またはガラク トシルジグリセリ ド類 （ガラタ トシル ジラウロイルグリセリ ド、 ガラタ トシルジミ リストイルグリセリ ド、 ガラク トシ ルジパルミ トイルグリセリ ドもしくはガラク トシルジステァロイルグリセリ ド 等） が挙げられる。 スフインゴ糖脂質としては、 例えばガラク トシルセレブロシ ド、 ラクトシルセレブ口シドまたはガングリオシド等が挙げられる。
また、 本発明に用いられるステロール類としては、 例えば、 コレステロール、 コレステロールへミサクシネート、 3 β — [Ν- ( Ν，，Ν，一ジメチルァミノエタ ン） 力ルバモイノレ] コレステロール、 エノレゴステロールまたはラノステロ一ノレ等 が挙げられる。
本発明に用いられるリン脂質としては、 例えばホスファチジルコリ 、 ホスフ ァチジルエタノーノレアミン、 ホスファチジノレセリン、 ホスファチジン酸、 ホスフ ァチジルグリセローノレ、 ホスファチジノレイノシトール、 リゾホスファチジノレコリ ン、 スフインゴミエリン、 卵黄レシチン、 大豆レシチンまたは水素添加リン脂質 等の天然または合成のリン脂質等が挙げられる。
本発明において、 これらの脂質は 1種でもよく 2種以上を組み合わせて用いる こともできる。
これらの脂質の配合比は特に限定されるものではなく、 公知の配合比を用いる ことができる。 例えば、 リン脂質/コレステロール/脂肪酸の配合比は、 モル比で 10/1〜20/0.1〜5が好ましく、 10/6〜： 12/1.5〜2.5がより好ましい。
本発明の生体組織検査薬に用いられるリン脂質小胞体に使用される総脂質量は、 ヘモグロビンの使用量に対し、 約 0.：！〜 2.0 (単位： g/g) であることが好ましい。
さらに本発明においては、 リン脂質小胞体の表面がポリアルキレングリコール 類で修飾されていてもよい。 これによつて本発明の生体組織検査薬の血中滞留時 間を延長させることができるので、' より効率良く、 標的組織又は器官を標識する ことができる。
ポリアルキレングリコール類としては、 特に限定されないが、 アルキレン鎖が 炭素数 1〜6程度のものが好ましい。 また、 アルキ.レン鎖は、 本発明に支障のな い置換基、 例えば水酸基、 力ルポキシル基、 アミノ基、 アルコキシ基などで置換 されていてもよい。 具体的には、 例えば、 ポリエチレングリコール、 ポリプロピ レンダリコールなどを用いることができる。 ポリアルキレングリコール類の分子 量は特に限定されないが、 分子量が約 200〜400 万程度のもの、 好ましくは約 1，000〜50,000程度のものを用いることができる。 本発明において、 ポリアルキ レンダリコール類の含有量は特に限定されないが、 リン脂質小胞体を構成する総 脂質量に対して約 0.1~30モル％程度が好ましい。
本発明に用いられるリン脂質小胞体は、 既知の方法、 例えば、 逆相蒸発法、 高 圧押出法、 マイクロフルイダィザ一法などにより調製することができる。 リン脂 質小胞体の表面をポリアルキレングリコール類で修飾する方法も公知であり、 通 常、 非リン脂質型の脂質とポリアルキレングリコール類とをスぺーサなどを介し て結合させた結合脂質をリン脂質小胞体の構成脂質として用いることなどによつ てリン脂質小胞体の表面を修飾することができる。
リン脂質小胞体内部に i502 で標識したへモグロビンを内包させる方法として は、 リン脂質小胞体を調製する際にリン脂質小胞体の構成脂質の混合液中に
15〇2で標識したへモグロビンを添加する方法を使用することもできる。 伹し、 1502の半減期が短いことを考慮すると、 未標識のへモグロビンを用いてあらか じめへモグロビン内包リボソームを調製しておき、 使用時にへモグロビン内包リ ポソームの分散液または浮遊液中に ΐ502ガスをパブリングし、 ヘモグロビンを 1502標識する方法が好ましい。
本発明の生体組織検査薬の使用量は、 患者の年齢、 性別、 体重、 症状、 検査部 位、 投与方法 （急速、 持続） などによって異なり、 特に限定されないが、 通常投 与時の ΐ502の放射能レベルが 18.5MBq〜740 MBq になることが好ましく、 37MBq〜370MBqがより好ましい。
• ヘモグロビン内包リボソームの調製方法として、 より具体的には、 Sakai H， et al.: Hemoglobin-vesicies suspended in recombinant numan serum albumin for resuscitation from hemorrhagic shock in anesthetized rats. Crit Care Med 2004 Vol. 32, No. 2, 539-545 (以下、 文献 1という） に記載の方法を参照するこ とができる。 なお、 文献 1は参照によって本明細書に組み込まれるものとする。 なお、 本発明の生体組織検查薬には、 必要に応じて、 電解質、 糖質、 アミノ酸、 抗酸化剤、 pH調整剤、 等張化剤などの公知の添加剤を含むこともできる。 これ らは、 通常、 医薬に用いられるものであれば特に限定されるものではなく、 1種 で用いることもできるし、 2種以上を組み合わせて用いることもできる。 これら の添加剤は、 リン脂質小胞体の調製時に構成脂質成分と混合することにより、 リ ン脂質小胞体内部に内包させてもよい。
本発明に用いられる電解質としては、 例えば、 ナトリウム塩 （例えば、 塩化ナ トリゥム、 炭酸水素ナトリゥム、 クェン酸ナトリゥム、 乳酸ナトリ ゥム、 硫酸ナ トリウム、 リン酸二水素ナトリウム、 リン酸水素ニナトリウム、 酢酸ナトリウム、 グリセ口リン酸ナトリウム、 炭酸ナトリウム、 アミノ酸ナトリウム塩、 プロピオ ン酸ナトリゥム、 —ヒ ドロキシ酪酸ナトリゥム、 ダルコン酸ナトリゥム） 、 力 リウム塩 (例えば、 塩化カリウム、 酢酸カリウム、 ダルコン酸カリウム、 炭酸水 素カリウム、 グリセ口リン酸カリウム、 硫酸カリウム、 乳酸カリウム、 ヨウ化力 リウム、 リン酸二水素カリウム、 リン酸水素二カリウム、 クェン酸カリウム、 ァ ミノ酸力リゥム塩、 プロピオン酸カリゥム、 ーヒ ドロキシ酪酸力リゥム） 、 力 ルシゥム塩 （例えば、 塩化カルシウム、 ダルコン酸カルシウム、 乳酸カルシウム、 グリセ口リン酸カルシウム、 パントテン酸カルシウム、 酢酸カルシウム） 、 マグ ネシゥム塩 （例えば、 塩化マグネシウム、 硫酸マグネシウム、 グリセ口リン酸マ グネシゥム、 酢酸マグネシウム、 乳酸マグネシウム、 アミノ酸マグネシウム塩） 、 アンモニゥム塩 （例えば、 塩化アンモニゥム） 、 亜鉛塩 （例えば、 硫酸亜鉛、 塩 化亜鉛、 ダルコン酸亜鉛、 乳酸亜鉛、 酢酸亜鉛） 、 鉄塩 （例えば、 硫酸鉄、 塩化 第一鉄、 ダルコン酸鉄） 、 銅塩 （例えば、 硫酸銅） 、 マンガン塩 (例えば、 硫酸 マンガン） 等が挙げられる。 この中でも、 特に塩化ナトリウム、 塩化カリウム、 塩化マグネシウム、 リン酸水素ニナトリウム、 リン酸水素二カリウム、 リン酸二 水素力リゥム、 乳酸ナトリゥム、 酢酸ナトリゥム、 タエン酸ナトリゥム、 酢酸力 リウム、 グリセ口リン酸カリウム、 ダルコン酸カルシウム、 塩化カルシウム、 硫 酸マグネシウム、 硫酸亜鉛が好ましい。
本発明に用いられる糖類としては、 例えば、 グルコース、 フルク トース、 キシ リ トール、 ソルビトール、 マンニトール、 デキス トリン、 グリセリン、 シュクロ ース、 トレノヽロース、 グリセロール、 マルト—ス、 ラク トース、 エリスリ トーノレ、 等が挙げられる。 この中、 特にグルコース、 フルク トース、 キシリ トール、 ソル ビトール、 マンニトール、 デキストリン、 グリセリン、 およぴシュクロースが好 ましい。
本発明に用いられるアミノ酸としては、 例えば、 リジン、 塩酸リジン、 酢酸リ ジン、 ァスパラギン、 グルタミン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 セリン、 ト レオニン、 チロシン、 メチォニン、 シスチン、 システィン、 塩酸システィン、 リ ンゴ酸システィン、 ホモシスティン、 ィソロイシン、 ロイシン、 フエ二ルァラ二 ン、 トリプトフ 'アン、 バリン、 アルギニン、 塩酸アルギニン、 ヒスチジン、 塩酸 ヒスチジン、 ァラニン、 プロリン、 ァミノ酢酸等おょぴそれらの塩等が挙げられ る。 この中、 特にリジン、 ァスパラギン、 グルタミン、 ァスパラギン酸、 グルタ ミン酸、 セリン、 トレオニン、 チロシン、 メチォニン、 シスチン、 システィン、 ホモシスティン、 ァミノ酢酸が好ましい。
本発明の抗酸化剤としては、 例えば、 亜硫酸水素ナトリウム、 亜硫酸ナトリウ ム、 ピロ亜硫酸ナトリウム （例えば、 メタ重亜硫酸ナトリウム） 、 ロンガリット (CH2OHS02Na) 、 ァスコルビン酸、 ァスコルビン酸ナト リ ウム、 エリ ソルビ ン酸、 エリソルビン酸ナトリ ウム、 システィン、 塩酸システィン、 ホモシスティ ン、 ダルタチオン、 チォグリセロール、 アルファチォグリセリン、 ェデト酸ナト リ ウム、 クェン酸、 クェン酸イソプロピル、 ジクロルイソシァヌール酸カリウム、 チォダリコール酸ナトリゥム、 チオリンゴ酸ナトリゥム、 ピロ亜硫酸ナトリウム
1、 3—ブチレングリコール、 エチレンジァミン E酢酸 Ca 二 Na、 エチレンジ アミン四酢酸二 Na、 アミノ酸亜硫酸塩 （例えば、 L—リジン亜硫酸塩） 、 プチ ルヒ ドロキシァ二ソール (BHA) 、 ジブチルヒ ドロキシトルエン （BHT) 、 没 食子酸プロピル、 ァスコルビン酸パルミテート、 ビタミン Eおよびその誘導体 • (例えば d 1 - a - トコフエロール、 酢酸トコフェロー^/、 天然ビタミン£、 d — δ — トコフエロール、 濃縮混合トコフエロール、 trolox) 、 グアヤタ脂、 ノル ジヒ ドログアヤレト酸 （NDGA) 、 Lーァスコルビン酸ステアリ ン酸エステル、 大豆レシチン、 パノレミチン酸ァスコノレビン酸、 ベンゾトリァゾーゾレ、 ペンタエリ スリチルーテ トラキス [3- (3，5-ジ -t-ブチル -4-ヒ ドロキシフエニル) プロビオネ ート] 2-メルカプトべンズイミダゾール等が挙げられる。 このうち、 亜硫酸水素 ナトリゥム、 亜硫酸ナトリ ゥム、 ァスコルビン酸、 ホモシスティン、 d 1— α— トコフェローノレ、 酢酸トコフェローノレ、 グノレタチオン、 troloxが好ましい。
本発明において、 pH 調整剤としては、 例えば、 酸としては、 アジピン酸、 力 ゼインナトリウム、 塩酸、 希塩酸、 硫酸、 硫酸アルミニウムカリウム、 クェン酸、 クェン酸二水素ナトリゥム、 グリシン、 ダルコノ一 δ—ラタ トン、 ダルコン酸、 ダルコン酸ナトリウム、 結晶リン酸二水素ナトリウム、 コハク酸、 酢酸、 酢酸ァ ンモニゥム、 酒石酸、 D—酒石酸、 乳酸、 氷酢酸、 フマル酸一ナトリウム、 プロ ピオン酸ナトリウム、 ホウ酸、 ホウ酸アンモ-ゥム、 マレイン酸、 マロン酸、 リ ンゴ酸、 無水リン酸ニナトリウム、 メタンスルホン酸、 、 リン酸、 リン酸二水素 塩 （例えば、 リン酸ニ水素力リウム、 リン酸ニ水素ナトリウム） 、 等が挙げられ る。 この中、 塩酸、 クェン酸、 コハク酸、 酢酸、 乳酸、 氷酢酸、 リン酸、 リン酸 二水素カリウム、 リン酸二水素ナトリウムが好ましい。
アルカリ としては、 アンモニア水、 乾燥炭酸ナトリウム、 クェン酸ナトリウム、 酢酸ナトリ ウム、 ジイソプロパノールァミン、 L一酒石酸ナトリウム、 乳酸塩 (例えば、 乳酸カルシウム、'乳酸ナトリウム） 、 ホウ砂、 マレイン酸ナトリウム、 マロン酸ナトリウム、 リンゴ酸ナトリウム、 水酸化カリウム、 水酸化カルシウム、 水酸化ナトリウム、 水酸化マグネシウム、 炭酸水素ナトリウム、 炭酸ナトリウム、 トリイソプロパノールァミン、 モノエタノールァミン、 トリエタノールアミン、 無水酢酸ナトリウム、 無水リン酸一水素ナトリウム、 メダルミン、 リン酸塩 （例 えば、 リン酸三ナトリウム） 、 パルビタールのナトリウム塩、 リン酸水素塩 （例 えば、 リン酸水素ニナトリウム、 リン酸水素二カリウム） 等が挙げられる。 この 中、 特に酢酸ナトリゥム、 水酸化ナトリゥム、 炭酸水素ナトリゥム、 炭酸ナトリ ゥム、 リン酸三ナトリウム、 リン酸水素ニナトリウム、 リン酸—水素二カリウムが 好ましい。
本発明に用いられる等張化剤としては、 例えば、 アミノエチルスルホン酸、 亜 硫酸水素ナトリウム、 塩化力リウム、 塩化カルシウム、 塩化ナトリウム、 塩化べ ンザルコニゥム、 塩化マグネシウム、 糖類 （例えば、 乳糖、 濃グリセリン、 プド ゥ糖、 果糠、 キシリ トール、 グリセリン） 、 糖アルコール （例えば、 D—ソルビ トール、 D—マンニトール） 、 クェン酸、 クェン酸ナトリ ウム、 結晶リン酸二水 素ナトリウム、 臭化カルシウム、 臭化ナトリウム、 水酸化ナトリウム、 生理食塩 液、 酒石酸ナトリウム '二水和物、 炭酸水素ナトリゥム、 ニコチン酸ァ ド、 乳 酸ナトリウム液、 プロピレングリコーノレ、 ペンジノレアノレコーノレ、 ホウ酸、 ホウ砂、 無水ピロリン酸ナトリウム、 リン酸、 リン酸水素ニナトリウム、 リン酸二水素力 リウム、 リン酸二水素ナトリウム、 マクロゴール 4000、 等が挙げられる。 この 中でも特に塩化カリウム、 塩化ナトリウム、 濃グリセリン、 リン酸水素ニナトリ ゥム、 リン酸二水素カリウムが好ましい。
本発明の生体組織検査薬は、 生体組織又は器官における酸素代謝の検出を利用 する検査方法に広く用いることができる。 例えば、 本発明の生体組織検查薬は、
PET 検査に好適に用いることができる。 本発明の生体組織検査薬を用いること によって、 従来の鼻腔から i5O2ガスを吸入していたことによる問題点も解消す ることができ、 安全で効率的に検査を行うことができる。 PET検查によれば、 患者の組織又は器官の働きを断層画像として捉え、 病気の原因や病状を的確に診 断することができるので、 この PET検査に使用できる本発明の生体組織検查薬 の有用性は高い。 病気としては、 癌、 虚血性循環障害 （脳梗塞、 心筋梗塞、 不安 定心筋症など） 、 くも膜下出血、 もやもや病、 脳出血等が挙げられ、 本発明の生 体組織検査薬はこれらの診断に使用できる。
次に、 本発明の生体組織検查薬の製造方法を説明する。 本発明の製造方法は、 ヘモグロビン内包リボソームに内包されるヘモグロビンを 02で標識すること を含む。 ヘモグロビンを 02で標識する方法は既に述べたとおりであり、 15〇2 の半減期が短いことを考慮すると、 へモグロビン内包リボソームを調製した後、 このへモグロビン内包リボソームを含む分散液または浮遊液中に 02ガスをバ ブリングし、 ヘモグロビンを 1502標識することが好ましい。 また、 へモグロビ ン内包リボソームの製造方法についても前述したとおりであり、 既知の方法に従 つて製造することができる。
なお、 本発明の生体組織検査薬を製造する際は無菌条件下で行うことが好まし い。 本発明の製造方法によって製造される生体組織検査薬は、 酸素代謝の検出を 利用する検査に広く用いられ、 特に PET検査に好適に用いられる
2 . 生体組織における酸素代謝の検出方法
次に、 本発明の生体組織における酸素代謝の検出方法について説明する。 本発 明の酸素代謝の検出方法は、 i5O2で標識したヘモグロビンを用いることを特徴 とする。 本発明の好ましい態様によれば、 本発明は、 1502を用いて人工酸素運 搬体中のヘモグロビンを標識し、 この標識されたヘモグロビンを用いることによ つて、 被験者の組織又は器官における i5O2の動態を検出することができる。 よ り好ましくは、 標識されたへモグロビンは被験者の体内に静脈注射によって投与 される。
本発明の方法においては、 i5O2で標識されたヘモグロビンは、 人工酸素運搬 体、 より好ましくはリボソームに内包されて組織又は器官に導入されることが好 ましい。 本発明に用いられる 02で標識したヘモグロビンとしては、 前述した 本発明の生体組織検査薬を用いることができる。 例えば、 i502で標識し へモ グロビンを内包したへモグロビン内包リポソームを用いることによって、 へモグ ロビン由来の副作用を抑制することができる。 本発明の検出方法における i502 で標識したへモグロビンの使用量は、 生体組織検査薬の欄で記載したとおりであ り、 ヘモグロビンの含有量とヘモグロビンの標識に用いられる i502 の使用量か ら定義される。
本発明の好ましい態様によれば、 本発明の方法には、 （a) 1502ガスの作製工程、 (b) i5O2ガスによる人工酸素運搬体中のへモグロビンの標識工程、 （c) i5O2で標識 されたへモグロビンの体内への投与工程、 及ぴ (d) i502の検出工程が含まれる。 以下、 各工程について述べる。
(a) i5O2ガスの作製工程
本工程では i502ガスを作製する。 1502ガスは、 例えばサイクロトロン内にお いて、 窒素 14に重陽子を照射して "N(d， n) i5O反応により作製することができ る。 なお、 窒素 14 は N2ジェネレータにより得ることができる。 あるいは、 15N(p,n)l50 反応により作製することができる。 15N は同位体濃縮によって得 ることができる。 本発明においては、 必要に応じて、 上記の方法で作製された 15〇2を精製する こともできる。 502 ガスの精製は、 モレキュラーシーブを使用することが好ま しい。 このように精製処理を行うことによって、 i502濃度が高まり、 検出され る放射能が増える。 但し、 i502は半減期が短いため、 精製処理によって放射能 レベルが低下する場合がある。 このため、 精製処理は、 濃縮効率や処理時間との バランスによって行うか否かを決定するのが望ましい。
(b) 1502ガスによる人工酸素運搬体中のへモグロビンの標識工程
本工程では 15〇2ガスにより人工酸素運搬体中のヘモグロビンを標識する。
is〇2ガスによる人工酸素運搬体中のヘモグロ ビンの標識は、 例えば HbV
(deoxyHb 型） の分散液もしくは浮遊液に 1502ガス （5'20%1502含有） を約 0.1〜2分程度、 好ましくは 60秒程度バブリングすることにより行うことができ る。
1502使用量は特に限定されないが、 ヘモグロビンの使用量 lg に対し、 通常 3.7GB (！〜 18.5GBq の範囲である。 このように本発明の方法は、 吸入法に比べて i5O2の使用効率が高い。
本発明に用いられる人工酸素運搬体は、 生体内で酸素を可逆的に吸脱着できる ものであれば特に限定されないが、 リン脂質小胞体内部にへモグロビンを内包し たセル型酸素輸液が好ましく使用できる。 より好ましくは HbVが好適に用いら れる。
人工酸素運搬体は、 赤血球製剤に比べて以下の優位性がある。
1) ウィルス不活化および精製処理を行うことができ極めて安全性が高い。 . -
2) 室温で長期間 （望ましくは二年間） 保存可能であるため、 必要なときに必
要な量を用意できる。
3) 血液型不適合の危険性が無い。
4) 他の血液成分との相互作用が無い。
5) タンパクを溶液中に含まないため、 人工肺のような特殊な装置を用いる必
要がない。
(c) 1502で標識されたへモグロビンの体内への投与工程
本工程では i5O2で標識されたヘモグロビンを体内に投与する。 体内への投与 は、 前記 (b)工程で i502標識されたヘモグロビンを内包する人工酸素運搬体を、 例えば注射針とシリンジなどを用いて採取し、 静脈注射することによって行うこ とができる。
(d) 15O2の検出工程
本工程では 02の検出を行う。 例えば、 PET装置を用いて検出を行うことが 好ましい。 これにより、 各組織における酸素代謝状況を検出し、 虚血状態等を診 断することができる。 PET装置は公知のものを使用できる。
通常の PET検査において日常使用される放射能レベルは 200-400MBq前後で ある。 この点を考慮し、 本発明において標識操作時に用いられる放射能レベルは、 通常 200MBq〜2000MBqの範囲であることが好ましレ、。
なお、 i50の放射化学的半減期は 2.04 min ( β + 電子捕獲） であり、 標識効 率なども考慮すると、 上記工程 (a)〜(d)の操作において、 放射能レベルは例えば 次のように変化する。
(a)40GBq→(b) lOGBq→(c) 500MBq→(d) 200MBq
本発明の好ましい態様によれば、 本発明は、 上記の工程 (a)〜(d)を含むことに より、 各組織 （例えば脳） における酸素の代謝状況を検出し、 虚血状態等を診断 することができる。
本発明の好ましい態様によれば、 本発明は、 標識される生理活性物質として、 自己血または赤血球製剤の代わりに人工酸素運搬体を用いるものであるので、 極 めて安全性が高く、 患者や医療スタッフに負担を与えることなく簡便な方法で被 験者の組織又は器官において i502の動態を検出することができる。 さらに、 人 ェ酸素運搬体は血液型不適合の危険性が無く、 他の血液成分との相互作用もない ので、 これらを考慮することなくより簡便な方法で診断を行うことができるとレヽ う利点もある。 また本人工酸素運搬体が常温で長期保存が可能であること、 機能 に大きな個人差のある赤血球に依存しない酸素代謝ィメージングが実施できるこ とは大きな福音である。
なお、 本出願は、 2004年 11月 22 日付提出の米国仮出願 60/630,257号、 及 ぴ 2005年 7月 15 日付提出の米国仮出願 60/699,841の優先権の利益を受けるも のであり、 同出願の明細書に記載の内容は参照によって本明細書に組み込まれる ものとする。 実施例
以下、 実施例により、 本発明を具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら実施 例に限定されるものではない。
1. 血液 6 mlを 15 mlバイアルにいれ、 底部まで差し込んだ注射針を通じて放 射性ガス （約 20%O2含有） を 20秒程度バブリングした。 廃ガスは別途つけ た針からドレインへ回収した。
2. バイアル中 185MBq 程度の放射能が入っている状態で、 ラインにてつない だ注射針とシリンジを用いて血液全量を採取した。
3. シリンジ中の放射能を測定し （18.5MBq) 、 直ちにゥサギ耳に留置しておい たラインを通じて静脈注射し、 注射開始時より 10分間 PETデータ収集した。 結果を図 1上段に示す。 PET装置は、 GE社製 Advanceを使用した。
4. 同様の実験を人工酸素運搬体を用いて繰り返し、 データを収集した。 得られ た画像を図 1下段に示す。 人工酸素運搬体は、 文献 1記載の方法により調製 した試料を使用した。 具体的な調製方法は以下に示したとおりである。
5. 人工酸素運搬体を用いた PET ·測定においても、 血液 （赤血球） を用いた場 合と全く同じ画像が得られたことから、 PET検査に人工酸素運搬体が有効に 用いられることが確認された。 ぐ人工酸素運搬体の調製 >
1,2-ジパルミ トイル -sn-グリセ口- 3-ホスファチジルコリン、 コレステロール、 1，5-ビス- O-へキサデシル -N-スクシニル -L-グルタメ一ト 〔日本精化株式会社 製〕 をモル比にして 5/5/1で含み、 全脂質に対し 0.3 mol%の 1,2-ジステアロイ ル -sn-グリセ口- 3-ホスファチジルエタノールアミン -N-ポリ （エチレングリコー ル） 〔日本油脂株式会社製〕 を含む混合物をナス型フラスコに入れた。 ここにべ ンゼンを加え加温しながら完全溶解させた。 これを液体窒素で凍結後、 凍結乾燥 機に装着し、 12時間凍結乾燥して白色粉末を得た。 これを注射用水に添加して 25°Cで攪拌し、 粒子径 1.8 μ ηι の小胞体分散液を 得た。 この小胞体分散液を液体窒素で凍結して 25°Cで融解させる凍結融解サイ クルを 4回繰返し、 粒径 520nmの小胞体分散液を得た。 この分散液を液体窒素 で凍結後、 凍結乾燥機に装着し、 15時間凍結乾燥して白色乾燥小胞体を得た。 人工酸素運搬体に内包されるヘモグロビン （40 g/dL) は、 献血由来の赤血球 を精製することによって得た。 ァロステリック効果の調節のためにピリ ドキサ一 ノレ 5，-ホスフエ一ト （Sigma Chemical製） をへモグロビンに対して 2.5 モル比 になるよう添加した。
乾燥小胞体にヘモグロビン溶液 5mLを添加し、 25°Cで攪拌してヘモグロビン 小胞体分散液を得た。 この時小胞体の粒子径は 540nm であり、 乾燥前の粒子径 をほぼ保持していた。 こ.れを E X T R U D E R (登録商標） （商品名、 日油リポ ソーム製） に加え、 加圧 （20kg/cm2) しながら 14°Cで孔径 3.0 μ πι、 0·8 μ ηι、 0.65 z m、 0.45 ιη、 0.30 ju m、 0.22 μ m のァセチルセノレロースフィルター （富 士フィルム製） に順次透過させ、 ヘモグロビン小胞体分散液を得た。 これを限外 ろ過膜に通して、 未内包ヘモグロビンを除去した。
R筒型フラスコにへモグロビン小胞体分散液を入れ、 これをロータリーエバポ レータに装填して回転 (56 rpm)させた。 これによつて形成された液膜に、 ハロゲ ンランプ (500W)を用いて酸素通気下 (lL/min)で 3分間可視光を照射し、 一酸化 炭素結合へモグロビン (HbCO)からォキシへモグロビン (HbO2)への配位子交換を 行った。 そしてバイアル瓶に封入した後、 水蒸気飽和させた窒素ガスを瓶内に導 き、 ヘモグロビン小胞体液内でパブリングさせて溶解している酸素を除去し、 人 ェ酸素運搬体を得た。 産業上の利用可能性
本発明は、 患者の組織又は器官における酸素代謝の検出を利用することにより、 患者の病気の原因や病状等を診断する検査方法に広く活用できる。
また、 本発明は癌病巣の検出を既存で汎用されている iiC-flurodeoxyglucose を併用することにより、 酸素の摂取の盛んな癌病巣の質的診断を可能にすること で放射線感受性の有無の ¾定にも応用できる。 本発明により脳梗塞後の神経細胞死周囲の治療回復の余地のある領域の診断に 役立てることが可能になる。

Claims

請 求 の 範 囲
I . i502で標識したへモグロビンを含むことを特徴とする生体組織検査薬。
2 . 1502で標識したヘモグロビンは人工酸素運搬体に内包されたものである、 請求の範囲第 1項又は第 2項記載の生体組織検査薬。
3 . i502で標識したヘモグロビンはリボソームに内包されたものである、 請求 の範囲第 1項記載の生体組織検查薬。
4 . 1502で標識したへモグロビンを内包するへモグロビン内包リポソ一ムを含 むことを特徴とする生体組織検査薬。
5 . 陽電子放射断層撮影検査用である、 請求の範囲第 1項から第 4項のいずれ か記載の生体組織検査薬。
6 . ヘモグロビン内包リボソームに内包されるヘモグロビンを 1502で標識する ことを含む生体組織検査薬の製造方法。
7 . 生体組織検査薬は陽電子放射断層撮影検査用である、 請求の範囲第 6項記 載の生体組織検查薬の製造方法。
8 . 1502で標識したへモグロビンを用いることを特徴とする生体組織における 酸素代謝の検出方法。
9 . i502で標識したヘモグロビンはリボソームに内包されたものである、 請求 の範囲第 8項記載の検出方法。
1 0 . 生体組織における酸素代謝を検出するための 1502で標識したへモグロビ ンの使用。
I I . 1502で標識したヘモグロビンはリボソームに内包されたものである、 請 求の範囲第 1 0項記載の使用。
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