CN111939126A - 一种阳离子脂质体、包含所述脂质体的分散液及它们的制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医疗领域，特别是涉及一种阳离子脂质体、包含所述脂质体的分散液及它们的制备方法和用途。本发明提供一种脂质体，包括：磷脂、流动性缓冲剂和十六烷基三甲基溴化铵。本发明提供一种新的、包含所述脂质体的分散液及它们的制备方法和用途，所述脂质体中包括CTAB，通过CTAB修饰的阳离子脂质体透析可提高对尿毒症蛋白结合类毒素的清除作用，可成为一种有效、成本较低、前途广阔的血液净化疗法。

Description

一种阳离子脂质体、包含所述脂质体的分散液及它们的制备 方法和用途

技术领域

本发明涉及医疗领域，特别是涉及一种阳离子脂质体、包含所述脂质体的分散液及它们的制备方法和用途。

背景技术

蛋白结合类毒素是指在血浆中大部分以结合形式存在、在病理状态下代谢异常而蓄积的毒素。由于蛋白结合类毒素在血液中的游离水平低，与蛋白结合的毒素无法通过透析膜，因而难以通过常规血液透析技术加以清除。尿毒症蛋白结合毒素(PBUTs)在终末期肾脏病患者体内积蓄，与尿毒症并发症的发生率升高相关，其中硫酸吲哚酚与硫酸对甲酚被证实与慢性肾脏病(CKD)患者全因死亡率、心血管疾病的发生率升高密切相关。对尿毒症PBUTs的清除是血液净化技术的难题。PBUTs通常为小分子有机阴离子，其中带有芳香族苯环的有机阴离子在血液循环中主要与血清白蛋白的site II位点紧密结合，以硫酸对甲酚(PCS)、硫酸吲哚酚(IS)、吲哚-3-乙酸(3-IAA)为代表。而对于肝功能异常患者，胆红素水平是影响慢加急性肝衰竭患者死亡的独立危险因素，蓄积的蛋白结合类毒素在肾衰竭、肝性脑病、循环障碍等严重并发症的继发性发展中起着重要作用。以白蛋白透析(AD)为代表的人工肝支持技术(ALSS)应运而生，ALSS通过清除肝功能衰竭患者体内蓄积的胆红素、胆汁酸等蛋白结合类毒性物质和代谢产物，促进内环境改善，帮助患者渡过急性期以待肝脏移植或自身肝功能恢复。

在白蛋白透析治疗过程中，血液中游离的蛋白结合类毒素弥散进入透析液，导致血液侧游离毒素的浓度下降，使毒素-白蛋白结合/解离平衡状态向解离方向移动，从而解离及释放毒素，并达到新的平衡。透析液中与白蛋白结合的毒素量即决定了毒素清除量。白蛋白透析结合了血浆灌流去除蛋白结合类毒素的优势，以及血液透析良好的生物相容性，其实质是以弥散、吸附为基础的清除作用。尽管白蛋白透析能有效清除水溶性毒素及蛋白结合类毒素，纠正患者内环境紊乱，从而改善临床症状，其临床应用却受到人血白蛋白来源和治疗费用的限制。寻找替代白蛋白透析、成本低廉、且有效清除蛋白结合类毒素的血液净化方式将有助于提高对尿毒症患者体内PBUTs的清除，以及帮助肝功能衰竭患者改善症状。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种阳离子脂质体、包含所述脂质体的分散液及它们的制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种脂质体，包括：磷脂、流动性缓冲剂和十六烷基三甲基溴化铵。

在本发明一些实施方式中，流动性缓冲剂与磷脂的重量比为0.2～0.35，十六烷基三甲基溴化铵与磷脂的重量比为≤0.5。

在本发明一些实施方式中，所述流动性缓冲剂选自胆固醇、维生素E中的一种或多种的组合。

在本发明一些实施方式中，所述脂质体还包括弹性增强剂。

在本发明一些实施方式中，所述脂质体的粒径为50～500nm，所述脂质体的表面电势为-2mV～12mV。

在本发明一些实施方式中，所述弹性增强剂选自非离子表面活性剂中的一种或多种的组合，所述非离子表面活性剂优选选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80中的一种或多种的组合。

在本发明一些实施方式中，弹性增强剂与磷脂的重量比为0.35～0.6。

本发明另一方面提供一种脂质体分散液，包括所述的脂质体。

在本发明一些实施方式中，所述脂质体分散液中，脂质体的含量为5～200g/L，优选为20-60g/L；

在本发明一些实施方式中，所述脂质体分散液为含水的脂质体分散液。

在本发明一些实施方式中，所述脂质体分散液中，还包括Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、碳酸氢根、醋酸根、葡萄糖中的一种或多种的组合。

在本发明一些实施方式中，所述脂质体分散液中，还包括：Na⁺125-145mmol/L，K⁺≤4mmol/L，Ca²⁺≤2mmol/L，Mg²⁺≤2mmol/L，Cl^-90-120mmol/L，碳酸氢根25-45mmol/L或醋酸根30-45mmol/L，葡萄糖≤20g/L。

本发明另一方面提供所述的脂质体、或所述的脂质体分散液的制备方法，包括：通过薄膜水化法制备所述脂质体。

在本发明一些实施方式中，所述制备方法具体包括：

A)将各原料组分分散于溶剂中以提供预混物；

B)脱除步骤A)所提供的预混物中的溶剂，以提供磷脂膜；

C)将步骤B)所提供的磷脂膜水合、均化，以提供所述脂质体。

本发明另一方面提供所述的脂质体、或所述的脂质体分散液在制备血液透析液中的用途。

附图说明

图1显示为本发明模拟体外透析实验装置的示意图。

图2显示为本发明实施例1制备获得的CTAB阳离子脂质体粒径示意图。

图3显示为本发明实施例1制备获得的CTAB(10％)阳离子脂质体的透射电镜观察示意图。

图4显示为本发明脂质体透析液室温下的稳定性示意图。A)第1天；B)第10天；C)第14天。D)第10天普通脂质体出现沉淀；E)第10天含聚醚酰亚胺的阳离子脂质体出现沉淀；F)第14天CTAB(10％)脂质体未见明显沉淀；F)第14天CTAB(20％)脂质体未见明显沉淀。

图5显示为本发明脂质体、BSA与PBUTs的结合率示意图。CTAB 0.1为含5％CTAB脂质体；CTAB 0.2为含10％CTAB脂质体；CTAB 0.3为含15％CTAB脂质体；CTAB 0.4为含20％CTAB脂质体。与普通脂质体比，^***P＜0.001；与BSA相比，^##P＜0.01，^###P＜0.001。

图6显示为本发明平衡板透析法检测CTAB脂质体透析液对PBUTs的清除作用示意图。CTAB 0.1为含5％CTAB脂质体；CTAB 0.2为含10％CTAB脂质体；CTAB 0.3为含15％CTAB脂质体；CTAB 0.4为含20％CTAB脂质体。与普通脂质体比，^**P＜0.01，^***P＜0.001；与BSA相比，^#P＜0.05，^###P＜0.001。

图7显示为本发明平衡板透析法检测0-4小时样本室、透析液室中各组PBUTs的浓度变化示意图。CTAB 0.1为含5％CTAB脂质体；CTAB 0.2为含10％CTAB脂质体；CTAB 0.3为含15％CTAB脂质体；CTAB 0.4为含20％CTAB脂质体。

具体实施方式

本发明发明人经过大量实践研究意外发现，以磷脂为主要原料的脂质体，在经过十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)进一步修饰以后，可以进一步增强其对蛋白结合类毒素的吸附作用，包括所述脂质体的透析液对于尿毒症蛋白结合类毒素(PBUTs)的清除作用明显被增强，与传统透析、白蛋白透析、普通脂质体透析比较，在蛋白结合类毒素的清除方面具有明显的优势，在此基础上完成了本发明。

本发明第一方面提供一种脂质体，包括：磷脂、流动性缓冲剂和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。所述脂质体通常包含至少一个脂质双层，所述脂质双层可以是天然的，也可以是人工合成的，所述脂质双层通常可以围绕内部水相形成复层脂质囊泡。

本发明所提供的脂质体中，可以包括磷脂。所述磷脂通常可以作为制备脂质体的骨架材料，适合于制备脂质体的磷脂对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述磷脂可以是天然磷脂和/或合成磷脂等，所述天然磷脂可以是卵磷脂等，具体可以是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、和磷脂酰肌醇(PI)等中的一种或多种的组合，天然磷脂还可以包括氢化大豆PC(HSPC)、鞘磷脂、和磷脂酰甘油(PG)等中的一种或多种的组合；所述合成磷脂可以是胆碱磷酸衍生物(例如DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DEPC等)、磷酸甘油衍生物(例如DMPG、DPPG、DSPG、POPG等)、磷脂酸衍生物(例如DMPA、DPPA、DSPA等)、磷酸乙醇胺衍生物(例如DMPE、DPPE、DSPE、DOPE等)、磷酸丝氨酸衍生物(例如DOPS等)、磷脂PEG衍生物(例如mPEG-磷脂、聚甘油-磷脂、官能化磷脂、末端活化磷脂等)等中的一种或多种的组合。

本发明所提供的脂质体中，还可以包括流动性缓冲剂。所述流动性缓冲剂通常可以用于调节膜流动性。适合于制备脂质体的流动性缓冲剂的种类和用量对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述流动性缓冲剂可以是胆固醇、维生素E等中的一种或多种的组合，再例如，流动性缓冲剂比例过高通常会导致脂质体粒径过大，从而会影响脂质体稳定性，比例过小则通常会导致脂质体粒径过小，则会导致更多的脂质体在透析治疗过程中进入血液侧，流动性缓冲剂与磷脂的重量比具体可以为0.2～0.35、0.2～0.25、0.25～0.3、或0.3～0.35。

本发明所提供的脂质体中，还可以包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。十六烷基三甲基溴化铵作为两亲性组分，通常与磷脂分子一起排列于脂质体的磷脂双层中，十六烷基三甲基溴化铵的引入可以明显改善脂质体对于蛋白结合类毒素的清除能力。脂质体中，十六烷基三甲基溴化铵的使用量是本领域技术人员可调节的，但是十六烷基三甲基溴化铵的使用比例通常不宜过高，其原因在于，十六烷基三甲基溴化铵比例过高会影响脂质体的稳定性，例如，十六烷基三甲基溴化铵与磷脂的重量比可以为≤0.5、0.01～0.05、0.05～0.1、0.1～0.2、0.2～0.3、0.3～0.4、或0.4～0.5。

本发明所提供的脂质体中，还可以包括弹性增强剂。所述弹性增强剂通常用于增强脂质体的膜流动性，提高脂质体的稳定性。适合于制备脂质体的弹性增强剂的种类和用量对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述弹性增强剂可以是非离子表面活性剂等，更具体可以是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80等中的一种或多种的组合，再例如，弹性增强剂比例过高或过低都会影响脂质体的膜结构，从而影响脂质体的稳定性，弹性增强剂与磷脂的重量比具体可以为0.35～0.4、0.4～0.45、0.45～0.5、0.5～0.55、或0.55～0.6。

本发明所提供的脂质体中，所述脂质体的粒径和/或表面的电势是可以通过改变流动性缓冲剂与磷脂比例和/或十六烷基三甲基溴化铵的含量被调整的。例如，增加流动性缓冲剂的比例则通常可以使脂质体的粒径增大，反之则可以使脂质体的粒径减小，所述脂质体的粒径具体可以为50～500nm、50～100nm、100～200nm、200～300nm、300～400nm、或400～500nm；再例如，增加十六烷基三甲基溴化铵的含量通常可以提升脂质体的表面电势，使其具有更大的正电势，反之则可以使脂质体表面的电势下降，所述脂质体的表面的电势具体可以为-2～12mV、-2～0mV、0～2mV、2～4mV、4～6mV、6～8mV、8～10mV、或10～12mV。

本发明第二方面提供一种脂质体分散液，包括本发明第一方面所提供的脂质体。所述脂质体分散液通常为含水的脂质体分散液，从而可以形成稳定的脂质双层，并进一步形成脂质体的分散液。脂质体在脂质体分散液中的含量通常是可以被调整的，例如，以所述脂质体分散液的总质量计，脂质体的含量可以为5～200g/L、5～10g/L、10～20g/L、20～30g/L、30～40g/L、40～60g/L、60～100g/L、100～150g/L、或150～200g/L(即脂质体中各组分的总质量相对于脂质体分散液的体积浓度)。再例如，所述脂质体分散液中，磷脂含量通常决定了脂质体在分散液中的含量，磷脂含量过高通常会导致脂质体浓度过高，影响脂质体分散液的稳定性，磷脂含量过低通常会导致能够实现的毒素清除效果不佳，磷脂的含量具体可以为2～60g/L、2～5g/L、5～10g/L、10～20g/L、20～30g/L、30～40g/L、40～50g/L、或50～60g/L。再例如，所述脂质体分散液中，流动性缓冲剂比例过高会导致脂质体粒径过大及影响脂质体分散液的稳定性，并且多出未参与构成脂质体部分会分散于脂质体分散液中，并在透析过程中部分进入血液，而比例过低则通常会导致脂质体粒径降低，具有潜在提高脂质体在透析治疗过程中进入血液侧的量升高的风险，流动性缓冲剂的含量具体可以为0.5～35g/L、0.5～1g/L、1～3g/L、3～5g/L、5～10g/L、10～15g/L、15～20g/L、20～25g/L、25～30g/L、或30～35g/L。再例如，所述脂质体分散液中，但是十六烷基三甲基溴化铵的使用比例只要不是过高，即不会影响脂质体的稳定性，十六烷基三甲基溴化铵的含量具体可以为≤35g/L、0.1～0.5g/L、0.5～1g/L、1～3g/L、3～5g/L、5～10g/L、10～15g/L、15～20g/L、20～25g/L、25～30g/L、或30～35g/L。再例如，所述脂质体分散液中，弹性增强剂比例过高会影响脂质体的膜结构，从而影响脂质体分散液的稳定性，并且多出未参与构成脂质体部分会分散于脂质体分散液中，并在透析过程中部分进入血液，而比例过低则通常会降低脂质体的稳定性，从而影响脂质体分散液的稳定性，弹性增强剂的含量具体可以为1～50g/L、1～3g/L、3～5g/L、5～10g/L、10～15g/L、15～20g/L、20～25g/L、25～30g/L、30～35g/L、35～40g/L、40～45g/L、或45～50g/L。所述脂质体中各组分在脂质体分散液中的含量通常还需要符合如上所述的各组分之间的比例关系。

本发明所提供的脂质体分散液中，还可以包括血液透析液中可以含有的其他各种组分。例如，所述脂质体分散液还可以包括Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、碳酸氢根、醋酸根、葡萄糖等中的一种或多种的组合。再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括125-145mmol/L的Na⁺；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括≤4mmol/L的K⁺；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括≤2mmol/L的Ca²⁺；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括≤2mmol/L的Mg²⁺；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括90-120mmol/L的Cl^-；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括25-45mmol/L的碳酸氢根；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括30-45mmol/L的醋酸根；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括≤20g/L葡萄糖。

本发明第三方面提供本发明第一方面所提供的脂质体、或本发明第二方面所提供的脂质体分散液的制备方法。通常如上所提供的脂质体的组分配方，本领域技术人员可选择合适的方法制备所述脂质体和/或脂质体分散液，例如，可以通过薄膜水化法制备所述脂质体和/或脂质体分散液。

本发明所提供的制备方法中，可以包括：A)将各原料组分分散于溶剂中以提供预混物。所述制备方法中所使用的溶剂通常可以是原料组分的良溶剂，通常可以为有机溶剂，具体可以是卤代烷烃类溶剂、醇类溶剂等，在本发明一优选实施例中，所述溶剂可以是包括但不限于二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇或乙醇等中的一种或多种的组合，溶剂的使用量可以是25～75mL/1g固体、25～35mL/1g固体、35～45mL/1g固体、45～55mL/1g固体、55～65mL/1g固体、或65～75mL/1g固体。

本发明所提供的制备方法中，还可以包括：B)脱除步骤A)所提供的预混物中的溶剂，以提供磷脂膜。脱除溶剂的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以在减压的条件下，通过蒸发脱除预混物中的溶剂。

本发明所提供的制备方法中，还可以包括：C)将步骤B)所提供的磷脂膜水合、均化，以提供所述脂质体。对磷脂膜进行水合、均化的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以采用水合介质对磷脂膜进行水合，具体可以是合适的水溶液、缓冲液、透析液等。在本发明一优选实施方式中，采用缓冲液和/或透析液对磷脂膜进行水合处理，水合处理中所使用的缓冲液中可以包括但不限于PBS缓冲液、醋酸钙溶液等中的一种或多种的组合，用量可以为15～50mL/1g固体、15～25mL/1g固体、25～35mL/1g固体、或35～50mL/1g固体，水合处理中所使用的透析液中可以包括血液透析液中可以含有的其他各种组分，例如，所述脂质体分散液还可以包括Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、碳酸氢根、醋酸根、葡萄糖等中的一种或多种的组合。再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括125-145mmol/L的Na⁺；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括≤4mmol/L的K⁺；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括≤2mmol/L的Ca²⁺；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括≤2mmol/L的Mg²⁺；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括90-120mmol/L的Cl^-；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括25-45mmol/L的碳酸氢根；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括30-45mmol/L的醋酸根；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括≤20g/L葡萄糖。再例如，可以采用高压均质的方法进行均化，在本发明一优选实施方式中，所述高压均质的参数具体为：均质压力为≤300bar，均质时间为5-60min。

本发明第四方面提供本发明第一方面所提供的脂质体、或本发明第二方面所提供的脂质体分散液在制备血液透析液中的用途，更具体为作为血液透析液中纳米吸附材料的用途。所述透析液对于尿毒症蛋白结合类毒素(PBUTs)具有更强的清除作用，可以用于针对尿毒症蛋白结合类毒素的血液透析中，所述尿毒症蛋白结合类毒素可以是包括但不限于硫酸吲哚酚(IS)、3-吲哚乙酸(3-IAA)、对甲酚等中的一种或多种的组合。

本发明第五方面提供一种血液透析方法，包括：通过本发明第二方面所提供的脂质体分散液对待处理血液进行血液透析处理。对血液进行透析处理的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述血液透析通常指将患者的血液引入透析装置的血室中(例如，通过动脉血管，再例如，可以通过泵体进行输送)，通过透析器膜的扩散可以将血液中所溶解的特定物质从血液中移除的处理方法，经受处理后的血液可以被返送给患者(例如，通过静脉血管)，所述血液透析处理中，通常需要使用透析液与血液进行物质交换，透析液可以被引入血液透析装置中，血液中所溶解的特定物质可以通过血液透析装置中的半透膜扩散到透析液中。

本发明所提供的血液透析方法中，待处理血液通常可以来源于各种可以被施用血液透析的动物，具体可以包括但不限于人类、非人类的灵长类、哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等。

本发明提供一种新的脂质体、包含所述脂质体的分散液及它们的制备方法和用途，所述脂质体中包括十六烷基三甲基溴化铵，通过十六烷基三甲基溴化铵对脂质体的改性，可以有效提高脂质体对尿毒症、肝功能衰竭相关蛋白结合类毒素的清除作用，被应用于血液净化疗法中的透析液中时，具有效率高、成本较低等优点。具体来说，含有十六烷基三甲基溴化铵脂质体的透析液在清除有害毒素方面与白蛋白或其他吸附剂相比具有独特的优势，其合成简单、价格低廉，来源广泛；与白蛋白透析相比，十六烷基三甲基溴化铵脂质体透析也避免了由外源性白蛋白引起的过敏反应；更重要的是，本发明所提供的脂质体和脂质体的分散液对特定毒素的清除效果甚至优于白蛋白，可以高效、选择性地清除特定的内源性和外源性毒素。

本发明提供一种新的、包含所述脂质体的分散液及它们的制备方法和用途，所述脂质体中包括CTAB，通过CTAB修饰的阳离子脂质体透析可提高对尿毒症蛋白结合类毒素的清除作用，可成为一种有效、成本较低、前途广阔的血液净化疗法。通过将该阳离子脂质体加入透析液，可以增强对PBUTs或其他蛋白结合类毒素的清除作用，含有CTAB的阳离子脂质体的透析液在清除有害毒素方面与普通脂质体、白蛋白或其他吸附剂相比，具有合成简单、价格低廉、来源广泛等优势。此外，可能是源于以带正电的CTAB进行修饰，通过增强静电作用进一步提高了对带阴离子的PBUTs的吸附作用，这种纳米材料对带阴离子的PBUTs的清除效果甚至优于白蛋白，可以通过调整CTAB脂质体的电势从而清除特定的内源性和外源性毒素。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1

脂质体的制备：

采用薄膜水化法制备普通脂质体及CTAB阳离子脂质体。CTAB阳离子脂质体中，磷脂(大豆卵磷脂，分析纯，上海艾韦特医药科技有限公司)、胆固醇(分析纯，上海源聚生物科技有限公司)、吐温-80(分析纯，上海源聚生物科技有限公司)和CTAB(sigma)的质量比为10：5：3：2，普通脂质体中，磷脂、胆固醇、吐温-80的质量比为12：5：3。

将磷脂、胆固醇和吐温-80溶于二氯甲烷中(如制备CTAB阳离子脂质体，还同时加入CTAB)，在真空条件下通过旋转蒸发除去二氯甲烷后成膜，并在真空条件下过夜。然后用醋酸钙溶液缓冲液(加入量为25mL/1g固体)对所得干膜进行水合处理，用高压均质机进行均质处理，均质压力60bar，均质时间10min。随后将脂质体溶液装进透析袋并分别在硫酸钠溶液和PBS溶液中分别透析12h和1h。将透析完成脂质体在4℃下保存直至使用。

实施例2

十六烷基三甲基溴化铵脂质体表征：

用磷钨酸染色，并在透射电镜下观察脂质体形态。利用马尔文激光粒度仪检测脂质体粒径和表面电势。

CTAB阳离子脂质体的粒径分布在50～500nm，大部分在100～200nm(如图2所示)，透射电镜下可见磷脂分子的双分子层结构(如图3所示)。CTAB脂质体的电势约在-2～12mV。脂质体溶液在室温下可长时间保持稳定(至少14天)，未见明显沉淀(如图4所示)。

实施例3

CTAB脂质体与上述蛋白结合类毒素的结合率：

结合率检测方法：使用超滤管法(Millipore，分子截留量3KDa)检测阳离子脂质体透析液的直接吸附能力，研究吸附能力与脂质体中CTAB含量的关系(每个样品重复4次)，检测过程中所使用实施例1制备获得的含有脂质体的透析液进行检测。超滤管(Millipore)含分子截留量3KDa的低结合再生纤维素滤过膜，通常用于DNA和蛋白的纯化及浓缩，亦可分离分子量大于3KDa的白蛋白和脂质体。按IS(初始浓度150μmol/L)、3-IAA(20μmol/L)、对甲酚(200μmol/L)浓度将待测蛋白结合类毒素加入实施例1制备获得的含有CTAB阳离子脂质体的透析液、含有普通脂质体的透析液、40g/L的BSA(sigma，纯度≥98％)溶液中，随后以14,000x g转速30分钟离心可将500μL起始体积的溶液充分离心。通过检测离心所得超滤液中、及离心前溶液中相关溶质的浓度，可计算蛋白/脂质体结合率＝(1-游离浓度/总浓度)*100％，具体结果如图5所示。由图5可以观察到随着脂质体中CTAB含量升高(5％-20％)浓度升高，与IS(sigma)、3-IAA(sigma)、对甲酚(sigma)的结合率随之升高。与BSA结合率：IS约为80％，3-IAA约为75％，对甲酚约为78％。与40g/L普通脂质体的结合率相比，40g/L CTAB(10％-20％)脂质体与IS的结合率较高(p<0.05)；40g/L CTAB(15％-20％)脂质体与3-IAA、对甲酚的结合率较高(p<0.05)。与40g/L BSA的结合率相比，40g/L CTAB(15％-20％)脂质体与IS、对甲酚的结合率较高(p<0.05)。统计学方法运用SPSS 21.0统计软件进行处理，数据用平均值±标准差表示，两组间的比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义，下同。

总体而言，CTAB(15％-20％)脂质体与PBUTs的结合作用优于普通脂质体，甚至优于BSA。

实施例4

平衡板透析(RED)法检测清除作用：

毒素清除作用检测方法：

平衡板透析法(Thermo，分子截留量8KDa)初步评估脂质体透析液对上述蛋白结合类毒素的清除能力，检测过程中所使用的透析液为实施例1制备获得的含有脂质体的透析液。快速平衡透析板(Rapid Equilibrium Dialysis,Thermo)包含样本室(300ul)和透析液室(500ul)，之间以8KDa的聚丙烯膜隔开。平衡透析板法是一种精确、可靠的测定蛋白质与化合物或生物物质结合的方法。以250rpm转速在摇床上孵育1、2、4小时，可达到样本室溶质弥散到透析液室的浓度平衡。样本室溶质浓度下降率＝(透前浓度-透后浓度)/透前浓度*100％。

毒素浓度检测方法：

(1)生化检测：以标准生化检测法检测胆红素、胆汁酸、白蛋白等浓度。

(2)高效液相色谱(HPLC)仪建立IS、PCS、3-IAA方法学，利用Agilent 1100型高效液相色谱仪进行各毒素浓度检测。含蛋白、脂质体的样品前处理方法：吸取样本溶液50μL,加入甲醇150μL使蛋白或脂质体沉淀，于4℃，以12,000rpm离心20min，取上清液检测。

在以下实验中选择40g/L作为脂质体浓度。

样本室中分别加入300ul IS(初始浓度150μmol/L)、3-IAA(20μmol/L)、对甲酚(200μmol/L)的BSA(40g/L)溶液，透析液室中分别加入500μL BSA(40g/L)、普通脂质体或CTAB阳离子脂质体透析液。

在RED中250rpm孵育4小时后，可达到样本室溶质弥散到透析液室的浓度平衡，在1、2、4小时从样本室、透析液室中分别取样50μL，样本处理并以HPLC检测，以观察各物质的浓度变化趋势。在RED透析前2小时内，蛋白结合率较高的PBUTs如IS、对甲酚，样本室中PBUTs浓度下降较快，随后放缓；相应地，透析液室中PBUTs浓度上升较快，随后放缓，提示透析液室中结合剂(BSA、脂质体)的结合能力随吸附毒素而下降，对于蛋白结合率较低的PBUTs如3-IAA，在RED透析的4小时内样本室中3-IAA的浓度持续下降(具体结果如图7所示)。

孵育4小时后的样本室中的毒素比较如图6所示，由图6可见，PBS组样品室中各毒素下降率分别为：IS 22.5％；3-IAA 43.4％；对甲酚29.6％。CTAB(10％-20％)脂质体组(40g/L)较普通脂质体组(40g/L)、BSA组(40g/L)IS(56.6％vs.45.5％vs.51.6％，p<0.05)下降率更高。CTAB(0.3-0.4)脂质体组较普通脂质体组3-IAA(57.7％vs.45.5％，p<0.05)下降率更高。CTAB(5％-20％)脂质体组较普通脂质体组、BSA组对甲酚(70.3％vs.62.0vs.54.0％，p<0.05)下降率更高。

总体而言，随着脂质体CTAB含量升高(5％-20％)浓度升高，样本侧PBUTs的下降率随之升高。CTAB(15％-20％)脂质体对PBUTs的清除作用与BSA接近，甚至更佳。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种脂质体，包括：磷脂、流动性缓冲剂和十六烷基三甲基溴化铵。

2.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，流动性缓冲剂与磷脂的重量比为0.2～0.35，十六烷基三甲基溴化铵与磷脂的重量比为≤0.5。

3.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述流动性缓冲剂选自胆固醇、维生素E中的一种或多种的组合；

和/或，所述脂质体还包括弹性增强剂；

和/或，所述脂质体的粒径为50～500nm，所述脂质体的表面电势为-2mV～12mV。

4.如权利要求3所述的脂质体，其特征在于，所述弹性增强剂选自非离子表面活性剂中的一种或多种的组合，所述非离子表面活性剂优选选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80中的一种或多种的组合；

和/或，弹性增强剂与磷脂的重量比为0.35～0.6。

5.一种脂质体分散液，包括如权利要求1～4任一权利要求所述的脂质体。

6.如权利要求5所述的脂质体分散液，其特征在于，所述脂质体分散液中，脂质体的含量为5～200g/L，优选为20-60g/L；

和/或，所述脂质体分散液为含水的脂质体分散液；

和/或，所述脂质体分散液中，还包括Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、碳酸氢根、醋酸根、葡萄糖中的一种或多种的组合。

7.如权利要求6所述的脂质体分散液，其特征在于，所述脂质体分散液中，还包括：Na⁺125-145mmol/L，K⁺≤4mmol/L，Ca²⁺≤2mmol/L，Mg²⁺≤2mmol/L，Cl^-90-120mmol/L，碳酸氢根25-45mmol/L或醋酸根30-45mmol/L，葡萄糖≤20g/L。

8.如权利要求1～4任一权利要求所述的脂质体、或如权利要求5～7任一权利要求所述的脂质体分散液的制备方法，包括：通过薄膜水化法制备所述脂质体。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括：

A)将各原料组分分散于溶剂中以提供预混物；

B)脱除步骤A)所提供的预混物中的溶剂，以提供磷脂膜；

C)将步骤B)所提供的磷脂膜水合、均化，以提供所述脂质体。

10.如权利要求1～4任一权利要求所述的脂质体、或如权利要求5～7任一权利要求所述的脂质体分散液在制备血液透析液中的用途。

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