CN111821263A - 一种脂质体、包含所述脂质体的分散液及它们的制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医疗领域,特别是涉及一种脂质体、包含所述脂质体的分散液及它们的制备方法和用途。本发明提供一种脂质体,包括:磷脂、流动性缓冲剂和亚油酸。本发明所提供的脂质体中包括亚油酸,通过亚油酸对脂质体的改性,可以有效提高脂质体对尿毒症、肝功能衰竭相关蛋白结合类毒素的清除作用,被应用于血液净化疗法中的透析液中时,具有效率高、成本较低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医疗领域,特别是涉及一种脂质体、包含所述脂质体的分散液及它们的制备方法和用途。
背景技术
蛋白结合类毒素是指在血浆中大部分以结合形式存在、在病理状态下代谢异常而蓄积的毒素,由于蛋白结合类毒素在血液中游离水平低,与蛋白结合的毒素无法通过透析膜,因而难以通过常规血液透析技术加以清除。尿毒症蛋白结合毒素(PBUTs)在终末期肾脏病患者体内积蓄,并与尿毒症并发症的发生率升高相关,其中硫酸吲哚酚与硫酸对甲酚被证实与慢性肾脏病(CKD)患者全因死亡率、心血管疾病的发生率升高相关。对尿毒症PBUTs的清除是血液净化技术的难题。而对于肝功能异常患者,胆红素水平是影响慢加急性肝衰竭患者死亡的独立危险因素,蓄积的蛋白结合类毒素在肾衰竭、肝性脑病、循环障碍等严重并发症的继发性发展中起着重要作用。以白蛋白透析(AD)为代表的人工肝支持技术(ALSS)应运而生,ALSS通过清除肝功能衰竭患者体内蓄积的胆红素、胆汁酸等蛋白结合类毒性物质和代谢产物,促进内环境改善,帮助患者渡过急性期以待肝脏移植或自身肝功能恢复。
在白蛋白透析治疗过程中,血液中游离的蛋白结合类毒素弥散进入透析液,导致血液侧游离毒素的浓度下降,使毒素-白蛋白结合/解离平衡状态向解离方向移动,从而解离及释放毒素,并达到新的平衡。透析液中与白蛋白结合的毒素量即决定了毒素清除量。白蛋白透析结合了血浆灌流去除蛋白结合类毒素的优势,以及血液透析良好的生物相容性,其实质是以弥散、吸附为基础的清除作用。几种主要的白蛋白透析方式,包括分子循环再吸附系统(MARS)等都可显著降低血清胆红素、胆汁酸水平,缓解胆汁淤积症,因此白蛋白透析也被用于治疗胆汁淤积症引起的顽固性瘙痒。尽管白蛋白透析能有效清除水溶性毒素及蛋白结合类毒素,纠正患者内环境紊乱,从而改善临床症状,其临床应用却受到人血白蛋白来源和治疗费用的限制。寻找替代白蛋白透析、成本低廉、且有效清除蛋白结合类毒素的血液净化方式将有助于提高对尿毒症患者体内PBUTs的清除,以及帮助肝功能衰竭患者改善症状,为肝功能恢复或等待供体肝争取时机。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种脂质体、包含所述脂质体的分散液及它们的制备方法和用途,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明一方面提供一种脂质体,包括:磷脂、流动性缓冲剂和亚油酸。
在本发明一些实施方式中,流动性缓冲剂与磷脂的重量比为0.2~0.35,亚油酸与磷脂的重量比为≤0.5。
在本发明一些实施方式中,所述流动性缓冲剂选自胆固醇、维生素E中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中,所述脂质体还包括弹性增强剂。
在本发明一些实施方式中,所述脂质体的粒径为50~500nm,所述脂质体的表面负电势为-20mV~5mV。
在本发明一些实施方式中,所述弹性增强剂选自非离子表面活性剂中的一种或多种的组合,所述非离子表面活性剂优选选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中,弹性增强剂与磷脂的重量比为0.35~0.6。
本发明另一方面提供一种脂质体分散液,包括所述的脂质体。
在本发明一些实施方式中,所述脂质体分散液中,脂质体的含量为5~200g/L,优选为20-60g/L;
在本发明一些实施方式中,所述脂质体分散液为含水的脂质体分散液。
在本发明一些实施方式中,所述脂质体分散液中,还包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、碳酸氢根、醋酸根、葡萄糖中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中,所述脂质体分散液中,还包括:Na+125-145mmol/L,K+≤4mmol/L,Ca2+≤2mmol/L,Mg2+≤2mmol/L,Cl-90-120mmol/L,碳酸氢根25-45mmol/L或醋酸根30-45mmol/L,葡萄糖≤20g/L。
本发明另一方面提供所述的脂质体、或所述的脂质体分散液的制备方法,包括:通过薄膜水化法制备所述脂质体。
在本发明一些实施方式中,所述制备方法具体包括:
A)将各原料组分分散于溶剂中以提供预混物;
B)脱除步骤A)所提供的预混物中的溶剂,以提供磷脂膜;
C)将步骤B)所提供的磷脂膜水合、均化,以提供所述脂质体。
本发明另一方面提供所述的脂质体、或所述的脂质体分散液在制备血液透析液中的用途。
附图说明
图1显示为本发明模拟体外透析实验装置的示意图。
图2显示为本发明实施例1制备获得的亚油酸脂质体的粒径示意图。
图3显示为本发明实施例1制备获得的亚油酸脂质体的代表性的透射电子显微镜(TEM)图像,以磷钨酸负染的磷脂双分子层结构包裹亲水性内核,刻度条代表100nm。
图4显示为本发明普通脂质体透析液(左)和亚油酸脂质体透析液(右)在室温下14天的稳定性。A)第1天;B)第5天;C)第10天;D)第14天。
图5显示为本发明实施例中脂质体、BSA与蛋白结合类毒素的结合率示意图,其中,L40:40g/L普通脂质体组;LA5~LA60:脂质体浓度为5g/L、10g/L、20g/L、40g/L、60g/L的亚油酸脂质体组;BSA:牛血清白蛋白组。与BSA组相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001;与L40组相比,#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001。数据表示为平均值±标准误,n=3。
图6显示为本发明实施例快速平衡透析(RED)装置中检测对蛋白结合类毒素的清除作用示意图,其中,PBS:透析液室内不含结合剂的磷酸缓冲盐溶液;BSA:透析液室内含40g/L牛血清白蛋白;L40:透析液室内含40g/L普通脂质体;LA5~LA60:透析液室内亚油酸脂质体浓度为5g/L、10g/L、20g/L、40g/L、60g/L。与BSA组相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001;与L40组相比,#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001。数据表示为平均值±标准误,n=3。
图7显示为本发明实施例体外模拟血液透析评估对蛋白结合类毒素的清除作用示意图,其中,IS(A,B)、3-IAA(C,D)、对甲酚(E,F)、GCA(G,H)、Cr(I,J)在样品侧(A,C,E,G,I)和透析侧(B,D,F,H,J)的浓度。体外透析结束时,与透析液中不含结合剂的HD组相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001;与BSA组相比,#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001。数据表示为平均值±标准误,n=4。
图8显示为本发明不同亚油酸比例的脂质体对尿毒症蛋白结合毒素结合能力示意图,其中,BSA;牛血清白蛋白,L40:脂质体浓度为40g/L的普通脂质体透析液,LA 0.05-0.2:脂质体固态物质中亚油酸含量为5-20%。
具体实施方式
本发明发明人经过大量实践研究意外发现,以磷脂为主要原料的脂质体,在经过亚油酸进一步修饰以后,可以进一步增强其对疏水性毒素的吸附作用,包括所述脂质体的透析液对于PBUTs和肝衰竭相关蛋白结合类毒素的清除作用明显被增强,与传统透析、白蛋白透析、普通脂质体透析比较,在蛋白结合类毒素的清除方面具有明显的优势,在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供一种脂质体,包括:磷脂、流动性缓冲剂和亚油酸。所述脂质体通常包含至少一个脂质双层,所述脂质双层可以是天然的,也可以是人工合成的,所述脂质双层通常可以围绕内部水相形成复层脂质囊泡。
本发明所提供的脂质体中,可以包括磷脂。所述磷脂通常可以作为制备脂质体的骨架材料,适合于制备脂质体的磷脂对于本领域技术人员来说应该是已知的,例如,所述磷脂可以是天然磷脂和/或合成磷脂等,所述天然磷脂可以是卵磷脂等,具体可以是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、和磷脂酰肌醇(PI)等中的一种或多种的组合,天然磷脂还可以包括氢化大豆PC(HSPC)、鞘磷脂、和磷脂酰甘油(PG)等中的一种或多种的组合;所述合成磷脂可以是胆碱磷酸衍生物(例如DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DEPC等)、磷酸甘油衍生物(例如DMPG、DPPG、DSPG、POPG等)、磷脂酸衍生物(例如DMPA、DPPA、DSPA等)、磷酸乙醇胺衍生物(例如DMPE、DPPE、DSPE、DOPE等)、磷酸丝氨酸衍生物(例如DOPS等)、磷脂PEG衍生物(例如mPEG-磷脂、聚甘油-磷脂、官能化磷脂、末端活化磷脂等)等中的一种或多种的组合。
本发明所提供的脂质体中,还可以包括流动性缓冲剂。所述流动性缓冲剂通常可以用于调节膜流动性。适合于制备脂质体的流动性缓冲剂的种类和用量对于本领域技术人员来说应该是已知的,例如,所述流动性缓冲剂可以是胆固醇、维生素E等中的一种或多种的组合,再例如,流动性缓冲剂比例过高通常会导致脂质体粒径过大,从而会影响脂质体稳定性,比例过小则通常会导致脂质体粒径过小,则会导致更多的脂质体在透析治疗过程中进入血液侧,流动性缓冲剂与磷脂的重量比具体可以为0.2~0.35、0.2~0.25、0.25~0.3、或0.3~0.35。
本发明所提供的脂质体中,还可以包括亚油酸。亚油酸作为疏水组分,通常位于脂质体的脂质双层中,亚油酸的引入可以明显改善脂质体对于蛋白结合类毒素的清除能力。脂质体中,亚油酸的使用量是本领域技术人员可调节的,但是亚油酸的使用比例通常不宜过高,其原因在于,亚油酸比例过高会影响脂质体的稳定性,例如,亚油酸与磷脂的重量比可以为≤0.5、0.01~0.05、0.05~0.1、0.1~0.2、0.2~0.3、0.3~0.4、或0.4~0.5。
本发明所提供的脂质体中,还可以包括弹性增强剂。所述弹性增强剂通常用于增强脂质体的膜流动性,提高脂质体的稳定性。适合于制备脂质体的弹性增强剂的种类和用量对于本领域技术人员来说应该是已知的,例如,所述弹性增强剂可以是非离子表面活性剂等,更具体可以是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80等中的一种或多种的组合,再例如,弹性增强剂比例过高或过低都会影响脂质体的膜结构,从而影响脂质体的稳定性,弹性增强剂与磷脂的重量比具体可以为0.35~0.4、0.4~0.45、0.45~0.5、0.5~0.55、或0.55~0.6。
本发明所提供的脂质体中,所述脂质体的粒径和/或表面的电势是可以通过改变流动性缓冲剂与磷脂比例和/或亚油酸的含量被调整的。例如,增加流动性缓冲剂的比例则通常可以使脂质体的粒径增大,反之则可以使脂质体的粒径减小,所述脂质体的粒径具体可以为50~500nm、50~100nm、100~200nm、200~300nm、300~400nm、或400~500nm;再例如,增加亚油酸的含量通常可以降低脂质体表面的电势,使其具有更大的负电势,反之则可以使脂质体表面的电势上升,所述脂质体的表面的电势具体可以为-20~5mV、-20~-15mV、-15~-10mV、-10~-5mV、-5~0mV、或0~5mV。在本发明一优选实施例中,所述脂质体的表面电势为负电势,具体可以为≥-10mV且<-5mV的负电势。
本发明第二方面提供一种脂质体分散液,包括本发明第一方面所提供的脂质体。所述脂质体分散液通常为含水的脂质体分散液,从而可以形成稳定的脂质双层,并进一步形成脂质体的分散液。脂质体在脂质体分散液中的含量通常是可以被调整的,例如,以所述脂质体分散液的总质量计,脂质体的含量可以为5~200g/L、5~10g/L、10~20g/L、20~30g/L、30~40g/L、40~60g/L、60~100g/L、100~150g/L、或150~200g/L(即脂质体中各组分的总质量相对于脂质体分散液的体积浓度)。再例如,所述脂质体分散液中,磷脂含量通常决定了脂质体在分散液中的含量,磷脂含量过高通常会导致脂质体浓度过高,影响脂质体分散液的稳定性,磷脂含量过低通常会导致能够实现的毒素清除效果不佳,磷脂的含量具体可以为2~60g/L、2~5g/L、5~10g/L、10~20g/L、20~30g/L、30~40g/L、40~50g/L、或50~60g/L。再例如,所述脂质体分散液中,流动性缓冲剂比例过高会导致脂质体粒径过大及影响脂质体分散液的稳定性,并且多出未参与构成脂质体部分会分散于脂质体分散液中,并在透析过程中部分进入血液,而比例过低则通常会导致脂质体粒径降低,具有潜在提高脂质体在透析治疗过程中进入血液侧的量升高的风险,流动性缓冲剂的含量具体可以为0.5~35g/L、0.5~1g/L、1~3g/L、3~5g/L、5~10g/L、10~15g/L、15~20g/L、20~25g/L、25~30g/L、或30~35g/L。再例如,所述脂质体分散液中,但是亚油酸的使用比例只要不是过高,即不会影响脂质体的稳定性,亚油酸的含量具体可以为≤35g/L、0.1~0.5g/L、0.5~1g/L、1~3g/L、3~5g/L、5~10g/L、10~15g/L、15~20g/L、20~25g/L、25~30g/L、或30~35g/L。再例如,所述脂质体分散液中,弹性增强剂比例过高会影响脂质体的膜结构,从而影响脂质体分散液的稳定性,并且多出未参与构成脂质体部分会分散于脂质体分散液中,并在透析过程中部分进入血液,而比例过低则通常会降低脂质体的稳定性,从而影响脂质体分散液的稳定性,弹性增强剂的含量具体可以为1~50g/L、1~3g/L、3~5g/L、5~10g/L、10~15g/L、15~20g/L、20~25g/L、25~30g/L、30~35g/L、35~40g/L、40~45g/L、或45~50g/L。所述脂质体中各组分在脂质体分散液中的含量通常还需要符合如上所述的各组分之间的比例关系。
本发明所提供的脂质体分散液中,还可以包括血液透析液中可以含有的其他各种组分。例如,所述脂质体分散液还可以包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、碳酸氢根、醋酸根、葡萄糖等中的一种或多种的组合。再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括125-145mmol/L的Na+;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括≤4mmol/L的K+;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括≤2mmol/L的Ca2+;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括≤2mmol/L的Mg2+;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括90-120mmol/L的Cl-;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括25-45mmol/L的碳酸氢根;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括30-45mmol/L的醋酸根;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括≤20g/L葡萄糖。
本发明第三方面提供本发明第一方面所提供的脂质体、或本发明第二方面所提供的脂质体分散液的制备方法。通常如上所提供的脂质体的组分配方,本领域技术人员可选择合适的方法制备所述脂质体和/或脂质体分散液,例如,可以通过薄膜水化法制备所述脂质体和/或脂质体分散液。
本发明所提供的制备方法中,可以包括:A)将各原料组分分散于溶剂中以提供预混物。所述制备方法中所使用的溶剂通常可以是原料组分的良溶剂,通常可以为有机溶剂,具体可以是卤代烷烃类溶剂、醇类溶剂等,在本发明一优选实施例中,所述溶剂可以是包括但不限于二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇或乙醇等中的一种或多种的组合,溶剂的使用量可以是25~75mL/1g固体、25~35mL/1g固体、35~45mL/1g固体、45~55mL/1g固体、55~65mL/1g固体、或65~75mL/1g固体。
本发明所提供的制备方法中,还可以包括:B)脱除步骤A)所提供的预混物中的溶剂,以提供磷脂膜。脱除溶剂的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的,例如,可以在减压的条件下,通过蒸发脱除预混物中的溶剂。
本发明所提供的制备方法中,还可以包括:C)将步骤B)所提供的磷脂膜水合、均化,以提供所述脂质体。对磷脂膜进行水合、均化的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的,例如,可以采用水合介质对磷脂膜进行水合,具体可以是合适的水溶液、缓冲液、透析液等。在本发明一优选实施方式中,采用缓冲液和/或透析液对磷脂膜进行水合处理,水合处理中所使用的缓冲液中可以包括但不限于PBS缓冲液、醋酸钙溶液等中的一种或多种的组合,用量可以为15~50mL/1g固体、15~25mL/1g固体、25~35mL/1g固体、或35~50mL/1g固体,水合处理中所使用的透析液中可以包括血液透析液中可以含有的其他各种组分,例如,所述脂质体分散液还可以包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、碳酸氢根、醋酸根、葡萄糖等中的一种或多种的组合。再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括125-145mmol/L的Na+;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括≤4mmol/L的K+;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括≤2mmol/L的Ca2+;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括≤2mmol/L的Mg2+;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括90-120mmol/L的Cl-;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括25-45mmol/L的碳酸氢根;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括30-45mmol/L的醋酸根;再例如,所述脂质体分散液中,还可以包括≤20g/L葡萄糖。再例如,可以采用高压均质的方法进行均化,在本发明一优选实施方式中,所述高压均质的参数具体为:均质压力为≤300bar,均质时间为5-60min。
本发明第四方面提供本发明第一方面所提供的脂质体、或本发明第二方面所提供的脂质体分散液在制备血液透析液中的用途,更具体为作为血液透析液中纳米吸附材料的用途。所述透析液对于蛋白结合类毒素具有更强的清除作用,可以用于针对蛋白结合类毒素清除的血液透析中,所述蛋白结合类毒素可以是包括但不限于3-吲哚乙酸(3-IAA)、3-羧基-4-甲基-5-丙基-2呋喃丙酸(CMPF)、胆汁酸等中的一种或多种的组合。
本发明第五方面提供一种血液透析方法,包括:通过本发明第二方面所提供的脂质体分散液对待处理血液进行血液透析处理。对血液进行透析处理的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的,例如,所述血液透析通常指将患者的血液引入透析装置的血室中(例如,通过动脉血管,再例如,可以通过泵体进行输送),通过透析器膜的扩散可以将血液中所溶解的特定物质从血液中移除的处理方法,经受处理后的血液可以被返送给患者(例如,通过静脉血管),所述血液透析处理中,通常需要使用透析液与血液进行物质交换,透析液可以被引入血液透析装置中,血液中所溶解的特定物质可以通过血液透析装置中的半透膜扩散到透析液中。
本发明所提供的血液透析方法中,待处理血液通常可以来源于各种可以被施用血液透析的动物,具体可以包括但不限于人类、非人类的灵长类、哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等。
本发明提供一种新的脂质体、包含所述脂质体的分散液及它们的制备方法和用途,所述脂质体中包括亚油酸,通过亚油酸对脂质体的改性,可以有效提高脂质体对尿毒症、肝功能衰竭相关蛋白结合类毒素的清除作用,被应用于血液净化疗法中的透析液中时,具有效率高、成本较低等优点。具体来说,含有亚油酸脂质体的透析液在清除有害毒素方面与白蛋白或其他吸附剂相比具有独特的优势,其合成简单、价格低廉,来源广泛;与白蛋白透析相比,亚油酸脂质体透析也避免了由外源性白蛋白引起的过敏反应;更重要的是,本发明所提供的脂质体和脂质体的分散液对特定毒素的清除效果甚至优于白蛋白,可以高效、选择性地清除特定的内源性和外源性毒素。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知,下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
此外应理解,本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤,除非另有说明;还应理解,本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置,除非另有说明。而且,除非另有说明,各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具,而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围,其相对关系的改变或调整,在无实质变更技术内容的情况下,当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1
脂质体的制备:
采用薄膜水化法制备大豆卵磷脂脂质体及亚油酸修饰的脂质体。
亚油酸修饰的脂质体中,大豆卵磷脂(分析纯,上海艾韦特医药科技有限公司)、胆固醇(分析纯,上海源聚生物科技有限公司)、吐温-80(分析纯,上海源聚生物科技有限公司)和亚油酸(分析纯,Sigma)之间的比例为9:3:4:3,大豆卵磷脂脂质体中(即未加入亚油酸修饰的脂质体),大豆卵磷脂、胆固醇、吐温-80之间的比例为12:5:3,将各原料组分溶于二氯甲烷中,真空蒸发过夜。然后用PBS缓冲液(加入量为25mL/1g固体)对所得干膜进行水合处理,用高压均质机进行均质处理,均质压力60bar,均质时间10min。并在4℃下保存直至使用。
实施例2
亚油酸脂质体表征:
用磷钨酸染色,并在透射电镜下观察亚油酸脂质体形态。利用Zetasizer仪测量脂质体粒径和电势。
大多数脂质体的直径范围为100-200nm,分布范围大概为109.1±60.28nm,亚油酸脂质体平均粒径约为116.4±0.99nm,分散系数(PDI)0.15±0.01(图2)。透射电镜下可见磷脂双分子层包裹水性内核的结构(图3)。脂质体溶液在室温下14天稳定,不发生沉淀,脂质体的稳定性部分归因于其表面负电势(-6.96±0.68mV)有关(图4)。
实施例3
亚油酸脂质体与上述蛋白结合类毒素的结合率:
结合率检测方法:超滤管法(Millipore,分子截留量10KDa)评价亚油酸脂质体透析液对PBUTs、肝功能衰竭相关蛋白结合类毒素(胆红素、胆汁酸等)的直接吸附能力,初步确定合适的脂质体浓度,检测过程中所使用的透析液为实施例1制备获得的含有脂质体的透析液。超滤管(Millipore)含分子截留量10KDa的低结合再生纤维素滤过膜,通常用于DNA和蛋白的纯化及浓缩,亦可分离分子量大于10KDa的白蛋白和脂质体。按IS(初始浓度150μmol/L)、3-IAA(20μmol/L)、PCS(200μmol/L)、CMPF(250μmol/L)、GCA(80μmol/L)、CA(80μmol/L)、脱氧胆酸(DCA 80μmol/L)、未结合胆红素(60μmol/L)浓度将待测蛋白结合类毒素加入实施例1制备获得的含有亚油酸修饰的脂质体的透析液、含有大豆卵磷脂脂质体的透析液、40g/L的BSA(sigma,纯度≥98%)溶液中,随后进行离心,以14,000x g转速30分钟可将500μL起始体积浓缩至15μL。通过检测离心所得超滤液中、及离心前溶液中相关溶质的浓度,可计算蛋白/脂质体结合率=(1-游离浓度/总浓度)*100%。
观察到随着亚油酸脂质体(5-60g/L)浓度升高,与PBUTs、未结合胆红素、胆汁酸等蛋白结合类毒素的的结合率随之升高(图5)。与40g/L普通脂质体的结合率相比,40g/L亚油酸脂质体与3-IAA、CMPF、甘氨胆酸(GCA)、胆酸(CA)的结合率较高(p<0.05)。总体而言,亚油酸脂质体(40g/L)与PBUTs、肝功能衰竭相关蛋白结合类毒素的结合作用与BSA(40g/L)相近。
实施例4
平衡板透析(RED)法检测清除作用:
毒素清除作用检测方法:
平衡板透析法(Thermo,分子截留量12KDa)初步评估脂质体透析液对上述蛋白结合类毒素的清除能力,检测过程中所使用的透析液为实施例1制备获得的含有脂质体的透析液。快速平衡透析板(Rapid Equilibrium Dialysis,Thermo)包含样本室(300ul)和透析液室(500ul),之间以12KDa的聚丙烯膜隔开。平衡透析板法是一种精确、可靠的测定蛋白质与化合物或生物物质结合的方法。以250rpm转速在摇床上孵育4小时,可达到样本室溶质弥散到透析液室的浓度平衡。样本室溶质浓度下降率=(透前浓度-透后浓度)/透前浓度*100%。
毒素浓度检测方法:
(1)生化检测:以标准生化检测法检测胆红素、胆汁酸、白蛋白等浓度。
(2)高效液相色谱(HPLC)仪建立IS、PCS、3-IAA方法学,利用Agilent 1100型高效液相色谱仪进行各毒素浓度检测。
在以下实验中选择40g/L作为脂质体浓度。
分别配制含IS(初始浓度150μmol/L)、3-IAA(20μmol/L)、PCS(200μmol/L)、CMPF(250μmol/L)、GCA(80μmol/L)、CA(80μmol/L)、脱氧胆酸(DCA 80μmol/L)、未结合胆红素(60μmol/L)的BSA(40g/L)溶液。
在RED中250rpm孵育4小时后,PBS组样品室中各毒素下降率分别为:IS 21.85±1.01%;3-IAA 39.88±0.41%;对甲酚9.73±3.21%;CMPF 1.76±2.15%;GCA 3.00±1.46%;CA 1.41±0.28%;DCA 0.96±0.32%;胆红素0.68±2.70%。
亚油酸脂质体组(40g/L)相较于普通脂质体组(40g/L)对IS(68.89±1.73%v.s.45.01±0.29%,p<0.05)、3-IAA(49.68±0.47%v.s.42.45±1.60%,p<0.05)、CMPF(12.34±0.72%v.s.5.23±0.22%,p<0.05)、GCA(13.00±0.85%v.s.9.08±1.29%,p<0.05)、CA(10.47±1.60%v.s.6.26±1.10%,p<0.05)的下降率更高。
亚油酸脂质体组(40g/L)相较于BSA组(40g/L)对甲酚(52.53±1.57%v.s.35.08±0.24%,p<0.05)的下降率更高。对于蛋白结合率特别高的溶质,如DCA、未结合胆红素,可提高亚油酸脂质体浓度(60g/L)以增强清除效率(图6)。
总体而言,随着亚油酸脂质体(5-60g/L)浓度升高,样本侧蛋白结合类毒素的的下降率随之升高。
实施例5
体外透析模型评估脂质体透析液对蛋白结合类毒素的清除作用:
毒素清除作用检测方法:
构建包含微型透析器(分子截留量20KD)的体外透析模型(表1),进行体外模拟血液透析实验(图1),评估亚油酸脂质体透析液对蛋白结合类毒素的清除作用,将样本液泵入管路和微型透析器(Dialyzer),透析液(Dialysate)侧装有100mL以BSA或脂质体为结合剂或不含结合剂的PBS透析液。样本(Sample)侧装有50mL含上述浓度毒素的40g/L BSA溶液。体外透析采用5.0ml/min的血液流速(Qb)和5.0ml/min的透析液流速(Qd)进行,超滤为0ml/min,持续6小时。检测过程中所使用的透析液为实施例1制备获得的含有脂质体的透析液。
表1微滤器参数
毒素浓度检测方法参照实施例4。
利用微型透析器建立模拟血液透析平台,选择IS(初始浓度150μmol/L)、3-IAA(20μmol/L)、对甲酚(200μmol/L)、GCA(80μmol/L)作为蛋白结合类毒素的代表,肌酐(750μmol/L)作为水溶性毒素的代表。
在6小时体外循环结束时,亚油酸脂质体组(40g/L)较PBS组样本侧GCA(27.76±2.36μmol/L v.s.46.20±2.42μmol/L,p<0.05);IS(77.25±5.11μmol/L v.s.97.74±6.00μmol/L,p<0.05)浓度更低(n=4)。相应地,亚油酸脂质体组(40g/L)较PBS组透析液侧GCA(13.55±0.31μmol/L v.s.9.49±0.21μmol/L,p<0.05);IS(37.32±1.93μmol/Lv.s.16.74±3.29μmol/L,p<0.05)浓度更高,即亚油酸脂质体透析液较PBS透析液对GCA、IS具有更好的清除效果。亚油酸脂质体组(40g/L)较PBS组样本侧3-IAA浓度无统计学差异,但亚油酸脂质体组(40g/L)较PBS组透析液侧3-IAA浓度更高(5.22±0.99μmol/L v.s.2.73±0.96μmol/L,p<0.05),即亚油酸脂质体透析液较PBS透析液可以提取更多的3-IAA溶质。
在6小时体外循环结束时,亚油酸脂质体组(40g/L)较BSA(40g/L)组样本侧对甲酚浓度更低(35.26±2.52μmol/L v.s.61.53±9.28μmol/L,p<0.05),相应地,亚油酸脂质体组较BSA组透析液侧对甲酚浓度更高(81.27±1.31μmol/L v.s.61.47±2.63μmol/L,p<0.05),即亚油酸脂质体透析液对于对甲酚的清除效果甚至优于BSA。模拟透析实验中证实,亚油酸脂质体对蛋白结合类毒素的清除作用优于PBS,对部分毒素甚至优于BSA溶液。此外,在PBS缓冲液中添加白蛋白或脂质体不会对以肌酐(Cr)为代表的水溶性溶质的清除作用产生影响(图7)。
实施例6
不同亚油酸比例的脂质体对尿毒症蛋白结合毒素结合能力的研究:
采用薄膜水化法制备脂质体方法如实施例1所述。调整亚油酸在脂质体总固含量中的比例为5%、10%、20%。以超滤管法检测不同亚油酸比例的脂质体对PBUTs的结合作用,超滤管法的步骤详见实施例3,具体的检测结果如图8所示。
图8中,可以观察到随着亚油酸固含量(5-20%)的升高,脂质体与IS、3-IAA、对甲酚的结合率随之升高。与浓度为40g/L的普通脂质体溶液的结合率相比,亚油酸固含量为10-20%的亚油酸脂质体与IS、3-IAA、对甲酚的结合率较高;总体而言,亚油酸固含量为10-20%的亚油酸脂质体与PBUTs的结合作用与BSA相近。
综上所述,本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种脂质体,包括:磷脂、流动性缓冲剂和亚油酸。
2.如权利要求1所述的脂质体,其特征在于,流动性缓冲剂与磷脂的重量比为0.2~0.35,亚油酸与磷脂的重量比为≤0.5。
3.如权利要求1所述的脂质体,其特征在于,所述流动性缓冲剂选自胆固醇、维生素E中的一种或多种的组合;
和/或,所述脂质体还包括弹性增强剂;
和/或,所述脂质体的粒径为50~500nm,所述脂质体的表面负电势为-20mV~5mV。
4.如权利要求3所述的脂质体,其特征在于,所述弹性增强剂选自非离子表面活性剂中的一种或多种的组合,所述非离子表面活性剂优选选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80中的一种或多种的组合;
和/或,弹性增强剂与磷脂的重量比为0.35~0.6。
5.一种脂质体分散液,包括如权利要求1~4任一权利要求所述的脂质体。
6.如权利要求5所述的脂质体分散液,其特征在于,所述脂质体分散液中,脂质体的含量为5~200g/L,优选为20-60g/L;
和/或,所述脂质体分散液为含水的脂质体分散液;
和/或,所述脂质体分散液中,还包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、碳酸氢根、醋酸根、葡萄糖中的一种或多种的组合。
7.如权利要求6所述的脂质体分散液,其特征在于,所述脂质体分散液中,还包括:Na+125-145mmol/L,K+≤4mmol/L,Ca2+≤2mmol/L,Mg2+≤2mmol/L,Cl- 90-120mmol/L,碳酸氢根25-45mmol/L或醋酸根30-45mmol/L,葡萄糖≤20g/L。
8.如权利要求1~4任一权利要求所述的脂质体、或如权利要求5~7任一权利要求所述的脂质体分散液的制备方法,包括:通过薄膜水化法制备所述脂质体。
9.如权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法具体包括:
A)将各原料组分分散于溶剂中以提供预混物;
B)脱除步骤A)所提供的预混物中的溶剂,以提供磷脂膜;
C)将步骤B)所提供的磷脂膜水合、均化,以提供所述脂质体。
10.如权利要求1~4任一权利要求所述的脂质体、或如权利要求5~7任一权利要求所述的脂质体分散液在制备血液透析液中的用途。
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