CN101001639A - 血管活性肠肽(vip)/垂体腺苷酸环化酶活化肽(pacap)受体2(vpac2)激动剂的聚乙二醇化和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含与聚乙二醇聚合物连接的VPAC2激动剂的修饰血管活性肠肽(VIP)/垂体腺苷酸环化酶活化肽(PACAP)受体2(VPAC2)激动剂(VPAC2激动剂)，以及用于治疗目的的其相关配方、剂量和给药方法。这些VPAC2激动剂、组合物和方法，在没有降低或减低血压的治疗限制副作用的情况下，通过诱导葡萄糖依赖性胰岛素分泌而有效用于给那些患有代谢紊乱例如糖尿病、葡萄糖耐量削弱、代谢性综合征或前期糖尿病状态的个体提供治疗方案。
Description
本申请要求2004年6月12日提交的美国临时申请序列No.60/579,190的权益，本文引入其全部内容作为参考。
发明领域
本发明涉及包含与聚乙二醇聚合物连接的VPAC2激动剂的修饰性血管活性肠肽(VIP)/垂体腺苷酸环化酶活化肽(PACAP)受体2(VPAC2)激动剂(VPAC2激动剂)，以及用于治疗目的的其相关制剂、剂量和给药方法。这些VPAC2激动剂、组合物和方法，在没有减少或降低血压的治疗限制副作用的情况下，通过诱导葡萄糖依赖性胰岛素分泌而有效用于给那些患有代谢紊乱例如糖尿病、葡萄糖耐量削弱、代谢性综合症或前期糖尿病状态的个体提供治疗方案。
发明背景
糖尿病以其本身显现的葡萄糖代谢削弱为特征，其中，糖尿病患者的血糖水平升高。下面的缺陷导致糖尿病分为两个主要类型：1型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，其是当在患者的胰腺中缺乏产生胰岛素的β-细胞时产生的，和2型糖尿病或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)，其存在于患有β-细胞功能削弱和胰岛素作用改变的患者中。
目前用胰岛素治疗1型糖尿病患者，而大部分2型糖尿病患者是用刺激β-细胞功能的药剂或用增强患者对于胰岛素的组织灵敏度的药剂治疗的。随着时间的过去，几乎一半2型糖尿病患者对这些药剂失去响应，而后必须采用胰岛素疗法。
由于当前治疗的问题，需要治疗2型糖尿病的新疗法。尤其是，需要维持正常(葡萄糖-依赖性)胰岛素分泌的新疗法。这种新药具有下列特征：依赖促进胰岛素分泌的葡萄糖(即仅在高血糖存在下产生胰岛素分泌)；低的原发性和继发性失败率；和保护小岛细胞功能。本文中公开的开发新疗法的策略是以环腺苷酸单磷酸酯(cAMP)信号机理和其对胰岛素分泌的影响为基础的。
环化AMP是胰岛素分泌过程的主要调节剂。在蛋白激酶A路径活化之后，这种信号分子的升高促进了K+通道的关闭。K+通道的关闭导致细胞去极化，和随后的Ca++通道的开放，其反过来导致胰岛素粒的胞吐作用。在低葡萄糖浓度的情况下，几乎不存在对胰岛素分泌的影响(Weinhaus等人，Diabetes 47：1426-1435，1998)。促泌剂类垂体腺苷酸环化酶活化肽(“PACAP”)和GLP-1(胰高血糖素样肽1)以葡萄糖-依赖性方式使用cAMP系统来调节胰岛素分泌(Filipsson等人，Diabetes 50：1959-1969，2001；Komatsu等人，Diabetes46：1928-1938，1997；Drucker，Endocrinol.142：521-527，2001)。通过升高cAMP起作用的胰岛素促泌剂，例如GLP-1和PACAP，除了增加胰岛素释放之外，还能增加胰岛素合成(Borboni等人，Endocrinol.140：5530-5537，1999；Skoglund等人，Diabetes 49：5530-5537，2000)。
PACAP是源于胰腺β-细胞的葡萄糖-依赖性胰岛素分泌的有效激活剂。已经描述了三种不同的PACAP受体类型(PAC1，VPAC1和VPAC2)(Vaudry等人，Pharmacol.Rev.52：269-324，2000；Harmar等人，Pharmacol.Rev.50：265-270，1998)。PACAP显示没有受体选择性、对于所有三种受体具有类似的活性和效能。PAC1主要位于CNS，而VPAC1和VPAC2分布更广。VPAC1位于CNS以及肝脏、肺和肠中。VPAC2位于CNS、胰腺、骨骼肌、心脏、肾脏、脂肪组织、睾丸和胃中。最近的研究表明，VPAC2在源于β-细胞的胰岛素分泌中起一定作用(Inagaki等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2679-2683，1994；Tsutsumi等人，Diabetes 51：1453-1460，2002)。VPAC2活化导致胞内cAMP的升高，其反过来活化β-细胞增加的[Ca++]中的非选择性阳离子通道，并促进包含胰岛素的分泌颗粒的胞吐。
PACAP是代谢、神经内分泌和神经传递介质肽类激素超家族的新成员，其通过cAMP-介导的信号转导途径产生其作用(Arimura，Regul.Peptide 37：287-303，1992)。生物学活性肽是从两种分子形式中的生物合成前体中释放的，可以是具有酰胺化羧基末端的38-氨基酸肽(PACAP-38)和/或27-氨基酸肽(PACAP-27)的形式。
在脑和睾丸中发现了最高浓度的两种形式的肽。较短形式的肽，PACAP-27，显示了与血管活性肠多肽(VIP)的68％结构同源性。最近的研究证明了PACAP的各种生物学作用，从复制作用至刺激胰岛素分泌的能力(McArdle，Endocrinol.135：815-817，1994；Yada等人，J.Biol.Chem.269：1290-1293，1994)。此外，PACAP似乎在脂类和碳水化合物代谢的激素调节、昼夜节律功能、免疫系统、生长、能量动态平衡、男性生殖功能、调节食欲、以及急性和慢性炎症性疾病、脓毒性休克和自身免疫疾病(例如系统性红斑狼疮)中起一定作用(Gray等人，Mol.Endocrinol.15：1739-1747，2001；Harmar等人，Cell 109：497-508，2002；Asnicar等人，Endocrinol.143：3994-4006，2002；Tachibana等人，Neurosci.Lett.339：203-206，2003；Pozo，Trend.Mol.Med.9：211-217，2003)。
PACAP-27导致外周血管舒张，其引起心率的代偿性增加(Gardiner等人，Br.J.Pharmacol.111：589-597，1994；Champion等人，Ann.NY Acad.Sci.805：429-441，1996)。对于受体介导这种心血管副作用的译码，试验非选择性激动剂PACAP-27、VPAC1/VPAC2选择性激动剂VIP、PAC1-选择性激动剂maxadilian、VPAC1选择性激动剂PG 97-269和VPAC2选择性激动剂BAY 55-9837对心率和血压的影响(Moro等人，J.Biol.Chem.272：966-970，1997；Gourlet等人，Peptides 18：1555-1560，1997；Tsutsumi等人，，2002)。当静脉内注射0.1nmol/kg肽时，PACAP-27和PAC1选择性激动剂在狗中增加了两倍心率，而VIP和VPAC1-选择性激动剂仅仅增加了10-20％心率。相同剂量的VPAC2选择性激动剂没有效果。尽管大部分心血管副作用可以归于PAC1活性化，但VPAC2激动剂还在鼠模型中显示了显著的心血管效果。在大鼠中以快速灌注方式静脉注射之后，它以剂量-依赖性方式降低平均动脉压，具有400pmol/kg的ED50。在禁食大鼠中通过静脉注射这种肽导致血浆胰岛素水平以剂量-依赖性方式增加，具有3pmol/kg的ED50。虽然在促进胰岛素分泌的效果和心血管副作用之间似乎有显著的差别，但在治疗2型糖尿病中，安全性需要更大的差别。
因此，本发明提供了VPAC2激动剂、组合物和方法，通过在没有降低或减低血压的治疗限制副作用的情况下诱导葡萄糖-依赖性胰岛素分泌而有效用于给那些患有代谢紊乱例如糖尿病、葡萄糖耐量削弱、代谢性综合症或前期糖尿病状态的个体提供治疗方案。
发明概述
本发明涉及修饰的VPAC2激动剂，其包含与具有大于22kD分子量的聚乙二醇(PEG)聚合物连接的VPAC2激动剂，并且其保持其激动VPAC2的能力。这些修饰的VPAC2激动剂在治疗代谢失调例如糖尿病或葡萄糖耐量削弱、前期糖尿病状态中是有效的。而且，本发明的修饰VPAC2激动剂能够治疗代谢失调而不降低平均动脉压，由此不产生心血管副作用(例如降低血压和增加心率)，并因此可以给药较高的更有效剂量。
本发明的多肽给具有下列病症的患者提供了新疗法：例如代谢失调，例如由于降低内原性胰岛素分泌而引起的那些，尤其是2型糖尿病，或葡萄糖耐量削弱，具有轻微胰岛素分泌变化的前期糖尿病状态。此外，本发明的多肽可以用于预防和/或治疗1型糖尿病，妊娠期糖尿病，青春晚期糖尿病(MODY)，成人隐性自身免疫糖尿病(latent autoimmune diabetes adult，LADA)，和相关的糖尿病性血脂异常及其它糖尿病性并发症，以及高血糖症，血胰岛素增多，葡萄糖耐量削弱，空腹血糖受损(impaired fasting glucose)，血脂异常，高甘油三酯血症，综合症X和胰岛素耐受性。
本发明的一个方面是选自下列的多肽：SEQ ID NOs：1至153，及其片段、衍生物和变体，它们显示至少一种生物学功能，这种功能与列出的SEQ ID NOs.的多肽(总的来说，“本发明的多肽”)基本上相同，包括其功能等效物。
本发明的另一个实施方案是编码本发明多肽的多肽，和重组表达本发明多肽所必需的伴随载体和宿主细胞。
本发明也涉及在哺乳动物中治疗糖尿病、糖尿病相关病症和/或受本发明多肽影响、优选受本发明多肽的VPAC2激动剂功能的影响的其它疾病或病症的方法，包括给药治疗有效量的本发明的任何多肽或对于VPAC2是活性的任何多肽。
附图简述
图1a-1d描述了SEQ ID NOs：1至153的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NOs：115-153是指在半胱氨酸C-末端通过一个马来酰亚胺键PEG化的肽。PEG可以是例如22kD直链PEG或43kD支链PEG。
图2是表明非PEG化的肽SEQ ID NO：1显著降低血压的线图。如实施例所述治疗动物。结果用赋形剂-治疗大鼠的平均血压的百分数来表示。
图3表明用直链22kD PEG进行PEG化的肽SEQ ID NO：1+PEG(22kD)，以快速浓注的方式给药≥160μg/kg的静脉内剂量，可以降低血压，尽管血压降低效果小于非PEG化的肽(SEQ ID NO：1)的效果。如实施例所述治疗动物。
图4表明用支链43kD PEG进行PEG化的肽SEQ ID NO：1+PEG(43kD)，以快速浓注的方式给药1.6至480μg/kg的静脉注射剂量，对血压没有影响。在大鼠IPGTT(＜1nM)中，在480μ/kg iv剂量的SEQ ID NO：1+PEG(43kD)(＞4000nM)之后，估量的估计血浆浓度是ED50时SEQ ID NO：1+PEG(43 kD)的血浆浓度的＞4000倍的。如实施例所述治疗动物。
图5是条形图，说明了在暴露于本发明的PEG化肽之后，分散的大鼠胰岛细胞的胰岛素分泌。
发明详述
本发明的多肽在葡萄糖动态平衡中起一定作用，尤其是，这些肽通过降低血浆葡萄糖浓度而起VPAC2激动剂的作用。考虑到VPAC2在促进胰腺中的葡萄糖-调节的胰岛素分泌的作用，VPAC2激动剂在治疗代谢失调及其它疾病中具有潜在的价值。然而迄今为止，VPAC2激动剂具有显著的副作用；也就是降低平均动脉压，其反过来可以导致心率增加，对于2型糖尿病是特别危险的状况。
已经确定了具有VPAC2激动剂活性的肽，并且包括例如PACAP，VIP，BAY 55-9837，Ro 25-1553，Ro 25-1392及其它PACAP和VIP类似物(Gourlet等人，Peptides 18：403-408；Xia等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.281：629-633，1997)。
本文发明人发现，通过连接具有大于22kD分子量的聚乙二醇(PEG)聚合物来修饰本发明的多肽，可以抑制与VPAC2激动剂相关的平均动脉压降低。不受理论约束，本发明人相信，使用PEG化技术来增加VPAC2激动剂的尺寸，可以限制VPAC2激动剂进入围绕血管壁的较小血管化的平滑肌组织，而不限制其进入高度血管化的胰岛的能力。因此，PEG化的VPAC2激动剂不会促进可导致血压降低的血管平滑肌松弛。然而，PEG化的VPAC2激动剂仍可到达胰腺，并因此降低血糖，这正是治疗2型糖尿病所需要的作用。
因此，本发明涉及修饰的VPAC2激动剂，其包含与具有大于22kD分子量的聚乙二醇聚合物连接的VPAC2激动剂，并且提供了用于治疗目的的其给药方法。这些修饰的VPAC2受体激动剂和组合物可在体内起到VPAC2受体激动剂的功能，用于预防和/或治疗诸如糖尿病，高血糖症，葡萄糖耐量削弱，空腹血糖受损和葡萄糖-依赖性胰岛素分泌引起的肥胖症的疾病或病症，而不会降低平均动脉压。
本发明的多肽可在体内起到VPAC2激动剂功能，或者用于预防和/或治疗诸如下列的疾病或病症：糖尿病包括1型和2型糖尿病，妊娠期糖尿病，青春晚期糖尿病(MODY)(Herman等人，Diabetes43：40，1994)；成人隐性自身免疫糖尿病(LADA)(Zimmet等人，Diabetes Med.11：299，1994)；和相关的糖尿病性血脂异常及其它糖尿病的并发症，以及高血糖症，血胰岛素增多，葡萄糖耐量削弱，空腹血糖受损，血脂异常，高甘油三酯血症，综合症X和胰岛素耐受性。
在一个实施方案中，本发明的多肽以葡萄糖-依赖性方式刺激胰岛素从胰腺β-细胞中释放，并且本发明的多肽在含水和非水制剂中均是稳定的，并呈现大于一小时的血浆半衰期。
在另一个实施方案中，本发明的多肽是选择性的VPAC2激动剂，相对于VPAC1和/或PAC1，其对于VPAC2具有更大的选择性。本发明的多肽以葡萄糖-依赖性方式刺激胰岛素释放到血浆中而不会引起血浆葡萄糖水平的停滞或增加，这种停滞或增加对于治疗例如2型糖尿病起相反作用。另外，优选本发明的多肽是VPAC2受体的选择性激动剂，由此导致例如释放到血浆里的胰岛素增加，同时针对负责这种副作用如胃肠水分保持和/或不希望的心血管效果例如平均动脉压降低和心率增加的其它受体具有选择性。
下面定义了贯穿本说明书所使用的某些术语。具体氨基酸的单字母缩写、其相应的氨基酸和三字母缩写如下：A，丙氨酸(ala)；C，半胱氨酸(cys)；D，天冬氨酸(asp)；E，谷氨酸(glu)；F，苯丙氨酸(phe)；G，甘氨酸(gly)；H，组氨酸(his)；I，异亮氨酸(ile)；K，赖氨酸(lys)；L，亮氨酸(leu)；M，甲硫氨酸(met)；N，天冬酰胺(asn)；P，脯氨酸(pro)；Q，谷酰胺(gln)；R，精氨酸(arg)；S，丝氨酸(ser)；T，苏氨酸(thr)；V，缬氨酸(val)；W，色氨酸(trp)；Y，酪氨酸(tyr)。
“功能等效物”和“基本上相同生物学功能或作用”各自是指约30％至约100％内或更大生物活性的生物活性度，当各个多肽的生物活性是通过相同的方法测定时，其通过与它比较的多肽表示。例如，当在实施例中描述的环化AMP(cAMP)闪烁近似测定法中试验时，与图1的多肽功能等效的多肽是表示在表达人类VPAC2受体的CHO细胞系中的cAMP的积聚的一种多肽。
当提及图1的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“变体”是指多肽的片段、衍生物和变体，其基本上保持与这种多肽相同的生物学功能或活性，如下面的进一步描述。
类似物包括前多肽，其中包括本发明的多肽的氨基酸序列。通过自然、体内过程或本领域熟知的方法例如酶催化或化学裂解，本发明的活性多肽可以从完成前多肽分子的其它氨基酸上断裂。
片段是多肽的一部分，其基本上保持类似的功能活性，如本文公开的体内模型中所述。
衍生物包括多肽的所有改型，其基本上保持本文公开的功能，并且包括其它的结构和附带的功能(例如PEG化的多肽，其具有更大的半衰期)，对于预定目标具有靶向特异性或其它活性例如毒性的融合多肽。
本发明的多肽可以是重组体多肽、天然提纯多肽或合成多肽。
本发明的多肽的片段、衍生物或变体可以是下列所述者：(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代并且这种取代的氨基酸残基可以或可以不是通过遗传密码编码者，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基团，或(iii)其中成熟多肽与另一种化合物融合，例如提高多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)，或(iv)其中其它的氨基酸与成熟多肽融合，例如引导或分泌序列或用于纯化成熟多肽或多肽原序列的序列，或(v)其中多肽序列与较大的多肽(例如人白蛋白，抗体或Fc，用于提高效果的持续时间)融合。从本文的教导，认为这种片段、衍生物及变体和类似物在本领域技术人员的范围之内。
本发明的衍生物可以包含在一个或多个预定的，优选非必需的氨基酸残基处所进行的保守氨基酸取代(在下面进一步定义)。“非必需的”氨基酸残基是可以由蛋白的野生型序列加以改变但不改变生物活性的残基，而“必需的”氨基酸残基是生物活性所必需的。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换的取代。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括带有下列侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-支链侧链(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。非保守取代不会对保守氨基酸残基或位于保守蛋白区域内的氨基酸残基，例如残基19和27进行，其中所述残基对蛋白活性例如VPAC2活性和/或VPAC2选择性是必要的。片段或生物学活性部分包括适合用作药物、产生抗体、作为研究试剂等等的多肽片段。片段包括包含与本发明多肽的氨基酸序列足够相似或衍生自其的氨基酸序列并且显现该多肽的至少一种活性的肽，但其比本文公开的全长多肽包括更少的氨基酸。典型地，生物学活性部分包括具有至少一种多肽活性的区域或模体。多肽的生物学活性部分可以是这样的肽，其具有例如五个或更多氨基酸长度。这种生物学活性部分可以合成或通过重组技术制备，并且可以通过本文公开的方法和/或本领域熟知的方法来评价本发明多肽的一种或多种功能活性。
变体包括由于致突变作用造成氨基酸序列不同的多肽。起VPAC2激动剂作用的变体可以通过筛选用于VPAC2激动剂活性的本发明多肽的突变株的组合库来确定，例如截头突变株。
本发明也提供了嵌合或融合多肽。设计靶向序列以定位递送多肽至胰腺，使潜在的副作用减到最小。本发明的多肽可以由通过肽键或修饰肽键(即肽等排体)相互连接的氨基酸组成，并且可以包括20基因-编码的氨基酸之外的氨基酸。多肽可以通过自然方法例如转译后的方法或通过本领域熟知的化学修饰技术来修饰。这种修饰在基础文本和更详细的专题论文以及大量研究文献中得到了较好的描述。修饰可以发生在多肽中的任何地方，包括肽骨架，氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应理解，可以在所给定多肽中的一些位点处存在相同或不同程度的相同类型的修饰。同样，给定的多肽可以包括许多类型的修饰。多肽可以是支链的，例如，由于遍在蛋白化作用，并且它们可以是环状的，有或者没有支链。环状、支链和支链环状的多肽可以由转译后的自然过程产生，或可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，核黄素的共价连接，血红素部分的共价连接，核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接，脂类或脂类衍生物的共价连接，磷脂酰肌醇的共价连接，交联，环化，二硫键形成，脱甲基作用，共价交联的形成，形成半胱氨酸，形成焦谷氨酸盐，制剂，γ-羧化作用，糖基化，GPI固定形式，羟基化作用，碘化作用，甲基化作用，十四酰化，氧化，PEG化，蛋白酶解加工，磷酸化，异戊二烯化，外消旋化，硒酰化，硫酸盐化，转移-RNA介导的氨基酸对蛋白质的加成例如精氨酰化，和遍在蛋白化作用(参见例如
Proteins，Structure and Molecular Properties，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，编，Academic Press，New York，第1-12页(1983)；Seifter等人，Meth.Enzymol 182：626-646，1990；Rattan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62，1992)。
在PEG化的情况下，肽与PEG的融合可以通过本领域技术人员已知的任何方法完成。例如，首先将半胱氨酸突变引入到肽中，提供与PEG连接的连接基，而后用PEG-马来酰亚胺定位衍生化，从而可以完成PEG化。或者，N-末端修饰可以引入与PEG偶合的反应性部分，例如如上面公开的N-末端修饰化合物的氨基、巯基或羧酸酯基团。例如，首先通过N-末端修饰基团将巯基部分引入到多肽中，提供与PEG连接的连接基，而后用例如Nektar Therapeutics(SanCarlos，CA，USA)和/或NOF(Tokyo，Japan)提供的甲氧基-PEG-马来酰亚胺试剂定位衍生化，从而可以完成PEG化。除了马来酰亚胺之外，许多Cys反应基团对蛋白交联领域技术人员是已知的，例如使用烷基卤化物和乙烯基砜(参见例如
Proteins，Structure and Molecular Properties，第2版.，T.E.Creighton，W.H.Freeman andCompany，New York，1993)。此外，可以通过直接连接到C-末端羧酸酯基团上，或连接到内在的氨基酸例如Cys、Lys、Asp或Glu上，或连接到包含类似反应性侧链部分的人造氨基酸上而引入PEG。
可以使用各种大小的PEG基团，例如但不局限于约5kDa至约43kDa的PEG聚合物。PEG修饰可以包括单一直链PEG。例如，与马来酰亚胺或其它交联基团连接的直链5、20或30kDa的PEG得自于Nektar和/或NOF。同样，修饰可以包括得自于Nektar和NOF的支链PEG，其包含两个或多个与马来酰亚胺或其它交联基团连接的PEG聚合物链。
PEG和肽交联基团之间的连接基可以变化。例如，源于Nektar(Huntsville，Al)的可商业购买的硫醇-反应性的40kDa PEG(mPEG2-MAL)使用马来酰亚胺基团与Cys共轭，并且马来酰亚胺基团通过包含Lys的连接基与PEG相连接。作为第二个例子，源于NOF的可商业购买的硫醇-反应性的43kDa PEG(GL2-400MA)使用马来酰亚胺基团与Cys共轭，并且马来酰亚胺基团通过二取代的烷烃连接基与PEG相连接。此外，PEG聚合物可以直接与马来酰亚胺相连接，例如源于Nektar Therapeutics(Huntsville，Al)的分子量5和20kDa的PEG试剂。
本发明的多肽包括例如图1的多肽(SEQ ID NOs：1至153)，以及源于它们的具有无实质变化顺序的那些序列。“无实质变化”包括任何序列的增补、取代或缺失变体，其基本上保持本发明多肽的至少一种生物学功能，例如本文中说明的VPAC2激动活性和/或胰岛素屏蔽活性。这些功能等效物可以包括例如具有图1多肽的至少约90％特性、或图1多肽的至少95％特性、或图1多肽的至少97％特性的多肽，并且也包括具有基本上相同生物活性的这种多肽的部分。然而，如本文进一步描述，表明功能等效的来源于图的多肽1在氨基酸序列中具有非实质性变异的任何多肽都包括在本发明的说明书内。
本领域已知的两个多肽之间的“相似性”是通过将一种多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸取代物与第二种多肽序列进行比较来测定的。这种保守取代包括如上所述的那些及Dayhoff(The Atlas ofProtein Sequence and Structure5，1978)和Argos(EMBO J.8：779-785，1989)中的那些。例如，属于下列基团中的一种的氨基酸表示保守变化：
-ala，pro，gly，gln，asn，ser，thr；
-cys，ser，tyr，thr；
-val，ile，leu，met，ala，phe；
-lys，arg，his；
-phe，tyr，trp，his；和
-asp，glu。
还提供了本领域技术人员了解的相关化合物，例如化学模拟物，有机模拟物或肽模拟物。本文中使用的术语“模拟物”、“肽的模拟物”、“肽模拟物”、“有机模拟物”和“化学模拟物”拟包括肽衍生物、肽类似物和具有三维定向原子结构的化合物，其相当于本发明的肽。很清楚，本文中使用的短语“相当于”拟包括这样的化合物：具有某些原子的取代，或所述肽中的化学部分，在模拟化合物中具有产生所述原子和部分的相同或足够类似结构或方向的键长、键角和结构，以具有本发明肽的生物学功能。在本发明的肽模拟物中，化学组分的立体结构在结构上和/或功能上相当于肽中的肽骨架和组分氨基酸侧链的立体结构，产生本发明肽的这种肽、有机和化学模拟物，其具有基本的生物活性。按照本领域的理解使用这些术语作为举例说明，例如Fauchere(Adv.Drug Res.15：29，1986)；Veber& Freidinger(TINS p.392，1985)；和Evans等人(J.Med.Chem.30：1229，1987)，本文将其引入作为参考。
很清楚，对于本发明各个肽的生物活性，存在药效团。药效团在本领域理解为，其包含生物活性结构要求的理想化三维定义。可以用现行计算机模型软件(计算机辅助药物设计)设计肽、有机和化学模拟物，以拟合各个药效团。可以基于本发明肽的取代基原子的位置信息，通过结构功能分析制备所述模拟物。
本发明提供的肽可以有利地通过本领域已知的任何化学合成技术，尤其是固相合成技术，例如使用商业上适宜的自动化肽合成仪来合成。本发明的模拟物可以通过通常用于肽合成的固相或液相方法合成(参见例如Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85：2149-54，1963；Carpino，Acc.Chem.Res.6：191-98，1973；Birr，Aspects of theMerrifield Peptide Synthesis，Springer-Verlag：Heidelberg，1978；The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology，Vols.1，2，3，和5，(Gross&Meinhofer编)，Academic Press：New York，1979；Stewart等人，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chem.Co.：Rockford，Ill.，1984；Kent，Ann.Rev.Biochem.57：957-89，1988；和Gregg等人，Int.J.Peptide Protein Res.55：161-214，1990，本文引入其全部内容作为参考)。
还可以使用固相方法。简要地说，N-保护的C-末端氨基酸残基与不能溶解的载体连接，载体例如二乙烯基苯交联的聚苯乙烯，聚丙烯酰胺树脂，硅藻石/聚酰胺(pepsyn K)，可控孔度玻璃，纤维素，聚丙烯膜，丙烯酸-涂布的聚乙烯条材等等。连续保护氨基酸衍生物的脱保护、中和与偶合的循环用来从C-末端按照氨基酸序列连接氨基酸。对于一些合成肽，可以使用利用酸敏感树脂的FMOC策略。在这点上，固体载体的例子是二乙烯基苯交联聚苯乙烯树脂，其是可商业购买的各种功能化形式，包括氯甲基树脂，羟甲基树脂，对乙酰胺基甲基树脂，二苯甲基胺(BHA)树脂，4-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂，肟树脂，4-烷氧基苄基醇树脂(王氏树脂)，4-(2’，4’-二甲氧基苯基氨基甲基)-苯氧基甲基树脂，2，4-二甲氧基二苯甲基-胺树脂，和4-(2’，4’-二甲氧基苯基-FMOC-氨基-甲基)-苯氧基乙酰胺基正亮氨酰-MBHA树脂(Rink酰胺MBHA树脂)。此外，如果需要的话，酸-敏感树脂还提供C-末端酸。对于α-氨基酸尤其优选的保护基是碱-不稳定的9-芴基甲氧基-羰基(FMOC)。
化学上与BOC(叔丁氧羰基)和FMOC基团相容的氨基酸的侧链官能团的合适保护基在本领域为大家所熟知。当使用FMOC化学过程时，优选下列被保护的氨基酸衍生物：FMOC-Cys(Trit)，FMOC-Ser(But)，FMOC-Asn(Trit)，FMOC-Leu，FMOC-Thr(Trit)，FMOC-Val，FMOC-Gly，FMOC-Lys(Boc)，FMOC-Gln(Trit)，FMOC-Glu(OBut)，FMOC-His(Trit)，FMOC-Tyr(But)，FMOC-Arg(PMC(2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰基))，FMOC-Arg(BOC)2，FMOC-Pro，和FMOC-Trp(BOC)。可以使用本领域已知的各种偶合剂和化学过程来偶合氨基酸残基，例如直接与下列化合物偶合：DIC(二异丙基-碳二亚胺)，DCC(二环己基碳二亚胺)，BOP(苯并三唑基-N-氧基三(二甲基氨基)_六氟磷酸盐)，PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基_六氟磷酸盐)，PyBrOP(溴-三-吡咯烷基_六氟磷酸盐)；通过表现对称的酸酐；通过活性酯例如五氟苯酯；或通过表现HOBt(1-羟基苯并三唑)活性的酯或通过使用FMOC-氨基酸氟化物和氯化物或通过使用FMOC-氨基酸-N-羧基酸酐。优选在HOBt或HOAt(7-氮杂羟基苯并三唑)的存在下用HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)，1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)或HATU(2-(1H-7-氮杂-苯并三唑-1-基)，1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)活化。
可以手工进行固相方法，或可以在可商业购买的肽合成仪(例如Applied Biosystems 431A等等；Applied Biosystems，Foster City，CA)上使用自动合成法。在一种典型的合成法中，在氯三苯甲基树脂上加载第一个(C-末端)氨基酸。按照ABI FastMoc方案(AppliedBiosystems)的连续脱保护(用20％哌啶/NMP(N-甲基吡咯烷酮))和偶合循环可以用来产生肽序列。还可以使用通过乙酸酐封端的双和三重偶合。
合成的模拟物肽可以从树脂上断裂，并通过用包含合适清除剂的TFA(三氟乙酸)处理来脱保护。可以使用许多这种裂解试剂，例如Reagent K(0.75克结晶苯酚，0.25毫升乙二硫醇，0.5毫升苯甲硫醚，0.5毫升去离子水，10毫升TFA)及其它试剂。通过过滤从树脂中分离肽，并通过醚沉淀进行分离。通过常规方法例如凝胶过滤和反相HPLC(高效液相色谱法)可以获得进一步纯化。按照本发明的合成模拟物可以是药学可接受盐的形式，特别是碱加成盐的形式，包括有机碱和无机碱的盐。酸性氨基酸残基的碱加成盐是按照本领域技术人员熟知的方法、通过用合适的碱或无机碱处理来制备的，或所需要的盐可以直接通过合适碱的冷冻干燥获得。
通常，本领域技术人员将认识到，本文中描述的肽可以通过各种化学技术进行修饰，以制备与未修饰的肽具有基本上相同活性和任选具有其它合乎需要性能的肽。例如，可以以药学可接受阳离子的盐形式提供肽的羧酸基团。在肽内的氨基可以是药学可接受的酸加成盐形式，例如HCl、HBr、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、马来酸、酒石酸及其它有机盐，或可以转变为酰胺。可以用大量公认的保护基例如乙酰胺基团来保护硫醇。本领域技术人员还将认识到将环状结构引入到本发明肽中的方法，以使原来的限制构型几乎更近似。例如，可以将羧基末端或氨基末端半胱氨酸残基加入到肽中，以使当氧化时，肽将包含二硫键，由此产生环肽。其它肽环化方法包括形成硫醚及羧基和氨基-末端酰胺和酯。
具体地说，对于构成与相应的肽化合物具有相同或类似的所需要生物活性的肽衍生物和类似物，各种技术是适宜的，就溶解度、稳定性及对水解和解朊作用的敏感性而论，这种肽衍生物和类似物比肽具有更有利的活性。这种衍生物和类似物包括在N-末端氨基、C-末端羧基修饰的肽，和/或将肽中的一个或多个酰胺键改变为非酰胺键。很清楚，两种或多种这样的修饰可以在肽模拟物结构中结合(例如在C-末端羧基修饰和在肽中的两个氨基酸之间包含-CH2-氨基甲酸酯键)。
氨基末端修饰包括烷基化，乙酰化，加入羧苯甲酰基团和形成琥珀酰亚胺基团。具体地说，N-末端氨基可以反应形成式RC(O)NH--的酰胺基，其中R是烷基，优选低级烷基，并通过与酰卤化物，RC(O)Cl或酸酐反应加入。典型地，该反应可以如下进行：使约等摩尔或过量(例如约5当量)的酰卤化物在惰性稀释剂(例如二氯甲烷)中与肽接触，惰性稀释剂优选包含过量(例如约10当量)的叔胺例如二异丙基乙胺，以清除反应期间产生的酸。反应条件是常规的(例如室温，30分钟)。末端氨基的烷基化提供了低级烷基N-取代，而后与如上所述的酰卤化物反应，提供式RC(O)NR-的N-烷基酰胺基团。或者，通过与琥珀酸酐反应，氨基末端可以与琥珀酰亚胺基团共价连接。使用大约等摩尔数量或过量的琥珀酸酐(例如约5当量)，利用本领域熟知的方法，包括使用过量(例如10当量)叔胺例如二异丙基乙胺，如Wollenberg等人(U.S.专利4,612,132)所述(本文引入其全部作为参考)，将末端氨基转变为琥珀酰亚胺。还应该理解，琥珀酸基团可以被例如以常规方式制备的C2-至C6-烷基或--SR取代基取代，由此提供了在肽的N-末端取代的琥珀酰亚胺。这种烷基取代基可以按照Wollenberg等人(上文)描述的方式，通过低级烯烃(C2-至C6-烃基)与马来酸酐反应来制备，-SR取代基可以通过RSH与马来酸酐反应来制备，其中R如上所述。另一个有利的实施方案中，氨基末端可以衍生形成苄氧羰基-NH-，或取代的苄氧羰基-NH-基团。这种衍生物可以通过与大约当量数量或过量的苄氧羰基氯化物(CBZ-Cl)、或取代的CBZ-Cl在合适的惰性稀释剂(例如二氯甲烷)中反应来制备，惰性稀释剂优选包含叔胺，以清除反应期间产生的酸。在又一个衍生物中，通过与当量数量或过量(例如5当量)的R-S(O)2Cl在合适的惰性稀释剂(二氯甲烷)中反应以将末端胺转化为氨磺酰而使N-末端包含氨磺酰基团，其中R是烷基并优选低级烷基。优选，惰性稀释剂包含过量叔胺(例如10当量)例如二异丙基乙胺，以清除反应期间产生的酸。反应条件是常规的(例如室温，30分钟)。通过与当量数量或过量(例如5当量)的R-OC(O)Cl或R-OC(O)OC6H4-p-NO2在合适的惰性稀释剂(例如二氯甲烷)中反应以将末端胺转化为氨基甲酸酯而可以在氨基末端制备氨基甲酸酯基团，其中R是烷基，优选低级烷基。优选，惰性稀释剂包含过量叔胺(例如10当量)，例如二异丙基乙胺，以清除反应期间产生的任何酸。反应条件是常规的(例如室温，30分钟)。通过与当量数量或过量(例如5当量)的R-N＝C＝O在合适的惰性稀释剂(例如二氯甲烷)中反应以将末端胺转化为脲(即RNHC(O)NH-)基团而可以在氨基末端形成脲基团，其中R如上所述。优选，惰性稀释剂包含过量叔胺(例如10当量)，例如二异丙基乙胺。反应条件是常规的(例如室温，约30分钟)。
在制备其中C-末端羧基可以被酯(例如-C(O)OR，其中R是烷基，优选低级烷基)替代的肽模拟物过程中，可以使用用于制备肽酸的树脂，侧链保护的肽可以用碱和合适的醇(例如甲醇)断裂。通过用氟化氢处理可以用普通方式除去侧链保护基，获得所需要的酯。在制备其中C-末端羧基被酰胺-C(O)NR3R4替代的肽模拟物过程中，二苯甲基胺树脂用作肽合成的固体载体。当合成完毕时，用氟化氢处理，以从载体上释放肽，直接得到游离肽酰胺(即C-末端是-C(O)NH2)。或者，在肽合成期间，使用氯甲基化树脂与氨进行偶合反应，从载体上将侧链保护的肽断裂，得到游离肽酰胺，与烷基胺或二烃基胺反应，得到侧链保护的烷基酰胺或二烷基酰胺(即C-末端是-C(O)NRR1，其中R和R1是烷基，优选低级烷基)。然后通过用氟化氢处理用普通的方式除去侧链保护，得到游离酰胺，烷基酰胺或二烷基胺化物。
在另一个替代实施方案中，通过用N-末端氨基分别取代羧基或酯的-OH或酯(-OR)，可以引起C-末端羧基或C-末端酯环化，形成环肽。例如，合成和裂解得到肽酸之后，利用合适的羧基活化剂例如二环己基碳二亚胺(DCC)，例如在二氯甲烷(CH2Cl2)、二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物中，游离酸在溶液中转化为活化酯。然后通过用N-末端胺取代活化酯，形成环肽。可以使用非常稀释的溶液、按照本领域熟知的方法来提高环化，而非聚合。
正如本领域所了解的和本发明提供的肽模拟物，其在结构上与本发明的肽相似，但具有一个或多个任选被选自下列连接基取代的肽键：--CH2NH--，--CH2S--，--CH2CH2--，--CH＝CH-(顺式和反式构象体两者)，--COCH2--，--CH(OH)CH2--，和--CH2SO--，利用本领域已知的和进一步在下面参考文献中描述的方法：Spatola，Chemistry andBiochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins，(Weinstein，ed.)，Marcel Dekker：New York，p.267，1983；Spatola，Peptide BackboneModifications 1：3，1983；Morley，Trends Pharm.Sci.pp.463-468，1980；Hudson等人，Int.J.Pept.Prot.Res.14：177-185，1979；Spatola等人，Life Sci.38：1243-1249，1986；Hann，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I 307-314，1982；Almquist等人，J.Med.Chem.23：1392-1398，1980；Jennings-White等人，Tetrahedron Lett.23：2533，1982；Szelke等人，EP045665A；Holladay等人，Tetrahedron Lett.24：4401-4404，1983；和Hruby，Life Sci.31：189-199，1982；将每篇引入到本文中作为参考。这种肽模拟物可以显著优于多肽实施方案，例如包括制备更经济，具有更大的化学稳定性或增强的药理学性能(例如半衰期，吸收，效能，效果等等)，降低抗原性，及其它性能。
还可以使用常规或合理的药物设计原理获得本发明肽的模拟类似物(参见例如Andrews等人，Proc.Alfred Benzon Symp.28：145-165，1990；McPherson，Eur.J.Biochem.189：1-24，1990；Hol等人，Molecular Reeognition：Chemical and Biochemical Problems，(Roberts，ed.)；Royal Society of Chemistry；pp.84-93，1989a；Hol，Arzneim-Forsch.39：1016-1018，1989b；Hol，Agnew Chem.Int.Ed.Engl.25：767-778，1986；本文引入其全部公开内容作为参考)。
按照常规药物设计方法，可以通过随机试验分子获得所需要的模拟物分子，随机试验分子的结构具有与“未加修饰”肽的结构相同的特征。由结合分子的具体基团变化而产生的定量作用可以通过测定假定模拟物与肽活性相比较的生物活性来确定。在合理的药物设计的一个实施方案中，将模拟物设计成能够共享肽的大部分稳定三维构象的属性。因此，例如，可以设计模拟物具有这样的化学基团，其以足够引起离子、疏水性或范德华相互作用的方式定向，其与本发明肽所显现的那些相似，如本文所公开内容。
表现合理模拟物设计的一种方法使用了能够形成肽的立体结构表述的计算机系统，例如Hol，1989a；Hol，1989b；和Hol，1986所举例说明的那些。可以使用本领域可商业购买的计算机辅助设计程序来产生本发明肽的肽-、有机-和化学模拟物的分子结构。这种程序的例子包括SYBYL 6.5_，HQSARTM，和ALCHEMY 2000TM(Tripos)；GALAXYTM和AM2000TM(AM Technologies，Inc.，San Antonio，TX)；CATALYSTTM和CERIUSTM(Molecular Simulations，Inc.，SanDiego，CA)；CACHE PRODUCTSTM，TSARTM，AMBERTM，和CHEM-XTM(Oxford Molecular Products，Oxford，CA)和CHEMBUILDER3DTM(Interactive Simulations，Inc.，San Diego，CA)。
使用例如现有技术公认的分子模型程序、使用本文公开的肽制备的肽-、有机-和化学模拟物，可以使用常规化学合成技术、设计成能适应高流通量筛选的方法来制备，包括组合化学方法。用于制备本发明的肽-、有机-和化学模拟物的组合方法包括噬菌体展示阵列，固相合成和组合化学阵列，如下面所提供的，例如SIDDCO(Tuscon，Arizona)；Tripos，Inc.；Calbiochem/Novabiochem(San Diego，CA)；Symyx Technologies，Inc.(Santa Clara，CA)；Medichem Research，Inc.(Lemont，IL)；Pharm-Eco Laboratories，Inc.(Bethlehem，PA)；或N.V.Organon(Oss，Netherlands)。本发明的肽-、有机-、和化学模拟物的组合化学产物可以按照本领域已知的方法制备，包括但不限于公开在下列文献中的技术：Terrett，(Combinatorial Chemistry，OxfordUniversity Press，London，1998)；Gallop等人，J.Med.Chem.37：1233-51，1994；Gordon等人，J.Med.Chem.37：1385-1401，1994；Look等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.6：707-12，1996；Ruhland等人，J.Amer.Chem.Soc.118：253-4，1996；Gordon等人，Acc.Chem.Res.29：144-54，1996；Thompson & Ellman，Chem.Rev.96：555-600，1996；Fruchtel & Jung，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：17-42，1996；Pavia，“The Chemical Generation of Molecular Diversity”，NetworkScience Center，www.netsci.org，1995；Adnan等人，“Solid SupportCombinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization，”同前，1995；Davies and Briant，“Combinatorial Chemistry LibraryDesign using Pharmacophore Diversity，”同前，1995；Pavia，“Chemically Generated Screening Libraries：Present and Future，”同前，1996；和U.S.专利5,880,972；5,463,564；5,331573；和5,573,905。
最新合成的多肽可以基本上通过制备高效液相色谱法纯化(参见例如Creighton，Proteins：Structures And Molecular Principles，WH Freeman and Co.，New York，N.Y.，1983)。本发明的合成多肽组合物可以通过氨基酸分析或通过例如Edman降解法的序列来确定(Creighton，上文)。另外，具有源于其它蛋白质序列的多肽的氨基酸序列的任何部分可以在直接合成和/或使用化学方法的组合期间改变，以制备变体多肽或融合多肽。
还包括在本发明内的是选择性结合本发明多肽的抗体和抗体片段。本领域已知的任何类型抗体可以使用本领域熟知的方法产生。例如，可以产生抗体，以与本发明多肽的表位具体地结合。本文使用的“抗体”包括完好的免疫球蛋白分子，以及其片段，例如Fab，F(ab′)2和Fv，其能够与本发明多肽的表位结合。典型地，需要至少6、8、10或12个连续氨基酸形成表位。然而，包括非连续氨基酸的表位可能需要更多氨基酸，例如至少15、25或50个氨基酸。
具体与本发明多肽的表位结合的抗体可以用于治疗以及免疫化学试验，例如Western印迹，ELISAs，放射免疫测定，免疫组织化学试验，免测沉淀法，或本领域已知的其它免疫化学试验。各种免疫测定可以用来鉴定患有所需要特异性的抗体。用于竞争性结合或免疫放射测定法的许多方案在本领域为大家所熟知。这种免疫测定典型地包括测定免疫原和与免疫原特异结合的抗体之间的复合物形成。
典型地，与本发明多肽特异结合的抗体提供了检测信号，当用于免疫化学试验时，这种检测信号比其它蛋白质提供的检测信号至少高5、10或20倍。例如，与本发明多肽特异结合的抗体不能在免疫化学试验中检测其它蛋白质，但可以从溶液中免疫沉淀本发明多肽。
本发明的多肽可以用来使哺乳动物免疫，以制备多克隆的抗体，哺乳动物例如小鼠，大鼠，兔，豚鼠，猴子或人类。如果需要的话，本发明的多肽可以与载体蛋白例如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和钥孔血蓝素共轭。根据宿主物种，各种助剂可用于提高免疫学响应。这种助剂包括但不局限于Freund’s助剂，矿物质凝胶剂(例如氢氧化铝)，和表面活性物质(例如溶血卵磷脂，复合多元醇，聚阴离子，肽，油乳化液，钥孔血蓝素，和二硝基酚)。在用于人类的助剂之中，BCG(卡介苗)和小棒状杆菌是特别有效的。
与本发明多肽特异结合的单克隆抗体可以使用任何技术制备，其通过培养物中的连续细胞系提供了抗体分子产物。这些技术包括但不局限于：杂交瘤技术，人类B细胞杂交瘤技术，和EBV杂交瘤技术(Kohler等人，Nature 256：495-97，1985；Kozbor等人，J.Immunol.Methods 81：3142，1985；Cote等人，Proc.Natl.Acad.Sci.80：2026-30，1983；Cole等人，Mol.Cell Biol.62：109-20，1984)。
此外，可以使用“嵌合抗体”产物的开发、小鼠抗体基因与人类抗体基因的接合技术，以获得具有合适抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-55，1984；Neuberger等人，Nature 312：604-08，1984；Takeda等人，Nature 314：452-54，1985)。单纯系及其它抗体可以还被“人源化”，当治疗使用它时，可以防止患者针对抗体增加免疫反应。这种抗体可以以与人类抗体足够类似的顺序直接用于治疗，或可能需要少数关键残基的变化。啮齿动物抗体和人类序列之间的序列差异可以通过下列方式减到最小：通过个体残基的位点定向诱变或通过全部互补决定地区的滤栅来替代那些不同于人类序列的残基。或者，人源化抗体可以使用重组体方法制备(参见例如GB2188638B)。与本发明多肽特异结合的抗体可以含有抗原结合位点，该结合位点既可以部分也可以完全人源化，如U.S.专利5,565,332中所公开内容。
或者，可以使用本领域已知的方法来修改单链抗体产物所描述的技术，以制备与本发明多肽具体结合的单链抗体。具有相关特异性、但具有独特个体基因型组合的抗体，可以通过无规组合免疫球蛋白库的链改组产生。
单链抗体还可以使用杂交瘤cDNA作为模板、使用DNA扩增方法例如PCR构成(Thirion等人，Eur.J.Cancer Prey.5：507-11，1996)。单链抗体可以是单或双特异性的，并且可以是二价或四价的。例如在Coloma & Morrison(Nat.Biotechnol.15：159-63，1997)中教导了四价、双特异性单链抗体的构成。二价、双特异性单链抗体的构成在Mallender & Voss(J.Biol.Chem.269：199-206，1994)中进行了讲授。
编码单链抗体的核苷酸序列可以使用手工或自动化核苷酸合成法构成，使用标准重组DNA方法克隆到表达结构中，并引入到细胞中，以表达编码序列，如下所述。或者，单链抗体可以直接使用例如丝状噬菌体技术制备(Verhaar等人，Int.J.Cancer 61：497-501，1995；Nicholls等人，J.Immunol.Meth.165：81-91，1993)。
具体与本发明多肽结合的抗体还可以通过体内诱导淋巴细胞群中的产物、或通过筛选文献中公开的高度特异结合试剂的免疫球蛋白库或清单来制备(Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.86：38333-37，1989；Winter等人，Nature 349：293-99，1991)。
在本发明的方法中，可以构成并治疗使用其它类型的抗体。例如，可以按照WO 93/03151公开的内容构成嵌合抗体。还可以制备衍生自免疫球蛋白并且是多价和多特异性的结合蛋白质，例如“二价二聚体”(参见例如WO 94/13804)。
具有与本发明多肽结合能力的人类抗体还可以用MorphoSysHuCAL_库或如下的类似技术进行鉴定。本发明的多肽可以在微量滴定板上涂渍，并可以用MorphoSys HuCAL_Fab噬菌体库培养。不与本发明多肽结合的那些噬菌体连接的Fabs可以从平皿中洗去，仅仅保留与本发明多肽紧密结合的噬菌体。可以洗脱结合的噬菌体，例如通过pH值的变化或用大肠杆菌洗脱，并通过大肠杆菌宿主的感染得到增强。这种浅盘方法可以重复一或两次，以富集与本发明多肽紧密结合的抗体群。然后表达、纯化源于富集池的Fabs，并在ELISA试验中筛选。
按照本发明的抗体可以通过本领域熟知的方法纯化。例如，可以将抗体通过一个与本发明多肽结合的柱来进行亲合性纯化。然后使用具有高盐浓度的缓冲液从柱中洗脱出结合的抗体。
使用方法
下面定义了本文所使用的各种术语。
当介绍本发明的要素或其优选实施方案时，冠词“一”、“一个”、“该”和“所述”是指有一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”意指包括在内的，并且指可能存在除了列表要素以外的其它要素。
本文使用的术语“患者”包括哺乳动物(例如人类和动物)。
术语“治疗”包括任何方法、作用、应用、疗法等等，其中以直接或间接地改进患者病症为目的，给患者(包括人)提供医疗救护，或迟缓患者的病症或障碍的发展。
术语“组合治疗”或“共同疗法”是指给药两种或多种治疗剂，以治疗糖尿病性的病症和/或障碍。这种给药包括以基本上同时的方式共同给药两种或多种治疗剂，例如以具有固定比率活性组分的单一胶囊形式，或以每种抑制药剂的多重独立胶囊的形式。此外，这种给药包括以顺序方式使用各种治疗剂。
短语“治疗有效”是指每个药剂的给药量可以获得糖尿病性病症或障碍严重度得到改善的目的，同时避免或使与所给定治疗相关的不良副作用减到最小。
术语“药学可接受的”是指患者适于使用药学产品。
本发明的多肽应该是有价值的治疗剂。相应地，本发明的一个实施方案包括治疗患者(包括哺乳动物)各种病症的方法，其包括给药所述患者有效治疗靶向病症、含有适量本发明多肽的组合物。
本发明多肽由于能够刺激胰腺胰岛细胞体外分泌胰岛素，并导致体内血糖降低，从而可以用于治疗糖尿病，包括1型和2型(非胰岛素依赖性糖尿病)糖尿病两者。这种治疗还可以延迟糖尿病和糖尿病性并发症的发作。多肽可以用来预防患有葡萄糖耐量削弱的患者继续发展为2型糖尿病。在本发明的方法中，可以使用本发明多肽治疗或预防的其它疾病和病症包括：青春晚期糖尿病(MODY)(Herman等人Diabetes 43：40，1994)；成人隐性自身免疫糖尿病(LADA)(Zimmet等人Diabetes Med.11：299，1994)；葡萄糖耐量削弱(IGT)(Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus，Diabetes Care 22(Supp.1)：S5，1999)；空腹血糖受损(IFG)(Charles等人，Diabetes40：796，1991)；妊娠期的糖尿病(Metzger，Diabetes，40：197，1991)；和代谢性综合症X。
本发明多肽还可以用于预防和/或治疗下列病症：肥胖症(例如调节食欲和食物摄入)；能量动态平衡的障碍；脂类和碳水化合物代谢的障碍；心血管疾病，包括动脉粥样硬化，冠心病，冠状动脉病，血脂质过多，高胆固醇血症，低HDL水平和高血压症；脑血管疾病和周围血管疾病；多囊卵巢综合症；致癌作用和增生；哮喘和慢性阻塞性肺病；男性生殖问题(包括勃起机能障碍)；溃疡；神经变性疾病(包括帕金森症和老年痴呆症)；睡眠障碍和昼夜节律的机能障碍；生长障碍；免疫疾病，包括自身免疫疾病(例如系统性红斑狼疮)；长期炎症性疾病；脓毒性休克；HIV感染和AIDS，及本文确定的其它病症，或本文以后描述的功能。
本发明多肽还可以有效用于治疗与下列有关的生理失调：例如细胞分化以产生脂类积累细胞，与例如异常胰腺β-细胞功能有关的胰岛素灵敏度和血糖水平的调节，导致动脉粥样硬化的噬菌斑形成的巨噬细胞变异，炎症性响应，致癌作用，增生，胰腺β-细胞团块减少，胰岛素分泌，对于胰岛素的组织灵敏度，脂肉瘤细胞生长，多囊卵巢疾病，长期停止排卵，雄激素过多症，黄体酮产物，类固醇生成，细胞中的氧化还原电位和氧化应激反应，氧化氮合酶(NOS)产物，γ-谷氨酰基转肽酶增加，催化酶，血浆甘油三酯，HDL，和LDL胆固醇含量等等。
在本发明方法中，本发明多肽还可以用于治疗糖尿病辅因(secondary causes of diabetes)(Expert Committee on Classification ofDiabetes Mellitus，Diabetes Care 22(Supp.1)：S5，1999)。这种辅因包括糖皮质激素过量，生长激素过量，嗜铬细胞瘤和药物诱导的糖尿病。可以诱导糖尿病的药物包括但不局限于：扑鼠脲(priminil)，烟酸，糖皮质激素，苯妥英，甲状腺激素，β-肾上腺素能药剂，β-干扰素和用于治疗HIV感染的药物。
此外，本发明的多肽可以用于治疗哮喘(Bolin等人，Biopolymer37：57-66，1995；U.S.专利5,677,419；表明多肽R3P0在松弛豚鼠气管平滑肌方面具有活性)；低血压诱导作用(在哮喘患者中，VIP诱导低血压，心动过速，面部潮红(Morice等人，Peptides 7：279-280，1986；Morice等人，Lancet 2：1225-1227，1983)；男性生殖问题(Siow等人，Arch.Androl.43(1)：67-71，1999)；作为抗编程性细胞死亡/神经保护药剂(Brenneman等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.865：207-12，1998)；缺血现象期间的心脏保护作用(Kalfin等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.1268(2)：952-8，1994；Das等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.865：297-308，1998)，昼夜节律钟的控制和其相关障碍(Hamar等人，Cell 109：497-508，2002；Shen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.97：11575-80，2000)，和最后作为抗溃疡药剂(Tuncel等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.865：309-22，1998)。
在治疗糖尿病和相关障碍过程中，本发明多肽可以单独使用或与本领域技术人员已知的其它疗法和/或化合物组合使用。或者，可以在组合治疗中部分或全部使用本文描述的方法和多肽。
本发明多肽还可以与治疗糖尿病的其它已知疗法组合给药，其它已知疗法包括PPAR配体(例如激动剂，拮抗剂)，胰岛素促泌剂例如磺酰脲类药物和非磺酰脲类促泌剂，α-葡糖苷酶抑制剂，胰岛素敏化剂，胰岛素促泌剂，肝葡萄糖排出量降低化合物，胰岛素和胰岛素衍生物和抗肥胖症药物。这种疗法可以在给药本发明多肽之前、同时或之后给药。胰岛素和胰岛素衍生物包括胰岛素的长效和短效形式和制剂。PPAR配体可以包括PPAR受体或其组合的任一项的激动剂和/或拮抗剂。例如，PPAR配体可以包括PPAR-α、PPAR-γ、PPAR-δ的配体或两个或三个PPAR受体的任一组合。PPAR配体包括例如罗格列酮，曲格列酮和吡格列酮。磺酰脲类药物包括例如优降糖，格列美脲，氯磺丙脲，甲苯磺丁脲，和格列甲嗪。当与本发明多肽一起给药时，可以用于治疗糖尿病的α-葡糖苷酶抑制剂包括阿卡波糖，米格列醇和伏格列醇。可以用于治疗糖尿病的胰岛素敏化剂包括PPAR-γ激动剂例如格列酮类(例如曲格列酮，吡格列酮，恩格列酮，MCC-555，罗格列酮等等)及其它噻唑啉二酮和非噻唑啉二酮化合物；双缩胍例如二甲双胍和苯乙双胍；蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)抑制剂；二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制剂；和11β-HSD抑制剂。当与本发明多肽一起给药时，可以用于治疗糖尿病的肝葡萄糖排出量降低化合物包括例如胰高血糖素拮抗剂和二甲双胍，例如Glucophage和Glucophage XR。当与本发明肽一起给药时，可以用于治疗糖尿病的胰岛素促泌剂包括磺酰脲类和非磺酰脲类药物：GLP-1，GIP，VIP，PACAP，分泌素和它们的衍生物；那格列萘，美格替耐类，瑞格列奈，优降糖，格列美脲，氯磺丙脲，和格列甲嗪。例如，GLP-1包括具有比天然GLP-1的半衰期长的GLP-1的衍生物，例如脂肪族酸衍生的GLP-1和exendin。在本发明的一个实施方案中，本发明多肽与胰岛素促泌剂组合使用，以增加胰腺β-细胞对于胰岛素促分泌剂的灵敏度。
在本发明的方法中，本发明多肽还可以与抗肥胖症药物组合使用。抗肥胖症药物包括β-3肾上腺素能受体激动剂；CB-1(大麻素)受体拮抗剂；神经肽Y拮抗剂；食欲抑制剂，例如西布曲明(Meridia)；和脂肪酶抑制剂，例如奥利司他(Xenical)。本发明多肽可以与其它药学药剂组合给药，其它药学药剂例如apo-B/MTP抑制剂，MCR-4激动剂，CCK-A激动剂，一元胺再摄取抑制剂，拟交感神经药，多巴胺激动剂，促黑素细胞激素受体类似物，黑色素浓缩激素拮抗药，瘦素，瘦素类似物，瘦素受体激动剂，甘丙肽(galanin)拮抗剂，脂肪酶抑制剂，铃蟾素激动剂，拟甲状腺素药，脱氢异雄甾酮或其类似物，糖皮质激素受体激动剂或拮抗剂，增食欲素(orexin)受体拮抗剂，优洛可定结合蛋白拮抗剂，睫状神经营养因子，AGRPs(人类刺豚鼠相关蛋白质)，ghrelin受体拮抗剂，组胺3受体拮抗剂或反向激动剂，神经介肽U受体激动剂等等。
在本发明的方法中，本发明多肽还可以与通常用于治疗脂类障碍的药物组合使用。这种药物包括但不局限于：HMG-CoA还原酶抑制剂，烟酸，脂肪酸降低化合物(例如阿西莫司)；脂类降低药物(例如stanol酯，植物甾醇苷例如替奎安(tiqueside)，和氮杂环丁酮例如依泽替米贝)，ACAT抑制剂(例如avasimibe)，胆汁酸多价螯合剂，胆汁酸再摄取抑制剂，微粒体的甘油三酯输送抑制剂，和贝丁酸(fibricacid)衍生物。HMG-CoA还原酶抑制剂包括例如洛伐他汀，西伐他汀，普伐他汀，氟伐他汀，阿妥伐他汀，瑞伐他汀，伊伐他汀，西立伐他汀，和ZD-4522。贝丁酸衍生物包括例如冠心平，非诺贝特，苯扎贝特，环丙贝特，苄氯贝特(beclofibrate)，依托贝特(etofibrate)，和吉非贝齐(gemfibrozil)。多价螯合剂包括例如消胆胺，考来替泊(Colestipol)，和交联右旋糖酐的二烷基氨基烷基衍生物。
此外，本发明多肽可以与抗高血压药物例如β-阻断剂和ACE抑制剂组合给药。与本发明肽组合使用的其它抗高血压药剂的例子包括：钙通道阻断剂(L型和T型；例如地尔硫卓，维拉帕米，硝苯地平，氨氯地平和mybefradil)，利尿剂(例如氯噻嗪，双氢氯噻嗪，三氟甲噻，双氢氟噻嗪，苄氟噻嗪，甲基氯噻嗪，三氯噻嗪，多噻嗪，苄噻嗪，利尿酸tricrynafen，氯噻酮，利尿磺胺，musolimine，丁尿胺，triamtrenene，氨氯吡脒，螺甾内酯)，肾素抑制剂，ACE抑制剂(例如卡托普利，佐芬普利(zofenopril)，福辛普利，依那普利，ceranopril，cilazopril，地拉普利，喷托普利(Pentopril)，喹那普利，雷米普利，赖诺普利)，AT-1受体拮抗剂(例如氯沙坦，伊贝沙坦，丙戊沙坦)，ET受体拮抗剂(例如塞塔生坦(sitaxsentan)，atrsentan，中性肽链内切酶(NEP)抑制剂，血管肽酶(vasopepsidase)抑制剂(双重NEP-ACE抑制剂)(例如，奥马曲拉(omapatrilat)和gemopatrilat)，和硝酸盐。
这种共同疗法可以与两种或多种药物组合给药(例如本发明多肽与胰岛素敏化剂和抗肥胖症药物组合)。这种共同疗法可以以药物组合物的形式给药，如上所述。
药物组合物
基于熟知的用于测定上面确定的哺乳动物病症治疗效果的试验，并将这些结果与用于治疗这些病症的已知药物的效果进行比较，可以容易地确定本发明多肽对于治疗每个目标适应症的有效剂量。在治疗这些病症中的一种的过程中，所给药的活性组分(例如多肽)数量可以按照下列考虑来宽泛地变化：所使用的具体化合物和剂量单位，给药模式，疗程，所治疗患者的年龄和性别，所治疗病症的性质和程度。
可以给药的活性组分的总量通常在每天约0.0001毫克/千克至约200毫克/千克的范围，且优选为约0.01毫克/千克至约200毫克/千克体重。单元剂量可以含有约0.05毫克至约1500毫克的活性成分，且可以每天一次或多次给药。对于注射给药，包括静脉内、肌肉内、皮下和肠胃外注射，并使用输液技术，每日剂量可以从约0.01至200毫克/千克。对于直肠给药方案，日剂量可以从总体重的0.01到200毫克/千克。透皮浓度可以要求维持日剂量为0.01到200毫克/千克。
当然，对于每个患者，具体初始和继续给药方案将按照下列来变化：通过出席诊断专家确定的病症的性质和严重度，所使用具体多肽的活性，患者的年龄，患者的饮食，给药时间，给药途径，药物的排泄速率，药物组合等等。治疗的目标模式和本发明多肽的剂量数可以使用常规治疗试验、通过本领域技术人员来确定。
可以使用本发明多肽，通过给药需要其的患者适当配制的药物组合物来获得目标药理学效果。对本发明来说，患者是需要治疗具体病症或疾病的哺乳动物，包括人类。因此，本发明包括由药学可接受的载体和治疗有效量的多肽组成的药物组合物。药学可接受的载体是在与活性组分的有效活性相应的浓度下对患者相对无毒的和无害的任何载体，以致于可归因于载体的任何副作用不会使活性组分的有利的实施失效。治疗有效量的多肽是可以产生对于所治疗的具体病症产生效果或产生影响的数量。本文描述的多肽可以使用任何有效的常规剂量单位形式与药学可接受的载体一起给药，包括例如快速和延时释放制剂，口服，胃肠外，局部等等。
对于口服，多肽可以配制成固体或液体制剂，比如胶囊，药丸，片剂，药片，糖淀，溶体，粉末，溶液，悬浮液，或乳液，并可以根据本领域已知的制备药物组合物的方法制备。固体单元剂型可以是胶囊，其可以是含有例如表面活性剂、润滑剂和惰性填料比如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉的普通的硬-或软-壳凝胶类型。
在另一个实施方案中，本发明的多肽可以用常规的片剂基质比如乳糖、蔗糖和玉米淀粉与下列物质组合制成片剂：粘合剂比如阿拉伯胶、玉米淀粉或凝胶；在给药后可以帮助片剂崩裂和溶解的崩解剂，比如马铃薯淀粉、海藻酸、玉米淀粉和胍尔豆胶；用于改善片剂粒化的流速和防止片剂材料粘附到片剂模具和冲压机上的润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸、或硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌；染料；着色剂；和用于提高片剂的美观性质量和使它们更可被患者接受的增香剂。用于口服液体剂型的适宜的赋形剂包括稀释剂比如水和醇，例如乙醇，苯甲醇，和聚乙烯醇，不论加入或者没有加入药学可接受的表面活性剂，悬浮剂或乳化剂。可以存在各种其它材料如涂布或修饰剂量单元的外形的材料。例如片剂，药丸或胶囊可以涂有片胶，糖或两者。
可分散性粉剂和粒剂适合于水悬浮液的制备。它们提供活性组分与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合物。适宜的分散或润湿剂和悬浮剂已经通过如上所述的那些例子举例说明。也可以提供其它的赋形剂，例如甜味剂，调味剂和着色剂，如上所述。
本发明的药物组合物还可以以水包油乳化剂的形式。油相可以是植物油比如液体石蜡或植物油的混合物。适宜的乳化剂可以是(1)天然存在的树胶比如阿拉伯树胶和黄著树胶，(2)天然存在的磷脂比如大豆和卵磷脂，(3)衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐的酯或偏酯，例如，去水山梨糖醇单油酸酯，(4)所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如，聚氧化乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。乳液还可能含有甜味剂和增香剂。
油性的悬浮液可以通过将活性组分悬浮在植物油比如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、或矿物油比如液体石蜡中加以配制。油性的悬浮液可能含有增稠剂，比如蜂蜡，硬石蜡，或鲸蜡醇。悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种增香剂；和一种或多种甜味剂比如蔗糖或糖精。
糖浆和酏剂可以用甜味剂比如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖配制。这样的制剂还可以含有缓和剂，防腐剂，调味剂和着色剂。
本发明多肽还可以胃肠外给药，即皮下、静脉内、肌肉内或腹膜间给药，以生理学可接受的稀释剂与药学载体中的可注射剂量的多肽形式，生理学可接受的稀释剂与药学载体可以是无菌的液体或液体混合物，例如水，生理盐水，葡萄糖水溶液和相关糖液；醇例如乙醇，异丙醇，或十六醇；乙二醇例如丙二醇或聚乙二醇；丙三醇缩酮例如2，2-二甲基-1，1-二氧戊烷-4-甲醇，醚例如聚(乙二醇)400；油；脂肪酸；脂肪酸酯或甘油脂；或乙酰化脂肪酸甘油脂，其中可以加入或者不加入药学可接受的表面活质，例如皂或清净剂，悬浮剂例如果胶，卡波姆，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，或羧甲基纤维素，或乳化剂及其它药学助剂。
可用于本发明的肠胃外制剂中的油的例子是石油，动物、蔬菜或合成来源的油，例如，花生油，豆油，芝麻油，棉子油，玉米油，橄榄油，石蜡油和矿物油。适宜的脂肪酸包括油酸，硬脂酸，和异硬脂酸。适宜的脂肪酸酯是例如油酸乙酯和十四烷酸异丙酯。适宜的皂包括脂肪族碱金属、铵和三乙醇胺盐，适宜的洗涤剂包括阳离子洗涤剂，例如二甲基二烷基铵卤化物，烷基吡啶嗡卤化物，和烷基胺乙酸酯；阴离子洗涤剂，例如烷基、芳基和烯属磺酸酯，烷基、烯烃、醚和甘油单酯硫酸盐，和磺基丁二酸酯；非离子洗涤剂，例如，脂肪胺氧化物，脂肪酸链烷醇酰胺，和聚环氧乙烷聚丙烯共聚物；和两性洗涤剂，例如，烷基-β-氨基丙酸酯，和2-烷基咪唑啉季胺盐，以及混合物。
本发明的肠胃外组合物可以在溶液中典型地含有约0.5％到约25％重量的活性组分。也可以优选使用防腐剂和缓冲液。为了减少或消除在注射部位的刺激，这样的组合物可以含有具有约12到约17的亲水亲油平衡值(HLB)的非离子型表面活性剂。在这样的制剂中表面活性剂的数量在约5％到约15％重量的范围。表面活性剂可以是具有上述HLB的单一组分或可以是具有所需要的HLB的两种或多种组分的混合物。
用于肠胃外制剂的表面活性剂的例子是聚乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯，例如去水山梨糖醇单油酸酯和由氧化丙烯与丙二醇缩合形成的氧化乙烯与疏水性碱的高分子量加合物。
药物组合物可以以无菌的可注射的水悬浮液的形式。可以按照已知的方法、使用合适的分散或润湿剂和悬浮剂来配制这种悬浮液，悬浮剂例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟基丙基甲基-纤维素，海藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮，黄著树胶和阿拉伯树胶；分散或润湿剂可以是天然存在的磷脂例如卵磷脂，烯基氧化物与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧化乙烯硬脂酸酯，氧化乙烯与长链脂族醇的缩合产物，例如十七烷环氧丙烷鲸蜡醇，氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯，或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐的偏酯的缩合产物，例如聚氧化乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。
无菌的可注射制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的可注射的溶液或悬浮液。可以使用的稀释剂和溶剂是例如水，Ringer’s溶液，和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的固定油类通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的单或二酸甘油酯。另外，脂肪酸比如油酸在注射制剂中可以应用。
本发明的组合物还可以以直肠给药的栓剂的形式给药。这些组合物可以通过将药物(例如多肽)与适宜的非刺激性的赋形剂混合来制备，其中赋形剂在普通的温度下是固体但在直肠温度下是液体，因此在直肠中融化释放出药物。这样的材料是，例如，可可脂和聚乙二醇。
可用于本发明方法中的另一种制剂是使用透皮输送装置(“贴片”)。这样的透皮贴片可在控制数量内用来提供本发明多肽的连续或间断输注。递送药用试剂的透皮贴片的结构和使用是本领域所熟知的(参见例如U.S.专利5,023,252，本文引入作为参考)。可以将这种贴片构造成用于连续、脉动、或根据需要递送的药用试剂。
另一种制剂采用了可生物降解的微球体的用途，其可以控制、持续释放本发明的肽和PEG化的肽。这种制剂可以由合成聚合物或共聚物组成。这种制剂可以用于注射、吸入、鼻用或口服。递送药用试剂的可生物降解的微球体的结构和使用是本领域所熟知的(例如US专利6,706,289，本文引入作为参考)。
通过机械输送装置对患者引入药物组合物可能是理想的或必需的。递送药用试剂的机械输送装置的结构和使用是本领域所熟知的。例如，直接对脑给药的直接技术，通常包括将施药导管放置到患者的脑室系统中以绕过血脑屏障。一种用于将药剂运载到身体的具体解剖学区域的这种可植入输送系统描述在U.S.专利5,011,472中，本文引入作为参考。
根据需要或需求，本发明组合物还可以含有其它常规的药学可接受的配料成分，泛指载体或稀释剂。通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸或其它合适的防腐剂，本发明的任何组合物可以保存。可以使用以合适的剂型制备这样的组合物的常规方法。
可以用作适合于配制预定给药途径组合物的通常使用的药学组分包括：酸化剂，例如但不局限于乙酸，柠檬酸，富马酸，盐酸，硝酸；和碱化剂例如但不局限于氨溶液，碳酸铵，二乙醇胺，单乙醇胺，氢氧化钾，硼酸钠，碳酸钠，氢氧化钠，三乙醇胺，trolamine。
其它药学组分包括例如但不局限于吸附剂(例如，粉末纤维素和活性炭)；气雾剂基质(例如，二氧化碳，CCl2F2，F2ClC-CClF2和CClF3)；空气顶替剂(例如，氮气和氩气)；抗真菌防腐剂(例如，苯甲酸，对羟基苯甲酸丁酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，苯甲酸钠)；抗菌防腐剂(例如，苯扎氯铵，氯化苄乙氧铵，苯甲醇，氯化十六烷吡啶，氯代丁醇，酚，苯乙醇，硝酸苯汞和硫汞撒)；抗氧化剂(例如，抗坏血酸，抗坏血酰棕榈酸酯，丁羟基大茴香醚，丁基化羟基甲苯，次磷酸，单硫代甘油，没食子酸丙酯，抗坏血酸钠，亚硫酸氢钠，甲醛合次硫酸氢钠，焦亚硫酸钠)；结合物质(例如，嵌段共聚物，天然和合成橡胶，聚丙烯酸酯，聚氨酯，硅氧烷和苯乙烯-丁二烯共聚物)；缓冲剂(例如，偏磷酸钾，磷酸二氢钾，乙酸钠，柠檬酸钠无水和柠檬酸钠二水合物)；载体(例如，阿拉伯胶糖浆，芳香稠浆液，香药酒，樱桃糖浆，可可稠浆液，橙皮糖浆，稠浆液，玉米油，矿物油，花生油，芝麻油，抑菌氯化钠注射液和抑菌注射用水)；螯合剂(例如，仍地酸钙钠和乙二胺四乙酸)；着色剂(例如FD&C Red No.3，FD&C Red No.20，FD&C Yellow No.6，FD&C Blue No.2，D&C Green No.5，D&COrange No.5，D&C Red No.8，焦糖和三氧化二铁)；澄清剂(例如膨润土)；乳化剂(但不局限于阿拉伯胶，聚西托醇(cetomacrogol)，鲸蜡醇，单硬脂酸甘油酯，卵磷脂，去水山梨糖醇单油酸酯，聚乙烯50硬脂酸酯)；包封剂(例如，凝胶和邻苯二甲酸醋酸纤维素)；香料(例如，茴香油，肉桂油，可可，薄荷醇，橙色油，薄荷油和香草醛)；湿润剂(例如，甘油，丙二醇和山梨糖醇)；研磨剂(例如，矿物油和甘油)；油类(例如，花生油，矿物油，橄榄油，花生油，芝麻油和植物油)；软膏基质(例如，羊毛脂，亲水性软膏，聚乙二醇油膏，凡士林，亲水性的凡士林，白色油膏，黄色油膏，和玫瑰香水油膏)；渗入增强剂(透皮递送)(例如，一羟基或多羟基醇，饱和或不饱和脂肪醇，饱和或不饱和脂肪酸酯，饱和或不饱和二羧酸，必要的油类，磷脂酰基衍生物，脑磷脂，萜烯，酰胺，醚，酮和脲)；增塑剂(例如，邻苯二甲酸二乙酯和甘油)；溶剂(例如，醇，玉米油，棉子油，甘油，异丙醇，矿物油，油酸，花生油，净化水，注射用水，灭菌注射水和冲洗用无菌水)；增稠剂(例如，鲸蜡醇，鲸蜡基酯蜡，微晶蜡，烷属烃，十八醇，白蜡和黄石蜡)；栓剂基质(例如，可可脂和聚乙二醇(混合物))；表面活质(例如，苯扎氯铵，壬苯醇醚10，oxtoxynol 9，聚山梨酸酯80，十二烷基硫酸钠和去水山梨糖醇甘油一棕榈酸酯)；悬浮剂(例如，琼脂，膨润土，卡波姆，羧甲基纤维素钠，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，高岭土，甲基纤维素，黄芪胶和veegum)；甜味剂(例如，阿斯巴甜，葡萄糖，甘油，甘露糖醇，丙二醇，糖精钠，山梨糖醇和蔗糖)；片剂防粘剂(例如，硬脂酸镁和滑石粉)；片剂结合剂(例如，阿拉伯胶，海藻酸，羧甲基纤维素钠，可压缩的糖，乙基纤维素，凝胶，液状葡萄糖，甲基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮和预胶凝淀粉)；片剂和胶囊稀释剂(例如，二元磷酸钙，高岭土，乳糖，甘露糖醇，微晶纤维素，粉末纤维素，沉淀碳酸钙，碳酸钠，磷酸钠，山梨糖醇和淀粉)；片剂包覆剂(例如，液状葡萄糖，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，甲基纤维素，乙基纤维素，邻苯二甲酸醋酸纤维素和片胶)；片剂直接压制赋形剂(例如，二元磷酸钙)；片剂崩解剂(例如，海藻酸，羧甲基纤维素钙，微晶纤维素，polacrillin钾，海藻酸钠，淀粉乙醇酸钠和淀粉)；片剂助流剂(例如，胶态硅石，玉米淀粉和滑石粉)；片剂润滑剂(例如，硬脂酸钙，硬脂酸镁，矿物油，硬脂酸和硬脂酸锌)；片剂/胶囊不透明剂(例如，二氧化钛)；片剂抛光剂(例如，carnuba石蜡和白蜡)；增稠剂(例如，蜂蜡，鲸蜡醇和烷属烃)；紧张剂(例如，葡萄糖和氯化钠)；增粘剂(例如，海藻酸，膨润土，卡波姆，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮，海藻酸钠和黄芪胶)；和润湿剂(例如，十七乙烯基氧基鲸蜡醇，卵磷脂，聚乙烯山梨糖醇一油酸酯，聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯，和聚氧化乙烯硬脂酸酯)。
本文中描述的多肽可以以单一药用试剂给药或与一种或多种其它药用试剂联用给药，其中联用不会导致不能接受的不利影响。例如，本发明的多肽可以与已知的肥胖症药或已知的抗糖尿病药或其它适应症药剂等等联用，以及与其混合物和组合联用。
还可以以游离碱形式或组合物形式使用本文中描述的多肽，用于研究和诊断学，或作为分析比照标准等等。因此，本发明包括组合物，其由惰性载体和有效量的、通过本文描述方法确定的多肽或其盐或酯组成。惰性载体可以是任何物质，其不与所携带的多肽相互作用，并且给所携带的多肽提供载体、运送方法、容积、可追踪物质等等。多肽的有效量是可以对所施行的具体方法产生效果或影响的数量。
已知多肽可以在水溶液和非水环境下进行水解、脱酰胺、氧化、外消旋化和异构化。可以通过毛细管电泳容易地检测降解例如水解，脱酰胺或氧化。尽管存在最小化的酶催降解，但具有延长的血浆半衰期或生物学存在时间的多肽应该在水溶液中稳定。在一天内、在体温下，多肽基本显现小于10％的降解。更加优选，在一天内、在体温下，多肽显现小于5％的降解。由于长期糖尿病患者中的治疗期限，更加优选这些治疗剂适宜于(而且很少发生)通过肠胃外途径给药。在几周期间内、在体温下的稳定性(即小于百分之几的降解)允许更不频繁的给药。经过多年、在冷冻温度下的稳定性，允许制造商提供液体制剂，因此避免重组的不便。另外，在有机溶剂中稳定将提供配制为新剂型的多肽，例如植入。
适合于皮下、静脉内、肌肉内等等的制剂，合适的药学载体，和用于配制和给药的技术，可以通过本领域熟知的任何方法制备(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，20th版，2000)。
本文中描述的结构、物质、组合物和方法是本发明的代表性例子，很清楚，本发明的范围不受实施例的范围所限制。本领域技术人员将会认识到，可以用公开的结构、物质、组合物和方法的变体实践本发明，并且认为这种变体在本发明范围之内。
提供下列实施例来说明本文描述的发明，但无论如何不应该将其理解为限制本发明的范围。
实施例
为了更好地理解本发明，列出下列实施例。这些实施例仅仅为了举例说明的目的，不能看作是以任何方式限制本发明的范围。在本文中提到的所有出版物以其全部引入作为参考。
实施例1.肽合成方法
按照下列一般方法，合成本发明的一些多肽：
通过FMOC/叔丁基策略(Pennington & Dunn，Peptide SynthesisProtocols，Volume 35，1994)在连续流动条件下使用Rapp-PolymerePEG-聚苯乙烯树脂(Rapp-Polymere，Tubingen，Germany)进行肽合成。合成完毕后，将肽从树脂上断裂，并使用TFA/DTT/H2O/三异丙基硅烷(88/5/5/2)去保护。使用冷乙醚将肽从裂解混合物中沉淀。用冷醚洗涤肽沉淀三次，而后溶于5％乙酸中，然后冷冻干燥。通过反相色谱法，在YMC-Pack ODS-AQ柱(YMC，Inc.，Wilmington，NC)上在Waters ALLIANCE_系统(Waters Corporation，Milford，MA)上，使用含有3％TFA的水/乙腈以0％至100％乙腈作为梯度，并通过MALDI质谱在VOYAGER DETM MALDI质谱仪(Model5-2386-00，PerSeptive BioSystems，Framingham，MA)上检测肽。将肽样品加入到1/1比例的基质缓冲液(50/50 dH2O/乙腈，含有3％TFA)中。对于那些不满足＞95％的纯度标准的肽，通过反相色谱法在Waters DeltaPrep 4000 HPLC系统(Waters Corporation，Milford，MA)上纯化。
实施例2.肽的PEG化
可以通过聚乙二醇(PEG)部分与肽连接、由此减少肽的肾清除率并降低肽的蛋白酶降解而提高肽的体内半衰期。VPAC2受体激动剂肽的用途受到其非常短的体内半衰期的严重限制；然而，PEG部分与肽连接(PEG化)延长了肽的半衰期，足以允许每天一次至每周一次的治疗。
PEG化可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。然而，在此实施例中，聚乙二醇化是如下进行的：通过将独特的半胱氨酸突变引入到肽中，而后通过肽的巯基和甲氧基-PEG-马来酰亚胺试剂Nektar Therapeutics(Huntsville，Al，USA)的马来酰亚胺基团之间稳定的硫醚键将半胱氨酸PEG化。优选将独特的半胱氨酸引入肽的C-末端以通过PEG化使活性的潜在降低减到最小。
具体地说，将2倍摩尔过量的mPEG-mal(MW 22kD和43kD)试剂加入到1毫克肽(例如SEQ ID NO：1，在肽的C-末端具有半胱氨酸突变)中，并溶于pH6的反应缓冲液(0.1M磷酸钠/0.1MNaCl/0.1M EDTA)中。在室温下0.5小时之后，将2倍摩尔过量的DTT加入到mPEG-mal中，从而终止反应。将肽-PEG-mal反应混合物施加到阳离子交换柱上，以除去残余的PEG试剂，而后通过凝胶过滤柱除去残余的游离肽。通过SDS-PAGE和MALDI-TOF质谱测定纯度、质量和PEG化位点的数目。当22kD PEG与本发明肽相连接时，可以保持有效的VPAC2受体活性。而且，还保持了VPAC2对比VPAC1和PAC1的受体活性选择性。有可能用较小的PEG(例如直链22kD PEG)进行PEG化，会较小地降低肽的活性，而较大的PEG(例如支链的43kD PEG)将更可能降低活性。然而，较大的PEG将会进一步提高血浆半衰期，使得一周一次注射变成可能(Harris等人，Clin.Pharmacokinet.40：539-551，2001)。
实施例3.肽克隆
为了重组表达这些肽，将编码肽的DNA序列克隆到带有分离单体肽和GST的单个Xa因子识别位点的谷胱甘肽S-转移酶(GST)的C-末端。通过将两个重叠单链DNA片段(70-90mers)杂交来合成编码Xa因子识别位点的基因，该识别位点与要生产的肽的DNA序列融合，所述单链DNA片段含有Bam HI或Xho I限制性酶位点，其紧靠所克隆的基因的DNA序列的5’位置，而后通过DNA聚合酶I的大片段进行相反链的DNA合成(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)。为每种基因所选择的DNA序列基于所设计的每个肽的氨基酸序列的反向翻译。在某些情况下，通过由上述方法已制备基因的PCR致突变作用产生编码肽的基因(Picard等人，Nucleic Acids Res 22：2587-91，1994；Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989)。然后将双链产物用Bam HI和Xho I加热浸提，并连接到pGEX-6P-1上(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，同样将其用Bam HI和Xho I加热浸提。
实施例4.肽重组体表达和纯化
将用含有GST-肽融合物转化的BL21细胞(Stratagene，La Jolla，CA)在37℃培育直至OD600达到0.6至1.0，然后在37℃将细胞用1mMIPTG (Life Technologies，Carlsbad，CA)培养2小时。将细胞(2L)在7,700g下离心15分钟，称重，并在-20℃下存储至少3小时。将冷冻细胞颗粒再悬浮在100mL冰冷的PBS中，其含有每克细胞250μL蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Chemical，St.Louis，MO)，将其超声处理每次1分钟3次，其中间隔15秒。然后将细胞在10,000g下离心20分钟。在4℃，将上清液与2毫升50％谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B树脂(Pharmacia)在振荡器上混合过夜。将上清液/树脂在1,500g下离心15分钟，填充到空的Poly-Prep层析柱(Bio-Rad，Hercules，CA)上，用30毫升PBS洗涤，而后用10毫升Xa因子缓冲液(1mM CaCl2，100mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH值8.0)洗涤。通过加入60单位的在1毫升Xa因子缓冲液中的Xa因子(Pharmacia)，在4℃培养过夜，并通过C18 HPLC(Beckman System Gold)分离，使用2毫升循环，流速2毫升/分钟，采用下列程序：缓冲液A(0.1％TFA/H2O)10分钟，梯度至缓冲液B(0.1％TFA/ACN)30分钟，缓冲液A 10分钟，梯度10分钟，和缓冲液A 10分钟。收集峰值馏份(每个1毫升)，并通过10-20％麦黄酮-SDS凝胶电泳进行筛选。将含有图1的肽的馏份集中并干燥。典型的收率是每升大肠杆菌培养物含有几百微克游离肽。重组体肽显示了具有与其合成形式相同的活性。
实施例5.环化AMP SPA
将表达VPAC2肽的CHO细胞涂覆在96孔平皿上，8×104个细胞/孔，并在37℃在αMEM、核苷、谷酰胺(Gibco/BRL，Rockville，MD)、5％FBS、100μg/mL Pen/Strep、0.4mg/mL潮霉素和1.5mg/mL遗传霉素(Gibco/BRL)中培育24小时。除去介质并用PBS洗涤平皿。将细胞在37℃用肽(在10mM Hepes、150mM NaCL、5mM KCL、2.5mM CaCl2、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、25mM NaHCO3(pH值7.4)与1％BSA和100μM IBMX中)培养15分钟。使用cAMP SPA直接筛选试验系统(Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)，定量细胞提取物中的环化AMP。按照这种试剂盒提供的说明书，测定存在于溶解产物中的cAMP的量。将各个浓度的肽所产生的cAMP的量(pmol)绘图，并使用Prizm软件进行非线性回归分析，以测定每种肽的EC50值。
当PEG部分(22kD或43kD)与VPAC2选择性VIP突变蛋白质肽(例如P5，P12，P212和P412)的C-末端半胱氨酸相连接时，保持了有效的VPAC2受体活性，该活性是通过在超表达VPAC2受体的细胞中升高水平的cAMP测定的。而且，也保持了受体活性的VPAC2对VPAC1的选择性。用代表性多肽进行的cAMP试验的结果示于表1中。确定为P5、P12、P212(P12+22kD PEG)和P412(P12+43kDPEG)的肽全部都是VPAC2受体的有效激动剂，其可以将受体活化至100％最大水平受体活性，该受体活性是通过内原性肽PACAP-27获得的。而且，确定为P5、P12、P212和P412的肽是选择性的VPAC2受体激动剂，其对于VPAC1具有非常弱的激动剂活性。PACAP-27是VPAC1和VPAC2受体两者的有效激动剂。基于VIP序列设计多肽，其在PAC1已经显示缺乏活性(Vaudry等人，Pharmacol.Rev.52：269-324，2000)，并且多肽P5、P12、P212和P412在PAC1不具有明显的活性。
表1
多肽的VPAC1和VPAC2激动剂活性
| 肽 | VPAC2EC50(nM) | VPAC1EC50(nM) |
| PACAP-27 | 0.09 | 0.35 |
| P5* | 0.33 | 232.5 |
| P12** | 0.38 | ＞1000 |
| P212 | 1.32 | ＞1000 |
| P412 | 4.19 | ＞1000 |
*P5：HSDAVFTDQYTRLRKQVAAKKYLQSIKQKRY
**P12：HSDAVFTDQYTRLRKQVAAKKYLQSIKQKRYC
实施例6.源于分散大鼠胰岛细胞的胰岛素分泌物
如下测定了通过大量本发明肽介导的分散大鼠胰岛的胰岛素分泌物。使用胶原酶将从SD大鼠(200-250g)分离的胰岛加热浸提。用胰蛋白酶处理分散胰岛细胞，播种到96V形底平皿中，并造粒。然后将细胞在有或者没有本发明肽的介质中培养过夜。将介质吸出，并将细胞在37℃用含有3mM葡萄糖的Krebs-Ringer-HEPES缓冲液培养30分钟。除去预培养缓冲液，并将细胞在37℃用含有合适葡萄糖浓度(例如8mM)的含有或者不含有肽的Krebs-Ringer-HEPES缓冲液培养合适的时间。在一些研究中，同样包括合适浓度的GLP-1。除去一部分上清液，并通过SPA测定胰岛素含量。结果用“相对于对照物的倍数”(FOC)来表示。
在300nM浓度时，多肽P412(即肽P12+43kD PEG)可以将源于分散胰岛细胞的胰岛素分泌物升高大约1.7倍。与葡萄糖激发之后的赋形剂处理的动物相比，PEG化的肽具有延长的体内活性，可以促进胰岛素分泌物，导致血糖水平降低。在IPGTT(腹膜内的葡萄糖耐量试验)中，当在葡萄糖激发之前3小时给药肽时，相对于赋形剂，代表性的PEG化的肽P212和P412可以显著地降低血糖水平(降低17％-28％葡萄糖AUC)。PEG化肽除了具有葡萄糖降低活性之外，在给药肽之后，PEG化肽在延长时间(例如3小时)内降低血糖的能力是在此时间点的循环中存在PEG化肽的明显标志，并因此相对于PACAP-27延长了半衰期。PACAP-27具有非常短的体内半衰期(＜10分钟)。
实施例7.测定麻醉大鼠的血压
在给药非PEG化的或PEG化的VPAC2激动剂肽之后，测定大鼠血压。如下测定血压：用戊巴比妥(55mg/kg i.p.)麻醉雄性Wistar大鼠，并将导管插入右侧的颈动脉和颈静脉。将颈动脉与Biopac系统(Harvard Apparatus Co.，Harvard，MA)连通以连续监听血压和心率。通过颈静脉导管注射给药赋形剂或肽。
当静脉内(iv)对大鼠给药时，非PEG化的肽P12剂量依赖性地降低血压，具有3μg/kg的ED50值(图2)。
用直链22kD PEG进行PEG化的肽(P212)以快速浓注方式静脉内给药≥160μg/kg的剂量可以降低血压，尽管血压降低效果小于非PEG化肽(P12)的效果(图3)。
用支链43kD PEG进行PEG化的肽(P412)以静脉快速浓注方式静脉内给药1.6至480μg/kg的剂量对大鼠血压没有影响(图4)。在大鼠IP葡萄糖耐量试验(IPGTT)中，在480μg/kg iv剂量的P412之后，估算的血浆浓度(＞4000nM)＞4000倍在ED50时P412的血浆浓度，估计其＜1nM。
以1、3、10和30μg/kg的升高剂量、以1小时的间隔，同样将P412通过iv快速浓注方式给药两只狗。贯穿该研究，连续监测血压、心率和心血管参数。在任何所测定的参数中，P412均具有好的耐受性，没有观察到效果。因此，以远远超过估算治疗水平的系统暴露程度，在狗中对由P412诱导的心血管参数没有影响，狗是已知的对于心血管效果高度敏感的物种。
实施例8.肽对于大鼠门静脉松弛影响的测定
假定不同于高度血管化的胰岛，43kD PEG化的肽(P412)不能有效地通向在围绕血管壁的较差血管化的平滑肌组织中的VPAC2。因此，P412不能促进导致血压降低的血管平滑肌松弛。这种假设得到了分离大鼠门静脉组织浴槽的研究结果的支持。
将源于Wistar大鼠的门静脉在32℃在Krebs(pH值7.4)中在组织浴(10ml)中在赋形剂(PBS，pH值7)或标明浓度的肽的存在下培养10分钟。相对于对VIP的响应，评价血管紧张的等量变化并记录。
在这种研究中表明，P12(即非PEG化的肽)导致门静脉松弛，ED50＝0.3nM(与其在细胞cAMP试验中的0.4nM的EC50值相似)。另一方面，以最高剂量试验(30nM)，其＞7倍以上在细胞cAMP试验中的EC50值(4.2nM)，43kD PEG化的肽不能引起任何门静脉松弛。
表2
相对于VIP，肽对于大鼠门静脉松弛的影响
| 肽 | 浓度(nM) | 激动剂活性(％VIP) |
| P12(非PEG化的) | 3 | 87 |
| 1 | 70 | |
| 0.3 | 52 | |
| P12+43kD PEG | 30 | 0 |
| 10 | 0 | |
| 3 | 0 |
实施例9.PEG化的肽对于大鼠腹膜内葡糖耐量的影响
在大鼠中，当皮下给药本发明PEG化肽时，检验其体内活性。将禁食过夜的大鼠皮下注射对照物或PEG化的肽(1-100μg/kg)。三小时后，测定基础血糖，并腹膜内给予大鼠2g/kg的葡萄糖。15、30和60分钟之后，再一次测定血糖。按照IPGTT(腹膜内的葡萄糖耐量试验)，相对于赋形剂，本发明代表性的PEG化肽显著地降低了血糖水平，降低17％-28％的葡萄糖AUC(图5)。这说明PEG化肽具有延长的体内葡萄糖降低活性。本发明PEG化肽除了具有葡萄糖降低活性之外，它还显示了延长的肽体内半衰期。PACAP-27具有非常短的体内半衰期(＜10分钟)。在给药肽3小时之后，本发明PEG化肽降低血糖的能力是在此时间点的循环中存在肽的明显标志，并因此相对于PACAP-27延长了半衰期。
在上述说明书提到的所有出版物在此引入作为参考。在不背离本发明的范围和精神的条件下，所描述的本发明组合物和方法的各种修饰和变体，对本领域技术人员是显而易见的。尽管结合具体优选实施方案描述了本发明，但应该理解，所要求的本发明不应该过度地限于这种具体实施方案。实际上，上述实施本发明模式的各种变体对分子生物学领域或相关领域的技术人员是明显的，并在下列权利要求的范围范围之内。仅仅利用常规实验，本领域技术人员将会认识或能够确定与本文中描述的许多本发明具体实施方案等效的实施方案。这种等效内容包括在下列权利要求中。
序列表
<110>拜尔药品公司
J.惠兰
C.潘
<120>血管活性肠肽(VIP)/垂体腺苷酸环化酶活化肽(PACAP)受体2(VPAC2)激动剂的聚乙二醇化和使用方法
<130>5201-PCT
<150>US 60/579,190
<151>2004-06-12
<160>153
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<400>1
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Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
20 25 30
<210>2
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
<400>2
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<213>智人
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<213>智人
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<400>109
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Tyr
20 25 30
<210>110
<211>30
<212>PRT
<213>智人
<400>110
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Arg Ile
20 25 30
<210>111
<211>30
<212>PRT
<213>智人
<400>111
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Arg Ile
20 25 30
<210>112
<211>30
<212>PRT
<213>智人
<400>112
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Arg Ile
20 25 30
<210>113
<211>30
<212>PRT
<213>智人
<400>113
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
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20 25 30
<210>114
<211>30
<212>PRT
<213>智人
<400>114
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Asn Arg Ile
20 25 30
<210>115
<211>32
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(32)..(32)
<223>PEG化
<400>115
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
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Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys
20 25 30
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<211>32
<212>PRT
<213>智人
<220>
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<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
<220>
<221>MOD_RES
<222>(32)..(32)
<223>PEG化
<400>116
His Thr Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
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Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys
20 25 30
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<211>32
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(32)..(32)
<223>PEG化
<400>117
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys
20 25 30
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<211>30
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>PEG化
<400>118
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Cys
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<211>32
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(32)..(32)
<223>PEG化
<400>119
His Thr Glu Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys
20 25 30
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<211>32
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
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<223>PEG化
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<212>PRT
<213>智人
<220>
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<223>PEG化
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<211>32
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(32)..(32)
<223>PEG化
<400>122
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
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Leu Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys
20 25 30
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<211>32
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(32)..(32)
<400>123
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys
20 25 30
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<211>32
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(32)..(32)
<223>PEG化
<400>124
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala His Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys
20 25 30
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<211>32
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(32)..(32)
<223>PEG化
<400>125
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys His Tyr Leu G1n Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys
20 25 30
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<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>126
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Cys
20 25 30
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<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>127
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Cys
20 25 30
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<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>128
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Arg Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Cys
20 25 30
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<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>129
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Cys
20 25 30
<210>130
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>130
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Pro Gln Lys Arg Cys
20 25 30
<210>131
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>131
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Gln Gln Lys Arg Cys
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<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>132
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Gln Lys Arg Cys
20 25 30
<210>133
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>133
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Arg Cys
20 25 30
<210>134
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>134
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ala Cys
20 25 30
<210>135
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>135
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Phe Cys
20 25 30
<210>136
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>136
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys His Cys
20 25 30
<210>137
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>137
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ile Cys
20 25 30
<210>138
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>138
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Lys Cys
20 25 30
<210>139
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>39
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Leu Cys
20 25 30
<210>140
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>140
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Met Cys
20 25 30
<210>141
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>141
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Pro Cys
20 25 30
<210>142
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>142
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Gln Cys
20 25 30
<210>143
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>143
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ser Cys
20 25 30
<210>144
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>144
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Thr Cys
20 25 30
<210>145
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>145
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Val Cys
20 25 30
<210>146
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>146
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Trp Cys
20 25 30
<210>147
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>147
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Tyr Cys
20 25 30
<210>148
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>148
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile Cys
20 25 30
<210>149
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>149
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile Cys
20 25 30
<210>150
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>150
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile Cys
20 25 30
<210>151
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>151
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Pro Gln Arg Ile Cys
20 25 30
<210>152
<211>31
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>PEG化
<400>152
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Gln Arg Ile Cys
20 25 30
<210>153
<211>32
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
<220>
<221>MOD_RES
<222>(32)..(32)
<223>PEG化
<400>153
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1 5 10 15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys
20 25 30
Claims (40)
1.选自SEQ ID NOs：1-153的多肽和其功能等效片段、衍生物和变体。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽与聚乙二醇聚合物连接。
3.权利要求2的多肽，其中所述聚乙二醇具有至少22 kD的分子量。
4.权利要求3的多肽，其中所述聚乙二醇是支链的。
5.权利要求1的多肽，其中所述多肽是乙酰化的。
6.编码权利要求1的多肽序列的多核苷酸，或其变性的变体。
7.包括权利要求6的多核苷酸的载体。
8.包括权利要求7载体的宿主细胞。
9.制备多肽的方法，包括：
a)在适合于表达所述多肽的条件下，培养权利要求8的宿主细胞；和
b)从宿主细胞培养物中回收多肽。
10.用于降低或抑制VPAC2受体激动剂的血压副作用的方法，包括将聚乙二醇聚合物与所述VPAC2受体激动剂连接的步骤。
11.权利要求10的方法，其中所述聚乙二醇具有至少22 kD的分子量。
12.权利要求11的方法，其中所述聚乙二醇是支链的。
13.权利要求10的方法，其中所述GLP-1受体激动剂选自SEQID NOs：1-153和其功能等效片段、衍生物和变体。
14.一种药物组合物，包括与药学可接受载体组合的治疗有效量的权利要求1至5的任一项的多肽或其功能等效片段、衍生物和变体。
15.一种药物组合物，包括与药学可接受载体和一种或多种其它药学试剂组合的治疗有效量的权利要求1至5的任一项的多肽或其功能等效片段、衍生物和变体。
16.权利要求15的药物组合物，其中所述药学试剂选自：PPAR配体，胰岛素促泌剂，磺酰脲类药物，α-葡糖苷酶抑制剂，胰岛素敏化剂，肝葡萄糖排出量降低化合物，胰岛素和胰岛素衍生物，双缩胍，蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B，二肽基肽酶IV，11β-HSD抑制剂，抗肥胖症药物，HMG-CoA还原酶抑制剂，烟酸，脂类降低药物，ACAT抑制剂，胆汁酸多价螯合剂，胆汁酸再摄取抑制剂，微粒体的甘油三酯输送抑制剂，贝丁酸衍生物，β-阻断剂，ACE抑制剂，钙通道阻断剂，利尿剂，肾素抑制剂，AT-1受体拮抗剂，ET受体拮抗剂，中性肽链内切酶抑制剂，血管肽酶抑制剂和硝酸盐。
17.治疗糖尿病患者的方法，包括下列步骤：给药需要其的患者治疗有效量的权利要求1至5的任一项的多肽或权利要求14的药物组合物。
18.权利要求17的方法，其中所述糖尿病选自1型糖尿病，2型糖尿病，青春晚期糖尿病，成人隐性自身免疫糖尿病和妊娠期糖尿病。
19.权利要求17的方法，其中所述多肽与一种或多种药学试剂组合给药。
20.治疗综合症X的方法，包括下列步骤：给药需要其的患者治疗有效量的权利要求1至5的任一项的多肽或权利要求14的药物组合物。
21.治疗糖尿病相关障碍的方法，包括下列步骤：给药需要其的患者治疗有效量的权利要求1至5的任一项的多肽或权利要求14的药物组合物。
22.权利要求21的方法，其中所述糖尿病-相关障碍选自高血糖症，血胰岛素增多，葡萄糖耐量削弱，空腹血糖受损，血脂异常，高甘油三酯血症，和胰岛素耐受性。
23.治疗或预防糖尿病辅因的方法，包括下列步骤：给药需要其的患者治疗有效量的权利要求1至5的任一项的多肽或权利要求14的药物组合物。
24.治疗糖尿病的方法，包括下列步骤：给药需要其的患者与一种或多种其它药学试剂组合的治疗有效量的权利要求1至5的任一项的多肽或权利要求14的药物组合物。
25.权利要求24的方法，其中所述药学试剂选自：PPAR激动剂，磺酰脲类药物，非磺酰脲类促泌剂，α-葡糖苷酶抑制剂，胰岛素敏化剂，胰岛素促泌剂，肝葡萄糖排出量降低化合物，胰岛素，和抗肥胖症试剂。
26.权利要求24的方法，其中所述糖尿病选自1型糖尿病，2型糖尿病，青春晚期糖尿病，成人隐性自身免疫糖尿病和妊娠期糖尿病。
27.治疗综合症X的方法，包括下列步骤：给药需要其的患者与一种或多种其它药学试剂组合的治疗有效量的权利要求1至5的任一项的多肽或权利要求14的药物组合物。
28.权利要求27的方法，其中所述药学试剂选自：PPAR激动剂，磺酰脲类药物，非磺酰脲类促泌剂，α-葡糖苷酶抑制剂，胰岛素敏化剂，胰岛素促泌剂，肝葡萄糖排出量降低化合物，胰岛素，和抗肥胖症试剂。
29.治疗糖尿病相关障碍的方法，包括下列步骤：给药需要其的患者与一种或多种其它药学试剂组合的治疗有效量的权利要求1至5的任一项的多肽或权利要求14的药物组合物。
30.权利要求29的方法，其中所述糖尿病-相关障碍选自高血糖症，血胰岛素增多，葡萄糖耐量削弱，空腹血糖受损，血脂异常，高甘油三酯血症，和胰岛素耐受性。
31.权利要求29的方法，其中所述药学试剂选自：PPAR激动剂，磺酰脲类药物，非磺酰脲类促泌剂，α-葡糖苷酶抑制剂，胰岛素敏化剂，胰岛素促泌剂，肝葡萄糖排出量降低化合物，胰岛素，和抗肥胖症试剂。
32.治疗或预防糖尿病辅因的方法，包括下列步骤：给药需要其的患者与一种或多种其它药学试剂组合的治疗有效量的权利要求1至5的任一项的多肽或权利要求14的药物组合物。
33.权利要求32的方法，其中所述药学试剂选自：PPAR激动剂，磺酰脲类药物，非磺酰脲类促泌剂，α-葡糖苷酶抑制剂，胰岛素敏化剂，胰岛素促泌剂，肝葡萄糖排出量降低化合物，胰岛素，和抗肥胖症试剂。
34.治疗糖尿病、X综合症、糖尿病-相关障碍或糖尿病辅因的方法，包括下列步骤：给药需要其的患者与一种或多种其它药学试剂组合的治疗有效量的权利要求1至5的任一项的多肽或权利要求14的药物组合物，所述其它药学试剂选自HMG-CoA还原酶抑制剂，烟酸，脂类降低药物，ACAT抑制剂，胆汁酸多价螯合剂，胆汁酸再摄取抑制剂，微粒体的甘油三酯输送抑制剂，贝丁酸衍生物，β-阻断剂，ACE抑制剂，钙通道阻断剂，利尿剂，肾素抑制剂，AT-1受体拮抗剂，ET受体拮抗剂，中性肽链内切酶抑制剂，血管肽酶抑制剂，和硝酸盐。
35.权利要求34的方法，其中所述糖尿病-相关障碍选自高血糖症，血胰岛素增多，葡萄糖耐量削弱，空腹血糖受损，血脂异常，高甘油三酯血症，和胰岛素耐受性。
36.权利要求24至35的任一项的方法，其中多肽和一种或多种药学试剂是以单一药学剂量制剂的形式给药的。
37.按照权利要求1至5的任一项的多肽用于治疗和/或预防糖尿病。
38.一种药物，包括至少一种按照权利要求1至5的任一项的多肽与至少一种药学可接受的、药学安全的载体或赋形剂的组合。
39.按照权利要求1至5的任一项的多肽用于制备治疗和/或预防糖尿病的药物的用途。
40.按照权利要求38的药物用于治疗和/或预防糖尿病。
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