CN113735977A

CN113735977A - rhFGF21融合蛋白、编码其的多核苷酸、包含其组合物及其用途

Info

Publication number: CN113735977A
Application number: CN202010468160.4A
Authority: CN
Inventors: 肖伟; 李德山; 于丹; 刘芝航; 王振中; 尹成凯; 孙旭
Original assignee: Jiangsu Kangyuan Ruiao Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Kangyuan Ruiao Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-05-28
Filing date: 2020-05-28
Publication date: 2021-12-03
Also published as: EP4159758A1; JP2023527093A; KR20230017804A; WO2021239046A1

Abstract

本申请公开了一种重组人成纤维细胞生长因子21(rhFGF21)融合蛋白、编码其的多核苷酸、重组表达载体、重组细胞、包含其的药物组合物和试剂盒、其用途及产生其的方法。本申请通过基因工程方法高效可溶性地表达得到rhFGF21‑(VPGXG)_n融合蛋白，其中，通过rhFGF21与具有合适的循环数n的类弹性蛋白(VPGXG)_n的融合，使得到的融合蛋白相较于野生型人成纤维细胞生长因子21具有更好的生物活性。而且，试验结果表明，本申请的rhFGF21‑(VPGXG)_n融合蛋白表达效率较高，并能有效地降低糖尿病动物体内的血糖水平。此外，相比于野生型hFGF21，本申请的融合蛋白在降低血糖水平方面还具有药效持续时间长的优点。

Description

rhFGF21融合蛋白、编码其的多核苷酸、包含其组合物及其用途

技术领域

本申请属于生物医药领域，具体而言，涉及一种包含融合在一起的重组人成纤维细胞生长因子21蛋白(rhFGF21)与类弹性蛋白(VPGXG)_n的融合蛋白、编码其的多核苷酸、重组表达载体和重组细胞、包含其的组合物、试剂盒及其用途和产生该融合蛋白的方法。

背景技术

成纤维细胞生长因子21(FGF21)是主要由肝脏产生的新陈代谢调控因子，其在肥胖症和2型糖尿病动物模型中发挥有效的降糖和降脂作用。FGF21代谢作用的主要位点是脂肪组织、肝脏和胰腺。实验研究已显示，在对糖尿病小鼠和灵长类施用FGF21后，糖尿病代偿和血脂异常有改善。

但是，FGF21在体内循环半衰期非常短，进而达不到理想的药效。用聚乙二醇(PEG)修饰FGF21能有效改善其药代动力学，改善药物分布，提高其疗效。然而，目前的PEG化FGF21存在如反应产率低、结合位点和偶联化学计量难以控制等弊端，在生产中增加了成本。因此，开发反应条件温和、步骤简单、快速、高效的位点特异性修饰方法对保证FGF21的药效尤为重要。

五肽重复序列单元是由五种氨基酸VPGXG组成的具有弹性功能和温度敏感性的多肽。X(即，Xaa)可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。它具有良好的生物相容性，但是针对不同蛋白，不同的循环数(即，VPGXG单元的重复次数)会对表达量、半衰期以及活性产生不同的影响。对于能保证FGF21活性并延长其半衰期的合适的弹性蛋白的循环数，目前尚未有报道，需要实验探究。

因此，需要开发出合适的融合蛋白以确保人成纤维细胞生长因子21(hFGF21)活性并延长其半衰期，同时，还需要进一步开发出适合该融合蛋白的体外表达体系，以高效得到具有活性的融合蛋白。

发明内容

本申请针对rhFGF21的半衰期短、活性无法保证等在药用过程中存在的问题，发明人通过研究而提供一种新的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白。进一步地，发明人还开发了适合该融合蛋白的原核表达体系，从而能够以期望的效率实现rhFGF21融合蛋白的可溶性表达。

一个方面，本申请涉及一种重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括融合在一起的rhFGF21和(VPGXG)_n，所述rhFGF21包含以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性的氨基酸序列；X为A和/或V；n为选自20-80中的整数。

另一方面，本申请涉及编码上述的融合蛋白的多核苷酸。

另一方面，本申请涉及含有编码上述的融合蛋白的多核苷酸的重组表达载体。

另一方面，本申请涉及含有上述的重组表达载体或者在其基因组中整合有上述的多核苷酸的重组细胞。

另一方面，本申请涉及一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含上述的融合蛋白。

另一方面，本申请涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含上述的融合蛋白或上述的药物组合物。

另一方面，本申请涉及上述的融合蛋白在制备用于预防或治疗与血糖代谢异常相关的疾病的药物中的用途。

又一方面，本申请涉及产生本申请上述的融合蛋白的方法，其中，所述方法包括：对上述的重组细胞进行培养，然后诱导上述的重组细胞进行表达并对表达产物进行纯化，得到所述融合蛋白。

本文中通过糖尿病模型鼠来评价本申请所述的融合蛋白治疗的糖尿病效果，动物学试验结果表明，本申请的融合蛋白能够有效降低糖尿病模型动物的血糖水平，而且与野生型hFGF21相比，本申请的融合蛋白在降低血糖水平方面还具有药效持续时间长(即，半衰期更长)等优点。同时，本申请所述的融合蛋白表现出良好的促进糖吸收的能力，而且，所述融合蛋白能够实现期望的表达效率。

附图说明

图1为SUMO-rhFGF21-(VPGXG)_n融合蛋白表达量的电泳图。其中的各附图标记分别表示：

1：蛋白marker；2：IPTG诱导前的蛋白表达；3：SUMO-rhFGF21；4：SUMO-rhFGF21-(VPGXG)₂₀；5：SUMO-rhFGF21-(VPGXG)₄₀；6：SUMO-rhFGF21-(VPGXG)₆₀；7：SUMO-rhFGF21-(VPGXG)₈₀。对结果进行灰度分析可知，SUMO-rhFGF21-(VPGXG)₄₀表达量占总蛋白表达量的百分比相较于其它组更高，相同条件下，具有更高效的表达：SUMO-rhFGF21-(VPGXG)₄₀，11.2％；SUMO-rhFGF21-(VPGXG)₂₀，9.7％；SUMO-rhFGF21-(VPGXG)₆₀，10.1％；SUMO-rhFGF21-(VPGXG)₈₀，3.2％。

图2为示出经不同的测试样品刺激后的β-Klotho-3T3-L1脂肪细胞的糖吸收的变化的图表。经10nmol/L SUMO-rhFGF21刺激后(以“rhFGF21”示出)，β-Klotho-3T3-L1脂肪细胞的糖吸收水平为约35％，经10nmol/L rhFGF21-(VPGXG)₂₀刺激后，β-Klotho-3T3-L1脂肪细胞的糖吸收水平增加至约39％，经10nmol/L rhFGF21-(VPGXG)₄₀刺激后，β-Klotho-3T3-L1脂肪细胞的糖吸收水平增加至约46％，经10nmol/L rhFGF21-(VPGXG)₆₀刺激后，β-Klotho-3T3-L1脂肪细胞的糖吸收水平增加至约37％，经10nmol/L rhFGF21-(VPGXG)₈₀刺激后，β-Klotho-3T3-L1脂肪细胞的糖吸收水平增加至约32％。可见，与其它组相比，10nmol/LrhFGF21-(VPGXG)₄₀在细胞水平上具有更好的促进糖吸收的能力。

图3为对rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白的纯度进行分析的HPLC谱图。经过HPLC分析，在保留时间为约6min时开始出现rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白的峰，且其纯度可达95％以上。

图4为示出采用不同的测试样品对STZ模型鼠治疗12小时后的降糖结果的图表，其中，与模型组相比，rhFGF21治疗组在给予12小时后的降糖效果逐渐减弱；rhFGF21-(VPGXG)₂₀治疗组、rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组、rhFGF21-(VPGXG)₆₀治疗组和rhFGF21-(VPGXG)₈₀治疗组仍然表现出一定的治疗效果，且rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组的降糖效果最好。其中，^*p<0.05，^**p<0.01，与模型组相比；^#p<0.05，^##p<0.01，与正常组相比。

图5为示出口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的结果的图表。口服葡萄糖后30min，模型组的血糖水平显著上升，rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组的血糖水平显著低于模型组。其中，^*p<0.05，^**p<0.01，与模型组相比；^#p<0.05，^##p<0.01，与正常组相比。

图6为示出58天内各组小鼠的血糖的变化情况的图表。模型组小鼠的血糖始终维持较高的水平，rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组小鼠的血糖较模型组显著下降，治疗后血糖维持在较低的水平并接近正常组小鼠的血糖水平，且药效比rhFGF21更持久。其中，^*p<0.05，^**p<0.01，与模型组相比；^#p<0.05，^##p<0.01，与正常组相比。

图7为示出各组小鼠的血清胰岛素含量的图表。模型组小鼠的血清胰岛素含量显著下降，而rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组小鼠的血清胰岛素含量相较于模型组得到显著的提高。其中，^*p<0.05，^**p<0.01，与模型组相比；^#p<0.05，^##p<0.01，与正常组相比。

图8为示出各组小鼠的糖化血红蛋白水平的图表。给予相应的测试样品30天后，模型组小鼠的糖化血红蛋白含量维持在较高的水平，而rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组小鼠的糖化血红蛋白水平显著下降。其中，^*p<0.05，^**p<0.01，与模型组相比；^#p<0.05，^##p<0.01，与正常组相比。

图9为示出各组小鼠的肝脏内G6Pase基因的相对表达量的图表。模型组小鼠的肝脏内G6Pase表达量显著升高，而rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组小鼠的肝脏内G6Pase表达量显著下降。其中，^*p<0.05，^**p<0.01，与模型组相比；^#p<0.05，^##p<0.01，与正常组相比。

图10为示出各组小鼠的肝脏内PCK基因的相对表达量的图表。模型组小鼠的肝脏内PCK基因表达量显著升高，而rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组小鼠的肝脏内PCK基因表达量显著下降。其中，^*p<0.05，^**p<0.01，与模型组相比；^#p<0.05，^##p<0.01，与正常组相比。

图11和图12为示出各组小鼠的肝脏内的G6Pase和PCK蛋白的表达量的图。模型组小鼠的肝脏内G6Pase和PCK蛋白表达量显著升高，而rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组小鼠的肝脏内G6Pase和PCK蛋白表达量显著下降。其中，^*p<0.05，^**p<0.01，与模型组相比；^#p<0.05，^##p<0.01，与正常组相比。

图13为示出胰腺HE染色以及免疫组化结果的图片。模型组小鼠胰腺胰岛破坏比较严重，分泌胰岛素的量显著降低，而rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组小鼠胰岛相较于模型组得到显著的改善。

图14为示出在不同pH值(pH 5.0和5.5)的柠檬酸盐缓冲溶液中于25℃下保存14天后的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白以及-80℃保存的相同蛋白的HPLC分析的结果的谱图。

图15为示出在不同浓度的精氨酸水溶液(含有50mM、100mM和150mM精氨酸)中于25℃下保存25天后的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白以及-80℃保存的相同蛋白的HPLC分析的结果的谱图。

图16为示出在精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液(pH 5.5)中于25℃下保存35天后的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白以及-80℃保存的相同蛋白的HPLC分析的结果的谱图。

图17为示出在不同pH值(pH 5.0和5.5)的精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液中于4℃下保存60天后的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白以及-80℃保存的相同蛋白的HPLC分析的结果的谱图。

图18为示出在25℃和-80℃下储存35天后的不同剂量(10nmol、100nmol和1000nmol)的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白促进HepG2细胞对葡萄糖的摄取的结果的图表。

在上述各图涉及的融合蛋白中，X为A和V，且A与V比例为2：3。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步描述本申请，本申请的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本申请的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本申请的精神和范围下可以对本申请技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本申请的保护范围内。

除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见如Singleton等，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，NY 1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press(Cold SpringsHarbor，NY 1989)。

在本文中，除非另有说明，术语“模型组”和“模型对照组”可互换使用，术语“正常组”、“空白组”和“正常对照组”可互换使用。

在本文中，除非另有说明，术语“重组质粒”和“重组表达载体”可互换使用。

在本文中，除非另有说明，术语“接头”可为用于将rhFGF21和(VPGXG)_n以及(VPGXG)_n中的各重复单元连接在一起的氨基酸序列(其长度例如可为约1个至约5个氨基酸)，并可用于鉴定，例如可包括本领域常见的接头肽序列、酶切位点等，但不限于此。

在一个实施方式中，本申请提供了一种重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括融合在一起的rhFGF21和(VPGXG)_n，所述rhFGF21包含以SEQ IDNO:1示出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性的氨基酸序列；X为A和/或V；n为选自20-80中的整数。

在一个优选的实施方式中，所述rhFGF21包含与SEQ ID NO:1具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。

在一个优选的实施方式中，所述rhFGF21具有以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列(SEQ ID NO:1：HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS)。

在一个优选的实施方式中，X为A和V，且A与V比例为(1-3):(1-3)，例如A与V比例为(1-2):(1-3)、(1-2):(2-3)、(2-3):(1-3)、(2-3):(2-3)、(2-3):(1-2)、1:(1-3)、2:(1-3)或3:(1-3)。在更优选的实施方式中，X为A和V，且A与V比例为2:3(即，此时(VPGXG)_n为[(VPGAG)₂(VPGVG)₃]_m，其中，m的值满足n＝m×(2+3))。

在一个优选的实施方式中，n为选自30-80中的整数，例如n为选自30-70、30-60、30-50、40-80、40-70、40-60、40-50中的整数。在一些具体的实施方式中，n为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75。在一些具体的实施方式中，n为30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70。在一些更优选的实施方式中，n为40-60，例如40。

在一个优选的实施方式中，所述融合蛋白由融合在一起的rhFGF21和(VPGXG)_n以及任选的接头组成。

在一个优选的实施方式中，所述接头的氨基酸序列为RS和/或GS。

在一个优选的实施方式中，所述融合蛋白具有以SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％、例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。

在一个优选的实施方式中，所述融合蛋白具有以SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列(SEQ ID NO:2：HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYASRSVPGAGVPGAGVPGAGVPGAGVPGAGVPGAGVPGAGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGGSVPGAGVPGAGVPGAGVPGAGVPGAGVPGAGVPGAGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVG)。

在本文中，包含与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性的氨基酸序列的rhFGF21的融合蛋白或包含与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性的氨基酸序列的融合蛋白具有降糖活性。

在一个实施方式中，本申请提供编码上述的融合蛋白的多核苷酸。在本文中，除非另有说明，术语“多核苷酸”、“核酸”、“核酸序列”和“基因”可互换使用。

在一些优选的实施方式中，编码上述的融合蛋白中的rhFGF21的多核苷酸部分包含以SEQ ID NO:3示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％、例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。

在进一步优选的实施方式中，编码上述的融合蛋白中的rhFGF21的多核苷酸部分具有以SEQ ID NO:3示出的核苷酸序列(SEQ ID NO:3：CATCCTATTCCTGACAGCTCACCCCTGTTACAGTTTGGCGGTCAGGTTCGTCAACGCTATTTATACACCGACGACGCACAGCAAACCGAAGCACACCTGGAAATTCGTGAAGACGGCACCGTTGGTGGTGCAGCAGATCAATCCCCGGAATCTCTGCTGCAGTTAAAAGCATTAAAACCGGGCGTTATACAGATTTTAGGTGTCAAAACCTCCCGTTTTCTGTGTCAGCGGCCGGACGGTGCGCTTTATGGTAGCTTACACTTTGATCCGGAAGCCTGTAGTTTTCGTGAGCTGCTGCTGGAGGACGGTTACAATGTTTATCAATCAGAAGCACATGGTCTGCCGTTACATCTGCCGGGTAATAAGAGCCCGCATCGCGATCCGGCACCGCGTGGTCCAGCCAGATTTCTGCCTCTGCCGGGACTGCCGCCGGCACTTCCTGAACCGCCTGGTATTCTGGCACCGCAGCCGCCTGATGTTGGTTCATCTGATCCTCTGTCAATGGTTGGACCGAGCCAGGGACGTTCTCCCTCATACGCTTCT)。

在一些优选的实施方式中，编码上述的融合蛋白中的接头的多核苷酸部分包含以SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5示出的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5具有至少80％、例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。

在进一步优选的实施方式中，编码上述的融合蛋白中的接头的多核苷酸部分具有以SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5示出的核苷酸序列(SEQ ID NO:4：AGATCT；SEQ ID NO:5：GGATCC)。

在一些优选的实施方式中，编码上述的融合蛋白的多核苷酸包含以SEQ ID NO:6示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6具有至少80％、例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。

在一个优选的实施方式中，编码上述的融合蛋白的多核苷酸具有以SEQ ID NO:6示出的核苷酸序列(SEQ ID NO:6：CATCCTATTCCTGACAGCTCACCCCTGTTACAGTTTGGCGGTCAGGTTCGTCAACGCTATTTATACACCGACGACGCACAGCAAACCGAAGCACACCTGGAAATTCGTGAAGACGGCACCGTTGGTGGTGCAGCAGATCAATCCCCGGAATCTCTGCTGCAGTTAAAAGCATTAAAACCGGGCGTTATACAGATTTTAGGTGTCAAAACCTCCCGTTTTCTGTGTCAGCGGCCGGACGGTGCGCTTTATGGTAGCTTACACTTTGATCCGGAAGCCTGTAGTTTTCGTGAGCTGCTGCTGGAGGACGGTTACAATGTTTATCAATCAGAAGCACATGGTCTGCCGTTACATCTGCCGGGTAATAAGAGCCCGCATCGCGATCCGGCACCGCGTGGTCCAGCCAGATTTCTGCCTCTGCCGGGACTGCCGCCGGCACTTCCTGAACCGCCTGGTATTCTGGCACCGCAGCCGCCTGATGTTGGTTCATCTGATCCTCTGTCAATGGTTGGACCGAGCCAGGGACGTTCTCCCTCATACGCTTCTAGATCTGTTCCGGGTGCAGGTGTTCCGGGTGCCGGTGTTCCGGGGGCAGGTGTTCCTGGTGCGGGTGTTCCGGGCGCGGGTGTTCCTGGAGCGGGTGTTCCAGGTGCGGGTGTGCCGGGTGCGGGTGTACCTGGTGTTGGTGTTCCGGGAGTTGGTGTTCCTGGGGTTGGTGTTCCAGGGGTTGGTGTGCCGGGGGTTGGTGTCCCGGGTGTTGGTGTGCCTGGTGTTGGGGTTCCGGGTGTTGGGGTGCCGGGTGTTGGCGTTCCGGGTGTGGGTGTTCCGGGTGTCGGTGTTCCGGGTGTAGGTGGATCTGTTCCGGGTGCAGGTGTTCCGGGTGCCGGTGTTCCGGGGGCAGGTGTTCCTGGTGCGGGTGTTCCGGGCGCGGGTGTTCCTGGAGCGGGTGTTCCAGGTGCGGGTGTGCCGGGTGCGGGTGTACCTGGTGTTGGTGTTCCGGGAGTTGGTGTTCCTGGGGTTGGTGTTCCAGGGGTTGGTGTGCCGGGGGTTGGTGTCCCGGGTGTTGGTGTGCCTGGTGTTGGGGTTCCGGGTGTTGGGGTGCCGGGTGTTGGCGTTCCGGGTGTGGGTGTTCCGGGTGTCGGTGTTCCGGGTGTAGGTTGA)。

在一个实施方式中，本申请提供含有编码上述的融合蛋白的多核苷酸的重组表达载体。

目前的表达载体的类型虽多，但对于特定的蛋白而言，选择合适的载体却并不容易，很多表达系统的蛋白的表达量虽高，但表达的蛋白可溶性较差。就本申请的融合蛋白而言，为了便于大量生产和后续的纯化，优选能够在原核表达体系中进行表达，因此，在本申请考虑之列的是适合于原核表达体系的原核表达载体。优选的，考虑到分子伴侣有助于协助蛋白质折叠，可以选择携带分子伴侣的原核表达载体。其中，所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)。SUMO是一种小分子泛素样修饰蛋白，其能够促进目的蛋白的正确折叠进而增加目的蛋白的表达量和可溶性。

作为非限制性示例，适用于本申请的合适的表达载体例如但不限于：pSUMO载体、PET系列载体(如PET30a载体)。

在一个实施方式中，本申请提供含有上述的重组表达载体或者在其基因组中整合有上述的多核苷酸的重组细胞。

考虑到后续发酵和纯化的便利性，优选用于构建所述重组细胞的宿主细胞为原核宿主细胞，优选地，所述原核宿主细胞的实例包括但不限于：大肠杆菌(E.coli)(例如大肠杆菌Rossetta(DE3))、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)等。

在一个实施方式中，本申请提供一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含上述的融合蛋白。

在优选的实施方式中，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的药用辅料可选自例如但不限于溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、抗氧剂、渗透促进剂、pH值调节剂、表面活性剂、稀释剂等。关于其它可用的药学上可接受的药用辅料，可参见例如《药用辅料手册》(第4版)，R.C.罗等著，郑泽民主译，2005年，化学工业出版社。

在一个实施方式中，本申请涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含上述的融合蛋白或上述的药物组合物。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒进一步包含pH 5.0-5.5的柠檬酸盐缓冲溶液。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒进一步包含精氨酸水溶液、优选50mmol/L-150mmol/L的精氨酸水溶液。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒进一步包含pH 5.0-5.5的精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒进一步包含pH 5.0-5.5的柠檬酸盐缓冲溶液和精氨酸水溶液，并且，所述融合蛋白或所述药物组合物、所述pH 5.0-5.5的柠檬酸盐缓冲溶液、所述精氨酸水溶液包装在一起或者分别单独包装。

在一个实施方式中，本申请涉及上述的融合蛋白在制备用于预防或治疗与血糖代谢异常相关的疾病的药物中的用途。

在优选的实施方式中，所述与血糖代谢异常相关的疾病选自但不限于：糖尿病及糖尿病相关代谢疾病。优选地，所述糖尿病相关代谢疾病选自糖尿病肾病、血脂异常、肥胖症、心血管疾病、代谢综合征、脂代谢紊乱、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)或神经系统疾病(如癫痫、抑郁等)，但不限于此。

在一个实施方式中，本申请提供产生本申请上述的融合蛋白的方法，其中，所述方法包括：对上述的重组细胞进行培养，然后诱导上述的重组细胞进行表达并对表达产物进行纯化，得到所述融合蛋白。

在一个优选的实施方式中，所述重组细胞可为重组原核细胞，优选地，所述重组原核细胞的实例包括但不限于：重组大肠杆菌(例如重组大肠杆菌Rossetta(DE3))、重组农杆菌、重组金黄色葡萄球菌、重组白色葡萄球菌、重组嗜酸乳杆菌、重组炭疽芽孢杆菌、重组枯草芽孢杆菌或重组苏云金芽孢杆菌等。

重组细胞的培养可由本领域技术人员根据重组细胞的种类选择常规的培养基和培养条件进行(例如可参见如下的记载：《微生物培养基的制造与应用》，陈天寿主编，中国农业出版社，1995年；《微生物培养基实用手册》，马乐好等主编，吉林科学技术出版社，2005年；http://www.cgmcc.net/；以及https://www.sigmaaldrich.com/china-mainland/technical-documents/articles/bi ology/microbial-media.html等)。

可采用本领域技术人员已知的常规诱导剂，诱导上述的重组细胞进行表达。作为示例性的实施方式，例如采用选自如下的诱导剂，诱导上述的重组细胞进行表达：IPTG和/或乳糖。

可采用本领域技术人员已知的常规纯化手段对表达产物进行纯化以得到融合蛋白，所述常规纯化手段例如离子交换层析、吸附层析、亲和层析、分子筛层析、疏水层析或它们的任意组合等，但不限于此。在一个优选的实施方式中，所述表达产物的纯化包括如下步骤：(i)在诱导表达后，将所述重组细胞进行离心以收集菌体，将所述菌体进行破碎后离心收集上清；(ii)将所述上清进行离子交换层析，收集洗脱液；(iii)将所述洗脱液进行亲和层析，得到所述融合蛋白。

在一些优选的实施方式中，将所述重组细胞在10000-12000rpm/min下进行离心以收集菌体。

在一些优选的实施方式中，通过向所述菌体中加入溶菌酶并进行超声，将所述菌体进行破碎。

在一些优选的实施方式中，在10000-12000rpm/min下离心以收集所述上清。

在一些优选的实施方式中，采用琼脂糖凝胶、例如DEAE琼脂糖凝胶进行所述离子交换层析。

在一些优选的实施方式中，采用包括如下组成的缓冲液对所述上清进行洗脱：25mmol/L Tris-HCl，0.25mol/L NaCl，pH 8.0-8.2。

在一些优选的实施方式中，采用Ni·NTA树脂进行所述亲和层析。

在一些优选的实施方式中，所述亲和层析包括如下过程：在用平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡后，以所述洗脱液向所述亲和层析柱上样并采用洗涤缓冲液进行洗涤，然后，采用洗脱缓冲液对目的蛋白进行洗脱。

在一些优选的实施方式中，所述平衡缓冲液包括如下组成：50mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0-8.2。

在一些优选的实施方式中，所述洗涤缓冲液包括如下组成：50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑，pH 8.0-8.2。

在一些优选的实施方式中，所述洗脱缓冲液包括如下组成：50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，pH 8.0-8.2。

在一些优选的实施方式中，上述的产生融合蛋白的方法进一步包括如下步骤：

(1)合成编码rhFGF21的多核苷酸，并合成编码(VPGXG)₂₀的多核苷酸；

(2)将上述的编码rhFGF21的多核苷酸和编码(VPGXG)₂₀的多核苷酸进行酶切和连接，通过PCR反应，获得编码所述融合蛋白的多核苷酸；

(3)将编码所述融合蛋白的多核苷酸与表达载体进行酶切和连接，得到重组表达载体，将所述重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到所述重组细胞。

可通基于本领域已知的rhFGF21的蛋白序列或其DNA或RNA序列(例如，可参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_061986.1；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_033945.1；或https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_019113.4)，通过密码子优化，利用常规的基因合成手段合成编码rhFGF21的多核苷酸序列。

在优选的实施方式中，在步骤(1)中，所述编码rhFGF21的多核苷酸序列包含以SEQID NO:3示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％、例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。

在优选的实施方式中，在步骤(1)中，所述编码rhFGF21的多核苷酸具有以SEQ IDNO:3示出的核苷酸序列。

在优选的实施方式中，在步骤(1)中，所述编码(VPGXG)₂₀的多核苷酸包含以SEQ IDNO:7示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少80％、例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。

在优选的实施方式中，在步骤(1)中，所述编码(VPGXG)₂₀的多核苷酸具有以SEQ IDNO:7示出的核苷酸序列(SEQ ID NO:7：GTTCCGGGTGCAGGTGTTCCGGGTGCCGGTGTTCCGGGGGCAGGTGTTCCTGGTGCGGGTGTTCCGGGCGCGGGTGTTCCTGGAGCGGGTGTTCCAGGTGCGGGTGTGCCGGGTGCGGGTGTACCTGGTGTTGGTGTTCCGGGAGTTGGTGTTCCTGGGGTTGGTGTTCCAGGGGTTGGTGTGCCGGGGGTTGGTGTCCCGGGTGTTGGTGTGCCTGGTGTTGGGGTTCCGGGTGTTGGGGTGCCGGGTGTTGGCGTTCCGGGTGTGGGTGTTCCGGGTGTCGGTGTTCCGGGTGTAGGTTGA)。

在优选的实施方式中，在步骤(2)中，任选在所述编码(VPGXG)₂₀的多核苷酸的5′端和3′端分别连接有编码选自如下的接头的多核苷酸：RS和/或GS。优选地，在所述编码(VPGXG)₂₀的多核苷酸的5′端和3′端分别连接有具有以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5示出的核苷酸序列的多核苷酸。

在优选的实施方式中，在步骤(2)中，利用BglII限制性内切酶与BamHI限制性内切酶进行所述酶切和连接。

可由本领域技术人员基于本领域的普通知识(例如可参见《分子克隆实验指南》(第4版)，J.萨姆布鲁克等编著，贺福初主译，科学出版社，2017年)选择合适的常规的PCR实验条件和步骤、或者采用可商购的PCR试剂盒按照其中的说明书进行所述PCR反应。不受限制的，还可采用其它引物对和本领域已知的其它的基因合成手段来获得编码上述的融合蛋白的多核苷酸。

上述的酶切和连接，其具有本领域公知的含义，酶切和连接是指采用限制性核酸内切酶对两种目的DNA片段或者对一种目的DNA片段与载体DNA分子进行特异性切割，然后使用连接酶将进行酶切后的两种目的DNA片段或者酶切后的目的DNA片段与载体DNA分子的末端进行连接，从而得到重组分子或者重组载体。

在优选的实施方式中，在步骤(3)中，利用BsaI限制性内切酶与BamHI限制性内切酶进行所述酶切和连接。

对于将重组表达载体导入宿主细胞中的具体手段，可采用本领域已知的任何常规手段，例如转化、转染等。优选地，通过转化将该重组表达载体导入宿主细胞中。转化是指通过采用分子生物学和基因工程中的一些已知方法处理宿主细胞，使经处理后的宿主细胞处于感受态，并由此与外源DNA接触，从而使外源DNA进入处于感受态的宿主细胞中。

在优选的实施方式中，在步骤(3)中，所述宿主细胞为原核宿主细胞，优选地，所述原核宿主细胞的实例包括但不限于：大肠杆菌(例如大肠杆菌Rossetta(DE3))、农杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、炭疽芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌等。

对于导入重组表达载体的宿主细胞，可通过抗性筛选等常规手段筛选得到阳性的重组细胞。所述重组细胞的培养可由本领域技术人员根据重组细胞的种类选择常规的培养基和培养条件进行(例如，可参见如下的记载：《微生物培养基的制造与应用》，陈天寿主编，中国农业出版社，1995年；《微生物培养基实用手册》，马乐好等主编，吉林科学技术出版社，2005年；http://www.cgmcc.net/；以及https://www.sigmaaldrich.com/china-mainland/technical-documents/articles/biology/microbial-media.html等)。

在优选的实施方式中，在步骤(3)中，所述表达载体选自pSUMO载体和PET系列载体(如PET30a载体)，但不限于此。在进一步优选的实施方式中，将携带小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)作为分子伴侣的pSUMO载体用作所述表达载体，并将大肠杆菌Rossetta(DE3)用作宿主细胞。

在示例性的实施方式中，将含有编码上述的融合蛋白的多核苷酸的重组pSUMO载体转化至所述宿主细胞中；对筛选得到的重组细胞进行培养，然后诱导上述的重组细胞表达SUMO-融合蛋白，对表达产物进行离子交换层析和亲和层析纯化得到初步纯化的SUMO-融合蛋白，在透析后，利用SUMO蛋白酶切除与融合蛋白相连的分子伴侣SUMO，并对切除SUMO后的融合蛋白进行亲和层析纯化，得到经纯化的融合蛋白。

本发明的示例性的技术方案可通过如下编号段落的内容进行说明：

1.一种重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括融合在一起的rhFGF21和(VPGXG)_n，所述rhFGF21包含以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列或与SEQID NO:1具有至少80％一致性的氨基酸序列；X为A和/或V；n为选自20-80中的整数。

2.如段落1所述的融合蛋白，其中，X为A和V，且A与V比例为(1-3):(1-3)、优选2:3。

3.如段落1或2所述的融合蛋白，其中，n为40-60中的整数、优选40。

4.如段落1-3中任一段所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由融合在一起的rhFGF21和(VPGXG)_n以及任选的接头组成。

5.如段落4所述的融合蛋白，其中，所述接头的氨基酸序列为RS和/或GS。

6.如段落1-5中任一段所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白具有以SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性的氨基酸序列。

7.一种编码段落1-6中任一段所述的融合蛋白的多核苷酸。

8.如段落7所述的多核苷酸，其中，编码所述融合蛋白中的rhFGF21的多核苷酸部分包含以SEQ ID NO:3示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性的核苷酸序列。

9.如段落7或8所述的多核苷酸，其中，编码所述融合蛋白中的接头的多核苷酸部分包含以SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5示出的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:4和/或SEQID NO:5具有至少80％一致性的核苷酸序列。

10.如段落7-9中任一段所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含以SEQ ID NO:6示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6具有至少80％一致性的核苷酸序列。

11.一种含有段落7-10中任一段所述的多核苷酸的重组表达载体。

12.如段落11所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为原核重组表达载体。

13.如段落12所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为携带分子伴侣的原核重组表达载体。

14.段落13所述的重组表达载体，其中，所述分子伴侣为小分子泛素样修饰蛋白。

15.如段落11或12所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为重组的pSUMO载体或重组的PET系列载体。

16.一种含有段落11-15中任一段所述的重组表达载体或者在其基因组中整合有段落7-10中任一段所述的多核苷酸的重组细胞。

17.如段落16所述的重组细胞，其中，用于构建所述重组细胞的宿主细胞为原核宿主细胞。

18.如段落17所述的重组细胞，其中，所述原核宿主细胞选自大肠杆菌、农杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、炭疽芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。

19.一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含段落1-6中任一段所述的融合蛋白。

20.如段落19所述的药物组合物，其中，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的辅料。

21.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含段落1-6中任一段所述的融合蛋白或者段落19或20所述的药物组合物。

22.如段落21所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含pH5.0-5.5的柠檬酸盐缓冲溶液。

23.如段落21或22所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含精氨酸水溶液、优选50mmol/L-150mmol/L的精氨酸水溶液。

24.如段落21-23中任一段所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含pH 5.0-5.5的精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液。

25.如段落21所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含精氨酸水溶液和pH5.0-5.5的柠檬酸盐缓冲溶液，并且，所述融合蛋白或所述药物组合物、所述pH 5.0-5.5的柠檬酸盐缓冲溶液、以及所述精氨酸水溶液包装在一起或者分别单独包装。

26.段落1-6中任一段所述的融合蛋白在制备用于预防或治疗与血糖代谢异常相关的疾病的药物中的用途。

27.如段落26所述的用途，其中，所述与血糖代谢异常相关的疾病选自糖尿病及糖尿病相关代谢疾病，优选地，所述糖尿病相关代谢疾病选自糖尿病肾病、血脂异常、肥胖症、心血管疾病、代谢综合征、脂代谢紊乱、非酒精性脂肪肝疾病或神经系统疾病。

28.一种产生段落1-6中任一段所述的融合蛋白的方法，其中，所述方法包括：对段落16-18中任一段所述的重组细胞进行培养，然后诱导所述重组细胞进行表达并对表达产物进行纯化，得到所述融合蛋白。

29.如段落28所述的方法，其中，采用选自如下的诱导剂，诱导所述重组细胞进行表达：IPTG和/或乳糖。

30.如段落28或29所述的方法，其中，所述表达产物的纯化包括如下步骤：(i)在诱导表达后，将所述重组细胞进行离心以收集菌体，将所述菌体进行破碎后离心收集上清；(ii)将所述上清进行离子交换层析，收集洗脱液；(iii)将所述洗脱液进行亲和层析，得到所述融合蛋白。

31.如段落28-30中任一段所述的方法，其中，所述方法还包括如下步骤：

32.如段落31所述的方法，在步骤(1)中，所述编码rhFGF21的多核苷酸序列包含以SEQ ID NO:3示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性的核苷酸序列。

33.如段落31或32所述的方法，在步骤(1)中，所述编码(VPGXG)₂₀的多核苷酸包含以SEQ ID NO:7示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少80％一致性的核苷酸序列。

34.如段落31-33中任一段所述的方法，在步骤(2)中，任选在所述编码(VPGXG)₂₀的多核苷酸的5′端和3′端分别连接有编码选自如下的接头的多核苷酸：RS和/或GS。

35.如段落31-34中任一段所述的方法，在步骤(2)中，利用BglII限制性内切酶与BamHI限制性内切酶进行所述酶切和连接。

36.如段落31-35中任一段所述的方法，在步骤(3)中，利用BsaI限制性内切酶与BamHI限制性内切酶进行所述酶切和连接。

37.如段落31-36中任一段所述的方法，在步骤(3)中，所述表达载体选自pSUMO载体和PET系列载体。

38.如段落31-37中任一段所述的方法，在步骤(3)中，所述表达载体为pSUMO载体，且所述宿主细胞为大肠杆菌Rossetta(DE3)。

需要说明的是，本申请中涉及的基因的设计、合成和克隆，原核表达载体的构建，核酸提取及序列分析及鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作步骤，可按照本领域已知的技术进行(例如参见CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY的记载)。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非另外说明，下述实施例中使用的试剂、材料和设备均为可商购的试剂、材料和设备。

实施例实施例1重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白的基因的制备

将rhFGF21的基因与(VPGXG)₂₀的基因之间通过BglII酶切位点相连，然后进行PCR在rhFGF21-(VPGXG)₂₀的5’端与3’端引入BsaI与BamHI酶切位点；再利用BamHI酶切位点连接至另一经BglII和BamHI酶切后的(VPGXG)₂₀的基因，得到rhFGF21-(VPGXG)₄₀，然后进行PCR在rhFGF21-(VPGXG)₄₀的5’端引入BsaI酶切位点，在3’端引入终止密码子和BamHI酶切位点。

1、带有酶切位点的rhFGF21的基因的合成

通过NCBI查询野生型hFGF21的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，并经密码子优化得到编码rhFGF21的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)，委托基因合成公司合成带有BsaI酶切位点(SEQID NO:10：GGTCTCAGGT)和BglII酶切位点(SEQ ID NO:4：AGATCT)的基因(SEQ ID NO:8：GG TCTCAGGTCATCCTATTCCTGACAGCTCACCCCTGTTACAGTTTGGCGGTCAGGTTCGTCAACGCTATTTATACACCGACGACGCACAGCAAACCGAAGCACACCTGGAAATTCGTGAAGACGGCACCGTTGGTGGTGCAGCAGATCAATCCCCGGAATCTCTGCTGCAGTTAAAAGCATTAAAACCGGGCGTTATACAGATTTTAGGTGTCAAAACCTCCCGTTTTCTGTGTCAGCGGCCGGACGGTGCGCTTTATGGTAGCTTACACTTTGATCCGGAAGCCTGTAGTTTTCGTGAGCTGCTGCTGGAGGACGGTTACAATGTTTATCAATCAGAAGCACATGGTCTGCCGTTACATCTGCCGGGTAATAAGAGCCCGCATCGCGATCCGGCACCGCGTGGTCCAGCCAGATTTCTGCCTCTGCCGGGACTGCCGCCGGCACTTCCTGAACCGCCTGGTATTCTGGCACCGCAGCCGCCTGATGTTGGTTCATCTGATCCTCTGTCAATGGTTGGACCGAGCCAGGGACGTTCTCCCTCATACGCTTCTAGATCT)。

2、接头-(VPGXG)₂₀的基因的制备

委托基因合成公司合成具有以SEQ ID NO:9示出的核苷酸序列的接头-(VPGXG)₂₀的基因，其由5′端的具有以SEQ ID NO:4示出的核苷酸序列的编码接头RS的多核苷酸(即，BglII酶切位点)、具有以SEQ ID NO:7示出的核苷酸序列的编码(VPGXG)₂₀的多核苷酸、以及3′端的具有以SEQ ID NO:5示出的核苷酸序列的编码接头GS的多核苷酸(即，BamHI酶切位点)组成(SEQ ID NO:9：AGATCTGTTCCGGGTGCAGGTGTTCCGGGTGCCGGTGTTCCGGGGGCAGGTGTTCCTGGTGCGGGTGTTCCGGGCGCGGGTGTTCCTGGAGCGGGTGTTCCAGGTGCGGGTGTGCCGGGTGCGGGTGTACCTGGTGTTGGTGTTCCGGGAGTTGGTGTTCCTGGGGTTGGTGTTCCAGGGGTTGGTGTGCCGGGGGTTGGTGTCCCGGGTGTTGGTGTGCCTGGTGTTGGGGTTCCGGGTGTTGGGGTGCCGGGTGTTGGCGTTCCGGGTGTGGGTGTTCCGGGTGTCGGTGTTCCGGGTGTAGGTGGATCC)。

3、rhFGF21-(VPGXG)₄₀融合蛋白的基因的制备

以上述得到的带有酶切位点的rhFGF21的基因和接头-(VPGXG)₂₀的基因作为模板，采用BglII限制性内切酶按制造商的说明书进行酶切并采用T4DNA连接酶进行连接，得到rhFGF21-(VPGXG)₂₀多肽的核苷酸序列。

为了得到rhFGF21-(VPGXG)₄₀融合蛋白的基因，采用引物P1(SEQ ID NO:11)和P2(SEQ ID NO:12)以及rTaq酶按照下文所述的50μL体系进行PCR，向得到的rhFGF21-(VPGXG)₂₀多肽的核苷酸序列的5’端与3’端引入BsaI与BamHI酶切位点。

P1：5′-GGTCTCAGGTCATCCTATTCCTGACAGCT-3′

BsaI

P2：5′-GGATCCACCTACACCCGGAACA-3′

BamHI

将上述的引入酶切位点后的核苷酸序列，通过solution I连接酶连接至T载体后，利用BamHI限制性内切酶进行酶切；同时，将接头-(VPGXG)₂₀的基因通过BglII和BamHI限制性内切酶进行酶切，按制造商的说明书进行酶切，并将上述两种酶切产物采用DNA片段胶回收试剂盒(购自Omega，货号：D6492)进行胶回收后，采用T4 DNA连接酶进行连接。

然后，以连接产物作为模板，采用rTaq酶进行PCR反应(50μL体系)，引入终止密码子(TCA)：

其中，引物P1和引物P3(SEQ ID NO:13)的序列如下：

P1：5′-GGTCTCAGGTCATCCTATTCCTGACAGCT-3′

BsaI

P3：5′-GGATCCTCAACCTACACCCGGAACA-3′

BamHI

将得到的PCR产物采用DNA片段胶回收试剂盒(购自Omega，货号：D6492)进行胶回收，得到rhFGF21-(VPGXG)₄₀融合蛋白的基因。

4、其它的融合蛋白的基因的制备

按照与上述制备rhFGF21-(VPGXG)₄₀融合蛋白的基因相同的操作和条件，得到融合蛋白rhFGF21-(VPGXG)₂₀、rhFGF21-(VPGXG)₆₀、rhFGF21-(VPGXG)₈₀的基因。

其中，为了制备融合蛋白rhFGF21-(VPGXG)₂₀的基因，直接在得到的rhFGF21-(VPGXG)₂₀多肽的核苷酸序列的3’端通过PCR引入终止密码子，而无需再引入酶切位点，其中，50μL的PCR体系同上文所述。

实施例2人成纤维细胞生长因子21融合蛋白的制备

本实施例中涉及的pSUMO和大肠杆菌Rossetta(DE3)通过商购得到。

1、rhFGF21-(VPGXG)₄₀基因重组原核表达载体的构建

将实施例1得到的rhFGF21-(VPGXG)₄₀目的基因片段与原核表达载体pSUMO采用BsaI和BamHI酶按制造商的说明书进行双酶切，并采用DNA片段胶回收试剂盒(购自Omega，货号：D6492)对酶切产物进行纯化，随后利用T4 DNA连接酶以10μL的连接反应体系按制造商的说明书进行连接，16℃连接过夜。

经过BsaI和BamHI双酶切并将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，构建得到含有正确序列的重组质粒pSUMO-rhFGF21-(VPGXG)₄₀。

2、rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白的表达和纯化

(1)诱导表达

将含有正确序列的重组质粒pSUMO-rhFGF21-(VPGXG)₄₀转化至表达菌株大肠杆菌Rossetta(DE3)感受态细胞中。将转化后的感受态细胞涂布至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养10-12h后，挑取转化后的阳性重组菌的单菌落接种至5mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中，37℃培养10h，将培养液以1:100接种于500mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中，37℃培养2h，A600＝0.3-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L进行诱导(在诱导前，取培养物在12000rpm/min下离心30min得到上清和沉淀，并将所述上清和沉淀进行15％SDS-PAGE电泳分析)，诱导3h后通过离心(12000rpm/min下离心30min)收集菌体。

(2)蛋白质纯化

通过上述的离心收集菌体后，向菌体中加入溶菌酶至终浓度1mg/mL，冰上静置1h，然后进行超声破碎并在破碎完成后离心(12000rpm/min，30min)收集上清，分别取得到的上清和沉淀进行15％SDS-PAGE电泳分析，其中，可溶性表达的目的蛋白可占菌体总目的蛋白的70％以上。将所述上清通过DEAE Sepharose FF层析柱进行纯化，其中，用缓冲液1(25mmol/L Tris-HCl，0.25mol/L NaCl，pH 8.0)进行洗脱，收集得到离子交换层析洗脱液。将所述离子交换层析洗脱液进行Ni·NTA树脂柱亲和层析，其中，先用平衡缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.5mol/L NaCl，10mmol/L咪唑)平衡Ni·NTA树脂柱，然后将上述的洗脱液上样到平衡好的树脂柱中，上样完毕后用洗涤缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.5mol/L NaCl，50mmol/L咪唑)进行洗涤。最后，以洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，500mmol/L咪唑)进行目的蛋白的洗脱。收集各洗脱峰得到亲和层析洗脱液，并进行SDS-PAGE检测。

将所述亲和层析洗脱液用PBS缓冲液(pH 7.4)4℃透析过夜，得到去除咪唑的融合蛋白SUMO-rhFGF21-(VPGXG)₄₀，向其中加入DTT至终浓度为2mmol/L和SUMO Protease-I(带有His Tag)(切割比例为1:50，即1mg SUMO Protease-I：50mg SUMO-rhFGF21-(VPGXG)₄₀)，4℃切割过夜。将得到的切割产物与Ni-NTA Agarose充分混合以收集流穿液，其中，用PBS缓冲液(pH 7.4)将非特异性吸附的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白洗脱。经过HPLC分析(流动相为PBS缓冲液，流速为1mL/min，色谱柱：Agilent AdvanceBio SEC

2.7μm，7.8×300mm，货号：PL1180-5301)显示出，纯化后的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白(具有以SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列)的纯度达到95％以上(图3)。

以与上述的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白相同的表达和纯化操作和条件，实施rhFGF21-(VPGXG)₂₀、rhFGF21-(VPGXG)₆₀、rhFGF21-(VPGXG)₈₀蛋白的表达和纯化。利用15％SDS-PAGE电泳对各蛋白的表达量进行分析(图1)。实施例3人成纤维细胞生长因子21融合蛋白的活性试验

1、rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白的细胞水平活性检测

将β-Klotho克隆至逆转录病毒真核表达载体pBMN-βKlotho-IRES-EGFP中，以绿色荧光蛋白作为报告基因，利用脂质体转染法将重组的逆转录病毒载体转入293包装细胞，离心收集病毒上清，感染3T3-L1前体细胞(购自ATCC，货号：CL-173)，利用流式细胞仪筛选到表达β-Klotho的β-Klotho-3T3-L1稳定细胞系，称为β-Klotho-3T3-L1脂肪细胞。将β-Klotho-3T3-L1脂肪细胞饥饿12h，用细胞培养基(DMEM，gibco，C11965500BT)稀释纯化后的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白，使其终浓度为10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L，以每孔1ml的量将不同浓度的稀释液加入到已分化成熟的脂肪细胞中。每个浓度至少设3个重复孔。

葡萄糖浓度的检测：在上述处理后分别孵育细胞24h后，取上清培养基2μL放入200μL的葡萄糖检测液中测定葡萄糖的含量。每个浓度至少重复3次，37℃反应5～10分钟后，在500nm波长下测OD值。细胞的葡萄糖消耗率计算方法如下，并对实验结果进行统计学分析。

计算培养基中残留的葡萄糖浓度(C)，公式为：

葡萄糖浓度(mmol/L)＝OD_样品/OD_标准×5.55mmol/L

计算细胞对葡萄糖的消耗率，公式为：

细胞葡萄糖消耗率(％)＝[(C_{空白葡萄糖}-C_{给药葡萄糖})/C_{空白葡萄糖}]×100％。

用不同浓度的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白处理脂肪细胞24h后，经微量化的GOD-POD法葡萄糖检测试剂盒检测培养基中葡萄糖含量，统计学分析结果显示，用rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白处理的细胞对葡萄糖的摄取利用显著增加，与未经任何处理的对照组相比，残存在培养基中的葡萄糖含量明显减少。

按照上述方法，采用rhFGF21和上述制备的各融合蛋白对β-Klotho-3T3-L1脂肪细胞进行处理，结果显示，未经处理的β-Klotho-3T3-L1脂肪细胞的糖吸收为约27％，经10nmol/L rhFGF21刺激后增加至约35％，经10nmol/L rhFGF21-(VPGXG)₂₀刺激后增加至约39％，经10nmol/L rhFGF21-(VPGXG)₄₀刺激后增加至约46％，经10nmol/L rhFGF21-(VPGXG)₆₀刺激后增加至约37％，经10nmol/L rhFGF21-(VPGXG)₈₀刺激后增加至约32％。结果表明，相较于同剂量的rhFGF21以及其它融合蛋白，10nmol/L rhFGF21-(VPGXG)₄₀融合蛋白具有最好的活性(图2)。

2、rhFGF21和不同的融合蛋白的动物体内降糖活性的比较

利用STZ(80mg/kg)诱导C57BL/6J小鼠(长春亿斯实验动物技术有限责任公司，动物质量合格证号SCXK(吉)-2011-0004)，获得糖尿病小鼠，血糖持续高于13.8mmol/L的小鼠被认为是糖尿病小鼠。

将建立好的糖尿病模型小鼠，随机分为6组，每组8只。同时设置正常小鼠组作为空白对照组，8只。通过皮下给药方式，模型对照组注射PBS缓冲液；rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组以1mg/kg/d剂量注射融合蛋白，rhFGF21-(VPGXG)₂₀、rhFGF21-(VPGXG)₆₀、rhFGF21-(VPGXG)₈₀治疗组分别以与rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组相同的剂量注射融合蛋白，注射完毕12小时后(在此期间，小鼠自由饮食)，检测各组小鼠的血糖水平。结果显示，在给药12小时后，与模型组相比，rhFGF21治疗组的降糖效果减弱；各融合蛋白治疗组表现出一定的治疗效果，其中，融合蛋白rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组的小鼠的血糖水平较模型组显著下降(p<0.01)，且相较于其它组，rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组的降糖效果最好(图4)。

3、rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白的体内活性试验

(1)糖尿病小鼠模型检测rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白活性

利用STZ(80mg/kg)诱导C57BL/6J小鼠(长春亿斯实验动物技术有限责任公司，动物质量合格证号SCXK(吉)-2011-0004)，获得糖尿病小鼠(血糖持续高于13.8mmol/L)，随机分为5组，每组8只。同时将正常小鼠作为正常对照组，8只。通过皮下给药方式，模型对照组注射PBS缓冲液；rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组以1mg/kg/d剂量注射融合蛋白，连续注射58天。实验开始于上午8:00(此时模型动物血糖为一天内较高值)，实验过程中自由饮食。

模型对照组：糖尿病小鼠每天上午8:00左右皮下注射PBS缓冲液，单次注射体积为0.15mL；

rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组：糖尿病鼠每天上午8:00左右皮下注射rhFGF21-(VPGXG)₄₀融合蛋白(溶剂为PBS缓冲液)，单次注射剂量为1mg/kg/d rhFGF21-(VPGXG)₄₀融合蛋白(以总蛋白计)，单次注射体积为0.15mL。

正常对照组：健康小鼠每天上午8:00左右皮下注射PBS缓冲液，单次注射体积为0.15mL。

每2天检测一次各组小鼠血糖，结果显示，经rhFGF21-(VPGXG)₄₀融合蛋白治疗3天，该组小鼠的血糖水平较模型组显著下降，治疗6天后血糖维持在较低的水平并接近正常组小鼠血糖水平。持续给药30天后，OGTT检测各组小鼠的糖耐受水平。结果显示，口服葡萄糖后30min，模型组小鼠的血糖显著上升，且30min后下降比较缓慢，rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组小鼠的血糖显著低于模型组，并且血糖在60min已降至接近正常组小鼠血糖(图5)。结果表明，rhFGF21-(VPGXG)₄₀融合蛋白治疗后，小鼠的葡萄糖耐受得到显著的改善。在58天的注射期间，模型组小鼠的血糖始终维持较高的水平，rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组小鼠的血糖较模型组显著下降，治疗后血糖维持在较低的水平并接近正常组小鼠的血糖水平，且药效比rhFGF21更持久(图6)。模型组小鼠的血清胰岛素水平较正常组显著下降，经rhFGF21-(VPGXG)₄₀融合蛋白治疗后，血清胰岛素含量较模型组得到显著的提高(图7)。模型组小鼠的糖化血红蛋白水平较正常组显著上升，rhFGF21-(VPGXG)₄₀融合蛋白治疗后，糖化血红蛋白较模型组得到显著的降低(图8)。通过实时荧光定量PCR和western印迹检测肝脏G6Pase和PCK表达量，结果显示，模型组小鼠的G6Pase和PCK表达量较正常组显著上升；rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗后，小鼠的G6Pase和PCK表达量较模型组显著下降(图9至图12)。此外，利用HE染色和免疫组化评价胰岛的损伤情况。结果显示，模型组小鼠的胰岛损伤严重，分泌胰岛素的量显著下降；rhFGF21-(VPGXG)₄₀治疗组小鼠的胰岛的损伤情况得到显著的改善，分泌胰岛素的量显著提高(图13)。

实施例4人成纤维细胞生长因子21融合蛋白的稳定储存条件的确定

1、rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白的缓冲溶液的确定

分别配制如下缓冲液：醋酸缓冲溶液pH 4.0、pH 5.0(将醋酸溶于水配制)；柠檬酸盐缓冲溶液pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0(将柠檬酸和柠檬酸钠溶于水配制)；磷酸盐缓冲溶液pH6.5、pH 7.0(将磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶于水配制)；Tris-HCl缓冲溶液pH 7.5、pH 8.0(将Tris-HCl溶于水配制)。将HiPrepTM 26/10Desalting脱盐柱连接到AKTA purifier100系统中，先用8-10倍柱体积的蒸馏水冲掉脱盐柱中的保护液(20％乙醇)，再用8-10倍柱体积的上述目的缓冲溶液平衡脱盐柱，上载样品(处于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中的浓度为2mg/mL的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白的溶液)。紫外曲线先上升，当紫外曲线下降至基线后电导曲线上升，利用收集器将相应紫外吸收峰处的蛋白收集，即获得缓冲溶液置换后的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白。将缓冲溶液置换后的9组rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白置于25℃恒温箱中避光保存，每隔一段时间进行蛋白保存的外观检查并分别取样进行15％SDS-PAGE电泳及HPLC检测(PBS缓冲液，1mL/min，色谱柱：Agilent AdvanceBio SEC

2.7μm，7.8×300mm，货号：PL1180-5301)；并以于-80℃保存的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白水溶液作为对照。

结果显示，刚置换到pH 4.0的醋酸盐缓冲溶液中，rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白就出现了肉眼可见的浑浊现象，在pH 4.5的醋酸盐缓冲溶液中在第7天出现了浑浊；在pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液中，在第三天出现了浑浊现象，在pH 7.5的Tris-HCl缓冲溶液中，在第7天出现了浑浊；任一pH的柠檬酸盐缓冲溶液和磷酸盐缓冲溶液在14天时，都没有发现肉眼可见的浑浊现象。分别取不同缓冲液保存的蛋白进行15％SDS-PAGE分析、HPLC检测。由15％SDS-PAGE的结果可以看出：虽然两种pH的磷酸盐缓冲溶液保存的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白溶液都没有肉眼可见的浑浊现象，但都出现了大部分的蛋白降解；保存在pH 6.0柠檬酸盐缓冲溶液中的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白也有大部分的蛋白降解，相比之下，保存在pH 5.0和5.5的柠檬酸盐缓冲溶液中的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白有相对较少降解发生。由HPLC结果可知，以于-80℃保存的未加保护剂的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白的水溶液作为对照，只有pH 5.0和pH 5.5的柠檬酸盐缓冲溶液中保存的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白保持了较好的完整性(图14)。而且结果发现：pH 5.5的柠檬酸盐缓冲溶液对rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白的保护作用略好于pH5.0的柠檬酸盐缓冲溶液。

2、rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白的保护剂的确定

分别用蒸馏水配制如下保护剂溶液：蔗糖溶液(25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL)、海藻糖溶液(25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL)、甘氨酸溶液(50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L)、精氨酸溶液(50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L)、组氨酸溶液(25mmol/L、50mmol/L、100mmol/L)、甘露醇溶液(2.5％、5％、7.5％)、山梨醇溶液(5％、10％、15％)、NaCl溶液(50mg/mL、100mg/mL、150mg/mL)、右旋糖酐溶液(2％、3％、5％)。各保护剂溶液置换方法如本实施例第1部分所述，利用收集器将相应紫外吸收峰处的蛋白收集，即获得保护剂溶液置换后的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白。将各组保护剂溶液置换后的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白置于25℃恒温箱中避光保存，每隔一段时间分别取样进行15％SDS-PAGE电泳及HPLC检测(PBS缓冲液，1mL/min，色谱柱：Agilent AdvanceBio SEC

2.7μm，7.8×300mm，货号：PL1180-5301)，并以于-80℃保存的未加保护剂的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白水溶液作为对照。

结果显示，由15％SDS-PAGE蛋白电泳图可以看出：在其它保护剂溶液中保存的蛋白在25℃保存25天后基本已经全部降解；而在精氨酸溶液中的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白在25℃保存25天后，发生相对较少的降解，仍能够具有很好的完整性，可见，精氨酸水溶液对融合蛋白的稳定性起到了很好的保护作用，并且三种浓度的精氨酸水溶液的保护效果的差别并不明显，为了更好的比较，对上述三种浓度的精氨酸水溶液中保存的融合蛋白进行HPLC分析(PBS缓冲液，1mL/min，色谱柱：Agilent AdvanceBio SEC

2.7μm，7.8×300mm，货号：PL1180-5301)。由HPLC的结果可以看出，精氨酸水溶液对rhFGF21-VPGXG₄₀蛋白在25℃的稳定性起到了很大的保护作用，且三种浓度的精氨酸水溶液的保护效果差别不大(图15)。

3、rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白的储存溶液的确定

将精氨酸、柠檬酸和柠檬酸钠溶于水分别配制pH 5.5和pH 5.0的精氨酸(50mmol/L)+柠檬酸盐缓冲溶液。rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白的储存溶液置换方法如本实施例第1部分所述，利用收集器将相应紫外吸收峰处的蛋白收集，即获得储存溶液置换后的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白。将各组蛋白储存溶液置换后的rhFGF21-VPGXG₄₀蛋白分成2等份，一份置于25℃恒温箱中避光保存；另一份置于4℃展示柜中避光保存。每隔一段时间分别取样进行15％SDS-PAGE电泳及HPLC检测(PBS缓冲液，1mL/min，色谱柱：Agilent AdvanceBio SEC

2.7μm，7.8×300mm，货号：PL1180-5301)，并以于-80℃保存的蛋白水溶液作为对照。

结果显示，将精氨酸和柠檬酸盐缓冲溶液混合后用于保存蛋白时，对蛋白的保存效果提高。在只有柠檬酸盐缓冲溶液保存的情况下，25℃放置14天时蛋白发生了降解。在只有精氨酸保存的情况下，在25℃放置25天后发生了降解。但是在精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液中，在25℃保存了35天后，保存在pH 5.0的精氨酸(50mmol/L)+柠檬酸盐缓冲溶液中的蛋白才有降解，而pH 5.5的精氨酸(50mmol/L)+柠檬酸盐缓冲溶液此时仍没有看到降解现象的发生。为了更精细地确定pH 5.5的精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液对蛋白的保护效果，将其与-80℃保存的蛋白进行HPLC分析(PBS缓冲液，1mL/min，色谱柱：Agilent AdvanceBio SEC

2.7μm，7.8×300mm，货号：PL1180-5301)和比较，结果可以看出两者均几乎没有变化，这说明了将蛋白保存在pH 5.5的精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液中明显提高了蛋白的稳定性，在35天的保存期间保持了蛋白的物理及化学的稳定性(图16)。将蛋白在上述两种精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液中在4℃保存60天后，两者的SDS-PAGE电泳的结果看不出明显区别，均未显示出降解的带。但是经过HPLC检测(PBS缓冲液，1mL/min，色谱柱：AgilentAdvanceBio SEC

2.7μm，7.8×300mm，货号：PL1180-5301)后可以看出，由pH 5.0的精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液保存的蛋白仅发生少量的降解(即，降解的带经SDS-PAGE电泳未分开)；而由pH 5.5的精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液保存的蛋白，经HPLC检测(PBS缓冲液，1mL/min，色谱柱：Agilent AdvanceBio SEC

2.7μm，7.8×300mm，货号：PL1180-5301)未发现降解现象(图17)。可见，采用上述两种精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液在25℃保存35天或在4℃保存60天均能较好地保持蛋白的物理和化学稳定性；相对而言，pH 5.5的精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液能更好地保持蛋白的物理和化学稳定性。

4、蛋白储存溶液中的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白的活性检测

向HepG2细胞中加入在-80℃及25℃储存35天后的处于上述储存溶液中的rhFGF21-(VPGXG)₄₀蛋白，在37℃、0.5％CO₂下孵育培养24h后，运用GOD-POD法葡萄糖检测试剂盒检测培养基(DMEM，gibco，C11965500BT)中剩余的葡萄糖含量。

结果显示，25℃储存的蛋白对细胞的葡萄糖吸收仍有很好的促进作用，且其促进作用呈现出剂量依赖关系；25℃储存的蛋白的3个剂量(10nmol、100nmol、1000nmol)的促进作用与相应剂量(10nmol、100nmol、1000nmol)的-80℃保存的蛋白相比，虽然都略微下降，但是它们之间的差异并不显著，说明在上述储存溶液中于25℃保存的蛋白保持很好的生物学活性(图18)。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏康缘瑞翱生物医药科技有限公司

<120> rhFGF21融合蛋白、编码其的多核苷酸、包含其组合物及其用途

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 181

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> rhFGF21

<400> 1

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 2

<211> 385

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> rhFGF21-(VPGXG)40 fusion protein

<400> 2

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser Arg Ser Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala

180 185 190

Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly

195 200 205

Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val

210 215 220

Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro

225 230 235 240

Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly

245 250 255

Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val

260 265 270

Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Ser Val Pro Gly

275 280 285

Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala

290 295 300

Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly

305 310 315 320

Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val

325 330 335

Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro

340 345 350

Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly

355 360 365

Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val

370 375 380

Gly

385

<210> 3

<211> 543

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence for encoding rhFGF21

<400> 3

catcctattc ctgacagctc acccctgtta cagtttggcg gtcaggttcg tcaacgctat 60

ttatacaccg acgacgcaca gcaaaccgaa gcacacctgg aaattcgtga agacggcacc 120

gttggtggtg cagcagatca atccccggaa tctctgctgc agttaaaagc attaaaaccg 180

ggcgttatac agattttagg tgtcaaaacc tcccgttttc tgtgtcagcg gccggacggt 240

gcgctttatg gtagcttaca ctttgatccg gaagcctgta gttttcgtga gctgctgctg 300

gaggacggtt acaatgttta tcaatcagaa gcacatggtc tgccgttaca tctgccgggt 360

aataagagcc cgcatcgcga tccggcaccg cgtggtccag ccagatttct gcctctgccg 420

ggactgccgc cggcacttcc tgaaccgcct ggtattctgg caccgcagcc gcctgatgtt 480

ggttcatctg atcctctgtc aatggttgga ccgagccagg gacgttctcc ctcatacgct 540

tct 543

<210> 4

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence for encoding linker

<400> 4

agatct 6

<210> 5

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence for encoding linker

<400> 5

ggatcc 6

<210> 6

<211> 1158

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence for encoding rhFGF21-(VPGXG)40 fusion protein

<400> 6

catcctattc ctgacagctc acccctgtta cagtttggcg gtcaggttcg tcaacgctat 60

ttatacaccg acgacgcaca gcaaaccgaa gcacacctgg aaattcgtga agacggcacc 120

gttggtggtg cagcagatca atccccggaa tctctgctgc agttaaaagc attaaaaccg 180

ggcgttatac agattttagg tgtcaaaacc tcccgttttc tgtgtcagcg gccggacggt 240

gcgctttatg gtagcttaca ctttgatccg gaagcctgta gttttcgtga gctgctgctg 300

gaggacggtt acaatgttta tcaatcagaa gcacatggtc tgccgttaca tctgccgggt 360

aataagagcc cgcatcgcga tccggcaccg cgtggtccag ccagatttct gcctctgccg 420

ggactgccgc cggcacttcc tgaaccgcct ggtattctgg caccgcagcc gcctgatgtt 480

ggttcatctg atcctctgtc aatggttgga ccgagccagg gacgttctcc ctcatacgct 540

tctagatctg ttccgggtgc aggtgttccg ggtgccggtg ttccgggggc aggtgttcct 600

ggtgcgggtg ttccgggcgc gggtgttcct ggagcgggtg ttccaggtgc gggtgtgccg 660

ggtgcgggtg tacctggtgt tggtgttccg ggagttggtg ttcctggggt tggtgttcca 720

ggggttggtg tgccgggggt tggtgtcccg ggtgttggtg tgcctggtgt tggggttccg 780

ggtgttgggg tgccgggtgt tggcgttccg ggtgtgggtg ttccgggtgt cggtgttccg 840

ggtgtaggtg gatctgttcc gggtgcaggt gttccgggtg ccggtgttcc gggggcaggt 900

gttcctggtg cgggtgttcc gggcgcgggt gttcctggag cgggtgttcc aggtgcgggt 960

gtgccgggtg cgggtgtacc tggtgttggt gttccgggag ttggtgttcc tggggttggt 1020

gttccagggg ttggtgtgcc gggggttggt gtcccgggtg ttggtgtgcc tggtgttggg 1080

gttccgggtg ttggggtgcc gggtgttggc gttccgggtg tgggtgttcc gggtgtcggt 1140

gttccgggtg taggttga 1158

<210> 7

<211> 303

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence for encoding (VPGXG)20

<400> 7

gttccgggtg caggtgttcc gggtgccggt gttccggggg caggtgttcc tggtgcgggt 60

gttccgggcg cgggtgttcc tggagcgggt gttccaggtg cgggtgtgcc gggtgcgggt 120

gtacctggtg ttggtgttcc gggagttggt gttcctgggg ttggtgttcc aggggttggt 180

gtgccggggg ttggtgtccc gggtgttggt gtgcctggtg ttggggttcc gggtgttggg 240

gtgccgggtg ttggcgttcc gggtgtgggt gttccgggtg tcggtgttcc gggtgtaggt 300

tga 303

<210> 8

<211> 559

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gene for encoding rhFGF21 with restriction site

<400> 8

ggtctcaggt catcctattc ctgacagctc acccctgtta cagtttggcg gtcaggttcg 60

tcaacgctat ttatacaccg acgacgcaca gcaaaccgaa gcacacctgg aaattcgtga 120

agacggcacc gttggtggtg cagcagatca atccccggaa tctctgctgc agttaaaagc 180

attaaaaccg ggcgttatac agattttagg tgtcaaaacc tcccgttttc tgtgtcagcg 240

gccggacggt gcgctttatg gtagcttaca ctttgatccg gaagcctgta gttttcgtga 300

gctgctgctg gaggacggtt acaatgttta tcaatcagaa gcacatggtc tgccgttaca 360

tctgccgggt aataagagcc cgcatcgcga tccggcaccg cgtggtccag ccagatttct 420

gcctctgccg ggactgccgc cggcacttcc tgaaccgcct ggtattctgg caccgcagcc 480

gcctgatgtt ggttcatctg atcctctgtc aatggttgga ccgagccagg gacgttctcc 540

ctcatacgct tctagatct 559

<210> 9

<211> 312

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gene for encoding linker-(VPGXG)20

<400> 9

agatctgttc cgggtgcagg tgttccgggt gccggtgttc cgggggcagg tgttcctggt 60

gcgggtgttc cgggcgcggg tgttcctgga gcgggtgttc caggtgcggg tgtgccgggt 120

gcgggtgtac ctggtgttgg tgttccggga gttggtgttc ctggggttgg tgttccaggg 180

gttggtgtgc cgggggttgg tgtcccgggt gttggtgtgc ctggtgttgg ggttccgggt 240

gttggggtgc cgggtgttgg cgttccgggt gtgggtgttc cgggtgtcgg tgttccgggt 300

gtaggtggat cc 312

<210> 10

<211> 10

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> restriction site of BsaI

<400> 10

ggtctcaggt 10

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer P1

<400> 11

ggtctcaggt catcctattc ctgacagct 29

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer P2

<400> 12

ggatccacct acacccggaa ca 22

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer P3

<400> 13

ggatcctcaa cctacacccg gaaca 25

Claims

1.一种重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括融合在一起的rhFGF21和(VPGXG)_n，所述rhFGF21包含以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列或与SEQ IDNO:1具有至少80％一致性的氨基酸序列；X为A和/或V；n为选自20-80中的整数。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，X为A和V，且A与V比例为(1-3):(1-3)、优选2:3；

优选地，n为40-60中的整数、优选40；

优选地，所述融合蛋白由融合在一起的rhFGF21和(VPGXG)_n以及任选的接头组成；更优选地，所述接头的氨基酸序列为RS和/或GS；

优选地，所述融合蛋白具有以SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性的氨基酸序列。

3.一种编码权利要求1或2所述的融合蛋白的多核苷酸；

优选地，编码所述融合蛋白中的rhFGF21的多核苷酸部分包含以SEQ ID NO:3示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性的核苷酸序列；

优选地，编码所述融合蛋白中的接头的多核苷酸部分包含以SEQ ID NO:4和/或SEQ IDNO:5示出的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5具有至少80％一致性的核苷酸序列；

优选地，所述多核苷酸包含以SEQ ID NO:6示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6具有至少80％一致性的核苷酸序列。

4.一种含有权利要求3所述的多核苷酸的重组表达载体；

优选地，所述重组表达载体为原核重组表达载体；

更优选地，所述重组表达载体为携带分子伴侣的原核重组表达载体；

进一步优选地，所述分子伴侣为小分子泛素样修饰蛋白；

或者进一步优选地，所述重组表达载体为重组的pSUMO载体或重组的PET系列载体。

5.一种含有权利要求4所述的重组表达载体或者在其基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸的重组细胞；

优选地，用于构建所述重组细胞的宿主细胞为原核宿主细胞；

更优选地，所述原核宿主细胞选自大肠杆菌、农杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、炭疽芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。

6.一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含权利要求1或2所述的融合蛋白；

优选地，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的辅料。

7.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的融合蛋白或者权利要求6所述的药物组合物；

优选地，所述试剂盒进一步包含pH 5.0-5.5的柠檬酸盐缓冲溶液；

优选地，所述试剂盒进一步包含精氨酸水溶液、优选50mmol/L-150mmol/L的精氨酸水溶液；

优选地，所述试剂盒进一步包含pH 5.0-5.5的精氨酸+柠檬酸盐缓冲溶液；

优选地，所述试剂盒进一步包含精氨酸水溶液和pH 5.0-5.5的柠檬酸盐缓冲溶液，并且，所述融合蛋白或所述药物组合物、所述pH 5.0-5.5的柠檬酸盐缓冲溶液、以及所述精氨酸水溶液包装在一起或者分别单独包装。

8.权利要求1或2所述的融合蛋白在制备用于预防或治疗与血糖代谢异常相关的疾病的药物中的用途；

优选地，所述与血糖代谢异常相关的疾病选自糖尿病及糖尿病相关代谢疾病，更优选地，所述糖尿病相关代谢疾病选自糖尿病肾病、血脂异常、肥胖症、心血管疾病、代谢综合征、脂代谢紊乱、非酒精性脂肪肝疾病或神经系统疾病。

9.一种产生权利要求1或2所述的融合蛋白的方法，其中，所述方法包括：对权利要求5所述的重组细胞进行培养，然后诱导所述重组细胞进行表达并对表达产物进行纯化，得到所述融合蛋白；

优选地，采用选自如下的诱导剂，诱导所述重组细胞进行表达：IPTG和/或乳糖；

优选地，所述表达产物的纯化包括如下步骤：(i)在诱导表达后，将所述重组细胞进行离心以收集菌体，将所述菌体进行破碎后离心收集上清；(ii)将所述上清进行离子交换层析，收集洗脱液；(iii)将所述洗脱液进行亲和层析，得到所述融合蛋白。

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述方法还包括如下步骤：

(3)将编码所述融合蛋白的多核苷酸与表达载体进行酶切和连接，得到重组表达载体，将所述重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到所述重组细胞；

优选地，在步骤(1)中，所述编码rhFGF21的多核苷酸序列包含以SEQ ID NO:3示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性的核苷酸序列；

优选地，在步骤(1)中，所述编码(VPGXG)₂₀的多核苷酸包含以SEQ ID NO:7示出的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少80％一致性的核苷酸序列；

优选地，在步骤(2)中，任选在所述编码(VPGXG)₂₀的多核苷酸的5′端和3′端分别连接有编码选自如下的接头的多核苷酸：RS和/或GS；

优选地，在步骤(2)中，利用BglII限制性内切酶与BamHI限制性内切酶进行所述酶切和连接；

优选地，在步骤(3)中，利用BsaI限制性内切酶与BamHI限制性内切酶进行所述酶切和连接；

优选地，在步骤(3)中，所述表达载体选自pSUMO载体和PET系列载体；

优选地，在步骤(3)中，所述表达载体为pSUMO载体，且所述宿主细胞为大肠杆菌Rossetta(DE3)。