DK173503B1 - Replicerbare plasmider, levedygtige kulturer af bakterielle transformatorer og fremgangsmåder til fremstilling af humant væ - Google Patents

Replicerbare plasmider, levedygtige kulturer af bakterielle transformatorer og fremgangsmåder til fremstilling af humant væ Download PDF

Info

Publication number
DK173503B1
DK173503B1 DK198100973A DK97381A DK173503B1 DK 173503 B1 DK173503 B1 DK 173503B1 DK 198100973 A DK198100973 A DK 198100973A DK 97381 A DK97381 A DK 97381A DK 173503 B1 DK173503 B1 DK 173503B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
polypeptide
plasmid
growth hormone
fragment
amino acid
Prior art date
Application number
DK198100973A
Other languages
English (en)
Other versions
DK97381A (da
Inventor
Herbert L Heyneker
David V Goeddel
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26733870&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DK173503(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of DK97381A publication Critical patent/DK97381A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK173503B1 publication Critical patent/DK173503B1/da

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • C07K14/61Growth hormones [GH] (Somatotropin)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62DNA sequences coding for fusion proteins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/01Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/50Fusion polypeptide containing protease site
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/70Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185Escherichia
    • C12R2001/19Escherichia coli
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01Peptide or protein sequence
    • Y10S930/12Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides

Description

DK 173503 B1
Opfindelsen angår replicerbare bakterielle plasmider, som i en transformant bakterie er i stand til at udtrykke et polypeptid omfattende humant væksthormon, og hvori det polypep-tidkodende gen kontrolleres af en ekspressionspromotor, hvilket plasmid kan fremstilles i overensstemmelse med en metode, ved hvilken 5 genet, der koder for polypeptidet, fremstilles ved (a) gennem revers transkription fra mRNA at fremstille et første genfragment til et andet ekspressionsprodukt end polypeptidet, hvilket fragment omfatter i det mindste én væsent- 10 lig del af kodningssekvensen for polypeptidet; (b) når det første fragment omfatter proteinkodende codoner til andre aminosyresekven-ser end de sekvenser, der indeholdes i polypeptidet, at eliminere disse, idet i det mindste en væsentlig del af kodningssekvensen bibeholdes, og det resulterende fragment ikke 15 desto mindre koder for et ekspressionsprodukt, som er forskelligt fra det nævnte polypeptid; idet produktet fra trin (a) eller, om nødvendigt, trin (b) er et fragment, der koder for færre end alle aminosyresekvenseme for det nævnte polypeptid; 20 (c) ved organisk syntese at tilvejebringe ét eller flere genfragmenter, der koder for resten af det nævnte polypeptids aminosyresekvens, idet mindst ét af de nævnte fragmenter koder for polypeptidets aminoterminaldel; og 25 (d) at anbringe det(de) syntetiske genfragment(er) fra trin (c) og det fragment, der er fremstillet på trin (a) eller (b), hvor det er relevant, i et replikabelt kloningsmedium i passende læseramme i forhold til hinanden, plasmidet pHGH107 (ATCC nr. 40011) og plasmidet pHGH107-1, som kan fremstilles ud 30 fra plasmid pHGH107 (ATCC nr. 40011) ved spaltning af pHGH107 med Eco RI, fordøjelse af de resulterende enkeltstrengsender med SI endonuclease og recirkulering ved blunt-end ligering med T4-ligase, 2 DK 173503 B1 levedygtige kulturer af bakterielle transformanter indeholdende plasmideme samt en fremgangsmåde til på i og for sig kendt måde at fremstille humant væksthormon, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man: 5 (a) anbringer en kultur ifølge opfindelsen i en fermenteringsbeholder, med iltning og omrystning i et vandigt, næringsholdigt fermenteringsmedium; (b) opdyrker kulturen under iltning og omrystning, idet der efter behov tilføres yderligere næringsstoffer til opretholdelse af kraftig vækst; 10 (c) adskiller den resulterende cellemasse fra fermenteringsmediet; (d) iyserer cellerne for at frigøre deres indhold; 15 (e) adskiller cellulært affald fra supernatant; og (f) isolerer og oprenser polypeptidet fra supematanten.
Den DNA (deoxyribonucleinsyre), hvoraf gener består, indeholder både protein-kodende 20 eller "strukturgener og kontrolområder, som formidler udtrykkeisen af deres information ved tilvejebringelse af centre for RNA-polymerase-binding, information for ribosom-bin-dingssteder o.s.v. Indkodet protein "udtrykkes" fra dets tilsvarende DNA ved en flertrins proces i en organisme, hvorved: 25 1. Enzymet RNA-polymerase aktiveres i kontrolområdet (i det følgende betegnet "promotoren") og bevæger sig langs strukturgenet, idet det transkriberer dets indkodede information til budbringer-ribonucleinsyre (mRNA), indtil transkriptionen afsluttes ved en eller flere "stop"-codoner.
30 2. mRNA-budskabet translateres ved ribosomeme til et protein, for hvis aminosyrese-kvens genet koder, begyndende ved et translations-"start"-signal, mest almindeligt ATG (som translateres "f-methionin").
I overensstemmelse med den genetiske kode specificerer DNA hver aminosyre ved en 35 triplet eller "codon" af tre nabostillede nucleotider individuelt udvalgt blandt adenosin, 3 DK 173503 B1 thymidin, cytidin og guanin eller, som anvendt i denne beskrivelse, A, T, C eller G. Disse forekommer i kodningsstrengen eller kodningssekvensen af dobbeltstrenget ("duplex'*) DNA, hvis anden eller "komplementære" streng er dannet af nucleotider ("baser"), som ved hydrogenbinding er forbundet med deres komplementer i kodningsstrengen. A er 5 komplement til T, og C er komplement til G. Disse og andre emner, som berører opfindelsens baggrund, er omtalt udførligt i Benjamin Lewin, Gene Expression 1, 2 (1974) and 3 (1977), John Wiley and Sons, N.Y.
DNA-spaltnina og -liaerinq 10
En varieret teknik står til rådighed for DNA-rekombination, ifølge hvilken tilstødende ender af separate DNA-fragmenter tilpasses på en eller anden måde til at lette ligering. Den sidstnævnte betegnelse henfører til dannelsen af phosphodiester-bindinger mellem tilstødende nucleotider, oftest ved indvirkning af enzymet T4-DNA-ligase. Således kan stumpe 15 ender ligeres direkte. Alternativt drages nytte af fragmenter indeholdende komplementære enkeltstrenge ved deres tilstødende ender ved hjælp af hydrogenbinding, som anbringer de respektive ender i stilling til efterfølgende ligering. Sådanne enkeltstrenge, betegnet som kohæsive ender, kan dannes ved tilsætning af nucleotider til stumpe ender under anvendelse af terminal transferase og sommetider simpelthen ved at tygge én streng af en 20 stump ende tilbage med et enzym, såsom λ-exonuclease. Igen, og mest almindeligt, kan man gribe til restriktions-endonucleaser (i det følgende betegnet "restriktionsenzymer"), som spalter phosphodiester-bindinger i og omkring specifikke sekvenser af nucleotider på omkring 4-6 basepar i længde ("genkendelsessekvenser"). Mange restriktionsenzymer og deres genkendelsessekvenser er kendte. Se f.eks. R. J. Roberts, CRC Critical Reviews in 25 Biochemistry, 123 (Nov. 1976). Mange foretager forskudte klip, som frembringer korte komplementære enkeltstrengede sekvenser ved enderne af duplex fragmenterne. Som komplementære sekvenser kan de udragende eller "kohæsive" ender rekombinere ved baseparring. Når to forskellige molekyler spaltes med dette enzym, frembringer krydsvis parring af de komplementære enkeltstrenge et nyt DNA-molekyle, som kan gives kovalent 30 integritet ved anvendelse af ligase til lukning af de enkeltstreng-brud, som bliver tilbage ved sammensmeltningspunktet. Restriktionsenzymer, som efterlader samtidigt endende eller "stumpe" ender på duplex-DNA, der er blevet spaltet, tillader rekombination via f.eks. T4-ligase med andre stumpende sekvenser.
4 DK 173503 B1
Kloningsmedier og rekombinant-DNA
Til de foreliggende formål er et "kloningsmedium" en ikkekromosomal længde af duplex-DNA omfattende et intakt replicon således, at mediet kan repliceres, når det anbringes in-5 den i en encellet organisme ("mikrobe") ved transformation. En således transformeret organisme kaldes en "transformant". For tiden er de kloningsmedier, som er i almindelig brug, afledt fra virus og bakterier og er mest almindeligt løkker af bakterie-DNA, kaldet "plasmider".
10 Fremskridt inden for biokemien i de seneste år har ført til konstruktionen af "rekombinant"-kloningsmedier, hvori f.eks. plasmider er bragt til at indeholde exogent DNA. I særlige tilfælde kan rekombinanten inkludere "heterolog" DNA, hvormed menes DNA, som koder for polypeptider, der almindeligvis ikke produceres af den organisme, som er modtagelig for transformation med rekombinantmediet. Således spaltes plasmider med restriktions-15 enzymer til dannelse af lineær DNA med ligerbare ender. Disse bindes til et exogent gen med ligerbare ender til dannelse af en biologisk funktionel del med et intakt replicon og en fænotypisk egenskab, som er nyttig ved udvælgelse af transformanter. Rekombinantdelen indsættes i en mikroorganisme ved transformation, og transformanten isoleres og klones med det formål at opnå store populationer, som inkluderer kopier af det exogene gen og i 20 særlige tilfælde med det yderligere formål at udtrykke det protein, for hvilket genet koder.
Den dermed forbundne teknologi og dens potentielle anvendelser er gennemgået in extenso i the Miles International Symposium Series 10: Recombinant Molecules: Impact on Science and Society, Beers and Bosseff, eds.. Raven Press, N.Y. (1977).
25 Rekom bina nt-DNA-udtrvkkelse
Bortset fra brugen af kloningsmedier til at forøge forsyningen af gener ved replikation er der gjort forsøg, hvoraf nogle har været heldige, på faktisk at udtrykke proteiner, for hvilket generne koder. I det første sådanne tilfælde blev et gen for hjernehormonet somato-30 statin under indflydelse af lac-promotoren udtrykt i Escherichia coli bakterier; K. Itakura et al, Science 198,1056 (1977). Senere blev A- og B-kæden af humant insulin udtrykt på den samme måde og kombineret til dannelse af hormonet; D.V. Goeddel et al., Proc.
Nat’l. Acad. Sci., USA 76, 106 (1979). I hvert tilfælde blev generne konstrueret i deres helhed ved syntese. I hvert tilfælde ville proteolytiske enzymer i cellen øjensynligt nedbry-35 de det ønskede produkt, hvilket nødvendiggjorde dets produktion i konjugeret form, d.v.s.
DK 173503 B1 5 i tandem med et andet protein, som beskyttede det ved kompartmentafisering, og som kunne fraspaltes ekstracellulært ti! opnåelse af det påtænkte produkt Dette arbejde er beskrevet i de følgende britiske offentliggørelsesskrifter fra ansøgeren til den foreliggende ansøgning: GB 2 007 675 A, GB 2 007 670 A, GB 2 007 676 A og GB 2 008 123 A.
5
Selvom fremgangsmåden med syntetisk gen har vist sig nyttig i de adskillige tilfælde, som hidtil er omtalt, opstår der virkelige vanskeligheder i tilfældet af langt større proteinprodukter, f.eks. væksthormon, interferon o.s.v., hvis gener er tilsvarende mere komplekse og mindre tilpassede til let syntese. Samtidig ville det være ønskeligt at udtrykke sådanne 10 produkter uden ledsagende protein, hvis nødvendige udtrykkelse kræver tildeling af ressourcer i organismen, som kunne udnyttes til konstruktion af det påtænkte produkt.
Andre arbejdere har forsøgt at udtrykke gener afledt ikke ved organisk syntese, men snarere omvendt transkription fra det tilsvarende mRNA renset fra væv. To problemer har 15 ledsaget dette forsøg. Til at begynde med kan revers-transkriptase stoppe transkriptionen fra mRNA kort før fuldførelsen af cDNA for hele den ønskede aminosyresekvens. Således opnåede f.eks. Villa-Komaroff et al. cDNA for rotte-proinsulin, som manglede codoner for de første tre aminosyrer af insulin-forstadiet; Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA 75, 3727 (1978).
Igen har omvendt transkription af mRNA for polypeptider, som udtrykkes i forstadieform, 20 givet cDNA for forstadieformen snarere end det bioaktive protein, som bliver resultatet, når ledersekvenser fjernes enzymatisk i en eukaryotisk celle. Hidtil har ingen bakteriecelle vist sig at have del i den evne således, at mRNA-transkripter har givet udtrykkelsespro-dukter indeholdende forstadieformens ledersekvenser snarere end selve det bioaktive protein. Endelig har tidligere forsøg af andre på bakterielt at udtrykke humane hormoner 25 (eller deres forstadier) ud fra mRNA-transkripter af og ti! kun ført til fremstillingen af konjugerede proteiner, som øjensynligt ikke kunne undergå ekstracellulær spaltning, f.eks. Vil-laKomaroff, ovenfor, (penicillinase-proinsulin); Seeburg, ovenfor (betalactamase-for-væksthormon).
30 Humant væksthormon
Humant væksthormon ("HGH") secerneres i den menneskelige hypofyse. Det består af 191 aminosyrer og er med sin molekylvægt på omkring 21 500 mere end tre gange så stort som insulin. Indtil den foreliggende opfindelse kunne humant væksthormon kun op-35 nås ved arbejdskrævende ekstraktion fra en begrænset kilde - hypofysekirtler fra menne- DK 173503 B1 6 skelig. Den deraf følgende knaphed på stoffet har begrænset dets anvendelser til behandling af hypofysær dværgvækst, og selv her antyder pålidelige bedømmelser, at humant afledt HGH ikke er til rådighed i tilstrækkelig mængde til at behandle mere end omkring 50% ramte individer.
5
Sammenfattende findes der et behov for nye fremgangsmåder til fremstilling af HGH og andre polypeptid-produkter i større mængde, og det behov har været særlig akut i tilfælde af polypeptider, som er for store til at tillade organisk syntese eller for den sags skyld mikrobiel udtrykkelse fra helt syntetiske gener. Udtrykkelse af pattedyrhormoner fra mRNA-10 transkripter har syntes lovende med hensyn til at omgå vanskeligheder, som ledsager den syntetiske fremgangsmåde, men hidtil har den kun tilladt mikrobiel produktion af bio-inaktive konjugater, ud fra hvilke det ønskede hormon ikke kunne fraspaltes i praksis.
Sammenfatning af opfindelsen 15
Den foreliggende opfindelse tilvejebringer plasmider som beskrevet i krav 1-12, levedygtige kulturer af bakterielle transformanter som beskrevet i krav 13 og fremgangsmåder til fremstilling af humant væksthormon som beskrevet i krav 14-21, dvs. fremgangsmåder og midler til udtrykkelse af kvasisyntetiske gener, hvorved revers transkription tilvejebringer 20 en væsentlig del, fortrinsvis hovedparten, af kodningssekvensen uden arbejdskrævende griben til helt syntetisk konstruktion, medens syntese af resten af kodningssekvensen giver et fuldstændigt gen, som er i stand til at udtrykke det ønskede polypeptid uden ledsagelse af bio-inaktiverende ledersekvenser eller andet fremmed protein. Alternativt kan den syntetiske rest give et proteolyse-resistent konjugat således indrettet, at det tillader eks-25 tra-cellulær fraspaltning af fremmed protein til opnåelse af den bio-aktive form. Opfindelsen stiller således fremgangsmåder og midler til rådighed for mikrobiel produktion af talrige materialer, som hidtil kun kunne produceres i begrænset mængde ved dyr ekstraktion fra væv, og andre endnu, som hidtil ikke kunne fremstilles industrielt. I dens mest foretrukne udførelsesform repræsenterer opfindelsen det første tilfælde, hvorved et medicinsk 30 vigtigt polypeptidhormon (humant væksthormon) er blevet udtrykt bakterielt under undgåelse af både intra-cellulær proteolyse og nødvendigheden af at kompartmentalisere den bioaktive form i fremmed protein, som kræver ekstra-cellulær spaltning.
Mikrobielle kilder til humant væksthormon, som er stillet ti! rådighed ved opfindelsen, til-35 byder for første gang rigelige forsyninger af hormonet til behandling af hypofysær dværg- DK 173503 B1 7 vækst sammen med andre anvendelser, som hidtil lå langt ud over kapaciteten for vævsafiedte hormonkilder, herunder diffus maveblødning, pseudarthrosis, brandsårsterapi, sårheling, dystrophi og bensammenknytning.
5 Den måde, hvorpå disse og andre formål og fordele ved opfindelsen kan opnås, fremgår mere fuldstændigt af den følgende detaljerede beskrivelse og af de ledsagende tegninger, som angår en foretrukken udførelsesform af opfindelsen, og på hvilke: figur 1 viser synteseskemaet for konstruktion af et genfragment, der koder for de første 24 10 aminosyrer i humant væksthormon sammen med startsignalet ATG og bindeled anvendt ved kloning. Pilene i kodningsstrengen eller den øvre streng ("U") og i den komplementære eller nedre streng ("L") angiver de oligonucleotider, der er sammenføjet til dannelse af det afbildede fragment; 15 figur 2 afbilder sammenføjningen af "U"- og "L"-oligonucleotider til dannelse af genfragmentet i figur 1 og dets indsætning i et plasmid-kloningsmedium; figur 3 belyser DNA-sekvensen (kun kodningsstrengen) af Hae III restriktionsenzym-fragmentet af en hypofysær mRNA-transkript med de nummererede aminosyrer fra humant 20 væksthormon, for hvilke de koder. Hoved-restriktionscentre er angivet ligesom DNA (efter ’‘stop") for utranslateret mRNA; figur 4 belyser konstruktionen af et kloningsmedium for et genfragment, der koder for de aminosyrer i humant væksthormon, som ikke er afledt syntetisk, og konstruktionen af det 25 genfragment som komplementær DNA ved revers transkription fra mRNA isoleret fra en human hypofysekilde; og figur 5 belyser konstruktionen af et plasmid, som er i stand til i bakterier at udtrykke humant væksthormon, begyndende med plasmiderne i figur 2 og 3.
30
Detaljeret beskrivelse af opfindelsen
Den almene fremgangsmåde ifølge opfindelsen indebærer kombinationen i et enkelt kloningsmedium af flere genfragmenter, som i kombination koder for udtrykkelse af det øn-35 skede produkt. Af disse er mindst ét et cDNA-fragment afledt ved revers transkription fra DK 173503 B1 8 mRNA isoleret fra væv, f.eks. ved den metode, som er beskrevet af A. Ullrich et al.,
Science 196. 1313 (1977). cDNA'en tilvejebringer en væsentlig portion, og fortrinsvis mindst en hovedpart, af codoneme for det ønskede produkt, medens resterende portioner af genet leveres syntetisk. De syntetiske fragmenter og mRNA-transkript-fragmenterne 5 klones separat for at tilvejebringe passende mængder til anvendelse i det senere kombinationstrin.
En lang række overvejelser influerer på fordelingen af codoner for slutproduktet mellem syntetisk og cDNA, først og fremmest DNA-sekvensen i den komplementære DNA be-10 stemt f.eks. ved den metode, som er beskrevet af Maxam and Gilbert, Proc. Nat'l Acad.
Sci. USA 74, 560 (1977). Komplementær DNA opnået ved revers transkription vil uvægerligt indeholde codoner for mindst en carboxy-terminal del af det ønskede produkt såvel som andre codoner for utranslateret mRNA neden for translations-stop-signalet eller -signalerne op til carboxy-enden. Tilstedeværelsen af DNA for utranslateret RNA er stort set 15 irrelevant, selvom ubekvemt lange sekvenser af den art kan fjernes, f.eks. ved spaltning med restriktionsenzym, for at bevare celleressourcer til anvendelse ved replicering og ud-trykkelse af DNA for det påtænkte produkt. I særlige tilfælde vil cDNA'en indeholde codoner for hele den ønskede aminosyre-sekvens såvel som fremmede codoner opad fra det påtænkte produkts amino-ende. F.eks. udtrykkes mange, om ikke alle, polypeptidhormo-20 ner i forstadieform med leder- eller signalsekvenser af protein involveret f.eks. i transport til cellemembranen. Ved udtrykkelse fra eukaryotiske celler fjernes disse sekvenser enzymatisk således, at hormonet træder ind i det periplasmatiske rum i dets frie. bio-aktive form. Imidlertid kan man ikke regne med, at mikrobielle celler udøver den funktion, og det er derfor ønskeligt at fjerne sekvenser, der koder for sådanne signaler eller ledersekven-25 ser fra mRNA-transkripten. I løbet af fjernelsesprocessen tabes translations-start-signalet også, og næsten uvægerligt vil også nogle codoner for det påtænkte produkt blive fjernet.
Den syntetiske komponent af det kvasisyntetiske genprodukt ifølge opfindelsen tilbagefører disse sidstnævnte codoner, og leverer ligeledes påny et translations-startsignal, hvor det medium, hvori hybridgenet til sidst vil blive anbragt, selv mangler en passende an-30 bragt start.
Eliminering af ledersekvensen fra forvæksthormon-cDNA nyder fordel af forekomsten af et restriktionssite i den væksthormon-kodende portion af genet. Opfindelsen kan ikke desto mindre praktiseres uden hensyn til forekomsten af et sådant center eller i hvert fald 35 uden hensyn til forekomsten af et restriktionscenter tilstrækkeligt nær ved amino-enden af DK 173503 B1 9 det ønskede polypeptid til at undgå behovet for udstrakt syntese af den genkomponent, som ikke er afledt fra mRNA. I enhver cDNA, der koder for det ønskede polypeptid og en ledersekvens eller en anden bio-inaktiverende sekvens, vil således grænsen mellem den sidstnævntes codoner og codonerne af det færdige polypeptid fremgå af aminosyre-se-5 kvensen i det færdige polypeptid. Man kan simpelthen spise sig ind i genet, der koder fra det udvalgte peptid, idet man fjerner den uønskede ledersekvens eller anden sekvens.
F.eks. i en given cDNA, såsom:
s· H-pH
TTAAGCCCTGATCGT ...
etc.
' AATTCGGGACTAGCA ...
5' l-4-a-.l hvor nedbrydningsendepunktet er vist ved pile, kan reaktionsbetingelserne for exonuclea-10 se-nedbrydning udvælges til at fjerne de øvre sekvenser "a" og "bH. hvorefter S1-nuclea-se-nedbrydning automatisk vil fjerne de nedre sekvenser "c" og "d". Alternativt og mere præcist kan man anvende DNA-polymerase-nedbrydning i nærvær af desoxynucleotid-triphosphater ("diA.T.C.GjTP"). I det ovenstående eksempel vil således DNA-polymerase i nærvær af dGTP fjerne sekvens "c" (derpå stoppe ved "G"), S1-nuclease vil derpå ned-15 bryde "a"; DNA-polymerase i nærvær af dTTP vil fjerne "d" (derpå stoppe ved T"), og S1-nuclease vil derefter afskære "b" o.s.v.; Se alment A. Kornberg, DNA Synthesis, side 87-88, W.H. Freeman and Co., San Francisco (1974).
Mere foretrukkent kan man simpelthen konstruere et restriktionscenter ved et hensigts-20 mæssigt punkt i den portion af cDNA’en, der koder for det ønskede produkt, ved en anvendelse af den utilpasnings-reparations-synteseteknik, som er beskrevet af A. Razin et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 75,4268 (1978). Ved denne teknik kan én eller flere baser udskiftes i en eksisterende DNA-sekvens under anvendelse af primere Indeholdende den utilpassede substitut. Mindst 7 palindromiske 4-baseparsekvenser genkendes på enestå-25 ende måde af kendte restriktionsenzymer, nemlig AGCT (A!u I), CCGG (Hpa II), CGCG (Tha 1), GATC (Sau 3A), GCGC (Hha), GGCC (Hae III) og TCGA (Tag I). Hvor cDNA-se-kvensen indeholder en sekvens, der adskiller sig fra et sådant center i en enkelt base, hvilket statistisk er højst sandsynligt, vil reparations-syntese give replikat-cDNA indehol- DK 173503 B1 10 dende den rette substituent-base og derfor det ønskede restriktionscenter. Spaltning vil befri DNA for den uønskede ledersekvens, hvorefter syntese vil erstatte codoner, der kræves til udtrykkelse af det fuldstændige polypeptid; f.eks.: , ( codoner for
r ‘leder -W- ønsket produkt-H
«-a-*j
I cDNA
I—-------------CAGG-1 \ * utilpasnings-^eparations-syntese )———---— CCGG-j-1
Hpall syntetisk "a" GG ——-1 ' kvasi- syntetisk
i , DNA
codoner for ønsket i ΰ ^-produkt -
Det vil selvfølgelig indses. at længere restriktionscentre ligeledes kan indsættes, hvor det ønskes, eller at successive reparationer kan skabe 4-basepar-restriktionscentre, hvor kun to baser fælles for centret forekommer ved det ønskede punkt, o.s.v.
10
Anvendelser vil forekomme, hvorved det er ønskeligt at udtrykke ikke kun det påtænkte produkts aminosyre-sekvens, men også et mål af fremmed, men specifikt indrettet protein. 4 sådanne anvendelser kan nævnes som eksempel. Først kan det kvasisyntetiske gen repræsentere et hapten eller en anden immunologisk determinant, på hvilken immuno-15 genicitet indføres ved konjugation til yderligere protein således, at der fremstilles vacciner.
Se alment GB patentskrift nr. 2 008 123A. Ligeledes kan det være ønskeligt af biologiske sikkerhedsgrunde at udtrykke det påtænkte produkt som et konjugat med andet bio-inak-tiverende protein således udformet, at det tillader ekstra-cellulær spaltning til opnåelse af den aktive form. For det tredie vil der blive præsenteret anvendelser, hvori transportsig-20 nal-polypeptider vil komme før det ønskede produkt for at tillade produktion af dette ved udskillelse igennem cellemembranen, blot signal-peptidet derpå kan fraspaltes. Endelig kan fremmed konjugat, udformet til at tillade specifik spaltning ekstracellulært, anvendes til at kompartmentlisere de påtænkte produkter, som ellers er modtagelige for nedbrydning fra endogene proteaser hos den mikrobielle vært. I det mindste i de sidstnævnte tre 25 anvendelser kan det syntetiske adaptormolekyle, som anvendes til at fuldende kodnings- DK 173503 B1 11 sekvensen af mRNA-transkripten, yderligere inkorporere codoner for aminosyre-sekven-ser, som er specifikt fraspaltelige f.eks. ved enzymatisk virkning. F.eks. vil trypsin eller chymotrypsin spalte specifikt ved arg-arg eller lys-lys o.s.v.; se GB patentskrift nr. 2 008 123A, ovenfor.
5
Af det foregående vil det ses, at opfindelsen i sin bredeste forstand tillader mangfoldige anvendelser, som hver har disse kendetegn til fælles: - Der anvendes en mRNA-transkript, som koder for en væsentlig portion af det påtænkte 10 polypeptids aminosyresekvens, men som, hvis den udtrykkes alene, ville producere et andet polypeptid, enten mindre eller større end det påtænkte produkt; - protein-kodende codoner for andre aminosyre-sekvenser end de, der indeholdes i det påtænkte produkt, fjernes, hvis de forekommer; 15 - organisk syntese giver ét eller flere fragmenter, som koder for resten af den ønskede sekvens; og - mRNA-transkripten og det eller de syntetiske fragmenter kombineres og anbringes i et 20 promotor-holdigt kloningsmedium til replikation og udtrykkelse af enten det påtænkte produkt uden fremmed konjugeret protein eller det påtænkte produkt konjugeret til, men specifikt fraspalteligt fra fremmed protein.
Selvfølgelig vil udtrykkelsesproduktet i ethvert tilfælde begynde med den aminosyre, som 25 der kodes for af translations-start-signalet (i tilfælde af ATG, f-methionin). Man kan forvente, at denne fjernes intra-cellulært eller i hvert fald, at den lader slutproduktets bio-aktivitet i hovedsagen upåvirket.
Selvom den tilvejebringer en fremgangsmåde af almen anvendelighed til fremstilling af 30 nyttige proteiner, herunder antistoffer, enzymer og lignende, er opfindelsen særligt egnet til udtrykkelse af pattedyr-polypeptidhormoner og andre stoffer med medicinske anvendelser, f.eks. glucagon, gastrointestinalt inhiberende polypeptid, pancreatisk polypeptid, ad-renocorticotropin, beta-endorphiner, interferon, urokinase, blodkoaguleringsfaktorer, humant albumin o.s.v. En foretrukken udførelsesform, som er belysende for opfindelsen, DK 173503 B1 12 omtales i det følgende, hvor et kvasisyntetisk gen, der koder for humant væksthormon, konstrueres, klones og udtrykkes mikrobielt.
Konstruktion og udtrvkkelse af et kloninqsmedium for humant væksthormon 5 1. Kloning af Hae III fragmentet af mRNA-transkripten ffigur 3 og 4)
Polyadenyleret mRNA for humant væksthormon (HGH) blev fremstillet ud fra HGH-produ-cerende tumorer ved den procedure, som er beskrevet af A. Ullrich et al., Science 196.
10 1313 (1977). 1,5 pg dobbeltstrenget ("ds") cDNA blev fremstillet ud fra 5 pg af denne RNA, hovedsageligt som beskrevet af Wickens et al., J. Biol Chem. 253, 2483 (1978), undtagen at RNA-polymerase-"Klenow fragment", H. Klenow, Proc. Nat'l. Aci. USA 65, 168 (1970), blev anvendt i stedet for DNA-polymerase I ved syntesen af den anden streng. Restriktionsmønstret af HGH er sådan, at Hae lil restriktionscentre er til stede i 3-15 ikke-kodningsregionen og i den sekvens, der koder for aminosyreme 23 og 24 i HGH, som vist i figur 3. Behandling af ds-HGH-cDNA med Hae III giver et DNA-fragment på 551 basepar ("bp"), der koder for aminosyreme 24-191 i HGH. Således blev 90 ng af cDNA'en behandlet med Hae 111, underkastet elektrophorese på en 8% polyacrylamidgel, og området ved 550 bp elueret. Der blev opnået tilnærmelsesvis 1 ng cDNA.
20 pBR322, fremstillet som beskrevet i F. Bolivar et al., Gene 2 (1977), 95-113, blev udvalgt som kloningsmediet for cDNA'en. pBR322 er blevet fuldstændig karakteriseret, J.G.
Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium 43, 70 (1978), og er et multikopi-replicerende plasmid, som udøver både ampicillin og tetracyclin-resistens på grund af dets inkludering 25 af de tilsvarende gener (henholdsvis "ApR" og "TcR" i figur 4), og det indeholder genkendelsescentre for restriktionsenzymerne Pst I, EcoRl og Hind 111 som vist i figuren.
Spaltningsprodukter af både Hae III og Pst l er stumpendede. Som følge heraf kunne GC-halepåsætningsmetoden beskrevet af Chang, A.C.Y. et al., Nature 275. 617 (1978), an-30 vendes til at kombinere de stumpendede produkter fra Pst I spaltning af pBR322 og fra Hae II! nedbrydning af mRNA-transkripten, idet man indsatte cDNA-fragmentet i Pst I centret af pBR322 på en sådan måde, at man genskabte Hae III restriktionscentrene (GG iCC) på cDNA'en, medens man genskabte Pst I restriktionscentrene (CTGCA lG) ved hver ende af det indskudte fragment.
35 DK 173503 B1 13 Således anvendtes terminal-desoxynucleotidyl-transferase (TdT) til at tilføje omkring 20 dC-rester pr. 3’-ende som beskrevet tidligere, Chang, A.Y.C., ovenfor. 60 ng Pst l-be-handlet pBR322 blev på lignende måde påsat en hale af omkring 10 dG-rester pr. 3’-ende. Sammensmeltning af den dC-halede ds-cDNA med den dG-halede vektor-DNA 5 blev gennemført i 130 pi 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 100 mM NaCI, 0,25 mM EDTA. Blandingen blev opvarmet til 70°C, fik lov at afkøles langsomt til 37°C (12 timer) og derpå til 20°C (6 timer), før den blev anvendt til at transformere E. coli x1776. DNA-sekvensanaly-se af plasmidet pHGH3l klonet i x1776 ved den metode, som er beskrevet af Maxam and Gilbert, Proc. Nat’l, Acad. Sci. USA 74, 560 (1977) resulterede i bekræftelse af codonerne 10 for aminosyrerne 24-191 fra HGH, som vist i figur 3.
E. coli K-12 stamme x1776 har genotypen FtonA53 dapD8 min-A1 supE42A40[gal-uvrB]Å"minB2 rfb-2 nalA25 oms-2 thyA57x metC65 oms-1 A29[bioH-asd] cycB2 cycA1 hsdR2. x1776 er blevet attesteret af the National Institutes of Health som et EK2 væri-15 vektorsystem.
x1776 har et obligat krav om diaminopimelinsyre (DAP) og kan ikke syntetisere muco-polysaccharidet colansyre. Den dør således af mangel på DAP i alle omgivelser, hvor DAP er begrænsende, men der forekommer tilstrækkelige næringsstoffertil at understøtte 20 cellemetabolisme og vækst. Den kræver thymin eller thymidin og dør af mangel på thymin med nedbrydning af DNA, når thymin og thymidin mangler i omgivelserne, men der er tilstrækkelige næringsstoffer til stede til at understøtte metabolisk aktivitet. x1776 er yderst følsom for galde og er således ude af stand til at overleve passage igennem tarmkanalen hos rotter. x1776 er yderst følsom for detergenser, antibiotica, lægemidler og kemikalier.
25 x1776 er ude af stand til at udføre såvel mørk som photoreparation af UV-frembragt beskadigelse og er således flere størrelsesordener mere følsom for sollys end vildype-stam-mer af E. coli. x1776 er resistent over for mange transducerende phager og er konjugati-onsdeficient for nedarvning af mange forskellige typer af konjugative plasmider på grund af tilstedeværelsen af forskellige mutationer. x1776 er resistent over for nalidixinsyre, cy-30 closerin og trimethoprim. Disse midler kan derfor sættes til medier for at muliggøre kontrol med stammen og udelukke transformation af kontaminanter under transformationen.
x1776 vokser med en generationstid på omkring 50 minutter i enten L-væske eller Pen-assay-væske, når den suppleres med 100 pg DAP/ml og 4 pg thymidinfml, og når slut-35 tætheder på 8 -10 x 108 celler/ml ved stationær fase. Svag omrøring ved omrystning eller DK 173503 B1 14 rystning frem og tilbage i et tidsrum på 1-2 minutter suspenderer cellerne tilstrækkeligt under opretholdelse af 100% levedygtighed. Yderligere detaljer vedrørende x1776 forekommer i R. Curtis et al., Molecular Cloning of Recombinant DNA, 99-177, Scott and Werner, eds., Academic Press (N.Y.1977). x1776 er blevet deponeret i the American 5 Type Culture Collection (3. juli 1979: ATCC accessionsnr. 31537) uden begrænsning.
2. Konstruktion og kloning af det syntetiske qenfraqment (fig. 1 og 2)
Strategien for konstruktion af det kvasi-syntetiske HGH-gen inkluderede konstruktion af et 10 syntetisk fragment omfattende et stump-endet restriktionsspaltningssite nær ved det punkt, hvorved fragmentet skulle sammenføjes med mRNA-transkripten. Således indeholdt det syntetiske gen for de første 24 aminosyrer af HGH, som vist i fig. 1, et Hae III spaltningssite efter aminosyre 23. Det syntetiske fragments yderste ende blev forsynet med en linker, som tillod sammensmeltning med en enkeltstrenget ende resulterende fra 15 restriktionsspaltning i plasmidet, hvori mRNA-transkripten og det syntetiske fragment til sidst skulle indføjes.
Som vist i fig. 1 har 5'-enderne af duplex-fragmentet enkeltstrengede kohæsive ender for Eco RI og Hind III restriktionsendonucleaseme for at lette plasmidkonstruktionen. Methi-20 onincodonen ved den venstre ende giver et center for start af translation. Tolv forskellige oligonucleotider varierende i størrelse fra undecamer til hexadecamer blev syntetiseret ved den forbedrede phosphotriester-metode beskrevet af Crea, R., Proc. Nat'l. Acad. Sci.
USA 75, 5765 (1978). Disse oligonucleotider, Ui - U6 og U - U, er angivet ved pile.
25 Mængder på 10 pg af U2 * U6 og L2 - L6 blev phosphoryleret under anvendelse af T4-poly-nucleotidkinase og (y32-P)ATP ved en publiceret procedure; Goeddel, D. V. et al., Proc.
Nat’l. Acad. Sci. USA 76, 106 (1979).
Der gennemførtes tre separate T4-ligase-katalyserede reaktionen 10 pg af 5-OH-frag-30 ment Ui blev kombineret med de phosphorylerede U2, L5 og L^; phosphoryleret U3l U4, L3 og U blev kombineret; og 10 pg af S'-OH-fragmentet Li blev kombineret med de phosphorylerede L2, U5 og Ue. Disse ligeringer blev udført ved 4°C i 6 timer i 300 pi 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM MgCI2, 10 mM dithiothreitol, 0,5 mM ATP under anvendelse af 100 enheder T4-ligase. De tre ligeringsblandinger blev derpå kombineret, der tilsattes 100 en-35 heder T4-ligase, og reaktionen fik lov at foregå i 12 timer ved 20°C. Blandingen blev fæl- DK 173503 B1 15 det med ethanol og underkastet elektrophorese på en 10% polyacrylamidgel. Båndet, der vandrede ved 84 basepar, blev udskåret fra gelen og elueret. pBR322 (1 pg) blev behandlet med Eco RI og Hind III, det store fragment isoleret ved gel-elektrophorese og ligeret til det syntetiske DNA. Denne blanding blev anvendt til at transformere E. coli K-12 5 stamme 294 (end A, thi", hsr", hsmk+). Stamme 294 blev deponeret den 30. oktober 1978 i the American Type Culture Collection (ATCC nr. 31446), uden begrænsning. Sekvensanalyse ved Maxam og Gilbert-teknikken, ovenfor, på Eco Ri - Hind III indskuddet fra et plasmid pHGH3 af én transformant bekræftede det, der er afbildet i fig. 1.
10 3. Konstruktion af olasmid til den bakterielle udtrvkkelse af HGH (fig. 5)
Med det syntetiske fragment i pHGH3 og mRNA-transkripten i pHGH31 blev der konstrueret et replicerbart plasmid indeholdende begge fragmenter under anvendelse af udtrykkel-sesplasmidet pGH6, som vist i fig. 5. Udtrykkelsesplasmidet, som indeholder tandem-lac-15 promotorer, blev først konstrueret som følger. Et Eco RI fragment på 285 basepar indeholdende to UV5-lac-promotor-fragmenter på 95 basepar adskilt af et heterologt DNA-fragment på 95 basepar blev isoleret fra plasmid pKB268, K. Backman et al., Cell, Vol. 13, 65-71 (1978). Fragmentet på 285 basepar blev indskudt i Eco RI centret af pBR322, og en klon pGH1 isoleret med promotorerne orienteret hen imod og i rigtig aflæsningsfase 20 med genet for tetracyclinresistens. Eco RI centret distalt til det sidstnævnte gen blev ødelagt ved delvis Eco RI nedbrydning, reparation af de resulterende enkeltstrengede Eco RI ender med DNA-polymerase I og genringslutning af plasmidet ved stump-ende-ligering. Det resulterende plasmid, pGH6, indeholder et enkelt Eco RI center rigtigt anbragt i forhold til promotor-systemet, hvori det fuldførte gen for HGH kunne indskydes.
25
For at gøre det syntetiske fragment parat til kombinering med RNA-transkripten blev 10 pg pHGH3 spaltet med Eco RI og Hae III restriktionsendonucleaser, og fragmentet på 77 basepar indeholdende kodningssekvenser for HGH-aminosyrerne 1-23 blev isoleret fra en 8% polyacrylamidgel.
30
Plasmidet pHGH31 (5 pg) blev dernæst spaltet med Hae III. HGH-sekvensen på 551 basepar og et sammen dermed vandrende Hae III fragment af pBR322 på 540 basepar blev renset ved gelelektrophorese. Efterfølgende behandling med Xma I spaltede kun HGH-sekvensen, idet den fjernede 39 basepar fra 3’-ikke-kodningsområdet. Det resulterende 35 fragment på 512 basepar blev adskilt fra pBR322 Hae III stykket på 540 basepar ved DK 173503 B1 16 elektrophorese på en 6% polyacrylamidgel. 0.3 pg af Eco RI - Hae III fragmentet på 77 basepar blev polymeriseret med T4-ligase i en 16 pi reaktion i 14 timer ved 4°C. Blandingen blev opvarmet til 70°C i 5 minutter for at inaktivere ligasen og derpå behandlet med Eco RI (for at spalte fragmenter, som var dimeriseret via deres Eco RI centre) og med 5 Sma I (for at spalte Xma I dimere), hvilket gav et fragment på 591 basepar med en Eco RI "kohæsiv" ende og en Sma I "stump" ende. Efter rensning på en 6% polyacrylamidgel blev der opnået tilnærmelsesvis 30 ng af dette fragment. Det skal bemærkes, at udtryk-kelsesplasmidet pGH6 ikke indeholder noget Xma I genkendelsescenter. Imidlertid genkender Sma I det samme center som Xma I, men klipper igennem midten af det og giver 10 stumpe ender. Den Sma-spaltede ende af fragmentet afledt fra pHGH31 kan som følge heraf stumpende-tigeres til pGH6.
Udtrykkelsesplasmidet pGH6, indeholdende tandem-lac-UV5-promotorer, blev behandlet successivt med Hind 111, nuclease-S1 og Eco RI og renset ved gelelektrophorese. 50 ng af 15 den resulterende vektor, som havde én Eco RI kohæsiv ende og én stump ende, blev ligeret til 10 ng af HGH-DNA’en på 591 basepar. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli x1776. Kolonier blev udvalgt til vækst på tetracyclin (12,5 pg/ml). Det er værd at bemærke, at indsætningen af HGH-hybridgenet i pGH6 ødelægger promotoren for tetracyclinresistensgenet, men at tandem-lac-promotoren tillader gennemlæsning af 20 strukturgenet for tet-modstandsdygtighed under bevarelse af denne selektionsegenskab.
Der blev opnået omkring 400 transformanter. Filterhybridisering ved Grunstein-Hogness-proceduren, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 72, 3961 (1975) identificerede 12 kolonier indeholdende HGH-sekvenser. Plasmiderne isoleret fra tre af disse kolonier gav de forventede restriktionsmønstre, når de blev spaltet med Hae III, Pvu II og Pst I. DNA-sekvensen af én 25 klon, pHGH107, blev bestemt.
Humant væksthormon udtrykt af transformanterne blev detekteret ved direkte radioimmu-noprøvning gennemført på rækkefortyndinger af supernatanter fra lyserede celler under anvendelse af Phadebas HGH PRIST sættet (Farmacia).
30
For at påvise, at HGH-udtrykkelsen er under kontrol af lac-promotoren, blev pHGH107 transformeret ind i E. coli stamme D1210enlac+(iQ0+zly+), en lac-repressor-overprodu-cent. Meningsfulde niveauer af HGH-udtrykkelse kunne ikke detekteres indtil tilsætning af induceren IPTG (isopropylthiogalactosid).
35 DK 173503 B1 17
Fjernelse af Eco RI centret i pGH107 ville efterlade ATG-startsignalet i samme afstand fra lac-promotorens ribosom-bindingscenter-codoner som forekommer i naturen mellem disse codoner og startsignalet for β-galactosidase. For at bestemme om udtrykkeisen ville blive forøget ved efterligning af denne naturlige afstand, omdannedes pGH107 til 5 pGH107-1 ved åbning af det førstnævnte med Eco RI, nedbrydning af de resulterende enkeltstrengsender med S1-endonuclease og genringslutning ved stump-ende-ligering med T4-ligase. Selv om det resulterende plasmid viste sig ligeledes at være i stand til at udtrykke HGH, gjorde det overraskende dette i mindre grad end pGH107, som vist ved direkte radioimmunoprøvning.
10
Det vil være klart for fagfolk, at den foreliggende opfindelse ikke er begrænset til den netop omtalte foretrukne udførelsesfomn, men omfatter alt hvad der indgår i de efterfølgende krav. Andre variationer end de hidtil omtalte vil være indlysende, hvad enten det drejer sig om valget af promotorsystem, moder-plasmid, det påtænkte polypeptidprodukt 15 eller andet. F.eks. inkluderer andre promotorsystemer, som er anvendelige til udøvelse af opfindelsen, lambda-promotoren, arabinoseoperonet (phi 80 d ara) eller colicin-EI-, galactose-, alkalisk-phosphatase- eller tryptophan-promotorsystememe. Værtorganismer for bakteriel udtrykkelse kan f.eks. udvælges blandt Enterobacteriaceae, såsom stammer af Escherichia coli og Salmonella; Bacillaceae, såsom Bacillus subtilis; Pneumococcus; 20 Streptococcus; og Haemophilus influenzae. Selvfølgelig vil valget af organisme bestemme de niveauer af fysisk indeslutning ved kloning og udtrykkelse, som skal praktiseres for at være i overensstemmelse med National Institutes of Health Guidelines for Recombinant DNA, 43 Fed. Reg. 60,080 (1978).
25 Selv om den foretrækkes til udøvelse af opfindelsen i laboratoriemålestok, kunne E. coli x1776 vise sig at være af begrænset praktisk anvendelighed ved industriel fremstilling i stor målestok på grund af de debilitationer, som med forsæt er inkorporeret i den af biologiske sikkerhedsgrunde. Med passende niveauer af fysisk, frem for biologisk, indeslutning kunne sådanne organismer som E. coli K-12 stamme 294, ovenfor, og E. coli stamme 30 RR1. genotype: Pro'LeuThrRB"recA+StiJ Lac y" anvendes til arbejde i større målestok. E. coli RR1 er afledt fra E. coli HB101 (H.W. Boyer et al, J. Mol. Bio. (1969) 41 459-472) ved parring med E. coli K12 stamme KL16 som Hfr-donor; se J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). En kultur af E. coli RR1 blev deponeret d. 30. oktober 1978 i the American Type Culture Collection, uden begrænsning 35 med hensyn til adgang (ATCC nr. 31343). En kultur af x1776 blev på lignende måde de- DK 173503 B1 18 poneret d. 3. juli 1979 i the American Type Culture Collection (ATCC nr. 31537). Deponeringer af de følgende blev foretaget i the American Type Culture Collection d. 3. juli 1979: plasmid pHGH107 (ATCC nr. 40011); plasmid pGH6 (ATCC nr. 40012); stamme x1776 transformeret med pHGH 107 (ATCC nr. 31538) og E. coli K12 stamme 294 transformeret 5 med pGH6 (ATCC nr. 31539).
Organismer indeholdende plasmider ifølge opfindelsen kan anvendes ved fermentativ produktion af humant væksthormon i industriel målestok og giver produktet i mængder og til anvendelser, som hidtil var uopnåelige. F.eks. kan transformant-E. coli-kulturer opdyr-10 kes i en stålbeholder eller anden gæringsbeholder, som er hensigtsmæssigt luftet og omrørt, i vandige medier ved f.eks, ca. 37°C og nær ved neutral pH-værdi (f.eks. pH 7+0,3) forsynet med passende næringsstoffer, såsom carbonhydrat eller glycerol, nitrogenkilder, såsom ammoniumsulfat, kaliumkilder, såsom kaliumphosphat, sporelementer, magnesiumsulfat og lignende. Transformantorganismer udviser fortrinsvis en eller flere selekti-15 onsegenskaber, såsom modstandsevne over for antibioticum, således at der kan påføres et selektionstryk for at hindre konkurrencevækst af vildype-E. coli. Som et eksempel kan der i tilfælde af en ampicillin- eller tetracyclin-resistent organisme sættes det pågældende antibioticum til gæringsmediet for at udselektere vildype-organismer, som mangler resistensegenskaben.
20
Efter fuldførelse af forgæringen centrifugeres bakteriesuspensionen, eller cellematerialet opsamles på anden måde fra væsken og lyseres derpå ved fysiske eller kemiske midler. Cellerester fjernes fra overvæsken, og opløseligt væksthormon isoleres og renses.
25 Humant væksthormon kan renses fra bakterieekstrakter under anvendelse af én eller en kombination af følgende procedurer: (1) polyethylenimin-fraktionering; (2) gelfiltrerings-chromatografi på "Sephacryl® S-200”; (3) ionbytterchromatografi på "Biroex-70"-harpiks eller "CM Sephadex"®; (4) ammoniumsulfat- og/eller pH-fraktionering og (5) affinitets-chromatografi under anvendelse af antistofharpikser fremstillet ud fra anti-HGH-lgG isole-30 ret fra immunosensitiverede dyr eller hybridomer; og desorberes under sure eller svagt denaturerende betingelser.

Claims (21)

1. Replicerbart bakterielt plasmid, kendetegnet ved, at det er i stand til i en transformant bakterie at udtrykke et poly-5 peptid omfattende humant væksthormon, og hvori det polypeptidkodende gen kontrolleres af en ekspressionspromotor, hvilket plasmid kan fremstilles i overensstemmelse med en metode, ved hvilken genet, der koder for polypeptidet, fremstilles ved 10 (a) gennem revers transkription fra mRNA at fremstille et første genfragment til et andet ekspressionsprodukt end polypeptidet, hvilket fragment omfatter i det mindste én væsentlig del af kodningssekvensen for polypeptidet; 15 (b) når det første fragment omfatter proteinkodende codoner til andre aminosyresekven-ser end de sekvenser, der indeholdes i polypeptidet, at eliminere disse, idet i det mindste en væsentlig del af kodningssekvensen bibeholdes, og det resulterende fragment ikke desto mindre koder for et ekspressionsprodukt, som er forskelligt fra det nævnte polypep-tid; idet produktet fra trin (a) eller, om nødvendigt, trin (b) er et fragment, der koder for færre end alle aminosyresekvenseme for det nævnte polypeptid; (c) ved organisk syntese at tilvejebringe ét eller flere genfragmenter, der koder for resten 25 af det nævnte polypeptids aminosyresekvens, idet mindst ét af de nævnte fragmenter koder for polypeptidets aminoterminaldel; og (d) at anbringe det(de) syntetiske genfragment(er) fra trin (c) og det fragment, der er fremstillet på trin (a) eller (b), hvor det er relevant, i et replikabelt kloningsmedium i pas- 30 sende læseramme i forhold til hinanden.
2. Replicerbart bakterielt plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er i stand til i en transformant bakterie at udtrykke humant væksthormon uden ledsagelse af fremmed konjugeret protein. 35 DK 173503 B1 20
3. Replicerbart bakterielt plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er i stand til i en transformant bakterie at udtrykke humant væksthormon ledsaget af fremmed konjugeret protein i form af en N-terminal specifikt spaltelig aminosyresekvens. 5
4. Plasmid ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, i hvilket genet for humant væksthormon er under kontrol af tandem lac-promotorer.
5. Plasmid ifølge krav 2, 10 kendetegnet ved, at dets humant væksthormon-kodende DNA i en væsentlig andel omfatter cDNA eller en replikation deraf.
6. Plasmid ifølge krav 3 eller 5, kendetegnet ved, at det udviser resistens overfor mindst ét antibiotikum. 15
7. Plasmid ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det mangler tetpromotoren, men alligevel udviser resistens overfor tetracyclin.
8. Plasmid pHGH107 (ATCC nr. 40011).
9. Plasmid pHGH107-1, kendetegnet ved, at det kan fremstilles ud fra plasmid pHGH107 (ATCC nr. 40011) ved spaltning af pHGH107 med Eco RI, fordøjelse af de resulterende enkeltstrengsender 25 med SI endonuclease og recirkulering ved blunt-end ligering med T4-ligase.
10. Replicerbart bakterielt plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er i stand til i transformant E. coli at udtrykke den DNA-se-kvens, som koder for den aminosyresekvens af humant væksthormon, som i det væsent-30 lige består af aminosyrerne 1 til 191 i Fig. 1 og Fig. 3 i kombination.
11. Replicerbart bakterielt plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er i stand til i transformant E. coli at udtrykke den DNA-se-kvens, som koder for et polypeptid, som omfatter en N-terminal specifikt spaltelig amino-35 syresekvens. DK 173503 B1 21
12. Replicerbart bakterielt plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det udviser to eller flere af de kendetegn, som er angivet i krav 5-7 eller krav 10. 5
13. Levedygtig kultur af bakterielle transformanter, kendetegnet ved, at den indeholder plasmider ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12.
14. Fremgangsmåde til på i og for sig kendt måde at fremstille humant væksthormon, kendetegnet ved, at man: (a) anbringer en kultur ifølge krav 13 i en fermenteringsbeholder, med iltning og omrystning i et vandigt, næringsholdigt fermenteringsmedium; 15 (b) opdyrker kulturen under iltning og omrystning, idet der efter behov tilføres yderligere næringsstoffer til opretholdelse af kraftig vækst; (c) adskiller den resulterende cellemasse fra fermenteringsmediet; 20 (d) lyserer cellerne for at frigøre deres indhold; (e) adskiller cellulært affald fra supernatant; og 25 (f) isolerer og oprenser polypeptidet fra supernatanten.
15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at nævnte transformante organisme er en bakterie.
16. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at nævnte polypeptid omfatter en N-terminal specifikt spaltelig aminosyresekvens. DK 173503 B1 22
17. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at nævnte polypeptid ikke ledsages af en N-terminal specifikt spaltelig aminosyresekvens.
18. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 14-16, kendetegnet ved, at nævnte isolering og oprensning indbefatter trinnet til specifik spaltning af nævnte N-terminale specifikt spaltelige aminosyresekvens.
19. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 14-16, 10 kendetegnet ved, at der fremstilles humant væksthormon, som i det væsentlige består af aminosyreme 1 til 191 som vist i Fig. 1 og Fig. 3 i kombination.
20. Fremgangsmåde ifølge krav 14 eller 15, kendetegnet ved, at der fremstilles methionylt humant væksthormon. 15
21. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at kulturen er en kultur af transformant E. coli, som udviser en selektionsegenskab, og hvor selektionstrykket påføres for at undertrykke konkurrence fra vildtype E. coli.
DK198100973A 1979-07-05 1981-03-04 Replicerbare plasmider, levedygtige kulturer af bakterielle transformatorer og fremgangsmåder til fremstilling af humant væ DK173503B1 (da)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5512679 1979-07-05
US06/055,126 US4342832A (en) 1979-07-05 1979-07-05 Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
US8000838 1980-07-03
PCT/US1980/000838 WO1981000114A1 (en) 1979-07-05 1980-07-03 Microbial expression of quasi-synthetic genes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DK97381A DK97381A (da) 1981-03-04
DK173503B1 true DK173503B1 (da) 2001-01-15

Family

ID=26733870

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK198100973A DK173503B1 (da) 1979-07-05 1981-03-04 Replicerbare plasmider, levedygtige kulturer af bakterielle transformatorer og fremgangsmåder til fremstilling af humant væ
DK251490A DK172132B1 (da) 1979-07-05 1990-10-18 Fremgangsmåde til konstruktion af en vektor, som i en prokaryot mikroorganisme kan udtrykke et bestemt polypeptid

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK251490A DK172132B1 (da) 1979-07-05 1990-10-18 Fremgangsmåde til konstruktion af en vektor, som i en prokaryot mikroorganisme kan udtrykke et bestemt polypeptid

Country Status (42)

Country Link
US (7) US4342832A (da)
EP (1) EP0022242B1 (da)
JP (4) JPH0612996B2 (da)
KR (2) KR830003574A (da)
AR (1) AR244341A1 (da)
AT (1) ATE82324T1 (da)
AU (2) AU533697B2 (da)
BE (1) BE884012A (da)
BG (1) BG41135A3 (da)
BR (1) BR8008736A (da)
CA (2) CA1164375A (da)
CH (1) CH661939A5 (da)
CS (3) CS250652B2 (da)
DD (3) DD157343A5 (da)
DE (3) DE3023627A1 (da)
DK (2) DK173503B1 (da)
EG (1) EG14819A (da)
ES (2) ES493149A0 (da)
FI (2) FI802030A (da)
FR (2) FR2460330B1 (da)
GB (2) GB2121047B (da)
GR (1) GR69320B (da)
HK (3) HK87584A (da)
IE (3) IE50461B1 (da)
IL (3) IL60312A (da)
IT (1) IT1131393B (da)
KE (3) KE3446A (da)
MX (1) MX172674B (da)
MY (3) MY8500764A (da)
NL (1) NL930114I2 (da)
NO (2) NO167673C (da)
NZ (2) NZ194043A (da)
OA (1) OA06562A (da)
PH (1) PH19814A (da)
PL (1) PL149278B1 (da)
PT (1) PT71487A (da)
RO (1) RO93374B (da)
SG (1) SG56984G (da)
WO (1) WO1981000114A1 (da)
YU (3) YU163580A (da)
ZA (1) ZA803600B (da)
ZW (1) ZW14180A1 (da)

Families Citing this family (184)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4898830A (en) * 1979-07-05 1990-02-06 Genentech, Inc. Human growth hormone DNA
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
US6455275B1 (en) 1980-02-25 2002-09-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA construct for producing proteinaceous materials in eucaryotic cells
CA1200773A (en) * 1980-02-29 1986-02-18 William J. Rutter Expression linkers
US4711843A (en) * 1980-12-31 1987-12-08 Cetus Corporation Method and vector organism for controlled accumulation of cloned heterologous gene products in Bacillus subtilis
ZA811368B (en) * 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
IL59690A (en) * 1980-03-24 1983-11-30 Yeda Res & Dev Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it
US4370417A (en) * 1980-04-03 1983-01-25 Abbott Laboratories Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator
US6610830B1 (en) 1980-07-01 2003-08-26 Hoffman-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferons
IE53166B1 (en) * 1980-08-05 1988-08-03 Searle & Co Synthetic urogastrone gene,corresponding plasmid recombinants,transformed cells,production thereof and urogastrone expression
US7101981B1 (en) 1980-08-26 2006-09-05 Regents Of The University Of California Bovine growth hormone recombinantly produced in E. coli
US4725549A (en) * 1980-09-22 1988-02-16 The Regents Of The University Of California Human and rat prolactin and preprolactin cloned genes
FR2490675B1 (fr) * 1980-09-25 1985-11-15 Genentech Inc Production microbienne d'interferon de fibroplaste humain
NZ199722A (en) * 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
JPS57181098A (en) * 1981-04-30 1982-11-08 Japan Found Cancer Novel recombinant dna
US4810645A (en) * 1981-08-14 1989-03-07 Hoffmann-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
US4801685A (en) * 1981-08-14 1989-01-31 Hoffmann-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
US4880910A (en) * 1981-09-18 1989-11-14 Genentech, Inc. Terminal methionyl bovine growth hormone and its use
US5254463A (en) * 1981-09-18 1993-10-19 Genentech, Inc. Method for expression of bovine growth hormone
NZ201918A (en) * 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US5236831A (en) * 1981-12-29 1993-08-17 Kiowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Amino acid synthesis in corynebacteria using E. coli genes
US4775622A (en) * 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
US4446235A (en) * 1982-03-22 1984-05-01 Genentech, Inc. Method for cloning human growth hormone varient genes
US4665160A (en) * 1982-03-22 1987-05-12 Genentech, Inc. Novel human growth hormone like protein HGH-V encoded in the human genome
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4652639A (en) * 1982-05-06 1987-03-24 Amgen Manufacture and expression of structural genes
DE3380262D1 (en) * 1982-05-25 1989-08-31 Lilly Co Eli Cloning vectors for expression of exogenous protein
US4778759A (en) * 1982-07-09 1988-10-18 Boyce, Thompson Institute For Plant Research, Inc. Genetic engineering in cyanobacteria
US4891315A (en) * 1982-10-25 1990-01-02 American Cyanamid Company Production of herpes simplex viral porteins
WO1984000775A1 (en) * 1982-08-10 1984-03-01 Univ Columbia The use of eucaryotic promoter sequences in the production of proteinaceous materials
US4530904A (en) * 1982-09-03 1985-07-23 Eli Lilly And Company Method for conferring bacteriophage resistance to bacteria
JPS59501852A (ja) * 1982-09-16 1984-11-08 アムジエン 鳥類の成長ホルモン
CA1209501A (en) * 1982-09-16 1986-08-12 Nikos Panayotatos Expression vector
US4666839A (en) * 1982-12-01 1987-05-19 Amgen Methods and materials for obtaining microbial expression of polypeptides including bovine prolactin
JPS59106297A (ja) * 1982-12-07 1984-06-19 Rikagaku Kenkyusho ヒト生長ホルモンのカルボキシ末端遺伝子の合成法
DK55685A (da) * 1985-02-07 1986-08-08 Nordisk Gentofte Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet
US5618697A (en) * 1982-12-10 1997-04-08 Novo Nordisk A/S Process for preparing a desired protein
US4634678A (en) * 1982-12-13 1987-01-06 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Plasmid cloning and expression vectors for use in microorganisms
GB8303383D0 (en) * 1983-02-08 1983-03-16 Biogen Nv Sequences recombinant dna molecules
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4755465A (en) * 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
US4859600A (en) * 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
IL71991A (en) 1983-06-06 1994-05-30 Genentech Inc Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes
BG49718A3 (en) * 1983-07-15 1992-01-15 Bio Technology General Corp Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty
US5242798A (en) * 1983-07-21 1993-09-07 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides corresponding to portions of proteinoids translated from brain-specific mRNAs, receptors, methods and diagnostics using the same
US4900811A (en) * 1983-07-21 1990-02-13 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides corresponding to portions of proteinoids translated from brain-specific mRNAs, receptors, methods and diagnostics using the same
JPS60137291A (ja) * 1983-12-26 1985-07-20 Takeda Chem Ind Ltd 発現ベクター
CA1213537A (en) * 1984-05-01 1986-11-04 Canadian Patents And Development Limited - Societe Canadienne Des Brevets Et D'exploitation Limitee Polypeptide expression method
CA1272144A (en) * 1984-06-29 1990-07-31 Tamio Mizukami Fish growth hormone polypeptide
US5489529A (en) * 1984-07-19 1996-02-06 De Boer; Herman A. DNA for expression of bovine growth hormone
WO1986002068A1 (en) * 1984-09-26 1986-04-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Mutual separation of proteins
ATE78515T1 (de) * 1984-10-05 1992-08-15 Genentech Inc Dna, zellkulturen und verfahren zur sekretion von heterologen proteinen und periplasmische proteinrueckgewinnung.
US4680262A (en) * 1984-10-05 1987-07-14 Genentech, Inc. Periplasmic protein recovery
NZ213759A (en) * 1984-10-19 1989-01-27 Genentech Inc Lhrh-ctp protein conjugates influencing prolactin fsh and lh release
US4645829A (en) * 1984-10-29 1987-02-24 Monsanto Company Method for separating polypeptides
US4652630A (en) * 1985-02-22 1987-03-24 Monsanto Company Method of somatotropin naturation
US4861868A (en) * 1985-02-22 1989-08-29 Monsanto Company Production of proteins in procaryotes
DK151585D0 (da) * 1985-04-03 1985-04-03 Nordisk Gentofte Dna-sekvens
EP0200986B2 (en) 1985-04-25 1998-03-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant human interleukin-1
DE3681787D1 (de) * 1985-07-05 1991-11-07 Whitehead Biomedical Inst Expression von fremdem genetischem material in epithelzellen.
US5041381A (en) 1986-07-03 1991-08-20 Schering Corporation Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same
US4892764A (en) * 1985-11-26 1990-01-09 Loctite Corporation Fiber/resin composites, and method of making the same
US5552528A (en) * 1986-03-03 1996-09-03 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Bovine b-endothelial cell growth factor
US5827826A (en) * 1986-03-03 1998-10-27 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Compositions of human endothelial cell growth factor
EP0245218B1 (en) * 1986-05-07 1993-12-29 ENIRICERCHE S.p.A. A plasmid vector for expression in bacillus and used for cloning the structural gene which codes for the human growth hormone and a method of producing the hormone
EP0252588A3 (en) * 1986-05-12 1989-07-12 Smithkline Beecham Corporation Process for the isolation and purification of p. falciparum cs protein expressed in recombinant e. coli, and its use as a vaccine
US4806239A (en) * 1986-11-28 1989-02-21 Envirotech Corporation Apparatus for shifting filter plates in a filter press
JPS63159244A (ja) * 1986-12-23 1988-07-02 三菱マテリアル株式会社 二層の押出成形珪酸質―石灰質系成形品の製造方法
DE3751144D1 (de) * 1986-12-31 1995-04-13 Lucky Ltd Verfahren zur herstellung eines lachswachstumshormons mittels eines kunstgens.
EP0329710A1 (en) * 1987-01-07 1989-08-30 Allied Corporation Microbial production of peptide oligomers
US4977089A (en) * 1987-01-30 1990-12-11 Eli Lilly And Company Vector comprising signal peptide-encoding DNA for use in Bacillus and other microorganisms
WO1988010119A1 (en) * 1987-06-22 1988-12-29 Genetics Institute, Inc. Novel thrombolytic proteins
FR2624835B2 (fr) * 1987-08-05 1990-09-07 Hassevelde Roger Support ergonomique a creme glacee, a cuillere integree, transformable en tout autre objet apres son utilisation premiere
US5268267A (en) * 1987-08-21 1993-12-07 The General Hospital Corporation Method for diagnosing small cell carcinoma
IT1223577B (it) * 1987-12-22 1990-09-19 Eniricerche Spa Procedimento migliorato per la preparazione dell'ormone della crescita umano naturale in forma pura
JPH0231042U (da) * 1988-08-19 1990-02-27
US5130422A (en) * 1988-08-29 1992-07-14 Monsanto Company Variant somatotropin-encoding DNA
ATE154364T1 (de) 1988-09-02 1997-06-15 Univ Rockefeller Makrophagenabgeleiteter entzündungsmediator(mip- 2)
US5079230A (en) * 1988-09-12 1992-01-07 Pitman-Moore, Inc. Stable bioactive somatotropins
US5082767A (en) * 1989-02-27 1992-01-21 Hatfield G Wesley Codon pair utilization
US5075227A (en) * 1989-03-07 1991-12-24 Zymogenetics, Inc. Directional cloning
US4960301A (en) * 1989-03-27 1990-10-02 Fry Steven A Disposable liner for pickup truck beds
US5164180A (en) 1989-05-18 1992-11-17 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates active against lepidopteran pests
US5266477A (en) * 1990-02-02 1993-11-30 Pitman-Moore, Inc. Monoclonal antibodies which differentiate between native and modified porcine somatotropins
CA2041446A1 (en) 1990-05-15 1991-11-16 August J. Sick Bacillus thuringiensis genes encoding novel dipteran-active toxins
US5849694A (en) * 1990-07-16 1998-12-15 Synenki; Richard M. Stable and bioactive modified porcine somatotropin and pharmaceutical compositions thereof
US5744139A (en) * 1991-06-28 1998-04-28 University Of Tennessee Research Corporation Insulin-like growth factor I (IGF-1) induced improvement of depressed T4/T8 ratios
US5202119A (en) * 1991-06-28 1993-04-13 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response
HUT67319A (en) * 1991-08-30 1995-03-28 Life Medical Sciences Inc Compositions for treating wounds
US5591709A (en) * 1991-08-30 1997-01-07 Life Medical Sciences, Inc. Compositions and methods for treating wounds
US5317012A (en) * 1991-10-04 1994-05-31 The University Of Tennessee Research Corporation Human growth hormone induced improvement in depressed T4/T8 ratio
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1994008611A1 (en) * 1992-10-22 1994-04-28 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research GROWTH HORMONE FRAGMENT hGH 108-129
DE69435280D1 (de) 1993-03-10 2010-04-15 Glaxosmithkline Llc Phosphodiesterase des menschlichen Gehirns und Screening-Verfahren
FR2738842B1 (fr) * 1995-09-15 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
GB9526733D0 (en) * 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US5760187A (en) * 1996-02-22 1998-06-02 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Purification process of a human growth hormone
JP3794748B2 (ja) * 1996-03-04 2006-07-12 第一アスビオファーマ株式会社 メタノール代謝系を有する微生物の培養法
US6503729B1 (en) 1996-08-22 2003-01-07 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Selected polynucleotide and polypeptide sequences of the methanogenic archaeon, methanococcus jannashii
MX9605082A (es) * 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
EP1007069A1 (en) * 1996-11-01 2000-06-14 Smithkline Beecham Corporation Novel coding sequences
US6068991A (en) * 1997-12-16 2000-05-30 Bristol-Myers Squibb Company High expression Escherichia coli expression vector
CN100340666C (zh) 1997-12-18 2007-10-03 孟山都技术有限公司 抗昆虫的转基因植物以及用于改善δ-内毒素抵抗目标昆虫活性的方法
US6087128A (en) 1998-02-12 2000-07-11 Ndsu Research Foundation DNA encoding an avian E. coli iss
IL138658A0 (en) 1998-03-31 2001-10-31 Tonghua Gantech Biotechnology Chimeric protein
US6512162B2 (en) 1998-07-10 2003-01-28 Calgene Llc Expression of eukaryotic peptides in plant plastids
US6271444B1 (en) 1998-07-10 2001-08-07 Calgene Llc Enhancer elements for increased translation in plant plastids
EP1405666B1 (de) 1998-08-28 2007-03-21 febit biotech GmbH Träger für Analytbestimmungsverfahren und Verfahren zur Herstellung des Trägers
ATE334197T1 (de) 1999-02-19 2006-08-15 Febit Biotech Gmbh Verfahren zur herstellung von polymeren
US6946265B1 (en) 1999-05-12 2005-09-20 Xencor, Inc. Nucleic acids and proteins with growth hormone activity
US6187750B1 (en) 1999-08-25 2001-02-13 Everyoung Technologies, Inc. Method of hormone treatment for patients with symptoms consistent with multiple sclerosis
AT408721B (de) 1999-10-01 2002-02-25 Cistem Biotechnologies Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung enthaltend ein antigen
GB9924351D0 (en) 1999-10-14 1999-12-15 Brennan Frank Immunomodulation methods and compositions
US6562790B2 (en) 2000-02-05 2003-05-13 Chein Edmund Y M Hormone therapy methods and hormone products for abating coronary artery blockage
CA2747325A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6995246B1 (en) * 2000-10-19 2006-02-07 Akzo Nobel N.V. Methods for removing suspended particles from soluble protein solutions
EP1346722B1 (en) 2000-12-01 2008-12-10 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for producing preparation containing bioactive substance
US20030049731A1 (en) * 2000-12-05 2003-03-13 Bowdish Katherine S. Engineered plasmids and their use for in situ production of genes
US20020164712A1 (en) * 2000-12-11 2002-11-07 Tonghua Gantech Biotechnology Ltd. Chimeric protein containing an intramolecular chaperone-like sequence
US20030143191A1 (en) * 2001-05-25 2003-07-31 Adam Bell Chemokine beta-1 fusion proteins
US6720538B2 (en) * 2001-06-18 2004-04-13 Homedics, Inc. Thermostat variation compensating knob
ES2606840T3 (es) 2001-10-10 2017-03-28 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glicoconjugación de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF)
US20030171285A1 (en) * 2001-11-20 2003-09-11 Finn Rory F. Chemically-modified human growth hormone conjugates
EP1463751B1 (en) 2001-12-21 2013-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1463752A4 (en) 2001-12-21 2005-07-13 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
WO2005003296A2 (en) 2003-01-22 2005-01-13 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ATE466085T1 (de) * 2002-09-09 2010-05-15 Hanall Pharmaceutical Co Ltd Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide
PA8588901A1 (es) * 2002-11-20 2005-02-04 Pharmacia Corp Conjugados de hormona de crecimiento humana pegilados n-terminales y proceso para su preparacion
KR20050090430A (ko) 2002-12-31 2005-09-13 알투스 파마슈티컬스 인코포레이티드 인간 성장 호르몬 결정 및 이것의 제조 방법
JP2006517995A (ja) * 2003-02-19 2006-08-03 ファルマシア・コーポレーション 活性化されたポリエチレングリコールエステル類
NZ543976A (en) * 2003-05-09 2008-04-30 Pharmexa As Immunogenic human TNF alpha analogues with reduced cytotoxicity and methods of their preparation
BRPI0507169A (pt) * 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos do hormÈnio de crescimento humano modificados e seu usos
EA200601793A1 (ru) * 2004-06-23 2007-02-27 Ю Эс Ви ЛИМИТЕД Химерный гормон роста человека, полученный из изоформы плаценты и гипофиза, и способы получения указанной химеры
US20060024288A1 (en) * 2004-08-02 2006-02-02 Pfizer Inc. tRNA synthetase fragments
US8282921B2 (en) * 2004-08-02 2012-10-09 Paul Glidden tRNA synthetase fragments
US7998930B2 (en) 2004-11-04 2011-08-16 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified growth hormones
EP1836314B1 (en) 2004-12-22 2012-01-25 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
NZ555206A (en) 2004-12-22 2010-09-30 Ambrx Inc Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone
CA2594561C (en) * 2004-12-22 2014-12-23 Ambrx, Inc. Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
US20070154992A1 (en) 2005-04-08 2007-07-05 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
EP1896134A2 (en) 2005-06-13 2008-03-12 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating degenerative bone disorders
WO2007005995A2 (en) * 2005-07-05 2007-01-11 Emisphere Technologies, Inc. Compositions for buccal delivery of human growth hormone
WO2007019646A1 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 University Of Technology, Sydney Liver-directed gene therapy
US20090018029A1 (en) 2005-11-16 2009-01-15 Ambrx, Inc. Methods and Compositions Comprising Non-Natural Amino Acids
AU2006330833A1 (en) * 2005-12-23 2007-07-05 Altus Pharmaceuticals Inc. Compositions comprising polycation-complexed protein crystals and methods of treatment using them
DE102006039479A1 (de) 2006-08-23 2008-03-06 Febit Biotech Gmbh Programmierbare Oligonukleotidsynthese
AU2007333959A1 (en) 2006-12-18 2008-06-26 Altus Pharmaceuticals Inc. Human growth hormone formulations
US20080260820A1 (en) * 2007-04-19 2008-10-23 Gilles Borrelly Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides
AU2008279584A1 (en) * 2007-04-27 2009-01-29 Dow Global Technologies Inc. Improved production and in vivo assembly of soluble recombinant icosahedral virus-like particles
WO2008136790A1 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Merial Limited Dna plasmids having improved expression and stability
AU2008275911A1 (en) * 2007-07-19 2009-01-22 Arizona Board of Regents, a body corporate acting for and on behalf of Arizona State University Self- anchoring MEMS intrafascicular neural electrode
US7939447B2 (en) * 2007-10-26 2011-05-10 Asm America, Inc. Inhibitors for selective deposition of silicon containing films
CN103694337B (zh) 2008-02-08 2016-03-02 Ambrx公司 经修饰瘦素多肽和其用途
EP3050576B1 (en) 2008-04-29 2021-03-31 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Pegylated recombinant human growth hormone compounds
US20110020924A1 (en) * 2008-04-30 2011-01-27 Gradalis, Inc. Highly pure plasmid dna preparations
WO2009158395A1 (en) * 2008-06-25 2009-12-30 Braasch Biotech Llc Compositions and methods for enhanced somatostatin immunogenicity
AU2008358353B2 (en) * 2008-06-25 2013-11-07 Braasch Biotech Llc Chloramphenicol acetyl transferase (CAT)-defective somatostatin fusion protein and uses thereof
US8703717B2 (en) * 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
PT2393828T (pt) 2009-02-03 2017-01-18 Amunix Operating Inc Polipéptidos recombinantes estendidos e composições que compreendem os mesmos
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
WO2010094772A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Febit Holding Gmbh Synthesis of sequence-verified nucleic acids
US9849188B2 (en) 2009-06-08 2017-12-26 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
JP5813641B2 (ja) 2009-08-24 2015-11-17 アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド 凝固第ix因子組成物ならびにそれを製造および使用する方法
NZ600363A (en) 2009-12-21 2014-07-25 Ambrx Inc Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
EP2805964A1 (en) 2009-12-21 2014-11-26 Ambrx, Inc. Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses
WO2011103325A1 (en) 2010-02-17 2011-08-25 Elona Biotechnologies Methods for preparing human growth hormone
EP2446898A1 (en) 2010-09-30 2012-05-02 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients
AU2012205301B2 (en) 2011-01-14 2017-01-05 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged immunoglobulin polypeptides and method of use thereof
RU2473556C1 (ru) * 2011-07-14 2013-01-27 Закрытое акционерное общество "ГЕНЕРИУМ" Промышленный способ получения и очистки рекомбинантного гормона роста человека из телец включения
EP2812012A1 (en) 2012-02-07 2014-12-17 Global Bio Therapeutics USA, Inc. Compartmentalized method of nucleic acid delivery and compositions and uses thereof
HUE043537T2 (hu) 2012-02-15 2019-08-28 Bioverativ Therapeutics Inc Rekombináns VIII faktor fehérjék
PL3564260T3 (pl) 2012-02-15 2023-03-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Kompozycje czynnika viii oraz sposoby ich wytwarzania i stosowania
US9700071B2 (en) 2012-03-26 2017-07-11 Axcella Health Inc. Nutritive fragments, proteins and methods
WO2013148328A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Pronutria, Inc. Nutritive proteins and methods
CA2868473A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Pronutria, Inc. Nutritive fragments, proteins and methods
AU2013240183B2 (en) 2012-03-26 2016-10-20 Axcella Health Inc. Charged nutritive proteins and methods
US9457096B2 (en) 2012-07-06 2016-10-04 Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas (Concet) Protozoan variant-specific surface proteins (VSP) as carriers for oral drug delivery
EP3030163B1 (en) 2013-08-08 2019-03-20 Global Bio Therapeutics, Inc. Clamp device for minimally invasive procedures
TW202003554A (zh) 2013-08-14 2020-01-16 美商百歐維拉提夫治療公司 因子viii-xten融合物及其用途
AU2014324901A1 (en) 2013-09-25 2016-05-19 Axcella Health Inc. Compositions and formulations for prevention and treatment of diabetes and obesity, and methods of production and use thereof in glucose and caloric control
BR112018002150A2 (pt) 2015-08-03 2018-09-18 Bioverativ Therapeutics Inc proteínas de fusão do fator ix e métodos de fabricação e uso das mesmas
WO2017189432A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
WO2020004368A1 (ja) 2018-06-25 2020-01-02 Jcrファーマ株式会社 蛋白質含有水性液剤
CN109486847B (zh) * 2018-12-17 2021-03-02 江南大学 基于人工串联启动子的枯草芽孢杆菌高效诱导表达系统

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3853832A (en) * 1971-04-27 1974-12-10 Harmone Res Foundation Synthetic human pituitary growth hormone and method of producing it
US3853833A (en) * 1971-04-27 1974-12-10 Hormone Res Foundation Synthetic human growth-promoting and lactogenic hormones and method of producing same
GB1521032A (en) * 1974-08-08 1978-08-09 Ici Ltd Biological treatment
US4237224A (en) * 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
NL7607683A (nl) * 1976-07-12 1978-01-16 Akzo Nv Werkwijze ter bereiding van nieuwe peptiden en peptide-derivaten en de toepassing hiervan.
US4190495A (en) * 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
NZ187300A (en) * 1977-05-27 1982-08-17 Univ California Dna transfer vector and micro-organism modified to contain a nucleotide sequence equivalent to the gene of a higher organism
US4363877B1 (en) * 1977-09-23 1998-05-26 Univ California Recombinant dna transfer vectors
CH630089A5 (de) * 1977-09-09 1982-05-28 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellung von siliciummodifizierten imidyl-phthalsaeurederivaten.
JPS5449837A (en) * 1977-09-19 1979-04-19 Kobashi Kogyo Kk Safety apparatus of soil block making machine
US4407948A (en) * 1977-09-23 1983-10-04 The Regents Of The University Of California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
ZA782933B (en) * 1977-09-23 1979-05-30 Univ California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
US4321365A (en) * 1977-10-19 1982-03-23 Research Corporation Oligonucleotides useful as adaptors in DNA cloning, adapted DNA molecules, and methods of preparing adaptors and adapted molecules
US4356270A (en) * 1977-11-08 1982-10-26 Genentech, Inc. Recombinant DNA cloning vehicle
GB2007675B (en) * 1977-11-08 1982-09-02 Genentech Inc Synthetic dna and process therefor
DK493878A (da) * 1977-11-08 1979-05-09 Genentech Inc Fremgangsmaade og middel til mikrobiel polypeptid-udrykning
BR7807288A (pt) * 1977-11-08 1979-06-12 Genentech Inc Processo para sintese de polinucleotidos
ES474852A1 (es) * 1977-11-08 1979-12-01 Genentech Inc Un metodo para la expresion,en un huesped bacteriano trans- formado de un polipeptido heterologo con respecto al huespeden su estado no transformado
US4366246A (en) * 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
US4652525A (en) * 1978-04-19 1987-03-24 The Regents Of The University Of California Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes
US4565785A (en) * 1978-06-08 1986-01-21 The President And Fellows Of Harvard College Recombinant DNA molecule
US4411994A (en) * 1978-06-08 1983-10-25 The President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
IE48385B1 (en) * 1978-08-11 1984-12-26 Univ California Synthesis of a eucaryotic protein by a microorganism
DE2963374D1 (en) * 1978-10-10 1982-09-09 Univ Leland Stanford Junior Recombinant dna, method for preparing it and production of foreign proteins by unicellular hosts containing it
US4332892A (en) * 1979-01-15 1982-06-01 President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
IE52036B1 (en) * 1979-05-24 1987-05-27 Univ California Non-passageable viruses
GR68404B (da) * 1979-06-01 1981-12-29 Univ California
US4898830A (en) * 1979-07-05 1990-02-06 Genentech, Inc. Human growth hormone DNA
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
GR70279B (da) * 1979-09-12 1982-09-03 Univ California
IL59690A (en) * 1980-03-24 1983-11-30 Yeda Res & Dev Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it
GR79124B (da) * 1982-12-22 1984-10-02 Genentech Inc
US4859600A (en) * 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
CA1267615A (en) * 1984-08-27 1990-04-10 Dan Hadary Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms

Also Published As

Publication number Publication date
NO167674B (no) 1991-08-19
EP0022242A3 (en) 1982-04-07
FR2460330B1 (fr) 1985-07-19
IL69492A0 (en) 1983-11-30
JPH02478A (ja) 1990-01-05
IE801214L (en) 1981-01-05
FI850198L (fi) 1985-01-16
NO167674C (no) 1991-11-27
KE3450A (en) 1984-10-05
US5424199A (en) 1995-06-13
AU533697B2 (en) 1983-12-08
CS250655B2 (en) 1987-05-14
US4342832A (en) 1982-08-03
MY8500764A (en) 1985-12-31
BE884012A (fr) 1980-12-29
IT1131393B (it) 1986-06-18
PL225376A1 (en) 1983-07-18
NL930114I1 (nl) 1993-10-18
CH661939A5 (de) 1987-08-31
HK87484A (en) 1984-11-16
AU1838883A (en) 1984-01-05
NZ194043A (en) 1983-09-30
YU121283A (en) 1984-02-29
IE50460B1 (en) 1986-04-30
JP2622479B2 (ja) 1997-06-18
EP0022242A2 (en) 1981-01-14
DD157343A5 (de) 1982-11-03
IL60312A0 (en) 1980-09-16
US5795745A (en) 1998-08-18
US4601980A (en) 1986-07-22
JPH0612996B2 (ja) 1994-02-23
HK87584A (en) 1984-11-16
NO167673B (no) 1991-08-19
IL60312A (en) 1985-04-30
CA1202256A (en) 1986-03-25
ATE82324T1 (de) 1992-11-15
NO860680L (no) 1981-02-20
GB2121047B (en) 1984-06-06
NO810608L (no) 1981-02-20
YU163580A (en) 1984-02-29
NL930114I2 (nl) 1994-10-17
DE3023627A1 (de) 1981-01-22
IE842193L (en) 1981-01-05
ES8205265A1 (es) 1982-06-01
IE50461B1 (en) 1986-04-30
ES8105386A1 (es) 1981-05-16
AU5949880A (en) 1981-01-15
DD210070A5 (de) 1984-05-30
CS270884A2 (en) 1987-07-16
US4604359A (en) 1986-08-05
US4658021A (en) 1987-04-14
HK87384A (en) 1984-11-16
ZA803600B (en) 1981-07-29
AU2583484A (en) 1984-07-12
IT8023070A0 (it) 1980-06-26
MX172674B (es) 1994-01-06
AU574351B2 (en) 1988-07-07
GB2055382A (en) 1981-03-04
FI802030A (fi) 1981-01-06
EP0022242B1 (en) 1992-11-11
KE3446A (en) 1984-10-05
SG56984G (en) 1985-03-08
KE3451A (en) 1984-10-05
RO93374B (ro) 1988-01-31
WO1981000114A1 (en) 1981-01-22
DK251490A (da) 1990-10-18
BG41135A3 (en) 1987-04-15
KR830003574A (ko) 1983-06-21
DE3050722C2 (da) 1987-09-24
FR2518572A1 (fr) 1983-06-24
EG14819A (en) 1985-03-31
GR69320B (da) 1982-05-14
CA1164375A (en) 1984-03-27
FR2518572B1 (fr) 1985-08-23
DK251490D0 (da) 1990-10-18
CS250652B2 (en) 1987-05-14
GB2121047A (en) 1983-12-14
PL149278B1 (en) 1990-01-31
JPH0648987B2 (ja) 1994-06-29
FR2460330A1 (fr) 1981-01-23
ZW14180A1 (en) 1980-09-10
PT71487A (en) 1980-08-01
ES493149A0 (es) 1981-05-16
KR870000701B1 (ko) 1987-04-07
IL69492A (en) 1985-04-30
NO167673C (no) 1991-11-27
PH19814A (en) 1986-07-08
JPH08242881A (ja) 1996-09-24
MY8500765A (en) 1985-12-31
OA06562A (fr) 1981-07-31
DK97381A (da) 1981-03-04
DD210071A5 (de) 1984-05-30
JPS5621596A (en) 1981-02-28
YU121183A (en) 1984-02-29
CS254973B2 (en) 1988-02-15
DK172132B1 (da) 1997-11-24
JPH05268970A (ja) 1993-10-19
GB2055382B (en) 1983-10-19
MY8500763A (en) 1985-12-31
AR244341A1 (es) 1993-10-29
NZ201312A (en) 1983-09-30
ES499043A0 (es) 1982-06-01
FI850198A0 (fi) 1985-01-16
BR8008736A (pt) 1981-04-28
US4634677A (en) 1987-01-06
IE50462B1 (en) 1986-04-30
DE3050725C2 (da) 1988-03-10
RO93374A (ro) 1988-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK173503B1 (da) Replicerbare plasmider, levedygtige kulturer af bakterielle transformatorer og fremgangsmåder til fremstilling af humant væ
US4898830A (en) Human growth hormone DNA
EP0154133B1 (en) Plasmidic expression vehicles, and method of producing a polypeptide therewith
Amann et al. Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli
JP2763024B2 (ja) 牛のプレ成長および成長ホルモンの製造方法
EP0161937B1 (en) Recombinant fusion proteins
IE52760B1 (en) Recombinant dna encoding a polypeptide displaying milk clotting activity and precursors thereof
EP0539530A1 (en) Purification directed cloning of peptides
EP0797671B1 (en) A process of producing extracellular proteins in bacteria
EP0026598A1 (en) DNA transfer vectors for human proinsulin and human pre-proinsulin, microorganisms transformed thereby, and processes involving such substances
GB2121048A (en) Microbial expression of quasi- synthetic genes
JP2525413B2 (ja) L−フェニルアラニン・アンモニアリア−ゼ発現用組換え体プラスミド及び該プラスミドを有する形質転換株
DK172695B1 (da) DNA-afsnit af trp-operonet fra E. coli, plasmider indeholdende DNA-afsnittet, fremgangsmåde til fremstilling af en vektor i
JPH01273591A (ja) ヒト成長ホルモン分泌プラスミド、ならびにそれを用いた形質転換体および蛋白質分泌生産法
CA1302321C (en) Preparation of polypeptides
JPH01104180A (ja) 魚類の成長ホルモン遺伝子、該遺伝子の組換え体プラスミド、該組換え体プラスミドを含む徴生物、該徴生物による魚類の成長ホルモンの製法及び該成長ホルモンによる魚類の成育促進法

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PUP Patent expired