JPS63102686A - 乳酸バクテリアの遺伝的形質転換 - Google Patents
乳酸バクテリアの遺伝的形質転換Info
- Publication number
- JPS63102686A JPS63102686A JP62241009A JP24100987A JPS63102686A JP S63102686 A JPS63102686 A JP S63102686A JP 62241009 A JP62241009 A JP 62241009A JP 24100987 A JP24100987 A JP 24100987A JP S63102686 A JPS63102686 A JP S63102686A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- transformation
- bacterial cells
- mixture
- dna
- polyethylene glycol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title claims description 74
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 36
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 19
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 title claims description 18
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 title claims description 18
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 63
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 51
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 47
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 47
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 43
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 43
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 41
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 29
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 27
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 27
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 21
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 12
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 10
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 claims description 7
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 claims description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 claims description 7
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 claims description 5
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 4
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 claims 3
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 70
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 7
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 6
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108010009719 mutanolysin Proteins 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000193815 Atopobium minutum Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101100264195 Caenorhabditis elegans app-1 gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186679 Lactobacillus buchneri Species 0.000 description 2
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 2
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LQIAZOCLNBBZQK-UHFFFAOYSA-N 1-(1,2-Diphosphanylethyl)pyrrolidin-2-one Chemical compound PCC(P)N1CCCC1=O LQIAZOCLNBBZQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 100 mM) Chemical compound 0.000 description 1
- 101100520159 Arabidopsis thaliana PIS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Diphosphoinositol tetrakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 240000002989 Euphorbia neriifolia Species 0.000 description 1
- 241000186777 Fructobacillus fructosus Species 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- 241000186715 Lactobacillus alimentarius Species 0.000 description 1
- 241001134659 Lactobacillus curvatus Species 0.000 description 1
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 description 1
- 241001147746 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis Species 0.000 description 1
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 description 1
- 241000186839 Lactobacillus fructivorans Species 0.000 description 1
- 240000002605 Lactobacillus helveticus Species 0.000 description 1
- 235000013967 Lactobacillus helveticus Nutrition 0.000 description 1
- 241001561398 Lactobacillus jensenii Species 0.000 description 1
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 1
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000186870 Lactobacillus ruminis Species 0.000 description 1
- 241000186866 Lactobacillus thermophilus Species 0.000 description 1
- 241000194034 Lactococcus lactis subsp. cremoris Species 0.000 description 1
- 241000194041 Lactococcus lactis subsp. lactis Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229920002593 Polyethylene Glycol 800 Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000014962 Streptococcus cremoris Nutrition 0.000 description 1
- 235000014969 Streptococcus diacetilactis Nutrition 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N THREONINE Chemical compound CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001537924 Tetracoccus <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000014048 cultured milk product Nutrition 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000002635 electroconvulsive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N hexahydrofarnesyl acetone Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)=O WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 229940068140 lactobacillus bifidus Drugs 0.000 description 1
- 229940054346 lactobacillus helveticus Drugs 0.000 description 1
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は乳酸生産性バクテリアの遺伝的形質転換に関す
る。
る。
漿ぎへ皮惟支肌図息
乳酸生産性バクテリアはチーズ、ヨーグルト等の発酵乳
生産物の製造のみならず、他の多くの食料品の発酵生産
に頻繁に用いられている。既知の乳酸バクテリアの例と
してストレプトコッカス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属、ラクトバチルス（Ｌ ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属人ブベヂイオコツカス（Ｐ ｅｄｉｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属に属する種が包含される。
生産物の製造のみならず、他の多くの食料品の発酵生産
に頻繁に用いられている。既知の乳酸バクテリアの例と
してストレプトコッカス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属、ラクトバチルス（Ｌ ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属人ブベヂイオコツカス（Ｐ ｅｄｉｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属に属する種が包含される。
乳酸バクテリアを改良し、その性質を修飾するのに組換
えＤＮＡ技術を応用することは興味があることである。
えＤＮＡ技術を応用することは興味があることである。
しかしながら、従来、Ｋ ｏｎｄｏ ｅｔａｌ、 Ｉ
Ａｐｐｌ、 Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｖｏｂｉｏｌ、
、４８ ＋２５２−２５９（１９８４）にストレプトコ
ッカス・ラクテイス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
１ａｃｔｉｓ）の形質転換について報告されていると
おり、乳酸バクテリアの形質転換のためには細胞壁の除
去（プロトプラスト形成）が必須であると考えられてい
た。
Ａｐｐｌ、 Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｖｏｂｉｏｌ、
、４８ ＋２５２−２５９（１９８４）にストレプトコ
ッカス・ラクテイス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
１ａｃｔｉｓ）の形質転換について報告されていると
おり、乳酸バクテリアの形質転換のためには細胞壁の除
去（プロトプラスト形成）が必須であると考えられてい
た。
プロトプラスト化されたＳ、ラクテイス菌体（Ｓ 、
１ａｃｔｉｓ ｃｅｌｌｓ）のプラスミドＤＮＡに
よる形質転換は達成されているが、プロトプラスト形成
条件や細胞壁再生条件、並びにＤＮＡ取込み（ｃｅｐｔ
ａｋｅ）ｉ構についての理解が貧弱なために、実際問題
として、異なった実験室で確立されたプロトフル（生物
医学的間圧研究の正確で詳門な計画）を再実施するのが
困難であった。さらに既知のプロトプラスト依存技術に
よる形質転換効率はしばしば人を落胆させるものであっ
た。従って、既存の技術の欠点を有さない、乳酸バクテ
リアの遺伝的形質転換方法が求められている。
１ａｃｔｉｓ ｃｅｌｌｓ）のプラスミドＤＮＡに
よる形質転換は達成されているが、プロトプラスト形成
条件や細胞壁再生条件、並びにＤＮＡ取込み（ｃｅｐｔ
ａｋｅ）ｉ構についての理解が貧弱なために、実際問題
として、異なった実験室で確立されたプロトフル（生物
医学的間圧研究の正確で詳門な計画）を再実施するのが
困難であった。さらに既知のプロトプラスト依存技術に
よる形質転換効率はしばしば人を落胆させるものであっ
た。従って、既存の技術の欠点を有さない、乳酸バクテ
リアの遺伝的形質転換方法が求められている。
発ａＢ ｙ＞ ４λ叉一
本発明によれば、ＤＮＡを、少なくとも約５重量％の水
溶性低級ポリアルキレングリコールを含有する生理的に
許容し得る水溶液中でグラム陽性乳酸生産性非プロドプ
ラ入ト化バクテリア菌体（ｃｅｌｌｓ）と混合する。そ
の混合物をインキュベートして菌体をＤＮＡで遺伝的に
形質転換する。
溶性低級ポリアルキレングリコールを含有する生理的に
許容し得る水溶液中でグラム陽性乳酸生産性非プロドプ
ラ入ト化バクテリア菌体（ｃｅｌｌｓ）と混合する。そ
の混合物をインキュベートして菌体をＤＮＡで遺伝的に
形質転換する。
好ましい態様の開示□
驚くべきことに、本発明者らは乳酸バクテリアの細胞壁
を酵素的に除去してプロトプラスト化する必要なしに、
乳酸バクテリアの細胞全体を遺伝的に形質転換する方法
を見い出した。
を酵素的に除去してプロトプラスト化する必要なしに、
乳酸バクテリアの細胞全体を遺伝的に形質転換する方法
を見い出した。
本発明は、乳酸バクテリア、例えばストレプトコツカス
属、ラクトバチルス属及びペディオコッカス属に属する
種を含む乳酸バクテリアを遺伝的に修飾、改良するのに
有用である。
属、ラクトバチルス属及びペディオコッカス属に属する
種を含む乳酸バクテリアを遺伝的に修飾、改良するのに
有用である。
日常品生産工業（ｄａｉｒｙ １ｎｄｕｓｔｒｙ）に
とって有用であることが認識されている乳酸バクテリア
の既知のＶｉ種には次のものが包含される：ストレブト
フツカＸ−ラクテイス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
１ａｑｔｉＳ）、ストレプトフッカス・クレモリス
（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ
）、ストレプトフッカス◆ジアセチラクテイス（Ｓ ｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉ
ｓ）、ストレプトフッカス・サーモフィラス（Ｓ ｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ
）、ストレプトフッカス噛７エシウム（Ｓ ｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｅｃｕｓ ｆａｃｃｉｕＩｌｌ）、ラクトバチ
ルス・アシドフイリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｃ １ｄｏｐｈｉ Ｉ １ｕｓ）、ラクトバチルス・
アリメンタリウス（ＬａｃＬｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａ
ｌｉｎｅｎｔａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ビフィズ
ス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ）
、ラクトバチルス・プレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ブクネリ（
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、
ラクトバチルス・ブリガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｂｕｌＨａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・
キャセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ
）、ラクトバチルスーカテナ７オルメ（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｅａｔｅｎａｆｏｒＩＩＩｅ）、ラク
トバチルス・セロビオサス（Ｌａｅｔ。
とって有用であることが認識されている乳酸バクテリア
の既知のＶｉ種には次のものが包含される：ストレブト
フツカＸ−ラクテイス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
１ａｑｔｉＳ）、ストレプトフッカス・クレモリス
（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ
）、ストレプトフッカス◆ジアセチラクテイス（Ｓ ｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉ
ｓ）、ストレプトフッカス・サーモフィラス（Ｓ ｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ
）、ストレプトフッカス噛７エシウム（Ｓ ｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｅｃｕｓ ｆａｃｃｉｕＩｌｌ）、ラクトバチ
ルス・アシドフイリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｃ １ｄｏｐｈｉ Ｉ １ｕｓ）、ラクトバチルス・
アリメンタリウス（ＬａｃＬｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａ
ｌｉｎｅｎｔａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ビフィズ
ス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ）
、ラクトバチルス・プレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ブクネリ（
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、
ラクトバチルス・ブリガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｂｕｌＨａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・
キャセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ
）、ラクトバチルスーカテナ７オルメ（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｅａｔｅｎａｆｏｒＩＩＩｅ）、ラク
トバチルス・セロビオサス（Ｌａｅｔ。
ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｕｓ）、ラク
トバチルス・コリ、ノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）、ラクトバチルＸ−
：ｆｆンヒューサス（Ｌ ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃ
ｏｎｆｕｓｕｓ）、ラクトバチルス中カーバタス（Ｌａ
ｃｔ。
トバチルス・コリ、ノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）、ラクトバチルＸ−
：ｆｆンヒューサス（Ｌ ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃ
ｏｎｆｕｓｕｓ）、ラクトバチルス中カーバタス（Ｌａ
ｃｔ。
ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチ
ルス・デルブレラキイ（Ｌａｃｔｏｂｇｃｉｌｌｕｓ
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・７アル
シミニス（Ｌ ａｃ ｔｏｂａｃ ｉ Ｉ ｌ ｕｓｆ
ａｒｃｉａ＋１ｎｉｓ）、ラクトバチルス舎７フーメン
テイテ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎ
ｔａｔｅ）、ラクトバチルスψ７アーメンタム（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｉｅｎｔｕ＋ａ）、ラク
トバチルス・７ラクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチル
ス＋７ラクトーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカ
ス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃ
ｕｓ）、ラクトバチルス・ヘテロヒオチ（Ｌａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｈｉｏｃｈｉ）、ラク
トバチルス・ヒル〃−ディ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｈｉｌＨａｒｄｉｉ）、ラクトバチルス・ホモヒ
オチ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｍｏｈｉ。
ルス・デルブレラキイ（Ｌａｃｔｏｂｇｃｉｌｌｕｓ
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・７アル
シミニス（Ｌ ａｃ ｔｏｂａｃ ｉ Ｉ ｌ ｕｓｆ
ａｒｃｉａ＋１ｎｉｓ）、ラクトバチルス舎７フーメン
テイテ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎ
ｔａｔｅ）、ラクトバチルスψ７アーメンタム（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｉｅｎｔｕ＋ａ）、ラク
トバチルス・７ラクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチル
ス＋７ラクトーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカ
ス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃ
ｕｓ）、ラクトバチルス・ヘテロヒオチ（Ｌａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｈｉｏｃｈｉ）、ラク
トバチルス・ヒル〃−ディ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｈｉｌＨａｒｄｉｉ）、ラクトバチルス・ホモヒ
オチ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｍｏｈｉ。
ｃｈｉ）、ラクトバチルス・ジエンセニイ（Ｌ ａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトバ
チルス−ラクテイス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
１ａｃｔｉｓ）、ラクトバチルスΦライヒマンニイ（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ
）、ラクトバチルス・マレ７アーメンタンス（Ｌ ａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎ
ｓ）、ラクトバチルス０マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｍａｌｉ）、ラクトバチルス”？ルタロミカス
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｗａｌｔａｒｏｍｉ
ｃｕｓ）、ラクトバチルス・ミヌタス（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｗｉｎｕｔｕｓ）、ラクトバチルス・
ベントアセティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｅｎｔｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・プラ
ンタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａ
ｒｕｍ）、ラクトバチルス−ｏゴセ（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｒｏｇｏｓａｅ）、ラクトバチルス・ル
ミニス（Ｌ ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｕｌＩＩｉｎ
ｉｓ）、ラクトバチルス・サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓａｋｅ）、ラクトバチルス・ラリバリラス（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉａｌｉｖａｒｉｕｓ）
、ラクトバチルスφサン７ランジス）（Ｌａｃｔｏｂａ
ｅｉｌｌｕｓ ５ａｎｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、ラクト
バチルス・サーモフィラス（Ｌ ａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉ ｌ Ｉｕｓ）、ラクトバチル
ス・トリコデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｓ）、ラクトバチルス・ビリデツセンス（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ
）、ラクトバチルス・ビチュリナス（Ｌ ａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓｖｉｔｕｌｉｎｕｓ）及びラクトバチルス
・キシロサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌ
ｏｓｕｓ）。
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトバ
チルス−ラクテイス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
１ａｃｔｉｓ）、ラクトバチルスΦライヒマンニイ（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ
）、ラクトバチルス・マレ７アーメンタンス（Ｌ ａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎ
ｓ）、ラクトバチルス０マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｍａｌｉ）、ラクトバチルス”？ルタロミカス
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｗａｌｔａｒｏｍｉ
ｃｕｓ）、ラクトバチルス・ミヌタス（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｗｉｎｕｔｕｓ）、ラクトバチルス・
ベントアセティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｅｎｔｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・プラ
ンタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａ
ｒｕｍ）、ラクトバチルス−ｏゴセ（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｒｏｇｏｓａｅ）、ラクトバチルス・ル
ミニス（Ｌ ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｕｌＩＩｉｎ
ｉｓ）、ラクトバチルス・サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓａｋｅ）、ラクトバチルス・ラリバリラス（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉａｌｉｖａｒｉｕｓ）
、ラクトバチルスφサン７ランジス）（Ｌａｃｔｏｂａ
ｅｉｌｌｕｓ ５ａｎｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、ラクト
バチルス・サーモフィラス（Ｌ ａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉ ｌ Ｉｕｓ）、ラクトバチル
ス・トリコデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｓ）、ラクトバチルス・ビリデツセンス（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ
）、ラクトバチルス・ビチュリナス（Ｌ ａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓｖｉｔｕｌｉｎｕｓ）及びラクトバチルス
・キシロサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌ
ｏｓｕｓ）。
従来、食品の発酵生産に有用であると認識されている他
の乳酸バクテリアには、ペディオコッカスφハロフィラ
ス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｅｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ
）、ベデイオフツカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、テト
ラコツカス・ツーヤニ（Ｔ ｅｔｒａｃｏｃｃｕｓ
５ｏｙａｅ）、ストレプトコッカス＋７エシウム（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、スト
レプトコッカス令７エカリス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｅｏｃ
ｅｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、ラクトバチルス・デルブレ
ラキイ（Ｌａｅｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕ
ｅｃｋｉｉ）及びラクトバチルス・キャセイ（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）が包含される。
の乳酸バクテリアには、ペディオコッカスφハロフィラ
ス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｅｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ
）、ベデイオフツカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、テト
ラコツカス・ツーヤニ（Ｔ ｅｔｒａｃｏｃｃｕｓ
５ｏｙａｅ）、ストレプトコッカス＋７エシウム（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、スト
レプトコッカス令７エカリス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｅｏｃ
ｅｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、ラクトバチルス・デルブレ
ラキイ（Ｌａｅｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕ
ｅｃｋｉｉ）及びラクトバチルス・キャセイ（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）が包含される。
本発明は以下ストレプトコッカス・ラクテイスＬ Ｍ
０２３０株の遺伝的形質転換について記述するが、本発
明を前記節で言及したような他の乳酸バクテリアの遺伝
的修飾のためにも用いることができることを理解すべき
である。
０２３０株の遺伝的形質転換について記述するが、本発
明を前記節で言及したような他の乳酸バクテリアの遺伝
的修飾のためにも用いることができることを理解すべき
である。
なお、上記ストレプトコッカス・ラクテイスしＭＯ２３
０株は、ストレプトコッカス・ラクテイスＴＲ８１−Ａ
と同遺伝子型である。上記ＴＲ８１−Ａ株はプグベスト
条約のちとにＡ ′Ｉ” ＣＣに国際寄託されＡＴＣＣ
５３１４６の番号が付されている。この菌株はその同遺
伝子型のバックグラウンドに１つの追加のプラスミドを
有しているが、本明細書に記載した方法のためには、Ｔ
Ｒ８Ｉ−Ａ株は前記ＬＭＯ２３０株と同じである。
０株は、ストレプトコッカス・ラクテイスＴＲ８１−Ａ
と同遺伝子型である。上記ＴＲ８１−Ａ株はプグベスト
条約のちとにＡ ′Ｉ” ＣＣに国際寄託されＡＴＣＣ
５３１４６の番号が付されている。この菌株はその同遺
伝子型のバックグラウンドに１つの追加のプラスミドを
有しているが、本明細書に記載した方法のためには、Ｔ
Ｒ８Ｉ−Ａ株は前記ＬＭＯ２３０株と同じである。
形質転換に先立って、Ｓ、ラクテイス菌体を、資化し得
る炭素源及び窒素源、並びに必須微量元素及び成長因子
を含有する栄養発酵培地中で６００ｎｏ＋の光学密度（
０，Ｄ、）で例えば約０．８９（すなわち約１０８菌体
／Ｌ１１２）になるまで増殖させることができる。つい
で培養液から例えば遠心分離によって培養菌体を集菌し
、洗浄する。
る炭素源及び窒素源、並びに必須微量元素及び成長因子
を含有する栄養発酵培地中で６００ｎｏ＋の光学密度（
０，Ｄ、）で例えば約０．８９（すなわち約１０８菌体
／Ｌ１１２）になるまで増殖させることができる。つい
で培養液から例えば遠心分離によって培養菌体を集菌し
、洗浄する。
洗浄された非プロトプラスト化菌体を生理的に許容し得
る形質転換用溶液に懸濁する。
る形質転換用溶液に懸濁する。
特に好ましい態様においては、菌体を生理的に許容し得
る高張溶液（例えば０．ＯＩＭ）リス、ｐＨ７，０で緩
衝化した０、５Ｍショ糖もしくは０．５Ｍソルビトール
溶液）中に懸濁して菌体を形質転換用に馴化する。３７
℃で約１時間のインキュベーションによって菌体が形質
転換用に馴化される（ａｃｃｌｉｍａｔｅ）ことが見い
出された６薗体を上述の溶液中でインキュベートして形
質転換用に馴化することによって、非プロトプラスト化
菌体の形質転換効率が実質的に改良されることが見い出
された。例えば非プロトプラスト化菌体を０．５Ｍシヨ
糖中３７℃で約１時間インキュベートした場合、該菌体
を０．５Ｍシヨ糖中３７℃で約１５分間インキュベート
した場合に比べ形質転換体の回数は約２０グサイクル増
加した。
る高張溶液（例えば０．ＯＩＭ）リス、ｐＨ７，０で緩
衝化した０、５Ｍショ糖もしくは０．５Ｍソルビトール
溶液）中に懸濁して菌体を形質転換用に馴化する。３７
℃で約１時間のインキュベーションによって菌体が形質
転換用に馴化される（ａｃｃｌｉｍａｔｅ）ことが見い
出された６薗体を上述の溶液中でインキュベートして形
質転換用に馴化することによって、非プロトプラスト化
菌体の形質転換効率が実質的に改良されることが見い出
された。例えば非プロトプラスト化菌体を０．５Ｍシヨ
糖中３７℃で約１時間インキュベートした場合、該菌体
を０．５Ｍシヨ糖中３７℃で約１５分間インキュベート
した場合に比べ形質転換体の回数は約２０グサイクル増
加した。
馴化した菌体を遠心分離によってペレット化し、ＤＮＡ
による菌体の形質転換のための、生理的に許容し得る高
張溶液中で裸の（ｎａｋｅｄ）Ｄ Ｎ Ａ （Ａａ状も
しくは環状プラスミド）と混合する。形質転換体数は、
ショ糖溶液中非プロトプラスト化菌体の懸濁液０．５１
に対し、０．４８〜１１．９μ８ＤＮＡの範囲に亘って
、ＤＮＡ濃度の増加に従って増加することが見い出され
た。この範囲及び用いられた条件において、形質転換効
率はテス）ＤＮＡのもつとも低いｉ（０，４８μｇ）で
もつとも高かった。この現象はＤＮＡの保存と形質転換
体数の最大化との闇の釣合いを示している。
による菌体の形質転換のための、生理的に許容し得る高
張溶液中で裸の（ｎａｋｅｄ）Ｄ Ｎ Ａ （Ａａ状も
しくは環状プラスミド）と混合する。形質転換体数は、
ショ糖溶液中非プロトプラスト化菌体の懸濁液０．５１
に対し、０．４８〜１１．９μ８ＤＮＡの範囲に亘って
、ＤＮＡ濃度の増加に従って増加することが見い出され
た。この範囲及び用いられた条件において、形質転換効
率はテス）ＤＮＡのもつとも低いｉ（０，４８μｇ）で
もつとも高かった。この現象はＤＮＡの保存と形質転換
体数の最大化との闇の釣合いを示している。
一方、菌体密度に関しては、本発明の方法ではテストさ
れたもつとも高い菌体密度（６００ｎｍでの光学密度（
０，Ｄ、）０．８９、すなわちコロニー数Ｉ Ｘ １０
”ｃｆｕ／ ｖ＋１ ）で最大の形質転換効率が達成
されることが見い出された。この点は、低い菌体濃度が
推奨される従来既知のプロトプラスト依存形質転換法と
対照的である。形質転換体は０、Ｄ、０．１３〜０．８
９の菌体密度で回収した。
れたもつとも高い菌体密度（６００ｎｍでの光学密度（
０，Ｄ、）０．８９、すなわちコロニー数Ｉ Ｘ １０
”ｃｆｕ／ ｖ＋１ ）で最大の形質転換効率が達成
されることが見い出された。この点は、低い菌体濃度が
推奨される従来既知のプロトプラスト依存形質転換法と
対照的である。形質転換体は０、Ｄ、０．１３〜０．８
９の菌体密度で回収した。
形質転換混合物を形成させるのに、非プロトプラスト化
菌体及びＤＮＡを含有する溶液を形質転換を促進する量
の水溶性低級ポリアルキレングリコール、例えば約５重
量％以上の水溶性ポリエチレングリコール（Ｐ Ｅ Ｇ
）もしくは低分子量ポリプロピレングリコール（ＰＰ
Ｇ）を含有する溶液と一緒にする。
菌体及びＤＮＡを含有する溶液を形質転換を促進する量
の水溶性低級ポリアルキレングリコール、例えば約５重
量％以上の水溶性ポリエチレングリコール（Ｐ Ｅ Ｇ
）もしくは低分子量ポリプロピレングリコール（ＰＰ
Ｇ）を含有する溶液と一緒にする。
本発明の一態様によれば平均分子量約１０００〜約８０
００のポリエチレングリコールを約３０〜３５重量％含
有するＰＥＧ溶液を用いる。
００のポリエチレングリコールを約３０〜３５重量％含
有するＰＥＧ溶液を用いる。
好ましい態様においては、ポリアルキレングリコール（
例えばＰＥＧ）溶液は約Ｏ℃で、ＤＮＡ／薗体混合体混
合物するショ糖溶液の容積の３〜４倍容積を有している
。
例えばＰＥＧ）溶液は約Ｏ℃で、ＤＮＡ／薗体混合体混
合物するショ糖溶液の容積の３〜４倍容積を有している
。
より好ましい態様においては、ポリエチレングリコール
溶液は平均分子量約３０００以上のポリエチレングリコ
ールを約０．５Ｍコハク酸ナトリウムを含有する、緩衝
化した水溶液に溶解することによって調製する。
溶液は平均分子量約３０００以上のポリエチレングリコ
ールを約０．５Ｍコハク酸ナトリウムを含有する、緩衝
化した水溶液に溶解することによって調製する。
特に好ましい態様においては、ポリエチレングリコール
の平均分子量は約５０００以上である。
の平均分子量は約５０００以上である。
ポリエチレングリコール溶液を用いる形質転換は室温で
行われたが、上記のごとく、非プロトプラスト化菌体及
びＤＮＡを含有するショ糖溶液と一緒にする際のポリエ
チレングリコール溶液の温度は約０℃であるのが有利で
ある。好ましい態様においては、分子ｉ６０００〜８０
００のポリエチレングリコールの約３５重量％溶液であ
って約０℃のものを用いる。
行われたが、上記のごとく、非プロトプラスト化菌体及
びＤＮＡを含有するショ糖溶液と一緒にする際のポリエ
チレングリコール溶液の温度は約０℃であるのが有利で
ある。好ましい態様においては、分子ｉ６０００〜８０
００のポリエチレングリコールの約３５重量％溶液であ
って約０℃のものを用いる。
ポリエチレングリコールが広いｐＨ域、例えば約５．０
〜約８．５のｒ＋Ｈ域に亘って形質転換を有効に促進す
ることが見い出された。特に好ましい態様においては、
形質転換溶液のｐＨは約６゜５〜７．０である。
〜約８．５のｒ＋Ｈ域に亘って形質転換を有効に促進す
ることが見い出された。特に好ましい態様においては、
形質転換溶液のｐＨは約６゜５〜７．０である。
３０〜３５重量％のポリエチレングリコール溶液と、非
プロトプラスト化菌体及びＤＮＡを含有する高張溶液と
を一緒にすることによって、約２０〜３５重１％のポリ
エチレングリコール溶液中の形質転換混合物が得られる
。形質転換混合物含有溶液が約２５〜約３０重量％のポ
リエチレングリコールを含有するのが最も好ましい。
プロトプラスト化菌体及びＤＮＡを含有する高張溶液と
を一緒にすることによって、約２０〜３５重１％のポリ
エチレングリコール溶液中の形質転換混合物が得られる
。形質転換混合物含有溶液が約２５〜約３０重量％のポ
リエチレングリコールを含有するのが最も好ましい。
好ましい態様においては、非プロトプラスト化菌体、Ｄ
ＮＡ及びぼりエチレングリコールを含有する高張形質転
換溶液をインキュベートしてＤＮＡによる非プロトプラ
スト化菌体の形質転換を竹わせる。−態様によれば、形
質転換混合物を約室温で約２０分間インキュベートし、
ついで形質転換促進温度で形質転換を促進する時間、例
えば約４０〜約４５℃で約２〜約１０分間熱ショックを
与える。
ＮＡ及びぼりエチレングリコールを含有する高張形質転
換溶液をインキュベートしてＤＮＡによる非プロトプラ
スト化菌体の形質転換を竹わせる。−態様によれば、形
質転換混合物を約室温で約２０分間インキュベートし、
ついで形質転換促進温度で形質転換を促進する時間、例
えば約４０〜約４５℃で約２〜約１０分間熱ショックを
与える。
特に好ましい態様においては、形質転換混合物を室温で
約２０分間インキュベートした後、約４２℃で約５分間
熱ショックを与える。形質転換溶液混合物のインキュベ
ーションに続く４２℃、５分の熱ショックにより、熱シ
ョック工程なしの場合に比べ形質転換体の回収が２倍に
なることが見い出された。
約２０分間インキュベートした後、約４２℃で約５分間
熱ショックを与える。形質転換溶液混合物のインキュベ
ーションに続く４２℃、５分の熱ショックにより、熱シ
ョック工程なしの場合に比べ形質転換体の回収が２倍に
なることが見い出された。
形質転換菌体は寒天平板のような栄養選択培地上で増殖
させる。平板培地が高い量の非栄養炭水化物を含有して
いるのが有利である。特に好ましい態様においては、形
質転換菌体を、浸透安定化剤として約０．５Ｍショ糖を
含有する栄養寒天のような浸透的に安定な栄養平板培地
上で培会する。
させる。平板培地が高い量の非栄養炭水化物を含有して
いるのが有利である。特に好ましい態様においては、形
質転換菌体を、浸透安定化剤として約０．５Ｍショ糖を
含有する栄養寒天のような浸透的に安定な栄養平板培地
上で培会する。
浸透的に安定化した培地上で形質転換された菌体を平板
培養することが形質転換体の回収を容易にすることが見
い出された。理論的根拠はないが、形質転換後の菌体は
ある程度浸透感受性を有しているようである。
培養することが形質転換体の回収を容易にすることが見
い出された。理論的根拠はないが、形質転換後の菌体は
ある程度浸透感受性を有しているようである。
形質転換体を選択するために、非プロトプラスト化菌体
の形質転換に用いるＤＮＡは１もしくはそれ以上の選択
し得る表現型マーカーを含んでいるのが有利である。表
現型による形質転換体の選択はよく知られている。選択
し得る表現型マーカーのふつうの例は抗生物質耐性の遺
伝子フードである。形質転換体は、非形質転換菌体の増
殖を阻止する培地、例えば挿入されたＤＮＡ上に担持さ
れた遺伝子によって菌体がそれに耐性とされた抗生物質
を含有する寒天上に、菌体を平板培養することによって
選択することができる。
の形質転換に用いるＤＮＡは１もしくはそれ以上の選択
し得る表現型マーカーを含んでいるのが有利である。表
現型による形質転換体の選択はよく知られている。選択
し得る表現型マーカーのふつうの例は抗生物質耐性の遺
伝子フードである。形質転換体は、非形質転換菌体の増
殖を阻止する培地、例えば挿入されたＤＮＡ上に担持さ
れた遺伝子によって菌体がそれに耐性とされた抗生物質
を含有する寒天上に、菌体を平板培養することによって
選択することができる。
本発明を以下実施例によって説明するが、本発明はそれ
に限定されるものではない。
に限定されるものではない。
実施例１
ｐ、 Ｓ Ａ ３ びｃ２φＤＮＡを用いるＳ、ラク
テイスの菌体まるごとの形質転換 Ｓ、ラクテイスＬＭＯ２３０株［最初の株名Ｃ１４５Ｓ
Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ、 ＋Ａｐｐ
１．Ｅｎｖｉｒ。
テイスの菌体まるごとの形質転換 Ｓ、ラクテイスＬＭＯ２３０株［最初の株名Ｃ１４５Ｓ
Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ、 ＋Ａｐｐ
１．Ｅｎｖｉｒ。
ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 、３５，５９２−６００
（１９７８）］を凍結シードバイアルからＭ１？−グル
コースブロス［Ｔｅｒｚａｇｂｉ ｅｔ ａｔ、
＋Ａｐｐ１． ＥｎｖｉｒｏｎｏＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、
、２９，８０７ ８１３（１９７５）］に植ＭＬ、３
２”Ｃで一夜増殖させた。Ｍ１７−グルコースブロス（
Ｍ１７ ｇｌｕとよぷことがある）はＴｅｒｚａｇｈ
ｉらのプロスの乳糖をグルコースに変えたものであり、
酵母エキス２．５ｇ、フイトンベプトン（ｐｈｙｔｏｎ
ｅ ｐｅｐｔｏｎｅ） ５ 、 Ｏｇ、ポリペプト
ンペプトン５．０ｇ、ビーフェキストラクト５４０ｇ１
グルコース５．Ｏｇ、β−グリセロリン酸塩１９ｇ１ア
スコルビン酸０．５ｇ、Ｉ Ｍ Ｍ ｇＳ Ｏ＋１
ｍＪ２ 、及！／ Ｈ２０１１全含有する。
（１９７８）］を凍結シードバイアルからＭ１？−グル
コースブロス［Ｔｅｒｚａｇｂｉ ｅｔ ａｔ、
＋Ａｐｐ１． ＥｎｖｉｒｏｎｏＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、
、２９，８０７ ８１３（１９７５）］に植ＭＬ、３
２”Ｃで一夜増殖させた。Ｍ１７−グルコースブロス（
Ｍ１７ ｇｌｕとよぷことがある）はＴｅｒｚａｇｈ
ｉらのプロスの乳糖をグルコースに変えたものであり、
酵母エキス２．５ｇ、フイトンベプトン（ｐｈｙｔｏｎ
ｅ ｐｅｐｔｏｎｅ） ５ 、 Ｏｇ、ポリペプト
ンペプトン５．０ｇ、ビーフェキストラクト５４０ｇ１
グルコース５．Ｏｇ、β−グリセロリン酸塩１９ｇ１ア
スコルビン酸０．５ｇ、Ｉ Ｍ Ｍ ｇＳ Ｏ＋１
ｍＪ２ 、及！／ Ｈ２０１１全含有する。
−夜増殖させた菌体の０．３ｍｎをＭ１７−グルコース
ブロス３０ｍ１に移し、３２℃水浴中で２時間増殖ｚせ
な。ついで６０ｏｏｒｐＩｌ（ｓ８３４ソーパルロータ
ー（ｓｏｒｖａｌ ｒｏｔｏｒ））で１５分遠心分離
して菌体を集菌した。集菌菌体を水冷した０゜０１Ｍト
リス、ｐＨ７，０（）リス塩基１．２１ｇを脱イオン水
１２に溶解し、ＨＣＩでｐＨ７，０に調整し、ついでオ
ートクレーブ殺菌して調製した）２０槍２で１回洗浄し
、再び６０００ ｒｐｍでベレット化した。
ブロス３０ｍ１に移し、３２℃水浴中で２時間増殖ｚせ
な。ついで６０ｏｏｒｐＩｌ（ｓ８３４ソーパルロータ
ー（ｓｏｒｖａｌ ｒｏｔｏｒ））で１５分遠心分離
して菌体を集菌した。集菌菌体を水冷した０゜０１Ｍト
リス、ｐＨ７，０（）リス塩基１．２１ｇを脱イオン水
１２に溶解し、ＨＣＩでｐＨ７，０に調整し、ついでオ
ートクレーブ殺菌して調製した）２０槍２で１回洗浄し
、再び６０００ ｒｐｍでベレット化した。
ベレット菌体を０．５Ｍショ糖（ｏ、０Ｍトリス、ｐＨ
７，０中）７．６ｍｌに再）ぢ濁し、３７℃で６０分イ
ンキュベートした。菌体をｓｏｏ。
７，０中）７．６ｍｌに再）ぢ濁し、３７℃で６０分イ
ンキュベートした。菌体をｓｏｏ。
ｒｐａ＋、１５℃１１０分の条件で再ベレット化した。
ついで菌体を、シヨ糖８５．５８ｇ、マレイン酸１．１
６８、ＭＨＣ１２’ ６Ｈ２０２，０３ｇ及びｄＨ２０
３５０ｍｌを混合し、ｐＨ７、Ｏｉ＝ｉ整し、Ｂ５Ａ３
．０８を加え、水テ５００ｍＪ！ トｔ ル：トによっ
て調製したｒｓＭＭＥ３Ｊ溶液１ｍ１に再懸濁した。こ
の懸濁液を０．５１ずつに分けて清潔な殺菌した管に入
れ、ショ糖ｓｊ、５ｓＦｌ、マレイン酸１．１６ｇ、Ｍ
ｇＣｌ２・６ Ｈ２０２、０３ｇ及ヒｄＨ２０１５０ｍ
ｅ ’；ｉ： ＋１合し、ｐＨ６，５に調整し、水で２
５０ｉｆにすることにより調製した「ｓＭＭＪ溶液（２
つ）と１：１で混合したＤＮＡ（ｐＳＡ３もしくはｃ２
φ）（予めＣｓＣｌ−臭化エチノウム遠心分離により精
製し、１０瞳Ｍトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０中
で透析して脱塩したもの）４μｇを加えた。
６８、ＭＨＣ１２’ ６Ｈ２０２，０３ｇ及びｄＨ２０
３５０ｍｌを混合し、ｐＨ７、Ｏｉ＝ｉ整し、Ｂ５Ａ３
．０８を加え、水テ５００ｍＪ！ トｔ ル：トによっ
て調製したｒｓＭＭＥ３Ｊ溶液１ｍ１に再懸濁した。こ
の懸濁液を０．５１ずつに分けて清潔な殺菌した管に入
れ、ショ糖ｓｊ、５ｓＦｌ、マレイン酸１．１６ｇ、Ｍ
ｇＣｌ２・６ Ｈ２０２、０３ｇ及ヒｄＨ２０１５０ｍ
ｅ ’；ｉ： ＋１合し、ｐＨ６，５に調整し、水で２
５０ｉｆにすることにより調製した「ｓＭＭＪ溶液（２
つ）と１：１で混合したＤＮＡ（ｐＳＡ３もしくはｃ２
φ）（予めＣｓＣｌ−臭化エチノウム遠心分離により精
製し、１０瞳Ｍトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０中
で透析して脱塩したもの）４μｇを加えた。
ｐＳＡ３ＤＮＡもしくはｃ２φＤＮＡを含有する各０．
５ｍｌ液に、水上で溶解した（ｔｈａｌＩＩｅｄ）、分
子ｆｉ８０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０
００）の３５％溶液１．８ｍｊ！を加え形質転換混合物
を形成させた。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８００
０）溶液はＷｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ、 ＋Ｊ。
５ｍｌ液に、水上で溶解した（ｔｈａｌＩＩｅｄ）、分
子ｆｉ８０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０
００）の３５％溶液１．８ｍｊ！を加え形質転換混合物
を形成させた。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８００
０）溶液はＷｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ、 ＋Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 、Ｌ凱り、８３１−８３６（１
９８６）の方法においてショ糖をコハク酸ナトリウムに
代えることによって調製した（つまり、１００ｍＭ）リ
ス、４０ ＩＩＩＭ ＣａＣｌ ２．１０ 鎗Ｍ
ＭｇＣ＋２．５００１Ｍ コハク酸ナトリウム）。形質
転換混合物は室温で２０分インキュベートし、ついで４
２℃で５分熱ショックを与えた。
９８６）の方法においてショ糖をコハク酸ナトリウムに
代えることによって調製した（つまり、１００ｍＭ）リ
ス、４０ ＩＩＩＭ ＣａＣｌ ２．１０ 鎗Ｍ
ＭｇＣ＋２．５００１Ｍ コハク酸ナトリウム）。形質
転換混合物は室温で２０分インキュベートし、ついで４
２℃で５分熱ショックを与えた。
形質転換溶液をついでＳＭＭ８５ｍＡで希釈し、５００
０ ｒｐＩｌｌで１０分回転させた。菌体をＳ Ｍ Ｍ
８５ｍｊ！で洗浄し、５０００ｒｐｍで１０分回転させ
た。形質転換した菌体を（２ＸＳＭＭ）：（Ｍ−１７ｇ
１ｕ） Ｉ ＩａＱに再怨濁し、形質転換を０．０５μ
ｇ／ｍｌエリスロマイシンで誘導した。室温で３０分回
りて形質発現させ、ついで管に直接調合したＳＭ １．
７軟寒天１２ＩＩｌＮを加えて菌体を平板化した（各平
板あたり３ｍＪ２）。（３Ｍ１７寒天は上記Ｍ１７グル
コースブロスと同様にして、さらにこれにシヨ糖７１．
１ｇ及び寒天を加えて調製する。各プレートは次のよう
にして調製した：上掛け７ｇ／２、底寒天１５ｇ／ｊり
。植苗後各平板を３２℃で２〜４日インキュベートした
。プラスミドｐＳＡ３形質転換体は１０μｇ／ｍｇエリ
スロマイシンを用いて、他方ｃ２φ形質転換体はＬＭＯ
２３０標識菌体中のプラーク形成単位として選択した（
ｃ２φはＪａｒｕｉｓ ｅｔ ａｔ、 １Ａｐｐｌ
、 Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、５１．
１２１２−１２７７（１９８６）に記述されている）。
０ ｒｐＩｌｌで１０分回転させた。菌体をＳ Ｍ Ｍ
８５ｍｊ！で洗浄し、５０００ｒｐｍで１０分回転させ
た。形質転換した菌体を（２ＸＳＭＭ）：（Ｍ−１７ｇ
１ｕ） Ｉ ＩａＱに再怨濁し、形質転換を０．０５μ
ｇ／ｍｌエリスロマイシンで誘導した。室温で３０分回
りて形質発現させ、ついで管に直接調合したＳＭ １．
７軟寒天１２ＩＩｌＮを加えて菌体を平板化した（各平
板あたり３ｍＪ２）。（３Ｍ１７寒天は上記Ｍ１７グル
コースブロスと同様にして、さらにこれにシヨ糖７１．
１ｇ及び寒天を加えて調製する。各プレートは次のよう
にして調製した：上掛け７ｇ／２、底寒天１５ｇ／ｊり
。植苗後各平板を３２℃で２〜４日インキュベートした
。プラスミドｐＳＡ３形質転換体は１０μｇ／ｍｇエリ
スロマイシンを用いて、他方ｃ２φ形質転換体はＬＭＯ
２３０標識菌体中のプラーク形成単位として選択した（
ｃ２φはＪａｒｕｉｓ ｅｔ ａｔ、 １Ａｐｐｌ
、 Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、５１．
１２１２−１２７７（１９８６）に記述されている）。
実施例２
Ｓ、ラクテイスＬＭＯ２３０のプロトプラストイ及び非
プロトプラスト化菌体のトランスフェクション 非プロトプラスト化菌体及び酵素温度を変えてプロトプ
ラスト化した菌体のトランスフェクションを比較した。
プロトプラスト化菌体のトランスフェクション 非プロトプラスト化菌体及び酵素温度を変えてプロトプ
ラスト化した菌体のトランスフェクションを比較した。
その条件及び結果は第１表に示す通りである。
第１表
酵素処理及び非処理下でのＬＭＯ２３０へのｃ２ムタノ
リシン’ ３００ ＜１０ ＜１０ ＜１０
７ボザイム２ ７０ ＜１０ ３５０ ＜１０
１、使用方法は以下の変更を加えた、前出Ｋｏｎｄｏ
ｅｔ ａｔ、によった。すなわも、ＬＭ０２３０楳
識菌体はプラーク検出のため、Ｍ１７−ｇｌｕ上でトラ
ンスフェクト化菌体くトランス７エクタント）を用いて
プレート化した。又、ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙ
ｓｉｎ）は最終濃度６．２５μｇ／ａ＋βで用いた。
リシン’ ３００ ＜１０ ＜１０ ＜１０
７ボザイム２ ７０ ＜１０ ３５０ ＜１０
１、使用方法は以下の変更を加えた、前出Ｋｏｎｄｏ
ｅｔ ａｔ、によった。すなわも、ＬＭ０２３０楳
識菌体はプラーク検出のため、Ｍ１７−ｇｌｕ上でトラ
ンスフェクト化菌体くトランス７エクタント）を用いて
プレート化した。又、ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙ
ｓｉｎ）は最終濃度６．２５μｇ／ａ＋βで用いた。
２、用いた方法は以下の修正を加えた実施例１によった
。すなわち、／ボザイム（ｎｏｖｏｚｙｍｅ）（ｉａｌ
ｌ）８度０． ６６ｍｇ／ｍｊ！ ）ヲ３７℃、１時間
のインキュベーションに先立って加えた。熱ショックは
省いた。ＰＥＧ−１０００をＰＥＧ−８０００に代えて
用いた。さらに標識菌体はトランス７エクタントを用い
てＭ１７−ｇｌｕ寒天上でプレート化した。
。すなわち、／ボザイム（ｎｏｖｏｚｙｍｅ）（ｉａｌ
ｌ）８度０． ６６ｍｇ／ｍｊ！ ）ヲ３７℃、１時間
のインキュベーションに先立って加えた。熱ショックは
省いた。ＰＥＧ−１０００をＰＥＧ−８０００に代えて
用いた。さらに標識菌体はトランス７エクタントを用い
てＭ１７−ｇｌｕ寒天上でプレート化した。
第１表のデータはもつとも高いトランス７エクタント水
準が本質的に実施例１の方法を用い酵素なしの場合に観
察されることを示している。ムタノリシンを省略するこ
とによって変更したＫ ｏｎｄ。
準が本質的に実施例１の方法を用い酵素なしの場合に観
察されることを示している。ムタノリシンを省略するこ
とによって変更したＫ ｏｎｄ。
らの方法（前出）の場合にはトランス７エクタントは検
出されなかったことが注意される。
出されなかったことが注意される。
実施例３
本実施例では、下の第２表に示す変更を伴った実施例１
の操作を行った。
の操作を行った。
第２表
室温（ＲＴ）及び０℃テノ、３ｏ％ＰＥＧ及ヒ３５％Ｐ
、ＥＧを用イル、ｐｓＡ３のＬＭｏ２３ｏへのＲＴ
６３ ５．３ ２６７ ２２．４０℃
５２ ４．４ ６２５ ５２．５１
、用いた方法は以下の変更を除いて実施例１と同様であ
る。すなわち熱ショックは用いず、ＰＥＧ−ｓｏｏｏに
代えＰＥＧ−１０００を用いた。
、ＥＧを用イル、ｐｓＡ３のＬＭｏ２３ｏへのＲＴ
６３ ５．３ ２６７ ２２．４０℃
５２ ４．４ ６２５ ５２．５１
、用いた方法は以下の変更を除いて実施例１と同様であ
る。すなわち熱ショックは用いず、ＰＥＧ−ｓｏｏｏに
代えＰＥＧ−１０００を用いた。
２、実験あたりＤＮＡｌ１．９μｇを用いた。
＠２表はポリエチレングリコール（Ｐ Ｅ Ｇ ）ｆＡ
度０℃、３５％ＰＥＧで有利な結果が得られたことを示
している。
度０℃、３５％ＰＥＧで有利な結果が得られたことを示
している。
実施例４
Ｓ、ラクテイスＬＭＯ２３０株−ｃ２φＤ ＮＡｔ：′
Ｈするポリエチレングリコール処理の影響トランスフェ
クション１こ対するポリエチレングリコールの影響を第
３表に示す。ＰＥＧを操作から省いたときはトランス７
エクタントは単離されなかったが、このことはＰＥＧが
トランスフェクションのために必要であることを示して
いる。さらにｐＳＡ３ＤＮＡについてＰＩＳ２表で示さ
れたパターンがｃ２φＤＮＡについての第３表でもくり
返された。すなわち、ＤＮＡの最大取込みは０℃近辺の
３５％ＰＥＧを用いる反応においてみられた・
第３表 室温（ＲＴ）及び０℃の３０％ＰＥＧ及び３５％ＰＥＧ
を用いる、ｃ２φＤＮＡによるＬＭＯ２３３０％ＲＴ
３２０ ５２ Ｍｌ）”０℃
１０００１００＜１０ ３５％ＲＴ ８８０ １４０
ＮＤＯ℃ １６００ ２６０ ＜
１０不使用 ＜１０ ＜０．１６
＜１０１、用いた操作は第２表で述べた変更を伴っ
た実施例１の操作と同様である。
Ｈするポリエチレングリコール処理の影響トランスフェ
クション１こ対するポリエチレングリコールの影響を第
３表に示す。ＰＥＧを操作から省いたときはトランス７
エクタントは単離されなかったが、このことはＰＥＧが
トランスフェクションのために必要であることを示して
いる。さらにｐＳＡ３ＤＮＡについてＰＩＳ２表で示さ
れたパターンがｃ２φＤＮＡについての第３表でもくり
返された。すなわち、ＤＮＡの最大取込みは０℃近辺の
３５％ＰＥＧを用いる反応においてみられた・
第３表 室温（ＲＴ）及び０℃の３０％ＰＥＧ及び３５％ＰＥＧ
を用いる、ｃ２φＤＮＡによるＬＭＯ２３３０％ＲＴ
３２０ ５２ Ｍｌ）”０℃
１０００１００＜１０ ３５％ＲＴ ８８０ １４０
ＮＤＯ℃ １６００ ２６０ ＜
１０不使用 ＜１０ ＜０．１６
＜１０１、用いた操作は第２表で述べた変更を伴っ
た実施例１の操作と同様である。
２、ＮＤ 定量せず
３、実験あたり６．２μｇのＤＮＡを使用した。
実際例５
形ｌ） に・するＤＮＡ゛度の影響
０〜１１．９μｇに亘るＤＮＡ濃度を形質転換反応あた
り加え、熱ショックを省き、ＰＥＧ−８０００に代えＰ
ＥＧ−１０００を用いた以外は実施例１の方法に従って
ＬＭＯ２３０株形質転換体を生産した。第１図はＤＮＡ
使用量を増すと、そのすべてのＤＮＡ濃度について形質
転換の回収率が増加するが、μ、Ｄ Ｎ Ａあたりの最
大形質転換効率はテストしたもっとも低いＤＮＡ濃度（
０゜４μｇ／ Ｄ Ｎ Ａ ）で観察されたことを示し
ている。
り加え、熱ショックを省き、ＰＥＧ−８０００に代えＰ
ＥＧ−１０００を用いた以外は実施例１の方法に従って
ＬＭＯ２３０株形質転換体を生産した。第１図はＤＮＡ
使用量を増すと、そのすべてのＤＮＡ濃度について形質
転換の回収率が増加するが、μ、Ｄ Ｎ Ａあたりの最
大形質転換効率はテストしたもっとも低いＤＮＡ濃度（
０゜４μｇ／ Ｄ Ｎ Ａ ）で観察されたことを示し
ている。
実施例６
プラスミド ５Ａ３ＤＮＡによるＳ、ラクテイスＬＭ０
２３０株の麩１＠換効−に対するポリエチレングリコー
ル分子 の影」 形質転換効率に対するＰＥＧ分子量の影響を調べるため
に、平均分子量１０００．３３５０及１８０００のＰＥ
Ｇを用いる、ｐＳＡ３ＤＮＡに！る形質転換を第４表に
示した変更を伴った、実施例１の操作により行った。
２３０株の麩１＠換効−に対するポリエチレングリコー
ル分子 の影」 形質転換効率に対するＰＥＧ分子量の影響を調べるため
に、平均分子量１０００．３３５０及１８０００のＰＥ
Ｇを用いる、ｐＳＡ３ＤＮＡに！る形質転換を第４表に
示した変更を伴った、実施例１の操作により行った。
第４表
ｐＳＡ３ＤＮＡのＬＭＯ２３０への形質転換１の効１０
００ ４．９Ｘ １０２ ＜
１３３５０
１．５Ｘ １０コ く １８０００
２．４Ｘ １０３＜ １３３５０（ショ
糖）２２，６Ｘ １０２＜ １１、形質転換は以下の変
更を褌っな、実施例１の操作と同様に行った。すなわち
、３５％ＰＥＧ（上記分子量のもの）、ｐＨ７，５を用
い、集菌に先立ち菌体を２時間増殖させ、さらに実験あ
たり２．２μｇのＤＮＡを用いた。
００ ４．９Ｘ １０２ ＜
１３３５０
１．５Ｘ １０コ く １８０００
２．４Ｘ １０３＜ １３３５０（ショ
糖）２２，６Ｘ １０２＜ １１、形質転換は以下の変
更を褌っな、実施例１の操作と同様に行った。すなわち
、３５％ＰＥＧ（上記分子量のもの）、ｐＨ７，５を用
い、集菌に先立ち菌体を２時間増殖させ、さらに実験あ
たり２．２μｇのＤＮＡを用いた。
２、ＰＥＧ？８液を潤製する際コハク酸ナトリウムに代
えショ糖を用いた。
えショ糖を用いた。
第４表に示すごとく、形質転換体の最大数はＰＥＧ−８
０００でみられた。コハク酸ナトリウムをショ糖に代え
ると形質転換体数は約１０グサイクル減じた。
０００でみられた。コハク酸ナトリウムをショ糖に代え
ると形質転換体数は約１０グサイクル減じた。
実施例７
本実施例では実施例１で行った熱ショック工程の利用、
及Ｖ浸透安定化剤としての０．５Ｍショ糖を含有するか
含有しない平板培地を用いる比較を含む、形質転換体の
回収率に影響を与えるパラメーターを試験した。結果を
第２図に示す、＠２図は形質転換体回収率に対する熱シ
ョック処理（４２℃／、５分）の正の影響を示している
。この処理によって形質転換体数は２倍に増加した。
及Ｖ浸透安定化剤としての０．５Ｍショ糖を含有するか
含有しない平板培地を用いる比較を含む、形質転換体の
回収率に影響を与えるパラメーターを試験した。結果を
第２図に示す、＠２図は形質転換体回収率に対する熱シ
ョック処理（４２℃／、５分）の正の影響を示している
。この処理によって形質転換体数は２倍に増加した。
実施例８
種々のプラスミドを用いるＳ、ラクテイスＬＭ植菌し一
夜増殖させたＬＭＯ２３０’Ｍ体を３２℃で４時間増殖
させ（ＯＤ、、、＝０．９）、３５％ＰＥＧ−８０００
ｆ：代、ｔ３０％ＰＥＧ−８０００（ｐＨ６，５）を用
いた以外は、実施例１の形質転換操作をすべての本質的
詳細においてくり返した。
夜増殖させたＬＭＯ２３０’Ｍ体を３２℃で４時間増殖
させ（ＯＤ、、、＝０．９）、３５％ＰＥＧ−８０００
ｆ：代、ｔ３０％ＰＥＧ−８０００（ｐＨ６，５）を用
いた以外は、実施例１の形質転換操作をすべての本質的
詳細においてくり返した。
形質転換に用いたプラスミｋを第７表に掲げる。
第７表
使用プラスミドの説明
１、連鎖球菌（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ ｉ ）中で
形質発現した。
形質発現した。
Ｃｍ ｒ：りｏ７ム７エ＝コールｉｉｔ性、ＥＩＩｌｒ
：エリスロマイシン耐性 ２、Ｄａｏ、Ｍ、Ｌ、及びＦｅｒｒｅｔｔｉｔ Ｊ 、
Ｊ 、Ａｐｐｌ。
：エリスロマイシン耐性 ２、Ｄａｏ、Ｍ、Ｌ、及びＦｅｒｒｅｔｔｉｔ Ｊ 、
Ｊ 、Ａｐｐｌ。
Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 、４９．１
１５−１以±ｆｆｌ プラスミドｐＳＡ３、ｐＡＮ５０及びｐＶＡ８５６ は
Ｓ ｏｌｈａｕｙ、 ｅｔ、 ａｌ、 ｔ Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎＬ ｌｌ１ｔｈＧｅｎｅ Ｆｕｓ
ｉｏｎｓｓ ｐｐ、１４７−１４８（１９８４）に従っ
てエシェリヒア・コリ菌株から単離した。
１５−１以±ｆｆｌ プラスミドｐＳＡ３、ｐＡＮ５０及びｐＶＡ８５６ は
Ｓ ｏｌｈａｕｙ、 ｅｔ、 ａｌ、 ｔ Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎＬ ｌｌ１ｔｈＧｅｎｅ Ｆｕｓ
ｉｏｎｓｓ ｐｐ、１４７−１４８（１９８４）に従っ
てエシェリヒア・コリ菌株から単離した。
５１６１培養ａ（５１＋１ＪＩ！ ｅｕｌｔｕｒｅ）か
らの小規模のＤ ｒ−ＪＡ単離物（ｓｍａｌｌ ５ｃ
ａｌｅ Ｄ Ｎ Ａ １ｓｏｌａｔｉｏｎｓ）を迅
速χｑｕｉｃｋ）プラスミドスクリーニングのために調
製した（ｐｒｅｐａｒｅｄ）。形質転換に使用するＤ
Ｎ Ａのために、その操作を１２菌体用にスケールアッ
プした。イソプロパ／−ルで沈殿させた。ＤＮＡを４０
ｍ１の塩化セシクムー臭化エチノツム勾配、屈折率１．
３９７０に負荷し、Ｂ ｅｃｋｍａｎ Ｔ ｉ ６０
ローター中４７ＱＯＯｒｐ＋＊で４８時間回松させた。
らの小規模のＤ ｒ−ＪＡ単離物（ｓｍａｌｌ ５ｃ
ａｌｅ Ｄ Ｎ Ａ １ｓｏｌａｔｉｏｎｓ）を迅
速χｑｕｉｃｋ）プラスミドスクリーニングのために調
製した（ｐｒｅｐａｒｅｄ）。形質転換に使用するＤ
Ｎ Ａのために、その操作を１２菌体用にスケールアッ
プした。イソプロパ／−ルで沈殿させた。ＤＮＡを４０
ｍ１の塩化セシクムー臭化エチノツム勾配、屈折率１．
３９７０に負荷し、Ｂ ｅｃｋｍａｎ Ｔ ｉ ６０
ローター中４７ＱＯＯｒｐ＋＊で４８時間回松させた。
ＤＮＡをＴＥ援衝液（１０論Ｍトリス、１ｍＭＭ Ｅ
Ｄ Ｔ Ａ 、 ｐ Ｈ８、０）中で一夜透析し、９５
％エタノール２容量及び３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，
２）０．１容量で沈殿させた。ＤＮＡをＴＥ緩衝液に再
懸濁し指示された濃度（ｉｎｄｉｃａｔｅｄｃｏｎｃｅ
ｎｔｒａｔｉｏｎ）にした。変更を加えたＭａｒｍｕｒ
ｗＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、、３，２０８−２１８（１９
６１）方法を用いて、染色体ＤＮＡをＬＭＯ２３０形質
転換体から単離した。Ｍ１７ｇｌｕプラス抗生物質の一
夜培養液からの１０％稙薗量を９ｍｊ！Ｍ１７ ｇｌ
ｕ培養液＋２０ｍＭ Ｄ、Ｌ−トレオニン中に入れ、
３２℃で２時間インキュベートした。菌体を集菌し、冷
０．ＯＩＭ）リス、ｐＨ７，０，１Ｉａｊ！に再懸濁し
、エッペンドル７管（Ｅ ｐｐｅｎｄｏｒｆｔｕｂｅ）
に移した。菌体をペレット化し、２５％ショ糖、５．０
ｍＭ）リス、ｐＨａ、ｏ、２ｍＭＥＤＴＡの５００μ２
に再懸濁した。これらの菌体にリボヌクレアー−４’Ａ
（１０ｍｇ／ｖｒｌ ）６ μｇ、リソチーム（１５塾
ｇ／ｍｌ水）７０μ２を加元、懸濁液を３７℃で１時間
保持した。１０％５Ｄ３４μ！を加えた。懸濁液を逆に
して混合し、室温で２０分保持した。ＤＮＡは２０秒間
旋回する（ｖｏｒｔｅｘ）ことにより断片化した。５０
ｍＭ）リス、ｐＨ８，０＝飽和フェノール：クロロホル
ム（１：１ ）で２回抽出し、ついでクロロホルム：イ
ソアミルアルコール（２４：１）で３回抽出した。ＤＮ
Ａを膜セントリフンン濾過器（ａ ｍｅｉｏｂｒａｎ
ｅ ｃｅｎｔｒｉｃｏｎｆ ｉ Ｉ ｔｅｒ）（Ａ
ｍ１ｃｏｎｔ Ｄ ｌｌｎｕｅｒｓ９Ｍ Ａ ）に通し
、１００μ２に濃縮した。
Ｄ Ｔ Ａ 、 ｐ Ｈ８、０）中で一夜透析し、９５
％エタノール２容量及び３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，
２）０．１容量で沈殿させた。ＤＮＡをＴＥ緩衝液に再
懸濁し指示された濃度（ｉｎｄｉｃａｔｅｄｃｏｎｃｅ
ｎｔｒａｔｉｏｎ）にした。変更を加えたＭａｒｍｕｒ
ｗＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、、３，２０８−２１８（１９
６１）方法を用いて、染色体ＤＮＡをＬＭＯ２３０形質
転換体から単離した。Ｍ１７ｇｌｕプラス抗生物質の一
夜培養液からの１０％稙薗量を９ｍｊ！Ｍ１７ ｇｌ
ｕ培養液＋２０ｍＭ Ｄ、Ｌ−トレオニン中に入れ、
３２℃で２時間インキュベートした。菌体を集菌し、冷
０．ＯＩＭ）リス、ｐＨ７，０，１Ｉａｊ！に再懸濁し
、エッペンドル７管（Ｅ ｐｐｅｎｄｏｒｆｔｕｂｅ）
に移した。菌体をペレット化し、２５％ショ糖、５．０
ｍＭ）リス、ｐＨａ、ｏ、２ｍＭＥＤＴＡの５００μ２
に再懸濁した。これらの菌体にリボヌクレアー−４’Ａ
（１０ｍｇ／ｖｒｌ ）６ μｇ、リソチーム（１５塾
ｇ／ｍｌ水）７０μ２を加元、懸濁液を３７℃で１時間
保持した。１０％５Ｄ３４μ！を加えた。懸濁液を逆に
して混合し、室温で２０分保持した。ＤＮＡは２０秒間
旋回する（ｖｏｒｔｅｘ）ことにより断片化した。５０
ｍＭ）リス、ｐＨ８，０＝飽和フェノール：クロロホル
ム（１：１ ）で２回抽出し、ついでクロロホルム：イ
ソアミルアルコール（２４：１）で３回抽出した。ＤＮ
Ａを膜セントリフンン濾過器（ａ ｍｅｉｏｂｒａｎ
ｅ ｃｅｎｔｒｉｃｏｎｆ ｉ Ｉ ｔｅｒ）（Ａ
ｍ１ｃｏｎｔ Ｄ ｌｌｎｕｅｒｓ９Ｍ Ａ ）に通し
、１００μ２に濃縮した。
プラスミドＤＮＡはｐＭＥｌａＤＮＡＥ製の場合の操作
を除き、Ａ ｎｄｅｒｓｏｎ及Ｖ Ｍ ｃｋａｙ＋ Ａ
ｐｐｌ。
を除き、Ａ ｎｄｅｒｓｏｎ及Ｖ Ｍ ｃｋａｙ＋ Ａ
ｐｐｌ。
Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 、４６．５
４９−５５２（１９８３）の操作を用いてＳ、ラクテイ
スから単離した。プラスミドｐＭＥ１ａはＫ Ｉａｅｎ
ｈａｍｍｅｒ ｅｔａｌ、＋Ａｐｐｌ、 Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ＋３５ ＋５９２−６０
０（１９７８）の溶苗及びＣｓ Ｃｌ ｔ＜ンド（ｂａ
ｎｄｉｎｇ）ｉ作を用いてＬ Ｍ Ｏ２３０から精製し
た。
４９−５５２（１９８３）の操作を用いてＳ、ラクテイ
スから単離した。プラスミドｐＭＥ１ａはＫ Ｉａｅｎ
ｈａｍｍｅｒ ｅｔａｌ、＋Ａｐｐｌ、 Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ＋３５ ＋５９２−６０
０（１９７８）の溶苗及びＣｓ Ｃｌ ｔ＜ンド（ｂａ
ｎｄｉｎｇ）ｉ作を用いてＬ Ｍ Ｏ２３０から精製し
た。
朕ヌＪＡＪ＝
上に注記していない、実施例１の操作からの変更を以下
に述べる。用いたｃ＆役液の組成は次のごとくである。
に述べる。用いたｃ＆役液の組成は次のごとくである。
緩衝溶液である、ＳＭＭ（０，５Ｍショ糖、０．０２Ｍ
マレイン酸塩、０．０２ＭＭｇＣｌ□ｔｐＨ６’、５）
及びＳＭＭＢ（５％ウシ血清アルブミンを加えたＳＭＭ
）は従前より知られ、かつ使用されており、例えばＫｏ
ｎｄｏ ｅｔ ａｌ、ｗ（前出）及ｕＫｏｎｄｏ
ａｎｄ Ｍｃｋａｙ、 Ｊ、 Ｄａｉｒｙ Ｓｃ
ｉ、＊影５，１４２８〜１４３１（１９８２）に記述さ
れている。ポリエチレングリコール溶液は上に注記した
、変更したＷｉｒｔｈらの捉作に従って、指示さｔｌＪ
、：ｐＨのＴＳＣＭ（１００ｍＭ） ’）Ｘ、４０ｍＭ
ＣａＣｌ２．５００＋ｅＭコハク酸ナトリウム）中で作
成した。ショ糖及び塩溶液は別々に高圧加熱滅菌し、つ
いで−緒にした。ＴＳＣＭ中に作成したＰＥＧ溶液は０
．４５μの濾過器を通して濾過し、２ｍｌずつの部分に
分け、使用まで−２０’Ｃで貯蔵した。形ＴＲ転換体は
０．５Ｍショ糖を補ったＭ１７Ｈ１ｕ寒天（Ｓ Ｍ １
７−ｇｌｕ）上で回収した。底及び上部の寒天はそれぞ
れ１．５％及び０．５％の寒天を含んでいた。
マレイン酸塩、０．０２ＭＭｇＣｌ□ｔｐＨ６’、５）
及びＳＭＭＢ（５％ウシ血清アルブミンを加えたＳＭＭ
）は従前より知られ、かつ使用されており、例えばＫｏ
ｎｄｏ ｅｔ ａｌ、ｗ（前出）及ｕＫｏｎｄｏ
ａｎｄ Ｍｃｋａｙ、 Ｊ、 Ｄａｉｒｙ Ｓｃ
ｉ、＊影５，１４２８〜１４３１（１９８２）に記述さ
れている。ポリエチレングリコール溶液は上に注記した
、変更したＷｉｒｔｈらの捉作に従って、指示さｔｌＪ
、：ｐＨのＴＳＣＭ（１００ｍＭ） ’）Ｘ、４０ｍＭ
ＣａＣｌ２．５００＋ｅＭコハク酸ナトリウム）中で作
成した。ショ糖及び塩溶液は別々に高圧加熱滅菌し、つ
いで−緒にした。ＴＳＣＭ中に作成したＰＥＧ溶液は０
．４５μの濾過器を通して濾過し、２ｍｌずつの部分に
分け、使用まで−２０’Ｃで貯蔵した。形ＴＲ転換体は
０．５Ｍショ糖を補ったＭ１７Ｈ１ｕ寒天（Ｓ Ｍ １
７−ｇｌｕ）上で回収した。底及び上部の寒天はそれぞ
れ１．５％及び０．５％の寒天を含んでいた。
第３図はＴＳＣＭ中に作成され、０〜３５％の濃度で使
用されたＰＥＧ−８０００の影響を示す。
用されたＰＥＧ−８０００の影響を示す。
これらの結果は３０％ＰＥＧ−８０００が最大の形質転
換収率を与えること、及ｖＰＥＧ不在の場合は形質転換
は実質上起こらないことを示している。
換収率を与えること、及ｖＰＥＧ不在の場合は形質転換
は実質上起こらないことを示している。
ＰＥＧ溶液のｐＨの影響もテストした。第４図のデータ
はＰＥＧが広範囲のｐＨ（５，５〜８．３）に亘って有
効であることを示している。しかしながら、ｐＨ４，４
では形質転換は有効に阻止された。
はＰＥＧが広範囲のｐＨ（５，５〜８．３）に亘って有
効であることを示している。しかしながら、ｐＨ４，４
では形質転換は有効に阻止された。
形質転換効率に対する菌体密度の影響を調べるために、
ＬＭＯ２３０菌体を１％植苗量で３２℃で１．５．２．
０．３．０及Ｖ４．０時間増殖させた。形質転換体はテ
ストされたもつとも高い菌体密度でより大きな効率で回
収した（第５図）。
ＬＭＯ２３０菌体を１％植苗量で３２℃で１．５．２．
０．３．０及Ｖ４．０時間増殖させた。形質転換体はテ
ストされたもつとも高い菌体密度でより大きな効率で回
収した（第５図）。
４．０時間後の菌体はＡ６゜。０．８８、すなわち生菌
Ｉ Ｘ １０ ”／ ａｌに相当する。これは、低い菌
体密度が推奨されるプロトプラスト繰作（Ｋｏｎｃｌ。
Ｉ Ｘ １０ ”／ ａｌに相当する。これは、低い菌
体密度が推奨されるプロトプラスト繰作（Ｋｏｎｃｌ。
ｅｔ ａｌ、１９８４．前出）と対照的である。
ＤＮＡ添加に先立っての、０．５Ｍショ糖中での菌体の
インキュベーションをテストした。ショ糖中３７℃での
保持時間を６０分から１５分に短縮すると、形質転換体
の回収率が２０グサイクル低下することが見い出された
（第６図）。ゆえにこの工程は菌体を形質転換に適合さ
せるために重要であると考えられる。
インキュベーションをテストした。ショ糖中３７℃での
保持時間を６０分から１５分に短縮すると、形質転換体
の回収率が２０グサイクル低下することが見い出された
（第６図）。ゆえにこの工程は菌体を形質転換に適合さ
せるために重要であると考えられる。
さらに、ＬＭ０２３０の凍結菌体を用いる可能性につい
てテストした。通常レベルに増殖させた菌体をペレット
化し、ベレットとして（安定化剤不使用）もしくは０．
５Ｍショ糖、０．ＯＩＭ）リス（ｐＨ７，０＞中−７０
℃で一夜凍結した。菌体を暖め、対照としての新たに増
殖させた菌体と共に、０．５μ５ｐＳＡ３ ＤＮＡで
形質転換した。
てテストした。通常レベルに増殖させた菌体をペレット
化し、ベレットとして（安定化剤不使用）もしくは０．
５Ｍショ糖、０．ＯＩＭ）リス（ｐＨ７，０＞中−７０
℃で一夜凍結した。菌体を暖め、対照としての新たに増
殖させた菌体と共に、０．５μ５ｐＳＡ３ ＤＮＡで
形質転換した。
２つの凍結菌体調製物は対照の数より約１０グサイクル
低い水準で同等によく形質転換された。
低い水準で同等によく形質転換された。
Ａ ｎｄｅｒｓｏｎ及びＭｃｋａｙ（前出）の操作を用
いて、ＣｓＣ１−ＥＢ勾配によるプラスミドの精製なし
に、ＬＭＯ２３０菌体１０ａ＋２から単離したｐＳＡ３
の形質転換能を調べた６菌体１０ＩＩ１１からのプラス
ミドＤＮＡから７．ｌＸｌ０”形質転換体１−が得られ
た。ゆえに形質転換効率は減少するが、密度勾配による
ＤＮＡの精製は形質転換のために必要ではない。
いて、ＣｓＣ１−ＥＢ勾配によるプラスミドの精製なし
に、ＬＭＯ２３０菌体１０ａ＋２から単離したｐＳＡ３
の形質転換能を調べた６菌体１０ＩＩ１１からのプラス
ミドＤＮＡから７．ｌＸｌ０”形質転換体１−が得られ
た。ゆえに形質転換効率は減少するが、密度勾配による
ＤＮＡの精製は形質転換のために必要ではない。
この形質転換系を連結反応混合物からの線状ＤＮＡに適
用することができれば、Ｅ、コリへの事前の選択なしに
ＬＭＯ２３０中への遺伝子の直接クローニングが可能と
なる。この形質転換系が線状ＤＮＡについても適当であ
ることが、ＥｃｏＲＶで消化したｐＭＥｌａ （１２，
４＃ｇ）ＤＮＡと混合した、比視ＲＶで直線化したｐＳ
Ａ ３ （０、６μｇ）ＤＮＡを用いるテストによっ
て明らかにされた。
用することができれば、Ｅ、コリへの事前の選択なしに
ＬＭＯ２３０中への遺伝子の直接クローニングが可能と
なる。この形質転換系が線状ＤＮＡについても適当であ
ることが、ＥｃｏＲＶで消化したｐＭＥｌａ （１２，
４＃ｇ）ＤＮＡと混合した、比視ＲＶで直線化したｐＳ
Ａ ３ （０、６μｇ）ＤＮＡを用いるテストによっ
て明らかにされた。
これらの消化物を４００単位のＴ４ＤＮＡす〃−ゼを用
い、−夜インキユベートした。対照としてＣｓＣｌで精
製したｐＳＡ３（０，５μｇ）及びそれ自身（２，４μ
ｇ）に再結合したｐｓ Ａ ３をテストした。
い、−夜インキユベートした。対照としてＣｓＣｌで精
製したｐＳＡ３（０，５μｇ）及びそれ自身（２，４μ
ｇ）に再結合したｐｓ Ａ ３をテストした。
ＤＮＡはＥｍｒ！：討する選択’Ｃ’ＬＭＯ２３０中１
：形質転換した。結果を下記第８表に示す。
：形質転換した。結果を下記第８表に示す。
第８表
ｐＭＥｌａのｐｓ Ａ ３への直接クローニングのだめ
の、ＬＭＯ２３０の苗木まるごと形質転換の使用 ｐＭＥ ｌａ １２．４μｓをｐｓ Ａ ３に連結した
。
の、ＬＭＯ２３０の苗木まるごと形質転換の使用 ｐＭＥ ｌａ １２．４μｓをｐｓ Ａ ３に連結した
。
第８表は線状及び／又は再連結したＤＮＡが約２０グサ
イクル低い効率で形質転換したことを示している。しか
しながら、得られた形質転換体の量はｐＭＥｌａのｐｓ
Ａ ３への部分的シーンバンクを確立するには適当で
ある。任意に選んだ２１の形質転換体のプラスミド含量
を調べた。これらの中で６つは挿入ＤＮＡを示しく第６
図）、この形質転換系が直接クローニングに有用である
ことが確立された。
イクル低い効率で形質転換したことを示している。しか
しながら、得られた形質転換体の量はｐＭＥｌａのｐｓ
Ａ ３への部分的シーンバンクを確立するには適当で
ある。任意に選んだ２１の形質転換体のプラスミド含量
を調べた。これらの中で６つは挿入ＤＮＡを示しく第６
図）、この形質転換系が直接クローニングに有用である
ことが確立された。
ｐＶＡ８５６、ｐＡＮ５０及ＶｐＴＶ１を含む追加のプ
ラスミドのＬＭ０２３０への形質転換能についてテスト
した。これらのプラスミドの形質転換の頻度はやや低か
ったが、各場合とも形質転換体を単離できた。プラスミ
ドＤＮＡの存在はアカロースデル電気泳動によって確認
した。Ｔｎ９１７伝達媒体である、ｐＴＶｌのＥ１１ｒ
形質転換体のプラスミドＤＮＡを調べたがいずれも明ら
かでなかった。形質転換体はＴｎ９１７上に維持されて
いるマーカーである、Ｅｌｒに基づいて選択した。
ラスミドのＬＭ０２３０への形質転換能についてテスト
した。これらのプラスミドの形質転換の頻度はやや低か
ったが、各場合とも形質転換体を単離できた。プラスミ
ドＤＮＡの存在はアカロースデル電気泳動によって確認
した。Ｔｎ９１７伝達媒体である、ｐＴＶｌのＥ１１ｒ
形質転換体のプラスミドＤＮＡを調べたがいずれも明ら
かでなかった。形質転換体はＴｎ９１７上に維持されて
いるマーカーである、Ｅｌｒに基づいて選択した。
ゆえに、もし形質転換に続いて転位が起こっていたなら
ば、Ｅ＠’表現型は染色体上に担持されたＴｎり１７か
ら生ずることとなる。このことを４つの形質転換体から
の染色体ＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで切断し、３２ｐ
−で標識したｐＴＶｌでプローブすることによって調べ
た。結果はｐＴＶＩＤＮＡが形質転換体の染色体ＤＮＡ
調製物中に存在することを示した。というのはハイドリ
ッドを形成するＥｃｏＲＩ断片がお互いに及びｐＴＶｌ
と異なる大きさであったからである。ｐＴＶｌからのＤ
Ｎ Ａの組込みが転位によるのか又は相合組換えによ
るのかは不明である。しかしながら、すべての形質転換
体はＥＩＩｒではあるが、Ｃａ＋８であった。このこと
はＴｎ９１７がｐＴＶ１プラスミドＤＮＡを保持するこ
となく組み込まれたことを示している。
ば、Ｅ＠’表現型は染色体上に担持されたＴｎり１７か
ら生ずることとなる。このことを４つの形質転換体から
の染色体ＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで切断し、３２ｐ
−で標識したｐＴＶｌでプローブすることによって調べ
た。結果はｐＴＶＩＤＮＡが形質転換体の染色体ＤＮＡ
調製物中に存在することを示した。というのはハイドリ
ッドを形成するＥｃｏＲＩ断片がお互いに及びｐＴＶｌ
と異なる大きさであったからである。ｐＴＶｌからのＤ
Ｎ Ａの組込みが転位によるのか又は相合組換えによ
るのかは不明である。しかしながら、すべての形質転換
体はＥＩＩｒではあるが、Ｃａ＋８であった。このこと
はＴｎ９１７がｐＴＶ１プラスミドＤＮＡを保持するこ
となく組み込まれたことを示している。
本発明はプロトプラスト依存性でないばかりか、先行の
プロトプラスト依存方法より一貫性があって信頼のおけ
る、乳酸菌の形質転換法を提供する。
プロトプラスト依存方法より一貫性があって信頼のおけ
る、乳酸菌の形質転換法を提供する。
さらに形質転換体は５ｘｉｏ５個／μｇＤ Ｎ Ａの水
準で得ることができたが、これは乳酸菌について報告さ
れたいずれの形質転換頻度よりも大きい。
準で得ることができたが、これは乳酸菌について報告さ
れたいずれの形質転換頻度よりも大きい。
第１図は形質転換体数に対するＤＮＡレベルの増加量の
効果を示すグラフである。 第２図は形質転換レベルに対する熱ショックインキュベ
ーション時間及び回収培地の効果を示すグラフである。 第３図は形質転換体数に対するポリエチレングリコール
濃度の効果を示すグラフである。 第４図は形質転換効率に討するポリエチレングリコール
溶液のｐＨの影響を示すグラフである。 第５図は形質転換に対する菌体密度の影響を示すグラフ
である。 第６図はＤＮＡ添加に先立っての高張溶液中での菌体馴
化の形質転換に対する影響を示すグラフである。 特許出願人 マイルス・ラボラドリース・インコーホレ
ーテッド ｌ−一、 、 ＤＮ Ａ Ｊ’９ 一〇−Ｋシタツフ７し２間１７７”ＩＬ／コーλ纏るＣ
ＩＱつ 丁ｓｃ／′Ｉ中■々”５ｏｏｏのＯ乙 Ｆ Ｉ Ｇ、３ 陥ｑＱＰ日 Ｆ Ｉ Ｇ、 ４ ４殖晴間 （時間ジ ＦＩＧ、５
効果を示すグラフである。 第２図は形質転換レベルに対する熱ショックインキュベ
ーション時間及び回収培地の効果を示すグラフである。 第３図は形質転換体数に対するポリエチレングリコール
濃度の効果を示すグラフである。 第４図は形質転換効率に討するポリエチレングリコール
溶液のｐＨの影響を示すグラフである。 第５図は形質転換に対する菌体密度の影響を示すグラフ
である。 第６図はＤＮＡ添加に先立っての高張溶液中での菌体馴
化の形質転換に対する影響を示すグラフである。 特許出願人 マイルス・ラボラドリース・インコーホレ
ーテッド ｌ−一、 、 ＤＮ Ａ Ｊ’９ 一〇−Ｋシタツフ７し２間１７７”ＩＬ／コーλ纏るＣ
ＩＱつ 丁ｓｃ／′Ｉ中■々”５ｏｏｏのＯ乙 Ｆ Ｉ Ｇ、３ 陥ｑＱＰ日 Ｆ Ｉ Ｇ、 ４ ４殖晴間 （時間ジ ＦＩＧ、５
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）少なくとも約５重量％の水溶性低級ポリアル
キレングリコールを含有する生理的に許容し得る形質転
換溶液中のＤＮＡとグラム陽性乳酸生産性非プロトプラ
スト化バクテリア菌体との混合物を形成させ、そして （ｂ）該混合物をインキュベートして該菌体を該ＤＮＡ
で遺伝的に形質転換する ことを特徴とするグラム陽性乳酸生産性バクテリアをＤ
ＮＡで遺伝的に形質転換する方法。 ２、形質転換溶液が高張溶液である特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ３、ＤＮＡが裸の環状もしくは線状のＤＮＡである特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ４、ＤＮＡがプラスミドである特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ５、該混合物の形成に先立って、該菌体を生理的に許容
し得る高張溶液中でインキュベートして菌体を形質転換
のために馴化する特許請求の範囲第２項記載の方法。 ６、菌体を約０．５Ｍシヨ糖溶液中で約３７℃にて約１
時間インキュベートすることによって形質転換のために
馴化する特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、該低級ポリアルキレングリコールがポリエチレング
リコール又はポリプロピレングリコールである特許請求
の範囲第２項記載の方法。 ８、該グリコールがポリエチレングリコールである特許
請求の範囲第７項記載の方法。 ９、該混合物の形成に先立って、ポリエチレングリコー
ルを、緩衝化した約０．５Ｍコハク酸ナトリウム含有水
溶液に溶解する特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、混合物含有溶液が約２０〜約３５重量％のポリエ
チレングリコールを含有する特許請求の範囲第９項記載
の方法。 １１、混合物含有溶液が約２５〜約３０重量％のポリエ
チレングリコールを含有する特許請求の範囲第１０項記
載の方法。 １２、混合物をほぼ室温でインキュベートして菌体を形
質転換する特許請求の範囲第２項記載の方法。 １３、インキュベーション工程に続いて混合物に熱ショ
ックを与える特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、混合物に約４０〜約４５℃で約２〜約１０分間熱
ショックを与える特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、室温で約２０分のインキュベーションの後、混合
物に約４２℃で約５分熱ショックを与える特許請求の範
囲第１４項記載の方法。 １６、混合物含有溶液のｐＨが約５．０〜８．５である
特許請求の範囲第２項記載の方法。 １７、混合物含有溶液のｐＨが約６．５〜７．０である
特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、ポリエチレングリコールの平均分子量が約１００
０〜約８０００である特許請求の範囲第８項記載の方法
。 １９、ポリエチレングリコールの平均分子量が３０００
以上である特許請求の範囲第８項記載の方法。 ２０、ポリエチレングリコールの平均分子量が５０００
以上である特許請求の範囲第８項記載の方法。 ２１、形質転換した菌体を浸透的に安定な栄養平板培地
上で培養する工程をさらに含む特許請求の範囲第２項記
載の方法。 ２２、該培地が非栄養性炭水化物を含有する特許請求の
範囲第２１項記載の方法。 ２３、該培地が浸透的に安定化させる量のシヨ糖を含有
する特許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２４、平板培地が浸透安定化剤として約０．５Ｍのシヨ
糖を含有する特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５、バクテリア菌体がストレプトコッカス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ）属又はペディオコッカス（Ｐｅｄｉ
ｏｃｏｃｃｕｓ）属に属するバクテリアの菌体である特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ２６、バクテリア菌体がストレプトコッカス・ラクテイ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）種に
属するバクテリアの菌体である特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ２７、形質転換のための菌体の馴化に先立って、菌体を
栄養培地中で約１０＾８菌体／ｍｌの菌体密度になるま
で増殖させる特許請求の範囲第５項記載の方法。 ２８、（ａ）非プロトプラスト化ストレプトコッカス・
ラクテイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）菌体を、菌体にとってその他の点では生理的に許容
し得る高張溶液中でインキュベートして、形質転換のた
めに菌体を馴化し、 （ｂ）菌体に関して高張であるが、該菌体にとってその
他の点では生理的に許容し得る溶液中での馴化された非
プロトプラスト化菌体と裸のＤＮＡとの最初の混合物を
形成させ、 （ｃ）該最初の混合物と、５０００以上の平均分子量を
有するポリエチレングリコールを約３０〜３５重量％含
有する、最初の混合物の容量の約３〜４倍の容量を有す
る約０℃のポリエチレングリコール溶液を一緒にして形
質転換混合物を形成させ、 （ｄ）形質転換混合物をほぼ室温で約２０分間インキュ
ベートし、 （ｅ）インキュベートした形質転換混合物に約４０〜４
５℃で約２〜約１０分間熱ショックを与え、そして （ｆ）形質転換した菌体を浸透的に安定な栄養平板培地
上で培養する ことを特徴とするストレプトコッカス・ラクテイスを裸
のＤＮＡで遺伝的に形質転換する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US91295086A | 1986-09-29 | 1986-09-29 | |
| US912950 | 1986-09-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63102686A true JPS63102686A (ja) | 1988-05-07 |
Family
ID=25432739
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62241009A Pending JPS63102686A (ja) | 1986-09-29 | 1987-09-28 | 乳酸バクテリアの遺伝的形質転換 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0262516A2 (ja) |
| JP (1) | JPS63102686A (ja) |
| AU (1) | AU7897087A (ja) |
| DK (1) | DK509487A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03175978A (ja) * | 1989-09-12 | 1991-07-31 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 細胞接合による新規な乳酸菌、それを利用した醗酵乳及びその製造法 |
| JP2022095663A (ja) * | 2012-10-23 | 2022-06-28 | ツールゲン インコーポレイテッド | 標的ｄｎａに特異的なガイドｒｎａおよびｃａｓタンパク質コード核酸またはｃａｓタンパク質を含む、標的ｄｎａを切断するための組成物、ならびにその使用 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8820951D0 (en) * | 1988-09-07 | 1988-10-05 | Delta Biotechnology Ltd | Fermentation method |
| US5260202A (en) * | 1988-09-07 | 1993-11-09 | Delta Biotechnology Limited | Fermentation method |
| JPH10503643A (ja) * | 1994-06-17 | 1998-04-07 | ネーデルランセ オルハニサチエ フォール トゥーヘパスト−ナツールウェーテンシャッペルック オンデルズク テーエヌオー | 微生物中に遺伝物質を導入する方法およびその方法によってえられる形質転換体 |
| US5656611A (en) * | 1994-11-18 | 1997-08-12 | Supratek Pharma Inc. | Polynucleotide compositions |
| AU2296897A (en) * | 1997-03-20 | 1998-10-20 | Jean James Garreau | Food products based on soybean milk and method for making same |
-
1987
- 1987-09-17 EP EP19870113597 patent/EP0262516A2/en not_active Withdrawn
- 1987-09-25 AU AU78970/87A patent/AU7897087A/en not_active Abandoned
- 1987-09-28 DK DK509487A patent/DK509487A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-09-28 JP JP62241009A patent/JPS63102686A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03175978A (ja) * | 1989-09-12 | 1991-07-31 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 細胞接合による新規な乳酸菌、それを利用した醗酵乳及びその製造法 |
| JP2022095663A (ja) * | 2012-10-23 | 2022-06-28 | ツールゲン インコーポレイテッド | 標的ｄｎａに特異的なガイドｒｎａおよびｃａｓタンパク質コード核酸またはｃａｓタンパク質を含む、標的ｄｎａを切断するための組成物、ならびにその使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0262516A2 (en) | 1988-04-06 |
| DK509487A (da) | 1988-03-30 |
| DK509487D0 (da) | 1987-09-28 |
| AU7897087A (en) | 1988-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20180305777A1 (en) | Phage insensitive streptococcus thermophilus | |
| McKay et al. | Simultaneous loss of proteinase-and lactose-utilizing enzyme activities in Streptococcus lactis and reversal of loss by transduction | |
| Sing et al. | Conjugal transfer of bacteriophage resistance determinants on pTR2030 into Streptococcus cremoris strains | |
| JP3294288B2 (ja) | 乳酸桿菌由来の新規なプラスミドｐＢＵＬ１ 及びその誘導体 | |
| Broadbent et al. | Genetic construction of nisin-producing Lactococcus lactis subsp. cremoris and analysis of a rapid method for conjugation | |
| Turgeon et al. | Isolation and characterization of a Streptococcus thermophilus plasmid closely related to the pMV158 family | |
| Sanders et al. | A method for genetic transformation of nonprotoplasted Streptococcus lactis | |
| Dinsmore et al. | Phenotypic consequences of altering the copy number of abiA, a gene responsible for aborting bacteriophage infections in Lactococcus lactis | |
| JPS63102686A (ja) | 乳酸バクテリアの遺伝的形質転換 | |
| Mercenier et al. | Genetics of Streptococcus thermophilus: a review | |
| WO1995035389A1 (en) | Method for introduction of genetic material into microorganisms and transformants obtained therewith | |
| Lin et al. | Construction of an integrative food-grade cloning vector for Lactobacillus acidophilus | |
| Raya et al. | High-frequency plasmid transduction by Lactobacillus gasseri bacteriophage φadh | |
| US5538864A (en) | Bacteriophage resistant recombinant bacteria | |
| US5459072A (en) | Food-grade integration vectors for industrial bacterial strains | |
| JP2931939B2 (ja) | Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ 種染色体への遺伝子組込み方法及び遺伝子組込み体 | |
| US4883756A (en) | pTN1060, a conjugal plasmid and derivatives thereof that confer phage resistance to group N streptococci | |
| Kondo et al. | Mutanolysin for Improved Lysis and Rapid Protoplast Formation in Dairy Streptococci1 | |
| Zink et al. | Transformation of Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis by electroporation and cloning of origins of replication by use of a positive selection vector | |
| Kleinschmidt et al. | Evaluation of horizontal and vertical gene transfer and stability of heterologous DNA in Streptococcus thermophilus isolated from yogurt and yogurt starter cultures | |
| US5618723A (en) | Method of eliminating genetic routes for bacteriophage evolution and products produced thereby | |
| Zúñiga et al. | Transposons Tn916 and Tn925 can transfer from Enterococcus faecalis to Leuconostoc oenos | |
| US5747310A (en) | Gene integration into chromosomes of lactobacillus delbrueckii species and integrants thereof | |
| EP0246909B1 (en) | Plasmids conferring phage insensitivity on bacteria | |
| JPH0970292A (ja) | 食品微生物染色体へ外来遺伝子を導入する方法、外来遺伝 子導入用ベクターおよび外来遺伝子が導入された形質転換 体 |