WO2003000297A1 - Procede facilitant le transfert d'acides nucleiques - Google Patents

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WO2003000297A1
WO2003000297A1 PCT/JP2002/006137 JP0206137W WO03000297A1 WO 2003000297 A1 WO2003000297 A1 WO 2003000297A1 JP 0206137 W JP0206137 W JP 0206137W WO 03000297 A1 WO03000297 A1 WO 03000297A1
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WO
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nucleic acid
collagen
complex
gene
plasmid dna
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/006137
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masaaki Terada
Takahiro Ochiya
Yu Aso
Kimi Honma
Akihiko Sano
Shunji Nagahara
Original Assignee
Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
Koken Co., Ltd.
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Publication date
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Definitions

  • the present invention belongs to the medical field, particularly to the field of gene therapy and basic research related to genes.
  • the present invention relates to a preparation for promoting the introduction of a desired nucleic acid into a target cell and a method therefor.
  • Gene therapy is a method of treating diseases by supplementing cells with normal genes or repairing and correcting gene defects.Genes such as target enzymes and cytokins are inserted into the cells of patients. The gene is then introduced into the body to produce a target substance, thereby treating the disease. Gene therapy is a treatment that controls the foundation of life activities, and has the potential to treat not only cancer and genetic diseases, but also various other diseases such as AIDS, chronic joint rheumatism, and lifestyle-related diseases.
  • the present inventors have found an unexpected action of collagen, and have found a method for efficiently introducing nucleic acid into desired cells.
  • the combination of collagen and nucleic acids such as plasmid DNA surprisingly forms a complex, which promotes the transfer of nucleic acids into cells and expresses genes for long periods of time.
  • a gene preparation in which a gene is supported on a carrier composed of a biocompatible material such as collagen is disclosed (Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-71542)
  • the gene preparation releases the gene in vivo.
  • a sustained release formulation As a sustained release formulation.
  • the present invention is based on a novel use of collagen or collagen derivatives.
  • the present invention provides (1) an agent for promoting nucleic acid introduction into target cells, comprising collagen or a collagen derivative;
  • nucleic acid transfer promoter containing a complex of collagen or collagen derivative with a desired nucleic acid preferably a nucleic acid transfer promoter in which the complex is a particle, more preferably the complex particle Is 300nn! ⁇ 300m, more preferably 300nra 100 ⁇ m, more preferably 300 nm to 50 ⁇ m, and still more preferably 300 nn!
  • ⁇ 1 the number of nucleotide monomers in the plasmid DNA, preferably 1:50 to 1: the number of nucleotide monomers in the plasmid DNA, more preferably 1:50 to 1: 4000, still more preferably 1:50 to 1: 2000, more preferably Is 1:50 to 1: 1000, or when the nucleic acid is an oligonucleotide, the ratio of the number of collagen or collagen derivative molecules to the number of nucleotide monomers of the oligonucleotide in the complex is 1: 1 to 1: 200, Preferably, the ratio is 1: 3 to 1: 150, more preferably 1:20 to 1: 120, and still more preferably 1:50 to 1: 120. Agent;
  • a method for introducing a desired nucleic acid into a target cell or for improving the expression efficiency of a desired nucleic acid in a target cell comprising using the complex particle of (3) above;
  • a method for examining the function of a gene or a protein in a target cell comprising the nucleic acid encoding the gene or the protein or the nucleic acid that inhibits the expression of the gene or the protein in a cell.
  • the complex particles are applied to a solid phase surface, and the target cells are cultured on the solid phase surface.
  • the expression level of the nucleic acid or the gene or the protein in the target cells, or the cell growth rate Or a method characterized by examining the phenotype;
  • the complex particle of (3) containing a candidate nucleic acid of a nucleic acid that inhibits the expression of a gene involved in a disease in a cell is applied to a solid phase surface, and the disease state is applied on the solid phase surface. And culturing the cells at the expression level of the gene, which is inhibited by each candidate nucleic acid. Or a method of screening for a nucleic acid capable of treating the disease, characterized by examining a cell proliferation rate or a phenotype.
  • the nucleic acid transfer promoter of the present invention exhibited nuclear acid expression in an in vitro cell culture system in which gene expression was not observed with plasmid DNA alone. This indicated that the efficiency of nucleic acid introduction into cells was improved. Furthermore, the ability of the nucleic acid transfer promoter of the present invention to improve the intracellular stability of the nucleic acid was shown by the fact that the expression of the nucleic acid lasts longer than that of the liposomal preparation.
  • collagen interacts with nucleic acids electrostatically and / or physically to form a complex. Therefore, it is considered that the persistence of the nucleic acid expression observed in the Examples is brought about by the improvement of the stability of the nucleic acid in the cells due to the complex formation. This was thought to be due to the fact that the genes and the like encapsulated in the collagen matrix were gradually released by the degradation of collagen by biodegradation. Greatly different.
  • FIG. 1 is a photograph instead of a drawing, showing the results of agarose gel electrophoresis showing the electrostatic interaction between a fixed concentration of plasmid DNA and various concentrations of atelocollagen.
  • FIG. 2 is a photograph instead of a drawing, showing the results of agarose gel electrophoresis showing the effect of sodium chloride on the electrostatic interaction between plasmid DNA and atelocollagen.
  • FIG. 3 is a photograph instead of a drawing, showing the results of agarose gel electrophoresis showing the effect of heparan sulfate on the electrostatic interaction between plasmid DNA and atelocollagen.
  • the left photo shows the results in the absence of heparan sulfate, and the right photo shows the results in the presence of heparan sulfate.
  • FIG. 4 is a photomicrograph showing the shape of a complex of plasmid DNA with various concentrations of mouth mouth collagen.
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing the shape of a complex of plasmid DNA with various concentrations of atelocollagen after storage for one week.
  • Figure 6 shows the gel form of atelocollagen, the cationic ribosome preparation and It is a graph which shows comparison of the gene expression period of plasmid DNA in PBS solution.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between complexes having different collagen concentrations and the efficiency of plasmid DNA introduction 7 days after transfection by the dropping method.
  • FIG. 8 is a graph showing the fluorescence efficiency of plasmid DNA introduction after 7 days in complexes having different collagen concentrations.
  • FIG. 9 is a graph showing the relationship between complexes having different collagen concentrations and the efficiency of plasmid DNA introduction 7 days after transfection by the solid phase coating method.
  • FIG. 10 is a graph showing the relationship between the complexes having different plasmid DNA concentrations and the plasmid DNA introduction efficiency 7 days after the transfection by the dropping method.
  • FIG. 11 is a graph showing the relationship between complexes having different plasmid DNA concentrations and plasmid DNA introduction efficiency after transfection 7 by the solid phase coating method.
  • FIG. 12 is a graph showing fluorescence efficiency of plasmid DNA introduction efficiency 7 days after the transfection by the solid phase coating method and a micrograph showing the fluorescence.
  • FIG. 13 is a graph showing cell growth inhibition in the method of the present invention.
  • FIG. 14 is a graph showing that adenovirus was introduced in a solid-phase application method in a dose-dependent manner, and a micrograph showing the fluorescence thereof.
  • FIG. 15 is a graph showing the relationship between the number of collagen molecules bound to one plasmid DNA molecule and the average major axis of the complex.
  • FIG. 16 is a graph showing the relationship between the number of nucleotide monomers of a desired nucleic acid per collagen molecule and the average major axis of the complex.
  • FIG. 17 is a graph showing the relationship between the ratio of the number of oligonucleotides and collagen molecules during mixing and the number of oligonucleotides bonded to one collagen molecule in the complex.
  • FIG. 18 is a fluorescence micrograph obtained by observing a complex containing an oligonucleotide released from the surface of the cell culture device of the present invention with a fluorescence microscope.
  • FIG. 19 is a fluorescence micrograph obtained by observing a complex containing plasmid DNA released from the surface of the cell culture device of the present invention with a fluorescence microscope.
  • the present invention is an agent for promoting nucleic acid introduction into target cells, which contains collagen or a collagen derivative.
  • This embodiment makes use of the action of collagen or collagen derivative, which has been discovered for the first time, in promoting the introduction of nucleic acid into target cells. That is, the present embodiment provides a novel use of collagen or a collagen derivative for promoting the introduction of a nucleic acid into a target cell.
  • collagen or collagen derivative means any “collagen or collagen derivative” usually used in the medical, cosmetic, industrial and food fields.
  • the collagen it is preferable to use soluble or soluble collagen.
  • Soluble collagen is soluble in acidic or neutral water or salt solution
  • solubilized collagen is enzyme-solubilized collagen that is solubilized by enzymes, It is preferable that there be solubilized collagen, and that V and deviation can pass through a membrane filter having a pore size of 1 micrometer.
  • the degree of cross-linking of collagen used in the present invention is, for example, preferably trimers or less, more preferably 2 or less. Less than the monomer.
  • the molecular weight of the collagen is, for example, preferably from about 300,000 to about 900,000, and more preferably from about 300,000 to about 600,000.
  • Collagen can be used as extracted from any animal species, but is preferably extracted from vertebrates, more preferably extracted from mammals, birds and fish, and more preferably extracted from mammals having a high denaturation temperature. And collagen extracted from birds.
  • the type of collagen may be any type of collagen, but types IV are preferred in view of the amount present in the animal body.
  • type I collagen extracted from the dermis of mammals by acid is used, and more preferably, type I collagen extracted by acid from the dermis of calf, type I collagen produced by genetic engineering, etc. Is mentioned.
  • Collagen derived from tendon is not suitable for the same type I collagen because of its high degree of crosslinking and insolubility.
  • atelocollagen or gene from which telopeptide with high antigenicity is enzymatically removed Engineered atelocollagen is desirable, and aterocollagen having 3 or less tyrosine residues per 100 residues is more preferred.
  • Collagen whose side chains have been modified, cross-linked collagen, or the like can be used as necessary.
  • the side chain-modified collagen include succininolated or methinolated collagen
  • examples of the cross-linked collagen include daltaraldehyde, hexamethylene diisoanatate, and a polyepoxy compound.
  • Examples of the treated collagen include Frederance Journal 1989-12, 104-109, and JP-B-7-59522.
  • a preferred collagen derivative is gelatin or a crosslinked body of gelatin, or a crosslinked body with collagen.
  • Biocompatible materials can be mixed with collagen or collagen derivatives.
  • Biocompatible materials include, for example, gelatin, fibrin, albumin, hyaluronic acid, heparin, chondroitin sulfate, chitin, chitosan, alginic acid, pectin, agarose, hydroxyapatite, polypropylene, polypropylene, polydimethylsiloxane, or Examples thereof include a polymer of glycolic acid, lactic acid or amino acid or a copolymer thereof, or a mixture of two or more of these biocompatible materials.
  • the present invention in the second aspect is an agent for promoting nucleic acid introduction into target cells, comprising a complex containing a desired nucleic acid and collagen or a collagen derivative, preferably a complex particle as an essential component.
  • nucleic acids alone can hardly be introduced into in vitro cells when administered to cells in the presence of serum. By forming a complex with collagen or a collagen derivative, nucleic acid can be efficiently introduced into cells for the first time.
  • the “nucleic acid” may be a polynucleotide or an oligonucleotide, and may be a DNA or an RNA molecule.
  • a DNA molecule it may be a plasmid DNA, a cDNA, a genomic DNA or a synthetic DNA. Both DNA and UNA can be double-stranded or single-stranded. In the case of a single strand, it may be a code strand or a non-coding strand.
  • Nucleic acid refers to DNA derivatives or RNA
  • the derivative includes a nucleic acid having a phosphorothioate bond or a nucleic acid in which a phosphate portion, a sugar portion, and a base portion of an internucleotide are chemically modified to avoid degradation by an enzyme.
  • Nucleic acid also includes viruses such as adenovirus and retrovirus.
  • the "nucleic acid" is an oligonucleotide or lipozyme, preferably a pentamer to 100-mer, more preferably a pentamer to 30-mer oligonucleotide or lipozyme. is there. Plasmid DNA encoding a protein having a biological activity that has a therapeutic or ameliorating effect on disease symptoms, or a plasmid DNA encoding a protein that induces an immune response that has a preventive, therapeutic or ameliorating effect on disease symptoms. More preferred.
  • the nucleic acid is a plasmid DNA or a vector used for gene therapy such as a virus
  • the nucleic acid is preferably in a form configured to express the encoded genetic information in the cell when introduced into the cell.
  • the size of the plasmid DNA as the nucleic acid of the present invention is not particularly limited, and can be efficiently produced by a genetic engineering technique, and when introduced into a cell, a size that can efficiently express genetic information encoded in the cell. It can be selected from among them.
  • nucleic acid transfer promoter of the present invention several types of binders incorporating different desired nucleic acids may be present at the same time.
  • a single vector may be coded with a plurality of genetic information.
  • the amount of the vector contained in the transfer promoter is not particularly limited.
  • Nucleic acids encoding proteins that are required to be expressed during gene therapy include genes that can be used to treat genetic diseases, for example, enzymes such as adenosine deaminase and thymidine kinase, and cytotoxicity such as GM-CSF and IL-2. But not limited to, genes encoding fibroblast growth factor HST-1 (FGF4).
  • FGF4 fibroblast growth factor HST-1
  • the expressed protein or peptide induces immunity as an antigen, and a gene whose purpose is to prevent or treat infectious diseases or tumors. That is, a gene encoding a protein or peptide that can serve as the above antigen, for example, influenza virus Lus surface proteins such as HA and NA or nucleoprotein NP,
  • the nucleic acid is an oligonucleotide
  • at least a part thereof encodes a protein encoding a protein having a physiological effect that disrupts the homeostasis of a living organism, a sense of a gene specific to pathogens, live violence, bacteria, etc.
  • Base sequence that complementarily binds to the antisense strand or the antisense strand under physiological conditions. More specifically, it is a gene specific to pathogenic viruses, bacteria, etc., and a physiological effect that disrupts homeostasis. It is a nucleotide sequence that complementarily binds to the messenger RNA of a gene encoding a protein or the like.
  • the oligonucleotide used in the present invention is, for example, a region containing the initiation codon of the messenger thigh or a sequence complementary to a site where the precursor messenger RA is spliced.
  • examples of the oligonucleotide used for treating or preventing cancer include, for example, 5′-CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3 ′ (sequence No.
  • non-small cell lung cancer and colon cancer by specifically inhibiting the expression of protein kinase C Is effective for prostate cancer, breast cancer, ovarian cancer, knee cancer, colorectal cancer, small cell lung cancer ISIS3521, C-raf key expression It specifically inhibits the expression of ISIS5132 / CGP69846A and Ha-ras, which are being applied to prostate, breast, ovarian, brain, knee, colon, and small cell lung cancers.
  • oligonucleotides used in the treatment of inflammation include Crohn's disease, ulcerative colitis, kidney transplantation, which specifically suppresses the expression of ICAM-1 ISIS2302, which is being applied to rejection inhibition, psoriasis, and asthma; EPI_2010, which is trying to suppress adenosine A1 receptor expression and is being applied to asthma; and TNF-o ;, CD49d (VLA-4 ), VCAM-1, and oligonucleotides that suppress the expression of PECAM-1.
  • examples of oligonucleotides that prevent restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty include Resten-NG that suppresses c-rayc expression.
  • the gene encoding a protein having a physiological effect that disrupts homeostasis include a group of genes called oncogenes. More specifically, for example, a growth factor group, a receptor tyrosine kinase group, a non-receptor tyrosine kinase group, a GTP-binding protein, a serine-threonine kinase group, a transcriptional regulator group, and the like are exemplified. More specifically, for example, a gene encoding hst-1 or ortin decarboxylase and the like can be mentioned.
  • the nucleic acid transfer promoter of the present invention can contain a pharmaceutically acceptable additive, if necessary, in addition to the complex of the present invention.
  • Pharmaceutically acceptable excipients include isotonic agents when the complex is used as an agent, excipients, disintegrants, and coating agents when used as H-regulators, soothing agents, or solids. In Japan, it is described in the Pharmaceutical Excipients Dictionary (edited by the Japan Pharmaceutical Excipients Association). Specific examples include salts and saccharides used to maintain pH at 6 to 8 or to keep cells isotonic.
  • the properties of the nucleic acid transfer promoter of the present invention may be solid or solution.
  • the promoter of the present invention when promoting nucleic acid introduction, it may be used as it is or in a solution form using purified water, physiological saline, a buffer solution isotonic with a living body, or the like. Load cells.
  • Such a nucleic acid transfer promoter in the form of a solution also constitutes a part of the present invention.
  • the method for administering the nucleic acid transfer promoter of the present invention to a living body may be any of oral, injection, ophthalmic, nasal, pulmonary, and absorption through the skin, and is preferably oral or injection.
  • the site of administration can be selected according to the disease, but it can also be placed directly at the site required during surgery.
  • the nucleic acid transfer promoter according to any one of (1) to (4), wherein the collagen has a molecular weight of about 300,000 to about 900,000. (6) the collagen derivative is gelatin or a crosslinked product of gelatin;
  • nucleic acid transfer promoter according to any one of (1) to (7), wherein the nucleic acid is an oligonucleotide
  • nucleic acid transfer promoter according to any one of the above (1) to (7), wherein the nucleic acid is a lipozyme or an oligonucleotide.
  • nucleic acid transfer promoter according to any one of (1) to (7), wherein the nucleic acid is a plasmid DNA.
  • nucleic acid transfer promoter according to the above (13), wherein the plasmid DNA encodes a protein having a physiological activity having a therapeutic or ameliorating effect on disease symptoms.
  • nucleic acid transfer promoter according to the above (13), wherein the plasmid DNA encodes a protein that induces an immune response having a preventive, therapeutic or ameliorating effect on disease symptoms.
  • nucleic acid transfer promoter according to any one of (1) to (16), wherein the nucleic acid transfer promoter is a solution, and contains 10 mg / ml or less of nucleic acid as a complex component.
  • nucleic acid transfer promoter according to the above (17), wherein the nucleic acid contains lmg / ml or less as a complex component.
  • nucleic acid introduction promoter according to the above (18) which contains the nucleic acid as a complex component in an amount of 500 zg / ml or less,
  • nucleic acid transfer promoter according to any one of (1) to (19), which has a pH of 5 to 9, and preferably has a pH of 6 to 8,
  • nucleic acid transfer promoter according to any one of (1) to (22), which comprises a substance that suppresses formation of an aggregate of collagen, such as sucrose or argyun.
  • a third aspect of the present invention is a complex comprising collagen or a collagen derivative and a desired nucleic acid.
  • This complex includes an electrostatic complex that forms a complex by binding with an electrostatic force and a physical complex that forms a complex with a physical force such as a hydrophobic bond. In some cases, both binding modes may be mixed, and such a complex is also included in the complex of the present invention.
  • the term “electrostatic complex” refers to a polyion complex of a collagen or a collagen derivative having a large number of charges in a molecule and a nucleic acid, more specifically, a positively charged collagen or a collagen derivative has a negative charge. A conjugate electrically attracted to the nucleic acid.
  • the polyion complex causes a very large increase in entropy due to the fact that a large number of intramolecular charge interactions are freed during complex formation. Considering the form of such an electrostatic complex, it is considered that the persistence of the nucleic acid expression observed in the examples is brought about by the stabilization of the nucleic acid in the cell by the complex formation.
  • the smallest unit of the complex of the present invention is a complex formed by one molecule of collagen and one molecule of nucleic acid, but we believe that collagen is associated with other collagen in parallel with forming a complex with nucleic acid.
  • the formation of this aggregate is mainly composed of columnar collagen molecules with a diameter of about 300 mn and a diameter of about 1.5 nm, which are mainly associated in parallel with the molecular axis. I do. Therefore, a complex is a complex in which a plurality of aggregates and a plurality of nucleic acid molecules are bonded by non-covalent bonds. The elongation of the aggregates greatly progresses and the fibrous complex whose major axis exceeds lnm. There is a microfibrillar complex bound through the nucleus, and a particulate complex formed by a finer complex with the nucleic acid.
  • the composite of the present invention can take various shapes.
  • the composite of the present invention is preferably a particle.
  • the “particle” has a shape that collagen or a collagen derivative can take, and does not necessarily mean a spherical shape.
  • the size of the composite particle of the present invention is the minimum of 300 nm in the major axis of the complex formed by one molecule of collagen.
  • Particles having a diameter of 300 nm or more: Imm and a long diameter of 300 ⁇ to 300 ⁇ are preferred, more preferably 300 nm to a long diameter of 100 ⁇ m, and still more preferably a long diameter of 300 nn! ⁇ 50m, more preferably 300nn! ⁇ 30 / m.
  • the complex takes various forms due to the ratio of the nucleic acid to the collagen or collagen derivative that makes up the complex, and that the shape of the complex is promoted exclusively by forming a complex with the nucleic acid. It was found that it depends on the progress of aggregate (fiber) formation by collagen or collagen derivatives. Based on the finding in the present invention that hyperplasia of aggregates is unsuitable for the introduction of nucleoacids, we believe that the shape of such complexes can be determined not only by the concentration of the mixed collagen or collagen derivative and the desired nucleic acid, but also by the concentration of collagen. We have found that it can be controlled by adjusting the salt concentration, temperature, pH, and glucose concentration, which are environmental factors that affect aggregate formation.
  • the shape of the complex can affect the efficiency of nucleic acid transfer into cells.
  • the discovery that collagen forms a complex with a nucleic acid and that its shape affects the efficiency of nucleic acid introduction into cells ⁇ expression efficiency has provided a strategy that can optimize nucleic acid introduction efficiency.
  • liposomes used at the laboratory level to introduce nucleic acids into target cells have the property of aggregating immediately after mixing with nucleic acids, and the efficiency of nucleic acid introduction varies from use to use. It needs to be prepared and it is difficult to use it in practice.
  • the complex of the present invention is stored in a cool place, the form does not deteriorate.
  • the biggest challenge in gene transfer technology is that there are few universal methods.
  • the composite of the present invention is a highly realistic technique because the form does not change.
  • this embodiment provides the following invention.
  • the major axis is 300nn! ⁇ 50 / xm, preferably 300nn! ⁇ 30 ⁇ , the said
  • the ratio of the number of collagen or collagen derivative molecules to the number of nucleotide monomers in the plasmid DNA is 1:20 to 1: one nucleotide monomer in the plasmid DNA, preferably 1:50 to 1: the number of nucleotide monomers in the plasmid DNA;
  • P H5 ⁇ pH9 preferably present in the solution is PH6 ⁇ pH8, wherein (1) to (13) composite particles according,
  • the number of nucleotide monomers means the number of nucleotide monomer units constituting a desired nucleic acid.
  • the ratio of the number of collagen or collagen derivative molecules to the number of nucleotide monomers refers to the nucleotide monomer in a desired nucleic acid that forms a complex by electrostatically or physically binding to one molecule of collagen or collagen derivative. Means the number.
  • the number of nucleotide monomers is substantially the same as the “negative charge of the desired nucleic acid”.
  • negative charge of a desired nucleic acid means the number of phosphate groups existing between nucleotides constituting the nucleic acid.
  • the value of the negative charge of a nucleic acid is equal to the number of phosphate groups of nucleic acids, internucleotide phosphate groups of nucleic acids, and internucleotide phosphorus-containing groups (phosphate groups, phosphorothioate groups) of nucleic acids.
  • a substance that suppresses the formation of collagen aggregates means that the formation of collagen aggregates is mainly caused by the charge of basic amino acids and acidic amino acids in collagen molecules. And substances that do not associate collagen molecules regularly.
  • the former include salts, amino acids and urea, and the latter include sugars such as sucrose and arginine.
  • the composite particles of the present invention can be contained in the nucleic acid transfer promoter of the present invention. 4) Medical device or cell culture device
  • a fourth aspect of the present invention is a medical device or a cell culture device on which the composite particles of the present invention are applied.
  • the nucleic acid introduction efficiency is improved as compared with the case where the complex particles of the present invention are added dropwise from the target cells. It has been found that the solid phase coating method of the composite particles is superior to the dropping method in terms of introduction efficiency (see Example 6 below).
  • the medical device in this embodiment includes an artificial organ, more specifically, an artificial blood vessel, a medical device stent for reinforcing a blood vessel, or an artificial heart.
  • an artificial blood vessel vascular endothelial cells are used as artificial blood vessels to inhibit the growth of thrombus inside the blood vessel and suppress the activation of traps. Proliferates inside and needs to be coated. Therefore, vascular endothelial cell growth factor
  • the composite particles of the present invention in which nucleic acid encoding a cell growth factor such as (VEGF) is bound to collagen, are applied to an artificial blood vessel, the endothelial cells are expected to grow easily and rapidly. You.
  • VEGF cell growth factor
  • Cell culture instruments in which complex particles containing the desired nucleic acid and collagen or collagen derivative are applied to the cell culture surface include petri dishes, flasks, and 96-well microplates that are commonly used in cell culture experiments. .
  • the complex particles of the present invention are applied to the surface of a solid phase, it is shown in Example 6 below that the amount of the complex particles applied per unit area greatly affects the amount of nucleic acid introduced into cells. ing. Therefore, the amount of composite particles applied per unit area is also an important requirement of the present invention.
  • the present invention provides the following inventions.
  • the length is 300nn!
  • the circulation of the present invention is important.
  • liposomes need to be prepared at the time of use, and their distribution is extremely low.
  • adenovirus is mixed with collagen and applied to a solid phase surface and dried as in the present invention, high infectivity is maintained even after 7 days at room temperature. I carried it. This indicates that the medical device or the cell culture device of the present invention has high circulation.
  • the fifth aspect of the present invention is to use the composite particle of the present invention, to introduce a desired nucleic acid into a target cell, or to improve the expression efficiency of a desired nucleic acid in a target cell.
  • “improving expression efficiency” means increasing the expression amount of a desired nucleic acid or extending the expression period.
  • the present invention provides the following invention.
  • the function of a gene or protein in a target cell can be easily examined.
  • the Human Genome Project has identified so many genes and their nucleotide sequences have been revealed.
  • this information it is necessary to elucidate the functions of the identified genes.
  • the number of identified genes is enormous, and it has become evident that conventional methods of producing and purifying proteins from individual genes and examining their functions are too time-consuming and impractical. You.
  • a method of examining the function of a gene by introducing and expressing a plasmid DNA containing the gene whose function is to be examined in the cell and expressing the gene is proposed.
  • a method for examining the function of a gene by introducing an antisense oligonucleotide that suppresses the expression of the gene to be examined into cells and suppressing the expression of the gene is useful.
  • a liposome having high cytotoxicity adds to the information obtained by the effect of ribosome-induced cytotoxicity.
  • the collagen of the present invention is naturally present in a living body and is in contact with cells, the influence on cells is extremely low, and the function of a gene can be measured without noise.
  • a complex particle was formed by mixing a plasmid DNA expressing the gene whose function is to be elucidated, an adenovirus vector or an antisense oligonucleotide which suppresses the expression of the gene whose function is to be elucidated, and collagen. Then, coat and align on the solid phase of the culture plate.
  • the solid-phase plate used here is a 96-well multiwell plate or a more microplate. After drying the coated complex particles and fixing them on the solid phase, the cells are seeded and cultured on a plate for several days.
  • the applied composite particles are efficiently introduced into the cells adhered to the applied part, and express the gene whose function is to be examined or suppress the expression for a long time. A few days later, the function of the targeted gene can be determined by examining the morphology of the cell, the state of gene expression in the cell, or the type and amount of protein produced from the cell.
  • a feature of this method is that the composite particles applied on the solid phase are selectively and efficiently taken up by cells adhered to the applied portion. In other words, it is not necessary to culture cells in cells, and it is possible to analyze the functions of many genes on a microplate at one time. In this embodiment, the following invention is provided.
  • a method for examining the function of a gene or a protein in a target cell comprising the nucleic acid encoding the gene or the protein or the nucleic acid that inhibits the expression of the gene or the protein in a cell according to the present invention. Is applied to a solid phase surface, the target cells are cultured on the solid phase surface, and the expression level of the nucleic acid or the gene or protein in the target cells, or the growth rate or phenotype of the cells, is measured.
  • nucleic acid that inhibits the expression of the gene or the protein in a cell is an antisense oligonucleotide or a ribozyme, and the expression level of the gene or the protein is examined.
  • nucleic acids that can treat various diseases that can be treated can be screened. For example, a nucleic acid whose therapeutic effect is to be examined on a solid phase in the same manner as described in 6) is formed by forming complex particles with collagen, applied, dried, and immobilized, and the pathology is then displayed. By culturing the transformed cells, the nucleic acid is efficiently introduced into the diseased cells.
  • nucleic acids can be analyzed by changes in cell phenotype, cell death, cell proliferation, gene expression patterns in cells, and the type and amount of protein produced. It is obvious that the effect of the introduced vector should be suppressed to a minimum also in this nucleic acid introduction, and the present invention using collagen can examine the effect of the nucleic acid on the disease state without noise. Since a large number of nucleic acids whose functions are to be examined can be aligned and immobilized on a cell culture solid support having a small area, it is a feature of the present invention that a large number of nucleic acids can be evaluated at once.
  • a complex particle of the present invention containing a candidate nucleic acid of a nucleic acid that inhibits the expression of a gene involved in a disease in a cell is applied to a solid phase surface, and a cell in the disease state on the solid phase surface
  • a method of screening for a nucleic acid capable of treating the disease comprising culturing the nucleic acid and examining the expression level of the gene inhibited by each candidate nucleic acid, or the growth rate or phenotype of the cell.
  • a complex particle of the present invention containing a nucleic acid expected to inhibit the expression of a gene involved in a certain disease in a cell is applied to a solid phase surface, and the disease state is formed on the solid phase surface.
  • a method for examining the therapeutic effect of the nucleic acid on the disease which comprises culturing a cell and examining the expression level of the gene, or the proliferation rate or phenotype of the cell; '
  • the nucleic acid is a nucleic acid that inhibits expression of a gene involved in a disease in a cell or a nucleic acid that has a function of inhibiting expression of a gene involved in a disease in a cell. ) Described method, and
  • a plasmid DNA encoding a nucleic acid that inhibits the expression of a gene involved in a disease in a cell, or an oligonucleotide or a nucleic acid having a function of inhibiting the expression of a gene involved in a disease in a cell.
  • the method according to the above (3) which is a lipozyme.
  • a cell culture instrument in which a film containing a collagen or collagen derivative containing a desired nucleic acid is laid on a cell culture surface; preferably, the cell in which the desired nucleic acid forms complex particles with collagen or a collagen derivative Culture equipment;
  • nucleic acid is a cDNA or an oligonucleotide in a library
  • a method for examining the function of an arbitrary gene in a cell comprising culturing the cell on the cell culture instrument according to any one of (1) to (6) above, on which a nucleic acid containing cDNA of the gene is immobilized, A method comprising determining cell growth rate, phenotype, and production of a specific protein;
  • (13) A method for examining the function of an arbitrary gene in a cell, wherein the cell culture device according to any one of (1) to (6), wherein an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to a messenger RNA of the gene is immobilized. Culturing the cells, and examining cell growth rate, phenotype, and production of a specific protein; and
  • the cell culture instrument according to any one of (1) to (6), wherein the cell culture surface other than the portion on which the nucleic acid is immobilized is a highly hydrophilic or hydrophobic surface to which cells cannot adhere.
  • Methods for introducing nucleic acid into target cells on a solid phase include cell culture in which the nucleic acid is fixed together with collagen or a collagen derivative as described above, or directly fixed as a complex particle in which the nucleic acid is formed with collagen or a collagen derivative. There is a method of culturing target cells on the surface.
  • a method of laying a film containing a nucleic acid-containing collagen or collagen derivative or a film containing complex particles on a solid phase surface and culturing target cells thereon, and a method containing a nucleic acid-containing collagen There is a method using a film formed from agar-mouthed albumin containing particles of collagen or collagen derivatives or their composites.
  • the present invention examines the function of genes in cells under the same conditions simultaneously under the same conditions by complexing various types of nucleic acids with collagen or collagen derivatives and independently arranging (library) on the solid phase Make it possible. Also, the present invention provides a gene expression library or a gene expression suppression library capable of analyzing gene functions at a cell level by arranging nucleic acids containing cDNAs or antisense oligonucleotides already libraryd on a solid phase. Nuclei containing libraryed cDNA Any acid may be used, and examples thereof include Gene Storm pcDNA3.1 vector (In Vitrogen).
  • the cells into which the independently placed nucleic acid has been introduced must intersect with each other. Need to be avoided.
  • As a method of preventing this there is a method of partitioning the arrangement portion of each nucleic acid with a well, and it is possible to partition from 6 to 38.4 wells per plate. Apart from this, a highly hydrophilic layer, which cannot adhere to cells other than the gel, can prevent migration between the nucleic acid arrangement portions of the cell on a highly hydrophobic surface.
  • the surface having high hydrophilicity as referred to herein is a surface having a contact angle with water of 40 degrees or less, and the surface having high hydrophobicity is a surface having a contact angle with water of 110 degrees or more. is there.
  • the distance between the nucleic acid arrangement portions needs to be maintained to be equal to or longer than the length where the seeded cells extend most. In this way, by making the cell culture surface other than the portion on which the nucleic acid is immobilized or the film containing a nucleic acid is disposed a highly hydrophilic or highly hydrophobic surface, it is not necessary to partition and culture the cells with a gel. Above, it becomes possible to analyze the functions of many genes at once. Example
  • Example 1
  • Plasmid DNA (pCAHST-l: 7.9 Kbp) incorporating the fibroblast growth factor HST-1 (FGF4) gene (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2980-2984 (1987)) in g / ml.
  • Fig. 2 shows the results of electrophoresis after mixing in lOmM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.2M and 1.0M sodium chloride.
  • pCAHST-1 migrated in the presence of 1.0 M sodium chloride even in the presence of 100 / ig / ml collagen. This means
  • EGFP protein that emits fluorescence
  • a gel formulation was prepared by mixing equal amounts of an aqueous 0.02% (w / w) atelocollagen solution.
  • 100 ⁇ l of the prepared gel preparation (containing 10 ⁇ g of pCMV-EGFP) was added to 293 human fetal kidney cell line cells cultured in a culture dish having a diameter of 6 cm in the presence of 2 ml of serum-free medium. After the addition, the cells were cultured at 37 ° C overnight, and the cell surface was washed with PBS to remove the serum-free medium and the preparation.
  • the cells were cultured in a medium containing 10% calf serum. The cells were observed with a fluorescence microscope over time to observe the expression of EG5. As a control, a PBS solution containing the same amount of pCMV-EGFP, and a complex of the CATIOEC liposome preparation and pCMV-EGFP were added to 293 cells, respectively.
  • EGFG-3 complex (atelocollagen 0.01%, pCMV-EGFPlOO ⁇ g / ml), which had the highest transduction efficiency in Example 4, 0, 10, 50, 100, 250 and 500 / xl was placed in a 6-well culture dish.
  • the cultured 293 cells were added dropwise in the presence of 1 ml of serum-free medium. After the addition, the cells were cultured at 37 ° C for one ife, and the cell surface was washed with PBS to remove the serum-free medium and the complex.
  • the medium was replaced with a 10% FBS (containing 10% fetal bovine serum) medium. The cells were observed with a fluorescence microscope over time for 6 days, and the expression of EGFP was observed.
  • the composition of the EGFG-3 complex (atelocollagen 0.01%, pCMV-EGFP100 / ig / ml) with the highest transduction efficiency was determined. Based on the results, we compared the expression periods of the dropwise addition method and the solid-phase coating method while optimizing the composition of collagen and plasmid DNA.
  • the prepared complex was added dropwise to 293 cells cultured in a 6-well culture dish in the presence of a serum-free medium. After the dropwise addition, the cells were cultured at 37 ° C, and the cell surface was washed with PBS to remove the serum-free medium and the complex, and the medium was replaced with a medium containing 10% FBS. Seven days later, the number of cells expressing EGFP was counted by observation with a fluorescence microscope. Fig. 7 shows the results. For EGFG-3B, 3D and 3E, the fluorescence intensity of the expressed EGFP was measured (Army Scan II System, Cellomics). FIG. 8 shows the relative fluorescence intensity of each sample.
  • the prepared complex (250 / l / well) was applied to a 6-well culture dish and air-dried for 30 minutes. Then
  • Figures 7 and 9 show the results obtained by the dropping method and the results obtained by the solid-phase coating method, respectively, in that the collagen concentration affects the introduction efficiency and that the solid-phase coating method has a higher introduction efficiency than the dropping method. It shows that it is excellent.
  • FIG. 10 shows the results obtained by the dropping method
  • FIG. 11 shows the results obtained by the solid-phase coating method
  • Fig. 12 shows the relative fluorescence intensity of EGFP in each sample obtained by the solid phase coating method.
  • AdCMVEGFP 1x10 s Dfu / ml adenowinores setter AdCMVEGFP (K. Aoki, et al "Mol. 10 ⁇ l of a solution of Ther. (2000) 1 (6): 555-565) in a DMEM solution was mixed with 5 ⁇ l of a 2% solution of atelocollagen in PBS (—). This mixture 501 was added to a 24-well culture plate (uncoated) (Koningu Co., Ltd.), air-dried at room temperature for 15 minutes with a cold set dryer, and solid phase coating was performed.
  • AdCMVEGFP pfu / ml adenovirus vector AdCMVEGFP (K. Aoki, et al. Mol. Ther. (2000) 1 (6): 555-565 )
  • DMEM solution was mixed with an equal amount of 160 // g / m 1 atherocollagen solution. This mixture could be stored at 4 ° C for a long time without loss of activity.
  • Mix 50 1 to 96 Ueno M # nutrient plate
  • the obtained gel preparation was passed through a filter having a pore diameter of 70 ⁇ or 10 ⁇ m to prepare a sized gel preparation.
  • PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent (Molecular Probes) was added to the obtained preparation, pCMV-EGFP was stained, and the mixture was observed with a fluorescence microscope to measure the major axis of the complex.
  • the secretory signal peptide of HST-1 and plasmid DNA pCMV-HST-l-IL-2 (6.2 kbp) encoding interleukin 2 were mixed with atelocollagen to obtain a gel-like preparation, and the long diameter of the complex was determined. It was measured.
  • the resulting gel-like preparation was electrophoresed on an agarose gel (Tris' acetate buffer, 0.8% agarose gel) to separate the complexed plasmid DNA from the unformed plasmid DNA.
  • the band of the plasmid DNA that did not form a complex was stained with ethidium bromide, and the fluorescence intensity was measured using a Pluor-S-Multi Imager (BIO-RAD).
  • the amount of plasmid DNA that did not form a complex was quantified based on the calibration curve obtained from the fluorescence intensity of the band obtained by electrophoresis of the plasmid DNA of known concentration, and the amount of the negative charge of DNA contained in the complex and the molecular weight of collagen were determined. The ratio was calculated. Table of results See Figure 6. Table 6
  • the gel preparation obtained by mixing plasmid DNA and collagen is filtered through a filter having a pore size of 70 / im or 10 zm to form a granule complex having a smaller average long diameter. I got it.
  • Figure 15 shows the relationship between the number of collagen molecules bound to one plasmid DNA molecule and the average length of the complex.
  • both pCMV-EGFP and pCMV-HST-l-IL-2 tended to increase the average major axis as the number of collagen molecules bound to plasmid DNA increased.
  • the complex was prepared using a 0.1 M phosphate buffer and a 0.01 M phosphate buffer containing sodium chloride as a solvent, such a tendency was not observed. Even when collagen molecules with a major axis exceeding 100 ⁇ m formed a complex with plasmid DNA, the average major axis did not exceed 50 m.
  • FIG. 16 shows the relationship between the number of nucleotide monomers of plasmid DNA per collagen molecule and the average length of the complex. The average length of the complex tended to increase as the number of nucleotide monomers in the plasmid DNA decreased per collagen molecule.
  • PB 0.1 M phosphate buffer
  • the amount of oligonucleotide that formed a complex with collagen in the obtained gel-like preparation was determined by centrifuging the gel-like preparation at 150,000 rpm for 1 hour at 5 ° C to precipitate the complex and releasing it in the supernatant.
  • the amount of oligonucleotide was measured by HPLC (power column: Puresil C185 (Waters), mobile phase: ImM EDTA, 0.1 mM ammonium acetate (pH 7.0) containing 5 mM tetrabutylammonium). It changed from 24.5% to 35% in 35 minutes, flow rate: lml / min, and detection wavelength: 260nm.
  • a single-chain nucleic acid fluorescent staining reagent YOYO (Molecular Probes) was added to the obtained preparation to stain the oligonucleotide and observed by a fluorescence microscope to measure the major axis of the complex. Table 7 shows the results. Table 7
  • Example 10 In the same manner as in Example 10 using plasmid DNA, By mixing with gen, a complex of oligonucleotide and collagen was obtained. Unlike the case of plasmid DNA, the average long diameter of the complex is remarkable depending on the concentration of collagen and the concentration of oligonucleotide both in the case where salt-free water is used as the solvent and in the case where 0.1M phosphate buffer is used as the solvent. No change was seen. This is thought to be because the oligonucleotide is a small molecule compared to the plasmid DNA and therefore inhibits the formation of collagen aggregates.
  • Fig. 17 shows the relationship between the ratio of the number of oligonucleotides and collagen molecules during mixing and the number of oligonucleotides bound to one collagen molecule in the complex.
  • water or phosphate buffer is used as the solvent
  • the maximum number of oligonucleotide molecules that can bind to one collagen molecule varies depending on the solvent. Six molecules were obtained when water was used as the solvent, and three molecules were used when phosphate buffer was used as the solvent.
  • the molecular weight of collagen (300,000) is much larger than the molecular weight of oligonucleotides (about 6,500), and the shape of the complex depends exclusively on the number of collagen molecules forming the complex. Have approximately the same number of collagen molecules. Therefore, even in a complex having the same average major axis, the number of oligonucleotide molecules contained in the complex differs depending on the number of oligonucleotides bound to one molecule of collagen.
  • each complex comes into contact with the cell to introduce the oligonucleotide, so that a complex having a higher content of oligonucleotide molecules can introduce the oligonucleotide into the cell more efficiently.
  • PBS phosphate buffer
  • Example 10 Gel formulation prepared in Example 10 (10-3; composition confirmed to have good transduction efficiency in Example 6) 50 ⁇ L was dropped on the bottom of a 96-well microplate and directly blown by a 7th-inspired wind (Room temperature, 2 hours) or a method of standing with silica gel in a desiccator (room temperature, 2 days) to prepare a cell culture instrument in which the complex was applied to the cell culture surface.
  • PBS OO ⁇ l phosphate buffer
  • Example 1 Similarly 6 Ueru cell culture plates were prepared in Example 1 0 pCMV-HST- 1-IL - 2 gel formulation containing 10 1 3-2 2, 24 3 ⁇ ⁇ 1 or 500 mu 1 added Then, the cells were dried by blowing cold air to prepare a cell culture device to which a complex containing PCMV-HST-1-IL-2 was applied. As a control group, 500 1 of an aqueous solution containing 100 g / ml of pCMV-HST-IL-2, a PB solution, and a PBS solution of 300 ⁇ 1 was added to the plate and dried in the same manner.
  • Each well coated with the gel preparation 300 1 was seeded with 7.5 ⁇ 10 4 293 cells, and 10 ⁇ 13 to 19 were added to a DMEM medium containing 10% FBS and cultured at 37 ° C.
  • Cell seeding the medium was replaced after 8 days, about 11 days after culture were collected to measure IL- 2 concentration in the medium by ELISA (Quamtikine human IL-2 (R & D Systems)) 0 10- 20 ⁇ 22 are, DMEM Add medium After culturing at 37 ° C, the culture was changed to DMEM medium containing 10% FBS the next day, and the cells were cultured at 37 ° C. After 8 days and 11 days after the cell seeding, the medium was replaced.
  • the medium was collected and the IL-2 concentration in the medium was measured by ELISA.
  • DMEM medium containing 10% FBS was added and cultured at 37 ° C.
  • the 10- 14 ⁇ 17 50 () ⁇ 1 were seeded four NIH3T3 cells 5 X 10 to coated Ueru, 10 ° /. DMEM medium containing FBS was added, and the cells were cultured at 37 ° C. Eight days after cell seeding, the medium was collected and the IL-2 concentration in the medium was measured by ELISA.
  • the culture medium was changed to a sheep culture medium 0, and after culturing for 10-1, 10-4, and 10-7 for 13 days, and for 10-8, 10-9, and 10-10 for 5 days, The cells were observed with a fluorescence microscope and the number of cells expressing GFP was counted.
  • 7.5 ⁇ 10 4 293 cells were seeded on a 6-well cell culture plate, and cultured at 37 ° C. in the presence of DMEM medium containing 10% FBS. 2 days after sowing prepared in Example 10
  • Gel preparations containing pCMV-HST-l-IL-2 10-20, 10-21 and 300 ⁇ l of PB solution containing lOO g / ml pCMV-HST-l-IL-2 as a control were added.
  • the cells were subcultured at 37 ° C in the presence of DMEM medium containing 10% FBS at 37 ° C.
  • the medium was replaced with a new medium, and after culturing for 5 days, the medium was collected and IL-2 concentration in the medium was measured by ELISA (Quamtikine human IL-2 (R & D Systems)).
  • the complex of the present invention can protect and stabilize the desired nucleic acid by forming a complex with collagen or a collagen derivative, and 2) can efficiently introduce the desired nucleic acid into cells by administering it into the body; and 3) special gene transfer. Nucleic acid expression and suppression can be achieved without using reagents.
  • Gene expression is possible without using a special gene transfer reagent, and 4) regardless of the target nucleic acid type and immobilized form, and 5) when plasmid DNA is used.
  • Various applications are possible due to the special characteristics that the expression period is greatly extended.
  • the present invention it is possible to easily elucidate the function of a gene or protein whose expression has been suppressed by an antisense oligonucleotide by measuring cell proliferation, cell morphology, cytodynamic force, receptor expression level, and the like. it can.
  • it is not limited to antisense oligonucleotides that can form a complex with collagen and applied on a plate.
  • antisense oligonucleotides that can form a complex with collagen and applied on a plate.
  • ribozymes screening similar to that of antisense oligonucleotides can be performed.
  • adenovirus it becomes possible to analyze the function of a gene or protein by measuring the change in cells caused by the expression of a specific gene.
  • collagen or a collagen derivative constituting the complex does not damage cells, and therefore, screening using the complex of the present invention uses a general gene transfer agent. It is possible to analyze gene functions while minimizing the effects on non-specific cells that sometimes occur.

Description

明 細 書 核酸導入を促進させる方法 技術分野
本発明は、 医療分野、 特に遺伝子治療および遺伝子関連の基礎研究の分野に属 する。 詳細には、 本発明は、 所望の核酸の標的細胞への導入を促進する製剤およ びそのための方法に関する。 背景技術
近年、 遺伝子治療に関する研究が盛んに試みられており、 実際に種々の癌や遺 伝子疾患に臨床応用されている。 遺伝子治療とは、 正常な遺伝子を細胞に補った り、 遺伝子の欠陥を修復、 修正することで病気を治療する手法であり、 目的の酵 素、 サイト力イン等の遺伝子を患者の細胞内に導入し、 その遺伝子により体内に 目的とする物質を産生させて疾患の治療を行うものである。 遺伝子治療は生命活 動の根幹を制御する治療法であり、 癌や遺伝子疾患だけでなく、 AIDS、 慢性関 節リゥマチ、 生活習慣病など様々な病気の治療への可能性がある。
遺伝子治療において、 遺伝子の標的細胞への導入効率は治療の有効性を高める うえで重要な因子である。 癌に対する遺伝子治療方法としてアデノウィルス等に よる方法 (Cardiovascular Research, 28, 445 (1994); Science, 256, 808 (1992);
Gastroenterology, 106, 1076 (1994); TIBTECH, 11, 182 (1993); J. Biol. Chem, 266. 3361 (1991); Nature Medicine, 1, 583 (1995)およびこれらの引用文献)お ょぴリボソーム製剤を用いる方法 （Biochem Biop ys Acta, 1097. 1 (1991); Human Gene Therapy, 3, 399 (1992); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11277 (1992)) がある。 ウィルスベクターを用いる方法はリボソーム製剤を用いる方法 に比べて遺伝子の導入効率が一般に高い。 しかし、 ウィルスに由来する免疫反応 のために複数回の投与が困難という問題がある （J. Biol. Chem., 269,
13695(1994)、 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 10, 369 (1994))。
他方、 ヒトの全遺伝情報 （ヒトゲノム） の解読がほぼ完了したことから、 今後 そのヒトゲノム情報をどうのように医療や産業に生かしていくかというボストゲ ノムに研究の比重が置かれるようになった。 即ち、 解明された遺伝情報に基づ いて、 ヒト遺伝子の解明や、 それによつてコードされるタンパク質の構造、 機能 の解析の重要性が強調されている。 そのようなポストゲノム研究では、 遺伝情報 を解明するにタンパク質を発現させ生産する必要があり、 そのためには目的遺伝 子を細胞に導入することが必須である。 一方、 導入した遺伝子が宿主細胞のゲノ ムに取りこまれないアデノウイルスベクターやリボソームベクター、 プラスミド DNAベクターでは、 導入した遺伝子の発現が一過 '性であり、 定常的に遺伝子を 発現させることができないが、 この定常的な遺伝子発現は遺伝子治療や遺伝子機 能の解析に重要である。 発明の開示
このように、 遺伝子を構成し得る核酸を所望の細胞に効率的に導入し、 かつ宿 主細胞の染色体に遺伝子を組み込むことなく遺伝子を長期間発現する手法には大 きな有用性が期待できる。
本発明者らは、 コラーゲンの意外な作用を見出し、 核酸を所望の細胞に効率的 に導入する手法を発見した。 詳細には、 コラーゲンとプラスミド DNAなどの核 酸とを組合わせると、 意外にもそれらが複合体を形成し、 それが核酸の細胞への 導入を促進し、 かつ遺伝子を長期間発現することを見出した。 なお、 遺伝子をコ ラーゲン等の生体親和性材料からなる担体に担持させた遺伝子製剤が開示されて いるが （特開平 9— 7 1 5 4 2 ) 、 その遺伝子製剤は遺伝子を生体内において徐 放化させる徐放性製剤として記載されている。
このように、 本発明はコラーゲンまたはコラーゲン誘導体の新規な用途を基礎 とするものである。
即ち、 本発明は、 （1 ) コラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含有する、 標的 細胞への核酸導入促進剤；
( 2 ) コラーゲンまたはコラ一ゲン誘導体が所望の核酸と複合体を形成して含有 されている核酸導入促進剤、 好ましくは該複合体が粒子である核酸導入促進剤、 より好ましくは該複合体粒子の長径が 300nn！〜 300 m、 より好ましくは 300nra 〜 100 μ m、 さらに好ましくは 300nm〜50 μ m、 さらに好ましく 300nn！〜 30 μ mの複合 体を含有する核酸導入促進剤；具体的には核酸がプラスミド DNAである場合、 該複合体におけるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とプラスミド DNA のヌクレオチドモノマー数の比が 1： 20〜1 ：プラスミド DNAのヌクレオチ ドモノマー数、 好ましくは 1 ： 50〜1 ：プラスミド DNAのヌクレオチドモノ マー数、 より好ましくは 1 ： 50〜1 ： 4000、 さらに好ましくは 1 ： 50〜 1： 2000、 より好ましくは 1 ： 50〜1 ： 1000である、 または核酸がォ リゴヌクレオチドである場合、 該複合体におけるコラーゲンまたはコラーゲン誘 導体分子数とオリゴヌクレオチドのヌクレオチドモノマー数の比が 1 ： 1〜1 ： 200、 好ましくは 1： 3〜1 ： 150、 より好ましくは 1 ： 20〜1 ： 120、 さらに好ましくは 1： 50〜1 ： 120である、 核酸導入促進剤；
(3) コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを含む複合体粒子；
(4) コラーゲンの会合体形成を抑制する物質を含有する溶液中にて、 コラー ゲンまたはコラ一ゲン誘導体と所望の核酸とを混合することを特徴とする、 本発 明の複合体粒子を調製する方法；
(5) 上記 (3) の複合体粒子が表面に塗布されている医療用具、 または該複 合体粒子が細胞培養面に塗布されている細胞培養器具；
(6) 上記 (3) の複合体粒子を使用することを特徴とする、 所望の核酸を標 的細胞に導入するための、 または所望の核酸の標的細胞における発現効率を向上 させるための方法；
(7) 標的細胞における遺伝子またはタンパク質の機能を調べる方法であって、 該遺伝子もしくは該タンパク質をコードする核酸または該遺伝子もしくは該タン パク質の発現を細胞内で阻害する核酸を含む上記 (3) の複合体粒子を固相表面 に塗布し、 その固相表面上で該標的細胞を培養し、 該標的細胞における該核酸の 発現レベルまたは該遺伝子もしくは該タンパク質の発現レベル、 または細胞の増 殖率もしくは表現型を調べることを特徴とする方法；
( 8 ) ある疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害する核酸の候補核酸を 含む上記 (3) の複合体粒子を固相表面に塗布し、 その固相表面上にて該疾患状 態にある細胞を培養し、 各候補核酸によつて阻害される該遺伝子の発現レベル、 または細胞の増殖率もしくは表現型を調べることを特徴とする、 該疾患を処置で きる核酸をスクリーニングする方法；に関する。
以下の実施例にて詳細に説明しているように、 本発明の核酸導入促進剤は、 プ ラスミド DNA単独では遺伝子発現が見られない in vitroの細胞培養系において核 酸の発現が認められたことから、 核酸の細胞への導入効率を向上することが示さ れた。 さらに核酸の発現がリポソ一ム製剤と比較して長期間持続すること力 ら、 本発明の核酸導入促進剤は核酸の細胞内での安定性を向上することが示された。 今回、 コラーゲンが核酸と静電的におよび/または物理的に相互作用し複合体 を形成していることを見出した。 よって、 実施例にて認められた核酸発現の持続 は複合体形成による核酸の細胞内での安定性向上によってもたらされると考えら れる。 これは、 コラーゲンのマトリックス中に封入された遺伝子等が生分解作用 によるコラーゲンの分解により徐々に遺伝子が放出されると考えられていた、 従 来のコラ一ゲンによる遺伝子等の徐放メ力ェズムと大きく相違する。 図面の簡単な説明
図 1は、 一定濃度のプラスミド DNAと種々の濃度のァテロコラーゲンとの静 電的相互作用を示すァガ口ースゲル電気泳動結果の、 図面に代わる写真である。 図 2は、 プラスミド DNAとァテロコラーゲンとの静電的相互作用に対する塩 化ナトリゥムの影響を示すァガロースゲル電気泳動結果の、 図面に代わる写真で ある。
図 3は、 プラスミド DNAとァテロコラーゲンとの静電的相互作用に対するへ パラン硫酸の影響を示すァガロースゲル電気泳動結果の、 図面に代わる写真であ る。 左写真はへパラン硫酸不存在下、 右写真はへパラン硫酸存在下での結果であ る。
図 4は、 各種濃度のァテ口コラーゲンとのプラスミド DNAの複合体の形状を 表す顕微鏡写真である。
図 5は、 各種濃度のァテロコラーゲンとのプラスミ DNAの複合体における 1週間保存後の形状を表す顕微鏡写真である。
図 6は、 ァテロコラーゲンのゲル状製剤、 カチォニックリボソーム製剤および PBS溶液におけるプラスミド DNAの遺伝子発現期間の比較を示すグラフである。 図 7は、 コラ一ゲン濃度の異なる複合体と滴加法によるトランスフエクショ ン 7日後におけるプラスミド DNA導入効率との関係を示すグラフである。
図 8は、 コラーゲン濃度の異なる複合体における 7日後におけるプラスミド DNA導入効率を蛍光強度にて示すグラフである。
図 9は、 コラ一ゲン濃度の異なる複合体と固相塗布法によるトランスフエクシ ヨン 7日後におけるプラスミド DNA導入効率との関係を示すグラフである。 図 1 0は、 プラスミド DNA濃度の異なる複合体と滴加法によるトランスフエ クシヨン 7日後におけるプラスミド DNA導入効率との関係を示すグラフである。 図 1 1は、 プラスミド DNA濃度の異なる複合体と固相塗布法によるトランス フエクシヨン 7 後におけるプラスミド DNA導入効率との関係を示すグラフで ある。
図 1 2は、 固相塗布法によるトランスフエクシヨン 7日後におけるプラスミド DNA導入効率を蛍光強度にて示すグラフおよびその蛍光を示す顕微鏡写真であ る。
図 1 3は、 本発明方法における細胞増殖抑制を示すグラフである。
図 1 4は、 固相塗布法にてアデノウイルスが用量依存的に導入されていること を示すグラフおよびその蛍光を示す顕微鏡写真である。
図 1 5は、 プラスミド DNA 1分子に結合したコラーゲンの分子数と複合体の 平均長径の関係を示すグラフである。
図 1 6は、 コラーゲン 1分子あたりの所望の核酸のヌクレオチドモノマー数と 複合体の平均長径の関係を示すダラフである。
図 1 7は、 混合時におけるオリゴヌクレオチドとコラーゲンの分子数の比と複 合体におけるコラーゲン 1分子に結合したオリゴヌクレオチドの分子数との関係 を示すグラフである。
図 1 8は、 本発明の細胞培養器具の表面から遊離したオリゴヌクレオチドを含 む複合体を蛍光顕微鏡で観察して得られた蛍光顕微鏡写真である。
図 1 9は、 本発明の細胞培養器具の表面から遊離したプラスミド DNAを含む 複合体を蛍光顕微鏡で観察して得られた蛍光顕微鏡写真である。 発明を実施するための最良の形態
1 ) 核酸導入促進剤
第 1の態様における本発明は、 コラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含有する 標的細胞への核酸導入促進剤である。 本態様は、 標的細胞への核酸導入を促進さ せるというコラーゲンまたはコラーゲン誘導体における、 今回初めて見出された 作用を利用するものである。 即ち、 本態様では、 標的細胞への核酸導入を促進す るための、 コラーゲンまたはコラーゲン誘導体の新規な用途を提供する。
本発明において、 「コラーゲンまたはコラーゲン誘導体」 とは、 通常、 医療分 野、 化粧品分野、 工業分野および食品分野で用いられているあらゆる 「コラーゲ ンまたはコラーゲン誘導体」 を意味する。 コラーゲンは、 可溶性あるいは可溶ィ匕 コラーゲンを用いることが好ましい。 可溶性コラーゲンとは、 酸性あるいは中性 の水や塩溶液に可溶であり、 可溶化コラーゲンとは、 酵素により可溶化される酵 素可溶化コラーゲン、 アル力リにより可溶化されるアル力リ可溶化コラ一ゲンが あり、 V、ずれも孔サイズが 1マイクロメートルのメンブレンフィルターを通過で きることが好ましい。 コラーゲンの可溶性はコラーゲンの架橋度に依存し、 架橋 度が高いほど不溶化することから、 本発明に使用するコラーゲンの架橋度は、 例 えば、 3量体以下であることが好ましく、 より好ましくは 2量体以下である。 コ ラーゲンの分子量は例えば、 約 3 0万から約 9 0万が好ましく、 約 3 0万から約 6 0万がより好ましい。 コラーゲンはいかなる動物種から抽出されたものでも用 いることが出来るが、 好ましくは脊椎動物から抽出されたもの、 さらに好ましく は哺乳類、 鳥類、 魚類から抽出されたもの、 より好ましくは変性温度が高い哺乳 類、 鳥類から抽出されたコラーゲンが望ましい。 コラーゲンのタイプもいかなる タイプのコラーゲンでも良いが、 動物体内の存在量から I〜V型が好ましい。 具 体的には例えば、 哺乳動物の真皮から酸抽出した I型コラーゲンが挙げられ、 よ り好ましくは例えば、 仔牛の真皮から酸抽出した I型コラーゲン、 遺伝子工学的 に生産される I型コラーゲンなどが挙げられる。 同じ I型コラーゲンでも腱由来 のコラ一ゲンは架橋度が高く不溶性であるため適さない。 また、 安全性の面から 抗原性の高いテロべプチドを酵素的に除去したァテロコラーゲンあるいは遺伝子 工学的に生産されるァテロコラーゲンが望ましく、 1 0 0 0残基あたりチロシン 残基が 3以下であるァテロコラーゲンがより好ましい。 また、 必要に応じて側 鎖を修飾したコラーゲン、 架橋したコラーゲン等を用いることができる。 側鎖を 修飾したコラーゲンとしては、 例えばサクシ二ノレ化またはメチノレ化したコラーゲ ン等が挙げられ、 架橋したコラーゲンとしては、 例えばダルタルアルデヒド、 へ キサメチレンジィソアナ一トまたはポリエポキシ化合物等で処理したコラーゲン 等を挙げることができる （フレダランス ·ジャーナル 1989-12， 104-109、 特公 平 7-59522号公報)。 好ましいコラーゲン誘導体はゼラチンまたはゼラチンの架 橋体、 またはコラーゲンとの架橋体である。
なお、 コラーゲンまたはコラーゲン誘導体には他の生体親和性材料を混合する こともできる。 生体親和性材料としては、 例えばゼラチン、 フイブリン、 アルブ ミン、 ヒアルロン酸、 へパリン、 コンドロイチン硫酸、 キチン、 キトサン、 アル ギン酸、 ぺクチン、 ァガロース、 ハイドロキシアパタイト、 ポリプロピレン、 ポ リエチレン、 ポリジメチルシロキサン、 またはグリコール酸、 乳酸もしくはアミ ノ酸の重合体もしくはこれらの共重合体、 またはこれらの生体親和性材料の 2種 類以上の混合物等が挙げられる。
2 ) 複合体を含有する核酸導入促進剤
第 2の態様における本発明は、 所望の核酸とコラ一ゲンまたはコラ一ゲン誘導 体を含む複合体、 好ましくは複合体粒子を必須成分として含有する、 標的細胞へ の核酸導入促進剤である。
核酸は単独ではィンビトロの細胞に血清存在下に投与してもほとんど細胞に導 入できない。 コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と複合体を形成することにより、 初めて効率的に核酸を細胞に導入することができる。
本発明において、 「核酸」 はポリヌクレオチドであってもオリゴヌクレオチド であってもよく、 また DNAでも RNA分子でもあり得る。 DNA分子の場合、 プラ スミ ド DNA、 cDNA、 ゲノミック DNAあるいは合成 DNAであってもよい。 また DNAおよび UNAはいずれも 2本鎖でも 1本鎖でもあり得る。 1本鎖の場合、 コ 一ド鎖あるいは非コード鎖であり得る。 「核酸」 には DNA誘導体または RNA誘 導体が含まれ、 該誘導体とはホスホロチォエート結合を有する核酸、 または酵素 による分解を避ける為にィンターヌクレオチドのリン酸部位、 糖部分、 塩基部 分に化学修飾を施した核酸を意味する。 また、 「核酸」 にはアデノウイルス、 レ トロウィルス等のウィルスも含まれる。
好ましくは、 「核酸」 はォリゴヌクレオチドまたはリポザィムであり、 好まし くは 5量体以上 1 0 0量体以下、 より好ましくは 5量体以上 3 0量体以下のォリ ゴヌクレオチドまたはリポザィムである。 疾患症状の治療あるいは改善効果のあ る生理活性を有するタンパク質をコードしているプラスミド DNA、 または疾患 症状の予防、 治療あるいは改善効果のある免疫反応を誘導するタンパク質をコー ドしているプラスミド DNAがより好ましい。
核酸がプラスミド DNAまたはウィルス等の遺伝子治療に用いられるベクター である場合、 細胞内に導入されたとき、 コードした遺伝情報を細胞内で発現する ように構成された形態が好ましく、 プロモーター等、 目的遺伝子の発現に必要な 要素を含有する、 あるいは染色体への組み込みを可能とする要素を含有するべク ター等である。 本発明の核酸としてのプラスミド DNAのサイズには特に制限は なく、 遺伝子工学的手法で効率的に生産でき、 細胞に導入された場合、 効率的に コードした遺伝情報を細胞内で発現できるサイズの中から適当に選択することが できる。
本発明の核酸導入促進剤中には、 別個の所望の核酸を組み込んだ数種類のベタ ターが同時に存在してもよい。 また、 一つのベクターには複数の遺伝情報がコー ドされていてもよい。 導入促進剤中に含有されるベクターの量に特に制限はない。 遺伝子治療時に発現が要求されるタンパク質をコードする核酸には遺伝病の処 置に用いられ得る遺伝子、 例えばアデノシンデァミナーゼ、 チミジンキナーゼ等 の酵素類、 GM- CSF、 IL-2等のサイト力イン類、 または繊維芽細胞増殖因子 HST- 1 (FGF4)をコードする遺伝子が挙げられるがこれに限られるものではない。 また、 遺伝子治療時に発現が要求される別のタンパク質をコードする核酸として、 発現 されるタンパク質あるいはペプチドが抗原として免疫を誘導し、 感染症もしくは 腫瘍の予防または治療を行うことを目的とする遺伝子、 即ち上記の抗原となり得 るタンパク質あるいはペプチドをコードする遺伝子、 例えばインフルエンザウイ ルスの表面タンパク質である HAや NAまたは核タンパク質である NPの各タンパク質、
C型肝炎ウィルスの E2や NS 1タンパク質、 B型肝炎ウィルスの HBs抗原タンパク 質、 A型月干炎ウィルスのカプシドタンパク質である VP 1や VP 3、 あるいはカプシ ド様タンパク質、 デングウィルスの Egpタンパク質、 RSウィルスの Fあるいは Gタ ンパク質、 狂犬病ウィルスの構造タンパク質である Gや Nタンパク質、 ヘルぺスゥ ィルスの gDタンパク質、 日本脳炎ウィルスの E 1あるいは pre_Mタンパク質、 ロタ ゥィルスの外殻糖タンパク質 VP 7や外殻タンパク質 VP 4、 ヒ ト免疫不全ゥィルス の gpl20や gpl60タンパク質、 Leishmania majorの主要表面抗原タンパク質、 マラ リアのスポロゾィドの主要表面抗原（circum sporozoite protein)タンパク質、 トキソプラズマの 54- kdや CSタンパク質、 虫歯の原因となる Streptococcus mutansの菌体表層タンパク質 PAcをコードする遺伝子；また、 MAGE- 1、 MAGE - 3ま たは BAGEなどの癌退縮抗原や、 チロシナーゼ、 Mart-1、 gP100、 gp75などの組織 特異抗原、 pl5、 Mucl、 CEA、 HPV E6、 E7、 HPR2/neuなどをコードする遺伝子、 お よび I Immunization with DNA」 ： Journal of Immunological Methods, 176 卷， 1994年， 145 - 152頁に記載されている遺伝子を挙げることができるが、 これに 限定されるものではない。
核酸がオリゴヌクレオチドの場合、 例えば、 少なくともその一部が生体の恒常 性を乱す生理的な効果を有するタンパク質をコードした遺伝子、 病原' 1·生のウイノレ ス、 細菌等に特異的な遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖と生理的な条件下 で相補的に結合する塩基配列等であり、 より具体的には、 病原性ウィルス、 細菌 等に特異的な遺伝子および恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質等をコ 一ドした遺伝子のメッセンジャー RNAと相補的に結合する塩基配列である。
さらに具体的には、 本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは、 例えば、 メッ センジャー腿の開始コドンを含む領域あるいは前駆メッセンジャー R Aがスプラ イシングを受ける部位に相補的な配列等である。 本発明に用いられるオリゴヌク レオチドの例を示せば、 がんの治療あるいは予防に用いるオリゴヌクレオチドと しては、 例えば、 hst-1の発現を特異的に抑制する 5' - CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT - 3' (配列番号 1 ) の配列を有したオリゴヌクレオチド、 あるいはプロテインキナー ゼ Cひの発現を特異的に抑制して非小細胞性肺がんや結腸がんなどの進行性がん に有効で、 前立腺がん、 乳がん、 卵巣がん、 膝臓がん、 大腸がん、 小細胞肺がん への適用が試みられている ISIS3521、 C- rafキ? "一ゼの発現を特異的に抑制し て前立腺がん、 乳がん、 卵巣がん、 脳腫瘍、 膝臓がん、 大腸がん、 小細胞肺がん への適用が試みられている ISIS5132/CGP69846A、 Ha- rasの発現を特異的に阻害し て大腸がん、 乳がん、 脳腫瘍、 隨臓がん、 肺小細胞がんへの適用が試みられてい る ISIS2503、 プロテインキナーゼ Aタイプ Iの発現を特異的に抑制する GEM231、 DNAメチルトランスフエラーゼの発現を特異的に抑制する MG98、 c-mycの発現を抑 制する I XC- 6295、 C- mybの発現を抑制し白血病への適用が検討されている INX - 3001、 bcl- 2の発現を抑制して非ホジキンリンノ、。腫、 大腸がん、 小細胞肺がん、 慢性リンノ性白血病、 急性骨髄性白血病、 乳がん、 リンパ腫、 メラノーマ、 骨髄 腫、 非細胞性肺癌、 前立腺がんへの適用が検討されている G- 3139 (Genasense)、 MDM2蛋白の発現を抑制するォリゴヌクレオチド、 VEGFの発現を抑制するォリゴ ヌクレオチドなどを挙げることができる。 また、 感染症の治療あるいは予防に用 いるオリゴヌクレオチドとしては、 HIVの増殖を抑制する GEM92、 GPI_2A、 サイト メガロウィルスの増殖を抑制する ISIS2922 (fomivirsen)、 Vitravene, ISIS13312、
GEM132、 C型肝炎ウィルスの増殖を抑制する ISIS14803などが挙げられ、 炎症の治 療に用いられるオリゴヌクレオチドとしては、 ICAM-1の発現を特異的に抑制し クローン病、 潰瘍性大腸炎、 腎移植拒絶反応阻害、 乾癬、 喘息への適用が試みら れている ISIS2302、 アデノシン A 1レセプターの発現を抑制し、 喘息への適用が 試みられている EPI_2010、 および TNF- o;、 CD49d (VLA- 4)、 VCAM - 1、 PECAM- 1の発 現を抑制するオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。 また、 経皮経管冠動脈形成 術後の再狭窄を防止するォリゴヌクレオチドとして、 c-raycの発現を抑制する Resten-NGなどが挙げられる。
恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質をコードする遺伝子は具体的に は、 例えば、 がん遺伝子とよばれる一群の遺伝子群が挙げられる。 より具体的に は、 例えば増殖因子群、 受容体型チロシンキナーゼ群、 非受容体型チロシンキナ ーゼ群、 GTP結合タンパク質、 セリン■スレオニンキナーゼ群、 転写調節因子群 などが挙げられる。 さらに具体的には、 例えば、 hst - 1あるいはオル-チン脱炭 酸酵素等をコードする遺伝子等が挙げられる。 本発明の核酸導入促進剤は、 本発明の複合体の他、 必要に応じて医薬上許容さ れる添加剤を含有することができる。 医薬上許容される添加剤としては、 複合 体を、 剤として用いる場合の等張化剤、 ； H調節剤、 無痛化剤、 あるいは固形 剤として用いる場合の賦形剤、 崩壊剤、 コーティング剤が挙げられ、 日本では医 薬品添加物事典 （日本医薬品添加剤協会編集） に記述されているものである。 具 体的には p Hを 6〜8に保っため、 あるいは細胞と等張に保っために用いられる 塩類や糖類が挙げられる。
本発明の核酸導入促進剤の性状は固体状であっても溶液状であってもよい。 本 発明の促進剤が固体状である場合、 核酸導入を促進させる際には、 そのままの状 態あるいは精製水、 生理的食塩水、 生体と等張な緩衝液等を用いて溶液状とし、 所望の細胞に負荷する。 このような溶液状の核酸導入促進剤も本発明の一部を構 成する。
本発明の核酸導入促進剤を生体に投与する方法としては経口、 注射、 点眼、 点 鼻、 経肺、 皮膚を介した吸収のいずれでも良く、 好ましくは経口または注射であ る。 投与部位は疾患に応じて選択できるが、 手術時に必要な部位に直接留置する こともできる。
本態様では、 詳細には次の発明が提供される。
( 1 ) 所望の核酸とコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む複合体、 好ま しくは複合体粒子を必須成分として含有する、 標的細胞への核酸導入促進剤 （こ こに、 該複合体粒子の長径は好ましくはが30011111〜300 111、 より好ましくは
300nm~ 100 x m、 さらに好ましくは 300ηπ！〜 50 μ m、 さらに好ましくは 300nm〜30 μ mであ。) 、
( 2 ) 標的細胞が動物細胞である前記 ( 1 ) 記載の核酸導入促進剤、
( 3 ) 標的細胞が治療を必要とする臓器あるいは組織またはその付近の細胞 である前記 ( 2 ) 記載の核酸導入促進剤、
( 4 ) コラーゲンがァテロコラーゲンである前記 ( 1 ) 〜 （3 ) のいずれか に記載の核酸導入促進剤、
( 5 ) コラーゲンの分子量が約 3 0万〜約 9 0万である前記 ( 1 ) 〜 （4 ) のいずれかに記載の核酸導入促進剤、 (6) コラーゲン誘導体がゼラチンまたはゼラチンの架橋体である前記
(I) 〜 （5) いずれかに記載の核酸導入促進剤、
(7) コラーゲン誘導体がコラーゲンの架橋体である前記 (1) 〜 （5) 記 載の核酸導入促進剤、
(8) 核酸がオリゴヌクレオチドである前記 (1) 〜 （7) いずれかに記載 の核酸導入促進剤、
(9) オリゴヌクレオチドが 5量体以上 30量体以下の前記 ( 8 ) 記載の核 酸導入促進製剤、
(10) オリゴヌクレオチドが DNAあるいは DNA誘導体である前記 ( 8 ) または （9) 記載の核酸導入促進剤、
(I I) オリゴヌクレオチドが RNAあるいは RNA誘導体である前記 (8) または （9) 記載の核酸導入促進剤、
(12) DNA誘導体あるいは RN A誘導体が分子内に少なくとも 1つ以上 のホスホロチォエート結合を有する前記 （10) または （1 1) 記載の核酸導入 促進剤、
(13) 核酸がリポザィムまたはォリゴヌクレオチドである前記 （ 1 ) 〜 (7) いずれかに記載の核酸導入促進剤、
(14) 核酸がプラスミド DNAである前記 (1) 〜 （7) いずれかに記載 の核酸導入促進剤、
(15) プラスミド DNAが疾患症状の治療あるいは改善効果のある生理活 性を有するタンパク質をコードしている前記 （13) 記載の核酸導入促進剤、 お ょぴ
(16) プラスミド DNAが疾患症状の予防、 治療あるいは改善効果のある 免疫反応を誘導するタンパク質をコードしている前記 （13) 記載の核酸導入促 進剤。
(17) 核酸導入促進剤が溶液であり、 複合体成分として核酸を 10mg/ml以下 含有する前記 (1) 〜 （16) 記載の核酸導入促進剤、
(18) 複合体成分として核酸を lmg/ml以下含有する前記 (17) 記載の核酸 導入促進剤、 (1 9) 複合体成分として核酸を 500 zg/ml以下含有する前記 （18) 記載の核 酸導入促進剤、
(20) pH5〜pH9、 好ましくは pH6〜pH8である前記 (1) 〜 （19) 記載の 核酸導入促進剤、
(21) リン酸を 0.001M以上 0.1M以下含有する前記 (1) 〜 （20) 記載の核 酸導入促進剤、
(22) リン酸を 0.01M以上 0.1M以下含有する前記 （21) 記載の核酸導入促 進剤、
(23) コラーゲンの会合体形成を抑制する物質、 例えばシュクロースまたはァ ルギユンを含有する前記 (1) 〜 （22) 記載の核酸導入促進剤、
(24) 医薬上許容される添加剤を適量含有する前記 (1) 〜 （24) 記載の核 酸導入促進剤。
3) 複合体
本発明の第 3の態様は、 コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを 含む複合体である。 この複合体には、 静電的な力により結合して複合体を形成す る静電的複合体と疎水結合等の物理的な力により複合体を形成する物理的複合体 が含まれる。 場合によっては、 両方の結合様式が混在する場合があるが、 そのよ うな複合体も本発明における複合体に含まれる。
今回、 コラーゲンが核酸と静電的に相互作用し複合体を形成し得ることが見出 された。
本発明において 「静電的複合体」 とは、 分子中に多数の荷電を有するコラーゲ ンまたはコラーゲン誘導体と核酸のポリイオン複合体、 詳細には正電荷を帯びた コラーゲンまたはコラーゲン誘導体が負電荷を帯びた核酸と電気的に引き合った 結合体を意味する。 ポリイオン複合体は複合体形成時に分子内の荷電の力ゥンタ ーィオンを多数フリ一にすること力 ら、 非常に大きなェントロピーの増大が生じ る。 このような静電的複合体の形態から考えると、 実施例にて認められた核酸発 現の持続は複合体形成による細胞内での核酸の安定化によってもたらされると考 えられる。 本発明の複合体の最少単位は一分子のコラーゲンと一分子の核酸が形成する複 合体であるが、 我々はコラ一ゲンは核酸と複合体を形成するのと並行して他の コラーゲンと会合し会合体を形成することを見出した。 この会合体の形成は、 長 径約 300mn、 直径約 1.5nmの円柱状のコラーゲン分子が主として分子の直軸方 向と平行に会合するものであり、 主として会合体は分子の長軸方向に伸長する。 従つて複合体は複数の会合体と複数の核酸分子が非共有結合で結合したものであ り、 会合体の伸長が大きく進展し長軸が lnmを越える線維状複合体、 細い会合 体が核酸を介して結合した微線維状複合体、 より微細な複合体が核酸と形成した 粒子状複合体がある。
本発明の複合体は様々な形状をとることができる。
本発明の複合体は粒子であることが好ましい。 本発明において、 「粒子」 とは コラーゲンまたはコラーゲン誘導体がとり得る形状であり、 必ずしも球状を意味 するものでない。 本発明の複合体粒子のサイズは、 一分子のコラーゲンが形成す る複合体の長径 300nmが最少であり、 核酸導入効率を考慮し、 その長径が
300nm〜： Immであり、 長径 300ηιη〜300 μ πιである粒子が好ましく、 より好ま しくは長径 300nm〜： 100 μ mであり、 さらに好ましくは長径 300nn！〜 50 m、 さ らに好ましくは長径 300nn！〜 30/ mである。
我々は複合体が様々な形状をとる原因が、 複合体を構成するコラーゲンまたは コラーゲン誘導体と核酸との割合にあること、 さらに複合体の形状が専ら核酸と 複合体を形成することによって促進されるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体に よる会合体 （線維） 形成の進展に依存することを見出した。 会合体の過形成は核 酸導入には不適であるという本発明における知見に基づき、 我々は、 かかる複合 体の形状が、 混合するコラーゲンまたはコラーゲン誘導体および所望の核酸の濃 度の他、 コラーゲンの会合体形成に影響を与える環境因子である塩濃度、 温度、 p H、 グルコース濃度を調整することにより制御できることを見出した。 また、 我々は複合体形成に伴うコラーゲンまたはコラーゲン誘導体の会合体形成が、 核 酸の鎖長に影響を受け、 一般に lOOObpを超えるプラスミド DNAでは会合体形成 が著しく促進されるのに対して、 一般に 100b以下のオリゴヌクレオチドでは会 合体形成の促進効果が弱いことを見出し、 それぞれに適したコラーゲンまたはコ ラーゲン誘導体と核酸の組成が存在することを見出した。
複合体の形状は核酸の細胞への導入効率に影響し得る。 よって、 コラーゲン が核酸と複合体を形成し、 その形状が核酸の細胞への導入効率■発現効率に影響 するという発見により、 核酸導入効率を最適化し得るストラテジーが提供された。 さらに、 核酸の標的細胞への導入に実験室レベルで用いられているリポソームは、 核酸と混合した後、 直ちに凝集する性質があり、 使用毎に核酸の導入効率にばら つきがある他、 用時調製の必要があり、 実際に汎用されるのは困難である。 一方、 本 明の複合体は冷所で保管することで形態が悪ィ匕することがない。 遺伝子導入 技術において最大の課題は汎用的な方法が少ないということである。 本発明の複 合体は形態が変化しない点からも現実性の高い技術である。
本態様では具体的には次の発明が提供される。
( 1 ) 所望の核酸とコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む複合体粒子、
(2) 長径が 300nn！〜 300 ηιである、 前記 （1) 記載の複合体粒子、
(3) 長径が 300nm〜 ΙΟΟμ mである、 前記 (2) 記載の複合体粒子、
(4) 長径が 300nn！〜 50/xm、 好ましくは 300nn！〜 30μιηである、 前記
(3) 記載の複合体粒子、
(5) 核酸がプラスミド DNAである前記 (1) 〜 （4) 記載の複合体粒子、
(6) コラーゲンまたはコラ一ゲン誘導体分子数とプラスミド DNAのヌクレ ォチドモノマー数の比が 1 ： 20〜 1 ：プラスミド DNAのヌクレオチドモノマ 一数、 好ましくは 1 ： 50〜1 ：プラスミド DNAのヌクレオチドモノマー数、 より好ましくは 1 ： 50〜1 ： 4000、 さらに好ましくは 1 ： 50〜1 ： 20 00、 より好ましくは 1 ： 50〜1 ： 1000である、 前記 (5) 記載の複合体 粒子、
(7) 1 : 96〜1 ：プラスミ ド DNAのヌクレオチドモノマー数である前記 (6) 記載の複合体粒子、
(8) 1 : 96-1 : 1122である前記 (7) 記載の複合体粒子、
(9) 1 ： 96〜1 ： 701である前記 （8) 記載の複合体粒子、
(10) 核酸がオリゴヌクレオチドである前記 (1) 〜 （4) 記載の複合体粒 子、 (11) 該複合体におけるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とオリゴ ヌクレオチドのヌクレオチドモノマー数の比が 1 ： 1〜1 ： 200、 好ましく は 1 ： 3〜1 ： 150、 より好ましくは 1 ： 3〜1 ： 120である前記 (10) 記載の複合体粒子、
(12) 1 ： 20〜1 ： 120である前記 （11) 記載の複合体粒子、
(13) 1 ： 50-1 ： 120である前記 (12) 記載の複合体粒子、
(14) PH5〜pH9、 好ましくは pH6〜pH8である溶液中に存在する、 前記 (1) 〜 （13) 記載の複合体粒子、
(15) 10°C以下に冷却した溶液中でコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と 核酸を混合することで前記 (1) 〜 （13) 記載の複合体粒子を調製する方法、
(16) リン酸を 0.001M以上 0.1M以下含有する溶液中でコラーゲンまたはコ ラーゲン誘導体と核酸を混合することで前記 (1) 〜 （13) 記載の複合体粒子 を調製する方法、
(17) リン酸を 0.01M以上 0.1M以下含有する溶液中でコラーゲンまたはコ ラーゲン誘導体と核酸を混合することで前記 (1) 〜 （13) 記載の複合体粒子 を調製する方法、
(18) コラーゲンの会合体形成を抑制する物質、 例えばシュクロースあるい はアルギ ンを含有する溶液中でコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と核酸を混 合することで前記 （1) 〜 （13) 記載の複合体粒子を調製する方法、
(19) 医薬上許容される添加剤を適量含有する溶液中でコラーゲンまたはコ ラーゲン誘導体と核酸を混合することで前記 (1) 〜 （13) 記載の複合体粒子 を調製する方法 （ここに、 医薬上許容される添加剤とは上記記載のもの） 、
(20) 前記 (14) 〜 （19) 記載の方法を 2以上組み合わせて前記 （1) 〜 （13) 記載の複合体粒子を調製する方法、
(21) 100 /zm以下の孔径のフィルターを通過させて整粒する工程をさらに 含む、 前記 (1) 〜 （13) 記載の複合体粒子を調製する方法、
(22) ΙΟμιη以下の孔径のフィルターを通過させて整粒する前記 （21) 記載の方法、
(23) 10,000回転以上の速さで遠心することで複合体を濃縮、 単離するェ 程をさらに含む、 前記 （1 ) 〜 （1 3 ) 記載の複合体を調製する方法、
( 2 4 ) 50,000回転以上の速さで遠心する前記 （2 3 ) 記載の方法。 本発明において、 「ヌクレオチドモノマー数」 とは所望の核酸を構成するヌク レオチドモノマー単位の数を意味する。 「コラーゲンまたはコラーゲン誘導体分 子数とヌクレオチドモノマー数の比」 とは、 コラーゲンまたはコラーゲン誘導体 1分子に対し、 静電的または物理的に結合して複合体を構成する所望の核酸にお けるヌクレオチドモノマーの数を意味する。 ヌクレオチドモノマー数は、 「所望 の核酸の負電荷」 と略同一である。 本発明において 「所望の核酸の負電荷」 とは、 核酸を構成するヌクレオチド間に存在するリン酸基の数を意味する。 核酸の負電 荷の数値は、 核酸のリン酸基、 核酸のヌクレオチド間リン酸基、 核酸のヌクレオ チド間リン含有基 （リン酸基、 ホスホロチォエイト基） の数に等しい。
「コラーゲンの会合体形成を抑制する物質」 とは、 コラーゲンの会合体形成が 主としてコラーゲン分子中の塩基性ァミノ酸や酸性ァミノ酸の荷電によって生じ ることを考慮し、 これらの静電的相互作用を抑制する物質およびコラーゲン分子 を規則正しく会合させない物質が挙げられる。 前者としては塩類、 アミノ酸類、 尿素であり、 後者としてはシュクロース等の糖類およびアルギニンが挙げられる。 本発明の複合体粒子は、 本癸明の核酸導入促進剤に含有させることができる。 4 ) 医療用具または細胞培養器具
本発明の第 4の態様は、 本発明の複合体粒子が表面に塗布されている医療用具 または細胞培養器具である。
本発明の複合体粒子を固相表面に塗布し、 そこへ標的細胞を接触させると、 標 的細胞の上から本発明複合体粒子を滴加するよりも、 核酸の導入効率が向上する、 即ち複合体粒子の固相塗布法が滴加法よりも導入効率の点で優れていることが見 出された （以下の実施例 6参照） 。
本態様における医療用具には人工臓器、 より具体的には人工血管、 血管を補強 する医療用具ステントまたは人工心臓が含まれる。 人工血管の場合、 血管内側で の血栓の成長を P且害および捕体の活性化を抑制するには血管内皮細胞が人工血管 の内側で増殖し、 被覆する必要がある。 そのために、 血管内皮細胞増殖因子
(VEGF) などの細胞増殖因子をコードする核酸をコラーゲンに結合させた本 発明の複合体粒子を人工血管に塗布しておけば、 その血管内皮細胞が容易かつ迅 速に増殖することが期待される。
所望の核酸とコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む複合体粒子が細胞培養 面に塗布されている細胞培養器具としては、 細胞培養実験に通常用いられている シャーレ、 フラスコ、 9 6穴マイクロプレート等が挙げられる。 本発明の複合体 粒子を固相表面に塗布する場合、 単位面積あたりに塗布する複合体粒子の量は細 胞への核酸の導入量に大きく影響することが以下の実施例 6にて示されている。 従って単位面積あたりに塗布する複合体粒子の量も本発明の重要な要件である。 本様態では具体的には次の発明が提供される。
( 1 ) 所望の核酸とコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む複合体粒子が塗布 された医療用具または細胞培養器具、
( 2 ) 1平方センチメ一トルあたり 0.1 g以上 50 g以下の核酸を含有する複合 体粒子が塗布された前記 （1 ) 記載の医療用具または細胞培養器具、
( 3 ) 1平方センチメ一トルあたり 0.5 μ g以上 50 μ g以下の核酸を含有する複合 体粒子が塗布された前記 ( 2 ) 記載の医療用具または細胞培養器具、
( 4 ) 1平方センチメートルあたり 1 μ g以上 10 μ g以下の核酸を含有する複合体 粒子が塗布された前記 ( 3 ) 記載の医療用具または細胞培養器具、
( 5 ) 生体と等張の溶液に暴露した場合、 長择が 300nn！〜 300 /i mである複合体 粒子が固相表面より遊離する前記 ( 1 ) 記載の医療用具または細胞培養器具、 お ょぴ
( 6 ) 生体と等張の溶液が塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液である前記 ( 5 ) 記載の医療用具または細胞培養器具。
本態様を実施するに際して本発明の流通性は重要である。 先に述べた通り、 リ ポソ一ムは用時調製が必要であり、 流通性が極めて低い。 一般にアデノウイルス も本態様のように固相表面に塗布された状態で長期間室温で流通することは困難 と考えられている。 しかし意外にも本願発明のようにアデノウィルスをコラーゲ ンと混合して固相表面に塗布、 乾燥した場合、 室温下 7日後でも高い感染性を維 持した。 このことは本発明の医療用具または細胞培養器具が高い流通性を有して いることを示している。
5 ) 所望の核酸を標的細胞に導入し、 またはその発現効率を向上させる方法 上記のように、 本努明の複合体粒子を使用すれば、 所望の核酸の標的細胞への 導入を促進させることができる。 よって、 本発明は第 5の態様として、 本発明の 複合体粒子を使用することを特徴とする、 所望の核酸を標的細胞に導入するため の、 または所望の核酸の標的細胞における発現効率を向上させるための方法を提 供する。 本発明において、 「発現効率を向上させる」 とは、 所望の核酸の発現量 を増大させ、 または発現期間を延長させることを意味する。
即ち、 本態様では次の発明が提供される。
( 1 ) 所望の核酸とコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む上記の複合体 粒子を使用することを特徴とする、 所望の核酸を標的細胞に導入するための方法、
( 2 ) 所望の核酸とコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む上記の複合体 粒子を使用することを特徴とする、 所望の核酸の標的細胞における発現効率を向 上させるための方法、
( 3 ) 発現量を増大させる、 または発現期間を延長させるための、 前記 ( 2 ) 記載の方法、 および
( 4 ) 前記複合体粒子を固相表面に塗布し、 その固相表面上にて標的細胞を 培養することを特徴とする、 前記 ( 1 ) 〜 （3 ) までのいずれかに記載の方法。 6 ) 標的細胞における遺伝子またはタンパク質の機能を調べる方法
核酸の細胞への導入が促進される本発明に従えば、 遺伝子またはタンパク質の 標的細胞内での機能を容易に調べることができる。 例えば、 ヒトゲノムプロジェ クトによって非常に多くの遺伝子が同定され、 その塩基配列が明らかになった。 しかしこれらの情報を実際に医療あるいは食品産業で生力すには、 同定された遺 伝子の機能を解明する必要がある。 しかしながら同定された遺伝子の数は膨大で あり、 従来のように一つ一つの遺伝子からタンパク質を産生かつ精製して機能を 調べる方法では、 時間がかかりすぎて現実的でないことが明らかになってきてい る。 従って、 細胞内に機能を調べたい遺伝子を組み込んだプラスミド DNAを導 入して発現させることによってその遺伝子の機能を調べる方法、 あるいは機能を 調べたい遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に導 入して遺伝子の発現を抑制することによってその遺伝子の機能を調べる方法が 有用である。 また、 このように細胞の表現型によって遺伝子の機能を調べる場合、 プラスミド DNAおよびアンチセンス DNAを細胞に導入する方法は、 細胞に影響 を極力与えない方法で行うことは必須である。 従って細胞障害性の高いリポソ一 ムを用いることは、 得られる情報にリボソームによる細胞障害の影響が加わるこ ととなる。 一方、 本発明のコラーゲンは元来生体内に存在し、 細胞と接触してい る物質であることから細胞への影響は極めて低く、 遺伝子の機能をノィズなく測 定することが可能である。 具体的な測定方法としては、 機能を解明したい遺伝子 を発現するプラスミド DNA、 アデノウイルスベクターあるいは機能を解明した い遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドとコラーゲンを混合 し、 複合体粒子を形成した後、 培養プレート固相上に塗布、 整列配置する。 ここ で使用する固相プレートは 9 6穴のマルチウエルプレートや、 さらにミクロなプ レートなどである。 塗布した複合体粒子を乾燥して固相上に固定した後、 細胞を 播種し、 数日間プレート上で培養する。 塗布された複合体粒子は塗布された部分 に接着した細胞に効率的に導入され、 機能を調べたい遺伝子を発現あるいはその 発現を長期間抑制する。 数日後、 細胞の形態や細胞内での遺伝子発現の状態、 あ るいは細胞から産生されたタンパク質の種類や量を調べることによつて標的とし た遺伝子の機能を明らかにすることができる。 本方法の特徴は固相上に塗布され た複合体粒子が、 塗布された部分に接着した細胞に選択的かつ効率的に取り込ま れることも挙げられる。 すなわち細胞をゥ ルで区切って培養する必要がなく、 ミクロプレート上で多数の遺伝子の機能を一度に解析することが可能となる。 本態様では、 次の発明が提供される。
( 1 ) 標的細胞における遺伝子またはタンパク質の機能を調べる方法であつ て、 該遺伝子もしくは該タンパク質をコードする核酸または該遺伝子もしくは該 タンパク質の発現を細胞内で阻害する核酸を含む本発明の複合体粒子を固相表面 に塗布し、 その固相表面上で該標的細胞を培養し、 該標的細胞における該核酸の 発現レベルまたは該遺伝子もしくは該タンパク質の発現レベル、 または細胞の增 殖率もしくは表現型を調べることを特徴とする方法、 ( 2 ) 該遺伝子または該タンパク質をコードする核酸がプラスミド DNAで あり、 該核酸の発現レベルを調べる、 前記 ( 1 ) 記載の方法、 および
( 3 ) 該遺伝子または該タンパク質の発現を細胞内で阻害する核酸がアンチ センスオリゴヌクレオチドまたはリボザィムであり、 該遺伝子または該タンパク 質の発現レベルを調べる、 前記 ( 1 ) 記載の方法。
7 ) 疾患を処置できる核酸をスクリーニングする方法
核酸の細胞への導入が促進される本発明に従えば、 遺伝子疾患、 癌、 AIDS、 慢十生関節リウマチ、 生活習慣病など、 正常な遺伝子を補ったり、 遺伝子の欠陥を 修復、 修正すること処置できる様々な疾患を処置し得る核酸をスクリ一ユングす ることができる。 例えば、 6 ) で記述したのと同じ方法で固相上に疾患の治療効 果を調べたい核酸をコラーゲンと複合体粒子を形成させて塗布、 乾燥して固定化 し、 この上で病態を呈した細胞を培養することにより、 核酸が病態を呈した細胞 に効率的に導入される。 核酸の効果は、 細胞の表現型の変化、 細胞死、 細胞の增 殖、 細胞内での遺伝子発現のパターン、 産生されるタンパク質の種類や量により 解析することができる。 また、 この核酸導入においても、 導入ベクターによる影 響を最小限に抑制すべきことは自明であり、 コラーゲンを用いる本発明はノィズ なく病態に対する核酸の効果を調べることができる。 機能を調べたい核酸は微小 な面積の細胞培養固相担体上に多数整列固定ィ匕することができることから、 一度 に多数の核酸を評価できることも本発明の特徴である。
本態様では、 次の発明が提供される。
( 1 ) ある疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害する核酸の候補核酸 を含む本発明の複合体粒子を固相表面に塗布し、 その固相表面上にて該疾患状態 にある細胞を培養し、 各候補核酸によって阻害される該遺伝子の発現レベル、 ま たは細胞の増殖率もしくは表現型を調べることを特徴とする、 該疾患を処置でき る核酸をスクリ一ユングする方法、
( 2 ) ある疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害すると期待される核 酸を含む本発明の複合体粒子を固相表面に塗布し、 その固相表面上にて該疾患状 態にある細胞を培養し、 該遺伝子の発現レベル、 または細胞の増殖率もしくは表 現型を調べることを特徴とする、 該核酸の該疾患に対する治療効果を調べる方法、 '
22
(3) 該核酸が疾患に関与する遺伝子の発現を細胞內で阻害する核酸、 また は疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害する機能を有する核酸である前 記 （1) または （2) 記載の方法、 および
(4) 疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害する核酸が該遺伝子をコ ードするプラスミド DNA、 あるいは疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻 害する機能を有する核酸がオリゴヌクレオチドまたはリポザィムである前記 (3) 記載の方法。
8) 他の態様
この態様では、 以下の発明が提供できる。
(1) 所望の核酸をコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と共に細胞培養面に固定 化した細胞培養器具；好ましくは核酸がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と複 合体粒子を形成している該細胞培養器具；
( 2 ) 所望の核酸を含有するコラーゲンまたはコラ一ゲン誘導体を含むフィルム を細胞培養面に敷いた細胞培養器具；好ましくは所望の核酸がコラーゲンまたは コラーゲン誘導体と複合体粒子を形成している該細胞培養器具；
( 3 ) コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを含む複合体粒子を含 有するフィルムを細胞培養面に敷いた細胞培養器具；
(4) 核酸がライブラリ化されている前記 (1) 乃至 （3) 記載の細胞培養器 具；
(5) 核酸がライブラリ化されている cDNAまたはオリゴヌクレオチドである 前記 4記載の細胞培養器具；
(6) ライブラリ化された核酸がそれぞれ隔てられた位置毎に分画されている前 記 （4) または （5) 記載の細胞培養器具；
(7) コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを含有するフイノレムで あって、 ライブラリ化された核酸がそれぞれ隔てられた位置毎に分画されている フイノレム ；好ましくは核酸がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と複合体粒子を 形成している該フィルム ；
( 8 ) 核酸が c DNAまたはォリゴヌクレオチドである前記 (7) 記載のフィル ム： (9) 前記 (7) または （8) 記載のフィルムを細胞培養表面に敷いた前記 (2) または （3) に記載の細胞培養器具；
(10) タンパク質宪現用の前記 (9) 記載の細胞培養器具；
(1 1) 遺伝子発現抑制用の前記 (9) 記載の細胞培養器具；
(1 2) 細胞における任意の遺伝子の機能を調べる方法であって、 該遺伝子の cDNAを含有した核酸を固定化した前記 (1) 乃至 （6) 記載の細胞培養器具上 で細胞を培養し、 細胞の増殖率、 表現型、 特定のタンパク質の産生量を調べるこ とを特徴とする方法；
(1 3) 細胞における任意の遺伝子の機能を調べる方法であって、 該遺伝子の伝 令 RNAと相補な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを固定化した前記 ( 1 ) 乃至 （6) 記載の細胞培養器具上で細胞を培養し、 細胞の増殖率、 表現型、 特定 のタンパク質の産生量を調べることを特徴とする方法；および
(14) 核酸を固定化した部分以外の細胞培養表面が、 細胞が接着できない高い 親水性あるいは疎水性表面である前記 (1) 乃至 （6) 記載の細胞培養器具。 核酸を固相上で標的の細胞に導入する方法としては、 上述のように核酸をコラ 一ゲンまたはコラーゲン誘導体と共にあるいは、 核酸がコラーゲンまたはコラー ゲン誘導体と形成した複合体粒子として直接固定した細胞培養表面上で標的細胞 を培養する方法がある。 またこれら以外に、 核酸を含有するコラーゲンまたはコ ラーゲン誘導体を含むフィルムあるいは複合体粒子を含有するフィルムを固相表 面上に敷いてその上で標的細胞を培養する方法、 および核酸を含有するコラーゲ ンまたはコラーゲン誘導体またはそれらの複合体粒子を含むァガ口ースゃアルブ ミンから形成されるフィルムを用いる方法がある。
本発明は多種類の核酸をコラーゲンまたはコラ一ゲン誘導体と複合体化して固 相上に独立して整列配置 （ライブラリ化） することにより、 同時に同じ条件で細 胞内での遺伝子の機能を調べることを可能にする。 また、 既にライブラリ化され た cDNAを含む核酸あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドを固相上に整列配 置することで細胞レベルで遺伝子の機能を解析できる遺伝子発現ライプラリある いは遺伝子発現抑制ライブラリを提供する。 ライブラリ化された cDNAを含む核 酸はどのようなものでも良いが、 例えば Gene Storm pcDNA3.1 vector (In Vitrogen社)などが挙げられる。
核酸を含む複合体を固相上に整列配置し、 その上で細胞を培養して導入された 遺伝子の機能を解析する場合、 独立して配置した核酸がそれぞれ導入された細胞 が互いに交じり合うことを避ける必要がある。 これを防ぐ方法として、 各核酸の 配置部分をゥエルで仕切る方法があり、 1プレートあたり 6ゥエルから 3 8 4ゥ エルまで仕切ることが可能である。 また、 これとは別にゥエル以外に細胞が接着 できな 、高い親水性あるレヽは高 、疎水性を有する表面で細胞の核酸配置部分間の 移動を妨げることができる。 ここでいう高い親水性を有する表面とは、 水との接 触角が 4 0度以下の表面であり、 高い疎水性を有する表面とは、 水との接触角が 1 1 0度以上の表面である。 また、 核酸配置部分間の距離は播種する細胞が最も 伸展した場合の長さ以上に保つ必要がある。 このように核酸を固定化あるいは核 酸を含むフィルムを配置する部分以外の細胞培養表面を高い親水性あるいは高い 疎水性表面とすることで、 細胞をゥェルで仕切つて培養する必要がなく、 ミクロ プレート上で多数の遺伝子の機能を一度に解析することが可能となる。 実施例
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。 実施例 1
プラスミド DNAとコラ一ゲンとの複合体の形成
繊維芽細胞増殖因子 HST-1(FGF4)の遺伝子 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2980-2984 (1987))を組み込んだプラスミド DNA(pCAHST-l: 7.9Kbp)を g/ml含む水溶液と 200， 60, 20， 6, 2, 0.6， O gのァテロコラーゲン （(株)高研） を 含む中性水溶液とを等量混合し、 ァガロースゲル電気泳動で分析した。 ァガロー スゲル電気泳動は水平型電気泳動ユニット (Mupid、 （株)アドバンス)にて、 TAE
(トリス '酢酸） 緩衝液中 0.8%ァガロースゲノレを用いて行った。 電気泳動後、 ェチジゥムプロマイドでゲルを染色し、 トランスイルミネーター上で撮影を行つ た。 結果を図 1に示す。 pCAHST-1は lO w g/ml以上の濃度のコラーゲン存在下 では泳動されずゥエルに残留した。 この結果は 5 μ g/mlの pCAHST-1が 10 μ g/mlのコラーゲンと複合体を形成することを示している。
同様に 10 μ g/mlの pCAHST-1と 100 β g/mlのコラ一ゲンを等量、 0.15M、
0·2Μ、 1.0Mの塩化ナトリゥムを含む lOmMトリス塩酸緩衝液 (pH7.5)中で混合 し、 電気泳動で分析した結果を図 2に示す。 pCAHST-1は 100 /i g/mlのコラーゲ ン存在下でも 1.0M塩化ナトリウムが共存すると泳動された。 このことは
pCAHST-1とコラーゲンが形成する複合体は静電的複合体であることを示して いる。
また、 0.15Mの塩化ナトリゥムを含む 10mMトリス塩酸緩衝液 (pH7.5)中、 10 μ g/mlの pCAHST-1とコラーゲンの複合体形成をへパラン硫酸の有無で比較し た。 結果を図 3に示す。 へパラン硫酸が存在しない場合、 S ^u g/m^^pCAHST-l は 100 μ g/mlのコラ一ゲンによりすべて複合体を形成したが、 へパラン硫酸存在 下では 300 μ g/mlのコラーゲン存在下でも複合体を形成していなレ、 pCAHST-1の 存在が確認された。 これは pCAHST-1と同様に負電荷を有するへパラン硫酸が 存在することによって、 コラーゲンとの複合体形成に pCAHST-1とへパラン硫 酸の競争反応が生じたことを示しており、 pCAHST-1とコラーゲンが静電的複 合体を形成することを示唆している。 実施例 2
複合体の顕微鏡観察結果
200 μ g/mlの pCAHST-1水溶液と 0， 20, 200, 1000 μ g/mlのァテ口コラーゲン水 溶液を等量混合し、 得られた混合液に PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent (Molecular Probes)を添加して pCAHST-1を染色して蛍光顕微鏡で観察した。 得 られた結果を図 4に示す。 混合後のコラーゲン濃度が 500 μ g/ml (図中、 コラー ゲン 0.05%) の場合、 主として長径 lmmを超える線維状複合体が観察された力 コラーゲン濃度が 100 μ g/ml (図中、 コラーゲン 0.01%) の場合、 主として 10〜 100 μ mの粒子状複合体が、 さらに ΙΟμ g/ml (図中、 コラーゲン 0.001%) の場 合には、 主として 10 /x m以下の微粒子状複合体が観察された。 この結果は、 混 合時のプラスミド DNAとコラーゲンの濃度によって複合体の形状を制御できる ことを示している。 また、 この複合体は 5°Cに保管することで 1週以上安定にそ の形状が保持された （図 5 ) 。 この結果は、 この複合体が長期間にわたって貯蔵 することが可能であり、 用時調製する必要がなく複合体の状態で流通できること を示している。 実施例 3
複合体による発現期間の延長効果
蛍光を発するタンパク質 (EGFP)をコードするプラスミド DNA pCMV-EGFP/ pEGFP-Nl,クローンテック株式会社) 200 μ g/mlを含有する zk溶液と
0.02%(w/w)のァテロコラ一ゲン水溶液を等量混合することにより、 ゲル状製剤 を調製した。
直径 6cmの培養皿で培養したヒト胎児腎臓細胞株 293細胞に無血清培地 2ml存 在下、 調製したゲル状製剤を 100 μ l(pCMV-EGFP10 μ g 有)添加した。 添加後、 37°Cで一晩培養した後、 細胞表面を PBSで洗浄して無血清培地と製剤を除去し、
10%の子牛血清を含む培地中で培養した。 経時的に細胞を蛍光顕微鏡で観察し、 EG5 の発現を観察した。 対照として同量の pCMV-EGFPを含有する PBS溶液 およびカチォエックリポソーム製剤と pCMV-EGFPの複合体を 293細胞にそれぞ れ添加した。
得られた結果を図 6に示す。 pCMV-EGFPのゲル状製剤の場合、 EGFPの発 現が観察され、 その発現は添加 52日後までの長期間確認された。 これに対し、 pCMV-EGFPを含有する PBS溶液の場合には EGFPの発現が観察されず、 また カチォニックリボソーム製剤では、 EGFPの発現は確認されたが、 その発現は 2 日間という短期間であった。 これらの結果は、 プラスミド DNAをコラーゲンに て製剤化することでプラスミド DNAの発現効率を高めることができ、 力つ発現 を長期間持続させることができることを示している。
この結果はプラスミド DNAとコラ一ゲンが形成した複合体が細胞内へのブラ スミド D NAの移入を高め、 かつ細胞内外でのプラスミド D NAの安定性を高め、 細胞内で遺伝子の発現を長期化していることを示している。 特定の理論にとらわ れるものでないが、 系中に複合体が存在しない状態においても発現が長期間持続 されることは、 複合体が洗浄にて除去されない程度に細胞と相互作用してレヽる 、 あるいは複合体として細胞内に取りこまれることが考えられる。 実施例 4
複合体の組成におけるプラスミド DNA導入効率に対する効果
以下の表 1に示す各種組成の複合体を、 プラスミド DNAとして pCMV-EGFP を用いて調製した。 表 1
Figure imgf000028_0001
結果は、 EGFG-3複合体 > EGFG-2複合体 > EGFG-4複合体 = EGFG-5複 合体の順で導入効率が高かった。 EGFG-1では導入は確認されなかった。 この結 果はプラスミド D N Aがァテロコラーゲンと複合体を形成することでプラスミド D NAの発現効率が高まること、 さらに等量のプラスミド D N Aを含有する複合 体でもァテロコラーゲンの含有量によって発現効率が異なることを示している。 実施例 5
プラスミド DNA導入効率に対するプラスミド DNA量の影響
実施例 4にて最も導入効率が高かった EGFG-3複合体 （ァテロコラーゲン 0.01%、 pCMV-EGFPlOO^ g/ml) 0、 10、 50、 100、 250および 500 /x lを、 6穴 培養皿で培養した 293細胞に無血清培地 lml存在下、 滴加した。 滴加後、 37°Cで 一 ife培養した後、 細胞表面を PBSで洗浄して無血清培地と複合体を除去し、 10%FBS ( 1 0 %牛胎児血清を含む） 培地と培地交換した。 6日間経時的に細 胞を蛍光顕微鏡で観察し、 EGFPの発現を観察した。
プラスミド DNA量を増大させると導入効率も向上した。 具体的データは次の 通りである。 表中、 発現効率は、 顕微鏡で観察できる決まった区画に存在する全 細胞数を計数し、 その中で EGFPを発現して蛍光を発する細胞数を計数して算出 した。 表 2 トランスフエクシヨン効率 EGFG^iyl) 100 250 500
EGFP発現細胞 (細胞 zゥヱル） 262 1057 1081
効率 0.006 0.03 0.03 実施例 6
複合体による発現期間の延長効果における複合体滴加法と固相塗布法の比較 まず、 最も導入効率が高かった EGFG-3複合体 （ァテロコラーゲン 0.01%、 pCMV-EGFP100 /i g/ml) の組成に基づき、 コラーゲンおよびプラスミド DNA 組成の最適化を図りつつ、 滴加法および固相塗布法による発現期間を比較した。
( 1 ) 以下の表 3に示す各種ァテロコラーゲン濃度組成の複合体を、 プラスミド DNAとして DCMV-EGFPを用いて調製した。
表 3 実験 6:ァテロコラーゲン濃度と遺伝子導入効率
Figure imgf000030_0001
6穴培養皿で培養した 293細胞に無血清培地存在下、 調製した複合体を滴加し た。 滴加後、 3 7 °Cでー晚培養した後、 細胞表面を PBSで洗浄して無血清培地 と複合体を除去し、 1 0 %FBSを含む培地と培地交換した。 7日後に蛍光顕微 鏡で観察して EGFPを発現している細胞数を計数した。 結果を図 7に示す。 また EGFG-3B, 3D、 3Eについては、 発現した EGFPの蛍光強度を測定した （Army Scan II System, Cellomics社） 。 各サンプルの相対的な蛍光強度を図 8に示す。
6穴培養皿に調製した複合体 250 / l/ゥエルを塗布し、 30分間風乾した。 次いで、
10%FBSを含有する培地中、 293細胞 （4 - 5xl05細胞/ゥエル） を加え、 37°Cで ー晚培養し、 7日後に蛍光顕微鏡で観察して EGFPを発現している細胞数を計数 した。 結果を図 9に示す。
滴加法による結果を示す図 7および固相塗布法による結果を示す図 9は、 コラ 一ゲン濃度が導入効率に影響を与えること、 および固相塗布法が滴加法よりも導 入効率の点で優れていることを示している。
( 2 ) 以下の表 4に示す各種プラスミド DNA濃度組成の複合体を調製し、 上記 同様に滴加法と固相塗布法における導入効率を比較した。
差替え用紙（«120) 表 4
Figure imgf000031_0001
滴加法による結果を図 1 0に、 固相塗布法による結果を図 1 1に示す。 また、 固相塗布法により得られた各サンプルでの EGFPの相対的な蛍光強度を図 1 2に示 す。 これらの結果は、 プラスミド DNA濃度の比率が導入効率に影響を与え、 特に 固相塗布法では EGFPの発現量とプラスミド、 D NAの濃度の間に正の相関がある こと、 およびここでも固相塗布法が滴加法よりも導入効率の点で優れていること を示している。 実施例 7
固相塗布法のスクリ一ユングへの応用
線維芽細胞増殖因子 HST-1(FGF4)の遺伝子 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2890-2984 (1987)に記載)の 4196bから 4216bまでの配列に相捕的な配列を有した ホスホロチォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド (5，- CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3',分子量：約 6500、 配列番号 2 ) (5) (サヮデ 一株式会社） 10 / Mと 0.05%ァテロコラーゲン液を混合して複合体を形成した。 得られた複合体を細胞培養用 96穴プレートの底部に塗布し風乾し、 複合体が底 部に塗布された細胞培養器具を得た。 同様に HST-1遺伝子と同じ配列を有する ホスホロチォエート型センスオリゴヌクレオチド (5'-
GAGCATCCGCAACATCAACA-3\ 配列番号 3 ) (1)およびァンチセンスオリゴ ヌクレオチドの配列をスクランブノレさせた配列 (5，-
AGTCGCATGCACACAACACA-3\ 配列番号 4 ) (2)および 3種のランダムな配 列 (5，-GACCATCGTCGATTCCAGT-3，、 配列番号 5 ) (3)、 (5'- CATGAACATCCTGAGCATCC-3，酉己歹 U番号 6 ) (4)、 (5'- GTTCACGAAGAAAGAAGGCT-3\ 配列番号 7 ) (6)を有するホスホロチォエー ト型アンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれコラーゲンと複合体を形成さ せてプレートの底部に塗布、 乾燥させた。 これらのオリゴヌクレオチドを塗布し たプレートに HST-1が過剰に発現することによって増殖が促進されている NEC8 細胞と HST-1以外の遺伝子で増殖が促進されている HepG2細胞を 0.5 X 105個/ゥ エルの濃度で播種し、 4日間培養した。 培養後、 細胞の増殖抑制をテトラカラー ワン細胞増殖アツセィ試薬 （生化学工業） を用いて測定した。 具体的には着色し たサンプル液を 6 5 Onmの吸光度を対照として 4 5 Ornnの吸光度を測定した
(図 1 3 ) 。
結果、 HST- 1に対するァンチセンスオリゴヌクレオチドをコラーゲンと複合 体を形成させて塗布した場合にのみ、 NEC8細胞で増殖阻害効果が認められた
(図 1 3— 5 ) 。 一方、 HST-1に対するセンスオリゴヌクレオチドをコラーゲ ンと複合体を形成してプレート底部に塗布した場合には、 阻害効果は認められな かった (図 1 3— 1 ) 。 同様にアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列をスクラ ンプルさせた配列 （図 1 3— 2 ) およびランダムな配列 （図 1 3— 3、 4、 6 ) を有するホスホロチォエート型オリゴヌクレオチドをコラーゲンと複合体を形成 させて塗布した場合には、 阻害効果は認められなかった。 この結果は、 アンチセ ンスオリゴヌクレオチドをァテロコラーゲンと複合体を形成させて固相上に塗布 し、 その固相上で細胞を培養すれば、 カチォニックリボソームゃカチオン性脂質 など通常生体内には存在しない遺伝子導入試薬を用いることなく細胞の増殖に関 与する遺伝子をスクリーニング出来ることを示している。 更にこの結果は、 本方 法によつて遺伝子導入試薬が細胞に与える障害によるノィズなしに、 かつ少量の 細胞おょぴォリゴヌクレオチドで高感度に遺伝子機能を解析できることを示して いる。 実施例 8
ァテロコラーゲンによるアデノウイノレスベクターの風乾保存
(固相塗布法による調製）
1x10s Dfu/mlアデノウイノレスベタター AdCMVEGFP (K. Aoki, et al" Mol. Ther. (2000) 1 (6): 555-565) の DMEM溶液中溶液 10 μ 1を、 ァテロコラーゲン の: PBS (—)中 2%溶液 5 μ ΐと混合した。 この混合物 50 1を 24ゥエル培養プレー ト （非被覆） （コ一二ング社） に添加し、 冷セットのドライヤーにより室温にて 15分間風乾し、 固相塗布を行った。
(ウィルスの保存安定性試験）
得られた培養プレートを室温に放置しつつ、 放置後 1日、 7日および 14 Θ目に ヒト肝癌細胞株 HepG2細胞を 2χ105細胞/ゥエルで加え、 それぞれの 2日後に GFP の発現量を蛍光顕微鏡によって確認した。 対照として、 アデノウイルスベクター のみ、 およびァテロコラーゲンのみを培養プレートに固相塗布し、 同様に実験を 行った。
得られた結果を表 5に示す。
表 5 「結果 J
細胞播種 2日後の GFP陽性率 （％) ァテロ Zアデノ アデノのみ ァテロのみ
1日間 6 4 7 2 0
7日間 4 2 1 0以下 0
4日間
実施例 9
固相塗布法での遺伝子導入効果のアデノウィルス用量依存性
4 X 104 , 4 X 105， 4 X 106， 4 X 107 pfu/mlのアデノウイルスベクター AdCMVEGFP (K. Aoki, et al. Mol. Ther. (2000) 1 (6)： 555-565)の DMEM溶液を 160 // g/m 1のァテロコラ一ゲン溶液と等量混合した。 この混合物は 4°Cで長期 間活性を低下することなく保存できた。 混合物 50 1を 96ウエノ M#養プレート
(非被覆、 コーエング社） に添加し、 風乾し固相塗布を行った。 このプレートは 活性を低下させることなく、 少なくとも 2週間から 4週間の間保存可能である。 羞替え用紙（規則 26) 得られた培養プレートに胚幹細胞 （ES細胞） を播種し、 3日後に GFPの発現を蛍 光顕微鏡で確認すると共に、 蛍光強度を測定した。 結果、 GFPの蛍光強度はァ デノウィルスの投与量と正の相関があった （図 1 4 ) 。 この結果は、 本発明がァ デノウィルスを用いた ES細胞のハイスループットスクリーニングに有用な技術で あり、 アデノウィルスとコラーゲンが形成した複合体を塗布したハイスループッ トスクリーニング用プレートが提供できることを示している。 実施例 1 0
プラスミド DNAを含有する複合体の組成と平均長径との関係
10°C以下に冷却した蛍光を発するタンパク質 (EGFP)をコードするプラスミド
DNA pCMV-EGFP/pEGFP-Nl, 4.7kbp, クローンテック株式会社) 200 μ g/ml を含有する水溶液、 0.1Mリン酸緩衝液 (PB)、 塩化ナトリゥムを含む 0.01Mリン 酸緩衝夜 (PBS)と、 10°C以下に冷却した 0.002〜0.2%(w/w)のァテ口コラーゲン ((株)高研） を含有する水溶液、 0.1Mリン酸緩衝液、 塩化ナトリウムを含む 0.01Mリン酸緩衝液をそれぞれ 10°C以下で等量混合し、 一晩 10°C以下で静置す ることによりゲル状製剤を調製した。 得られたゲル状製剤を 70 μ ηι、 あるいは 10 μ mの孔径を有するフィルターを通過させ、 整粒したゲル状製剤を調製した。 得られた製剤に PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent (Molecular Probes) を添加して pCMV-EGFPを染色し蛍光顕微鏡で観察することにより、 複合体の 長径を測定した。 同様に HST-1の分泌シグナルぺプチドとインターロイキン 2を コードするプラスミド DNA pCMV-HST-l-IL-2、 6.2kbp)とァテロコラーゲンを 混合してゲル状製剤を得、 複合体の長径を測定した。 また、 得られたゲル状製剤 をァガロースゲル (トリス '酢酸緩衝液、 0.8%ァガロースゲル)で電気泳動するこ とによって、 複合体を形成したプラスミド DNAと形成しなかったプラスミド DNAを分離した。 複合体を形成しなかったプラスミド DNAのバンドをェチジゥ ムプロマイドで染色し、 蛍光強度を Pluor-S-Multi Imager(BIO-RAD)を用いて 測定した。 濃度既知のプラスミ DNAを電気泳動したバンドの蛍光強度から得 られる検量線を基に、 複合体を形成しなかったプラスミド DNA量を定量し、 複 合体に含まれる DNAの負電荷量とコラーゲン分子量の比を算出した。 結果を表 6に示す。 表 6
Figure imgf000035_0001
塩を含有しない水を溶媒として複合体を調製した場合、 pCMV-EGFP, pCMV-HST-l-IL-2共にコラーゲン濃度が 0.05%以上の場合、 平均長径が 122 μ m 以上の複合体が得られた。 またコラーゲン濃度力 S0.005% 0.02%の時には平均 長径 6.1 ^ n！〜 53 μ mの複合体が、 コラーゲン濃度が 0.001%の時には平均長径 10 μ ηι以下の複合体が得られた。 この結果は、 塩を含有しない水を溶媒とした場合、 混合時のプラスミド DNAとコラーゲンの濃度の調節によって複合体の形状を制 御できることを示している。 特にコラーゲンの濃度を高くする、 即ちコラーゲン の分子数を増加すると複合体の形状は大きくなる傾向があつたが、 これは複合体 の長径の増大が専らコラーゲン分子による会合体形成に依存することを示してい る。
この結果は、 実施例 2において pCAHST-1を用いて複合体を調製した結果と 一致している。 使用した各プラスミド DNAのサイズはそれぞれ、 pCAHST-1： 7.9kbp, pCMV-EGFP： 4.7kbp、 pCMV-HST-l-IL-2： 6.2kbpと相互に異なつ ている。 このことも、 プラスミド DNAのサイズは、 形成される複合体の形状に 影響しないことを示している。
他方、 0.1Mリン酸緩衝液および塩化ナトリゥムを含む 0.01Mリン酸緩衝液を 溶媒として複合体を調製した場合、 コラーゲン濃度が 0.001%〜0.1%の時、 複合 体平均長径が 3.4 μ m以下〜 29 μ mの複合体が得られ、 100 μ mを超えるサイズの 複合体は得られなかった。 これは塩の存在によってコラーゲンの会合体形成が抑 制されるためと考えられ、 コラーゲンの会合体形成を抑制する物質の存在下複合 体を調製することで 100 m以下の平均長径を有する複合体をコラーゲンの濃度 に依らず調製できることが示された。
また、 一且プラスミド DNAとコラーゲンを混合して得られたゲル状製剤を 70 /i mあるいは 10 z mの孔径を有するフィルターでろ過することによって、 より平 均長径の小さレヽ複合体に整粒して得ることができた。
図 1 5にプラスミド DNA1分子に結合したコラーゲンの分子数と複合体の平均 長径の関係を示した。 塩を含有しない水を溶媒とした場合、 pCMV-EGFP, pCMV-HST-l-IL-2共にプラスミド DNAに結合するコラーゲン分子数が多くなる に従って複合体の平均長径が増大する傾向が見られた。 一方、 0.1Mリン酸緩衝 液、 塩化ナトリゥムを含む 0.01Mリン酸緩衝液を溶媒として複合体を調製した場 合には、 そのような傾向は見られず、 水を溶媒とした場合には平均長径が 100 μ mを超えるコラーゲン分子がプラスミド DNAと複合体を形成した場合でも平均 長径は 50 mを超えなかった。 これは先に述べたように水を溶媒とした場合、 プラスミド DNAとコラーゲンが複合体を形成するのに伴ってコラーゲン会合体 の形成が進展する力 この反応は専ら会合体の長軸を延伸する反応であるためと 考えられる。 一方、 塩が存在する場合には、 コラーゲン分子がプラスミド DNA と結合して形成されたコラ一ゲン会合体が塩の存在によつて充分に会合体の長軸 方向に延伸できないため、 微細な会合体がプラスミド DNAに多数結合する構造 をとるためと考えられる。 他方、 コラーゲンは適当な塩濃度において微細な会合 体を形成することが知られていることから、 一部のコラーゲンはプラスミド DNAと混合する前に予め微細な会合体を形成し、 プラスミド DNAと微細なコラ 一ゲン会合体が結合して複合体を生成したと考えられる。 このことは、 予めコラ 一ゲンを微細会合体化してプラスミド DNAと混合することで、 平均長径 50 μ m 以下の複合体を生成できることを示している。
今回得られた結果をブラスミド DNAのサイズに依らず一般化して解析するた め、 複合体中のコラーゲン 1分子あたりのプラスミド DNAのヌクレオチドモノマ 一数を算出した。 コラーゲン 1分子あたりのプラスミド DNAのヌクレオチドモノ マー数と複合体の平均長径の関係を図 1 6に示した。 コラーゲン 1分子あたり、 プラスミド DNAのヌクレオチドモノマー数が少なくなるに従って複合体の平均 長径が增大する傾向が見られた。
図 1 6と表 6を総合すると次のことが導かれる。 ヌクレオチドモノマー数が 95以下になった場合、 平均長径が 120μ ιηを超える複合体が得られた。 このこと は、 コラーゲン 1分子あたりのヌクレオチドモノマー数の減少が複合体中のプラ スミド DNAに対するコラーゲン分子数の増大を示し、 よってコラーゲン 1分子 あたりのプラスミド DNAのヌクレオチドモノマー数を 96以上に保つことによつ て平均長径が 120 μ m以下の複合体を得ることができることを意味している。 一 方、 複合体の最少単位はコラーゲン 1分子とプラスミド DNA1分子が形成する複 合体である。 コラーゲン 1分子と複数のプラスミド DNAが複合体を形成すること は、 プラスミド DNA間の負電荷による反発と立体的な障害により困難である。 従って、 コラーゲン 1分子あたりのヌクレオチドモノマー数が最大になるのは、 コラーゲンとプラスミド DNAが各々 1分子で複合体を形成した場合であり、 プラ スミド DNAが有するヌクレオチドモノマー数により規定される。 実施例 1 1
オリゴヌクレオチドを含有する複合体の組成と平均長径との関係
線維芽細胞増殖因子 HST-1(FGF4)の遺伝子 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2890-2984 (1987)に記載)の 4196bから 4216bまでの配列に相補的な配列を有した ホスホロチォエート型ァンチセンスオリゴヌクレオチド (5'-
CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3',分子量：約 6500、 配列番号 8 ) (エスペック 株式会社)を 2.0 μ Μ〜40.0 μ Μの濃度で含有し、 10°C以下に冷却した水溶液、 0.1Mリン酸緩衝液 (PB)と、 10°C以下に冷却した 0.02〜3.0%(w/w)のァテロコラ 一ゲン （(株)高研） を含有する水溶液、 0.1Mリン酸緩衝液をそれぞれ 10°C以下 で等量混合し、 10°C以下でー晚静置するとによりゲル状製剤を調製した。 得ら れたゲル状製剤中でコラーゲンと複合体を形成したオリゴヌクレオチド量は、 ゲ ル状製剤を 5°Cで 1時間 15万回転で遠心して複合体を沈殿させ、 上澄み液中の遊 離したォリゴヌクレオチド量を HPLC (力ラム ： Puresil C18 5 (Waters),移動 相： ImMの EDTA, 5mMのテトラプチルアンモェゥムを含有する 0.1M酢酸アン モェゥム (pH 7.0)中のァセトニトリル含量を 35分間で 24.5%から 35%に変化，流 速： lml/min，検出波長： 260nm)で定量して算出した。 得られた製剤に単鎖核 酸蛍光染色試薬 YOYO (Molecular Probes)を添加してォリゴヌクレオチドを染色 し蛍光顕微鏡で観察することにより、 複合体の長径を測定した。 結果を表 7に示 す。 表 7
Figure imgf000038_0001
プラスミド DNAを用いた実施例 1 0と同様に、 オリゴヌクレオチドをコラ、 ゲンと混合することでオリゴヌクレオチドとコラーゲンの複合体が得られた。 プ ラスミド DNAの場合と異なり、 塩を含有しない水を溶媒とした場合、 0.1Mリ ン酸緩衝液を溶媒とした場合共に、 コラーゲンの濃度およびオリゴヌクレオチド の濃度によって複合体の平均長径に顕著な変化は見られなかった。 これはオリゴ ヌクレオチドがプラスミド DNAに比べて低分子であるため、 コラーゲンの会合 体形成を阻害するためと考えられる。
図 1 7に混合時のオリゴヌクレオチドとコラーゲンの分子数の比と複合体中で コラーゲン 1分子に結合したオリゴヌクレオチドの分子数の関係を示した。 水、 リン酸緩衝液のいずれを溶媒として用いた場合でも、 混合時のコラーゲン分子数 に対するオリゴヌクレオチド分子数が高いほど、 形成される複合体中でコラーゲ ン 1分子に結合したオリゴヌクレオチド分子数が高くなる傾向があった。 また、 コラーゲン 1分子に結合する最大のオリゴヌクレオチド分子数は溶媒によって異 なり、 水を溶媒とした場合 6分子、 リン酸緩衝液を溶媒とした場合には 3分子で めった。
コラーゲンの分子量 (30万)はオリゴヌクレオチドの分子量 (約 6,500)に比べて非 常に大きく、 複合体の形状は専ら複合体を形成するコラーゲン分子数に依存する ことから、 平均長径が同じ複合体中のコラーゲン分子数はほぼ同数である。 従つ て平均長径が同じ複合体でもコラ一ゲン 1分子に結合したォリゴヌクレオチド数 に依存して、 複合体に含有されるオリゴヌクレオチド分子数が異なる。 細胞にォ リゴヌクレオチドを導入する際、 個々の複合体が細胞と接触してォリゴヌクレオ チドを導入するため、 オリゴヌクレオチド分子の含量が高い複合体の方が効率的 に細胞にオリゴヌクレオチドを導入できる。 従ってコラーゲン 1分子あたりのォ リゴヌクレオチド分子数が高い複合体がより望ましく、 一般化すればコラーゲン 1分子あたりに結合するヌクレオチドモノマー数が高いものがより望ましい。 実施例 1 2
オリゴヌクレオチドを含有する複合体を塗布した細胞培養器具
実施例 1 1で調製したゲル状製剤 (11-3、 実施例 7における製剤の組成) 50 1 を 96穴マイクロプレートの底部に滴下し、 冷風を直接吹き付ける方法 (室温、 2 時間)あるいはデシケーター中にシリカゲルと共に静置する方法 (室温、 間)で 乾燥し、 複合体を細胞培養表面に塗布した細胞培養器具を調製した。 細胞培養 器具のゥエルに塩化ナトリゥムにより生体と等張に調整した 0.01Mリン酸緩衝液 (PBS)100 / lを添加し、 直ちに軽くピペッティングして液を採取した。 また、 細 胞培養器具のゥエルに塩化ナトリウムにより生体と等張に調整した 0.01Mリン酸 緩衝液 100 xlを添加し、 37°Cでー晚静置した後、 軽くピぺティングして液を採 取した。 得られた液 10 β 1に単鎖核酸蛍光染色試薬 YOYO (Molecular Probes)2 μ 1を添加してオリゴヌクレオチドを染色し、 細胞培養器具表面から遊離した複合 体を蛍光顕微鏡で観察した。 得られた蛍光顕微鏡像を図 1 8に示した。 採取した すべての液で、 50 μ ιη以下の長径を有する複合体が確認された。 これは PBSに 暴露することで、 細胞培養器具表面から複合体が遊離されることを示している。 遊離した複合体の形状は、 乾燥方法、 PBSへの暴露の状態に関わらず、 細胞培 養器具表面に塗布する前と変化がなかった。 この結果は、 乾燥方法に依らず複合 体が形状を保持した状態で細胞培養器具表面で保持されたことを示しており、 更 に一般に細胞培養に使用される 37°Cという温度条件においても複合体の形状が 変化しないことを示している。 実施例 1 3
プラスミド DNAを含有する複合体を塗布した細胞培養器具
実施例 1 0で調製したゲル状製剤 (10-3；実施例 6にて良好な導入効率が確認 された組成) 50 μ ΐを 96穴マイクロプレートの底部に滴下し、 7令風を直接吹き付け る方法 (室温、 2時間)あるいはデシケーター中にシリカゲルと共に静置する方法 (室温、 2日間)で乾燥し、 複合体を細胞培養表面に塗布した細胞培養器具を調製 した。 細胞培養器具のゥエルに塩化ナトリウムにより生体と等張に調整した 0.01Mリン酸緩衝液 (PBS OO^ lを添加し、 直ちに軽くピペッティングして液を 採取した。 また、 細胞培養器具のゥエルに塩化ナトリウムにより生体と等張に調 整した 0.01Mリン酸緩衝液 100 //1を添加し、 37°Cで一晚静置した後、 軽くピぺテ ィングして液を採取した。 得られた液 10 μ 1に PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent (Molecular Probes) 2 μ 1を添加してプラスミド DNAを染色し、 細胞培 養器具表面から遊離した複合体を蛍光顕微鏡で観察した。 得られた蛍光顕微鏡像 を図 1 9に示した。 採取したすべての液で、 100 μ ιη以下の長径を有する複合 体が確認された。 これは PBSに暴露することで、 細胞培養器具表面から複合体 が遊離されることを示している。 遊離した複合体の形状は、 乾燥方法、 PBSへ の暴露の状態に関わらず、 細胞培養器具表面に塗布する前と変化がなかった。 こ の結果は、 乾燥方法に依らず複合体が形状を保持した状態で細胞培養器具表面で 保持されたことを示しており、 更に一般に細胞培養に使用される 37°Cという温 度条件においても複合体の形状が変化しないことを示している。 実施例 1 4
複合体を塗布した細胞培養器具による遺伝子導入
6ゥエルの細胞培養プレートに実施例 1 0で調製した pCMV- EGFPを含有したゲ ル状製剤 10-1、 10-4、 10-7を 300 μ ΐ添加し、 冷風を吹きかける方法で乾燥して pCMV-EGFを含有した複合体が塗布された細胞培養器具を調製した。 対照群として IOO g/mlの pCMV- EGFPを含有する水溶液 300 /ζ 1をプレート上に添加し、 同様に乾 燥させた。 各ゥエルに 293細胞 7. 5 X 104個を播種し、 10%FBSを含む DMEM培地を加 えて 37°Cで培養した。 培養開始後、 4、 5日おきに培地を新鮮な培地に交換した。 細胞播種 11日後、 蛍光顕微鏡で細胞を観察して GFPを発現している細胞数を計測 し、 導入効率を算出した。
同様に 6ゥエルの細胞培養プレートに実施例 1 0で調製した pCMV-HST- 1-IL - 2 を含有したゲル状製剤 10- 13〜22, 24を3 ΟΟ μ 1あるいは 500 μ 1添加し、 冷風を吹き かける方法で乾燥して PCMV- HST- 1- IL- 2を含有した複合体が塗布された細胞培養 器具を調製した。 対照群として 100 g/mlの pCMV-HST-卜 IL- 2を含有する水溶液、 PB液、 P B S液 300 ^ 1ぁるぃは500 1をプレート上に添加し、 同様に乾燥させた。
1 ) 293細胞へのプラスミド DNAの導入
ゲル状製剤 300 1を塗布した各ゥエルに 293細胞 7. 5 X 104個を播種し、 10 - 13 〜19については 10%FBSを含む DMEM培地を加えて 37°Cで培養した。 細胞播種 8日後 に培地を交換し、 11日後培地を採取して培地中の IL- 2濃度を ELISAで測定した (Quamtikine human IL-2 (R&D Systems) ) 0 10- 20〜22については、 DMEM培地を加 えて 37°Cで培養ー晚培養し、 翌日培地を 10%FBSを含む DMEM培地に交換して 37°Cで 培養した。 細胞播種 8日後、 11日後に培地を交換し、 15日後培地を採取して培 地中の IL- 2濃度を ELISAで測定した。 また、 10- 20， 21， 24については、 10%FBSを含 む DMEM培地を加えて 37°Cで培養した。 細胞播種 8日後に培地を採取して培地中の IL-2濃度を ELISAで測定した。
2 ) N I H 3 T 3細胞へのプラスミ ド DNAの導入
10— 14〜17を 50() ί 1塗布したゥエルに NIH3T3細胞 5 X 104個を播種し、 10°/。FBSを 含む DMEM培地を加えて 37°Cで培養した。 細胞播種 8日後に培地を採取して培地中 の IL- 2濃度を ELISAで測定した。
上記 1 ) および 2 ) にて得られた結果を表 8と表 9にまとめた。 PCMV_EGFP、 pCMV-HST-1- IL- 2共にコラ一ゲンと複合体を形成して細胞培養器具に塗布するこ とによって遺伝子を効率的に 293細胞並びに NIH3T3細胞に導入できた。 この結果 は、 本発明の複合体による遺伝子導入促進効果がプラスミド DNAの種類、 細胞種 および培養液中の血清の有無に依らないことを示している。 また、 プラスミド DNAの場合、 コラーゲン 1分子あたりのヌクレオチドモノマー数が 1112以下で複合 体平均粒子径が 151 μ m以下の複合体を塗布した場合、 優れた導入効率および遺伝 子発現が確認された。 表 8 サンフ。ル名 コラ-ゲン 1分子あたりの 複合体平均長径 m) 導入効率
ヌクレ;f モノマ ~¾
対照例 0.0028
10-1 2406 9.1 0.0760
10-4 299 53 0.0729
10-7 66 303 0.0374 表 9
Figure imgf000043_0001
実施例 1 5
複合体添加による細胞への遺伝子導入
6ゥエルの細胞培養プレートに 293細胞 5 X 104個を播種し、 10%FBSを含む DMEM培地存在下 37°Cで培養した。 播種 3日後実施例 1 0で調製した pCMV- EGFPを含有したゲル状製剤 10-1、 10-4、 10-7、 10-8、 10-9、 10- 10と対照とし て 100 μ g/mlの pCMV-EGFPを含有する水あるいは PB溶液をそれぞれ 300 μ 1添 加し、 10%FBSを含む DMEM培地存在下 37°Cでー晚培養した。 翌 0、 鍾羊な培 地に交換して、 10-1、 10-4、 10-7については 1 3日間、 10-8、 10-9、 10- 10につ いては 5日間培養後、 蛍光顕微鏡で細胞を観察して GFPを発現している細胞数 を計測した。
同様に 6ゥエルの細胞培養プレートに 293細胞 7.5 X 104個を播種し、 10%FBS を含む DMEM培地存在下 37°Cで培養した。 播種 2日後実施例 1 0で調製した pCMV-HST-l-IL-2を含有したゲル状製剤 10-20、 10-21と対照として lOO g/ml の pCMV-HST-l-IL-2を含有する PB溶液をそれぞれ 300 μ 1添加し、 10%FBSを 含む DMEM培地存在下 37°Cで一 B免培養した。 翌日、 譲な培地に交換して 5日 間培養後、 培地を採取して培地中の IL-2濃度を ELISAで測定した (Quamtikine human IL-2 (R&D Systems))。
得られた結果を表 1 0、 1 1、 1 2にまとめた。 pCMV-EGFP、 pCMV-HST- 1-IL-2共にコラーゲンと複合体を形成して細胞に添加することによつて遺伝子を 効率的に細胞に導入できた。 本実施例のように複合体の平均長径が 53 μ ηι以下 の場合、 コラーゲン 1分子あたりのヌクレオチドモノマー数力 S2406以下、 更には 701以下の複合体を細胞に添加した場合、 優れた導入効率及ぴ遺伝子発現が確認 された。 表 1 0
Figure imgf000044_0001
サン, 'レ名 溶媒 コラ-ゲン 1分子あたりの 複合体平均長径 ( m) EGFP発現細胞数
ヌクレ杼ドモノマ ~¾
対照例 PB 100
10-8 PB 448 ぐ 3.4 128
10-9 PB 152 7.7 1200
10-10 PB 97 22 12000 表 1 2
Figure imgf000045_0001
産業上の利用の可能性
本発明の複合体は、 所望の核酸をコラーゲンまたはコラーゲン誘導体と複合体 化して保護、 安定化し、 2 ) 体内に投与することによって所望の核酸を効率よく 細胞に導入でき、 3 ) 特別の遺伝子導入試薬を使わずとも、 核酸の発現および抑 制が可能である。 また、 1 ) DNA、 了ンチセンスオリゴヌクレオチド、 ウィル スベクターを保護、 安定化し、 2 ) プレート上に塗布し、 乾燥した状態で長期間 保存が可能であり、 3 ) その上に細胞を播くことで特別な遺伝子導入試薬を使わ ずとも、 遺伝子の発現が可能であり、 4 ) その対象となる核酸の種類および固定 化される形態を選ばず、 また、 5 ) プラスミ ド DNAを用いた場合、 発現期間が 非常に延長されるという特个生から、 種々の応用が可能である。
本発明によれば、 細胞の増殖、 細胞の形態またはサイト力インやレセプターの 発現量などを測定することでァンチセンスオリゴヌクレオチドにより発現が抑制 された遺伝子またはタンパク質の機能を容易に解明することができる。 加えて、 コラーゲンと複合体を形成させてプレート上に塗布できるのはァンチセンスオリ ゴヌクレオチドに限られず、 リボザィムの場合にはアンチセンスオリゴヌクレオ チドと同様のスクリーニングが可能であり、 さらにプラスミド DNAあるいはァ デノウィルスの場合は特定の遺伝子の発現による細胞の変ィヒを測定して遺伝子ま たはタンパク質の機能を解析することが可能となる。 特に本複合体を構成してい るコラーゲンあるいはコラーゲン誘導体は、 細胞に障害を与えないことが知られ ていることから、 本発明の複合体を用いたスクリーニングでは、 一般の遺伝子導 入剤を用いた時に生じる非特異的な細胞への影響を極力排した遺伝子機能の解析 を行うことが可能である。

Claims

請 求 の 範 囲
I . コラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含有する、 標的細胞への核酸導入促進 剤。
2. コラーゲンまたはコラーゲン誘導体が所望の核酸と複合体を形成して含有さ れている、 請求項 1記載の標的細胞への核酸導入促進剤。
3 . 該複合体が粒子である、 請求項 2記載の核酸導入促進剤。
4. 該複合体粒子の長径が 300nm〜300 μ mである、 請求項 2記載の核酸導入促 進剤。
5 . 所望の核酸がプラスミド DNAである請求項 2力 ら 4までのいずれか記載の 核酸導入促進剤。
6 . 該複合体におけるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とプラスミド DNAのヌクレオチドモノマー数の比が 1 ： 2 0〜 1 ：プラスミド DNAのヌクレ ォチドモノマー数である、 請求項 5記載の核酸導入促進剤。
7. 所望の核酸がオリゴヌクレオチドである請求項 2から 4までのいずれ力記載 の核酸導入促進剤。
8 . 該複合体におけるコラ一ゲンまたはコラ一ゲン誘導体分子数とオリゴヌタレ ォチドのヌクレオチドモノマー数の比が 1 ： 1〜1 ： 2 0 0である、 請求項 7記 載の核酸導入促進剤。
9 . コラーゲンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを含む複合体粒子。
1 0. 長径が 300nn！〜 300 μ mである、 請求項 9記載の複合体粒子。
I I . 所望の核酸がプラスミド DNAである請求項 9または 1 0記載の複合体粒 子。
1 2 . 該複合体におけるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とプラスミド DNAのヌクレオチドモノマー数の比が 1 ： 2 0〜 1 ：プラスミド DNAのヌクレ ォチドモノマー数である、 請求項 1 1記載の複合体粒子。
1 3 . 所望の核酸がオリゴヌクレオチドである請求項 9または 1 0記載の複合体 粒子。
1 4. 該複合体におけるコラーゲンまたはコラーゲン誘導体分子数とオリゴヌク レオチドのヌクレオチドモノマー数の比が 1 ： 1〜1 ： 2 0 0である、 請求項 1 3記載の複合体粒子。
1 5 . コラーゲンの会合体形成を抑制する物質を含有する溶液中にて、 コラーゲ ンまたはコラーゲン誘導体と所望の核酸とを混合することを特徴とする、 請求項 9から 1 4までのいずれ力記載の複合体粒子を調製する方法。
1 6 . 請求項 9から 1 4までの ヽずれか記載の複合体粒子が表面に塗布されてい る医療用具。
1 7 . 請求項 9から 1 4までのいずれか記載の複合体粒子が細胞培養面に塗布さ れている細胞培養器具。
1 8 . 請求項 9から 1 4までのいずれ力記載の複合体粒子を使用することを特徴 とする、 所望の核酸を標的細胞に導入するための方法。
1 9 . 請求項 9から 1 4までのいずれ力記載の複合体粒子を使用することを特徴 とする、 所望の核酸の標的細胞における発現効率を向上させるための方法。
2 0 . 標的細胞における遺伝子またはタンパク質の機能を調べる方法であって、 該遺伝子もしくは該タンパク質をコードする核酸または該遺伝子もしくは該タン パク質の発現を細胞内で阻害する核酸を含む請求項 9から 1 4までのいずれか記 載の複合体粒子を固相表面に塗布し、 その固相表面上で該標的細胞を培養し、 該 標的細胞における該核酸の発現レベルまたは該遺伝子もしくは該タンパク質の発 現レベル、 または細胞の増殖率もしくは表現型を調べることを特徴とする方法。 2 1 . ある疾患に関与する遺伝子の発現を細胞内で阻害する核酸の候捕核酸を含 む請求項 9から 1 4までのいずれ力記載の複合体粒子を固相表面に塗布し、 その 固相表面上にて該疾患状態にある細胞を培養し、 各候補核酸によつて阻害される 該遺伝子の発現レベル、 または細胞の増殖率もしくは表現型を調べることを特徴 とする、 該疾患を処置できる核酸をスクリーニングする方法。
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