KR100888566B1 - 핵산 도입을 촉진시키는 방법 - Google Patents

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Abstract

목적하는 핵산을 효율적으로 세포에 도입하는 수단을 제공한다. 상기 수단은 콜라겐 또는 이의 유도체 및 목적하는 핵산을 포함하는 복합체를 이용하는 것을 특징으로 한다.

Description

핵산 도입을 촉진시키는 방법{METHOD OF PROMOTING NUCLEIC ACID TRANSFER}
본 발명은 의료 분야, 특히 유전자 치료 및 유전자 관련 기초연구 분야에 속한다. 상세하게는, 본 발명은 원하는 핵산의 표적세포로의 도입을 촉진시키는 제제 및 그것을 위한 방법에 관한 것이다.
최근, 유전자 치료에 관한 연구가 활발히 시도되고 있으며, 실제로 각종 암이나 유전자 질환에 임상 응용되고 있다. 유전자 치료란, 정상 유전자를 세포에 보충하거나, 유전자의 결함을 복원, 수정함으로써 병을 치료하는 수법으로, 목적 산소, 사이토카인 등의 유전자를 환자의 세포내에 도입하고, 그 유전자에 의하여 체내에 목적으로 하는 물질을 생산시켜 질환을 치료하는 것이다. 유전자 치료는 생명활동의 근간을 제어하는 치료법으로, 암이나 유전자 질환뿐만 아니라 AIDS, 만성 관절 류머티즘, 생활습관병 등 다양한 병의 치료에 대해 가능성이 있다.
유전자 치료에 있어서, 유전자의 표적세포로의 도입 효율은 치료의 유효성을 높이는 데에 중요한 인자이다. 암에 대한 유전자 치료방법으로서 아데노바이러스 등에 의한 방법 (Cardiovascular Research, 28, 445(1994);Science, 256, 808(1992);Gastroenterology, 106, 1076(1994);TIBTECH, 11, 182(1993);J.Biol.Chem, 266, 3361(1991);Nature Medicine, 1, 583(1995) 및 이들의 인용문헌) 및 리포솜 제제를 이용하는 방법 (Biochem Biophys Acta, 1097, 1(1991);Human Gene Therapy, 3 399(1992);Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11277(1992)) 이 있다. 바이러스 벡터를 이용하는 방법은 리포솜 제제를 이용하는 방법에 비하여 유전자의 도입 효율이 일반적으로 높다. 그러나, 바이러스에 유래하는 면역반응 때문에 복수회의 투여가 어렵다는 문제가 있다 (J. Biol. Chem.,269, 13695(1994), Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 10, 369(1994)).
한편, 인간의 전체 유전정보 (인간 게놈) 의 해독이 거의 완료되었으므로, 앞으로 그 인간 게놈 정보를 어떻게 의료나 산업에 활용해 나갈 것인가라는 포스트 게놈에 연구의 비중이 놓여지게 되었다. 즉, 해명된 유전정보에 기초하여, 인간 유전자의 해명이나, 그에 따라 코딩되는 단백질의 구조, 기능의 해석의 중요성이 강조되고 있다. 그러한 포스트 게놈 연구에서는 유전정보를 해명하기 위하여 단백질을 발현시켜 생산할 필요가 있으며, 그러기 위해서는 목적 유전자를 세포에 도입하는 것이 필수적이다. 한편, 도입한 유전자가 숙주세포의 게놈에 삽입되지 않는 아데노바이러스 벡터나 리포솜 벡터, 플라스미드 DNA 벡터에서는, 도입한 유전자의 발현이 일과성(一過性)이고, 정상적으로 유전자를 발현시킬 수 없으나, 이 정상적인 유전자 발현은 유전자 치료나 유전자 기능의 해석에 중요하다.
발명의 개시
이와 같이, 유전자를 구성할 수 있는 핵산을 원하는 세포에 효율적으로 도입 하고, 또한 숙주세포의 염색체에 유전자를 삽입하지 않고 유전자를 장기간 발현시키는 수법에는 큰 유용성을 기대할 수 있다.
본 발명자들은 콜라겐의 의외의 작용을 발견하여, 핵산을 원하는 세포에 효율적으로 도입하는 수법을 발견하였다. 상세하게는, 콜라겐과 플라스미드 DNA 등의 핵산을 조합하면, 의외로 이들이 복합체를 형성하고, 그것이 핵산 세포로의 도입을 촉진시키고, 또한 유전자를 장기간 발현시킴을 발견하였다. 또한, 유전자를 콜라겐 등의 생체 친화성 재료로 이루어지는 담체에 담지시킨 유전자 제제가 개시되어 있는데 (일본 공개특허공보 평9-71542 호), 그 유전자 제제는 유전자를 생체내에 있어서 서방화시키는 서방성 제제로서 기재되어 있다.
이와 같이, 본 발명은 콜라겐 또는 콜라겐 유도체의 신규한 용도를 기초로 하는 것이다.
즉, 본 발명은 (1) 콜라겐 또는 콜라겐 유도체를 함유하는 표적세포로의 핵산 도입 촉진제;
(2) 콜라겐 또는 콜라겐 유도체가 원하는 핵산과 복합체를 형성하여 함유되어 있는 핵산 도입 촉진제, 바람직하게는 이 복합체가 입자인 핵산 도입 촉진제, 좀더 바람직하게는 이 복합체 입자의 장경이 300㎚∼300㎛, 더욱 바람직하게는 300㎚∼100㎛, 더욱 바람직하게는 300㎚∼50㎛, 더욱 바람직하게는 300㎚∼30㎛ 의 복합체를 함유하는 핵산 도입 촉진제; 구체적으로는 핵산이 플라스미드 DNA 인 경우, 이 복합체에 있어서의 콜라겐 또는 콜라겐 유도체 분자수와 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 단량체수의 비가 1:20∼1:플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 단량체수, 바람직하게는 1:50∼1:플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 단량체수, 보다 바람직하게는 1:50∼1:4000, 보다 더 바람직하게는 1:50∼1:2000, 특히 바람직하게는 1:50∼1:1000 이다. 또는 핵산이 올리고뉴클레오티드인 경우, 이 복합체에 있어서의 콜라겐 또는 콜라겐 유도체 분자수와 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단량체수의 비가 1:1∼1:200, 바람직하게는 1:3∼1:150, 보다 바람직하게는 1:20∼1:120, 보다 더 바람직하게는 1:50∼1:120 인 핵산 도입 촉진제;
(3) 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 원하는 핵산을 함유하는 복합체 입자;
(4) 콜라겐의 회합체 형성을 억제하는 물질을 함유하는 용액 중에서, 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 원하는 핵산을 혼합하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 복합체 입자를 제조하는 방법;
(5) 상기 (3) 의 복합체 입자가 표면에 도포되어 있는 의료용구, 또는 이 복합체 입자가 세포 배양면에 도포되어 있는 세포배양기구;
(6) 상기 (3) 의 복합체 입자를 사용하는 것을 특징으로 하는, 원하는 핵산을 표적세포에 도입하기 위한, 또는 원하는 핵산의 표적세포에 있어서의 발현 효율을 향상시키기 위한 방법;
(7) 표적세포에 있어서의 유전자 또는 단백질의 기능을 조사하는 방법으로서, 이 유전자 또는 이 단백질을 코딩하는 핵산 또는 이 유전자 또는 이 단백질의 발현을 세포내에서 저해하는 핵산을 함유하는 상기 (3) 의 복합체 입자를 고상 표면에 도포하고, 그 고상 표면 위에서 이 표적세포를 배양하고, 이 표적세포에 있어서의 이 핵산의 발현 레벨 또는 이 유전자 또는 이 단백질의 발현 레벨, 또는 세포 의 증식률 또는 표현형을 조사하는 것을 특징으로 하는 방법;
(8) 임의의 질환에 관여하는 유전자의 발현을 세포내에서 저해하는 핵산의 후보 핵산을 함유하는 상기 (3) 의 복합체 입자를 고상 표면에 도포하고, 그 고상 표면 위에서 이 질환 상태에 있는 세포를 배양하고, 각 후보 핵산에 의하여 저해되는 이 유전자의 발현 레벨, 또는 세포의 증식률 또는 표현형을 조사하는 것을 특징으로 하는, 이 질환을 처치할 수 있는 핵산을 스크리닝하는 방법; 에 관한 것이다.
이하의 실시예에서 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 핵산 도입 촉진제는 플라스미드 DNA 단독으로는 유전자 발현이 관찰되지 않는 실험관내(in vitro)의 세포 배양계에 있어서 핵산의 발현이 확인되었으므로, 핵산의 세포로의 도입 효율을 향상시키는 것으로 나타났다. 또한, 핵산의 발현이 리포솜 제제에 비하여 장기간 지속되므로, 본 발명의 핵산 도입 촉진제는 핵산의 세포내에서의 안정성을 향상시키는 것으로 나타났다.
이번에, 콜라겐이 핵산과 정전적으로 및/또는 물리적으로 상호작용하여 복합체를 형성하고 있음을 발견하였다. 따라서, 실시예에서 확인된 핵산 발현의 지속은 복합체 형성에 의한 핵산의 세포내에서의 안정성 향상에 의해서도 초래되는 것으로 생각된다. 이는 콜라겐의 매트릭스 중에 봉입된 유전자들이 생분해 작용에 의한 콜라겐의 분해에 의하여 서서히 유전자가 방출되는 것으로 여겨지고 있던 종래의 콜라겐에 의한 유전자들의 서방 메카니즘과 크게 다르다.
도 1 은 일정 농도의 플라스미드 DNA 와 다양한 농도의 아텔로콜라겐의 정전 적 상호작용을 나타내는 아가로스 겔 전기영동 결과의 도면을 대신한 사진이다.
도 2 는 플라스미드 DNA 와 아텔로콜라겐의 정전적 상호작용에 대한 염화나트륨의 영향을 나타내는 아가로스 겔 전기영동 결과의 도면을 대신한 사진이다.
도 3 은 플라스미드 DNA 와 아텔로콜라겐의 정전적 상호작용에 대한 헤파란 황산의 영향을 나타내는 아가로스 겔 전기영동 결과의 도면을 대신한 사진이다. 왼쪽 사진은 헤파란 황산의 비존재하, 오른쪽 사진은 헤파란 황산의 존재하에서의 결과이다.
도 4 는 각종 농도의 아텔로콜라겐과의 플라스미드 DNA 의 복합체의 형상을 나타내는 현미경 사진이다.
도 5 는 각종 농도의 아텔로콜라겐과의 플라스미드 DNA 의 복합체에 있어서의 1 주간 보존후의 형상을 나타내는 현미경 사진이다.
도 6 은 아텔로콜라겐의 겔 형상 제제, 양이온성 리포솜 제제 및 PBS 용액에 있어서의 플라스미드 DNA 의 유전자 발현기간의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 7 은 콜라겐 농도가 다른 복합체와 적가법에 의한 트랜스펙션 7 일후의 플라스미드 DNA 도입 효율의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 8 은 콜라겐 농도가 다른 복합체에 있어서의 7 일후의 플라스미드 DNA 도입 효율을 형광강도로 나타내는 그래프이다.
도 9 는 콜라겐 농도가 다른 복합체와 고상 도포법에 의한 트랜스펙션 7 일후의 플라스미드 DNA 도입 효율의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 10 은 플라스미드 DNA 농도가 다른 복합체와 적가법에 의한 트랜스펙션 7 일후의 플라스미드 DNA 도입 효율의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 11 은 플라스미드 DNA 농도가 다른 복합체와 고상 도포법에 의한 트랜스펙션 7 일후의 플라스미드 DNA 도입 효율의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 12 는 고상 도포법에 의한 트랜스펙션 7 일후의 플라스미드 DNA 도입 효율을 형광강도로 나타내는 그래프 및 그 형광을 나타내는 현미경 사진이다.
도 13 은 본 발명 방법에 있어서의 세포증식억제를 나타내는 그래프이다.
도 14 는 고상 도포법으로 아데노바이러스가 용량 의존적으로 도입되어 있는 것을 나타내는 그래프 및 그 형광을 나타내는 현미경 사진이다.
도 15 는 플라스미드 DNA 1 분자에 결합한 콜라겐의 분자수와 복합체의 평균 장경의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 16 은 콜라겐 1 분자당의 원하는 핵산의 뉴클레오티드 단량체수와 복합체의 평균 장경의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 17 은 혼합시의 올리고뉴클레오티드와 콜라겐의 분자수의 비와 복합체에 있어서의 콜라겐 1 분자에 결합한 올리고뉴클레오티드의 분자수의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 18 은 본 발명의 세포배양기구의 표면에서 유리시킨 뉴클레오티드를 함유하는 복합체를 형광 현미경으로 관찰하여 수득된 형광 현미경 사진이다.
도 19 는 본 발명의 세포배양기구의 표면에서 유리시킨 플라스미드 DNA 를 함유하는 복합체를 형광 현미경으로 관찰하여 수득된 형광 현미경 사진이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
1) 핵산 도입 촉진제
제 1 태양에 있어서의 본 발명은 콜라겐 또는 콜라겐 유도체를 함유하는 표적세포로의 핵산 도입 촉진제이다. 본 태양은 표적세포로의 핵산 도입을 촉진시킨다는 콜라겐 또는 콜라겐 유도체에 있어서의 이번에 처음 발견된 작용을 이용하는 것이다. 즉, 본 태양에서는 표적세포로의 핵산 도입을 촉진시키기 위한 콜라겐 또는 콜라겐 유도체의 신규한 용도를 제공한다.
본 발명에 있어서, 「콜라겐 또는 콜라겐 유도체」란, 통상 의료 분야, 화장품 분야, 공업 분야 및 식품 분야에서 사용되고 있는 모든 「콜라겐 또는 콜라겐 유도체」를 의미한다. 콜라겐은 가용성 또는 가용화 콜라겐을 이용하는 것이 바람직하다. 가용성 콜라겐이란 산성 또는 중성 물이나 염용액에 가용이고, 가용화 콜라겐이란 효소에 의하여 가용화되는 효소 가용화 콜라겐, 알칼리에 의하여 가용화되는 알칼리 가용화 콜라겐이 있으며, 모두 구멍 사이즈가 1㎛ 인 멤브레인 필터를 통과할 수 있는 것이 바람직하다. 콜라겐의 가용성은 콜라겐의 가교도에 의존하고, 가교도가 높을수록 불용화되므로, 본 발명에 사용하는 콜라겐의 가교도는 예를 들면 3량체 이하인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 2량체 이하이다. 콜라겐의 분자량은 예를 들면 약 30만 내지 약 90만이 바람직하며, 약 30만 내지 약 60만이 더욱 바람직하다. 콜라겐은 어떠한 동물종에서 추출된 것이어도 사용 가능한데, 바람직하게는 척추동물에서 추출된 것, 좀더 바람직하게는 포유류, 조류, 어류에서 추출된 것, 더욱 바람직하게는 변성온도가 높은 포유류, 조류에서 추출된 콜라겐이 바람직하다. 콜라겐의 타입도 어떠한 타입의 콜라겐이 어도 상관없는데, 동물체내의 존재량의 점에서 Ⅰ∼Ⅴ 형이 바람직하다. 구체적으로는 예를 들면, 포유동물의 진피에서 산추출한 Ⅰ형 콜라겐을 들 수 있으며, 더욱 바람직하게는 예를 들면 송아지의 진피에서 산추출한 Ⅰ형 콜라겐, 유전자 공학적으로 생산되는 Ⅰ형 콜라겐 등을 들 수 있다. 동일한 Ⅰ형 콜라겐이라도 힘줄에서 유래한 콜라겐은 가교도가 높고 불용성이므로 적합하지 않다. 또한, 안전성의 면에서 항원성이 높은 텔로펩티드를 효소적으로 제거한 아텔로콜라겐 또는 유전자 공학적으로 생산되는 아텔로콜라겐이 바람직하며, 1000 잔기당 티로신 잔기가 3 이하인 아텔로콜라겐이 더욱 바람직하다. 또한, 필요에 따라 측쇄를 수식한 콜라겐, 가교한 콜라겐 등을 이용할 수 있다. 측쇄를 수식한 콜라겐으로는 예를 들면 석시닐화 또는 메틸화시킨 콜라겐 등을 들 수 있으며, 가교한 콜라겐으로는 예를 들면 글루탈알데히드, 헥사메틸렌디이소시아네이트 또는 폴리에폭시 화합물 등으로 처리한 콜라겐 등을 들 수 있다 (프레그란스ㆍ저널 1989-12, 104∼109, 일본 특허공보 평7-59522 호). 바람직한 콜라겐 유도체는 젤라틴 또는 젤라틴의 가교체, 또는 콜라겐과의 가교체이다.
또한, 콜라겐 또는 콜라겐 유도체에는 다른 생체 친화성 재료를 혼합할 수도 있다. 생체 친화성 재료로는, 예를 들면 젤라틴, 피브린, 알부민, 히알루론산, 헤파린, 콘드로이틴 황산, 키틴, 키토산, 알긴산, 펙틴, 아가로스, 하이드록시아파타이트, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리디메틸실록산, 또는 글리콜산, 락트산 또는 아미노산의 중합체 또는 이들의 공중합체, 또는 이들의 생체 친화성 재료의 2 종 이상의 혼합물 등을 들 수 있다.
2) 복합체를 함유하는 핵산 도입 촉진제
제 2 태양에 있어서의 본 발명은 원하는 핵산과 콜라겐 또는 콜라겐 유도체를 함유하는 복합체, 바람직하게는 복합체 입자를 필수성분으로 함유하는 표적세포로의 핵산 도입 촉진제이다.
핵산은 단독으로는 실험관내(in vitro)의 세포에 혈청 존재하에 투여해도 대부분 세포에 도입할 수 없다. 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 복합체를 형성함으로써, 비로소 효율적으로 핵산을 세포에 도입할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「핵산」은 폴리뉴클레오티드여도 되고 올리고뉴클레오티드여도 되며, 또한 DNA 일 수도 있으며 RNA 일 수도 있다. DNA 분자인 경우, 플라스미드 DNA, cDNA, 게노믹 DNA 또는 합성 DNA 여도 된다. 또한, DNA 및 RNA 는 모두 2 본쇄일 수도 있으며 1 본쇄일 수도 있다. 1 본쇄인 경우, 코드쇄 또는 비코드쇄일 수 있다. 「핵산」에는 DNA 유도체 또는 RNA 유도체가 포함되며, 이 유도체란 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산, 또는 효소에 의한 분해를 피하기 위하여 인터뉴클레오티드의 인산 부위, 당 부분, 염기 부분에 화학수식을 한 핵산을 의미한다. 또한, 「핵산」에는 아데노바이러스, 레트로바이러스 등의 바이러스도 포함된다.
바람직하게는, 「핵산」은 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임이며, 바람직하게는 5량체 이상 100량체 이하, 더욱 바람직하게는 5량체 이상 30량체 이하의 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임이다. 질환 증상의 치료 또는 개선 효과가 있는 생리활성을 갖는 단백질을 코딩하고 있는 플라스미드 DNA, 또는 질환 증상의 예방, 치료 또는 개선 효과가 있는 면역반응을 유도하는 단백질을 코딩하고 있는 플라스미드 DNA 가 더욱 바람직하다.
핵산이 플라스미드 DNA 또는 바이러스 등의 유전자 치료에 사용되는 벡터인 경우, 세포내에 도입되었을 때, 코딩한 유전정보를 세포내에서 발현시키도록 구성된 형태가 바람직하며, 프로모터 등의 목적 유전자의 발현에 필요한 요소를 함유하거나, 또는 염색체로의 조합을 가능하게 하는 요소를 함유하는 벡터 등이다. 본 발명의 핵산으로서의 플라스미드 DNA 의 사이즈에는 특별히 제한은 없고, 유전자 공학적 수법으로 효율적으로 생산 가능하며, 세포에 도입된 경우 효율적으로 코딩한 유전정보를 세포내에서 발현시킬 수 있는 사이즈 중에서 적당히 선택할 수 있다.
본 발명의 핵산 도입 촉진제 중에는, 별개의 원하는 핵산을 삽입한 여러 종류의 벡터가 동시에 존재해도 된다. 또한, 하나의 벡터에는 복수의 유전정보가 코딩되어 있어도 된다. 도입 촉진제 중에 함유되는 벡터의 양에 특별히 제한은 없다.
유전자 치료시에 발현이 요구되는 단백질을 코딩하는 핵산에는 유전병의 처치에 이용될 수 있는 유전자, 예를 들면 아데노신디아미나제, 티미딘키나제 등의 효소류, GM-CSF, IL-2 등의 사이토카인류, 또는 섬유아세포 증식인자 HST-1(FGF4) 을 코딩하는 유전자를 들 수 있는데, 이것에 한정되는 것은 아니다. 또한, 유전자 치료시에 발현이 요구되는 별도의 단백질을 코딩하는 핵산으로서, 발현되는 단백질 또는 펩티드가 항원으로서 면역을 유도하고, 감염증 또는 종양의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 유전자, 즉 상기 항원이 될 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자, 예를 들면 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질인 HA 나 NA 또는핵단백질인 NP 의 각 단백질, C 형 간염 바이러스의 E2 나 NS 1 단백질, B 형 간염 바이러스의 HBs 항원 단백질, A 형 간염 바이러스의 캡시드 단백질인 VP 1 이나 VP 3, 또는 캡시드 유사 단백질, 뎅기(dengue) 바이러스의 Egp 단백질, RS 바이러스의 F 또는 G 단백질, 광견병 바이러스의 구조 단백질인 G 나 N 단백질, 헤르페스 바이러스의 gD 단백질, 일본뇌염 바이러스의 E 1 또는 pre-M 단백질, 로타 바이러스의 외각당(外殼糖) 단백질 VP 7 이나 외각 단백질 VP 4, 인간 면역부전 바이러스의 gp120 이나 gp160 단백질, Leishmania major 의 주요 표면항원 단백질, 말라리아의 스포로조이드의 주요 표면항원 (circum sporozoite protein) 단백질, 톡소플라즈마의 54-kd 나 CS 단백질, 충치의 원인이 되는 Streptococcus mutans 의 균체 표층 단백질 PAc 를 코딩하는 유전자; 또한 MAGE-1, MAGE-3 또는 BAGE 등의 암퇴축 항원이나 티로시나제, Mart-1, gp100, gp75 등의 조직특이 항원, p15, Mucl, CEA, HPV E6, E7, HPR2/neu 등을 코딩하는 유전자 및 「Imunization with DNA」:Journal of Immunological Methods, 176 권, 1994 년, 145∼152 페이지에 기재되어 있는 유전자를 들 수 있는데, 이것에 한정되는 것은 아니다.
핵산이 올리고뉴클레오티드인 경우, 예를 들면 적어도 그 일부가 생체의 항상성을 흐트러뜨리는 생리적인 효과를 갖는 단백질을 코딩한 유전자, 병원성 바이러스, 세균 등에 특이적인 유전자의 센스쇄 또는 안티센스쇄와 생리적인 조건하에서 상보적으로 결합하는 염기서열 등이며, 더욱 구체적으로는 병원성 바이러스, 세 균 등에 특이적인 유전자 및 항상성을 흐트러뜨리는 생리적인 효과를 갖는 단백질 등을 코딩한 유전자의 메신저 RNA 와 상보적으로 결합하는 염기서열이다.
더욱 구체적으로는, 본 발명에 이용되는 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 메신저 RNA 의 개시 코돈을 포함하는 영역 또는 전구 메신저 RNA 가 스플라이싱을 받는 부위에 상보적인 서열 등이다. 본 발명에 이용되는 올리고뉴클레오티드의 예를 나타내면, 암의 치료 또는 예방에 이용하는 올리고뉴클레오티드로는, 예를 들면 hst-1 의 발현을 특이적으로 억제하는 5'-CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3' (서열번호 1) 의 서열을 가진 올리고뉴클레오티드, 또는 프로틴키나제 Cα의 발현을 특이적으로 억제하여 비소세포성 폐암이나 결장암 등의 진행성 암에 효과적이며, 전립선암, 유방암, 난소암, 췌장암, 대장암, 소세포폐암에 대한 적용이 시도되고 있는 ISIS3521, C-raf 키나제의 발현을 특이적으로 억제하여 전립선암, 유방암, 난소암, 뇌종양, 췌장암, 대장암, 소세포폐암에 대한 적용이 시도되고 있는 ISIS5132/CGP69846A, Ha-ras 의 발현을 특이적으로 저해하여 대장암, 유방암, 뇌종양, 췌장암, 폐소세포암에 대한 적용이 시도되고 있는 ISIS2503, 프로틴키나제A 타입Ⅰ 의 발현을 특이적으로 억제하는 GEM231, DNA 메틸트랜스퍼라제의 발현을 특이적으로 억제하는 MG98, c-myc 의 발현을 억제하는 INXC-6295, c-myb 의 발현을 억제하여 백혈병에 대한 적용이 검토되고 있는 INX-3001, bcl-2 의 발현을 억제하여 비호지킨 림프종, 대장암, 소세포폐암, 만성 임파성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 유방암, 림프종, 멜라노마, 골수종, 비세포성 폐암, 전립선암에 대한 적용이 검토되고 있는 G-3139(Genasense), MDM2 단백의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드, VEGF 의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 또한, 감염증의 치료 또는 예방에 이용하는 올리고뉴클레오티드로는, HIV 의 증식을 억제하는 GEM92, GPI-2A, 사이토메갈로 바이러스의 증식을 억제하는 ISIS2922(fomivirsen), Vitravene, ISIS13312, GEM132, C 형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 ISIS14803 등을 들 수 있으며, 염증의 치료에 이용되는 올리고뉴클레오티드로는, ICAM-1 의 발현을 특이적으로 억제하여 클론병, 궤양성 대장염, 신장이식 거절반응 저해, 건선, 천식 등에 대한 적용이 시도되고 있는 ISIS2302, 아데노신 A1 리셉터의 발현을 억제하여 천식에 대한 적용이 시도되고 있는 EPI-2010, 및 TNF-α, CD49d(VLA-4), VCAM-1, PECAM-1 의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 또한, 경피경관 관동맥 형성술 후의 재협착을 방지하는 올리고뉴클레오티드로서, c-myc 의 발현을 억제하는 Resten-NG 등을 들 수 있다.
항상성을 흐트러뜨리는 생리적인 효과를 갖는 단백질을 코딩하는 유전자는 구체적으로는, 예를 들면 암 유전자라 불리는 일군의 유전자군을 들 수 있다. 좀더 구체적으로는, 예를 들면 증식인자군, 수용체형 티로신키나제군, 비수용체형 티로신키나제군, GTP 결합 단백질, 세린ㆍ스레오닌키나제군, 전사조절인자군 등을 들 수 있다. 더욱 구체적으로는, 예를 들면 hst-1 또는 오르니틴 탈탄산 효소 등을 코딩하는 유전자 등을 들 수 있다.
본 발명의 핵산 도입 촉진제는 본 발명의 복합체 외, 필요에 따라 의약상 허용되는 첨가제를 함유할 수 있다. 의약상 허용되는 첨가제로는, 복합체를 주사제로서 이용하는 경우의 등장화제, pH 조절제, 무통화제, 또는 고형제로서 이용하 는 경우의 부형제, 붕괴제, 코팅제를 들 수 있으며, 일본에서는 의약품 첨가물 사전 (일본 의약품 첨가제 협회 편집) 에 기술되어 있는 것이다. 구체적으로는 pH 를 6∼8 로 유지하기 위하여, 또는 세포와 등장으로 유지하기 위하여 이용되는 염류나 당류를 들 수 있다.
본 발명의 핵산 도입 촉진제의 성상은 고체 형상이어도 되며 용액 형상이어도 된다. 본 발명의 촉진제가 고체 형상인 경우, 핵산 도입을 촉진시킬 때에는 그대로의 상태 또는 정제수, 생리적 식염수, 생체와 등장인 완충액 등을 사용하여 용액 형상으로 하고, 원하는 세포에 부하시킨다. 이러한 용액 형상의 핵산 도입 촉진제도 본 발명의 일부를 구성한다.
본 발명의 핵산 도입 촉진제를 생체에 투여하는 방법으로는 경구, 주사, 점안, 점비, 경폐, 피부를 통한 흡수 중 어느 것이어도 되며, 바람직하게는 경구 또는 주사이다. 투여 부위는 질환에 따라 선택할 수 있는데, 수술시에 필요한 부위에 직접 유치할 수도 있다.
본 태양에서는 상세하게는 다음의 발명이 제공된다.
(1) 원하는 핵산과 콜라겐 또는 콜라겐 유도체를 함유하는 복합체, 바람직하게는 복합체 입자를 필수성분으로 함유하는 표적세포로의 핵산 도입 촉진제 (여기서, 이 복합체 입자의 장경은 바람직하게는 300㎚∼300㎛, 보다 바람직하게는 300㎚∼100㎛, 보다 더 바람직하게는 300㎚∼50㎛, 특히 바람직하게는 300㎚∼30㎛ 이다),
(2) 표적세포가 동물세포인 상기 (1) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(3) 표적세포가 치료를 필요로 하는 장기 또는 조직 또는 그 부근의 세포인 상기 (2) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(4) 콜라겐이 아텔로콜라겐인 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(5) 콜라겐의 분자량이 약 30만∼약 90만인 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(6) 콜라겐 유도체가 젤라틴 또는 젤라틴의 가교체인 상기 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(7) 콜라겐 유도체가 콜라겐의 가교체인 상기 (1)∼(5) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(8) 핵산이 올리고뉴클레오티드인 상기 (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(9) 올리고뉴클레오티드가 5량체 이상 30량체 이하인 상기 (8) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(10) 올리고뉴클레오티드가 DNA 또는 DNA 유도체인 상기 (8) 또는 (9) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(11) 올리고뉴클레오티드가 RNA 또는 RNA 유도체인 상기 (8) 또는 (9) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(12) DNA 유도체 또는 RNA 유도체가 분자내에 적어도 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 갖는 상기 (10) 또는 (11) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(13) 핵산이 리보자임 또는 올리고뉴클레오티드인 상기 (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(14) 핵산이 플라스미드 DNA 인 상기 (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(15) 플라스미드 DNA 가 질환 증상의 치료 또는 개선 효과가 있는 생리활성을 갖는 단백질을 코딩하고 있는 상기 (13) 에 기재된 핵산 도입 촉진제, 및
(16) 플라스미드 DNA 가 질환 증상의 예방, 치료 또는 개선 효과가 있는 면역반응을 유도하는 단백질을 코딩하고 있는 상기 (13) 에 기재된 핵산 도입 촉진제.
(17) 핵산 도입 촉진제가 용액이며, 복합체 성분으로서 핵산을 10㎎/㎖ 이하 함유하는 상기 (1)∼(16) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(18) 복합체 성분으로서 핵산을 1㎎/㎖ 이하 함유하는 상기 (17) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(19) 복합체 성분으로서 핵산을 500㎍/㎖ 이하 함유하는 상기 (18) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(20) pH5∼pH9, 바람직하게는 pH6∼pH8 인 상기 (1)∼(19) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(21) 인산을 0.001M 이상 0.1M 이하 함유하는 상기 (1)∼(20) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(22) 인산을 0.01M 이상 0.1M 이하 함유하는 상기 (21) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(23) 콜라겐의 회합체 형성을 억제하는 물질, 예를 들면 수크로스 또는 아르기닌을 함유하는 상기 (1)∼(22) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
(24) 의약상 허용되는 첨가제를 적량 함유하는 상기 (1)∼(24) 에 기재된 핵산 도입 촉진제,
3) 복합체
본 발명의 제 3 태양은 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 원하는 핵산을 함유하는 복합체이다. 이 복합체에는 정전적인 힘에 의해 결합하여 복합체를 형성하는 정전적 복합체와 소수결합 등의 물리적인 힘에 의해 복합체를 형성하는 물리적 복합체가 포함된다. 경우에 따라서는, 양방의 결합양식이 혼재하는 경우가 있는데, 그러한 복합체도 본 발명에 있어서의 복합체에 포함된다.
이번에 콜라겐이 핵산과 정전적으로 상호 작용하여 복합체를 형성할 수 있음이 발견되었다.
본 발명에 있어서 「정전적 복합체」란, 분자 중에 다수의 전하를 갖는 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 핵산의 폴리이온 복합체, 상세하게는 양전하를 띤 콜라겐 또는 콜라겐 유도체가 음전하를 띤 핵산과 전기적으로 맞당기는 결합체를 의미한다. 폴리이온 복합체는 복합체 형성시에 분자내의 전하의 카운터 이온을 다수 자유롭게 하므로, 매우 큰 엔트로피의 증대가 발생한다. 이러한 정전적 복합체의 형태에서 고려하면, 실시예에서 확인된 핵산 발현의 지속은 복합체 형성에 의한 세포내에서의 핵산의 안정화에 의해서도 초래되는 것으로 생각된다.
본 발명의 복합체의 최소 단위는 한 분자의 콜라겐과 한 분자의 핵산이 형성하는 복합체인데, 우리는 콜라겐은 핵산과 복합체를 형성함과 병행하여 다른 콜라겐과 회합하여 회합체를 형성함을 발견하였다. 이 회합체의 형성은 장경 약 300㎚, 직경 약 1.5㎚ 의 원주 형상 콜라겐 분자가 주로 분자의 직축방향과 평행하게 회합하는 것으로, 주로 회합체는 분자의 장축방향으로 신장된다. 따라서, 복합체는 복수의 회합체와 복수의 핵산분자가 비공유 결합으로 결합된 것이며, 회합체의 신장이 크게 진전되어 장축이 1㎚ 를 초과하는 선유(線維) 형상 복합체, 가는 회합체가 핵산을 통하여 결합된 미세 선유 형상 복합체, 더욱 미세한 복합체가 핵산과 형성한 입자 형상 복합체가 있다.
본 발명의 복합체는 다양한 형상을 취할 수 있다.
본 발명의 복합체는 입자인 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 「입자」란 콜라겐 또는 콜라겐 유도체가 취할 수 있는 형상으로, 반드시 구 형상을 의미하는 것은 아니다. 본 발명의 복합체 입자의 사이즈는 한 분자의 콜라겐이 형성하는 복합체의 장경 300㎚ 가 최소이며, 핵산 도입 효율을 고려하여 그 장경이 300㎚∼1㎜ 이며, 장경 300㎚∼300㎛ 인 입자가 바람직하고, 보다 바람직하게는 장경 300㎚∼100㎛ 이며, 보다 더 바람직하게는 장경 300㎚∼50㎛, 특히 바람직하게는 장경 300㎚∼30㎛ 이다.
우리는 복합체가 다양한 형상을 취하는 원인이 복합체를 구성하는 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 핵산의 비율에 있으며, 또한 복합체의 형상이 오로지 핵산과 복합체를 형성함으로써 촉진되는 콜라겐 또는 콜라겐 유도체에 의한 회합체 (선유) 형성의 진전에 의존함을 발견하였다. 회합체의 과잉 형성은 핵산 도입에는 부적절하다는 본 발명의 지견에 기초하여, 우리는 이러한 복합체의 형상이, 혼합하는 콜라겐 또는 콜라겐 유도체 및 원하는 핵산의 농도 외에, 콜라겐의 회합체 형성에 영향을 주는 환경인자인 염농도, 온도, pH, 글루코스 농도를 조정함으로써 제어 가능함을 발견하였다. 또한, 우리는 복합체 형성에 수반되는 콜라겐 또는 콜라겐 유도체의 회합체 형성이 핵산의 쇄 길이에 영향을 받아, 일반적으로 1000bp 를 초과하는 플라스미드 DNA 에서는 회합체 형성이 현저히 촉진되는 데 반해, 일반적으로 100bp 이하의 올리고뉴클레오티드에서는 회합체 형성의 촉진 효과가 약함을 발견하여, 각각에 적합한 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 핵산의 조성이 존재함을 발견하였다.
복합체의 형상은 핵산의 세포로의 도입 효율에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 콜라겐이 핵산과 복합체를 형성하고, 그 형상이 핵산의 세포로의 도입 효율ㆍ발현 효율에 영향을 줌을 발견함으로써, 핵산 도입 효율을 최적화할 수 있는 전략이 제공되었다. 또한, 핵산의 표적세포로의 도입에 실험실 레벨에서 이용되고 있는 리포솜은 핵산과 혼합한 후 즉시 응집되는 성질이 있어, 사용할 때마다 핵산의 도입 효율에 편차가 생기는 외, 사용시 제조할 필요가 있어, 실제로 범용되기는 어렵다. 한편, 본 발명의 복합체는 냉소에서 보관함으로써 형태가 악화되지 않는다. 유전자 도입기술에 있어서 최대 과제는 범용적인 방법이 적다는 것이다. 본 발명의 복합체는 형태가 변화되지 않는 점에서도 현실성이 높은 기술이다.
본 태양에서는 구체적으로는 다음의 발명이 제공된다.
(1) 원하는 핵산과 콜라겐 또는 콜라겐 유도체를 함유하는 복합체 입자,
(2) 장경이 300㎚∼300㎛ 인 상기 (1) 에 기재된 복합체 입자,
(3) 장경이 300㎚∼100㎛ 인 상기 (2) 에 기재된 복합체 입자,
(4) 장경이 300㎚∼50㎛, 바람직하게는 300㎚∼30㎛ 인 상기 (3) 에 기재된 복합체 입자,
(5) 핵산이 플라스미드 DNA 인 상기 (1)∼(4) 에 기재된 복합체 입자,
(6) 콜라겐 또는 콜라겐 유도체 분자수와 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 단량체수의 비가 1:20∼1:플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 단량체수, 바람직하게는 1:50∼1:플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 단량체수, 보다 바람직하게는 1:50∼1:4000, 보다 더 바람직하게는 1:50∼1:2000, 특히 바람직하게는 1:50∼1:1000 인 상기 (5) 에 기재된 복합체 입자,
(7) 1:96∼1:플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 단량체수인 상기 (6) 에 기재된 복합체 입자,
(8) 1:96∼1:1122 인 상기 (7) 에 기재된 복합체 입자.
(9) 1:96∼1:701 인 상기 (8) 에 기재된 복합체 입자,
(10) 핵산이 올리고뉴클레오티드인 상기 (1)∼(4) 에 기재된 복합체 입자,
(11) 이 복합체에 있어서의 콜라겐 또는 콜라겐 유도체 분자수와 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단량체수의 비가 1:1∼1:200, 바람직하게는 1:3∼1:150, 더욱 바람직하게는 1:3∼1:120 인 상기 (10) 에 기재된 복합체 입자,
(12) 1:20∼1:120 인 상기 (11) 에 기재된 복합체 입자,
(13) 1:50∼1:120 인 상기 (12) 에 기재된 복합체 입자,
(14) pH5∼pH9, 바람직하게는 pH6∼pH8 인 용액 중에 존재하는 상기 (1)∼(13) 에 기재된 복합체 입자,
(15) 10℃ 이하로 냉각시킨 용액 중에서 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 핵산을 혼합함으로써 상기 (1)∼(13) 에 기재된 복합체 입자를 제조하는 방법,
(16) 인산을 0.001M 이상 0.1M 이하 함유하는 용액 중에 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 핵산을 혼합함으로써 상기 (1)∼(13) 에 기재된 복합체 입자를 제조하는 방법,
(17) 인산을 0.01M 이상 0.1M 이하 함유하는 용액 중에 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 핵산을 혼합함으로써 상기 (1)∼(13) 에 기재된 복합체 입자를 제조하는 방법,
(18) 콜라겐의 회합체 형성을 억제하는 물질, 예를 들면 수크로스 또는 아르기닌을 함유하는 용액 중에서 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 핵산을 혼합함으로써 상기 (1)∼(13) 에 기재된 복합체 입자를 제조하는 방법,
(19) 의약상 허용되는 첨가제를 적량 함유하는 용액 중에서 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 핵산을 혼합함으로써 상기 (1)∼(13) 에 기재된 복합체 입자를 제조하는 방법 (여기서, 의약상 허용되는 첨가제란 상기 기재된 것),
(20) 상기 (14)∼(19) 에 기재된 방법을 2 이상 조합하여 상기 (1)∼(13) 에 기재된 복합체 입자를 제조하는 방법,
(21) 100㎛ 이하의 공경을 갖는 필터를 통과시켜 입자를 조정하는 공정을 추 가로 포함하는 상기 (1)∼(13) 에 기재된 복합체 입자를 제조하는 방법,
(22) 10㎛ 이하의 공경을 갖는 필터를 통과시켜 입자를 조정하는 상기 (21) 에 기재된 방법,
(23) 10,000 회전 이상의 속도로 원심함으로써 복합체를 농축, 단리시키는 공정을 추가로 포함하는 상기 (1)∼(13) 에 기재된 복합체 입자를 제조하는 방법,
(24) 50,000 회전 이상의 속도로 원심하는 상기 (23) 에 기재된 방법.
본 발명에 있어서, 「뉴클레오티드 단량체수」란 원하는 핵산을 구성하는 뉴클레오티드 단량체 단위의 수를 의미한다. 「콜라겐 또는 콜라겐 유도체 분자수와 뉴클레오티드 단량체수의 비」란, 콜라겐 또는 콜라겐 유도체 1 분자에 대하여 정전적 또는 물리적으로 결합하여 복합체를 구성하는 원하는 핵산에 있어서의 뉴클레오티드 단량체의 수를 의미한다. 뉴클레오티드 단량체수는 「원하는 핵산의 음전하」와 대략 동일하다. 본 발명에 있어서 「원하는 핵산의 음전하」란, 핵산을 구성하는 뉴클레오티드간에 존재하는 인산기의 수를 의미한다. 핵산의 음전하의 수치는 핵산의 인산기, 핵산의 뉴클레오티드간 인산기, 핵산의 뉴클레오티드간 인 함유기 (인산기, 포스포로티오에이트기) 의 수와 동등하다.
「콜라겐의 회합체 형성을 억제하는 물질」이란, 콜라겐의 회합체 형성이 주로 콜라겐 분자중의 염기성 아미노산이나 산성 아미노산의 전하에 의하여 발생함을 고려하여, 이들의 정전적 상호작용을 억제하는 물질 및 콜라겐 분자를 규칙적으로 회합시키지 않는 물질을 들 수 있다. 전자로는 염류, 아미노산류, 우레아이며, 후자로는 수크로스 등의 당류 및 아르기닌을 들 수 있다.
본 발명의 복합체 입자는 본 발명의 핵산 도입 촉진제에 함유시킬 수 있다.
4) 의료용구 또는 세포배양기구
본 발명의 제 4 태양은 본 발명의 복합체 입자가 표면에 도포되어 있는 의료용구 또는 세포배양기구이다.
본 발명의 복합체 입자를 고상 표면에 도포하고, 거기에 표적세포를 접촉시키면, 표적세포의 위에서 본 발명 복합체 입자를 적가하는 것보다 핵산의 도입 효율이 향상됨이, 즉 복합체 입자의 고상 도포법이 적가법보다 도입 효율의 점에서 우수함이 발견되었다 (이하의 실시예 6 참조).
본 태양에 있어서의 의료용구에는 인공장기, 보다 구체적으로는 인공혈관, 혈관을 보강하는 의료용구 스텐트 또는 인공심장이 포함된다. 인공혈관의 경우, 혈관내측에서의 혈전의 성장을 저해 및 보체(補體)의 활성화를 억제하려면 혈관내피세포가 인공혈관의 내측에서 증식하여 피복할 필요가 있다. 그 때문에, 혈관내피세포 증식인자 (VEGF) 등의 세포증식인자를 코딩하는 핵산을 콜라겐에 결합시킨 본 발명의 복합체 입자를 인공혈관에 도포해 두면, 그 혈관내피세포의 용이하고 신속한 증식이 기대된다.
원하는 핵산과 콜라겐 또는 콜라겐 유도체를 함유하는 복합체 입자가 세포배양면에 도포되어 있는 세포배양기구로는, 세포배양실험에 통상 사용되고 있는 샬레, 플라스크, 96 웰 마이크로 플레이트 등을 들 수 있다. 본 발명의 복합체 입자를 고상 표면에 도포하는 경우, 단위면적당 도포하는 복합체 입자의 양은 세포로의 핵산의 도입량에 크게 영향을 주는 것이 이하의 실시예 6 에 나타나 있다. 따라서, 단위면적당 도포하는 복합체 입자의 양도 본 발명의 중요한 요건이다.
본 태양에서는 구체적으로는 다음의 발명이 제공된다.
(1) 원하는 핵산과 콜라겐 또는 콜라겐 유도체를 함유하는 복합체 입자가 도포된 의료용구 또는 세포배양기구,
(2) 1 ㎠ 당 0.1㎍ 이상 50㎍ 이하의 핵산을 함유하는 복합체 입자가 도포된 상기 (1) 에 기재된 의료용구 또는 세포배양기구,
(3) 1 ㎠ 당 0.5㎍ 이상 50㎍ 이하의 핵산을 함유하는 복합체 입자가 도포된 상기 (2) 에 기재된 의료용구 또는 세포배양기구,
(4) 1 ㎠ 당 1㎍ 이상 10㎍ 이하의 핵산을 함유하는 복합체 입자가 도포된 상기 (3) 에 기재된 의료용구 또는 세포배양기구,
(5) 생체와 등장인 용액에 노출된 경우, 장경이 300㎚∼300㎛ 인 복합체 입자가 고상 표면에서 유리되는 상기 (1) 에 기재된 의료용구 또는 세포배양기구, 및
(6) 생체와 등장인 용액이 염화나트륨을 함유하는 인산 완충액인 상기 (5) 에 기재된 의료용구 또는 세포배양기구.
본 태양을 실시하는 데 있어 본 발명의 유통성은 중요하다. 앞서 서술한 바와 같이, 리포솜은 사용시 제조가 필요하고, 유통성이 매우 낮다. 일반적으로 아데노바이러스도 본 태양과 같이 고상 표면에 도포된 상태에서 장기간 실온에서 유통시키기는 어려울 것으로 생각된다. 그러나, 의외로 본원발명과 같이 아데노바이러스를 콜라겐과 혼합하여 고상 표면에 도포, 건조시킨 경우, 실온하 7 일후에도 높은 감염성을 유지하였다. 이것은 본 발명의 의료용구 또는 세포배양 기구가 높은 유통성을 갖고 있음을 나타내고 있다.
5) 원하는 핵산을 표적세포에 도입하거나, 또는 그 발현 효율을 향상시키는 방법
상기와 같이, 본 발명의 복합체 입자를 사용하면 원하는 핵산의 표적세포로의 도입을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 제 5 태양으로서, 본 발명의 복합체 입자를 사용하는 것을 특징으로 하는, 원하는 핵산을 표적세포에 도입하기 위한, 또는 원하는 핵산의 표적세포에 있어서의 발현 효율을 향상시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 「발현 효율을 향상시킨다」는 것은 원하는 핵산의 발현량을 증대시키거나, 또는 발현기간을 연장시키는 것을 의미한다.
즉, 본 태양에서는 다음의 발명이 제공된다.
(1) 원하는 핵산과 콜라겐 또는 콜라겐 유도체를 함유하는 상기 복합체 입자를 사용하는 것을 특징으로 하는 원하는 핵산을 표적세포에 도입하기 위한 방법,
(2) 원하는 핵산과 콜라겐 또는 콜라겐 유도체를 함유하는 상기 복합체 입자를 사용하는 것을 특징으로 하는, 원하는 핵산의 표적세포에 있어서의 발현 효율을 향상시키기 위한 방법,
(3) 발현량을 증대시키거나, 또는 발현기간을 연장시키기 위한 상기 (2) 에 기재된 방법, 및
(4) 상기 복합체 입자를 고상 표면에 도포하고, 그 고상 표면 위에서 표적세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 방법.
6) 표적세포에 있어서의 유전자 또는 단백질의 기능을 조사하는 방법
핵산의 세포로의 도입이 촉진되는 본 발명에 따르면, 유전자 또는 단백질의 표적세포내에서의 기능을 용이하게 조사할 수 있다. 예를 들면, 인간게놈 프로젝트에 의하여 매우 많은 유전자가 동정되고, 그 염기서열이 밝혀졌다. 그러나, 이들 정보를 실제로 의료 또는 식품산업에서 활용하려면, 동정된 유전자의 기능을 해명할 필요가 있다. 그러나, 동정된 유전자의 수는 방대하여, 종래와 같이 하나 하나의 유전자로부터 단백질을 생산 또한 정제하여 기능을 조사하는 방법으로는 시간이 너무 많이 걸려 비현실적임이 밝혀졌다. 따라서, 세포내에 기능을 조사하고자 하는 유전자를 삽입한 플라스미드 DNA 를 도입하여 발현시킴으로써 그 유전자의 기능을 조사하는 방법, 또는 기능을 조사하고자 하는 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포내에 도입하여 유전자의 발현을 억제함으로써 그 유전자의 기능을 조사하는 방법이 유용하다. 또한, 이와 같이 세포의 표현형에 따라 유전자의 기능을 조사하는 경우, 플라스미드 DNA 및 안티센스 DNA 를 세포에 도입하는 방법은 세포에 영향을 가능한 한 주지 않는 방법으로 실시해야만 한다. 따라서, 세포 장해성이 높은 리포솜을 이용하는 것은 수득되는 정보에 리포솜에 의한 세포 장해의 영향이 가해지게 된다. 한편, 본 발명의 콜라겐은 원래 생체내에 존재하고 세포와 접촉하고 있는 물질이므로, 세포에 대한 영향은 매우 낮아, 유전자의 기능을 노이즈 없이 측정할 수 있다. 구체적인 측정방법으로는, 기능을 해명하고자 하는 유전자를 발현시키는 플라스미드 DNA, 아데노바이러스 벡터 또는 기능을 해명하고자 하는 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 콜라겐을 혼합하고, 복합체 입자를 형성한 후, 배양 플레이 트 고상 위에 도포, 정렬배치한다. 여기서 사용하는 고상 플레이트는 96 웰의 멀티 웰 플레이트나, 나아가서는 미크로적인 플레이트 등이다. 도포한 복합체 입자를 건조시켜 고상 위에 고정시킨 후, 세포를 파종하고 몇일간 플레이트 위에서 배양한다. 도포된 복합체 입자는 도포된 부분에 접착된 세포에 효율적으로 도입되고, 기능을 조사하고자 하는 유전자를 발현 또는 그 발현을 장기간 억제한다. 며칠후, 세포의 형태나 세포내에서의 유전자 발현의 상태 또는 세포에서 생산된 단백질의 종류나 양을 조사함으로써 표적으로 한 유전자의 기능을 밝힐 수 있다. 본 방법의 특징은 고상 위에 도포된 복합체 입자가, 도포된 부분에 접착된 세포에 선택적 또한 효율적으로 삽입되는 것도 들 수 있다. 즉, 세포를 웰로 구획지어 배양할 필요가 없고, 미크로 플레이트 위에서 다수의 유전자의 기능을 한번에 해석할 수 있게 된다.
본 태양에서는 다음의 발명이 제공된다.
(1) 표적세포에 있어서의 유전자 또는 단백질의 기능을 조사하는 방법으로서, 이 유전자 또는 이 단백질을 코딩하는 핵산 또는 이 유전자 또는 이 단백질의 발현을 세포내에서 저해하는 핵산을 함유하는 본 발명의 복합체 입자를 고상 표면에 도포하고, 그 고상 표면 위에서 이 표적세포를 배양하고, 이 표적세포에 있어서의 이 핵산의 발현 레벨 또는 이 유전자 또는 이 단백질의 발현 레벨, 또는 세포의 증식률 또는 표현형을 조사하는 것을 특징으로 하는 방법,
(2) 이 유전자 또는 이 단백질을 코딩하는 핵산이 플라스미드 DNA 로서, 이 핵산의 발현 레벨을 조사하는 상기 (1) 에 기재된 방법, 및
(3) 이 유전자 또는 이 단백질의 발현을 세포내에서 저해하는 핵산이 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임이며, 이 유전자 또는 이 단백질의 발현 레벨을 조사하는 상기 (1) 에 기재된 방법.
7) 질환을 처치할 수 있는 핵산을 스크리닝하는 방법
핵산의 세포로의 도입이 촉진되는 본 발명에 따르면, 유전자 질환, 암, AIDS, 만성 관절 류머티즘, 생활습관병 등, 정상적인 유전자를 보완하거나, 유전자의 결함을 복원, 수정함으로써 다양한 질환을 처치할 수 있는 핵산을 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, 6) 에서 기술한 것과 동일한 방법으로 고상 위에 질환의 치료효과를 조사하고자 하는 핵산을 콜라겐과 복합체 입자를 형성시켜 도포, 건조시켜 고정화하고, 이 위에서 병태를 띤 세포를 배양함으로써, 핵산이 병태를 띤 세포에 효율적으로 도입된다. 핵산의 효과는 세포의 표현형의 변화, 세포사, 세포의 증식, 세포내에서의 유전자 발현의 패턴, 생산되는 단백질의 종류나 양에 의하여 해석할 수 있다. 또한, 이 핵산 도입에 있어서도, 도입 벡터에 의한 영향을 최소한으로 억제해야 함은 자명하며, 콜라겐을 이용하는 본 발명은 노이즈 없이 병태에 대한 핵산의 효과를 조사할 수 있다. 기능을 조사하고자 하는 핵산은 미소한 면적의 세포배양 고상 담체 위에 다수 정렬 고정화시킬 수 있어, 한번에 다수의 핵산을 평가할 수 있는 것도 본 발명의 특징이다.
본 태양에서는 다음의 발명이 제공된다.
(1) 임의의 질환에 관여하는 유전자의 발현을 세포내에서 저해하는 핵산의 후보 핵산을 함유하는 본 발명의 복합체 입자를 고상 표면에 도포하고, 그 고상 표 면 위에서 이 질환 상태에 있는 세포를 배양하고, 각 후보 핵산에 의하여 저해되는 이 유전자의 발현 레벨, 또는 세포의 증식률 또는 표현형을 조사하는 것을 특징으로 하는 이 질환을 처치할 수 있는 핵산을 스크리닝하는 방법,
(2) 임의의 질환에 관여하는 유전자의 발현을 세포내에서 저해할 것으로 기대되는 핵산을 함유하는 본 발명의 복합체 입자를 고상 표면에 도포하고, 그 고상 표면 위에서 이 질환 상태에 있는 세포를 배양하고, 이 유전자의 발현 레벨, 또는 세포의 증식률 또는 표현형을 조사하는 것을 특징으로 하는 이 핵산의 이 질환에 대한 치료효과를 조사하는 방법,
(3) 이 핵산이 질환에 관여하는 유전자의 발현을 세포내에서 저해하는 핵산, 또는 질환에 관여하는 유전자의 발현을 세포내에서 저해하는 기능을 갖는 핵산인 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 방법, 및
(4) 질환에 관여하는 유전자의 발현을 세포내에서 저해하는 핵산이 이 유전자를 코딩하는 플라스미드 DNA, 또는 질환에 관여하는 유전자의 발현을 세포내에서 저해하는 기능을 갖는 핵산이 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임인 상기 (3) 에 기재된 방법.
8) 기타 태양
이 태양에서는 이하의 발명을 제공할 수 있다.
(1) 원하는 핵산을 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 함께 세포배양면에 고정화시킨 세포배양기구; 바람직하게는 핵산이 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 복합체 입자를 형성하고 있는 이 세포배양기구;
(2) 원하는 핵산을 함유하는 콜라겐 또는 콜라겐 유도체를 함유하는 필름을 세포배양면에 깐 세포배양기구; 바람직하게는 원하는 핵산이 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 복합체 입자를 형성하고 있는 이 세포배양기구;
(3) 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 원하는 핵산을 함유하는 복합체 입자를 함유하는 필름을 세포배양면에 깐 세포배양기구;
(4) 핵산이 라이브러리화되어 있는 상기 (1) 내지 (3) 에 기재된 세포배양기구;
(5) 핵산이 라이브러리화되어 있는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드인 상기 (4) 에 기재된 세포배양기구;
(6) 라이브러리화된 핵산이 각각 떨어진 위치마다 분획되어 있는 상기 (4) 또는 (5) 에 기재된 세포배양기구;
(7) 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 원하는 핵산을 함유하는 필름으로서, 라이브러리화된 핵산이 각각 떨어진 위치마다 분획되어 있는 필름; 바람직하게는 핵산이 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 복합체 입자를 형성하고 있는 이 필름;
(8) 핵산이 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드인 상기 (7) 에 기재된 필름;
(9) 상기 (7) 또는 (8) 에 기재된 필름을 세포배양표면에 깐 상기 (2) 또는 (3) 에 기재된 세포배양기구;
(10) 단백질 발현용의 상기 (9) 에 기재된 세포배양기구;
(11) 유전자 발현 억제용의 상기 (9) 에 기재된 세포배양기구;
(12) 세포에 있어서의 임의의 유전자의 기능을 조사하는 방법으로서, 이 유 전자의 cDNA 를 함유한 핵산을 고정화시킨 상기 (1) 내지 (6) 에 기재된 세포배양기구 위에서 세포를 배양하고, 세포의 증식률, 표현형, 특정 단백질의 생산량을 조사하는 것을 특징으로 하는 방법;
(13) 세포에 있어서의 임의의 유전자의 기능을 조사하는 방법으로서, 이 유전자의 메신저 RNA 와 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 고정화시킨 상기 (1) 내지 (6) 에 기재된 세포배양기구 위에서 세포를 배양하고, 세포의 증식률, 표현형, 특정 단백질의 생산량을 조사하는 것을 특징으로 하는 방법; 및
(14) 핵산을 고정화시킨 부분 이외의 세포배양표면이 세포를 접착할 수 없는 높은 친수성 또는 소수성 표면인 상기 (1) 내지 (6) 에 기재된 세포배양기구.
핵산을 고상 위에서 표적세포에 도입하는 방법으로는, 전술한 바와 같이 핵산을 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 함께 또는, 핵산이 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 형성한 복합체 입자로서 직접 고정시킨 세포배양표면 위에서 표적세포를 배양하는 방법이 있다. 또한, 이들 이외에 핵산을 함유하는 콜라겐 또는 콜라겐 유도체를 함유하는 필름 또는 복합체 입자를 함유하는 필름을 고상 표면 위에 깔고 그 위에서 표적세포를 배양하는 방법, 및 핵산을 함유하는 콜라겐 또는 콜라겐 유도체 또는 이들 복합체 입자를 함유하는 아가로스나 알부민으로 형성되는 필름을 사용하는 방법이 있다.
본 발명은 많은 종류의 핵산을 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 복합체화시켜 고상 위에 독립적으로 정렬배치 (라이브러리화) 함으로써, 동시에 동일한 조건으로 세포내에서의 유전자의 기능을 조사할 수 있도록 한다. 또한, 이미 라이브러리 화된 cDNA 를 함유하는 핵산 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 고상 위에 정렬배치함으로써 세포 레벨에서 유전자의 기능을 해석할 수 있는 유전자 발현 라이브러리 또는 유전자 발현 억제 라이브러리를 제공한다. 라이브러리화된 cDNA 를 함유하는 핵산은 어떠한 것이라도 상관없지만, 예를 들면 Gene Storm pcDNA3.1 vector(In Vitrogen 사) 등을 들 수 있다.
핵산을 함유하는 복합체를 고상 위에 정렬배치하고, 그 위에서 세포를 배양하여 도입된 유전자의 기능을 해석하는 경우, 독립적으로 배치한 핵산이 각각 도입된 세포가 서로 섞이지 않게 할 필요가 있다. 이것을 방지하는 방법으로서, 각 핵산의 배치 부분을 웰로 구획짓는 방법이 있으며, 1 플레이트당 6 웰 내지 384 웰까지 구획지을 수 있다. 또한, 이와는 별도로 웰 이외에 세포를 접착할 수 없는 높은 친수성 또는 높은 소수성을 갖는 표면에서 세포의 핵산 배치 부분간의 이동을 방해할 수 있다. 여기서 말하는 높은 친수성을 갖는 표면이란 물과의 접촉각이 40 도 이하인 표면이며, 높은 소수성을 갖는 표면이란 물과의 접촉각이 110 도 이상인 표면이다. 또한, 핵산 배치 부분간의 거리는 접종하는 세포가 가장 신전(伸展)된 경우의 길이 이상으로 유지할 필요가 있다. 이와 같이 핵산을 고정화 또는 핵산을 함유하는 필름을 배치하는 부분 이외의 세포배양표면을 높은 친수성 또는 높은 소수성 표면으로 함으로써, 세포를 웰로 구획지어 배양할 필요가 없어, 미크로 플레이트 위에서 다수의 유전자의 기능을 한번에 해석할 수 있게 된다.
이하에 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
플라스미드 DNA 와 콜라겐의 복합체의 형성
섬유아세포 증식인자 HST-1(FGF4) 의 유전자 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2980∼2984(1987)) 를 삽입한 플라스미드 DNA(pCAHST-1:7.9Kbp) 를 10㎍/㎖ 함유하는 수용액과 200,60,20,6,2,0.6,0㎍ 의 아텔로콜라겐 ((주)고켄) 을 함유하는 중성 수용액을 등량 혼합하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. 아가로스 겔 전기영동은 수평형 전기영동 유니트 (Mupid, (주)어드밴스) 로 TAE (트리스ㆍ아세트산) 완충액 중 0.8% 아가로스 겔을 이용하여 실시하였다. 전기영동후, 에티듐브로마이드로 겔을 염색하고 트랜스일루미네이터 위에서 촬영하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다. pCAHST-1 은 10㎍/㎖ 이상 농도의 콜라겐 존재하에서는 영동되지 않고 웰에 잔류하였다. 이 결과는 5㎍/㎖ 의 pCAHST-1 이 10㎍/㎖ 의 콜라겐과 복합체를 형성함을 나타내고 있다.
동일하게 10㎍/㎖ 의 pCAHST-1 과 100㎍/㎖ 의 콜라겐을 등량, 0.15M, 0.2M, 1.0M 의 염화나트륨을 함유하는 10mM 트리스염산 완충액 (pH 7.5) 중에서 혼합하고, 전기영동으로 분석한 결과를 도 2 에 나타낸다. pCAHST-1 은 100㎍/㎖ 의 콜라겐 존재하에서도 1.0M 염화나트륨이 공존하면 영동되었다. 이것은 pCAHST-1 과 콜라겐이 형성하는 복합체는 정전적 복합체임을 나타내고 있다.
또한, 0.15M 의 염화나트륨을 함유하는 10mM 트리스염산 완충액 (pH 7.5) 중, 10㎍/㎖ 의 pCAHST-1 과 콜라겐의 복합체 형성을 헤파란 황산의 유무로 비교하였다. 결과를 도 3 에 나타낸다. 헤파란 황산이 존재하지 않는 경우, 5㎍/㎖ 의 pCAHST-1 은 100㎍/㎖ 의 콜라겐에 의하여 모두 복합체를 형성하였지만, 헤파란 황산 존재하에서는 300㎍/㎖ 의 콜라겐 존재하에서도 복합체를 형성하지 않은 pCAHST-1 의 존재가 확인되었다. 이것은 pCAHST-1 과 동일하게 음전하를 갖는 헤파란 황산이 존재함으로써, 콜라겐과의 복합체 형성에 pCAHST-1 과 헤파란 황산의 경쟁반응이 생겼음을 나타내고 있으며, pCAHST-1 과 콜라겐이 정전적 복합체를 형성함을 시사하고 있다.
실시예 2
복합체의 현미경 관찰결과
200㎍/㎖ 의 pCAHST-1 수용액과 0,20,200,1000㎍/㎖ 의 아텔로콜라겐 수용액을 등량 혼합하고, 수득된 혼합액에 PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent(Molecular Probes) 를 첨가하여 pCAHST-1 을 염색하고 형광 현미경으로 관찰하였다. 수득된 결과를 도 4 에 나타낸다. 혼합후의 콜라겐 농도가 500㎍/㎖ (도면 중, 콜라겐 0.05%) 인 경우, 주로 장경 1㎜ 를 초과하는 선유 형상 복합체가 관찰되었지만, 콜라겐 농도가 100㎍/㎖ (도면 중, 콜라겐 0.01%) 인 경우, 주로 10∼100㎛ 의 입자 형상 복합체가, 또한 10㎍/㎖ (도면 중, 콜라겐 0.001%) 인 경우에는 주로 10㎛ 이하의 미립자 형상 복합체가 관찰되었다. 이 결과는 혼합시의 플라스미드 DNA 와 콜라겐의 농도에 의하여 복합체의 형상을 제어할 수 있음을 나타내고 있다. 또한, 이 복합체는 5℃ 에 보관함으로써 1 주일 이상 안정적으로 그 형상이 유지되었다 (도 5). 이 결과는 이 복합체를 장기간에 걸쳐 저장할 수 있으며, 사용시 제조할 필요가 없고 복합체의 상태로 유통 가능함을 나타내고 있다.
실시예 3
복합체에 의한 발현기간의 연장 효과
형광을 발하는 단백질 (EGFP) 을 코딩하는 플라스미드 DNA (pCMV-EGFP/pEGFP-N1, 클론테크 주식회사) 200㎍/㎖ 를 함유하는 수용액과 0.02%(w/w) 의 아텔로콜라겐 수용액을 등량 혼합함으로써 겔 형상 제제를 제조하였다.
직경 6㎝ 의 배양접시에서 배양한 인간 태아 신장세포주 293 세포에 무혈청 배지 2㎖ 존재하, 제조한 겔 형상 제제를 100㎕ (pCMV-EGFP 10㎍ 함유) 첨가하였다. 첨가후, 37℃ 에서 하룻밤 배양한 후, 세포표면을 PBS 로 세정하여 무혈청 배지와 제제를 제거하고, 10% 의 송아지 혈청을 함유하는 배지 중에서 배양하였다. 시간이 경과함에 따라 세포를 형광 현미경으로 관찰하여, EGFP 의 발현을 관찰하였다. 대조로서 동량의 pCMV-EGFP 를 함유하는 PBS 용액 및 양이온성 리포솜 제제와 pCMV-EGFP 의 복합체를 293 세포에 각각 첨가하였다.
수득된 결과를 도 6 에 나타낸다. pCMV-EGFP 의 겔 형상 제제의 경우, EGFP 의 발현이 관찰되고, 그 발현은 첨가 52 일후까지 장기간 확인되었다. 이에 반해, pCMV-EGFP 를 함유하는 PBS 용액의 경우에는 EGFP 의 발현은 관찰되지 않고, 또한 양이온성 리포솜 제제에서는 EGFP 의 발현은 확인되었으나 그 발현은 2 일간이라는 단기간이었다. 이들 결과는 플라스미드 DNA 를 콜라겐으로 제제화 함으로써 플라스미드 DNA 의 발현 효율을 높일 수 있으며, 또한 발현을 장기간 지속시킬 수 있음을 나타내고 있다.
이 결과는 플라스미드 DNA 와 콜라겐이 형성한 복합체가 세포내로의 플라스미드 DNA 의 이입을 높이고, 또한 세포 안팎에서의 플라스미드 DNA 의 안정성을 높이고, 세포내에서 유전자의 발현을 장기화시키고 있음을 나타내고 있다. 특정 이론에 얽매이는 것은 아니나, 계 중에 복합체가 존재하지 않는 상태에서도 발현이 장기간 지속되는 것은 복합체가 세정으로 제거되지 않을 정도로 세포와 상호작용하고 있거나, 또는 복합체로서 세포내로 삽입되는 것을 고려할 수 있다.
실시예 4
복합체의 조성에 있어서의 플라스미드 DNA 도입 효율에 대한 효과
이하의 표 1 에 나타내는 각종 조성의 복합체를 플라스미드 DNA 로서 pCMV-EGFP 를 이용하여 제조하였다.
복합체 아텔로콜라겐(%) pDNA(㎍/㎖)
EGFG-1 0 100
EGFG-2 0.001 100
EGFG-3 0.01 100
EGFG-4 0.05 100
EGFG-5 0.1 100
결과는 EGFG-3 복합체＞EGFG-2 복합체＞EGFG-4 복합체 = EGFG-5 복합체의 순서로 도입 효율이 높았다. EGFG-1 에서는 도입은 확인되지 않았다. 이 결과는 플라스미드 DNA 가 아텔로콜라겐과 복합체를 형성함으로써 플라스미드 DNA 의 발현 효율이 높아지고, 또한 등량의 플라스미드 DNA 를 함유하는 복합체에서도 아 텔로콜라겐의 함유량에 따라 발현 효율이 달라짐을 나타내고 있다.
실시예 5
플라스미드 DNA 도입 효율에 대한 플라스미드 DNA 량의 영향
실시예 4 에서 가장 도입 효율이 높았던 EGFG-3 복합체 (아텔로콜라겐 0.01%, pCMV-EGFP 100㎍/㎖) 0, 10, 50, 100, 250 및 500㎕ 를 6 웰 배양접시에서 배양한 293 세포에 무혈청 배지 1㎖ 존재하 적가하였다. 적가후, 37℃ 에서 하룻밤 배양한 후, 세포표면을 PBS 로 세정하여 무혈청 배지와 복합체를 제거하고, 10% FBS (10% 소태아 혈청을 함유) 배지와 배지교환하였다. 6 일간 시간 경과에 따라 세포를 형광 현미경으로 관찰하여 EGFP 의 발현을 관찰하였다.
플라스미드 DNA 량을 증대시키면 도입 효율도 향상되었다. 구체적 데이터는 다음과 같다. 표 중, 발현 효율은 현미경으로 관찰 가능한 정해진 구획에 존재하는 전체 세포수를 계수하고, 그 중에서 EGFP 를 발현시켜 형광을 발하는 세포수를 계수하여 산출하였다.
트랜스펙션 효율
EGFG-3(㎕) 100 250 500
EGFP 발현세포(세포/웰) 262 1057 1081
효율 0.006 0.03 0.03
실시예 6
복합체에 의한 발현기간의 연장 효과에 있어서의 복합체 적가법과 고상 도포법의 비교
먼저, 가장 도입 효율이 높았던 EGFG-3 복합체 (아텔로콜라겐 0.01%, pCMV- EGFP 100㎍/㎖) 의 조성에 기초하여, 콜라겐 및 플라스미드 DNA 조성의 최적화를 도모하면서, 적가법 및 고상 도포법에 의한 발현기간을 비교하였다.
(1) 이하의 표 3 에 나타내는 각종 아텔로콜라겐 농도 조성의 복합체를 플라스미드 DNA 로서 pCMV-EGFP 를 이용하여 제조하였다.
실험6:아텔로콜라겐 농도와 유전자 도입 효율
복합체 아텔로콜라겐(%) pDNA(㎍/㎖)
EGFG-3A 0.005 100
EGFG-3B 0.008 100
EGFG-3 0.01 100
EGFG-3C 0.015 100
EGFG-3D 0.02 100
EGFG-3E 0.03 100
pDNA 단독 0 100
6 구멍 배양접시에서 배양한 293 세포에 무혈청 배지 존재하, 제조한 복합체를 적가하였다. 적가후, 37℃ 에서 하룻밤 배양한 후, 세포 표면을 PBS 로 세정하여 무혈청 배지와 복합체를 제거하고, 10% FBS 를 함유하는 배지와 배지교환하였다. 7 일후에 형광 현미경으로 관찰하여 EGFP 를 발현시키고 있는 세포수를 계수하였다. 결과를 도 7 에 나타낸다. 또한, EGFG-3B, 3D, 3E 에 대해서는 발현시킨 EFGP 의 형광강도를 측정하였다 (Array Scan Ⅱ System, Cellomics 사). 각 샘플의 상대적인 형광강도를 도 8 에 나타낸다.
6 구멍 배양접시에 제조한 복합체 250㎕/웰을 도포하고, 30분간 자연건조시켰다. 이어서, 10% FBS 를 함유하는 배지 중, 293 세포 (4-5×105 세포/웰) 를 첨가하고, 37℃ 에서 하룻밤 배양하고, 7 일후에 형광 현미경으로 관찰하여 EGFP 를 발현시키고 있는 세포수를 계수하였다. 결과를 도 9 에 나타낸다.
적가법에 의한 결과를 나타내는 도 7 및 고상 도포법에 의한 결과를 나타내는 도 9 는 콜라겐 농도가 도입 효율에 영향을 주는 것, 및 고상 도포법이 적가법보다 도입 효율의 점에서 우수함을 나타내고 있다.
(2) 이하의 표 4 에 나타내는 각종 플라스미드 DNA 농도 조성의 복합체를 제조하고, 상기와 동일하게 적가법과 고상 도포법에 있어서의 도입 효율을 비교하였다.
복합체 아텔로콜라겐(%) pDNA(㎍/㎖)
EGFG-3B 0.008 100
EGFG-3B2 0.008 60
EGFG-3B3 0.008 40
EGFG-3B4 0.008 20
적가법에 의한 결과를 도 10 에, 고상 도포법에 의한 결과를 도 11 에 나타낸다. 또한, 고상 도포법에 의하여 수득된 각 샘플에서의 EGFP 의 상대적인 형광강도를 도 12 에 나타낸다. 이들 결과는 플라스미드 DNA 농도의 비율이 도입 효율에 영향을 주며, 특히 고상 도포법에서는 EGFP 의 발현량과 플라스미드, DNA 의 농도 사이에 정의 상관관계가 있는 것, 및 여기서도 고상 도포법이 적가법보다 도입 효율의 점에서 우수함을 나타내고 있다.
실시예 7
고상 도포법의 스크리닝으로의 응용
섬유아세포 증식인자 HST-1(FGF4) 의 유전자 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2890∼2984(1987) 에 기재) 의 4196b 에서 4216b 까지의 서열에 상보적인 서열을 가진 포스포로티오에이트형 안티센스 올리고뉴클레오티드 (5'- CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3', 분자량: 약 6500, 서열번호 2)(5)(사와데 주식회사) 10μM 와 0.05% 아텔로콜라겐액을 혼합하여 복합체를 형성하였다. 수득된 복합체를 세포배양용 96 구멍 플레이트의 바닥부에 도포하여 자연건조시켜, 복합체가 바닥부에 도포된 세포배양기구를 수득하였다. 동일하게 HST-1 유전자와 동일한 서열을 갖는 포스포로티오에이트형 센스 올리고뉴클레오티드 (5'-GAGCATCCGCAACATCAACA-3', 서열번호 3)(1) 및 안티센스 올리고뉴클레오티드의 서열을 스크램블시킨 서열 (5'-AGTCGCATGCACACAACACA-3', 서열번호 4)(2) 및 3 종의 랜덤한 서열 (5'-GACCATCGTCGATTCCAGT-3', 서열번호 5)(3), (5'-CATGAACATCCTGAGCATCC-3', 서열번호 6)(4), (5'-GTTCACGAAGAAAGAAGGCT-3', 서열번호 7)(6) 을 갖는 포스포로티오에이트형 안티센스 올리고뉴클레오티드를 각각 콜라겐과 복합체를 형성시켜 플레이트의 바닥부에 도포, 건조시켰다. 이들 올리고뉴클레오티드를 도포한 플레이트에 HST-1 이 과잉으로 발현됨으로 인하여 증식이 촉진되어 있는 NEC8 세포와 HST-1 이외의 유전자에서 증식이 촉진되어 있는 HepG2 세포를 0.5×105 개/웰의 농도로 파종하고, 4 일간 배양하였다. 배양후, 세포의 증식 억제를 테트라컬러원 세포증식 어세이 시약 (생화학공업) 을 이용하여 측정하였다. 구체적으로는 착색한 샘플액을 650㎚ 의 흡광도를 대조로서 450㎚ 의 흡광도를 측정하였다 (도 13).
그 결과, HST-1 에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 콜라겐과 복합체를 형성시켜 도포한 경우에만 NEC8 세포에서 증식저해 효과가 확인되었다 (도 13-5). 한편, HST-1 에 대한 센스 올리고뉴클레오티드를 콜라겐과 복합체를 형성하여 플레이트 바닥부에 도포한 경우에는 저해 효과는 확인되지 않았다 (도 13-1). 동일하게 안티센스 올리고뉴클레오티드의 서열을 스크램블시킨 서열 (도 13-2) 및 랜덤한 서열 (도 13-3, 4, 6) 을 갖는 포스포로티오에이트형 올리고뉴클레오티드를 콜라겐과 복합체를 형성시켜 도포한 경우에는 저해 효과는 확인되지 않았다. 이 결과는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 아텔로콜라겐과 복합체를 형성시켜 고상 위에 도포하고, 그 고상 위에서 세포를 배양하면, 양이온성 리포솜이나 양이온성 지질 등 통상 생체내에는 존재하지 않는 유전자 도입 시약을 이용하지 않고 세포의 증식에 관여하는 유전자를 스크리닝할 수 있음을 나타내고 있다. 또한, 이 결과는 본 방법에 의하여 유전자 도입 시약이 세포에 주는 장해에 의한 노이즈 없이, 또한 소량의 세포 및 올리고뉴클레오티드로 고감도로 유전자 기능을 해석할 수 있음을 나타내고 있다.
실시예 8
아텔로콜라겐에 의한 아데노바이러스 벡터의 자연건조 보존
(고상 도포법에 의한 제조)
1×108 pfu/㎖ 아데노바이러스 벡터 AdCMVEGFP (K. Aoki, et al., Mol. Ther.(2000)1(6):555∼565) 의 DMEM 용액 중 용액 10㎕ 를 아텔로콜라겐의 PBS(-) 중 2% 용액 5㎕ 와 혼합하였다. 이 혼합물 50㎕ 를 24웰 배양 플레이트 (비피복)(코닝사) 에 첨가하고, 냉 세팅된 드라이어에 의하여 실온에서 15 분간 자연건 조시키고 고상 도포를 실시하였다.
(바이러스의 보존 안정성 시험)
수득된 배양 플레이트를 실온에 계속 방치하면서, 방치후 1 일, 7 일 및 14 일째에 인간 간암세포주 HepG2 세포를 2×105 세포/웰로 첨가하고, 각각의 2 일후에 GFP 의 발현량을 형광 현미경에 의하여 확인하였다. 대조로서, 아데노바이러스 벡터만, 및 아텔로콜라겐만을 배양 플레이트에 고상 도포하고 동일하게 실험을 실시하였다.
수득된 결과를 표 5 에 나타낸다.
「결과」
세포접종 2일후의 GFP 양성률(%)
아텔로/아데노 아데노만 아텔로만
실온방치 1일간 64 72 0
실온방치 7일간 42 10 이하 0
실온방치 14일간
실시예 9
고상 도포법에서의 유전자 도입 효과의 아데노바이러스 용량 의존성
4×104, 4×105, 4×106, 4×107 pfu/㎖ 의 아데노바이러스 벡터 AdCMVEGFP (k. Aoki, et al., Mol. Ther.(2000)1(6):555∼565) 의 DMEM 용액을 160㎍/㎖ 의 아텔로 콜라겐 용액과 등량 혼합하였다. 이 혼합물은 4℃ 에서 장기간 활성을 저하시키지 않고 보존 가능하였다. 혼합물 50㎕ 를 96 웰 배양 플레이트 (비피복, 코닝사) 에 첨가하고, 자연건조시켜 고상 도포를 실시하였다. 이 플레이트 는 활성을 저하시키지 않고, 적어도 2 주간 내지 4 주간 동안 보존 가능하다. 수득된 배양 플레이트에 배간세포 (ES 세포) 를 접종하고, 3 일후에 GFP 의 발현을 형광 현미경으로 확인하는 동시에, 형광강도를 측정하였다. 그 결과, GFP 의 형광강도는 아데노바이러스의 투여량과 정의 상관관계가 있었다 (도 14). 이 결과는 본 발명이 아데노바이러스를 이용한 ES 세포의 하이 스루풋 스크리닝에 유용한 기술로서, 아데노바이러스와 콜라겐이 형성한 복합체를 도포한 하이 스루풋 스크리닝용 플레이트를 제공할 수 있음을 나타내고 있다.
실시예 10
플라스미드 DNA 를 함유하는 복합체의 조성과 평균 장경의 관계
10℃ 이하로 냉각시킨 형광을 발하는 단백질 (EGFP) 을 코딩하는 플라스미드 DNA(pCMV-EGFP/pEGFP-N1, 4.7kbp, 클론테크 주식회사) 200㎍/㎖ 를 함유하는 수용액, 0.1M 인산 완충액 (PB), 염화나트륨을 함유하는 0.01M 인산 완충액 (PBS) 과, 10℃ 이하로 냉각시킨 0.002∼0.2%(w/w) 의 아텔로콜라겐 ((주)고켄) 을 함유하는 수용액, 0.1M 인산 완충액, 염화나트륨을 함유하는 0.01M 인산 완충액을 각각 10℃ 이하에서 등량 혼합하고, 하룻밤 10℃ 이하에서 정치함으로써 겔 형상 제제를 제조하였다. 수득된 겔 형상 제제를 70㎛, 또는 10㎛ 의 공경을 갖는 필터를 통과시켜 입자를 조정한 겔 형상 제제를 제조하였다.
수득된 제제에 PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent (Molecular Probes) 를 첨가하여 pCMV-EGFP 를 염색하고 형광 현미경으로 관찰함으로써 복합체의 장경을 측정하였다. 동일하게 HST-1 의 분비 시그널 펩티드와 인터루킨 2 를 코딩 하는 플라스미드 DNA (pCMV-HST-1-IL-2, 6.2kbp) 와 아텔로콜라겐을 혼합하여 겔 형상 제제를 수득하고, 복합체의 장경을 측정하였다. 또한, 수득된 겔 형상 제제를 아가로스 겔 (트리스ㆍ아세트산 완충액, 0.8% 아가로스 겔) 로 전기영동함으로써, 복합체를 형성한 플라스미드 DNA 와 형성하지 않은 플라스미드 DNA 를 분리하였다. 복합체를 형성하지 않은 플라스미드 DNA 의 밴드를 에티듐브로마이드로 염색하고, 형광강도를 Fluor-S-Multi Imager (BIO-RAD) 를 이용하여 측정하였다. 농도를 이미 알고 있는 플라스미드 DNA 를 전기영동한 밴드의 형광강도로부터 수득되는 검량선을 기초로, 복합체를 형성하지 않은 플라스미드 DNA 량을 정량하고, 복합체에 함유되는 DNA 의 음전하량과 콜라겐 분자량의 비를 산출하였다. 결과를 표 6 에 나타낸다.
샘플명 플라스미드 DNA 용매 콜라겐농도(%) 콜라겐 1분자당 뉴클레오티드 단량체수 복합체평균장경(㎛)
혼합후 70㎛ 필터 투과후 10㎛ 필터 투과후
10-1 pCMV-EGFP 물 0.001 2406 9.1 8.9 〈3.4
10-2 pCMV-EGFP 물 0.005 742 37 26
10-3 pCMV-EGFP 물 0.008 699 6.6
10-4 pCMV-EGFP 물 0.01 299 53 44 35
10-5 pCMV-EGFP 물 0.02 356 17
10-6 pCMV-EGFP 물 0.05 76 122 105
10-7 pCMV-EGFP 물 0.1 66 303 174
10-8 pCMV-EGFP PB 0.001 448 〈3.4 / 〈3.4
10-9 pCMV-EGFP PB 0.01 152 7.7 /
10-10 pCMV-EGFP PB 0.1 97 22 / 14
10-11 pCMV-EGFP PBS 0.01 300 13 / 9.2
10-12 pCMV-EGFP PBS 0.1 97 22 / 15
10-13 pCMV-HST-1-IL-2 물 0.001 4228 6 6.1 〈3.4
10-14 pCMV-HST-1-IL-2 물 0.005 1122 20 9.8
10-15 pCMV-HST-1-IL-2 물 0.008 426 6.1
10-16 pCMV-HST-1-IL-2 물 0.01 324 20 13 27
10-17 pCMV-HST-1-IL-2 물 0.02 360 16
10-18 pCMV-HST-1-IL-2 물 0.05 95 151 201
10-19 pCMV-HST-1-IL-2 물 0.1 66 256 201
10-20 pCMV-HST-1-IL-2 PB 0.001 701 6.1 〈3.4
10-21 pCMV-HST-1-IL-2 PB 0.01 262 20
10-22 pCMV-HST-1-IL-2 PB 0.1 97 25 / 9.4
10-23 pCMV-HST-1-IL-2 PBS 0.01 315 9.8 /
10-24 pCMV-HST-1-IL-2 PBS 0.1 97 29 /
염을 함유하지 않은 물을 용매로 하여 복합체를 제조한 경우, pCMV-EGFP, pCMV-HST-1-IL-2 모두 콜라겐 농도가 0.05% 이상인 경우, 평균장경이 122㎛ 이상의 복합체가 수득되었다. 또한, 콜라겐 농도가 0.005%∼0.02% 일 때에는 평균장경 6.1㎛∼53㎛ 의 복합체가, 콜라겐 농도가 0.001% 일 때에는 평균장경 10㎛ 이하의 복합체가 수득되었다. 이 결과는 염을 함유하지 않는 물을 용매로 한 경우, 혼합시의 플라스미드 DNA 와 콜라겐의 농도를 조절함으로써 복합체의 형상을 제어할 수 있음을 나타내고 있다. 특히, 콜라겐의 농도를 높게 하면, 즉 콜라겐의 분자수를 증가시키면 복합체의 형상은 커지는 경향이 있었으나, 이는 복합체의 장경의 증대가 오로지 콜라겐 분자에 의한 회합체 형성에 의존함을 나타내고 있다.
이 결과는 실시예 2 에 있어서 pCAHST-1 을 이용하여 복합체를 제조한 결과와 일치하고 있다. 사용한 각 플라스미드 DNA 의 사이즈는 각각 pCAHST-1:7.9kbp, pCMV-EGFP:4.7kbp, pCMV-HST-1-IL-2:6.2kbp 와 상호 상이하다. 이것도 플라스미드 DNA 의 사이즈는 형성되는 복합체의 형상에 영향을 주지 않음을 나타내고 있다.
한편, 0.1M 인산 완충액 및 염화나트륨을 함유하는 0.01M 인산 완충액을 용매로 하여 복합체를 제조한 경우, 콜라겐 농도가 0.001%∼0.1% 일 때, 복합체 평균장경이 3.4㎛ 이하∼ 29㎛ 의 복합체가 수득되고, 100㎛ 를 초과하는 사이즈의 복합체는 수득되지 않았다. 이것은 염의 존재에 의하여 콜라겐의 회합체 형성이 억제되기 때문인 것으로 여겨지며, 콜라겐의 회합체 형성을 억제하는 물질의 존재하 복합체를 제조함으로써 100㎛ 이하의 평균장경을 갖는 복합체를 콜라겐의 농도에 의존하지 않고 제조할 수 있음이 나타났다.
또한, 일단 플라스미드 DNA 와 콜라겐을 혼합하여 수득된 겔 형상 제제를 70㎛ 또는 10㎛ 의 공경을 갖는 필터로 여과함으로써, 평균장경이 더욱 작은 복합체로 입자를 조정하여 수득할 수 있었다.
도 15 에 플라스미드 DNA 1 분자에 결합한 콜라겐의 분자수와 복합체의 평균장경의 관계를 나타내었다. 염을 함유하지 않은 물을 용매로 한 경우, pCMV-EGFP, pCMV-HST-1-IL-2 모두 플라스미드 DNA 에 결합하는 콜라겐 분자수가 많아짐에 따라 복합체의 평균장경이 증대되는 경향이 나타났다. 한편, 0.1M 인산 완충액, 염화나트륨을 함유하는 0.01M 인산 완충액을 용매로 하여 복합체를 제조한 경우에는 그러한 경향은 보이지 않고, 물을 용매로 한 경우에는 평균장경이 100㎛ 를 초과하는 콜라겐 분자가 플라스미드 DNA 와 복합체를 형성한 경우에도 평균장경은 50㎛ 를 초과하지 않았다. 이는 앞서 설명한 바와 같이 물을 용매로 한 경우, 플라스미드 DNA 와 콜라겐이 복합체를 형성하는데 수반하여 콜라겐 회합체의 형성이 진전되는데, 이 반응은 오로지 회합체의 장축을 연신하는 반응이기 때문인 것으로 여겨진다. 한편, 염이 존재하는 경우에는 콜라겐 분자가 플라스미드 DNA 와 결합하여 형성된 콜라겐 회합체가 염의 존재에 의하여 충분히 회합체의 장축방향으로 연신될 수 없기 때문에, 미세한 회합체가 플라스미드 DNA 에 다수 결합하는 구조를 취하기 때문인 것으로 여겨진다. 한편, 콜라겐은 적당한 염농도에 있어서 미세한 회합체를 형성하는 것으로 알려져 있으므로, 일부의 콜라겐은 플라스미드 DNA 와 혼합하기 전에 미리 미세한 회합체를 형성하고, 플라스미드 DNA 와 미세한 콜라겐 회합체가 결합하여 복합체를 생성한 것으로 여겨진다. 이는 미리 콜라겐을 미세 회합체화하여 플라스미드 DNA 와 혼합함으로써, 평균장경 50㎛ 이하의 복합체를 생성할 수 있음을 나타내고 있다.
이번에 수득된 결과를 플라스미드 DNA 의 사이즈에 의존하지 않고 일반화시켜 해석하기 위하여, 복합체 중의 콜라겐 1 분자당의 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 단량체수를 산출하였다. 콜라겐 1 분자당의 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 단량체수와 복합체의 평균장경의 관계를 도 16 에 나타내었다. 콜라겐 1 분자당 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 단량체수가 적어짐에 따라 복합체의 평균장경이 증대되는 경향이 나타났다.
도 16 과 표 6 을 종합하면 다음의 내용이 도출된다. 뉴클레오티드 단량체수가 95 이하가 된 경우, 평균장경이 120㎛ 를 초과하는 복합체가 수득되었다. 이는 콜라겐 1 분자당의 뉴클레오티드 단량체수의 감소가 복합체 중의 플라스미드 DNA 에 대한 콜라겐 분자수의 증대를 나타내며, 따라서 콜라겐 1 분자당의 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 단량체수를 96 이상으로 유지함으로써 평균장경이 120㎛ 이하의 복합체를 수득할 수 있음을 의미하고 있다. 한편, 복합체의 최소단위는 콜라겐 1 분자와 플라스미드 DNA 1 분자가 형성하는 복합체이다. 콜라겐 1 분자와 복수의 플라스미드 DNA 가 복합체를 형성하는 것은 플라스미드 DNA 간의 음전하에 의한 반발과 입체적인 장애로 인하여 어렵다. 따라서, 콜라겐 1 분자당의 뉴클레오티드 단량체수가 최대가 되는 것은 콜라겐과 플라스미드 DNA 가 각각 1 분자로 복합체를 형성한 경우로서, 플라스미드 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 단량체수에 의하여 규정된다.
실시예 11
올리고뉴클레오티드를 함유하는 복합체의 조성과 평균장경의 관계
섬유아세포 증식인자 HST-1(FGF4) 의 유전자 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2890∼2984(1987) 에 기재) 의 4196b 에서 4216b 까지의 서열에 상보적인 서열을 가진 포스포로티오에이트형 안티센스 올리고뉴클레오티드 (5'-CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3', 분자량: 약 6500, 서열번호 8)(에스펙 주식회사) 를 2.0μM∼40.0μM 의 농도로 함유하고, 10℃ 이하로 냉각시킨 수용액, 0.1M 인산 완충액 (PB) 과, 10℃ 이하로 냉각시킨 0.02∼3.0%(w/w) 의 아텔로콜라겐 ((주)고켄) 을 함유하는 수용액, 0.1M 인산 완충액을 각각 10℃ 이하에서 등량 혼합하고, 10℃ 이하에서 하룻밤 정치시킴으로써 겔 형상 제제를 제조하였다. 수득된 겔 형상 제제 중에서 콜라겐과 복합체를 형성한 올리고뉴클레오티드량은 겔 형상 제제를 5℃ 에서 1 시간 15 만 회전으로 원심하여 복합체를 침전시키고, 상청액 중의 유리된 올리고뉴클레오티드량을 HPLC (칼럼: Puresil C18 5(Waters), 이동상: 1mM 의 EDTA, 5mM 의 테트라부틸암모늄을 함유하는 0.1M 아세트산암모늄 (pH 7.0) 중의 아세토니트릴 함량을 35 분간 24.5% 에서 35% 로 변화, 유속: 1㎖/min, 검출파장: 260㎚) 로 정량하여 산출하였다. 수득된 제제에 단쇄 핵산 형광염색시약 YOYO (Molecular Probes) 를 첨가하여 올리고뉴클레오티드를 염색하고 형광 현미경으로 관찰함으로써 복합체의 장경을 측정하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
샘플명 용매 올리고뉴클레오티드 농도(μM) 콜라겐 농도 (%) 콜라겐 1분자당 올리고뉴클레오티드 분자수 콜라겐 1분자당 뉴클레오티드 단량체수 복합체 평균장경(㎛)
11-1 물 1.0 0.05 0.6 12 32
11-2 물 5.0 0.05 3 60 13
11-3 물 10.0 0.05 4.4 88 12
11-4 물 20.0 0.05 5.2 104 17
11-5 물 10.0 0.01 6.3 126 32
11-6 물 10.0 0.1 2.9 58 20
11-7 PB 1.0 0.05 0.5 10 25
11-8 PB 5.0 0.05 1.2 24 29
11-9 PB 10.0 0.05 1.4 28 35
11-10 PB 20.0 0.05 1.3 26 36
11-11 PB 10.0 0.01 3.3 66 23
11-12 PB 10.0 0.1 1.3 26 33
11-13 PB 10.0 0.5 0.5 10 46
11-14 PB 10.0 1.0 0.3 6 49
11-15 PB 10.0 1.5 0.2 4 54
플라스미드 DNA 를 이용한 실시예 10 과 동일하게, 올리고뉴클레오티드를 콜라겐과 혼합함으로써 올리고뉴클레오티드와 콜라겐의 복합체가 수득되었다. 플 라스미드 DNA 의 경우와 달리, 염을 함유하지 않는 물을 용매로 한 경우, 0.1M 인산 완충액을 용매로 한 경우 모두, 콜라겐의 농도 및 올리고뉴클레오티드의 농도에 따라 복합체의 평균장경에 현저한 변화는 보이지 않았다. 이는 올리고뉴클레오티드가 플라스미드 DNA 에 비하여 저분자이므로 콜라겐의 회합체 형성을 저해하기 때문인 것으로 여겨진다.
도 17 에 혼합시의 올리고뉴클레오티드와 콜라겐의 분자수의 비와 복합체 중에서 콜라겐 1 분자에 결합한 올리고뉴클레오티드의 분자수의 관계를 나타내었다. 물, 인산 완충액 중 어느 하나를 용매로 사용한 경우에도, 혼합시의 콜라겐 분자수에 대한 올리고뉴클레오티드 분자수가 높을수록 형성되는 복합체 중에서 콜라겐 1 분자에 결합한 올리고뉴클레오티드 분자수가 높아지는 경향이 있었다. 또한, 콜라겐 1 분자에 결합하는 최대 올리고뉴클레오티드 분자수는 용매에 따라 달라지며, 물을 용매로 한 경우 6 분자, 인산 완충액을 용매로 한 경우에는 3 분자였다.
콜라겐의 분자량 (30만) 은 올리고뉴클레오티드의 분자량 (약 6,500) 에 비하여 매우 크며, 복합체의 형상은 오로지 복합체를 형성하는 콜라겐 분자수에 의존하므로, 평균장경이 같은 복합체 중의 콜라겐 분자수는 대략 동일수이다. 따라서, 평균장경이 같은 복합체라도 콜라겐 1 분자에 결합한 올리고뉴클레오티드수에 의존하여, 복합체에 함유되는 올리고뉴클레오티드 분자수가 달라진다. 세포에 올리고뉴클레오티드를 도입할 때, 개개의 복합체가 세포와 접촉하여 올리고뉴클레오티드를 도입하기 때문에, 올리고뉴클레오티드 분자의 함량이 높은 복합체 쪽이 효율적으로 세포에 올리고뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 따라서, 콜라겐 1 분자당의 올리고뉴클레오티드 분자수가 높은 복합체가 더욱 바람직하며, 일반화하자면 콜라겐 1 분자당 결합하는 뉴클레오티드 단량체수가 높은 쪽이 더욱 바람직하다.
실시예 12
올리고뉴클레오티드를 함유하는 복합체를 도포한 세포배양기구
실시예 11 에서 제조한 겔 형상 제제 (11-3, 실시예 7 에 있어서의 제제의 조성) 50㎕ 를 96 구멍 마이크로 플레이트의 바닥부에 적하하고, 냉풍을 직접 쏘이는 방법 (실온, 2시간) 또는 데시케이터 중에 실리카 겔과 함께 정치시키는 방법 (실온, 2일간) 으로 건조시키고, 복합체를 세포배양 표면에 도포한 세포배양기구를 제조하였다. 세포배양기구의 웰에 염화나트륨에 의하여 생체와 등장으로 조정한 0.01M 인산 완충액 (PBS) 100㎕ 를 첨가하고 즉시 가볍게 피펫팅하여 액을 채취하였다. 또한, 세포배양기구의 웰에 염화나트륨에 의하여 생체와 등장으로 조정한 0.01M 인산 완충액 100㎕ 를 첨가하고, 37℃ 에서 하룻밤 정치시킨 후, 가볍게 피펫팅하여 액을 채취하였다. 수득된 액 10㎕ 에 단쇄 핵산 형광염색시약 YOYO (Molecular Probes) 2㎕ 를 첨가하여 올리고뉴클레오티드를 염색하고, 세포배양기구 표면에서 유리시킨 복합체를 형광 현미경으로 관찰하였다. 수득된 형광 현미경 이미지를 도 18 에 나타내었다. 채취한 모든 액에서 50㎛ 이하의 장경을 갖는 복합체가 확인되었다. 이것은 PBS 에 노출시킴으로써, 세포배양기구 표면에서 복합체가 유리됨을 나타내고 있다. 유리시킨 복합체의 형상은 건조방법, PBS 로의 노출의 상태에 상관없이, 세포배양기구 표면에 도포하기 전과 변화가 없었다. 이 결과는 건조방법에 의존하지 않고 복합체가 형상을 유지한 상태에서 세포배양기구 표면에서 유지되었음을 나타내고 있으며, 또한 일반적으로 세포배양에 사용되는 37℃ 라는 온도조건에 있어서도 복합체의 형상이 변화되지 않음을 나타내고 있다.
실시예 13
플라스미드 DNA 를 함유하는 복합체를 도포한 세포배양기구
실시예 10 에서 제조한 겔 형상 제제 (10-3; 실시예 6 에서 양호한 도입 효율이 확인된 조성) 50㎕ 를 96 구멍 마이크로 플레이트의 바닥부에 적하하고, 냉풍을 직접 쏘이는 방법 (실온, 2시간) 또는 데시케이터 중에 실리카 겔과 함께 정치시키는 방법 (실온, 2일간) 으로 건조시키고, 복합체를 세포배양 표면에 도포한 세포배양기구를 제조하였다. 세포배양기구의 웰에 염화나트륨에 의하여 생체와 등장으로 조정한 0.01M 인산 완충액 (PBS) 100㎕ 를 첨가하고 즉시 가볍게 피펫팅하여 액을 채취하였다. 또한, 세포배양기구의 웰에 염화나트륨에 의하여 생체와 등장으로 조정한 0.01M 인산 완충액 100㎕ 를 첨가하고, 37℃ 에서 하룻밤 정치시킨 후, 가볍게 피펫팅하여 액을 채취하였다. 수득된 액 10㎕ 에 PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent (Molecular Probes) 2㎕ 를 첨가하여 플라스미드 DNA 를 염색하고, 세포배양기구 표면에서 유리시킨 복합체를 형광 현미경으로 관찰하였다. 수득된 형광 현미경 이미지를 도 19 에 나타내었다. 채취한 모든 액에서 100㎛ 이하의 장경을 갖는 복합체가 확인되었다. 이것은 PBS 에 노출시킴으로써, 세포배양기구 표면에서 복합체가 유리됨을 나타내고 있다. 유리된 복합 체의 형상은 건조방법, PBS 로의 노출의 상태에 상관없이, 세포배양기구 표면에 도포하기 전과 변화가 없었다. 이 결과는 건조방법에 의존하지 않고 복합체가 형상을 유지한 상태에서 세포배양기구 표면에서 유지되었음을 나타내고 있으며, 또한 일반적으로 세포배양에 사용되는 37℃ 라는 온도조건에 있어서도 복합체의 형상이 변화되지 않음을 나타내고 있다.
실시예 14
복합체를 도포한 세포배양기구에 의한 유전자 도입
6 웰 세포배양 플레이트에 실시예 10 에서 제조한 pCMV-EGFP 를 함유한 겔 형상 제제 10-1, 10-4, 10-7 을 300㎕ 첨가하고, 냉풍을 쏘이는 방법으로 건조시켜 pCMV-EGFP 를 함유한 복합체가 도포된 세포배양기구를 제조하였다. 대조군으로서 100㎍/㎖ 의 pCMV-EGFP 를 함유하는 수용액 300㎕ 를 플레이트 위에 첨가하고 동일하게 건조시켰다. 각 웰에 293 세포 7.5×104 개를 접종하고, 10% FBS 를 함유하는 DMEM 배지를 첨가하여 37℃ 에서 배양하였다. 배양 개시후 4, 5 일 간격으로 배지를 신선한 배지로 교환하였다. 세포접종 11일후, 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 GFP 를 발현시키고 있는 세포수를 계측하고 도입 효율을 산출하였다.
동일하게, 6 웰 세포배양 플레이트에 실시예 10 에서 제조한 pCMV-HST-1-IL-2 를 함유한 겔 형상 제제 10-13∼22, 24 를 300㎕ 또는 500㎕ 첨가하고, 냉풍을 쏘이는 방법으로 건조시켜 pCMV-HST-1-IL-2 를 함유한 복합체가 도포된 세포배양기 구를 제조하였다. 대조군으로서 100㎍/㎖ 의 pCMV-HST-1-IL-2 를 함유하는 수용액, PB 액, PBS 액 300㎕ 또는 500㎕ 를 플레이트 위에 첨가하고 동일하게 건조시켰다.
1) 293 세포로의 플라스미드 DNA 의 도입
겔 형상 제제 300㎕ 를 도포한 각 웰에 293 세포 7.5×104 개를 접종하고, 10-13∼19 에 대해서는 10% FBS 를 함유하는 DMEM 배지를 첨가하여 37℃ 에서 배양하였다. 세포 접종후 8일후에 배지를 교환하고, 11일후 배지를 채취하여 배지중의 IL-2 농도를 ELISA 로 측정하였다(Quamtikine human IL-2(R&D Systems)). 10-20∼22 에 대해서는 DMEM 배지를 첨가하여 37℃ 에서 하룻밤 배양하고, 다음날 배지를 10% FBS 를 함유하는 DMEM 배지로 교환하여 37℃ 에서 배양하였다. 세포접종 8일후, 11일후에 배지를 교환하고, 15일후 배지를 채취하여 배지중의 IL-2 농도를 ELISA 로 측정하였다. 또한, 10-20, 21, 24 에 대해서는 10% FBS 를 함유하는 DMEM 배지를 첨가하여 37℃ 에서 배양하였다. 세포접종 8일후에 배지를 채취하여 배지중의 IL-2 농도를 ELISA 로 측정하였다.
2) NIH3T3 세포로의 플라스미드 DNA 의 도입
10-14∼17 을 500㎕ 도포한 웰에 NIH3T3 세포 5×104 개를 접종하고, 10% FBS 를 함유하는 DMEM 배지를 첨가하여 37℃ 에서 배양하였다. 세포접종 8일후에 배지를 채취하여 배지중의 IL-2 농도를 ELISA 로 측정하였다.
상기 1) 및 2) 에서 수득된 결과를 표 8 과 표 9 에 정리하였다. pCMV- EGFP, pCMV-HST-1-IL-2 모두에 콜라겐과 복합체를 형성하여 세포배양기구에 도포함으로써 유전자를 효율적으로 293 세포 및 NIH3T3 세포에 도입할 수 있었다. 이 결과는 본 발명의 복합체에 의한 유전자 도입촉진 효과가 플라스미드 DNA 의 종류, 세포종 및 배양액 중의 혈청의 유무에 의존하지 않음을 나타내고 있다. 또한, 플라스미드 DNA 의 경우, 콜라겐 1 분자당의 뉴클레오티드 단량체수가 1112 이하에서 복합체 평균입자경이 151㎛ 이하인 복합체를 도포한 경우, 우수한 도입 효율 및 유전자 발현이 확인되었다.
샘플명 콜라겐 1분자당 뉴클레오티드 단량체수 복합체 평균장경(㎛) 도입 효율
대조예 / / 0.0028
10-1 2406 9.1 0.0760
10-4 299 53 0.0729
10-7 66 303 0.0374
샘플명 세포종 용매 FBS 첨가 유무 콜라겐 1분자당 뉴클레오티드 단량체수 복합체 평균장경 (㎛) 배지중 IL-2 농도(pg/㎖)
대조예 293 물 유 / / 5.3
10-13 293 물 유 4228 6 7.3
10-14 293 물 유 1122 20 14.8
10-15 293 물 유 426 6.1 19.3
10-16 293 물 유 324 20 6.3
10-17 293 물 유 360 16 18.2
10-18 293 물 유 95 151 8.4
10-19 293 물 유 66 256 5.3
대조예 293 PB 무 / / 23.55
10-20 293 PB 무 701 6.1 72.93
10-21 293 PB 무 262 20 264.61
10-22 293 PB 무 97 25 86.22
대조예 293 PB 유 / / 3.35
10-20 293 PB 유 701 6.1 21.01
10-21 293 PB 유 262 20 86.68
대조예 293 PBS 유 / / 1.07
10-23 293 PBS 유 315 9.8 15.26
대조예 NIH3T3 물 유 / / 0
10-14 NIH3T3 물 유 1122 20 0.79
10-15 NIH3T3 물 유 426 6.1 6.06
10-16 NIH3T3 물 유 324 20 4.05
10-17 NIH3T3 물 유 360 16 2.78
실시예 15
복합체 첨가에 의한 세포로의 유전자 도입
6 웰의 세포배양 플레이트에 293 세포 5×104 개를 접종하고, 10% FBS 를 함유하는 DMEM 배지 존재하 37℃ 에서 배양하였다. 접종 3일후 실시예 10 에서 제조한 pCMV-EGFP 를 함유한 겔 형상 제제 10-1, 10-4, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 과 대조로서 100㎍/㎖ 의 pCMV-EGFP 를 함유하는 물 또는 PB 용액을 각각 300㎕ 첨가하고, 10% FBS 를 함유하는 DMEM 배지 존재하 37℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 신선한 배지로 교환하고, 10-1, 10-4, 10-7 에 대해서는 13일간, 10-8, 10-9, 10-10 에 대해서는 5일간 배양후, 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 GFP 를 발현시키고 있는 세포수를 계측하였다.
동일하게, 6 웰 세포배양 플레이트에 293 세포 7.5×104 개를 접종하고, 10% FBS 를 함유하는 DMEM 배지 존재하 37℃ 에서 배양하였다. 접종 2일후 실시예 10 에서 제조한 pCMV-HST-1-IL-2 를 함유한 겔 형상 제제 10-20, 10-21 과 대조로서 100㎍/㎖ 의 pCMV-HST-1-IL-2 를 함유하는 PB 용액을 각각 300㎕ 첨가하고, 10% FBS 를 함유하는 DMEM 배지 존재하 37℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 신선한 배지로 교환하고 5일간 배양후, 배지를 채취하여 배지중의 IL-2 농도를 ELISA 로 측정하였다(Quamtikine human IL-2(R&D Systems)).
수득된 결과를 표 10, 11, 12 에 요약하였다. pCMV-EGFP, pCMV-HST-1-IL-2 모두 콜라겐과 복합체를 형성하여 세포에 첨가함으로써 유전자를 효율적으로 세포에 도입할 수 있었다. 본 실시예와 같이 복합체의 평균장경이 53㎛ 이하인 경우, 콜라겐 1분자당의 뉴클레오티드 단량체수가 2406 이하, 나아가서는 701 이하인 복합체를 세포에 첨가한 경우, 우수한 도입 효율 및 유전자 발현이 확인되었다.
샘플명 용매 콜라겐 1분자당 뉴클레오티드 단량체수 복합체 평균장경(㎛) 도입 효율
대조예 물 / / 0.0012
10-1 물 2406 9.1 0.0231
10-4 물 299 53 0.0247
10-7 물 66 303 0.0041
샘플명 용매 콜라겐 1분자당 뉴클레오티드 단량체수 복합체 평균장경(㎛) EGFP 발현 세포수
대조예 PB / / 100
10-8 PB 448 〈3.4 128
10-9 PB 152 7.7 1200
10-10 PB 97 22 12000
샘플명 용매 콜라겐 1분자당 뉴클레오티드 단량체수 복합체 평균장경(㎛) 배지중 IL-2 농도(pg/㎖)
대조예 PB / / 0
10-20 PB 701 6.1 8.98
10-21 PB 262 20 76.81
10-22 PB 97 25 120.74
본 발명의 복합체는 원하는 핵산을 콜라겐 또는 콜라겐 유도체와 복합체화하여 보호, 안정화시키고, 2) 체내에 투여함으로써 원하는 핵산을 효율적으로 세포에 도입할 수 있으며, 3) 특별한 유전자 도입 시약을 사용하지 않고도 핵산의 발현 및 억제가 가능하다. 또한, 1) DNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 바이러스 벡터를 보호, 안정화시키고, 2) 플레이트 위에 도포하고, 건조시킨 상태에서 장기간 보존이 가능하며, 3) 그 위에 세포를 파종함으로써 특별한 유전자 도입 시약을 사용하지 않고도 유전자의 발현이 가능하고, 4) 그 대상이 되는 핵산의 종류 및 고정화되는 형태를 선택하지 않고, 또한 5) 플라스미드 DNA 를 이용한 경우, 발현 기간이 매우 연장된다는 특성에서, 다양한 응용이 가능하다.
본 발명에 의하면, 세포의 증식, 세포의 형태 또는 사이토카인이나 리셉터의 발현량 등을 측정함으로써 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의하여 발현이 억제된 유전자 또는 단백질의 기능을 용이하게 해명할 수 있다. 게다가, 콜라겐과 복합체를 형성시켜 플레이트 위에 도포 가능함은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 한정되지 않고, 리보자임의 경우에는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 동일한 스크리닝이 가능하며, 또한 플라스미드 DNA 또는 아데노바이러스의 경우에는 특정 유전자의 발현에 의한 세포의 변화를 측정하여 유전자 또는 단백질의 기능을 해석할 수 있게 된다. 특히 본 복합체를 구성하고 있는 콜라겐 또는 콜라겐 유도체는 세포에 장해를 주지 않는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명의 복합체를 이용한 스크리닝에서는 일반적인 유전자 도입제를 이용하였을 때에 발생하는 비특이적인 세포에 대한 영향을 최대한 배제한 유전자 기능의 해석을 실시할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited et al. <120> A Process for Facilitating The Gene Transfection <130> 663264 <150> JP 2001-186320 <151> 2001-06-20 <150> JP 2001-278293 <151> 2001-09-13 <160> 8 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense oligomer <400> 1 ctcgtaggcg ttgtagttgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: phosphorothioate antisense oligomer <400> 2 ctcgtaggcg ttgtagttgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: phosphorothioate sense oligomer <400> 3 gagcatccgc aacatcaaca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: phosphorothioate scramble oligomer <400> 4 agtcgcatgc acacaacaca 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: phosphorothioate random oligomer <400> 5 gaccatcgtc gattccagt 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: phosphorothioate random oligomer <400> 6 catgaacatc ctgagcatcc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: phosphorothioate random oligomer <400> 7 gttcacgaag aaagaaggct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: phosphorothioate antisense oligomer <400> 8 ctcgtaggcg ttgtagttgt 20

Claims (27)

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  9. 아텔로콜라겐과 원하는 핵산을 포함하는 복합체 입자로서, 핵산이 1 본쇄 또는 2 본쇄이고, 입자의 장경이 100㎛ 이하인 복합체 입자.
  10. 제 9 항에 있어서, 장경이 300㎚∼100㎛ 인 복합체 입자.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 원하는 핵산이 플라스미드 DNA 인 복합체 입자.
  12. 제 11 항에 있어서, 이 복합체에 있어서의 아텔로콜라겐 분자수와 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 단량체수의 비가 1:96∼1:1122인 복합체 입자.
  13. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 원하는 핵산이 올리고뉴클레오티드인 복합체 입자.
  14. 제 13 항에 있어서, 이 복합체에 있어서의 콜라겐 또는 콜라겐 유도체 분자수와 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단량체수의 비가 1:1∼1:200 인 복합체 입자.
  15. 염을 함유하지 않는 수성용매 중, 아텔로콜라겐의 최종농도가 0.02% 이하로 되도록, 아테로콜라겐과 원하는 1 본쇄 또는 2 본쇄 핵산을 혼합하는 것을 특징으로 하는, 제 9 항 또는 제 10 항에 기재된 복합체 입자를 제조하는 방법.
  16. 제 9 항 또는 제 10 항에 기재된 복합체 입자가 표면에 도포되어 있는 의료용구.
  17. 제 9 항 또는 제 10 항에 기재된 복합체 입자가 세포 배양면에 도포되어 있는 세포배양기구.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 표적세포에 있어서의 유전자 또는 단백질의 기능을 조사하는 방법으로서, 이 유전자 또는 이 단백질을 코딩하는 핵산 또는 이 유전자 또는 이 단백질의 발현을 세포내에서 저해하는 핵산을 함유하는 제 9 항 또는 제 10 항에 기재된 복합체 입자를 고상 표면에 도포하고, 그 고상 표면 위에서 이 표적세포를 배양하고, 이 표적세포에 있어서의 이 핵산의 발현 레벨 또는 이 유전자 또는 이 단백질의 발현 레벨, 또는 세포의 증식률 또는 표현형을 조사하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 삭제
  22. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 원하는 핵산이 DNA 또는 RNA 인 복합체 입자.
  23. 제 13 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 5 중체 이상 100 중체 이하인 복합체 입자.
  24. 제 13 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 5 중체 이상 30 중체 이하인 복합체 입자.
  25. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 복합체가 정전적 복합체인 복합체 입자.
  26. 제 9 항 또는 제 10 항의 복합체를 함유하는, 원하는 핵산의 도입촉진제.
  27. 인산을 0.001M 이상 0.1M 이하 함유하는 용액 중에, 아텔로콜라겐과 원하는 1 본쇄 또는 2 본쇄 핵산을 혼합하는 것을 특징으로 하는, 제 9 항 또는 제 10 항의 복합체 입자의 제조 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5118285B2 (ja) * 2000-06-20 2013-01-16 大日本住友製薬株式会社 オリゴヌクレオチド導入製剤
DK1407787T3 (da) 2001-06-20 2009-06-02 Dainippon Sumitomo Pharma Co Fremgangsmåde til fremme af nukleinsyreoverförsel
US20080318319A1 (en) * 2003-12-19 2008-12-25 Yoshiko Minakuchi Novel Method of Nucleic Acid Transfer
US20080038824A1 (en) * 2004-01-29 2008-02-14 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Composition and Method for Elevating Gene Transfer Efficiency
JP2007267602A (ja) * 2004-06-25 2007-10-18 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 固相上で細胞に核酸を導入し、かつ、この細胞を分化誘導させるための方法および組成物
JP4585242B2 (ja) * 2004-06-29 2010-11-24 株式会社高研 核酸導入用セルトランスフェクションアレイ
US20090062184A1 (en) * 2005-03-24 2009-03-05 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Fine particulate preparation comprising complex of nucleic acid molecule and collagen
US7838502B2 (en) * 2005-05-06 2010-11-23 University Of Massachusetts Medical School Compositions and methods to modulate H. influenzae pathogenesis
WO2006126600A1 (ja) * 2005-05-25 2006-11-30 National University Corporation Nagoya Universtiy 血管閉塞性疾患用医薬組成物
WO2007010620A1 (ja) 2005-07-22 2007-01-25 Koken Co., Ltd. 核酸導入用セルトランスフェクションアレイ
WO2007107774A2 (en) * 2006-03-22 2007-09-27 Cartela R & D Ab Integrin alpha-10 subunit as therapeutic target and diagnostic/prognostic marker for cancer
WO2008099906A1 (ja) * 2007-02-16 2008-08-21 Anges Mg, Inc. 歯周病、及び外科手術による歯槽骨欠損の治療剤
JP5789927B2 (ja) * 2010-07-30 2015-10-07 Jnc株式会社 放射線照射コラーゲン様ペプチドを用いた核酸導入法
WO2013102878A2 (en) 2012-01-05 2013-07-11 Department Of Biotechnology (Dbt) Fat1 gene in cancer and inflammation
WO2021041870A1 (en) * 2019-08-30 2021-03-04 University Of Florida Research Foundation Aptamer assemblies for protein crosslinking
WO2022120338A1 (en) * 2020-12-03 2022-06-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Aptamer assemblies for protein crosslinking

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5115094B2 (ko) * 1972-11-01 1976-05-14
JPH0712375B2 (ja) * 1986-11-17 1995-02-15 株式会社高研 移植組成物及びその製造方法
US5069936A (en) * 1987-06-25 1991-12-03 Yen Richard C K Manufacturing protein microspheres
JPS6416581A (en) 1987-07-09 1989-01-20 Rikagaku Kenkyusho Frozen animal cell and production thereof
JPH01157388A (ja) 1987-12-11 1989-06-20 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 形質転換方法
US5078997A (en) * 1988-07-13 1992-01-07 Cetus Corporation Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers
US5098890A (en) * 1988-11-07 1992-03-24 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Antisence oligonucleotides to c-myb proto-oncogene and uses thereof
US5936035A (en) 1988-11-21 1999-08-10 Cohesion Technologies, Inc. Biocompatible adhesive compositions
US5614587A (en) * 1988-11-21 1997-03-25 Collagen Corporation Collagen-based bioadhesive compositions
JP3187410B2 (ja) 1989-08-10 2001-07-11 住友製薬株式会社 脳内投与用徐放性製剤
JP2789115B2 (ja) 1989-09-07 1998-08-20 株式会社高研 可溶性コラーゲンパウダーを担体とする粒状医薬徐放剤の製造方法
DE69031172T2 (de) 1989-12-22 1998-03-12 Applied Research Systems Modifikation der endogenen genexpression mit hilfe eines regulatorischen elements mittels homologe rekombination
US5542935A (en) * 1989-12-22 1996-08-06 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic delivery systems related applications
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
JP2666535B2 (ja) 1990-08-07 1997-10-22 東洋紡績株式会社 大腸菌のコンピテントセル化緩衝液および大腸菌のコンピテントセル化方法
FR2694895B1 (fr) * 1992-08-20 1994-11-10 Coletica Procédé de fabrication de microparticules en émulsion par modification de la composition chimique de la phase dispersée après émulsification.
US5646042A (en) * 1992-08-26 1997-07-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. C-myb targeted ribozymes
NZ267291A (en) * 1993-05-28 1997-09-22 Chiron Corp Peptide inhibitors of urokinase receptor activity
AU7655194A (en) * 1993-09-09 1995-03-27 Schering Aktiengesellschaft Active principles and gas containing microparticles
CA2140053C (en) * 1994-02-09 2000-04-04 Joel S. Rosenblatt Collagen-based injectable drug delivery system and its use
US5942496A (en) 1994-02-18 1999-08-24 The Regent Of The University Of Michigan Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells
US5583034A (en) * 1994-02-22 1996-12-10 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Enhancement of adoptosis using antisense oligonucleotides
US5844107A (en) * 1994-03-23 1998-12-01 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
US5563255A (en) * 1994-05-31 1996-10-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
EP0769063A1 (en) * 1994-06-27 1997-04-23 The Johns Hopkins University Targeted gene delivery system
NO180167C (no) * 1994-09-08 1997-02-26 Photocure As Fotokjemisk fremgangsmåte til å innföre molekyler i cellers cytosol
GB9422495D0 (en) 1994-11-08 1995-01-04 Medical Res Council DNA transfer method
JP3867160B2 (ja) 1995-07-03 2007-01-10 大日本住友製薬株式会社 遺伝子製剤
IL122802A0 (en) 1995-07-03 1998-08-16 Koken Kk Gene preparations
US6998268B2 (en) * 1995-07-03 2006-02-14 Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd. Gene preparations
NZ320006A (en) 1995-10-23 2001-12-21 Meditech Res Ltd An adjuvant composition comprising hyaluronic acid for gene therapy either in the sense or antisense direction
DE69636122T2 (de) 1995-11-13 2006-12-07 Takara Bio Inc., Otsu Verfahren zum gentransfer in zielzellen mit einem retrovirus
ES2420106T3 (es) * 1995-12-18 2013-08-22 Angiodevice International Gmbh Composiciones de polímeros reticulados y métodos para su uso
CA2248538A1 (en) * 1996-03-14 1997-09-18 The Immune Response Corporation Targeted delivery of genes encoding interferon
US5874006A (en) * 1996-10-31 1999-02-23 Matrix Pharmaceutical, Inc. Aseptic collagen concentration process
US6042820A (en) * 1996-12-20 2000-03-28 Connaught Laboratories Limited Biodegradable copolymer containing α-hydroxy acid and α-amino acid units
US6218112B1 (en) * 1996-12-23 2001-04-17 Cobra Therapeutics Limited Optimization of gene delivery and gene delivery system
US6524613B1 (en) * 1997-04-30 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Hepatocellular chimeraplasty
IT1293088B1 (it) 1997-07-10 1999-02-11 Isi Ist Sierovaccinogeno Ital Microparticelle per il rilascio controllato di molecole biologicamente attive e loro uso in terapia, profilassi e diagnostica in vitro e in
JPH11127843A (ja) 1997-10-27 1999-05-18 Sumitomo Bakelite Co Ltd 培養用着色容器
TW572758B (en) 1997-12-22 2004-01-21 Sumitomo Pharma Type 2 helper T cell-selective immune response inhibitors comprising purine derivatives
AU2868099A (en) * 1998-02-13 1999-08-30 Selective Genetics, Inc. Concurrent flow mixing methods and apparatuses for the preparation of gene therapy vectors and compositions prepared thereby
EP1078639A4 (en) 1998-05-22 2004-10-06 Sumitomo Pharma STABLE GENERATION
JP3587438B2 (ja) 1999-01-14 2004-11-10 住友ベークライト株式会社 培養細胞凍結用マルチウェルプレート
JP3557924B2 (ja) * 1998-12-10 2004-08-25 トヨタ自動車株式会社 電動機制御装置及び電動機制御方法
TR199901199A3 (tr) 1999-05-31 2001-09-21 Kocagoez Tanil Bakteri transformasyon kiti
JP2001199903A (ja) 1999-11-09 2001-07-24 Eizo Mori 核酸含有複合体
EP1274410A2 (en) * 2000-03-31 2003-01-15 Trustees Of Boston University Use of locally applied dna fragments
JP2001335512A (ja) 2000-05-23 2001-12-04 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd 遺伝子導入のための微粒子
JP5118285B2 (ja) * 2000-06-20 2013-01-16 大日本住友製薬株式会社 オリゴヌクレオチド導入製剤
JP2002325572A (ja) * 2000-12-25 2002-11-12 Univ Osaka 外来物質の導入方法
DK1407787T3 (da) 2001-06-20 2009-06-02 Dainippon Sumitomo Pharma Co Fremgangsmåde til fremme af nukleinsyreoverförsel
JP4022614B2 (ja) 2002-03-25 2007-12-19 国立大学法人大阪大学 新規なバイオビーズの作製方法
ITMI20021444A1 (it) 2002-07-01 2004-01-02 Danieli Off Mecc Tubo forma spire
US7148342B2 (en) * 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
US20060030534A1 (en) * 2002-09-04 2006-02-09 Gabriele Dorn Treatment of neurological disorders by dsrna administration
JPWO2004026343A1 (ja) * 2002-09-20 2006-01-12 住友製薬株式会社 部位特異的遺伝子変換促進剤および遺伝子疾患治療剤
WO2004042024A2 (en) * 2002-11-01 2004-05-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS FOR siRNA INHIBITION OF HIF-1 ALPHA
ATE477337T1 (de) * 2003-01-16 2010-08-15 Univ Pennsylvania Zusammensetzungen und verfahren zur sirna-hemmung von icam-1
US8227434B1 (en) * 2003-11-04 2012-07-24 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Inc. Materials and methods for treating oncological disorders
JP4989456B2 (ja) * 2004-02-26 2012-08-01 ベイラー リサーチ インスティテュート 関節炎の全身処置のための組成物および方法
NZ553987A (en) * 2004-09-28 2011-01-28 Quark Pharmaceuticals Inc Oligoribonucleotides and methods of use thereof for treatment of alopecia, acute renal failure and other diseases
CA2584459A1 (en) * 2004-10-22 2006-04-27 Universite Laval Modulation of neuroglia-derived bdnf in the treatment and prevention of pain
US7585848B2 (en) * 2005-01-11 2009-09-08 Rush University Medical Center Methods and compositions for treating, inhibiting and reversing disorders of the intervertebral disc
WO2007082899A1 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Vib Vzw Inhibitors of prolyl-hydroxylase 1 for the treatment of skeletal muscle degeneration
US8106024B2 (en) * 2006-06-16 2012-01-31 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Method of treating cancer with an RPN2 gene expression inhibitor
CN101490253A (zh) * 2006-07-21 2009-07-22 赛伦斯治疗公司 用于抑制蛋白激酶3表达的方法
WO2008028085A2 (en) * 2006-08-30 2008-03-06 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Modulation of mlck-l expression and uses thereof
US7902167B2 (en) * 2006-10-02 2011-03-08 Aprea Ab Compounds and methods for down-regulating Wrap53 protein by RNA interference
US7812002B2 (en) * 2007-03-21 2010-10-12 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotide inhibitors of NRF2 and methods of use thereof for treatment of cancer
CA2782728A1 (en) * 2009-12-04 2011-06-09 Opko Ophthalmics, Llc Compositions and methods for inhibition of vegf

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nature Medicine, Vol. 5, No. 6, pp. 707-710(1999. 06)*

Also Published As

Publication number Publication date
US20040266004A1 (en) 2004-12-30
CN1313158C (zh) 2007-05-02
DE60232149D1 (de) 2009-06-10
PT1407787E (pt) 2009-07-07
EP1407787A4 (en) 2006-02-08
CA2451603A1 (en) 2003-01-03
JPWO2003000297A1 (ja) 2005-04-07
ATE429930T1 (de) 2009-05-15
DK1407787T3 (da) 2009-06-02
EP1407787B1 (en) 2009-04-29
CN1622831A (zh) 2005-06-01
EP1407787A1 (en) 2004-04-14
ES2324525T3 (es) 2009-08-10
US8742091B2 (en) 2014-06-03
CA2451603C (en) 2012-07-10
US20100081202A1 (en) 2010-04-01
JP4081436B2 (ja) 2008-04-23
WO2003000297A1 (fr) 2003-01-03
KR20040023622A (ko) 2004-03-18

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