JPWO2004026343A1 - 部位特異的遺伝子変換促進剤および遺伝子疾患治療剤 - Google Patents

Abstract

オリゴヌクレオチドを細胞内に効率的に導入して核内での局在化を促進する製剤、目的とするゲノム遺伝子の塩基配列の変換を促進する製剤および遺伝子疾患治療剤を提供する。少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含んでなる部位特異的遺伝子変換促進剤、少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含んでなる部位特異的遺伝子疾患治療剤、細胞の核内においてゲノム遺伝子上の特定の塩基を任意に変換する方法であって、前記遺伝子変換促進剤を当該細胞に接触させることを含む方法、および少なくともコラーゲンとオリゴヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドの核内局在化促進剤。

Description

本発明は、コラーゲンの新しい用途に関するものであり、詳しくは、コラーゲンとオリゴヌクレオチドを含有する、ゲノム遺伝子の部位特異的遺伝子変換促進剤等に関する。

遺伝子治療は、遺伝子の変異または欠失により発症する遺伝子疾患を根本的に治療する方法として大きな期待が寄せられている。一般に、遺伝子治療ではウイルスベクター、リポソームベクターまたはプラスミドＤＮＡベクター等を用いて細胞に治療に必要なタンパク質をコードした遺伝子を導入し、細胞のゲノム遺伝子に組み込む手法、あるいはゲノム遺伝子と共存させてタンパク質を発現させる手法が試みられているが、満足な治療効果が得られる例は少ない。この原因は、１）タンパク質全体をコードする大きなサイズの遺伝子をウイルスベクターあるいはプラスミドＤＮＡに組み込んで発現させるのは困難であること、２）導入する遺伝子をゲノム遺伝子に組み込まないアデノウイルスベクターやプラスミドＤＮＡベクターを用いた場合には、安定した長期間の発現が得られないこと、３）レトロウイルスベクターは導入する遺伝子をゲノム遺伝子の不特定な位置に組み込むため、却って正常遺伝子の機能を喪失させる可能性があること、４）ウイルスベクターを用いた場合、ウイルスに由来するタンパク質が産生され、このタンパク質に対する免疫反応が惹起されて副作用が生じること、５）更にプロモーターは細胞の特異性が高いため、遺伝子を発現できる細胞が限られることによると考えられている（Ｌｉ−Ｗｅｎ Ｌａｉら、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ」１９９９第７巻，ｐ．１１−１４）。
一方、遺伝子疾患では必要とされるタンパク質の遺伝子すべてが完全に欠失していることは稀で、多くの場合には遺伝子上の僅か一塩基が誤っているために異なるアミノ酸に置換されたり、一塩基が欠失あるいは挿入されているためにフレームシフトが生じて正常なタンパク質が産生されないことが原因となっている。
例えば、家族性アミロイドポリニューロパチー（Ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄｏｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ＦＡＰ）は、遺伝子変異を起こしたトランスサイレチン（Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ：ＴＴＲ）、アポリポ蛋白ＡＩ、ゲルソリンを前駆蛋白とし、種々の臓器・組織にアミロイド沈着をきたす全身性アミロイドーシスの１つである。そのうち、１２７個のアミノ酸から構成されるＴＴＲの３０番目のバリンがメチオニンへ変異した異型ＴＴＲがアミロイドとなり臓器障害がおこるＦＡＰ ｔｙｐｅＩ（ＦＡＰ ＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔ）は、四肢の感覚障害や運動神経障害を伴う多発神経炎、立ちくらみ、発汗、涙液分泌低下などの自律神経障害、下痢や便秘などの消化器症状、心、腎、眼などの臓器障害などを主症状とする常染色体優性遺伝を呈する遺伝性アミロイドーシスである。本症は２０〜３０代で発症し、約１０年の経過で死の転帰をとる予後不良の疾患である（Ｂｅｎｓｏｎら、「Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ」１９８９第１２巻，ｐ．８８−９２）。
ＦＡＰの原因蛋白であるＴＴＲが主に肝臓で産生されることから、ＦＡＰの治療として肝移植が行われるようになった。肝移植によりＦＡＰの症状の進行が停止し、一部の自律神経症状の改善を認めることから、肝臓での異型ＴＴＲの産生を抑制することは、ＦＡＰの有効な治療法であることが明らかになった。しかしながら、肝移植をすべての患者に適応することは様々な理由から不可能である。しかも、網膜での異型ＴＴＲの産生は抑制されないため、肝移植後も眼病変が進行するという問題点もある。そこで、これに代わる治療法として、肝臓、網膜での異型ＴＴＲの産生を抑制する遺伝子治療の確立が不可欠であると考えられる。
他方、ヒトゲノムプロジェクトによってヒトの全遺伝子配列が解読されるようになり、個体間で多くの一塩基変異があることが見出され、更にこの一塩基変異が疾病の罹患率や薬剤の感受性に大きく影響することが明らかになりつつある。従って遺伝子治療を実用化するには、ゲノム遺伝子上の特定の一塩基変異を修正する技術の確立が必要である。
１９９６年、Ｋｍｉｅｃらによって特定の塩基を変異する画期的な方法が発表された（Ｋｍｉｅｃら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９９６第２７３巻，ｐ．１３８６−１３８９）。ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドを用いるこの方法は、変異させたい遺伝子の領域と二重鎖を形成するオリゴヌクレオチドを細胞内に導入してゲノム遺伝子と相同組換えを生じさせることでゲノム遺伝子を変異させる方法であり、リンパ芽球細胞にオリゴヌクレオチドを導入して遺伝子疾患である鎌状細胞貧血の原因遺伝子であるβ−グロビンの遺伝子を変異させた。この報告以降、オリゴヌクレオチドを用いて種々の細胞内で特定の塩基を標的とした遺伝子変異が行えることが実証された。更にｉｎ ｖｉｖｏにおいては、Ｋｒｅｎらがラットの肝臓内で第９因子の遺伝子を変異させて血友病を治療できる可能性を示した（Ｋｒｅｎら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」１９９８第４巻，ｐ．２８５−２９０）のに続いて、Ｃｌｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ症候群（Ｋｒｅｎら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ」１９９９第９６巻，ｐ．１０３４９−１０３５４）、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーの治療に使用できる可能性が示されるに至っている。
また、最近ＤＮＡオリゴマーでもＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドと同様にゲノム遺伝子の特定の塩基を変異できることが、細胞の抽出液中（Ｇａｍｐｅｒら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」２０００第２８巻，ｐ．４３３２−４３３９）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｍｉｃｈａｅｌら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」２００１第２９巻，ｐ．４２３８−４２５０）で示され、遺伝子治療への活用が期待されている。
しかしながら、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドを単独で用いて相同組換えを行うこの方法は、再現性がなく、これら論文に報告されているような高い効率で相同組換えを行うことができないことは当該領域の研究者の共通の認識である。実際、Ｋｍｉｅｃらの論文を最初に掲載したＳｃｉｅｎｃｅ誌は、彼らが発表した論文の追跡調査を実施し、論文の内容が再現されないことを確認したとの記事を掲載した。また、その記事の中で最近のＫｍｉｅｃらの研究によれば、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドを単独で用いた場合の相同組換え効率は、０．０００２％〜０．００５％、ＤＮＡオリゴマーを単独で用いた場合の相同組換え効率は、０．０１６％〜０．０２％程度であることを明らかにしている（Ｔａｕｂｅｓ、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２００２第２９８巻，ｐ．２１１６−２１２０）。従って、これらオリゴヌクレオチドを用いて効率的に相同組換えを行う促進システムの開発が求められている。
一方、オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子治療を臨床的に実用化する上で最も大きな課題は、生体内の細胞へのオリゴヌクレオチドの送達方法である。実際、これまで行われたすべての研究では、エレクトロポレーション、ジーンガン、リポソーム、ポリカチオンなどの送達技術を用いたオリゴヌクレオチドの細胞内導入方法は、毒性や利便性などの問題があり臨床研究に供されたものはない。特に多くのリポソーム及びカチオン性ポリマーは、オリゴマーと混合した状態で長期間保存することが困難な上、調製時の手技に導入効率が大きく依存することはこの分野の研究者には良く知られた事実である。従って、オリゴヌクレオチドを安定かつ効率的に細胞内に導入してゲノム遺伝子を変換できると共に、安全で利便性の高い送達システムの開発が求められている。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達方法では、標的となるメッセンジャーＲＮＡが主として細胞質に存在することから、オリゴヌクレオチドを細胞内の特定の部位に局在化することは求められなかった。一方、ゲノム遺伝子の変換を行うには、オリゴヌクレオチドを核内に導入、局在化させて遺伝子変換の効率を高める必要があり、オリゴヌクレオチドを効率的に細胞の核内に局在化させる送達システムの開発が望まれている。

本発明は、オリゴヌクレオチドを細胞内に効率的に導入して核内での局在化を促進する製剤、目的とするゲノム遺伝子の塩基配列の変換を促進する製剤および遺伝子疾患治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）の患者の発症、病態および治療方法に関する研究に長年従事し、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子の点変異によりＴＴＲの３０番目のバリンがメチオニンに変異したＦＡＰタイプＩ（ＦＡＰ ＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔ）の遺伝子治療について鋭意検討した結果、下記要件を満たすことによりＦＡＰを初めとする様々な遺伝子疾患の治療のみならず、インビトロでの部位特異的遺伝子変換にも有効な製剤を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
［１］少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含んでなる部位特異的遺伝子変換促進剤、
［２］少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含んでなる部位特異的遺伝子疾患治療剤、
前記コラーゲンは水溶性コラーゲンであることが好ましく、前記水溶性コラーゲンはアテロコラーゲンであることが好ましい、
前記遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドが少なくとも２０塩基からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましく、具体的にはＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドであることが好ましい、
前記遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドは、変換する遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖と、１〜３塩基対のミスマッチ対合を含んでワトソン・クリック型塩基対を形成する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであること、あるいは、前記遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドは、変換する遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖と、１〜３塩基の欠失または挿入を含んでワトソン・クリック型塩基対を形成する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることが好ましい、
前記ミスマッチ対合は、オリゴヌクレオチドの中央部に位置すること、あるいは、前記塩基の欠失または挿入は、オリゴヌクレオチドの中央部に位置することが好ましい、
前記促進剤または治療剤は、その剤型が溶液状であることが好ましく、リン酸塩を０．０１Ｍ〜０．１Ｍの範囲で含有すること、ナトリウム塩を０．０７Ｍ〜０．１４Ｍの範囲で含有することが好ましい、
また、前記促進剤または治療剤は、剤型が固形状であることが好ましい、
遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドとコラーゲンは粒子状の会合体であり、粒子状の会合体の長径は３００ｎｍ〜５０μｍであることが好ましい、
溶液状の前記促進剤または治療剤は、コラーゲンを０．０１〜１．０重量％の範囲で含有すること、あるいはコラーゲンを０．０１〜０．２５重量％の範囲で含有することが好ましい、
［３］コラーゲンを、０．０１Ｍ〜０．１Ｍのリン酸塩および０．０７Ｍ〜０．１４Ｍのナトリウム塩を含有する溶液に溶解し、これに同濃度のリン酸塩および同濃度のナトリウム塩を含有する遺伝子変換用のオリゴヌクレオチド溶液を加えて１〜１０℃の温度下で攪拌することにより得られる部位特異的遺伝子変換促進剤または遺伝子治療剤、
［４］細胞の核内においてゲノム遺伝子上の特定の塩基を任意に変換する方法であって、前記遺伝子変換促進剤を当該細胞に接触させることを含む方法、
前記細胞は哺乳動物細胞、酵母または真菌であることが好ましい、
［５］少なくともコラーゲンとオリゴヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドの核内局在化促進剤、
前記核内局在化促進剤は、リン酸塩を０．０１Ｍ〜０．１Ｍの範囲で含有すること、ナトリウム塩を０．０７Ｍ〜０．１４Ｍの範囲で含有することが好ましい、
前記オリゴヌクレオチドとコラーゲンが粒子状の会合体であり、粒子状の会合体の長径が３００ｎｍ〜５０μｍであることが好ましい、
前記核内局在化促進剤は、コラーゲンを０．０１〜１．０重量％の範囲で含有すること、あるいはコラーゲンを０．０５〜０．２５重量％の範囲で含有することが好ましい、
［６］ 少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含む組成物を経口、経鼻、経肺、門脈内、筋肉内、皮下、臓器表面、臓器内または経皮投与することにより生体内の細胞と接触させ、当該細胞の遺伝子を変換する方法、
［７］ 前記［６］記載の方法を用いて遺伝子疾患を治療する方法。

第１図は、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドの構造を示す。
（ａ）ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド、（ｂ）２５ｍｅｒ ＤＮＡオリゴヌクレオチド、（ｃ）４５ｍｅｒ ＤＮＡオリゴヌクレオチド、（ｄ）７４ｍｅｒ ＤＮＡオリゴヌクレオチド。ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分（小文字）は２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡに、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの両端から３塩基（＊）はホスホロチオエートになっており、分解を防いでいる。
第２図は、アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＨｅｐＧ２細胞への取り込みを示す顕微鏡写真（ａ）および（ｂ）と、比較のため、ＨＶＪ−リポソーム封入ＤＮＡオリゴヌクレオチドでの結果を示す顕微鏡写真（ｃ）である。倍率は、すべて１００倍である。
第３図は、アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドの性状を示す顕微鏡写真である。
（ａ）：ＤＮＡオリゴヌクレオチドのみ
（ｂ）：０．０５％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド７４ｍｅｒ
第４図は、アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドによる正常トランスサイレチンの産生を示すトランスジェニックマウス血清中のトランスサイレチンの質量分析結果を示すグラフである。
Ａ：無処置トランスジェニックマウスの血清から抽出したトランスサイレチン
Ｂ：アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドを投与したトランスジェニックマウスの血清から抽出したトランスサイレチン

本発明の第一の態様は、少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含んでなる部位特異的遺伝子変換促進剤に関するものである。
本発明において「コラーゲン」とは、通常、医療分野、化粧品分野、工業分野および食品分野で用いられているあらゆる「コラーゲン」を意味する。コラーゲンは、水溶性または可溶化コラーゲンを用いることが好ましい。水溶性コラーゲンとは、酸性または中性の水や塩溶液に可溶であり、可溶化コラーゲンとは、酵素により可溶化される酵素可溶化コラーゲン、酸により可溶化される酸可溶化コラーゲン、アルカリにより可溶化されるアルカリ可溶化コラーゲンがあり、いずれも孔サイズが１マイクロメートルのメンブレンフィルターを通過できることが好ましい。コラーゲンの水溶性はコラーゲンの架橋度に依存し、架橋度が高いほど不溶化することから、本発明に使用するコラーゲンの架橋度は、例えば、３量体以下であることが好ましく、より好ましくは２量体以下である。コラーゲンの分子量は例えば、約３０万から約９０万が好ましく、約３０万から約６０万がより好ましい。コラーゲンはいかなる動物種から抽出されたものでも用いることが出来るが、好ましくは脊椎動物から抽出されたもの、さらに好ましくは哺乳類、鳥類、魚類から抽出されたもの、より好ましくは変性温度が高い哺乳類、鳥類から抽出されたコラーゲンが望ましい。コラーゲンのタイプもいかなるタイプのコラーゲンでも良いが、動物体内の存在量からＩ〜Ｖ型が好ましい。具体的には例えば、哺乳動物の真皮から酸抽出したＩ型コラーゲンが挙げられ、より好ましくは例えば、仔牛の真皮から酸抽出したＩ型コラーゲン、遺伝子工学的に生産されるＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンなどが挙げられる。また、安全性の面から抗原性の高いテロペプチドを酵素的に除去したアテロコラーゲンあるいは遺伝子工学的に生産されるアテロコラーゲンが望ましい。また、必要に応じて側鎖を修飾したコラーゲン、架橋したコラーゲン等を用いることができる。側鎖を修飾したコラーゲンとしては、例えばサクシニル化またはメチル化したコラーゲン等が挙げられ、架橋したコラーゲンとしては、例えばグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソアナートまたはポリエポキシ化合物等で処理したコラーゲン等を挙げることができる（フレグランス・ジャーナル１９８９−１２，１０４−１０９、特公平７−５９５２２号公報）。
なお、前記コラーゲンには他の生体親和性材料を混合することもできる。生体親和性材料としては、例えばゼラチン、フィブリン、アルブミン、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン、アルギン酸、ペクチン、アガロース、ハイドロキシアパタイト、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサン、またはグリコール酸、乳酸もしくはアミノ酸の重合体もしくはこれらの共重合体、またはこれらの生体親和性材料の２種類以上の混合物等が挙げられる。
本発明における「遺伝子変換用のオリゴヌクレオチド」とは、ゲノム遺伝子を変換させるに足りる長さと塩基配列を有する一本鎖のヌクレオチドである。前記オリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも２０塩基が好ましく、２５〜１００塩基がより好ましく、３０〜７５塩基がさらに好ましい。
前記オリゴヌクレオチドは、遺伝子変換の効率の観点からＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドが好ましく、合成および精製の容易さからＤＮＡオリゴヌクレオチドがより好ましい。
前記オリゴヌクレオチドは、生体内または細胞内でのヌクレアーゼに耐する安定性を高めるため、分子内に１個以上の核酸類似体を有しても良い。核酸類似体とはＤＮＡ鎖あるいはＲＮＡ鎖の酵素による分解を阻害することを目的としてデザインされた類似体である。例えば、リン酸ジエステル結合部位の酸素原子を一つイオウに置換したホスホロチオエート、メチル基に置換したメチルホスホネート、もしくはアミン基に置換したホスホロアミデート、またはリン酸ジエステル結合部位の二つの酸素原子をイオウに置換したホスホロジチオエート、もしくは一つのイオウ原子とメチル基に置換したメチルホスホロチオエート、または糖部分に化学修飾を施した２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ ＲＮＡ、２’−Ｏ−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ ＲＮＡもしくはＬｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（商品名）（ＬＮＡ）等を挙げることができる（バイオクリニカ、１２，１６６−１７０，１９９７、Ｂｉｏｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１，４５０３−４５１０，２００２）。核酸類似体がオリゴヌクレオチドに含まれる数をホスホロチオエート型核酸類似体を代表として表すと、ホスホロチオエート結合の数は、４〜６個程度が好ましい。ホスホロチオエート結合は変異させる塩基から少なくとも３塩基以上離れた位置の両側に導入されることが望ましく、変異させる塩基に近づけると、却って遺伝子の変換効率が低下する傾向がある。より好ましくはオリゴヌクレオチドの両末端部位に２塩基以上連続してあることが望ましい。前記オリゴヌクレオチドは、塩基部分に化学修飾を施したものであってもよい。
前記オリゴヌクレオチドの設計は、変換する遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖と、１〜３塩基対のミスマッチ対合をほぼ中央部に含んでワトソン・クリック型塩基対を形成する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとなるようにすることが好ましい。
すなわち、変換対象のゲノム遺伝子の２０塩基以上の塩基配列を選択し、当該配列の内部に位置する１〜３塩基の塩基配列を所望する塩基配列に置換し、その余の塩基配列をワトソン・クリック型塩基対（即ち、二本鎖）を形成する相補的配列に設計したオリゴヌクレオチドを設計することが好ましい。相補的配列は、ゲノム遺伝子のセンス鎖に対するものであってもアンチセンス鎖に対するものであってもよいが、センス鎖に対するものがより好ましい。このようなオリゴヌクレオチドとゲノム遺伝子とがワトソン・クリック型塩基対を形成すると、当該塩基対合中に１〜３塩基対のミスマッチ対合を含むことになる。遺伝子の変換効率を高めるためには、前記ミスマッチ対合はオリゴヌクレオチドの中央部に位置することがより好ましい。
このような遺伝子変換用オリゴヌクレオチドを用いると、ゲノム遺伝子中の１〜３塩基の変異を部位特異的に修復したり、逆にゲノム遺伝子中に１〜３塩基の変異を部位特異的に導入することができる。前記変異が２塩基または３塩基の場合、当該変異は連続していてもよく、不連続であってもよい。
また、前記遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドの設計は、変換する遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖と、１〜３塩基の欠失または挿入を含んでワトソン・クリック型塩基対を形成する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとなるようにすることが好ましい。
すなわち、変換対象のゲノム遺伝子の２０塩基以上の塩基配列を選択し、当該配列の内部に位置する１〜３塩基の塩基配列を欠失させるようにし、または当該配列の内部に１〜３塩基の塩基配列を挿入するようにし、その余の塩基配列をワトソン・クリック型塩基対（即ち、二本鎖）を形成する相補的配列に設計したオリゴヌクレオチドを設計することが好ましい。相補的配列は、ゲノム遺伝子のセンス鎖に対するものであってもアンチセンス鎖に対するものであってもよいが、センス鎖に対するものがより好ましい。このようなオリゴヌクレオチドとゲノム遺伝子とがワトソン・クリック型塩基対を形成すると、当該塩基対合中に１〜３塩基のループを含むことになる。遺伝子の変換効率を高めるためには、前記ループはオリゴヌクレオチドの中央部に位置することがより好ましい。
このような遺伝子変換用オリゴヌクレオチドを用いると、ゲノム遺伝子中の１〜３塩基の変異を部位特異的に欠失したり、逆にゲノム遺伝子中に１〜３塩基の変異を部位特異的に挿入することができる。前記変異が２塩基または３塩基の場合、当該変異は連続していてもよく、不連続であってもよい。
ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドの設計は、前記条件に加え、例えば図１（ａ）に示すように、センス鎖およびアンチセンス鎖それぞれとワトソン・クリック型塩基対を形成可能な２種の塩基配列部分と、塩基対を形成しない任意の介在配列部分とが連続した塩基配列を選択することができる。ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドの設計方法については、例えば、ＵＳ５，７３１，１８１、ＵＳ５，７５６，３２５に開示されている。
本発明の第二の態様は、少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含んでなる部位特異的遺伝子疾患治療剤に関するものである。
本発明の遺伝子疾患治療剤に含まれるコラーゲンおよび遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドは、前記遺伝子変換促進剤に含まれるコラーゲンおよび遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドと同様である。
本発明の部位特異的遺伝子変換促進剤および遺伝子疾患治療剤（以下、本発明の製剤ともいう）の剤型は、溶液状、懸濁液状、ゲル状、フィルム状、固形状（棒状、粉末状）等のいずれでもよく、用途によって選択される。例えば本発明の部位特異的遺伝子変換促進剤を用いて基材接着性細胞の遺伝子変換を行う場合には、溶液状態あるいは懸濁液状態の製剤を細胞の培養液に添加する方法の他、細胞へのオリゴヌクレオチドの接触を高めるために、基材表面にフィルム状あるいは粉末状の製剤を固定して用いられることが望ましい。また、浮遊細胞の遺伝子変換を行う場合には、溶液状態あるいは懸濁液状態の製剤を用いることが望ましい。剤形選択の重要性は、本発明の遺伝子疾患治療剤を生体に投与して遺伝子疾患の治療を行う場合更に大きくなる。全身の細胞を標的とした治療を行う場合、製剤は血管内に投与できるよう溶液状、懸濁液状が望ましいが、一般に遺伝子治療の分野では、予期し得ない副作用の発現の可能性を極力低減するために、例え正常細胞では遺伝子変換を行わないオリゴヌクレオチドを用いた場合でも、遺伝子変換の必要がない細胞へのオリゴヌクレオチドの導入は好ましくないと考えられている。限定された部位の細胞に対してのみ遺伝子変換を行いたい場合には、局所的な製剤の濃度を高く維持し、かつ周囲への製剤の拡散を抑制できるゲル状、フィルム状、固形状の製剤を用いることが望ましい。また、患者の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明の遺伝子疾患治療剤で処理して所望の遺伝子変換を行い、遺伝子変換された細胞を患者に移植する際に遺伝子疾患治療剤を除去する必要がある場合には、除去の容易さからフィルム状あるいは固形状の剤形が望ましい。
これらの剤型の製造方法は、国際公開第０１／９７８５７号パンフレット（発明の名称：オリゴヌクレオチド導入製剤）に記載されており、本発明においてはいずれの製造方法を用いてもよい。
以下に、溶液状、懸濁液状、ゲル状の本発明の製剤として、好ましい態様について説明する。
本発明の製剤中のオリゴヌクレオチドが遺伝子変異を生じさせる機構は、オリゴヌクレオチドと遺伝子との相同組換え、あるいはオリゴヌクレオチドと遺伝子がハイブリッドを形成することによるミスマッチ修復によると考えられているがいずれかは定かではない。但しいずれの機構にせよ、オリゴヌクレオチドと遺伝子がオリゴヌクレオチドが標的としている部分でハイブリッドを形成する必要がある。通常、細胞が細胞分裂期になく、かつタンパク質を産生していない場合、遺伝子は安定な二重鎖を形成し、かつヒストンと相互作用することで高密度に凝集して核内に存在するため、外来のオリゴヌクレオチドが遺伝子の二重鎖を解離させて標的の遺伝子鎖とハイブリッドを形成することは期待できない。従って、本発明の製剤中のオリゴヌクレオチドが標的の遺伝子鎖とハイブリッドを形成して目的の遺伝子変異を行うには、オリゴヌクレオチドが核内に存在する期間中に細胞分裂に伴う遺伝子の複製、あるいはタンパク質産生に伴う遺伝子の転写のため、遺伝子の二重鎖が解離する必要がある。一般に細胞が外的要因で傷害を受けた場合、細胞のタンパク産生能及び細胞分裂能が著しく低下することが知られていることから、本発明の製剤は、製剤が接触しオリゴヌクレオチドを導入する細胞に傷害を与えないよう処方設計されることが望ましい。即ち、溶液状、懸濁液状、ゲル状の本発明の製剤は細胞と等張であることが望ましい。本発明の製剤にリン酸塩とナトリウム塩を含有する場合、リン酸塩０．１Ｍからリン酸塩０．０１Ｍ、ナトリウム塩０．１４Ｍの範囲内で含有することが望ましく、リン酸塩０．０５Ｍ、ナトリウム塩０．０７Ｍからリン酸塩０．０１Ｍ、ナトリウム塩０．１４Ｍの範囲で含有することがより好ましい。
さらに、本発明の製剤は、遺伝子変換効率を高めるためには遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドとコラーゲンが粒子状の会合体となるように製造することが好ましい。ここで、「会合体」とは、分子中に多数の正電荷を帯びたコラーゲンと負電荷を帯びたオリゴヌクレオチドとが電気的に引き合った複合体が他のコラーゲンと会合したものを意味する。この会合体の形成は、長径約３００ｎｍ、直径約１．５ｎｍの円柱状のコラーゲン分子が主として分子の長軸方向と平行に会合するものであり、主として会合体は分子の長軸方向に伸張する。したがって、会合体は、伸張の程度により繊維状、微繊維状および粒子状等の様々な形状をとることができる。この中でも、本発明における会合体はオリゴヌクレオチドの細胞内、特に核内への移行効率の点から粒子状であることが好ましい。
前記粒子状の会合体の長径は、３００ｎｍ〜５０μｍが好ましく、３００ｎｍ〜３０μｍがより好ましい。
粒子状の会合体を形成させるためには、混合するコラーゲンとオリゴヌクレオチドの濃度と割合、塩濃度、温度、ｐＨなどを調整する。
塩が存在しない場合、会合体の長径は混合時のコラーゲン濃度に依存するため、上記の好ましい長径の会合体を得るには、混合時のコラーゲンの濃度が１．０〜０．００５重量％、より好ましくは０．５〜０．００５重量％、更により好ましくは０．０５〜０．００５重量％であることが望ましいが、コラーゲン濃度が低下するに従って会合体を形成するオリゴヌクレオチド濃度も低下する。より好ましい会合体を高濃度に得る方法として、予めコラーゲンを０．０１Ｍ〜０．１Ｍリン酸塩および０．０７Ｍ〜０．１４Ｍナトリウム塩を含有する溶液に溶解して微細なコラーゲン線維またはコラーゲン分子会合体を形成し、また場合によってコラーゲン分子を単分子状態で維持し、これにオリゴヌクレオチドを加えてコラーゲン線維、コラーゲン分子会合体またはコラーゲン単分子と会合体を形成する方法がある。また、コラーゲンの線維形成には温度が影響を与えるため、上記の好ましい長径の会合体を得るには、混合時の温度は１〜１０℃が望ましく、より好ましくは１〜５℃である。
従って、本発明の溶液状の製剤は、コラーゲンを、０．０１Ｍ〜０．１Ｍリン酸塩および０．０７Ｍ〜０．１４Ｍナトリウム塩を含有する溶液に溶解し、これに同濃度のリン酸塩および同濃度のナトリウム塩を含有する遺伝子変換用のオリゴヌクレオチド溶液を加えて１〜１０℃の温度下で攪拌することにより得られる。
混合時のコラーゲンの濃度は、通常５０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌであり、混合時のオリゴヌクレオチドの濃度は、通常２０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌである。
会合体を形成したコラーゲン分子数とオリゴヌクレオチドのヌクレオチドモノマー数との比は、１：１〜１：２００であり、好ましくは１：３〜１：１５０、より好ましくは１：３〜１：１２０である。
混合時の溶液のｐＨは、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８である。
このような条件下で本発明の製剤を製造することにより、粒子状の会合体を含む溶液状の製剤を提供することができる。
前記溶液状の製剤中のコラーゲンの濃度は、主にインビトロでの遺伝子変換やオリゴヌクレオチドの核内局在に使用する場合、０．０１〜１．０重量％の範囲で含有することが好ましい。
前記溶液状の製剤中のコラーゲンの濃度は、主にインビボでの遺伝子変換、遺伝子治療やオリゴヌクレオチドの核内局在に使用する場合、０．０１〜０．２５重量％の範囲で含有することが好ましい。
更に本発明の溶液状製剤は、オリゴヌクレオチドの安定化のためにＥＤＴＡを０．０１〜１重量％、容器及び投与器具への吸着防止のため界面活性剤を０．０１〜１重量％含有することができる。
以下に、フィルム状、固形状（棒状、粉末状）の本発明の製剤として、好ましい態様について説明する。
フィルム状、固形状製剤は上記の溶液状製剤を濃縮、乾燥して得られる。即ち上記の溶液状製剤を平面なプレート上にキャストして、４０℃以下の温度で乾燥させることによりフィルム状の製剤を調製できる。また、溶液状製剤を遠心してオリゴヌクレオチドとコラーゲンの会合体を沈殿させ、その沈殿物を４０℃以下で乾燥させることで粉末状の製剤を調製できる。このようにして得られた粉末状の製剤あるいは溶液状製剤を凍結乾燥して得られたスポンジ状化合物を圧縮して棒状の製剤を調製する方法、あるいは粉末状の製剤とスポンジ状製剤に少量の水を加えて練合して高濃度の溶液とし、ノズルから押し出して４０℃以下で乾燥させて棒状の製剤を調製することができる。
フィルム状、固形状製剤では、溶液状製剤に含有された添加剤に加えて、製剤の形状を保つ目的で、アルブミン、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、アガロース、ソルビトール、スクロース等の製剤上許容される添加剤を製剤全体の１０〜８０重量％の範囲で含有できる。
粉末状製剤の粒子径は、賦形剤により様々な形状を取り得るが、含有されるオリゴヌクレオチドとコラーゲンが形成する会合体の長径は、３００ｎｍ〜５０μｍが好ましく、３００ｎｍ〜３０μｍがより好ましい。
また、棒状の固形状製剤は局所に注射的に投与できるように、直径が０．１ｍｍ〜２．０ｍｍ、長さ３ｍｍ〜２０ｍｍが望ましく、直径が０．３ｍｍ〜１．０ｍｍ、長さ３ｍｍ〜１０ｍｍがより望ましい。
固形製剤に含有されるオリゴヌクレオチドの量は、通常固形製剤１ｍｇあたり１０μｇ〜１００μｇ、コラーゲン量は、通常固形製剤１ｍｇあたり９９０μｇ〜２５０μｇである。
本発明の第三の態様は、細胞の核内においてゲノム遺伝子上の特定の塩基を任意に変換する方法に関する。すなわち、本発明の変換方法は、本発明の部位特異的遺伝子変換促進剤を細胞に接触させることにより、当該促進剤中に含まれるオリゴヌクレオチドを接触した細胞の核内に移入、局在させ、所望の塩基の変換を行うことを特徴とする。
変換対象の細胞は、真核細胞であれば特に制限されるものではなく、酵母、真菌、植物細胞および動物細胞などが挙げられるが、好ましくは哺乳動物細胞、酵母または真菌である。
特定の塩基が変換されたかどうかは、本発明の遺伝子変換促進剤を接触させて一定の期間後に細胞を回収し、ＰＣＲ法等により特定の塩基を含む遺伝子領域を増幅して調べることができる。
本発明の遺伝子治療剤は、種々の遺伝子疾患の治療に使用することができる。治療対象の疾患としては、遺伝子の点変異（１〜３塩基の変異を含む）、欠失変異または挿入変異（１〜３塩基の変異を含む）により正常なタンパク質が発現されないことに起因する疾患があげられる。そのような疾患としては家族性ポリアミロイドニューロパチー（ＦＡＰ）、ファブリー病、ウイルソン病、サラセミア、鎌形赤血球症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、第五因子ライデン異常症、ビオチン依存性マルチプルカルボキシラーゼ欠損症等が挙げられる。
ＦＡＰの場合、点変異によりトランスサイレチン（ＴＴＲ）の３０番目のバリンがメチオニンに変異した異型ＴＴＲに起因する疾患（Ｉ型ＦＡＰ）や、ＴＴＲの８４番目のイソロイシンがセリンに変異した異型ＴＴＲに起因する疾患（ＩＩ型ＦＡＰ）などが代表例として挙げられる。また、ＦＡＰに関しては、これまで９０種を越える様々なＴＴＲの点変異によるＦＡＰが報告されており、本遺伝子治療剤は、これらすべてのタイプのＦＡＰに適用可能である。ＴＴＲは、主に肝臓で産生されることから、肝細胞を標的として本発明の遺伝子治療剤を投与することができる。また、異型ＴＴＲによるアミロイド沈着は眼の硝子体の白濁等を伴う視力障害をも引き起し、この障害は、本発明の遺伝子治療剤を直接眼の網膜に投与することにより治療することができる。
本発明の遺伝子治療剤の投与方法としては、治療目的に応じて経皮、皮下、皮内、経鼻、経肺、筋肉内、脳内、組織（臓器表面、臓器内）、血管内（静脈内、門脈内）または経口投与することができる。
本発明の遺伝子治療剤の投与量は、溶液状製剤の場合はその液量で、フィルム状剤型の場合はその面積で、棒状製剤の場合はその径と長さで、さらに粉末状製剤の場合はその粉体体積もしくは重量で容易に調節することができる。
本発明の遺伝子治療剤の最適な投与量は、適応疾患、投与部位、投与方法、剤型の種類、患者の性別、年齢、症状などによって異なるが、製剤中のオリゴヌクレオチドの量としては、患者に対して例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇである。
投与後の遺伝子治療剤中のオリゴヌクレオチドは、効率よくゲノム遺伝子中の変異を変換する、すなわち、変異を修復することができる。ＦＡＰの場合、遺伝子の修復の結果正常なＴＴＲが産生され、異型ＴＴＲ量は低下して、アミロイドの形成を抑制することにより、ＦＡＰの症状が改善される。
本発明の第四の態様は、少なくともコラーゲンとオリゴヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドの核内局在化促進剤を提供する。本製剤においては、オリゴヌクレオチドは前記遺伝子変換用オリゴヌクレオチドの条件に合致するように設計されたものを使用することができるが、オリゴヌクレオチドとしての通常の長さを有する任意のオリゴヌクレオチドも好適に使用することができる。
本製剤は、前記遺伝子変換促進剤と同様に種々の剤型をとることができるが、溶液状の剤型が好ましい。溶液状の本製剤に含まれるリン酸塩およびナトリウム塩の濃度は、前記と同様である。また、その他の条件（コラーゲンの濃度、コラーゲン分子数とオリゴヌクレオチドモノマー数との比、混合時の溶液のｐＨおよび温度など）は、前記と同様である。
本製剤を細胞に接触させることにより、製剤中に含まれるオリゴヌクレオチドを細胞の核内に効率的に局在させることができる。オリゴヌクレオチドが細胞の核内に局在したかどうかは、当該オリゴヌクレオチドを蛍光色素等で標識しておき、蛍光顕微鏡等により観察することにより確認することができる。

以下、実施例等により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。実施例において、コラーゲン濃度を示す％は、重量％を意味する。
製造例１
部位特異的遺伝子変換促進剤の調製
下記試験例および実施例で使用するＦＡＰに関連するＴＴＲの遺伝子の部位特異的変換促進剤およびファブリー病に関連するα−ガラクトシダーゼの遺伝子の部位特異的変換促進剤を調製した。配列番号２〜１２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド３．８３〜５０μＭと１０μｇ／ｍｌ〜１ｇ／ｍｌのアテロコラーゲンとを等量、０．１４Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で２℃で混合し、オリゴヌクレオチドとコラーゲンの会合体を含む溶液製剤（アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド）を調製した。

ＨｅｐＧ２細胞での遺伝子変換率
１）遺伝子変換用のオリゴヌクレオチド
ＦＡＰで最も多くみられるのは、ＴＴＲの３０番目のバリンがメチオニンへ変異したＦＡＰ ｔｙｐｅ Ｉ（ＦＡＰ ＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔ）である。そこで、正常ＴＴＲ遺伝子を有するＨｅｐＧ２細胞の正常ＴＴＲ遺伝子をＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔを発現するように変換するため、図１（ｂ）〜（ｄ）に示すようなＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドの最適な長さを検討するために、２５ｍｅｒ（配列番号：２）、４５ｍｅｒ（配列番号：３）、７４ｍｅｒ（配列番号：４）の３種類を合成した。また、前記オリゴヌクレオチドは、ヒトＴＴＲ遺伝子に基づいて設計されたものであり、マウスおよびウサギＴＴＲ遺伝子に基づいて設計して合成した７４ｍｅｒは、それぞれ配列番号：５および配列番号：６に記載している。
２）トランスフェクション方法
ＨｅｐＧ２細胞への遺伝子導入効率を検討するために、導入するオリゴヌクレオチドの５’末端をＦＩＴＣで標識した。Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ製）、ＥｘＧｅｎ ５００（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ製）、ＨＶＪ−リポソーム（大阪大学大学院医学系研究科、遺伝子治療学、金田安史博士より供与）または製造例１で調製したアテロコラーゲン製剤（ＦＩＴＣで標識したオリゴヌクレオチドを含有）を用いて、トランスフェクション法の最適化を検討した。
３）ＤＮＡオリゴヌクレオチドによるＨｅｐＧ２細胞における遺伝子変換率の検討
前日に２ｘ１０^５のＨｅｐＧ２細胞（大日本製薬より購入）を１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにまき、０．１％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド７４ｍｅｒ（３．８３μＭ）を３００μｌおよび６００μｌずつトランスフェクションし、５日（３００μｌ添加時）あるいは６日（６００μｌ添加時）後に細胞を回収した。回収した細胞からＤＮＡを抽出し、変異配列に相当する塩基が３’末端になるように設計した変異ＤＮＡ特異的オリゴヌクレオチドを用いて異常アレル（ＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔ）のみ効率よく増幅するように設定したＭＡＳＡ法（ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを用いて遺伝子変換率を算定した。
４）アテロコラーゲンに包埋したオリゴヌクレオチドの性状の検討
８μｌのアテロコラーゲンとオリゴヌクレオチドとの会合体（製造例１で調製したもの）を、一本鎖ＤＮＡを染色する５倍希釈の一本鎖核酸染色蛍光試薬ＹＯＹＯ（モレキュラープローブ社）２μｌと混合し、蛍光顕微鏡下で観察した。
５）ＤＮＡオリゴヌクレオチドによるＨｅｐＧ２細胞における遺伝子変換の最適条件の検討
前日に２ｘ１０^５のＨｅｐＧ２細胞を１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにまき、０．１％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０μＭ ２５ｍｅｒ，１０μＭ ４５ｍｅｒ，１０μＭ ７４ｍｅｒ）、または０．５％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（５０μＭ ２５ｍｅｒ，２５μＭ ４５ｍｅｒ，１０μＭ ７４ｍｅｒ）を６００μｌ（培養液６００μｌ）ずつトランスフェクションし、５日後に細胞を回収した。回収した細胞からＤＮＡを抽出し、ＭＡＳＡ法とｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを用いて遺伝子変換率を算定した。
以上の実験結果に基づき、遺伝子の変換効率の確認を行った。
（Ａ）オリゴヌクレオチドの細胞核内への局在率
ＨｅｐＧ２細胞へのＤＮＡオリゴヌクレオチドの核内局在率は、Ｆｕｇｅｎｅ６、ＥｘＧｅｎ５００、ＨＶＪ−リポソームおよびアテロコラーゲン製剤の中で、図２（ａ）、（ｂ）に示すようにアテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドがほぼ５０％のＨｅｐＧ２細胞に取り込まれ、更に導入されたＤＮＡオリゴヌクレオチドが核に局在していることがわかる。他の方法ではすべてこれよりも弱い蛍光を示し、核への局在率が低かった。
（Ｂ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドによるＨｅｐＧ２細胞における遺伝子変換率
これまでの報告では、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使った実験では、最適なＤＮＡオリゴヌクレオチドの長さを調べるために、２５ｍｅｒ〜７４ｍｅｒのＤＮＡオリゴヌクレオチドを使って遺伝子修復の効率を比較検討しており、４５ｍｅｒ、７４ｍｅｒのＤＮＡオリゴヌクレオチドが比較的遺伝子修復率が高いことが知られていることから、アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド７４ｍｅｒ（配列番号：４）を用いて、ＨｅｐＧ２細胞における遺伝子変換率を調べたところ、前記３）の条件下では３００μｌ及び６００μｌのアテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド濃度：３．８３μＭ）を添加した場合、それぞれ０．５％及び１％弱の遺伝子変換率であったのに対し、前記５）（オリゴヌクレオチド濃度：１０μＭ）では製剤中のアテロコラーゲン濃度を０．１％から０．５％に上げ、６００μｌのアテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドを６００μｌの細胞培養液に添加することにより遺伝子変換率が１％から１０％に上昇した。本製剤を用いた遺伝子変換率は、一定のレベルまで用量依存的に上昇することが考えられる。尚、遺伝子変換率はアテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド２５ｍｅｒ（配列番号：２）ではアテロコラーゲン濃度が０．１％（ＤＮＡオリゴヌクレオチド濃度：１０μＭ）のとき０％、０．５％（ＤＮＡオリゴヌクレオチド濃度：５０μＭ）のとき約０．５％、４５ｍｅｒ配列番号：３）ではアテロコラーゲン濃度が０．１％（ＤＮＡオリゴヌクレオチド濃度：１０μＭ）のとき０％、０．５％（ＤＮＡオリゴヌクレオチド濃度：２５μＭ）のとき約１％であった。
これらの結果は、本発明の用いるＤＮＡオリゴヌクレオチドの鎖長は、４５ｍｅｒ以上が望ましく、より望ましくは７４ｍｅｒ以上であることを示している。
（Ｃ）アテロコラーゲンに包埋したＤＮＡオリゴヌクレオチドの性状の検討
前記４）の蛍光顕微鏡による観察の結果を図３に示す。図３よりＤＮＡオリゴヌクレオチド単独では全く粒子は観察されないのに対して、０．０５％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号：５）では、会合体粒子が観察され、会合体粒子の平均長径は１８．７３μｍであった。

ＤＮＡオリゴヌクレオチドによる家兎の眼における遺伝子変換の検討
家兎の前眼房水を除去した後、０．５％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０μＭ ７４ｍｅｒ、配列番号：６）または１％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（３０μＭ ７４ｍｅｒ）を硝子体に直接注入（左眼）、あるいは硝子体切除後の硝子体に注入（右眼）した。１ヶ月後に眼を摘出し、ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いて、ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、ＭＡＳＡ法とｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを用いて、正常ＴＴＲおよびＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔのコピー数を決めることで遺伝子変換率を算定した。
遺伝子変換率は、ＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔのコピー数／（ＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔのコピー数＋正常ＴＴＲ遺伝子のコピー数）ｘ１００（％）で算定した。１％アテロコラーゲンで包埋した７４ｍｅｒのＤＮＡオリゴヌクレオチドの方が０．５％アテロコラーゲンで包埋した７４ｍｅｒのＤＮＡオリゴヌクレオチドよりも遺伝子変換率が高かった。また、硝子体切除を施行した方がより高い遺伝子変換率（約１％）を示した。

マウス肝臓における遺伝子変換の検討
正常および異常マウストランスサイレチン（ＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔ）遺伝子を有するヘテロトランスジェニックマウスならびに異常マウストランスサイレチン遺伝子を有するホモトランスジェニックマウス（変異導入マウスを用いた遺伝性アミロイドーシス発症機構の解析、前田秀一郎ら、厚生科学研究費補助金特定疾患対策研究事業「アミロイドーシスに関する研究」平成１３年度総括研究報告書、ｐ３９−４１）に下記製剤１〜３を投与し、遺伝子変換率を調べた。
オリゴヌクレオチド：遺伝子変換を行う塩基を中央に配し、両末端３塩基をホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとした７４ｍｅｒ（配列番号：５）
製剤：製剤１：オリゴヌクレオチド１０μＭ，アテロコラーゲン０．５％
製剤２：オリゴヌクレオチド１０μＭ，アテロコラーゲン０．２％
製剤３：オリゴヌクレオチド１０μＭ，アテロコラーゲン０．０５％
投与方法：マウスの肝臓の一つの肝葉の二ヶ所に０．２ｍｌずつ前記製剤を直接投与（トータル０．４ｍｌ）した。
３週間飼育後、製剤を投与した肝葉と、製剤を投与していない肝葉を採取して遺伝子を抽出し、ＭＡＳＡ法とｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを用いて両肝葉について全トランスサイレチン遺伝子中の正常遺伝子の割合を測定した。
また、３週間飼育後、無処置のホモトランスジェニックマウス（マウスのトランスサイレチン遺伝子ＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔのもの）および製剤を投与したホモトランスジェニックマウスより血液を採取し、血清に抗トランスサイレチン抗体を加え免疫沈降をさせ抽出したトランスサイレチンを質量分析装置（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ／ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を用いて解析し、正常トランスサイレチンが産生されているかどうかを検討した。
結果：製剤３投与ヘテロトランスジェニックマウスの両肝葉での正常遺伝子の割合は、製剤を投与した肝葉で６０．７％、製剤を投与していない肝葉で５１％であった。従って、１０％の遺伝子修復効果が得られたと考えられる。製剤２投与マウスは飼育中に死亡した（原因不明）。製剤１投与マウスでも遺伝子修復効果が得られたが僅かであった。製剤３投与ホモトランスジェニックマウスの両肝葉での遺伝子の正常化率は、製剤を投与した肝葉で８．７％、製剤を投与していない肝葉で０％であった。したがって、約９％の遺伝子修復効果が得られた。また、質量分析の結果、未処置のトランスジェニックマウスではＡＴＴＲ Ｖ３０Ｍの１３，６７２Ｄａのピークを認めたが（図４Ａ）、製剤３を投与したトランスジェニックマウスでは１３，６７２Ｄａのピークに加えて、ＭｅｔがＶａｌに修復することで分子量３２Ｄａマイナスにシフトした１３，６４０Ｄａ（図４Ｂ，↓）のピークを認めた。これらの結果は、アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドを肝臓に直接投与することで、異常トランスサイレチン遺伝子が修復され、正常トランスサイレチンが産生されたことを示しており、本発明のアテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドには、ＦＡＰの治療効果があるといえる。

ＨｅｐＧ２細胞での遺伝子変換率（２）
１）遺伝子変換促進剤の調製
ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして５１ｍｅｒのＹＫＳ−３８４（配列番号：７）、配列番号７において１，２，３，４７，４９および５０位をＬｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（商品名）（ＬＮＡ）に置換したＹＫＳ−３８２、ならびに配列番号７において１，２，３，１０，１１，１２，１４，３４，３５，３８，４７，４９および５０位をＬｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（商品名）（ＬＮＡ）に置換したＹＫＳ−３８３の３種類を合成した。また、前記オリゴヌクレオチドは、ヒトＴＴＲ遺伝子に基づいて設計されたものである。前記製造例１に記載の方法により、前記３種類のオリゴヌクレオチドとコラーゲンの会合体を含む溶液製剤（０．５％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０μＭ））を調製した。
２）ＨｅｐＧ２細胞における遺伝子変換率の検討
前日に２ｘ１０^５のＨｅｐＧ２細胞（大日本製薬より購入）を１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにまき、前記１）で調製した０．５％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド５１ｍｅｒ（１０μＭ）を６００μｌずつトランスフェクションし、６日後に細胞を回収した。対照としてＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＹＫＳ−３８４（配列番号：７）単独の溶液を調製し、この溶液を用いて同様にトランスフェクションした。回収した細胞からＤＮＡを抽出し、変異配列に相当する塩基が３’末端になるように設計した変異ＤＮＡ特異的オリゴヌクレオチドを用いて異常アレル（ＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔ）のみ効率よく増幅するように設定したＭＡＳＡ法（ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを用いて遺伝子変換率を算定した。
以上の実験結果に基づき、遺伝子の変換率の確認を行ったところ、アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド中のＤＮＡオリゴヌクレオチドとしてＹＫＳ−３８４を用いた場合は４％、６個のＬＮＡを含むＹＫＳ−３８２では１０％、１３個のＬＮＡを含むＹＫＳ−３８３では２３％であった。ＹＫＳ−３８４単独では遺伝子変換が起こらなかった。

ＤＮＡオリゴヌクレオチドによるＨｅｐＧ２細胞におけるＴＴＲ遺伝子上の５０番目及び１１４番目のアミノ酸変換をコードした塩基の変換率の検討
実施例１の検討により、アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いることで、ＨｅｐＧ２細胞におけるＴＴＲ遺伝子上の３０番目のアミノ酸をコードした塩基の変換が、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを単独で用いた場合に比べて促進できることが明らかになったことから、ＦＡＰの原因となるＴＴＲ遺伝子上の他のアミノ酸をコードした塩基の変換が、アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いることで促進できることを検討した。
１）遺伝子変換促進剤の調製
ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして、トランスサイレチン遺伝子の５０番目のセリンがイソロイシンに変異したＦＡＰ ＡＴＴＲ Ｓｅｒ ５０ Ｉｌｅ及び１１４番目のチロシンがシステインに変異したＦＡＰ ＡＴＴＲ Ｔｙｒ １１４ Ｃｙｓの遺伝子を正常化する効果を検討するために、ヒトＴＴＲ遺伝子に基づいてＤＮＡオリゴヌクレオチド７４ｍｅｒ（配列番号：８、９、遺伝子変換を行う塩基を中央に配し、両末端３塩基をホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）を合成した。前記製造例１に記載の方法により、前記２種類のＤＮＡオリゴヌクレオチドとコラーゲンの会合体を含む溶液製剤（０．５％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０μＭ））を調製した。
２）ＨｅｐＧ２細胞における遺伝子変換率の検討
前日に２ｘ１０^５のＨｅｐＧ２細胞を１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにまき、１）で調製した０．５％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０μＭ ７４ｍｅｒ）とＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０μＭ ７４ｍｅｒ）とを６００μｌ（培養液６００μｌ）ずつトランスフェクションし、５日後に細胞を回収した。回収した細胞からＤＮＡを抽出し、ＭＡＳＡ法とｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを用いて遺伝子変換率を算定した。
ヒトトランスサイレチン遺伝子上の５０番目のアミノ酸をコードした塩基を変換できるように設計したＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号：８）、ヒトトランスサイレチン遺伝子上の１１４番目のアミノ酸をコードした塩基を変換できるように設計したＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号：９）を各々、アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（アテロコラーゲン濃度：０．５％、ＤＮＡオリゴヌクレオチド濃度：１０μＭ）及びＤＮＡオリゴヌクレオチド単独でＨｅｐＧ２細胞に添加した。結果、塩基の変換率は、ヒトトランスサイレチン遺伝子上の５０番目のアミノ酸をコードした塩基を変換できるように設計したＤＮＡオリゴヌクレオチドでは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド単独で０％、アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドで１．６１％、ヒトトランスサイレチン遺伝子上の１１４番目のアミノ酸をコードした塩基を変換できるように設計したＤＮＡオリゴヌクレオチドでは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド単独で０％、アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドで０．５８％であった。この結果は、本発明のアテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、塩基変異部位が異なる場合でもＤＮＡオリゴヌクレオチドによる塩基変換を促進できることを示している。更にこのことは、本発明はタイプの異なるＦＡＰに対して治療薬を提供できることを示している。

ヒト網膜上皮細胞における遺伝子変換率の検討
実施例１の検討により、アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いることで、ＨｅｐＧ２細胞におけるＴＴＲ遺伝子上の３０番目のアミノ酸をコードした塩基の変換が、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを単独で用いた場合に比べて促進できることが明らかになった。一方、ＦＡＰでは異常なＴＴＲは肝臓だけでなく網膜でも産生されることから、ヒト網膜細胞でもＴＴＲ遺伝子上の塩基の変換が、アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いることで促進できることを検討した。
１）遺伝子変換促進剤の調製
ヒトＴＴＲ遺伝子に基づいたＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号：４）について、前記製造例１に記載の方法により、ＤＮＡオリゴヌクレオチドとコラーゲンの会合体を含む溶液製剤（０．５％、０．２５％、０．１％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０μＭ））を調製した。
２）ヒト網膜上皮細胞における遺伝子変換率の検討
前日に２ｘ１０^５ｃｅｌｌのヒト網膜上皮細胞（ＡＲＰＥ１９株）を１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにまき、０．１％、０．２５％、０．５％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０μＭ ７４ｍｅｒ）を６００μｌ（培養液６００μｌ）ずつトランスフェクションし、５日後に細胞を回収した。回収した細胞からＤＮＡを抽出し、ＭＡＳＡ法とｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを用いて遺伝子変換率を算定した。
アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドをヒト網膜上皮細胞に添加した場合、塩基の変換率は、アテロコラーゲン濃度が０．１％の時０％、０．２５％の時５．９１％、０．５％の時２．０８％であった。この結果は、本発明のアテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヒト肝臓細胞だけでなくヒト網膜細胞でもＤＮＡオリゴヌクレオチドによる塩基変換を促進できることを示している。

ファブリー病に関連する遺伝子変異の変換率の検討
１）遺伝子変換促進剤の調製
ＤＮＡオリゴヌクレオチドとしてファブリー病で見られるα−ガラクトシダーゼ遺伝子の変異に基づいて１２５番目または３７４番目のアミノ酸を変換するＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号：１０または１１、遺伝子変換を行う塩基を中央に配し、両末端３塩基をホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）を合成した。前記実施例６に記載の方法により、前記３種類のオリゴヌクレオチドとコラーゲンの会合体を含む溶液製剤（０．１％、０．２５、０．５％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０μＭ））を調製した。
２）ファブリー病患者由来ヒト繊維芽細胞における遺伝子変換率の検討
製剤投与当日に約５０％の細胞密度となるように前日に播種したファブリー病患者由来のヒト繊維芽細胞を１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにまき、０．１％、０．２５％、０．５％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０μＭ ７４ｍｅｒ）を６００μｌ（培養液６００μｌ）ずつトランスフェクションし、７日後に細胞を回収した。回収した細胞からＤＮＡを抽出し、ＭＡＳＡ法とｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを用いて遺伝子変換率を算定した。
３種類のアテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドをヒト繊維芽細胞に添加した場合、塩基の変換率は次の通りであった。
１２５番目のアミノ酸を変換するＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号：１０）
アテロコラーゲン濃度：塩基変換率
０．１％：０％、０．２５％：０％、０．５％：０．９５％
３７４番目のアミノ酸を変換するＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号：１１）
アテロコラーゲン濃度：塩基変換率
０．１％：１．３％、０．２５％：０％、０．５％：０％
この結果は、本発明のアテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ファブリー病に関連する遺伝子変異に対してもＤＮＡオリゴヌクレオチドによる塩基変換を促進できることを示している。更にこのことは、本発明はファブリー病に対してその治療薬を提供できることを示している。
参考例１
ＭＡＳＡ法を利用したｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲにより算出した遺伝子変換率の妥当性評価
１）実施例１の５）で０．５％アテロコラーゲン包埋ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０μＭ ７４ｍｅｒ）を添加したＨｅｐＧ２細胞から抽出したＤＮＡを用いて、ＴＴＲ遺伝子のエクソン２（変異部位のエクソン）を増幅し、ＤＨ５ α細胞にトランスフォームした。得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを精製し、制限酵素Ｎｓｉ １で切断することにより、正常ＴＴＲ遺伝子からＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔ遺伝子への変換率を検討した。その結果、６０コロニーのうち５０コロニーに遺伝子変換が認められ（８．３％）、ＭＡＳＡ法を利用したｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲの結果（１０％）とほぼ同じ結果が得られた。
２）ＦＡＰ ＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔホモ接合体患者から得られたＤＮＡを正常者のＤＮＡで希釈して得られた１００％、１０％、１％ＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔ遺伝子をスタンダードとして、５０％、２５％，１２．５％，６．２５％，３．１２５％ＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔ遺伝子についてＭＡＳＡ法を利用したｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い、理論値と測定値の相関を検討した。結果、理論値と計算値は一次の相関を示し、相関係数０．９９５６と良好な相関を認めた。
３）ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲにおいて、系中に残存したＤＮＡオリゴヌクレオチドがテンプレートとして働いてＰＣＲ産物が生じ、結果として遺伝子変換が生じたように計算される可能性を否定するため、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号：４）をテンプレートとしてｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを行なった。結果、ＤＮＡオリゴヌクレオチドをテンプレートとして使用した場合は、当初から緩やかな上昇カーブが見られ、融解曲線解析によるＰＣＲ産物のＴｍ値がスタンダード遺伝子（ＡＴＴＲ Ｖａｌ３０Ｍｅｔ）と全く異なることから、ＤＮＡオリゴヌクレオチドはテンプレートとして働かないことが明らかになった。
以上の結果より、ＭＡＳＡ法を利用したｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲにより算出した遺伝子変換率の妥当性が検証された。

本発明により、細胞のゲノム遺伝子上に存在する特定の塩基対を部位特異的に変換する遺伝子変換促進剤および遺伝子疾患治療剤が提供される。本発明の製剤は、生体内分解性でかつ低抗原性であり、既に生体に投与した場合の高い安全性が確認されているコラーゲンを用いることにより、オリゴヌクレオチドが極めて高い効率で細胞内に導入されて核に局在化でき、ゲノム遺伝子の変換を効率的に促進することができる。本発明の製剤は、オリゴヌクレオチドの核内局在化促進剤としても有用である。これらの製剤を使用することにより、遺伝子治療、遺伝子変異動物および植物の作出が可能である。

【配列表】

Claims (33)

1. 少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含んでなる部位特異的遺伝子変換促進剤。
2. 少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含んでなる部位特異的遺伝子疾患治療剤。
3. コラーゲンが水溶性コラーゲンである、請求項１または２に記載の促進剤または治療剤。
4. 水溶性コラーゲンがアテロコラーゲンである、請求項３記載の促進剤または治療剤。
5. 遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドが少なくとも２０塩基からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１〜４いずれかに記載の促進剤または治療剤。
6. 遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドがＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１〜５いずれかに記載の促進剤または治療剤。
7. 遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドが、変換する遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖と、１〜３塩基対のミスマッチ対合を含んでワトソン・クリック型塩基対を形成する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項５または６に記載の促進剤または治療剤。
8. 遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドが、変換する遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖と、１〜３塩基の欠失または挿入を含んでワトソン・クリック型塩基対を形成する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項５または６に記載の促進剤または治療剤。
9. 前記ミスマッチ対合がオリゴヌクレオチドの中央部に位置する、請求項７に記載の促進剤または治療剤。
10. 前記塩基の欠失または挿入がオリゴヌクレオチドの中央部に位置する、請求項８記載の促進剤または治療剤。
11. 剤型が溶液状である、請求項１〜１０いずれかに記載の促進剤または治療剤。
12. リン酸塩を０．０１Ｍ〜０．１Ｍの範囲で含有する請求項１１記載の促進剤または治療剤。
13. ナトリウム塩を０．０７Ｍ〜０．１４Ｍの範囲で含有する請求項１１記載の促進剤または治療剤。
14. 遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドとコラーゲンが粒子状の会合体である請求項１１〜１３いずれかに記載の促進剤または治療剤。
15. 粒子状の会合体の長径が３００ｎｍ〜５０μｍである請求項１４記載の促進剤または治療剤。
16. コラーゲンを０．０１〜１．０重量％の範囲で含有する請求項１１〜１５いずれかに記載の促進剤または治療剤。
17. コラーゲンを０．０１〜０．２５重量％の範囲で含有する請求項１１〜１５いずれかに記載の促進剤または治療剤。
18. コラーゲンを、０．０１Ｍ〜０．１Ｍのリン酸塩および０．０７Ｍ〜０．１４Ｍのナトリウム塩を含有する溶液に溶解し、これに同濃度のリン酸塩および同濃度のナトリウム塩を含有する遺伝子変換用のオリゴヌクレオチド溶液を加えて１〜１０℃の温度下で攪拌することにより得られる部位特異的遺伝子変換促進剤または遺伝子治療剤。
19. 剤型が固形状であり、遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドとコラーゲンが粒子状の会合体である請求項１〜１０いずれかに記載の促進剤または治療剤。
20. 遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドとコラーゲンが粒子状の会合体である請求項１９に記載の促進剤または治療剤。
21. 粒子状の会合体の長径が３００ｎｍ〜５０μｍである請求項２０に記載の促進剤または治療剤。
22. 細胞の核内においてゲノム遺伝子上の特定の塩基を任意に変換する方法であって、請求項１、３〜２１いずれかに記載の遺伝子変換促進剤を当該細胞に接触させることを含む方法。
23. 前記の細胞が哺乳動物細胞である請求項２２に記載の方法。
24. 前記の細胞が酵母または真菌である請求項２２に記載の方法。
25. 少なくともコラーゲンとオリゴヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドの核内局在化促進剤。
26. リン酸塩を０．０１Ｍ〜０．１Ｍの範囲で含有する請求項２５に記載の核内局在化促進剤。
27. ナトリウム塩を０．０７Ｍ〜０．１４Ｍの範囲で含有する請求項２５または２６に記載の核内局在化促進剤。
28. 前記オリゴヌクレオチドとコラーゲンが粒子状の会合体である請求項２５〜２７いずれかに記載の核内局在化促進剤。
29. 粒子状の会合体の長径が３００ｎｍ〜５０μｍである請求項２８に記載の核内局在化促進剤。
30. コラーゲンを０．０１〜１．０重量％の範囲で含有する請求項２５〜２９いずれかに記載の核内局在化促進剤。
31. コラーゲンを０．０５〜０．２５重量％の範囲で含有する請求項２５〜２９いずれか記載の核内局在化促進剤。
32. 少なくともコラーゲンと遺伝子変換用のオリゴヌクレオチドを含む組成物を経口、経鼻、経肺、門脈内、筋肉内、皮下、臓器表面、臓器内または経皮投与することにより生体内の細胞と接触させ、当該細胞の遺伝子を変換する方法。
33. 請求項３２記載の方法を用いて遺伝子疾患を治療する方法。

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