KR20190136018A

KR20190136018A - Pvr 및 4-1bbl을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190136018A
Application number: KR1020197030417A
Authority: KR
Inventors: 이승훈; 은소영; 조의철; 권해냄; 김태윤; 박혜영; 오인재; 남혜미; 원종화
Original assignee: 재단법인 목암생명과학연구소
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2018-04-30
Publication date: 2019-12-09
Also published as: KR20180120893A; WO2018199710A1

Abstract

본 발명은 PVR 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 PVR 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질은 T세포를 활성화 시켜 TNF-α, IFN-γ 및 Granzyme B의 분비를 증가시키므로, 면역증강제 및 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PVR 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도

본 발명은 PVR 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

4-1BBL(4-1BB Ligand)은 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF) 수퍼패밀리(superfamily)에 속하는 Ⅱ형 막단백질이다. 4-1BBL은 인간 및 마우스의 활성화된 수지상세포, 대식세포 및 B세포와 같은 항원제시세포(antigen presenting cell)에 발현된다. 4-1BBL은 4-1BB와의 결합을 통해 T세포의 활성화, 분화 및 세포사멸(apoptosis)에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Cannons JL et al, J Immunol. 167(3):1313-1324, 2001). 최근, 4-1BB를 타겟으로 하는 의약품 개발이 활발히 이루어지고 있다.

대표적으로, 4-1BB를 타겟으로 하는 의약품은 브리스톨 마이어스사의 우렐루맙(Urelumab)이 있다. 우렐루맙은 4-1BB를 타겟으로 하는 단일클론 항체 의약품으로 자연살해세포의 항체 의존성 세포독성작용(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 및 자연살해세포의 항암효과 증진을 목적으로 개발되었다. 하지만, 단일복용치료법(monotherapy)으로 진행한 우렐루맙의 초기 임상 시험에서 간 손상의 위험이 있는 것으로 나타나 개발이 중단되었다. 초기 임상 시험을 통해 우렐루맙의 최대 투여 용량이 제한되었다. 투여 용량의 제한으로 현재 우렐루맙은 다제병용요법(combination therapy)으로 임상 시험을 진행하고 있다. 또한, 화이자의 유토밀루맙(Utomilumab, PF-05082566)도 다제병용요법으로 임상시험을 진행하고 있다. 하지만, 하나의 약물만으로도 환자에게 부담이 되고 있는 상황에서 다제병용요법은 환자의 부담을 가중시키고 있다. 따라서, 4-1BB를 타겟으로 하는 안전하고 효과적인 의약품에 대한 지속적인 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 면역세포를 활성화시키는 4-1BB를 타겟으로 하는 안전하고 효과적인 의약품을 개발하기 위해 연구한 결과, 인간 PVR 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질과 상기 융합단백질의 다량체를 제조하였으며, 상기 융합단백질 및 이의 다량체가 T세포를 활성화시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 측면은 PVR 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 융합단백질이 2개 이상의 결합된 복합체 형태를 이루는 융합단백질 복합체를 제공한다.

나아가, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

나아가, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 i) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 ii) 상기 배양물로부터 본 발명의 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 융합단백질 생산방법을 제공한다.

나아가, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강제를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공한다.

나아가, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 PVR 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질은 T세포를 활성화시켜 TNF-α, IFN-γ 및 Granzyme B의 분비를 증가시키므로 항암제로서 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 융합단백질인 PVR-4-1BBL의 제조에 사용된 벡터를 도식화한 도면이다.
도 2는 PVR-4-1BBL을 도식화한 도면이다.
도 3은 PVR-4-1BBL의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도면이다.
도 4는 PVR-4-1BBL의 발현을 SDS-PAGE를 통해 확인한 도면이다.
도 5는 PVR-4-1BBL의 형태를 SE-HPLC 분석을 통해 확인한 도면이다.
도 6a는 PVR-4-1BBL에 ILZ 링커를 도입한 융합단백질을 SE-HPLC 분석을 통해 확인한 도면이다.
도 6b는 PVR-4-1BBL에 TNC 링커를 도입한 융합단백질을 SE-HPLC 분석을 통해 확인한 도면이다.
도 6c는 PVR-4-1BBL에 Ig 링커를 도입한 융합단백질을 SE-HPLC 분석을 통해 확인한 도면이다.
도 7a는 PVR-4-1BBL과 4-1BB와의 결합여부 및 결합력을 ELISA를 통해 확인한 도면이다.
도 7b는 PVR-4-1BBL과 TIGIT와의 결합여부 및 결합력을 ELISA를 통해 확인한 도면이다.
도 8a는 항-CD3 항체 및 각각의 융합단백질들을 T세포에 처리한 후, T세포의 IFN-γ의 분비 증가량을 ELISA를 통해 확인한 도면이다.
도 8b는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 및 각각의 융합단백질들을 T세포에 처리한 후, T세포의 IFN-γ의 분비 증가량을 ELISA를 통해 확인한 도면이다.
도 9는 PVR-Ig-4-1BBL 또는 항-4-1BB 항체를 T세포에 처리한 후 IFN-γ의 분비량을 농도별 및 시간별로 확인한 도면이다.
도 10은 PVR-Ig-4-1BBL 또는 항-4-1BB 항체를 T세포에 처리한 후, T세포의 TNF-α의 분비량을 농도별 및 시간별로 확인한 도면이다.
도 11a는 항-CD3 항체 농도에 따른 PVR-Ig-4-1BBL에 의한 IFN-γ의 분비량을 확인한 도면이다.
도 11b는 항-CD3 항체 농도에 따른 PVR-Ig-4-1BBL에 의한 TNF-α의 분비량을 확인한 도면이다.
도 12는 항-CD3 항체 농도에 따른 PVR-Ig-4-1BBL에 의한 림프구의 증식량을 확인한 도면이다.
도 13은 항-CD3 항체 농도에 따른 PVR-Ig-4-1BBL에 의한 림프구의 증식량을 나타낸 도면이다.
도 14a는 항-CD3 항체 농도에 따른 PVR-Ig-4-1BBL에 의한 Granzyme B의 분비량을 FACS 분석을 통해 확인한 도면이다.
도 14b는 항-CD3 항체 농도에 따른 PVR-Ig-4-1BBL에 의한 Granzyme B의 분비량을 퍼센트(%)로 나타낸 도면이다.
도 15a는 항-CD3 항체 또는 항-CD3 항체+PVR-Ig-4-1BBL을 T세포에 처리한 후, 항-CD3 항체 처리 농도별 T세포의 CD25의 발현량을 FACS 분석을 통해 확인한 도면이다.
도 15b는 항-CD3 항체 또는 항-CD3 항체+PVR-Ig-4-1BBL을 T세포에 처리한 후, 항-CD3 항체 처리 농도별 T세포의 CD25의 발현량을 퍼센트(%)로 나타낸 도면이다.
도 16은 가용성 상태의 PVR-Ig-4-1BBL 또는 막에 결합된 상태의 PVR-Ig-4-1BBL의 면역 활성 효력을 측정하기 위한 4-1BB-NFκB 루시퍼라아제(luciferase) 실험을 도식화한 도면이다.
도 17a는 4-1BBL의 처리에 따른 면역 활성 효력을 4-1BB-NFκB 루시퍼라아제 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 17b는 BMS사의 항-4-1BB 항체의 처리에 따른 면역 활성 효력을 4-1BB-NFκB 루시퍼라아제 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 17c는 Pfizer사의 항-4-1BB 항체의 처리에 따른 면역 활성 효력을 4-1BB-NFκB 루시퍼라아제 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 17d는 본 발명의 융합단백질인 PVR-Ig-4-1BBL의 처리에 따른 면역 활성 효력을 4-1BB-NFκB 루시퍼라아제 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 18a는 가용성 상태와 막에 결합된 상태의 4-1BBL 처리에 따른 면역 활성 효력을 4-1BB-NFκB 루시퍼라아제 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 18b는 가용성 상태와 막에 결합된 상태의 BMS사의 항-4-1BB 항체 처리에 따른 면역 활성 효력을 4-1BB-NFκB 루시퍼라아제 실험을 통해 확인한 도면이다.
도 18c는 가용성 상태와 막에 결합된 상태의 PVR-Ig-4-1BBL 처리에 따른 면역 활성 효력을 4-1BB-NFκB 루시퍼라아제 실험을 통해 확인한 도면이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용하는 용어 'PVR'이란, 폴리오바이러스 수용체(poliovirus receptor, CD155)로 면역 글로불린 수퍼패밀리(immunoglobulin superfamily)에 속하는 I형 막 당단백질을 의미한다. PVR은 수지상세포 및 대식세포에서 발현되며, T세포 및 자연살해세포에서 발현되는 TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)와 결합하여 T세포 활성을 억제시킬 수 있다. PVR의 N-말단에는 수용체와 결합하는 세포외 도메인(extracellular domain)을 가진다. 가용성(soluble) PVR 폴리펩타이드들은 세포외 도메인으로부터 유래될 수 있다. 상기 PVR은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, PVR은 서열번호 1과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 '4-1BBL'이란, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF) 수퍼패밀리(superfamily)에 속하는 Ⅱ형 막단백질을 의미한다. 4-1BBL(4-1BB Ligand)은 폴리펩타이드의 N-말단에서 세포내(cytoplasmic) 도메인을 가지며, 세포내 도메인에 이어서 막투과(transmembrane) 부위를 가진다. 또한, 4-1BBL은 C-말단에 세포외 도메인을 가지며, 가용성 4-1BBL 폴리펩타이드들은 세포외 도메인으로부터 유래될 수 있다. 4-1BBL이 4-1BB에 결합하게 되면 생물학적 신호전달이 개시된다.

상기 4-1BBL은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 4-1BBL은 서열번호 2와 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 4-1BB는 T세포의 보조 활성 수용체로 TCR(T-cell receptor)에 의한 항원인식을 통해 T세포에서 발현된다. T세포에 발현된 4-1BB는 항원제시세포에서 발현되는 4-1BBL과 결합하여 T세포 활성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 용어 "융합단백질"이란, PVR 및 4-1BBL 도메인을 포함하도록 인위적으로 합성된 단백질을 의미한다. 상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질을 구성하는 각 도메인의 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 도메인을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)을 이용해 증폭할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 합성한 발현벡터를 클로닝한 후, 세포에서 발현시켜 제조할 수 있다.

또한, 상기 PVR과 4-1BBL은 링커를 통해 연결될 수 있다. 상기 링커는 화학적 결합 또는 생물학적 결합을 통해 PVR과 4-1BBL을 연결할 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 1개 내지 100개의 아미노산일 수 있다. 상기 링커는 ILZ(Isoleucine zipper), TNC(Tenascin C) 및 Ig(Leukemia inhibitory factor의 gp190의 Ig-like domain)로 이루지는 군으로부터 선택되는 하나일 수 있다. 상기 ILZ는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 TNC는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 Ig는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

아울러, 상기 융합단백질은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 상기 융합단백질이 2개 이상 결합된 복합체 형태를 이루는 융합단백질 복합체를 제공한다. 4-1BBL은 T세포의 4-1BB와 결합하여 활성신호를 전달하기 위해서는 막에 결합된 형태이거나 육량체 이상의 복합체 형태를 형성해야 한다. 상기 융합단백질을 발현시키면 이량체 또는 삼량체 형태를 형성하며 육량체 형태를 이루기도 한다. 따라서, 상기 융합단백질은 이량체, 삼량체 또는 육량체 복합체 형태를 이룰 수 있다.

또한, 상기 융합단백질 복합체는, PVR끼리의 비공유 상호작용(non-covalent interaction) 또는 4-1-BBL끼리 비공유 상호작용 또는 PVR과 4-1-BBL 간의 비공유 상호작용에 의하여 용액 내에서 자발적으로 여러 개의 융합단백질이 복합체 형태를 이룰 수 있다. 또한, 이러한 자발적인 비공유 상호작용을 통해서 여러 개의 융합단백질이 복합체를 이룬 형태이기 때문에 용액(solution)내에서 보다 안정성이 높은 융합단백질 복합체를 만들기 위해, 상기 융합단백질 복합체는 링커를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질 복합체를 이루고 있는 융합단백질들 간에 링커를 포함할 수 있다. 상기 링커는 1개 내지 100개의 아미노산일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 융합단백질(PVR-Ig-4-1BBL)이 TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains) 및 4-1BB와 잘 결합하는 것을 확인하였다(도 7a 및 7b). 상기 융합단백질이 항-4-1BB 항체와 비교하여 T세포를 활성화시켜 IFN-γ, TNF-α 및 granzyme B와 같은 사이토카인의 분비를 증가시키는 것을 확인하였다(도 8a 내지 도 15b). 나아가, 본 발명의 융합단백질이 항-4-1BB를 타겟으로 하는 의약품인 BMS의 우렐루맙(Urelumab) 및 Pfizer 유토밀루맙(utomilumab, PF-05082566)과 NFκB 신호기전 활성화를 비교하였을 때, 본 발명의 융합단백질이 TIGIT을 과발현하는 세포가 있는 경우 NFκB 신호기전을 더 활성화시키는 것을 확인하였다(도 18a 내지 18c).

따라서, 본 발명의 융합단백질은 면역세포의 활성을 유도하며 기존 재조합 4-1BBL이 갖지 못하는 면역세포 활성 효과를 나타내는 신규한 단백질임을 알 수 있었다.

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합단백질 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 뉴클레오티드는 서열번호 15 내지 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기서열을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 PVR-4-1BBL, PVR-ILZ-4-1BBL, PVR-TNC-4-1BBL 및 PVR-Ig-4-1BBL을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 PVR-4-1BBL을 코딩하는 뉴클레오티드는 서열번호 15로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 PVR-ILZ-4-1BBL을 코딩하는 뉴클레오티드는 서열번호 16으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으며, 상기 PVR-TNC-4-1BBL을 코딩하는 뉴클레오티드는 서열번호 17로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 PVR-Ig-4-1BBL은 서열번호 18로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels nd Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르,포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함할 수 있다. 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

상기 발현벡터는 상기 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이때, 사용되는 벡터는 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 발현벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 발현벡터는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등),바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등) 등이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 HindIII와 BamHI 제한효소 절단 부위가 있는 pcIW2 벡터를 사용하였다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시켜서 제작될 수 있다. 또한, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있다.

상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다, 구체적으로, 상기 형질전환 방법은 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 형질전환체의 제작에 사용되는 숙주세포 역시 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 숙주세포는 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 융합단백질 생산 방법은 i) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 ii) 상기 배양물로부터 본 발명의 융합단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질 복합체를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 융합단백질 복합체 생산 방법은 i) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 ii) 상기 배양물로부터 본 발명의 융합단백질 복합체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.

상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 본 발명의 융합단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족시킬 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용할 수 있다. 이외에 탄소원으로는 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있다. 또한, 상기 탄소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 상기 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다.

상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 배지에 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질을 더 첨가할 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다.

아울러, 배양물로부터 상기 융합단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 융합단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 회수 방법은 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강제를 제공한다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 융합단백질은 면역세포의 활성을 유도하며 기존 재조합 4-1BBL이 갖지 못하는 면역세포 활성 효과를 나타내는 신규한 단백질임을 확인하였다. 따라서, 상기 융합단백질 또는 융합단백질 복합체는 면역 기능 감퇴나 장애 등의 증상을 수반하는 다양한 면역 질환의 면역증강제의 유효성분으로 사용될 수 있다.

이때, 상기 면역증강제는 조성물 총 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 융합단백질을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역증강제는 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.

상기 면역증강제는 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 제제화할 수 있다.

상기 면역증강제의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 포함된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 융합단백질의 유효량은 세포 내 농도가 1 nM 내지 1,000 nM, 구체적으로는 100 nM 내지 500 nM이 되도록 한다. 이때 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.

또한, 상기 면역증강제는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공한다. 상술한 바와 같이 본 발명의 융합단백질은 T세포의 항암 면역 기능을 하는 사이토카인인 IFN-γ, TNF-α 및 granzyme B의 분비량을 증가시키므로, 상기 융합단백질 또는 융합단백질 복합체는 암 또는 종양을 예방 또는 치료하기 위한 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있다.

상기 항암제는 췌장암, 간암, 위암, 폐암, 대장암, 직장암, 갑상선암, 식도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 자궁경부암, 유방암, 혈액암, 피부암, 상피암, 뇌암, 중추신경암 또는 난소암 등 다양한 암의 치료를 위해 사용될 수 있다.

이때, 상기 항암제는 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 융합단백질을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항암제는 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 항암제 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 예를 들어, 부형제, 담체, 희석제, 기타 보조제 등을 1종 이상 포함할 수 있다.

상기 항암제의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 항암제에 포함되는 융합단백질의 유효량은 세포 내 농도가 1 nM 내지 1,000 nM, 구체적으로는 100 nM 내지 500 nM이 되도록 한다. 이때 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이때, 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.

상기 융합단백질은 상술한 바와 같다. 또한, 상기 융합단백질은 2개 이상 결합된 복합체 형태를 이루는 융합단백질 복합체일 수 있다. 구체적으로, 4-1BBL은 T세포의 4-1BB와 결합하여 활성신호를 전달하기 위해서는 막에 결합된 형태이거나 육량체 이상의 복합체 형태를 형성해야 한다. 상기 융합단백질을 발현시키면 이량체 또는 삼량체 형태를 형성하며 육량체 형태를 이루기도 한다. 따라서, 상기 융합단백질은 이량체, 삼량체 또는 육량체 복합체 형태일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 면역 증진을 위한 본 발명의 융합단백질의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 면역 증진용 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 융합단백질의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 암을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 융합단백질의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 융합단백질의 용도를 제공한다.

발명의 실시를 위한 형태

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1.1. 융합단백질 발현벡터 제작

융합된 형태로 발현되는 PVR-4-1BBL 및 다량체 도메인(multimer domain)을 포함하는 PVR-4-1BBL의 벡터를 구축하였다. N-말단에 PVR의 세포외 영역(extracellular domain)과 C-말단에 4-1BBL의 세포외 영역을 연결하였다. 다량체 도메인인 ILZ, TNC, Ig 도메인은 PVR과 4-1BBL 사이에 연결되도록 구축하였다.

융합단백질 복합체는 PVR끼리의 비공유 상호작용(non-covalent interaction) 및/또는 4-1-BBL끼리 비공유 상호작용에 의하여 용액 내에서 자발적으로 여러 개의 단백질이 융합되어 여러 형태로 만들어질 수 있다.

결실된 인간 PVR 및 4-1BBL 서열은 NCBI에 등재된 각각의 핵산서열 NM_006505.4, NM_003811.3을 기준으로 합성하였다. ILZ 도메인은 Molecular Immunology 44 (2007) 3112-3121, TNC 도메인은 J Immunol. 2009 Aug 1;183(3):1851-61, Ig 도메인은 PLoS One. 2013;8(1):e54000. doi: 10.1371 논문에 제시된 서열을 사용하였다.

도메인	단백질명(종)	크기	형태	서열번호
ILZ	GCN4 (yeast)	43 a.a	Trimer	서열번호 4, 12
TNC	Tenascin C (human)	41 a.a	Trimer-hexamer	서열번호 6, 13
Ig	Gp190 (human)	81 a.a	dimer	서열번호 8, 14

상기 표 1은 다량체 도메인의 정보를 나타낸 표이다.

먼저, 유전자 발현벡터를 제조하기 위하여 5'에 HindIII와 3' BamHI 제한효소 절단부위를 포함하도록 바이오니아에 유전자 합성을 의뢰하였다. 유전자는 모두 동일한 제한효소를 사용하였고, 벡터는 pcIW2 벡터를 사용하였다(도 1). 합성된 유전자와 pcIW2 벡터를 HindIII와 BamHI로 절단한 후 클로닝하여 pcIW2-PVR-4-1BBL 발현벡터를 제작하였다. 발현벡터 구축의 정확성은 유전자 서열 검사로 확인하였다. pcIW2-PVR-ILZ-4-1BBL, pcIW2-PVR-TNC-4-1BBL 및 pcIW2-PVR-Ig-4-1BBL 발현벡터도 pcIW2-PVR-4-1BBL 발현벡터와 동일한 방법으로 제작하였다.

실시예 1.2. 융합단백질 발현 확인

실시예 1.1.에서 제작한 발현벡터들을 각각 Expi293F^TM 세포에 Expi293F™ Expression System Kit(Thermofisher, A14635)을 이용하여 주입하였다. 형질전환 방법 및 배양은 30 ㎖을 기준으로 실시하였다. 단백질 필요량에 따라 실제 배양 부피를 조절하였다.

형질전환 수행 24시간 전에 Expi293F^TM 세포를 2.0x10⁶ cells/㎖로 Expi293 배양배지를 이용하여 예상 필요량에 맞추어 계대배양 하였다. 형질전환 수행 당일, 세포 수와 세포 생존율(viability)을 측정하여 세포 생존율이 95% 이상일 경우 형질전환을 진행하였다. 125 ㎖ 플라스크에 7.5x10⁷ cells이 되도록 Expi293 배양배지를 첨가하여 25.5 ㎖로 맞춰주었다. 상기 발현벡터들을 30 ㎍씩을 Opti-MEM을 이용하여 총 볼륨이 1,500 ㎕가 되도록 섞어주었다. 80 ㎕ 형질감염 시약(transfection reagent)을 Opti-MEM을 이용하여 총 볼륨이 1,500 ㎕이 되도록 섞어주고 상온에서 5분간 반응시켰다. 5분 후, 형질감염 시약이 들어있는 Opti-MEM을 DNA가 들어있는 Opti-MEM에 넣어주고 부드럽게 섞어주었고, 30분간 상온에서 반응시켜 주었다.

3 ㎖의 DNA-형질감염 시약 복합체를 상기 Expi293F^TM 세포를 넣어준 125 ㎖ 플라스크에 한 방울씩 떨어뜨려주고 37℃, 5% CO₂ 진탕 배양기(shaking incubator)에서 125 rpm으로 배양하였다. 16 내지 20시간 후에 인핸서 1과 인핸서 2를 각각 150 ㎕, 1.5 ㎖을 넣어주고 37℃, 5% CO₂ 진탕 배양기에서 125 rpm으로 3일간 배양하였다. 도입 3일차에 각각의 융합단백질을 발현하는 세포를 원심 분리하여 배양액을 각각 회수하였다.

실시예 1.3. 융합단백질의 정제

융합단백질의 정제 공정은 크게 2단계로 구성되어 있으며, 실시예 1.2.에서 배양한 배양액을 이용하여 정제를 진행하였다.

첫 번째 단계에서는 배양액에서 융합단백질을 분리정제 하는 공정으로 GE사의 SP fast flow resin을 이용하였다. SP fast flow resin을 컬럼에 패킹한 후, 세척 버퍼(0.5 M NaOH, 1 M NaCl)를 흘려주어 컬럼을 세척하고, 평형 버퍼(20 mM sodium phosphate, pH 4.5)를 흘려주어 평형을 잡았다. 배양액을 평형 버퍼로 5배 이상 희석한 후, pH 를 4.5로 적정하고, 컬럼에 로딩하였다. 로딩 후, 평형 버퍼를 UV가 베이스라인(baseline)으로 떨어질 때까지 흘려주어 평형을 잡았다. 용출 버퍼(20 mM sodium phosphate, 1 M NaCl, pH 4.5)와 평형 버퍼를 섞어주어 구배(gradient)로 융합단백질을 용출하고, SDS-PAGE 분석을 통해 적절한 부분(fraction)을 풀링(pooling)하였다. 이때, 구배는 용출버퍼와 평형버퍼를 섞은 용매를 흘려주어 시간에 따라 전도도(conductivity)를 바꿔주는 것을 의미한다.

두 번째 단계에서는 첫 번째 단계의 용출액에 섞여 있는 HCP(host cell protein)를 제거해주는 공정으로 GE사의 Superdex 200 resin을 이용하였다. 패킹된 Superdex 200 컬럼에 평형 버퍼(PBS)를 흘려주어 평형을 잡았다. SP 공정 시료를 30 kDa 아미콘(amicon)을 이용하여 농축한 후, 샘플 루프(sample loop)를 이용하여 컬럼에 로딩하였다. 로딩 후, 평형 버퍼를 흘려주며 피크(peak)를 수집하고, SDS-PAGE와 SE-HPLC로 분석하여 적절한 부분을 풀링하였다.

실시예 1.4. 융합단백질의 형태 확인

PVR-4-1BBL을 Expi293FTM 세포에 발현 시킨 후 배양액을 수득하였다. 상기 배양액을 웨스턴 블랏(western blot)을 통해 분석을 진행하였다. 또한 상기 발현된 융합단백질을 정제하여 SDS-PAGE, SE-HPLC 및 SEC-MALS 분석을 진행하였다.

PVR-4-1BBL을 PVR 또는 4-1BBL과 결합하는 각각의 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 진행한 결과, 같은 위치에 밴드가 나오는 것으로부터 PVR-4-1BBL이 융합된 형태로 발현 되는 것을 확인하였다(도 3).

또한, PVR-4-1BBL을 SDS-PAGE로 분석한 결과 단량체 및 이량체 밴드가 확인되었다(도 4). 또한, PVR-4-1BBL의 용액(solution) 내 분자량(Molecular weight, mw)을 확인하기 위해 G3000SW_XL(TOSOH) 컬럼을 이용하여 SE-HPLC로 분석한 후, 분석결과를 크기배제크로마토그래피(SEC) 사이즈 마커와 비교하였다. 그 결과, PVR-4-1BBL의 peak 1이 443 kDa 분자량 사이즈 마커의 peak과 669 kDa 분자량 사이즈 마커의 peak 사이에 있는 것으로 확인하였다(도 5). 또한, PVR-ILZ-4-1BBL, PVR-TNC-4-1BBL, PVR-Ig-4-1BBL도 PVR-4-1BBL과 유사한 결과가 나오는 것을 확인하였다(도 6a 내지 6c).

PVR-ILZ-4-1BBL, PVR-TNC-4-1BBL, PVR-Ig-4-1BBL 또는 PVR-4-1BBL의 용액 내 정확한 분자량을 얻기 위해 SEC-MALS 분석을 진행한 결과, 각 물질의 아미노산 서열을 이용하여 계산한 이론적 분자량보다 2배 이상 증가한 것을 확인하였다(표 2 및 표 3). 이를 통해 PVR-ILZ-4-1BBL, PVR-TNC-4-1BBL, PVR-Ig-4-1BBL 또는 PVR-4-1BBL가 용액 내 다량체 형태를 이루는 것을 확인하였다.

	분자량 (kDa)
PVR-4-1BBL	58.6
PVR-ILZ-4-1BBL	63.2
PVR-TNC-4-1BBL	62.6
PVR-Ig-4-1BBL	67.25

상기 표 2는 PVR-ILZ-4-1BBL, PVR-TNC-4-1BBL, PVR-Ig-4-1BBL 또는 PVR-4-1BBL 단량체의 이론적인 분자량을 나타낸 것이다.

	Peak 1 (Da)	Peak 2 (Da)
PVR-4-1BBL	1.446 х 10⁵(삼량체)
PVR-ILZ-4-1BBL	3.472 х 10⁵(육량체)	1.843 х 10⁵(삼량체)
PVR-TNC-4-1BBL	4.136 х 10⁵(육량체)	2.179 х 10⁵(삼량체)
PVR-Ig-4-1BBL	5.032 х 10⁵(육량체)	2.538 х 10⁵(삼량체)

상기 표 3은 PVR-ILZ-4-1BBL, PVR-TNC-4-1BBL, PVR-Ig-4-1BBL 또는 PVR-4-1BBL의 다량체의 SEC-MALS 분자량 분석 결과를 나타낸 것이다.

이러한 결과를 종합하여 봤을 때, PVR과 4-1BBL이 비 공유결합성 상호작용(non-covalent interaction)을 통하여 용액 내에서 다량체화(multimerization) 되는 것으로 판단되며, 이러한 다량체화는 4-1BBL이 4-1BB에 결합하여 T세포를 활성화시킬 수 있을 것으로 판단된다.

실시예 2. 융합단백질의 결합력 확인

정제된 PVR-4-1BBL와 TIGIT 또는 4-1BB가 정상적으로 결합하는지를 확인하기 위해 in vitro에서 ELISA를 통해 결합력을 확인하였다.

그 결과, PVR-4-1BBL와 4-1BB의 결합력(binding affinity, K_D value)은 1.29 nM로 측정되었으며, PVR-4-1BBL와 TIGIT의 결합력은 5.24 nM로 측정되었다.

4-1BB와 4-1BBL의 경우 결합력이 1.2 nM인 것으로 보고되어 있으며(J. Biol. Chem. 2005 Dec 16;280(50):41472-81), PVR과 TIGIT의 경우 결합력이 1 nM내지 3 nM인 것으로 보고되어 있다(Nat. Immunol. 2009 Jan;10(1):48-57). 본 발명에서 PVR-4-1BBL 융합단백질을 만들었음에도 불구하고 각각의 결합력은 유지되고 있다는 것을 확인하였다(도 7a 및 7b).

실시예 3. 융합단백질에 의한 T세포의 IFN-γ 분비량 증가

in vitro에서 실시예 1.2.에서 제조된 4가지의 융합단백질과 항-4-1BB 항체(BMS)에 의한 IFN-γ 분비량 변화를 측정하였다. 항-CD3 항체(eBioscience, 16-0037-85) 또는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체(eBioscience, 16-0289-85)를 플레이트에 각각 1 ㎍/㎖ 농도로 코팅한 후, 500 ng/㎖의 융합단백질 및 항-4-1BB 항체를 말초혈 단핵구 세포(peripheral blood monuclear cell, 이하 PBMC)에 처리하였다. 48시간 후, 배양액을 회수하여 PBMC로부터 분비된 IFN-γ의 분비량을 ELISA를 통해 분석하였다.

그 결과, PVR-4-1BBL와 PVR-ILZ-4-1BBL은 항-CD3 항체만 처리한 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다. 반면에, PVR-TNC-4-1BBL, 항-4-1BB 항체는 항-CD3 항체만 처리한 대조군 대비 10% 이상 IFN-γ의 분비량이 증가되었다. 반면 항-CD3 항체와 항-CD28 항체를 처리한 경우 항-4-1BB 항체, PVR-4-1BBL, PVR-TNC-4-1BBL, PVR-ILZ-4-1BBL 모두 항-CD3와 항-CD28만 처리한 대조군보다 IFN-γ가 증가하지 않았다. 반면 PVR-Ig-4-1BBL의 경우에는 항-CD3 항체를 처리한 경우가 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 처리한 군보다 IFN-γ의 분비량이 각각 약 1.8배, 1.2배 증가하였다. 이를 통해 PVR-Ig-4-1BBL가 IFN-γ 분비량 증가에 가장 높은 효력을 나타냄을 확인하였다(도 8a 및 8b).

실시예 4. PVR-Ig-4-1BBL의 농도 및 처리시간에 따른 T세포의 IFN-γ 분비량 증가

농도 및 시간 별로 PVR-Ig-4-1BBL와 항-4-1BB 항체에 따른 T세포의 IFN-γ의 분비량 변화를 비교하였다. 항-CD3 항체를 1 ㎍/㎖ 농도로 96-웰-플레이트에 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 코팅하였다. 항-CD3 항체가 코팅된 96-웰-플레이트에 인간 PBMC 세포를 1х10⁵ cells/웰이 되도록 넣고, 1.5 내지 1,000 ng/㎖의 PVR-Ig-4-1BBL 또는 항-4-1BB 항체를 처리하였다. 날짜 별로 배양액을 채취하여 인간 IFN- γ DuoSet(R&D SYSTEMS, DY285)를 이용하여 ELISA 분석을 하였다.

그 결과, PVR-Ig-4-1BBL을 처리한 경우 IFN-γ의 분비량이 1일차에서 0 ng/㎖부터 123.5 ng/㎖까지 항-CD3 항체를 처리한 실험 군에서 점차 증가하다가 123.5 ng/㎖ 이상의 항-CD3 항체를 처리 하였을 때는 점차 감소하는 것을 확인하였다. 이와 같은 경향성은 2일차 분석과 3일차 분석 모두에서 동일하게 측정되었다. 반면 항-4-1BBL 항체의 경우 1일차 실험 군에서 항-CD3 항체의 농도가 증가함에 따라 IFN-γ가 증가되는 것을 확인하였다. 반면 2일차, 3일차에서의 IFN-γ 변화는 크지 않는 것을 확인하였다.

특히, PVR-Ig-4-1BBL에 의한 IFN-γ의 생성은 배양 1일차, 2일차 및 3일차 모두 항-CD3 항체를 13.7 ng/㎖ 이상 처리한 환경에서 IFN-γ의 분비량이 증가하였고, 123.5 ng/㎖을 처리한 환경에서 최고 수치를 나타내었다. 더욱이 3일차에 IFN-γ는 PVR-Ig-4-1BBL와 123.5 ng/㎖의 항-CD3 항체를 처리한 환경에서 가장 높은 농도로, 약 15 ng/㎖이 생성되는 것을 확인하였다(도 9).

실시예 5. PVR-Ig-4-1BBL의 농도 및 처리시간에 따른 T세포의 TNF-α 분비량 증가

농도 및 시간 별로 PVR-Ig-4-1BBL와 항-4-1BB 항체에 따른 T세포의 TNF-α의 분비량 변화를 비교하였다. 항-CD3 항체를 1 ㎍/㎖ 농도로 96-웰-플레이트에 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 코팅하였다. 항-CD3 항체가 코팅된 96-웰-플레이트에 인간 PBMC 세포를 1х10⁵ cells/웰이 되도록 넣어주었다. 1.5 ng/㎖ 내지 1,000 ng/㎖의 PVR-Ig-4-1BBL 또는 항-4-1BB 항체를 처리하였다. 날짜 별로 배양액을 채취하여 인간 TNF-α DuoSet(R&D SYSTEMS, DY210)를 이용하여 ELISA 분석을 하였다.

그 결과, TNF-α의 분비량은 IFN-γ와 유사하게 1일차, 2일차 모두 항-CD3 항체를 123.5 ng/㎖ 처리한 환경에서 가장 높게 측정되었고, 배양 3일차에서는 항-CD3 항체를 41.2 ng/㎖ 처리한 군에서 TNF-α가 가장 많이 분비되었다. 1일, 2일, 3일차 모두 고농도의 항-CD3 항체를 처리한 군에서는 TNF-α의 분비량이 감소되었다. 항-4-1BBL 항체의 경우 1일차에서는 TNF-α의 분비량이 항-CD3 농도에 관계없이 1 ng/㎖ 수준으로 유지되었고, 2일차에서는 3 ng/㎖, 3일차 에서는 4 ng/㎖ 농도로 유지되었다. 1일차 항-CD3 항체를 123.5 ng/㎖ 처리한 군에서 항-4-1BBL 항체 대비 PVR-Ig-4-1BBL을 처리하였을 때 약 3배 가량의 TNF-α의 분비량이 증가하는 것을 확인하였다(도 10).

실시예 6. PVR-Ig-4-1BBL에 의한 T세포의 사이토카인 분비량 변화 확인

항-CD3 항체를 1.25 내지 100 ng/㎖ 농도로 96-웰-플레이트에 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 코팅하였다. 항-CD3 항체가 코팅된 96-웰-플레이트에 인간 PBMC 세포를 1х10⁵ cells/웰이 되도록 넣어주었다. 200 ng/㎖의 PVR-Ig-4-1BBL을 처리하였다. 3일간 배양한 후 배양액을 채취하여 인간 IFN- γ DuoSet및 인간 TNF-α DuoSet를 이용하여 ELISA 분석을 하였다.

그 결과, TNF- α와 IFN- γ 모두 항-CD3 항체의 농도가 증가함에 따라 항-CD3 항체만 처리한 군과 항-CD3 항체와 PVR-Ig-4-1BBL 모두를 처리한 군에서 분비량이 증가하였다. IFN- γ의 경우 항-CD3 항체를 100 ng/㎖ 처리한 환경에서 약 3 ng/㎖이 분비된 반면, PVR-Ig-4-1BBL을 함께 처리한 환경에서는 7 ng/㎖의 IFN- γ 분비를 확인함을 통해, PVR-Ig-4-1BBL이 IFN- γ의 분비를 대조군 대비 두 배 이상 촉진하는 것을 확인하였다. TNF-α의 분비량 또한 2.5 ng/㎖ 항-CD3 항체 농도 환경에서 항-CD3 항체만 처리한 환경에서는 약 0.1 ng/㎖의 TNF-α가 분비되었고, PVR-Ig-4-1BBL을 함께 처리한 환경에서는 약 0.35 ng/㎖의 TNF-α가 분비되는 것을 확인하였다. 이를 통해 TNF-α의 분비가 대조군 대비 약 3배 이상 증가한 것을 확인하였다(도 11a 및 11b).

실시예 7. PVR-Ig-4-1BBL에 의한 림프구 증식 확인

항-CD3 항체를 1.25 내지 10 ng/㎖ 농도로 96-웰-플레이트에 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 코팅하였다. 항-CD3 항체가 코팅된 96-웰-플레이트에 카복시플루오레신 다이아세테이트 석신이미딜 에스터(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, 이하 CFSE)로 표지한 인간 PBMC를 1х10⁵ cells/웰이 되도록 넣고 500 ng/㎖의 PVR-Ig-4-1BBL을 처리하였다. 7일 후, 배양된 세포를 채취하여 FACS 분석을 하였다.

그 결과, 항-CD3 항체 2.5, 5 및 10 ng/㎖ 농도에서 PVR-Ig-4-1BBL처리에 의해 림프구 증식이 증가함을 확인하였다(도 12 및 도 13).

실시예 8. PVR-Ig-4-1BBL에 의한 T세포의 Granzyme B 발현량 증가

PVR-Ig-4-1BBL에 의한 T세포의 Granzyme B 발현량 변화를 확인하였다. 항-CD3 항체를 0.1 내지 100 ng/㎖ 농도로 96-웰-플레이트에 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 코팅하였다. 항-CD3 항체가 코팅된 96-웰-플레이트에 인간 PBMC를 1х10⁵ cells/웰이 되도록 넣고, 500 ng/㎖의 PVR-Ig-4-1BBL을 처리하였다. 48시간 후, 배양된 세포를 채취하여 CD8 항체(BD, 555636) 및 granzyme B 항체(eBioscience, 12-8899-41)를 사용해 FACS 분석을 하였다.

그 결과, 1 ng/㎖ 항-CD3 항체와 PVR-Ig-4-1BBL을 처리한 군이 항-CD3 항체만 처리한 군보다 더 높은 Granzyme B(Gr.B⁺) 발현을 보였다(도 14a 및 14b).

실시예 9. PVR-Ig-4-1BBL에 의한 T세포 활성화 확인

항-CD3 항체를 0, 5, 10 및 100 ng/㎖ 농도로 96-웰-플레이트에 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 코팅하였다. 항-CD3 항체가 코팅된 96-웰-플레이트에 인간 PBMC를 2х10⁵ cells/웰이 되도록 넣고 500 ng/㎖의 PVR-Ig-4-1BBL을 처리하였다. 3일 후, 배양된 세포를 채취하여 T세포 활성화 마커인 CD25(Biolegend, 302626)의 발현을 FACS 분석을 통해 확인하였다.

그 결과, 10 ng/㎖ 항-CD3 항체와 PVR-Ig-4-1BBL을 처리한 군에서 항-CD3 항체만 처리한 군보다 CD8⁺ T세포에서 CD25의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 15a 및 15b).

또한, PVR-Ig-4-1BBL에 의한 T세포의 NFκB 신호기전 활성화를 4-1BB-NFκB 루시퍼라제 분석을 통해 확인하였다. 상기 4-1BB-NFκB 루시퍼라제 분석은 4-1BB Bioassay kit(Promega, E5100) 이용하여 수행하였다(도 16).

가용성 상태의 PVR-Ig-4-1BBL에 의한 T세포의 NFκB 신호기전 활성화 확인을 위해서 NFκB-luc2/4-1BB Jurkat T세포만으로 실험을 진행하였다. 4-1BB-NFκB 루시퍼라제 분석의 대조군으로 his-4-1BBL 및 항-his 항체와 BMS 및 Pfizer사의 항-4-1BB 항체를 사용하였다. 위 실험은 가용성 상태와 막에 결합된 상태 두 조건에서 실험을 수행하였으며 가용성 상태란 TIGIT이 과발현 되어 있지 않은 조건으로 PVR과 TIGIT이 결합되지 않은 상태이고, 막에 결합된 상태는 TIGIT이 과발현 되어 있는 조건으로 PVR과 TIGIT이 결합하는 상태를 말한다.

가용성 상태의 his-4-1BBL 대조군은 155 ng/㎖, BMS사의 항-4-1BB 항체 대조군은 381 ng/㎖, PVR-Ig-4-1BBL 실험군은 277 ng/㎖의 EC₅₀ 값이 측정되었다(표 4). 가용성 상태의 PVR-Ig-4-1BBL은 4-1BBL, 4-1BB Ab와 유사한 EC₅₀값을 나타내는 것으로 확인되었다(도 17a 내지 17d).

	His-4-1BBL+항-his-tag	항-4-1BB 항체(BMS)	항-4-1BB 항체(Pfizer)	PVR-Ig-4-1BBL
Bottom	619.8	-499.1	-	607.1
Top	10558	21164	-	4680
LogEC50	-0.8088	-0.4186	-	-0.5570
HillSlope	2.411	0.6813	-	1.479
EC50 (㎍/㎖)	0.1553	0.3814	-	0.2773

상기 표 4는 실시예 7에 사용된 대조물질 및 시험물질을 나타낸 표이다.

또한, 막에 결합된 상태의 PVR-Ig-4-1BBL에 의한 T세포의 NF-κB 신호기전 활성화를 확인하기 위해서 NFκB-luc2/4-1BB Jurkat T세포에 동량의 TIGIT-Jurkat T세포를 넣어주어 실험을 진행하였다.

그 결과, his-4-1BBL와 BMS사의 항-4-1BB 항체의 경우 TIGIT-Jurkat T세포과 공동 배양을 하더라도 EC₅₀ 값에는 큰 변화를 보이지 않았다. 반면에, PVR-Ig-4-1BBL은 bioluminescence 수치에서 가용성 상태에서 153 ng/㎖을 나타낸 반면에, 막에 결합된 경우에 11 ng/㎖를 나타내었다. 이를 통해, 가용성 상태보다 막에 결합된 상태에서 약 11배 높은 효력을 보이는 것으로 분석되었다.

즉, PVR-Ig-4-1BBL은 가용성 상태에서도 T세포의 NFκB 신호기전을 활성화시킬 뿐만 아니라 TIGIT-Jurkat T세포의 막에 결합하였을 경우 E₅₀ 값이 10배 이상 증가 되는 것을 확인하였다(도 18a 내지 18c).

<110> Mogam Institute for Biomedical Research <120> FUSION PROTEIN COMPRISING PVR AND 4-1BBL, AND USE THEREOF <130> PCB801021MOG <150> KR 10-2017-0054798 <151> 2017-04-28 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for PVR <400> 1 Met Ala Arg Ala Met Ala Ala Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln 20 25 30 Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro 35 40 45 Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu 50 55 60 Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln 65 70 75 80 Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly 100 105 110 Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe 115 120 125 Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys 130 135 140 Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro 145 150 155 160 Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln 165 170 175 Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val 180 185 190 Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu 210 215 220 His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr 245 250 255 Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro 260 265 270 Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro 275 280 285 Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys 290 295 300 Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala 305 310 315 320 Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu 325 330 335 His Ser Gly Met Ser Arg Asn 340 <210> 2 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for 4-1BBL <400> 2 Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala 35 40 45 Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro 50 55 60 Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp 65 70 75 80 Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe 85 90 95 Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val 100 105 110 Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala 115 120 125 Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg 130 135 140 Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly 145 150 155 160 Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala 165 170 175 Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr 180 185 190 Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 195 200 205 <210> 3 <211> 548 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for PVR-4-1BBL <400> 3 Met Ala Arg Ala Met Ala Ala Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln 20 25 30 Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro 35 40 45 Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu 50 55 60 Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln 65 70 75 80 Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly 100 105 110 Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe 115 120 125 Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys 130 135 140 Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro 145 150 155 160 Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln 165 170 175 Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val 180 185 190 Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu 210 215 220 His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr 245 250 255 Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro 260 265 270 Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro 275 280 285 Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys 290 295 300 Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala 305 310 315 320 Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu 325 330 335 His Ser Gly Met Ser Arg Asn Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala 340 345 350 Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro 355 360 365 Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly 370 375 380 Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro 385 390 395 400 Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly 405 410 415 Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala 420 425 430 Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala 435 440 445 Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu 450 455 460 Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro 465 470 475 480 Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg 485 490 495 Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr 500 505 510 Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val 515 520 525 Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser 530 535 540 Pro Arg Ser Glu 545 <210> 4 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for ILZ <400> 4 Leu Gly Gly Gly Ser Ile Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile 1 5 10 15 Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys 20 25 30 Leu Ile Gly Glu Arg Gly His Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 5 <211> 591 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for PVR-ILZ-4-1BBL <400> 5 Met Ala Arg Ala Met Ala Ala Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln 20 25 30 Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro 35 40 45 Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu 50 55 60 Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln 65 70 75 80 Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly 100 105 110 Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe 115 120 125 Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys 130 135 140 Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro 145 150 155 160 Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln 165 170 175 Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val 180 185 190 Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu 210 215 220 His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr 245 250 255 Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro 260 265 270 Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro 275 280 285 Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys 290 295 300 Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala 305 310 315 320 Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu 325 330 335 His Ser Gly Met Ser Arg Asn Leu Gly Gly Gly Ser Ile Lys Gln Ile 340 345 350 Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn 355 360 365 Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg Gly His Gly Gly 370 375 380 Gly Ser Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly 385 390 395 400 Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp 405 410 415 Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 420 425 430 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 435 440 445 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 450 455 460 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val 465 470 475 480 Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 485 490 495 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 500 505 510 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu 515 520 525 Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser 530 535 540 Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg 545 550 555 560 His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 565 570 575 Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 580 585 590 <210> 6 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for TNC <400> 6 Ala Cys Gly Cys Ala Ala Ala Pro Asp Val Lys Glu Leu Leu Ser Arg 1 5 10 15 Leu Glu Glu Leu Glu Asn Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln Gly Ser 20 25 30 Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser 35 40 <210> 7 <211> 589 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for PVR-TNC-4-1BBL <400> 7 Met Ala Arg Ala Met Ala Ala Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln 20 25 30 Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro 35 40 45 Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu 50 55 60 Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln 65 70 75 80 Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly 100 105 110 Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe 115 120 125 Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys 130 135 140 Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro 145 150 155 160 Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln 165 170 175 Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val 180 185 190 Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu 210 215 220 His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr 245 250 255 Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro 260 265 270 Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro 275 280 285 Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys 290 295 300 Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala 305 310 315 320 Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu 325 330 335 His Ser Gly Met Ser Arg Asn Ala Cys Gly Cys Ala Ala Ala Pro Asp 340 345 350 Val Lys Glu Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu Leu Glu Asn Leu Val Ser 355 360 365 Ser Leu Arg Glu Gln Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser 370 375 380 Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala 385 390 395 400 Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro 405 410 415 Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala 420 425 430 Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro 435 440 445 Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp 450 455 460 Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe 465 470 475 480 Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val 485 490 495 Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala 500 505 510 Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg 515 520 525 Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly 530 535 540 Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala 545 550 555 560 Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr 565 570 575 Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 580 585 <210> 8 <211> 81 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for Ig <400> 8 Ile Pro Asp Ser Gln Thr Lys Val Phe Pro Gln Asp Lys Val Ile Leu 1 5 10 15 Val Gly Ser Asp Ile Thr Phe Cys Cys Val Ser Gln Glu Lys Val Leu 20 25 30 Ser Ala Leu Ile Gly His Thr Asn Cys Pro Leu Ile His Leu Asp Gly 35 40 45 Glu Asn Val Ala Ile Lys Ile Arg Asn Ile Ser Val Ser Ala Ser Ser 50 55 60 Gly Thr Asn Val Val Phe Thr Thr Glu Asp Asn Ile Phe Gly Thr Val 65 70 75 80 Ile <210> 9 <211> 629 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for PVR-Ig-4-1BBL <400> 9 Met Ala Arg Ala Met Ala Ala Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln 20 25 30 Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro 35 40 45 Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu 50 55 60 Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln 65 70 75 80 Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly 100 105 110 Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe 115 120 125 Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys 130 135 140 Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro 145 150 155 160 Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln 165 170 175 Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val 180 185 190 Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu 210 215 220 His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr 245 250 255 Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro 260 265 270 Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro 275 280 285 Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys 290 295 300 Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala 305 310 315 320 Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu 325 330 335 His Ser Gly Met Ser Arg Asn Ile Pro Asp Ser Gln Thr Lys Val Phe 340 345 350 Pro Gln Asp Lys Val Ile Leu Val Gly Ser Asp Ile Thr Phe Cys Cys 355 360 365 Val Ser Gln Glu Lys Val Leu Ser Ala Leu Ile Gly His Thr Asn Cys 370 375 380 Pro Leu Ile His Leu Asp Gly Glu Asn Val Ala Ile Lys Ile Arg Asn 385 390 395 400 Ile Ser Val Ser Ala Ser Ser Gly Thr Asn Val Val Phe Thr Thr Glu 405 410 415 Asp Asn Ile Phe Gly Thr Val Ile Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly 420 425 430 Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly 435 440 445 Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln 450 455 460 Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly 465 470 475 480 Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr 485 490 495 Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys 500 505 510 Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val 515 520 525 Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro 530 535 540 Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu 545 550 555 560 Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly 565 570 575 Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His 580 585 590 Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr 595 600 605 Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro 610 615 620 Ser Pro Arg Ser Glu 625 <210> 10 <211> 1029 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PVR <400> 10 atggcccgag ccatggccgc cgcgtggccg ctgctgctgg tggcgctact ggtgctgtcc 60 tggccacccc caggaaccgg ggacgtcgtc gtgcaggcgc ccacccaggt gcccggcttc 120 ttgggcgact ccgtgacgct gccctgctac ctacaggtgc ccaacatgga ggtgacgcat 180 gtgtcacagc tgacttgggc gcggcatggt gaatctggca gcatggccgt cttccaccaa 240 acgcagggcc ccagctattc ggagtccaaa cggctggaat tcgtggcagc cagactgggc 300 gcggagctgc ggaatgcctc gctgaggatg ttcgggttgc gcgtagagga tgaaggcaac 360 tacacctgcc tgttcgtcac gttcccgcag ggcagcagga gcgtggatat ctggctccga 420 gtgcttgcca agccccagaa cacagctgag gttcagaagg tccagctcac tggagagcca 480 gtgcccatgg cccgctgcgt ctccacaggg ggtcgcccgc cagcccaaat cacctggcac 540 tcagacctgg gcgggatgcc caatacgagc caggtgccag ggttcctgtc tggcacagtc 600 actgtcacca gcctctggat attggtgccc tcaagccagg tggacggcaa gaatgtgacc 660 tgcaaggtgg agcacgagag ctttgagaag cctcagctgc tgactgtgaa cctcaccgtg 720 tactaccccc cagaggtatc catctctggc tatgataaca actggtacct tggccagaat 780 gaggccaccc tgacctgcga tgctcgcagc aacccagagc ccacaggcta taattggagc 840 acgaccatgg gtcccctgcc accctttgct gtggcccagg gcgcccagct cctgatccgt 900 cctgtggaca aaccaatcaa cacaacttta atctgcaacg tcaccaatgc cctaggagct 960 cgccaggcag aactgaccgt ccaggtcaaa gagggacctc ccagtgagca ctcaggcatg 1020 tcccgtaac 1029 <210> 11 <211> 618 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4-1BBL <400> 11 gcctgcccct gggccgtgtc cggggctcgc gcctcgcccg gctccgcggc cagcccgaga 60 ctccgcgagg gtcccgagct ttcgcccgac gatcccgccg gcctcttgga cctgcggcag 120 ggcatgtttg cgcagctggt ggcccaaaat gttctgctga tcgatgggcc cctgagctgg 180 tacagtgacc caggcctggc aggcgtgtcc ctgacggggg gcctgagcta caaagaggac 240 acgaaggagc tggtggtggc caaggctgga gtctactatg tcttctttca actagagctg 300 cggcgcgtgg tggccggcga gggctcaggc tccgtttcac ttgcgctgca cctgcagcca 360 ctgcgctctg ctgctggggc cgccgccctg gctttgaccg tggacctgcc acccgcctcc 420 tccgaggctc ggaactcggc cttcggtttc cagggccgct tgctgcacct gagtgccggc 480 cagcgcctgg gcgtccatct tcacactgag gccagggcac gccatgcctg gcagcttacc 540 cagggcgcca cagtcttggg actcttccgg gtgacccccg aaatcccagc cggactccct 600 tcaccgaggt cggaataa 618 <210> 12 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of ILZ <400> 12 cttggtggcg gaagtatcaa acagatcgaa gataagattg aagagatctt gagcaaaatc 60 taccacattg aaaacgagat cgcgcgcatt aagaaactga tcggcgaacg tggccatggc 120 ggtgggtcg 129 <210> 13 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of TNC <400> 13 gcctgtggct gtgccgcagc ccctgatgtt aaggagctgc tgagcagact ggaggagctg 60 gagaacctgg tgtcttccct gagggagcaa ggctcctctg gttcgagtgg ttcgagtggt 120 tct 123 <210> 14 <211> 243 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of Ig <400> 14 atacctgatt ctcagactaa ggtttttcct caagataaag tgatacttgt aggctcagac 60 ataacatttt gttgtgtgag tcaagaaaaa gtgttatcag cactgattgg ccatacaaac 120 tgccccttga tccatcttga tggggaaaat gttgcaatca agattcgtaa tatttctgtt 180 tctgcaagta gtggaacaaa tgtagttttt acaaccgaag ataacatatt tggaaccgtt 240 att 243 <210> 15 <211> 1647 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PVR-4-1BBL <400> 15 atggcccgag ccatggccgc cgcgtggccg ctgctgctgg tggcgctact ggtgctgtcc 60 tggccacccc caggaaccgg ggacgtcgtc gtgcaggcgc ccacccaggt gcccggcttc 120 ttgggcgact ccgtgacgct gccctgctac ctacaggtgc ccaacatgga ggtgacgcat 180 gtgtcacagc tgacttgggc gcggcatggt gaatctggca gcatggccgt cttccaccaa 240 acgcagggcc ccagctattc ggagtccaaa cggctggaat tcgtggcagc cagactgggc 300 gcggagctgc ggaatgcctc gctgaggatg ttcgggttgc gcgtagagga tgaaggcaac 360 tacacctgcc tgttcgtcac gttcccgcag ggcagcagga gcgtggatat ctggctccga 420 gtgcttgcca agccccagaa cacagctgag gttcagaagg tccagctcac tggagagcca 480 gtgcccatgg cccgctgcgt ctccacaggg ggtcgcccgc cagcccaaat cacctggcac 540 tcagacctgg gcgggatgcc caatacgagc caggtgccag ggttcctgtc tggcacagtc 600 actgtcacca gcctctggat attggtgccc tcaagccagg tggacggcaa gaatgtgacc 660 tgcaaggtgg agcacgagag ctttgagaag cctcagctgc tgactgtgaa cctcaccgtg 720 tactaccccc cagaggtatc catctctggc tatgataaca actggtacct tggccagaat 780 gaggccaccc tgacctgcga tgctcgcagc aacccagagc ccacaggcta taattggagc 840 acgaccatgg gtcccctgcc accctttgct gtggcccagg gcgcccagct cctgatccgt 900 cctgtggaca aaccaatcaa cacaacttta atctgcaacg tcaccaatgc cctaggagct 960 cgccaggcag aactgaccgt ccaggtcaaa gagggacctc ccagtgagca ctcaggcatg 1020 tcccgtaacg cctgcccctg ggccgtgtcc ggggctcgcg cctcgcccgg ctccgcggcc 1080 agcccgagac tccgcgaggg tcccgagctt tcgcccgacg atcccgccgg cctcttggac 1140 ctgcggcagg gcatgtttgc gcagctggtg gcccaaaatg ttctgctgat cgatgggccc 1200 ctgagctggt acagtgaccc aggcctggca ggcgtgtccc tgacgggggg cctgagctac 1260 aaagaggaca cgaaggagct ggtggtggcc aaggctggag tctactatgt cttctttcaa 1320 ctagagctgc ggcgcgtggt ggccggcgag ggctcaggct ccgtttcact tgcgctgcac 1380 ctgcagccac tgcgctctgc tgctggggcc gccgccctgg ctttgaccgt ggacctgcca 1440 cccgcctcct ccgaggctcg gaactcggcc ttcggtttcc agggccgctt gctgcacctg 1500 agtgccggcc agcgcctggg cgtccatctt cacactgagg ccagggcacg ccatgcctgg 1560 cagcttaccc agggcgccac agtcttggga ctcttccggg tgacccccga aatcccagcc 1620 ggactccctt caccgaggtc ggaataa 1647 <210> 16 <211> 1776 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PVR-ILZ-4-1BBL <400> 16 atggcccgag ccatggccgc cgcgtggccg ctgctgctgg tggcgctact ggtgctgtcc 60 tggccacccc caggaaccgg ggacgtcgtc gtgcaggcgc ccacccaggt gcccggcttc 120 ttgggcgact ccgtgacgct gccctgctac ctacaggtgc ccaacatgga ggtgacgcat 180 gtgtcacagc tgacttgggc gcggcatggt gaatctggca gcatggccgt cttccaccaa 240 acgcagggcc ccagctattc ggagtccaaa cggctggaat tcgtggcagc cagactgggc 300 gcggagctgc ggaatgcctc gctgaggatg ttcgggttgc gcgtagagga tgaaggcaac 360 tacacctgcc tgttcgtcac gttcccgcag ggcagcagga gcgtggatat ctggctccga 420 gtgcttgcca agccccagaa cacagctgag gttcagaagg tccagctcac tggagagcca 480 gtgcccatgg cccgctgcgt ctccacaggg ggtcgcccgc cagcccaaat cacctggcac 540 tcagacctgg gcgggatgcc caatacgagc caggtgccag ggttcctgtc tggcacagtc 600 actgtcacca gcctctggat attggtgccc tcaagccagg tggacggcaa gaatgtgacc 660 tgcaaggtgg agcacgagag ctttgagaag cctcagctgc tgactgtgaa cctcaccgtg 720 tactaccccc cagaggtatc catctctggc tatgataaca actggtacct tggccagaat 780 gaggccaccc tgacctgcga tgctcgcagc aacccagagc ccacaggcta taattggagc 840 acgaccatgg gtcccctgcc accctttgct gtggcccagg gcgcccagct cctgatccgt 900 cctgtggaca aaccaatcaa cacaacttta atctgcaacg tcaccaatgc cctaggagct 960 cgccaggcag aactgaccgt ccaggtcaaa gagggacctc ccagtgagca ctcaggcatg 1020 tcccgtaacc ttggtggcgg aagtatcaaa cagatcgaag ataagattga agagatcttg 1080 agcaaaatct accacattga aaacgagatc gcgcgcatta agaaactgat cggcgaacgt 1140 ggccatggcg gtgggtcggc ctgcccctgg gccgtgtccg gggctcgcgc ctcgcccggc 1200 tccgcggcca gcccgagact ccgcgagggt cccgagcttt cgcccgacga tcccgccggc 1260 ctcttggacc tgcggcaggg catgtttgcg cagctggtgg cccaaaatgt tctgctgatc 1320 gatgggcccc tgagctggta cagtgaccca ggcctggcag gcgtgtccct gacggggggc 1380 ctgagctaca aagaggacac gaaggagctg gtggtggcca aggctggagt ctactatgtc 1440 ttctttcaac tagagctgcg gcgcgtggtg gccggcgagg gctcaggctc cgtttcactt 1500 gcgctgcacc tgcagccact gcgctctgct gctggggccg ccgccctggc tttgaccgtg 1560 gacctgccac ccgcctcctc cgaggctcgg aactcggcct tcggtttcca gggccgcttg 1620 ctgcacctga gtgccggcca gcgcctgggc gtccatcttc acactgaggc cagggcacgc 1680 catgcctggc agcttaccca gggcgccaca gtcttgggac tcttccgggt gacccccgaa 1740 atcccagccg gactcccttc accgaggtcg gaataa 1776 <210> 17 <211> 1770 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PVR-TNC-4-1BBL <400> 17 atggcccgag ccatggccgc cgcgtggccg ctgctgctgg tggcgctact ggtgctgtcc 60 tggccacccc caggaaccgg ggacgtcgtc gtgcaggcgc ccacccaggt gcccggcttc 120 ttgggcgact ccgtgacgct gccctgctac ctacaggtgc ccaacatgga ggtgacgcat 180 gtgtcacagc tgacttgggc gcggcatggt gaatctggca gcatggccgt cttccaccaa 240 acgcagggcc ccagctattc ggagtccaaa cggctggaat tcgtggcagc cagactgggc 300 gcggagctgc ggaatgcctc gctgaggatg ttcgggttgc gcgtagagga tgaaggcaac 360 tacacctgcc tgttcgtcac gttcccgcag ggcagcagga gcgtggatat ctggctccga 420 gtgcttgcca agccccagaa cacagctgag gttcagaagg tccagctcac tggagagcca 480 gtgcccatgg cccgctgcgt ctccacaggg ggtcgcccgc cagcccaaat cacctggcac 540 tcagacctgg gcgggatgcc caatacgagc caggtgccag ggttcctgtc tggcacagtc 600 actgtcacca gcctctggat attggtgccc tcaagccagg tggacggcaa gaatgtgacc 660 tgcaaggtgg agcacgagag ctttgagaag cctcagctgc tgactgtgaa cctcaccgtg 720 tactaccccc cagaggtatc catctctggc tatgataaca actggtacct tggccagaat 780 gaggccaccc tgacctgcga tgctcgcagc aacccagagc ccacaggcta taattggagc 840 acgaccatgg gtcccctgcc accctttgct gtggcccagg gcgcccagct cctgatccgt 900 cctgtggaca aaccaatcaa cacaacttta atctgcaacg tcaccaatgc cctaggagct 960 cgccaggcag aactgaccgt ccaggtcaaa gagggacctc ccagtgagca ctcaggcatg 1020 tcccgtaacg cctgtggctg tgccgcagcc cctgatgtta aggagctgct gagcagactg 1080 gaggagctgg agaacctggt gtcttccctg agggagcaag gctcctctgg ttcgagtggt 1140 tcgagtggtt ctgcctgccc ctgggccgtg tccggggctc gcgcctcgcc cggctccgcg 1200 gccagcccga gactccgcga gggtcccgag ctttcgcccg acgatcccgc cggcctcttg 1260 gacctgcggc agggcatgtt tgcgcagctg gtggcccaaa atgttctgct gatcgatggg 1320 cccctgagct ggtacagtga cccaggcctg gcaggcgtgt ccctgacggg gggcctgagc 1380 tacaaagagg acacgaagga gctggtggtg gccaaggctg gagtctacta tgtcttcttt 1440 caactagagc tgcggcgcgt ggtggccggc gagggctcag gctccgtttc acttgcgctg 1500 cacctgcagc cactgcgctc tgctgctggg gccgccgccc tggctttgac cgtggacctg 1560 ccacccgcct cctccgaggc tcggaactcg gccttcggtt tccagggccg cttgctgcac 1620 ctgagtgccg gccagcgcct gggcgtccat cttcacactg aggccagggc acgccatgcc 1680 tggcagctta cccagggcgc cacagtcttg ggactcttcc gggtgacccc cgaaatccca 1740 gccggactcc cttcaccgag gtcggaataa 1770 <210> 18 <211> 1890 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PVR-Ig-4-1BBL <400> 18 atggcccgag ccatggccgc cgcgtggccg ctgctgctgg tggcgctact ggtgctgtcc 60 tggccacccc caggaaccgg ggacgtcgtc gtgcaggcgc ccacccaggt gcccggcttc 120 ttgggcgact ccgtgacgct gccctgctac ctacaggtgc ccaacatgga ggtgacgcat 180 gtgtcacagc tgacttgggc gcggcatggt gaatctggca gcatggccgt cttccaccaa 240 acgcagggcc ccagctattc ggagtccaaa cggctggaat tcgtggcagc cagactgggc 300 gcggagctgc ggaatgcctc gctgaggatg ttcgggttgc gcgtagagga tgaaggcaac 360 tacacctgcc tgttcgtcac gttcccgcag ggcagcagga gcgtggatat ctggctccga 420 gtgcttgcca agccccagaa cacagctgag gttcagaagg tccagctcac tggagagcca 480 gtgcccatgg cccgctgcgt ctccacaggg ggtcgcccgc cagcccaaat cacctggcac 540 tcagacctgg gcgggatgcc caatacgagc caggtgccag ggttcctgtc tggcacagtc 600 actgtcacca gcctctggat attggtgccc tcaagccagg tggacggcaa gaatgtgacc 660 tgcaaggtgg agcacgagag ctttgagaag cctcagctgc tgactgtgaa cctcaccgtg 720 tactaccccc cagaggtatc catctctggc tatgataaca actggtacct tggccagaat 780 gaggccaccc tgacctgcga tgctcgcagc aacccagagc ccacaggcta taattggagc 840 acgaccatgg gtcccctgcc accctttgct gtggcccagg gcgcccagct cctgatccgt 900 cctgtggaca aaccaatcaa cacaacttta atctgcaacg tcaccaatgc cctaggagct 960 cgccaggcag aactgaccgt ccaggtcaaa gagggacctc ccagtgagca ctcaggcatg 1020 tcccgtaaca tacctgattc tcagactaag gtttttcctc aagataaagt gatacttgta 1080 ggctcagaca taacattttg ttgtgtgagt caagaaaaag tgttatcagc actgattggc 1140 catacaaact gccccttgat ccatcttgat ggggaaaatg ttgcaatcaa gattcgtaat 1200 atttctgttt ctgcaagtag tggaacaaat gtagttttta caaccgaaga taacatattt 1260 ggaaccgtta ttgcctgccc ctgggccgtg tccggggctc gcgcctcgcc cggctccgcg 1320 gccagcccga gactccgcga gggtcccgag ctttcgcccg acgatcccgc cggcctcttg 1380 gacctgcggc agggcatgtt tgcgcagctg gtggcccaaa atgttctgct gatcgatggg 1440 cccctgagct ggtacagtga cccaggcctg gcaggcgtgt ccctgacggg gggcctgagc 1500 tacaaagagg acacgaagga gctggtggtg gccaaggctg gagtctacta tgtcttcttt 1560 caactagagc tgcggcgcgt ggtggccggc gagggctcag gctccgtttc acttgcgctg 1620 cacctgcagc cactgcgctc tgctgctggg gccgccgccc tggctttgac cgtggacctg 1680 ccacccgcct cctccgaggc tcggaactcg gccttcggtt tccagggccg cttgctgcac 1740 ctgagtgccg gccagcgcct gggcgtccat cttcacactg aggccagggc acgccatgcc 1800 tggcagctta cccagggcgc cacagtcttg ggactcttcc gggtgacccc cgaaatccca 1860 gccggactcc cttcaccgag gtcggaataa 1890 <210> 19 <211> 6172 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of pcIW2 vector <400> 19 gttaggcgtt ttgcgctgct tcgcgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta 60 ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 120 ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 180 ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 240 cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 300 atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 360 cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 420 attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca 480 cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat 540 caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg 600 cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg 660 agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc gggaccgatc cagcctccgg 720 actctagagg atcgaaccct ggctagcgta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga 780 gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct 840 attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccagag cgctgcgatc 900 gcggcgcgcc gcggccgcca agcttcgtac gttaattaac ctgcagggga tccgatccaa 960 tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 1020 ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat 1080 ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg 1140 gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg 1200 ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat 1260 tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 1320 gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg tcctttccat ggctgctcgc 1380 ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 1440 tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg 1500 ctcgagaagg gttcgatccc taccggttag taatgagttt aaacggggga ggctaactga 1560 aacacggaag gagacaatac cggaaggaac ccgcgctatg acggcaataa aaagacagaa 1620 taaaacgcac gggtgttggg tcgtttgttc ataaacgcgg ggttcggtcc cagggctggc 1680 actctgtcga taccccaccg agaccccatt ggggccaata cgcccgcgtt tcttcctttt 1740 ccccacccca ccccccaagt tcgggtgaag gcccagggct cgcagccaac gtcggggcgg 1800 caggccctgc catagcagat ctgcgcagct ggggctctag ggggtatccc cacgcgccct 1860 gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 1920 ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 1980 gctttccccg tcaagctcta aatcggggca tccctttagg gttccgattt agtgctttac 2040 ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 2100 gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 2160 tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 2220 tggggatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 2280 aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag 2340 aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc 2400 cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc 2460 cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg 2520 ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca 2580 gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc cgggagcttg 2640 tatatccatt ttcggatctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca 2700 agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg 2760 ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg 2820 cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc 2880 agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt 2940 cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc 3000 atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca 3060 tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc 3120 acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg 3180 gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct 3240 cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc 3300 tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc 3360 tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta 3420 cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt 3480 ctgagcggga ctctggggtt cgcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac 3540 gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg 3600 acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc gcccacccca 3660 acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 3720 ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 3780 atcatgtctg tataccgtcg acctctagct agagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 3840 ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 3900 agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 3960 tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 4020 cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 4080 gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 4140 ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 4200 ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 4260 atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 4320 aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 4380 gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta 4440 ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 4500 ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 4560 acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 4620 gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 4680 ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 4740 ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 4800 gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 4860 ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 4920 agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 4980 ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 5040 gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 5100 catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 5160 cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 5220 cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 5280 gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 5340 tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 5400 gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 5460 tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 5520 gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 5580 gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 5640 taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 5700 tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 5760 ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 5820 taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 5880 tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 5940 aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtcgac ggatcgggag 6000 atctcccgat cccctatggt cgactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 6060 ccagtatctg ctccctgctt gtgtgttgga ggtcgctgag tagtgcgcga gcaaaattta 6120 agctacaaca aggcaaggct tgaccgacaa ttgcatgaag aatctgctta gg 6172

Claims

PVR 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질.
제 1항에 있어서,
상기 PVR은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
제 1항에 있어서,
상기 4-1BBL은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
제 1항에 있어서,
상기 PVR과 4-1BBL은 링커를 통해 결합하는 것인, 융합단백질.
제 4항에 있어서,
상기 링커는 1개 내지 100개의 아미노산으로 연결되는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
제 5항에 있어서,
상기 링커는 ILZ, TNC 및 Ig로 이루지는 군으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
제 6항에 있어서,
상기 ILZ는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 TNC는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 Ig는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질이 2개 이상 결합된 복합체 형태를 이루는 융합단백질 복합체.
제 8항에 있어서,
상기 복합체 형태가 이량체인 것을 특징으로 하는, 융합단백질 복합체.
제 8항에 있어서,
상기 복합체 형태가 삼량체인 것을 특징으로 하는, 융합단백질 복합체.
제 8항에 있어서,
상기 복합체 형태가 육량체인 것을 특징으로 하는, 융합단백질 복합체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 12항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15 내지 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 염기서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
제12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제14항의 발현벡터가 도입된 형질전환체.
i) 제15항의 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
ii) 상기 배양물로부터 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질의 생산방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 면역증강제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 항암제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합단백질 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법.