MXPA00004017A - Generacion rapida de lineas celulares de estables de mamifero que producen altos niveles de proteinas recombinantes - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos, secuencias de ADN, vectores y líneas celularesútiles para la generación rápida de líneas celulares estables de mamífero que expresan altos niveles de proteínas recombinantes.

Description

GENERACIÓNRÁPIDADE LINEAS CELULARES ESTABLES DE MAMÍFERO QUE PRODUCEN ALTOS NIVELES DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES.

Cam o de la Invención La presente invención se relaciona con un nuevo método para la generación de líneas celulares estables de mamífero, las cuales producen altos niveles de proteínas recombinantes, y a las líneas celulares y vectores que son apropiados para usarse en tales métodos.

Antecedientes de la Invención Las líneas celulares de mamífero, tales como las líneas celulares de ovario de hámster Chino (CHO) se emplean con frecuencia para la producción de proteínas recombinantes. En i tales métodos es deseable generar líneas celulares estables y ser capaces de general- tales líneas celulares estables y altamente productoras en un periodo de tiempo relativamente corto. La generación de tales líneas celulares hace posible la producción rápida de cantidades de proteína tecotnbinante en una escala útil para propósitos de evaluación biológica y producción comercial.

Objetivos de la Invención La presente invención se refiere a nuevos vectores mamíferos de expresión que permiten el establecimiento en un periodo de tiempo relativamente rápido, preferiblemente tan certo cotao "aproximadamente 4 semanas, de líneas celulares estables de mamífero que producen altos niveles de proteínas recombinantes secretadas y unidas a membrana. En una modalidad preferida de la invención, las líneas celulares de mamífero son de origen de ovario de hámster Chino (CHO). En una modalidad, la presente invención comprende secuencias de ADN recombinante y ¡olásmidos de expresión de genes útiles para la generación de líneas celulares estables. Las modalidades preferidas comprenden las secuencias de ADN recombinante de los plásmidos de expresión de genes pHTOP o pHTOPó. En otras modalidades^ la invención comprende vectores de ADN recombinante que comprenden un gene que codifica para un factor de transcripción quimérico [tTA], tTA que puede comprender una fusión de una proteínas de represor de tetraciclina de E. Coli [tet R] para un dominio de activación transcripcional de virus 16 de herpes simplex (VP16); y un vector que comprende un promotor mínimo precedido por secuencias de operador tet múltiples [tet O]. El vector pHTop cuando se transfecta en la línea celular CHO/A2 conduce a una expresión muy eficiente de un gene clonado dentro de éste, así como aquel del DHFR presente en el mismo mensaje policistrónico. Usando un protocolo de selección de MTX astringente, pueden aislarse clonas de alta expresión y expandirse en un mes. Para cinco genes probados, los niveles de expresión son mayores que los niveles de expresión transitoria de COS. Los niveles de expresión pueden ser amplificados haciendo crecer células en concentraciones crecientes de MTX. Se ha demostrado que la estabilidad de la expresión puede conservarse durante cuando menos tres semanas en la ausencia de selección. El nivel de expresión alcanzado a través de un protocolo de selección de una etapa varía de. gene a gene. Se han observado niveles de proteína secretada que varían de 1 a 14 µg/ml. La selección mediante MTX astringente generalmente produce clonas que expresan niveles uniformes de proteína, eliminando la necesidad de tamizar grandes números de clonas. Tanto las proteínas secretadas como las de membrana pueden ser expresadas en altos niveles usando el vector pHTop. El protocolo perfilado para el establecimiento de líneas celulares estables de CHO descrito en la presente invención puede emplearse como una alternativa para transfecciones de CGS a gran escala. Las células de CHO crecen bien en medios libres de suero y medios acondicionados se generan fácilmente para purificación de proteínas nuevas, por ejemplo, dicho protocolo puede acelerar la generación de líneas celulares estables en la búsqueda de una función.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es un diagrama del sistema de expresión susceptible de regulación, caracterizado por Gossen y Bujard. Este sistema de expresión está basado en dos elementos: un factor de transcripción quimérico (tTA), el cual es una fusión entre el represor (/e/R) de teíraciclina de E. Coli y el dominio transcripcional del virus 16 del herpes simplex (VP16); y un vector en el que un promotor mínimo que provee una casilla TATA está precedido por secuencias de operador tet múltiples (tetO). Cuando el transactivador quimérico es expresado. su dominio de tetR se une a la secuencia de tetO. Esto, a su vez, lleva al fuerte dominio de activación VP16 en la proximidad hacia el complejo de transcripción basal y lo activa. Esta interacción puede ser revertida a través de la acción de la tetraciclina, la cual puede por lo tanto ser usada como un interruptor para "apagar" la transcripción. En la ausencia de la tetraciclina, la expresión es "encendida." La Figura 2a es un diagrama que muestra el complejo de iniciación basal con el promotor mínimo en el sistema de expresión. La Figura 2b muesti-a el complejo de iniciación activado. La Figura 3 es un diagrama de plásmido de pED6. El pED6 es un plásmido de 5,354 pares de bases, conteniendo una unión entre las secuencias de DHFR y del líder EMC. La Figura 4 es un diagrama de plásmido que demuestra la construcción de un plásmido de expresión mínima AdMLP [pED6 min]. El origen y mej orador SV40, así como también ei promotor tardío mayor Adenoviral hasta 8 bp desde la casilla TATA han sido enlazados fuera de ?ED6, una deleción de 575 bp. Un único sitio Xhol es insertado para permitir la inserción I D de tetO. La Figura 5 es un diagrama que muestra la construcción de pHTopó a partir de pED6. Enseguida a la construcción de pEDómin, las secuencias de 6 tetO son ligadas dentro del sitio Xhol para formar pTOP6. Luego las secuencias de HBV poly A son insertadas corriente arriba de las secuencias de tetO. 0 La Figura 6 es un diagrama de plásmido de pHTOP. El pHTOP es un plásmido de 5,639 bp en el que la unión del líder EMC/DHFR de pHTOP6 está cambiada para "mutilar''' la traducción de DHFR sin afectar el nivel de expresión del gene corriente arriba. Esto permite la conservación de la selección astringente sin el uso de altos niveles del metotrexato [MTX]. La Figura 7 es un diagrama de plásmido de pZtTA. El PZtTA es un plásmido de 6,420 2D bp que es usado para construir una línea celular de CHO transactivadora. Con el propósito de construir tal línea celular, el pZtTA es electroforado en células de CHO. Después de la electrofsración, 24 clonas se seleccionan en la presencia de 1 ug/ml de G418. Estas 24 clonas ser entonces transfectadas transitoriamente en pTOP6 conteniendo el gene de CAT [pTOPóCAT] para la selección. Las clonas transfectadas son probadas en cuanto a actividad C de CAT. El nivel de actividad es comparado con aquel obtenido transfectando pTOP6CAT y pEDtTA en células de CHO.

La Figura 8 es un diagrama que muesü-a la derivación de un línea celular de CHO que expresa tTA, CHO/A2, como se describió en la descripción de la Figura 7 anterior. La Figura 9 es una gráfica que muestra la expresión transitoria de la fosfatasa alcalina secretada por el gene reportero (SEAP) en dos líneas celulares, pEDSEAP y pHTOPSEAP. La expresión de SEA es monitoreada usando un ensayo de quimioluminiscencia muy sensible. 0.05, 0.1 y 0.2 ug de pEDSEAP y pHTOPSEAP fueron cada uno lipofectado en la línea celular CHO/A2. Se determinó la actividad de SEA en cuentas por segundo [CPS], las cuales son proporcionales a la actividad de SEA en el intervalo mostrado en la gráfica. En los experimentos de transfección transitoria mostrados en la Figura 9, se demostró que el promotor susceptible de regulación tet es aproximadamente 5 veces más fuerte que el promotor tardío mayor adenoviral. La Figura 10 es una gráfica que muestra la expresión transitoria de SEA en células adenoviralmente transfectadas con pED6SEAP y pHTOP6SEAP, y pHTOP6SEAP en la presencia de Doxiciclina, un análogo de la tetraciclina. Otra vez, se mostró que la SEA es expresada aproximadamente 5 veces con más fuerza bajo las regulación de pHTOP6 que bajo pED6. La adición de Dox inhibe completamente la expresión de ADN por el promotor de tet.

La Figura 11 es una gráfica que compara el nivel de expresión estable de SEA en líneas celulares CHO/A2 transfectadas con pED6SEAP y pHTOP6SEAP. Las clonas fueron recolectadas en las concentraciones más altas posibles de MTX para cada vector [MTX 0.1 uM para. CHO/ED6SEAP; MTX 0.5 uM para CHO/A2/HTOP6SEAP]. El nivel de expresión observado en la concentración con MTX fue de aproximadamente 30 veces más alto que aquel observado en las clonas recolectadas en alfa [sin MTX]. El nivel de expresión en pHTOPSEAP es aproximadamente 3 veces más alto que aquel para pED6SEAP. El nivel de expresión es estas clonas es muy alto para las líneas celulares de CHO, tan alto como aquel obtenida en transfecciones transitorias de COS-1. _ La Figura 12 es un diagrama de un protocolo perfilado para una selección de linca celular CHO de una etapa usando el vector pHTOP y la línea celular transactivadora CHO/A2.

La Figura Í3 es en análisis Western blot de células CHO expresando establemente hGDF-9, las cuales fueron establecidas mediante transfección usando el vector pHTOP. 48 horas después de la transfección, las células fueron colocadas en placa para la formación de colonias en MTX 0.02 y 0.1 uM. Después de dos semanas, las clonas fueron recolectadas de cada concentración de MTX. Las células fueron hechas crecer para confluir y medio acondicionado y libre de suero, de 24 horas, fue cosechado para el análisis Western usando un anticuerpo policlonal específico de GDF-9 seguido de detección por quimioluminiscencia. Las clonas seleccionadas en MTX 0.1 uM (bandas 1 1-16) expresaron niveles más elevados de GDF-9 en comparación con las clonas seleccionadas en MTX 0.02 uM (bandas 1-10). Las clonas seleccionadas en la concentración de MTX más baja desplegaron un rango de expresión más ancho. Sin embargo los niveles de expresión de GDF-9 fueron muy uniformes para clonas seleccionadas en MTX 0.1 uM. Así, la selección astringente incrementando la concentración de metotrexato produjo clonas que expresaban uniformemente niveles altos de protema. La Figura 14 es una gráfica que muestra que el nivel de expresión obtenido con selección de una etapa varía de gene a gene. Las células CHO que expresan de manera estable formas secretadas de mCD28, mB7.2 o mCTLA4 [todas como proteínas de fusión de mIgG2a] se establecieron usando el vector phTOP. Las clonas fueron seleccionadas en MTX 0.05 uM. hechas crecer para confluir y medio acondicionado y libre de suero, de 24 horas, fue cosechado para el análisis ELISA de mIgG2a. Para los tres genes expresados, las clonas de mCTLA4 produjeron los niveles de proteína más altos [13 ug/ml] seguidas por mCD28 [8 ug/ml] y mB7.2 [3 ug/ml]. La Figura 15 es un Análisis Western Blot que muestra una comparación de sistemas de expresión de mamíferos. Las bandas 1 a 9 muestran el efecto de la amplificación gradual de células CHO establemente transfectadas con pEDBMP-2. Las bandas 10 a 16 muestran el efecto de la selección de una etapa de células CHO establemente transfectadas con pHTOPBMP-2. Las bandas 17 y 18 muestran la transfección transitoria de COS con pEDBMR-2 y una transfección simulada. _ _ La Figura 16 demuestra los vectores de dos vectores de expresión eficiente. El pED utiliza el promotor tardío mayor de adenovirus [AdMLP] para la iniciación de la transcripción. Contiene el origen SV40 de replicación para la expresión transitoria en células COS. Un intron híbrido es seguido por sitios de clonación única para la inserción de ADNcs. Un sitio de iniciación ribosomal interno (líder EMCV) precediendo el marcador susceptible de selección, DHFR, permite que el marcador sea traducido independientemente a partir de un mensaje poíicistronico único. Para preparar pHTop, el vector pED fue modificado de manera que los elementos promotor y mej orador SV40 y AdMLP fueran eliminados y solamente la casilla TATA y 35 bp corriente arriba del sitio de inicio transcripcional permanecieran [pEDmin]. En su lugar fueron insertadas 6 repeticiones de la secuencia operadora. Este vector [pTOP] es ahora controlado únicamente mediante el transactivador [tTA] a través de su interacción entre el represor de tet y el operador de tet y puede usarse tetraciclina para activar y desactivar la transcripción. Además, el sitio de poliadenilación de hepatitis fue insertado corriente arriba de la secuencia del operador de tet para prevenir la posible interferencia de promotores crípticos dentro de la columna vertebral del plásmido.

Descripción Detallada de la Invención Los vectores de la presente invención hacen uso de fuertes elementos transcripcionales activados mediante una construcción de transactivador quimérico establemente expresado en una línea, celular de mamífero recipiente. En una modalidad preferida, los fuertes elementos transcripcionales comprenden múltiples copias del operador de tet ubicado corriente arriba y adyacente a una secuencia "TATA" mínima de mamífero. Esta quimera forma un fuerte promotor mamífero. En una modalidad preferida adicional; este fuerte promotor dirige la síntesis de un mensaje policistrónico, en el cual la expresión de un marcador de resistencia, tal como el gene de resistencia al dihidrofolato [DHFR], es ligada a la expresión del gene de interés, permitiendo la selección de clonas de elevada expresión en un proceso de selección de una sola etapa. En una modalidad preferida, una parte de una secuencia líder apropiada, tal como el líder del virus EMC [EMCV], puede ser usada para el funcionamiento eficiente de este mensaje policistrónico. La secuencia líder de EMCV puede obtenerse, por ejemplo, a partir de pMT2-ECATl [S.K. Jung, et al., J. Virol 63:1651-1660 (1989)]. La descripción de este documento se incorpora a la presente como referencia. El uso combinado de este fuerte promotor de quimera, el cual produce un mensaje policistrónico con un marcador de resistencia susceptible de selección, con una célula hospedera que expresa un transactivador quimérico, permite la selección rápida de líneas celulares que producen altos niveles de proteína recombinante en una etapa. Se han obtenido niveles de proteína secretada de hasta aproximadamente 50 ug/ml usando este método de selección de una etapa. Clonas astringentemente seleccionadas en altos niveles de metotrexato [MTX] producen niveles uniformes de proteína, eliminando la necesidad de tamizar grandes números de clonas. Si bien el nivel de producción obtenido con ia etapa de selección inicial es variable de gene a gene, los niveles pueden ser amplificados incrementando la concentración de MTX. Además, los niveles de producción son estables en la presencia de selección o durante cuando menos 3 semanas cuando la presión de selección es retirada. El presente sistema tiene la ventaja de desarrollar líneas celulares estables mucho más rápidamente que lo que anteriormente era posible usando la amplificación gradual usual [aproximadamente 1 mes en comparación con aproximadamente 4 meses]. Además, niveles de producción más altos pueden ser obtenidos con este sistema en comparación con la expresión transitoria en células COS. En consecuencia, la presente invención provee métodos para el desarrollo de líneas celulares estables y de alta expresión, en forma rápida y fácil, satisfaciendo la largamente existente necesidad de tales sistemas entre expresión transitoria en células COS [labor rápida pero intensa para la producción a gran escala de proteínas] y expresión estable mediante amplificación gradual [lenta y de gran trabajo]. El sistema de expresión está basado en el uso combinado de dos elementos: un factor de transcripción quimérico (tTA], el cual es una fusión entre el represor de tetraciclina de E. Coli [tetR] y el dominio transcripcional del virus 16 de herpes simplex (VP16), y un vector en el que el promotor mínimo que provee una casilla TATA es precedido por las secuencias del operador tet múltiples [tet O]. Estos operadores portan el fuerte dominio de activación de VP16 en la proximidad inmediata del complejo de transcripción basal, activándolo. Esta interacción puede ser revertida a través del uso de la tetraciclina, la cual puede por lo tanto ser usada como un interruptor para "apagar" la transcripción. En la ausencia de la tetraciclina, la expresión es "activada." Sin embargo, el presente método no requiere que esta regulación sea usada. Así, en una modalidad, la presente invención comprende un plásmido en el que el promotor mínimo está operativamente unido a una secuencia líder que a su vez está operativamente unida a un gene de DHFR. Corriente arriba de la secuencia líder se encuentra uno o más sitios de restricción apropiados para la inserción de un gene que codifica para una proteína deseada para expresión. En una modalidad preferida, se utiliza el plásmido pHTOP6, el cual es creado a partir del plásmido pED como se describe aquí más adelante. El plásmido pHTOP también es útil en la presente invención. En pHTOP, la unión entre el líder EMCV y el gene DHFR fue alterada para deteriorar la traducción de DHFR sin afectar el nivel de expresión del gene corriente arriba. Para la producción de grandes proteínas, en donde pueden esperarse bajos niveles de expresión de DHFR, el pHTOPó puede ser el vector preferido. Los métodos de la presente invención son útiles para la producción de ambas proteínas, secretada y de membrana. Los métodos de esta invención pueden ser usados como una alternativa para transfecciones de COS a gran escala. En la modalidad preferida en donde se utilizan las células CHO, las células pueden ser hechas crecer en medio libre de suero para la purificación de proteínas. Una línea celular transactivadora útil como una línea celular de mamífero, recipiente, puede derivarse mediante transfección de un factor de transcripción quimérico, tal como tTA, descrito anteriormente, dentro de líneas celulares adecuadas, tales como una línea celular CHO. En una modalidad preferida, se usa la línea celular DUKX Bl l de CHO, la cual es deficiente en DHFR y por lo tanto normalmente no es capaz de sobrevivir en la presencia de selección por metoü-exato. Un diagrama de tal proceso se muestra en las Figuras 10 y 1 1. El plásmido pHTOP-X, en donde X es la secuencia de codificación para la proteína que va a ser expresada, se prepara y transfecta dentro de la línea celular transactivadora, y se tamiza como se ilustra en la Figura 15. Así, en una modalidad, la presente invención comprende secuencias de ADN recombinante que comprenden la secuencia de ADN de pHTO? o pHTOPó. En ohas modalidades, la presente invención comprende métodos para la producción de una línea celular de mamífero, recombinante y estable, dicho método comprendiendo: (1) transfección de una línea celular de mamífero recipiente con un vector plásmido para formar una línea celular de mamífero, recipiente, transfectada, dicho vectoi plásmido comprendiendo (a) un promotor mínimo precedido por operadores tet múltiples; (b) una secuencia líder capaz de dirigir la expresión eficiente de un mensaje policistrónico; y (c) un mensaje policistrónico que comprende un primer ADN codificando para una proteína de interés y una segunda secuencia de ADN que codifica para un gene marcador susceptible de detección, y dicha línea celular de mamífero, recipiente, comprendiendo (1) un factor de transcripción quimérico, el cual comprende una fusión de una o más copias de un represor de tetraciclina de E. Coli; (2) un dominio transcripcional del virus 16 de herpes simplex; y (3) un vector que comprende un promotor mínimo precedido por múltiples secuencias operador de tet; y (B) aislar la línea celular de mamífero, recipiente y transfectada que resulta. La línea celular transfectada pude opcionalmente ser cultivada para uso posterior.

Los ejemplos siguientes describen algunas de las modalidades preferidas de la presente invención. A. En amplificación gradual se observó lo siguiente: células DUKX de CHO fueron transfectadas establemente con pEDBMP-2. Las células fueron colocadas en placa para la formación de colonias en medio alfa 48h después de la transfección. Después de 2 semanas, las clonas fueron recolectadas, hechas crecer en MTX 0.2:M hasta ser estables (4 semanas) posteriormente fueron transferidas a MTX 0.1 :M y hechas crecer durante 4 semanas. Medio acondicionado sin suero (24 h) fue cosechado de células de confluencia para análisis Western.

B. En la presente selección de una etapa, células DUKX/A2 de CHO fueron establemente transfectadas con pHTopBMP-2. 48h después de transfección, las células fueron colocadas en placa para la formación de colonias en MTX 0.1 M y 1 mg/ml de medio G418.

Dos serffanas más tarde, las clonas fueron recolectadas, hechas crecer hasta confluencia y medio acondicionado libre de suero fue cosechado de células de confluencia para análisis Western. C. Se realizaron Uansfecciones transitorias de COS usando células COS-1 transfectadas transitoriamente con pEDBMP-2. 48-72 horas después de la transfección. medio acondicionado libre de suero fue cosechado para análisis Western. Análisis Western: Medio acondicionado 10:1 procedente de los protocolos A, B y C anteriores fue corrido en un gel SDS-PAGE al 16% bajo condiciones reductoras y transferido a nitrocelulosa mediarte Western blot. La BMP-2 fue detectada con un anticuerpo policlonal específico de Bl 4P-2 seguido de detección por quimioluminiscencia. Clonas establecidas por amplificación gradual usando vector pED desplegaron un amplio rango de expresión de BMP -2. En contraste, clonas recolectadas en la selección de una etapa usando el vector pHTop mostraron expresión de BMP -2 más elevada y más uniforme. El nivel de BMP -2 expresada en forma transitoria en células COS fue mucho más baja que la que se observó en las clonas de pHTop. Líneas celulares estables de CHO establecidas usando selección de una etapa desplegaron en forma consistente niveles de expresión más altos en comparación con la amplificación gradual de CHO o transitoria de COS. Además, los niveles de expresión logrados con la selección de una sola etapa fueron más uniformes. Líneas celulares de CHO que expresaban establemente una forma secretada de una proteína de fusión de mB7.1-m!gG2a fueron establecidas mediante transfección usando el vector pHTop. Las clonas seleccionadas en MTX 0.1 :M fueron hechas pasar dos veces por semana en la presencia o ausencia de selección (MTX y G418) durante 3 semanas. Medio acondicionado y sin suero (24h) fue cosechado de células de confluencia en 1, 2 y 3 semanas y se analizó mediante "Western blot usando un anticuerpo HRP de anti-mIgG2a seguido de detección por quimioiununiscencia. Los niveles de expresión permanecieron constantes durante cuando menos 3 semanas cuando la selección se retiró de las células seleccionadas en altas concentraciones de metotrexato. Células CHO que expresan en forma estable un forma secretada de una proteína de fusión de hCD28-h?gG4 fueron establecidas por transfección usando el vector pHTop. Las clonas fueron seleccionadas en MTX 0.1 :M, posteriormente hechas crecer en MTX 0.5 :M durante 3 semanas. Medio acondicionado y sin suero (24h) cosechado de células de confluencia fue analizado por Western blot usando anticuerpo de anti-hlgG-HRP seguido de detección por quimioluminiscencia. Cada banda representa medio acondicionado 101 o prcteíiia hIgG4 purificada para cuantificación. Se midieron mediante ELISA de h!gG4 los niveles de expresión para medio acondicionado procedente de las tres clonas de más alta expresión (2, 3, 5). Las clonas seleccionadas en MTX 0.1 :M que expresan aproximadamente l-2:g/ml de hCD28/hIgg4 mostraron un incremento importante (5-10 veces) en la expresión de hCD28, mientras que dos clonas (#1,40) mostraron un incremento moderado en la expresión. Los niveles de expresión de las células seleccionadas en altas concentraciones de metotrexato pueden ser amplificados incrementando la concentración del ir.etotrexato. Líneas celulares de CHO fueron establecidas transfectando pHTopmuFrzb-1 (Frazzled de muriólo) y seleccionando clonas en MTX 0.05 :M. 2 acumulaciones de colonias que sobrevivieron a MTX 0.1 uM fueron también establecidas Las células fueron marcadas durante 6 hr con 35S Metionina/Cisteina y medio acondicionado fue cosechado y analizado mediante SDS-PAGE. Cada banda representa 50 µl de medio acondicionado procedente de las clonas y acumulaciones. La expresión de clonas individuales seleccionadas en MTX 0.05:M fue uniforme y la expresión de las 2 acumulaciones fue tal alta como aquella de las clonas individuales. Debido a la uniformidad de expresión de las clonas individuales bajo condiciones de selección astringente, es posible acumular colonias sin comprometer la expresión, por lo tanto, acelerando la última etapa en la generación de líneas celulares estables. Líneas celulares de CHO que expresaban en forma estable CCR5 fueron establecidas mediante transfección usando el vector pHTop. Las clonas seleccionadas en MTX 0.02:M fueron analizadas para la expresión de CCR5 mediante análisis de FACS. Las células transfectadas fueron teñidas usando un anticuerpo monoclonal de anti-CCR5 (clona 45531.1 11 de R&D) o mi isotipo lgG2a de murino para células de control no-transfectadas, seguido por un anticuerpo de lgG de anti-murino conjugado con PE. De las 13 clonas tamizadas por expresión de CCR5, 11 clonas expresaban CCR5 como se dernosftó mediante m incremento de logaritmo de 2 de la fluorescencia sobre las células de control transfectadas. Solamente 2 clonas no mostearon expresión de CCR5 por encima del fondo. El sistema de selección de una etapa también puede ser usado para expresar proteínas de transmembrana. Los ejemplos y figuras en las siguientes páginas ilustran la práctica de la presente invención en la generación de líneas celulares estables de mamífero, las cuales producen altos niveles de proteínas recombinantes, usando líneas celulares y vectores que constituyen parle de ia invención, los cuales son adecuados para su uso en tal método. En los ejemplos, se demostró que la presente invención es efectiva para la producción eficiente de proteínas recombinantes. Un gran número de modificaciones y variaciones serán claras para el artesano capacitado a partir de la lectura de esta descripción y los ejemplos. Tales modificaciones y variantes constituyen parte de la invención, y los ejemplos no son limitativos.

LISTADO DE SECUENCIAS I) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: GENETICS INSTITUTE, INC. (ü! TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GENERACIÓN RÁPIDA DE LÍNEAS CELULARES ESTABLES DE MAMÍFERO QUE PRODUCEN ALTOS NIVELES DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES . liii) NUMERO DE SECUENCIAS: 1 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) REMITENTE: GENETICS INSTITUTE, INC. (B) CALLE: 87 CAMBRIDGEPARK DRIVE (C) CIUDAD: CAMBRIDGE (D) ESTADO: Massachusetts (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 02140 (v) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Floppy disk (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible _' (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #I.O, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: EUA XXXX (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE : (A) NOMBRE: LAZAR, STEVEN R. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 32,618 I (C) NÚMERO DE REREFENCIA/EXPEDIENTE : GI5310A-PCT (ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES: (A) TELÉFONO: (617) 498-8260 (B) TELEFAX: (617) 876-5851 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5639 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal di) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genomico) ( i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: AGCTCGAGC GCGGGACGTC CTTTGTTTAC GTCCCGTCGG CGCTGAATCC CGCGGACGAC 60 CCCTCTCGGG GCCGCTTGGG AGTCTCTCGT CCCCTTCTCC GTCTGCCGTT CCAGCCGACC 120 ACGGGGCGCA CCTCTCTTTA CGCGGTCTCC CCGTCTGTGC CTTCTCATCT GCCGGTCCGT 180 GTGCACTTCG CTTCACCTCT GCACGTTGCA TGGAGACCAC CGTGAACGCC CATCAGATCC 240 TGCCCAAGGT CTTACATAAG AGGACTCTTG GACTCTCAGC AATGTCAACG ACCGACCTTG 300 AGGCCT7?CTT CAAAGACTGT GTGTTTAAGG ACTGGGAGGA GCTGGGGGAG GAGATTAGGT 36QT TAAAGGTCTT TGTATTAGGA GGCTGTAGGC ATAAATTGGT CTGCGCACCA GCACCATGCA 420 ACTTTTTCAC CTCTGCCTAA TCATCTCTTG TACATGTCCC ACTGTTCAAG CCTCCAAGCT 480 GTGCCTTGGG TGGCTTTGGG GCATGGACAT TGACCCTTAT AAAGAATTTG GAGCTACTGT 540 ~ GGAGTTACTC TCGTTTTTGC CTTCTGACTT CTTTCCTTCC GTCAGCTCGA GTTTACCACT 600 CCCTATCAGT GATAGAGAAA AGTGAAAGTC GAGTTTACCA CTCCCTATCA GTGATAGAGA 660 AAAGTGAAAG TCGAGGTCGA GTTTACCACT CCCTATCAGT GATAGAGAAA AGTGAAAGTC 720 GAGGTCGAGT TTACCACTCC CTATCAGTGA TAGAGAAAAG TGAAAGTCGA GTTTACCACT 780 CCCTATCAGT GATAGAGAAA AGTGAAAGTC GAGGTCGAGT TTACCACTCC CTATCAGTGA 840 TAGAAAAGTG AAAGTGAAAG TCGAGGTCGA GTCGAGGGGG GCTATAAAAG GGGGTGGGGG 90D CGCGTTCGTC CTCACTCTCT TCCGCAICGC TGTCTGCGAG GGCCAGCTGT TGGGCTCGCG 96U— GTTGAGGACA AACTCTTCGC GGTCTTTCCA GTACTCTTGG ATCGGAAACC CGTCGGCCTC 102Q_ CGAACGGTAC TCCGCCACCG AGGGACCTGA GCGAGTCCGC ATCGACCGGA TCGGAAAACC 1080 TCTCGACTGT TGGGGTGAGT ACTCCCT-CTC AAAAGCGGGC ATGACTTCTG CGCTAAGATT 1140 GTCAGTTTCC AAAAACGAGG AGGATTTGAT ATTCACCTGG CCCGCGGTGA TGCCTTTGAG 1200 ^ GGTGGCCGCG TCCATCTGGT CAGAAAAGAC AATCTTTTTG TTGTCAAGCT TGAGGTGTGG 1260 "" CAGGCTTTGAG ATCTGGCCAT ACACTTGAGT GACAATGACA TCCACTTTGC CTTTCTCTCC 1320 ACAGGTGTCC ACTCCCAGGT CCAACTGCAG GTCGACTCTA GACCCGGGGA ATTCTAACGT 1380 TACTGGCCGA AGCCGCTTGG AATAAGGCCG GTGTGCGTTT GTCTATATGT TATTTTCCAC 1440 CATATTGCCG TCTTTTGGCA ATGTGAGGGC CCGGAAACCT GGCCCTGTCT TCTTGACGAG 1500 CATTCCTAGG GGTCTTTCCC CTCTCGCCAA AGGAATGCAA GGTCTGTTGA ATGTCGTGAA 1560 GGAAGCAGTT CCTCTGGAAG CTTCTTGAAG ACAAACAACG TCTGTAGCGA CCCTTTGCAG 1620 GCAGCGGAAC CCCCCACCTG GCGACAGGTG CCTCTGCGGC CAAAAGCCAC GTGTATAAGA 1680^ TACACCTGCA AAGGCGGCAC AACCCCAGTG CCACGTTGTG AGTTGGATAG TTGTGGAAAG 1740 AGTCAAATGG CTCTCCTCAA GCGTATTCAA CAAGGGGCTG AAGGATGCCC AGAAGGTACC 1800 _ CCATTGTATG GGATCTGATC TGGGGCCTCG GTGCACATGC TTTACATGTG TTTAGTCGAG 186Q- GTTAAAAAAC GTCTAGGCCC CCCGAACCAC GGGGACGTGG TTTTCCTTTG AAAACACG 1920 TTGCTCGAGC CATCATGGTT CGACCATTGA ACTGCATCGT CGCCGTGTCC CAAAATATGG 198Q GGATTGGCAA GAACGGAGAC CTACCCTGGC CTCCGCTCAG GAACGAGTTC AAGTACTTCC 2040 AAAGAATGAC CACAACCTCT TCAGTGGAAG GTAAACAGAA TCTGGTGATT ATGGGTAGGA 210Q AAACCTGGTT CTCCATTCCT GAGAAGAATC GACCTTTAAA GGACAGAATT AATATAGTTC 216Q_ TCAGTAGAGA ACTCAAAGAA CCACCACGAG GAGCTCATTT TCTTGCCAAA AGTTTGGATG 2220" ATGCCTTAAG ACTTATTGAA CAACCGGAAT TGGCAAGTAA AGTAGACATG GTTTGGATAG 2280- TCGGAGGCAG TTCTGTTTAC CAGGAAGCCA TGAATCAACC AGGCCACCTC AGACTCTTTG 2340- TGACAAGGAT CATGCAGGAA TTTGAAAGTG ACACGTTTTT CCCAGAAATT GATTTGGGGA 2400 AATATAAACT TCTCCCAGAA TACCCAGGCG TCCTCTCTGA GGTCCAGGAG GAAAAAGGCA 2460- TCAAGTATAA GTTTGAAGTC TACGAGAAGA AAGACTAACA GGAAGATGCT TTCAAGTTCT 2520_ CTGCTCCCCT CCTAAAGCTA TGCATTTTTT ATAAGACCAT GGGACTTTTG CTGGCTTTAG 2580 ATCATAATCA GCCATACCAC ATTTGTAGAG GTTTTACTTG CTTTAAAAAA CCTCCCACAC 2640 ~ CTCCCCCTGA ACCTGAAACA TAAAATGAAT GCAATTGTTG TTGTTAACTT GTTTATTGCA 2700 GCTTATAATG GTTACAAATA AAGCAATAGC ATCACAAATT TCACAAATAA AGCATTTTTT 2760 TCACTGCATT CTAGTTGTGG TTTGTCCAAA CTCATCAATG TATCTTATCA TGTCTGGATC 2820 CCCGGCÜAAC GGTCTGGTGA CCCGGCTGCG AGAGCTCGGT GTACCTGAGA CGCGAGTAAG 2880 CCCTTGAGTC AAAGACGTAG TCGTTGCAAG TCCGCACCAG GTACTGATCA TCGATGCTAG 2940 ACCGTGCAAA AGGAGAGCCT GTAAGCGGGC ACTCTTCCGT GGTCTGGTGG ATAAATTCGC 3000 AAGGGTATCA TGGCGGACGA CCGGGGTTCG AACCCCGGAT CCGGCCGTCC GCCGTGATCC 3050 ATCCGGTTAC CGCCCGCGTG TCGAACCCAG GTGTGCGACG TCAGACAACG GGGGAGCGCT 3120 CCTTTTGGCT TCCTTCCAGG CGCGGCGGCT GCTGCGCTAG CTTTTTTGGC GAGCTCGAAT 3180 TAATTCI-GCA TTAATGAATC GGCCAACGCG CGGGGAGAGG CGGTTTGCGT ATTGGGCGCT 3240 CTTCCGCTTC CTCGCTCACT GACTCGCTGC GCTCGGTCGT TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT 3300 CAGCTCACTC AAAGGCGGTA ATACGGTTAT CCACAGAATC AGGGGATAAC GCAGGAAAGA 3360 ACATGTGAGC AAAAGGCCAG CAAAAGGCCA GGAACCGTAA AAAGGCCGCG TTGCTGGCGT 3420 TTTTCCATAG GCTCCGCCCC CCTGACGAGC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT 3480 GGCGAAACCC GACAGGACTA TAAAGATACC AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC TCCCTCGTGC 3540 GCTCTCCTGT TCCGACCCTG CCGCTTACCG GATACCTGTC CGCCTTTCTC CCTTCGGGAA 3600 GCGTGGCGCT TTCTCAATGC TCACGCTGTA GGTATCTCAG TTCGGTGTAG GTCGTTCGCT 366CL CCAAGCTGGG CTGTGTGCAC GAACCCCCCG TTCAGCCCGA CCGCTGCGCC TTATCCGGTA 3720 ACTATCGTCT TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC ACGACTTATC GCCACTGGCA GCAGCCACTG 3780" GTAACAGGAT TAGCAGAGCG AGGTATGTAG GCGGTGCTAC AGAGTTCTTG AAGTGGTGGC 3840 CTAACTACGG CTACACTAGA AGGACAGTAT TTGGTATCTG CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA 39Q0 CCTTCGGAAA AAGAGTTGGT AGCTCTTGAT CCGGCAAACA AACCACCGCT GGTAGCGGTG 3960 GTTTTTTTGT TTGCAAGCAG CAGATTACGC GCAGAAAAAA AGGATCTCAA GAAGATCCTT 4020 TGATCTTTTC TACGGGGTCT GACGCTCAGT GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTGG 4080 TCATGAGATT ATCAAAAAGG ATCTTCACCT AGATCCTTTT AAATTAAAAA TGAAGTTTTA 4140 AATCAATCTA AAGTÁTATAT GAGTAAACTT GGTCTGACAG TTACCAATGC TTAATCAGTG 4200 AGGCACCTAT CTCAGCGATC TGTCTATTT.C GTTCATCCAT AGTTGCCTGA CTCCCCGTCG 4260 TGTAGATAAC TACGATACGG GAGGGCTTAC CATCTGGCCC CAGTGCTGCA ATGATACCGC 4320 GAGACCCACG CTCACCGGCT CCAGATT.TAT CAGCAATAAA CCAGCCAGCC GGAAGGGCCG 4380 AGCGCAGAAG TGGTCCTGCA ACTTTATCCG CCTCCATCCA GTCTATTAAT TGTTGCCGGG 4440 AAGCTAGAGT AAGTAGTTCG CCAGTTAATA GTTTGCGCAA CGTTGTTGCC ATTGCTACAG 4500 GCATCGTGGT GTCACGCTCG TCGTTTGGTA. TGGCTTCATT CAGCTCCGGT TCCCAACGAT 4560 CAAGGCGAGT TACATGATCC CCCATGTTGT GCAAAAAAGC GGTTAGCTCC TTCGGTCCTC 4620 CGATCGTTGT CAGAAGTAAG TTGGCCGCAG TGTTATCACT CATGGTTATG GCAGCACTGC 4680 ATAATTCTCT TACTGTCATG CCATCCGTAA GATGCTTTTC TGTGACTGGT GAGTACTCAA 4740 CCAAGTCATT CTGAGAATAG TGTATGCGGC GACCGAGTTG CTCTTGCCCG GCGTCAATAC 4800 GGGATAATAC CGCGCCACAT AGCAGAACTT TAAAAGTGCT CATCATTGGA AAACGTTCTT 4860 CGGGGCGAAA ACTCTCAAGG ATCTTACCGC TGTTGAGATC CAGTTCGATG TAACCCACTC 4920 GTGCACCCAA CTGATCTTCA GCATCTTTTA CTTTCACCAG CGTTTCTGGG TGAGCAAAAA 4980 CAGGAAGGCA AAATGCCGCA AAAAAGGGAA TAAGGGCGAC ACGGAAATGT TGAATACTCA 504Q TACTCTTCCT TTTTCAATAT TATTGAAGCA TTTATCAGGG TTATTGTCTC ATGAGCGGAT 5100 ACATATTTGA ATGTATTTAG AAAAATAAAC AAATAGGGGT TCCGCGCACA TTTCCCCGAA 5160 AAGTGCCACC TGACGTCTAA GAAACCATTA TTATCATGAC ATTAACCTAT AAAAATAGGC 5220 GTATCACGAG GCCCTTTCGT CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA 5280 TGCAGCTCCC GGAGACGGTC ACAGCTTGTC TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC AGACAAGCCC 5340 GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT GTTGGCGGGT GTCGGGGCTG GCTTAACTAT GCGGCATCAG 5400' AGCAGATTGT ACT AGAGTG CACCATATGC GGTGTGAAAT ACCGCACAGA TGCGTAAGGA 546Q GAAAATACCG CATCAGGCGC CATTCGCCAT TCAGGCTGCG CAACTGTTGG GAAGGGCGAT 5520" CGGTGCGGGC CTCTTCGCTA TTACGCCAGC TGGCGAAAGG GGGATGTGCT GCAAGGCGAT 5580" TAAGTTGGGT AACGCCAGGG TTTTCCCAGT CACGACGTTG TAAAACGACG GCCAGTGCC 5639_

Claims (3)

1. Novedad de la Invención 1. Una secuencia de ADN recombinante que comprende la secuencia de ADN de pHTOP —
2. 2. Un vector de ADN recombinante que comprende: (a) un factor de Uanscripción quimérico, el cual comprende una fusión de un represor de tetraciclina de E. Coli con el dominio activador transcripcional del virus 16 del herpes simplex; y (b) un vector que comprende un promotor mínimo precedido por secuencias de operador tet múltiples.
3. 3. Un método para la producción de una línea celular de mamífero, recombinante y estable, dicho método comprendiendo: (A) transfección de mía línea celular de mamífero recipiente con un vector plásmido para formar una línea celular de mamífero recipiente, transfectada, (1) dicho vector plásmido comprendiendo: I D (a) un promotor mínimo precedido por múltiples operadores de tet; (b) una secuencia líder capaz de dirigir la expresión eficiente de un mensaje policistrónico; y (c) un mensaje policistrónico comprendiendo un primer ADN que codifica para una proteína de interés y una segunda secuencia de ADN que codifica para un gene marcador 0 susceptible de selección; (2) dicha línea celular de mamífero recipiente comprende un factor de transcripción quimérico que comprenden una fusión de un represor de tetraciclina de E. Coli y un dominio activador transcripcional del virus 16 de herpes simplex; y (B) aislamiento y opcionalmente cultivo de dicha línea celular de mamífero recipiente, 25 transfectada.