CN111218476B - 哺乳动物细胞表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种哺乳动物表达载体，采用SV40核心启动子作为筛选基因的启动子，结合筛选基因密码子非最优化并以核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列代替筛选基因起始密码子前Kozak序列的设计，改变筛选基因的翻译、转录水平，确保载体上的筛选基因的低水平表达，从而在该载体整合至宿主细胞的基因组之后，只有整合在适合外源基因高表达的位置的细胞株才能存活，不仅能够有效降低筛选细胞的数量，并且能够提高所筛选得到细胞株的表达能力。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种哺乳动物细胞表达载体及其构建方法与应用。
背景技术
蛋白质在合成过程中要经过翻译后的加工和修饰，才能成为有活性的蛋白质，其中，翻译后加工过程包括：磷酸化、糖基化、二硫键形成、酰基化和蛋白酶加工等。原核细胞不具备翻译后加工的能力，因此，原核细胞在表达真核生物蛋白时效果。酵母，植物，昆虫细胞虽然能对重组蛋白进行糖基化修饰，但其糖基化方式与哺乳动物细胞不同，有可能产生免疫原性。因此，开发以哺乳动物细胞、尤其是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)为宿主，获得高水平生产性细胞株的载体成为本领域的当务之急。
其中，采用CHO细胞表达既能保证重组蛋白质的正确糖基化和磷酸化，又能保证重组蛋白二硫键的正确配对和蛋白质的正确折叠，从而使由CHO细胞表达的重组蛋白与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物学功能。但是在一般情况下，外源基因在CHO细胞中的表达量很低，很难用于实际工业化生产，而且需要大量筛选细胞株，获得高产细胞株的效率较低。因此，有必要构建一种可使外源基因在哺乳动物细胞中获得高效、高水平的表达的表达载体系统。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种哺乳动物细胞表达载体，使外源基因在哺乳动物细胞中获得高效、高水平的表达。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种哺乳动物细胞表达载体，所述哺乳动物细胞表达载体包括有：筛选基因表达框和目的基因表达框；
所述筛选基因表达框包括筛选基因启动子和筛选基因序列组成；
所述筛选基因启动子为SV40核心启动子；所述筛选基因序列的5’端连接有如SEQID NO.2所示的富含A/T的序列，且不含有Kozak序列。
本发明的另一个目的是提供一种哺乳动物细胞表达载体的构建方法，具体技术方案如下：
一种哺乳动物细胞表达载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建筛选基因表达框：所述筛选基因启动子为SV40核心启动子；所述筛选基因序列的5’端连接有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列，且不含有Kozak序列；
(2)合成表达载体中除筛选基因表达框外的其他部分，所述表达载体中除筛选基因表达框外的其他部分中包含有目的基因表达框以及复制子；
(3)将所述筛选基因表达框与表达载体中除筛选基因表达框外的其他部分连接，即得哺乳动物细胞表达载体。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明通过发明人大量创造性劳动，采用SV40核心启动子作为筛选基因的启动子，结合筛选基因密码子非最优化并以核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列代替筛选基因起始密码子前Kozak序列的设计，构建得到一种筛选基因表达框和目的基因表达框的哺乳动物细胞表达载体，改变筛选基因的翻译、转录水平，确保载体上的筛选基因的低水平表达，从而在该载体整合至宿主细胞的基因组之后，只有整合在适合外源基因高表达的位置的细胞株才能存活，不仅能够有效降低筛选细胞的数量，并且能够提高所筛选得到细胞株的表达能力。
附图说明
图1为真核表达载体pMCS的质粒图谱；
图2为实施例2构建得到的表达载体pMinus-1的质粒图谱；
图3为实施例3中pMinus-1-EPO和pMCS-EPO转染细胞不同单克隆细胞株的蛋白比产率。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明设计并构建得到一种哺乳动物细胞表达载体，该哺乳动物细胞表达载体包括有：筛选基因表达框和目的基因表达框；其中，筛选基因表达框包括筛选基因启动子和筛选基因序列；所述筛选基因启动子为SV40核心启动子，可以降低筛选基因的转录水平；优选地，所述筛选基因序列的5’端连接有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列，且不含有Kozak序列，这一设计策略可以有效降低筛选基因的翻译水平。
具体地，SV40核心启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，和/或所述筛选基因为zeocin抗性基因。优选地，所述筛选基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该序列采用大肠杆菌偏爱的密码子，以进一步降低筛选基因的翻译水平。在其他一些实施方式中，zeocin抗性基因的序列还可以采用其它在真核细胞中非最优化的密码子。可选地，筛选基因还可以为G418抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等。更优选地，哺乳动物细胞表达载体中，筛选基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。在其中一些实施例中，所述哺乳动物细胞表达载体的骨架部分取自真核表达载体pMCS。
上述哺乳动物细胞表达载体的构建方法，具体包括以下步骤：
(1)构建筛选基因表达框：所述筛选基因启动子为SV40核心启动子；所述筛选基因序列的5’端连接有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列，且不含有Kozak序列；
(2)合成表达载体中除筛选基因表达框外的其他部分，所述表达载体中除筛选基因表达框外的其他部分中包含有目的基因表达框以及复制子；
(3)将所述筛选基因表达框与表达载体中除筛选基因表达框外的其他部分连接，即得哺乳动物细胞表达载体。
其中一些实施例中，步骤(1)中所述SV40核心启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或所述筛选基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
其中一些实施例中，步骤(1)中所述构建筛选基因表达框由以下方法制备得到：以核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的筛选基因表达框架序列pzeocin为模板，以pMinus-1-F-F和pMinus-1-F-R为引物，PCR扩增，即得；其中，所述pMinus-1-F-F核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，pMinus-1-F-R核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
其中一些实施例中，步骤(2)所述表达中除筛选基因表达框外的其他部分骨架由以下方法制备得到：以载体pMCS为模板，pMinus-1-V-F和pMinus-1-V-R为引物进行PCR扩增，即得；其中，所述pMinus-1-V-F核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述pMinus-1-V-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例1表达载体pMinus-1中筛选基因表达框的设计
本发明在真核表达载体pMCS的基础上，构建了哺乳动物细胞表达载体pMinus-1，该载体主要由筛选基因表达框与目的基因表达框组成。该真核表达载体pMinus-1的筛选基因表达框中的启动子为core SV40启动子，降低筛选基因的转录水平，序列如下：
core SV40(SEQ ID NO.1)：
5’-GACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAA-3’
将原有载体pMCS筛选基因翻译起始位点ATG前的Kozak序列去除，用富含A/T序列代替Kozak序列，降低筛选基因的翻译水平，其中富含A/T序列(SEQ ID NO.2)如下：
5’-TAAAAATCTT-3’
原有载体pMCS筛选基因翻译起始位点ATG前的Kozak序列(SEQ ID NO.11)如下：
5’-GCGCCACC-3’
另外，筛选基因的密码子采用大肠杆菌偏爱的密码子，进一步降低筛选基因的翻译水平。
根据上述原则设计筛选基因表达框架序列pzeocin(SEQ ID NO.3)，委托通用生物系统(安徽)有限公司合成。序列如下：
筛选基因表达框架序列pzeocin(SEQ ID NO.3)：
5’-GACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAACTTGGCAATCCGGTACTGTTGGTAAAAATCTTATGGCTAAACTGACCTCTGCTGTTCCGGTTCTGACCGCTCGTGACGTTGCTGGTGCTGTTGAATTCTGGACCGACCGTCTGGGTTTCTCTCGTGACTTCGTTGAAGACGACTTCGCTGGTGTTGTTCGTGACGACGTTACCCTGTTCATCTCTGCTGTTCAGGACCAGGTTGTTCCGGACAACACCCTGGCTTGGGTTTGGGTTCGTGGTCTGGACGAACTGTACGCTGAATGGTCTGAAGTTGTTTCTACCAACTTCCGTGACGCTTCTGGTCCGGCTATGACCGAAATCGGTGAACAGCCGTGGGGTCGTGAATTCGCTCTGCGTGACCCGGCTGGTAACTGCGTTCACTTCGTTGCTGAAGAACAGGACTAA-3’
其中，筛选基因为zeocin抗性基因(SEQ ID NO.4)，具有大肠杆菌偏爱性的密码子，具体序列如下：
筛选基因zeocin抗性基因序列(SEQ ID NO.4)：
5’-ATGGCTAAACTGACCTCTGCTGTTCCGGTTCTGACCGCTCGTGACGTTGCTGGTGCTGTTGAATTCTGGACCGACCGTCTGGGTTTCTCTCGTGACTTCGTTGAAGACGACTTCGCTGGTGTTGTTCGTGACGACGTTACCCTGTTCATCTCTGCTGTTCAGGACCAGGTTGTTCCGGACAACACCCTGGCTTGGGTTTGGGTTCGTGGTCTGGACGAACTGTACGCTGAATGGTCTGAAGTTGTTTCTACCAACTTCCGTGACGCTTCTGGTCCGGCTATGACCGAAATCGGTGAACAGCCGTGGGGTCGTGAATTCGCTCTGCGTGACCCGGCTGGTAACTGCGTTCACTTCGTTGCTGAAGAACAGGACTAA-3’
实施例2构建pMinus-1表达载体
(1)筛选基因表达框架序列pzeocin的合成
设计PCR扩增引物pMinus-1-F-F(SEQ ID NO.5)、pMinus-1-F-R(SEQ ID NO.6)，以筛选基因表达框架序列pzeocin(SEQ ID NO.3)为模板进行扩增，得到目的片段1，使得片段两端具有便于将筛选基因表达框架序列与表达载体其余部分连接的同源序列。
pMinus-1-F-F(SEQ ID NO.5)：
5’-TTAATTCTGTGGAATGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAG G-3’
pMinus-1-F-R(SEQ ID NO.6)：
5’-ACCCCAGAGTCCCGCTTAGTCCTGTTCTTCAGCAACGAAGTG-3‘
(2)pMinus-1表达载体其他序列的合成
设计PCR扩增引物(序列如下)，以载体pMCS，质粒图谱如图1所示，为模板进行PCR扩增，得到目的片段2(即pMinus-1表达载体其他序列，其中包含有表达载体的目的基因表达框以及复制子)。
pMinus-1-V-F(SEQ ID NO.7)：
5’-GCGGGACTCTGGGGTTCG-3’
pMinus-1-V-R(SEQ ID NO.8)：
5’-ATTCCACAGAATTAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCA-3’
(3)、表达载体合成与筛选
使用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)试剂盒将步骤(1)中合成的目的片段1和步骤(2)中合成的目的片段2进行连接，取100ng片段1和100ng片段2混合，加入2μl 5×In-Fusion HD Enzyme Premix并加入去离子水使最终反应体系体积为10μl，混匀后在50℃下反应15分钟。取2μl反应液转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR方法挑取阳性克隆，所用引物如下，取10个单菌落分别加入到50μl PCR反应体系中进行PCR反应，经琼脂糖电泳并成像后确定阳性克隆。提取阳性克隆质粒，测序得到正确的pMinus-1载体，质粒图谱如图2所示。
pMinus-F(SEQ ID NO.9)：
5’-GGAGGCTAACTGAAACACGG-3’
pMinus-R(SEQ ID NO.10)：
5’-CCAGACCACGAACCCAAAC-3’
实施例3pMinus-1表达载体表达红细胞生成素Fc融合蛋白(EPO-Fc)
为了验证pMinus-1表达载体在稳定转染细胞株构建方面具有高效性，构建了表达红细胞生成素Fc融合蛋白(EPO-Fc)的载体pMinus-1-EPO以及对照表达载体pMCS-EPO。
pMinus-1-EPO和pMCS-EPO构建：设计EPO-Fc基因扩增引物(序列如下，划线为NheI和PacI酶切位点)，以质粒pcDNA3.1-EPO-Fc为模板进行PCR扩增，得到带有NheI和PacI酶切位点的基因片段，将扩增得到的片段分别定向克隆至实施例1构建得到的pMinus-1载体(图2)和pMCS载体(图1)的NheI和PacI酶切位点之间，得到pMinus-1-EPO和pMCS-EPO表达质粒。
EPO-F(SEQ ID NO.11)：
5’-CCTTGCTAGCGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTC-3’
EPO-R(SEQ ID NO.12)：
5’-CCCTTTTAATTAATCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3’
分别将pMinus-1-EPO和pMCS-EPO转染至CHO-K1细胞，转染及筛选过程如下：转染前一个小时在六孔板中每孔接种2×106个细胞，转染时每孔需要10μl Lipofectamine2000及4μg PvuI线性化的pMinus-1-EPO和pMCS-EPO质粒，转染6h后分别将细胞离心，弃上清，细胞用10ml Hycell CHO培养基重悬，转移至T125摇瓶，37℃、140rpm、5％CO2条件下培养，转染48小时后细胞开始筛选培养基进行培养，使用的筛选培养基为含200μg/ml Zeocin、6mMGlutamine的Hycell CHO培养基，每3天更换筛选培养基。转染后细胞在药物作用下活率先下降后上升，待细胞活率升至90％以上时，分别取两个转染后细胞接种至新的T125摇瓶，每瓶培养体积为30ml，细胞密度为0.5×106cells/ml，培养3天后细胞计数以及检测上清中EPO-Fc表达量，结果见表1，pMinus-1-EPO转染的细胞蛋白表达量以及比产率明显高于pMCS-EPO转染的细胞。
表1不同表达质粒转染细胞药物加压培养后表达量
同时，当转染后细胞活率升至90％以上时，利用有限稀释法分别将两个转染后细胞铺96孔板进行单克隆筛选，铺板细胞密度为0.5个/每孔，细胞在培养箱静置培养14天后，利用斑点免疫印迹检测单克隆细胞表达上清。根据检测结果每个转染细胞筛选出表达量最高的10株单克隆细胞株进行逐渐扩大培养，在6孔板中培养3天后，细胞计数并检测蛋白表达量，计算每个单克隆细胞的蛋白比产率，对比不用质粒转染的单克隆细胞蛋白比产率的分布，结果见图3，pMCS-EPO转染的细胞株蛋白比产率在6.2-11.3pg/cell/day，平均为8.0pg/cell/day，pMinus-1-EPO转染的细胞株蛋白比产率在26.2-35.6pg/cell/day，平均为31.1pg/cell/day。因此，利用改构后的表达载体pMinus-1在筛选效率和筛选效果上明显优于未改构的表达载体。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 东莞太力生物工程有限公司
<120> 哺乳动物细胞表达载体及其构建方法与应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc tgcctctgag ctattccaga 60
agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa a 101
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taaaaatctt 10
<210> 3
<211> 508
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc tgcctctgag ctattccaga 60
agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa acttggcaat ccggtactgt 120
tggtaaaaat cttatggcta aactgacctc tgctgttccg gttctgaccg ctcgtgacgt 180
tgctggtgct gttgaattct ggaccgaccg tctgggtttc tctcgtgact tcgttgaaga 240
cgacttcgct ggtgttgttc gtgacgacgt taccctgttc atctctgctg ttcaggacca 300
ggttgttccg gacaacaccc tggcttgggt ttgggttcgt ggtctggacg aactgtacgc 360
tgaatggtct gaagttgttt ctaccaactt ccgtgacgct tctggtccgg ctatgaccga 420
aatcggtgaa cagccgtggg gtcgtgaatt cgctctgcgt gacccggctg gtaactgcgt 480
tcacttcgtt gctgaagaac aggactaa 508
<210> 4
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggctaaac tgacctctgc tgttccggtt ctgaccgctc gtgacgttgc tggtgctgtt 60
gaattctgga ccgaccgtct gggtttctct cgtgacttcg ttgaagacga cttcgctggt 120
gttgttcgtg acgacgttac cctgttcatc tctgctgttc aggaccaggt tgttccggac 180
aacaccctgg cttgggtttg ggttcgtggt ctggacgaac tgtacgctga atggtctgaa 240
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ccgtggggtc gtgaattcgc tctgcgtgac ccggctggta actgcgttca cttcgttgct 360
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<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<211> 42
<212> DNA
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<400> 6
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<211> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 10
<211> 19
<212> DNA
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<400> 10
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<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccttgctagc gccaccatgg gggtgcacga atgtc 35
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccttttaat taatcattta cccggagaca gggag 35
Claims (6)
1.一种哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述哺乳动物细胞表达载体包括有：筛选基因表达框和目的基因表达框；
所述筛选基因表达框包括筛选基因启动子和筛选基因序列；
所述筛选基因启动子为SV40核心启动子；所述筛选基因序列的5’端连接有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列，且不含有Kozak序列；
所述SV40核心启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述筛选基因为zeocin抗性基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述筛选基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述哺乳动物细胞表达载体的骨架部分取自真核表达载体pMCS。
4.一种哺乳动物细胞表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建筛选基因表达框：所述筛选基因启动子为SV40核心启动子；所述筛选基因序列的5’端连接有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列，且不含有Kozak序列；所述SV40核心启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述筛选基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；
(2)合成表达载体中除筛选基因表达框外的其余部分，所述除筛选基因表达框外的其余部分中包含有目的基因表达框以及复制子；
(3)将所述筛选基因表达框与表达载体中除筛选基因表达框外的其余部分连接，即得哺乳动物细胞表达载体。
5.根据权利要求4所述的哺乳动物细胞表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述表达载体中除筛选基因表达框外的其余部分由以下方法制备得到：
以载体pMCS为模板，pMinus-1-V-F和pMinus-1-V-R为引物进行PCR扩增，即得；其中，所述pMinus-1-V-F核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述pMinus-1-V-R的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。
6.根据权利要求4所述的哺乳动物细胞表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述构建筛选基因表达框由以下方法制备得到：
以核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的筛选基因表达框架序列pzeocin为模板，以pMinus-1-F-F和pMinus-1-F-R为引物，PCR扩增，即得；其中，所述pMinus-1-F-F核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，pMinus-1-F-R核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
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| CN103525867A (zh) * | 2013-10-17 | 2014-01-22 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 用于高表达细胞株开发的载体的构建及应用 |
| CN103525868A (zh) * | 2013-10-17 | 2014-01-22 | 百泰生物药业有限公司 | 哺乳动物细胞高效表达载体的构建及应用 |
| CN104946687A (zh) * | 2015-06-09 | 2015-09-30 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法 |
| CN108251453A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-07-06 | 上海络祥基因科技有限公司 | GS-DHFRmut双基因筛选表达载体、制备方法及应用 |
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2018
- 2018-11-28 CN CN201811470247.4A patent/CN111218476B/zh active Active
Patent Citations (4)
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