CN102458414B - 川楝素或楝树提取物在痴呆预防和治疗上的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预防和治疗痴呆的含有川楝素或楝树提取物作为有效成分的治疗用组合物，具体地说，含有川楝树或楝树提取物为有效成份的用于预防和治疗痴呆的药物组合物。本发明的含有楝树提取物或者川楝树或者药学上可接受的盐及将其作为有效成分的药物组合物，其用途和预防、治疗痴呆的方法，对预防和治疗痴呆的效果显著。尤其，本发明的组合物、用途或者方法，对促进APPa生成的诱导作用卓越，对β淀粉样肽生成具有抑制作用而保护神经细胞，因此对如阿尔茨默病等痴呆的预防或治疗具有卓越功效。

Description

川楝素或楝树提取物在痴呆预防和治疗上的用途

技术领域

本申请主张以2009年6月19日申请的大韩民国专利申请第10-2009-0054949号作为优先权，上述说明书将全部作为本申请的参考文献。

本发明涉及川楝素或楝树提取物在预防或治疗痴呆病症上的用途，尤其涉及含有川楝素或其药学上可接受的盐或楝树提取物并将其作为有效成分的用于预防或治疗痴呆的药物组合物及其用途，以及相应的治疗方法。

背景技术

痴呆(dementia)是因神经细胞受损伤及损失，导致记忆力、集中力、语言和认知等能力产生严重障碍并长期发展下去，最终失去精神能力和社会活动能力的综合症，其中以阿尔茨海默病为典型疾病(Alzheime’s disease)。阿尔茨海默病根据其起因分为散发性(sporadic type)和家族性(familial type)，而且阿尔茨海默病的百分之八九十以上都属于不明原因的散发性疾病，主要发生在六十五岁以上高龄人口，其余是，淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein；以下简称APP)、早老素(presenilin；PS)I型和II型等基因突变为主要致病原因，大部分症状都出现在六十五岁以下人口。经认定，阿尔茨海默病的症状是以在脑组织的神经细胞外形成老年斑(senile plaque)的β淀粉样肽(Aβ)和在神经细胞内因过磷酸化而形成双螺旋纤维(paired helical filament)的tau蛋白质为主要致病物质。据报告，A β是APP因叫做β-和γ-分泌物的蛋白质分解酶，自动凝聚成由氨基酸序列特异性代谢形成的40～42个氨基酸组成的蛋白质，从而诱发神经细胞毒性、突触的损失及炎症(Cappari et al，Neurochem Res，2008，33：526-532)；tau蛋白质是与微管(microtubule)结合对细胞形态和结构起到维持作用，但因过磷酸化，从微管中分离，破坏微管以及形成神经纤维缠结(neurofibrillary tangles)而诱发神经细胞死亡(Iqbal et al，Acta Neuropathol，2009，in print)。据2008提统计数据，全球阿尔茨海默病患者数量约达2，600万名，而且随着老年人口的增加，其患病人数到2050年预计将达到1亿人以上(Carlsson，J Alz Dis，2008，15：327-338)，但其根本性治疗药物的开发却进展缓慢。目前市售药物有，使有关记忆的神经传递素即乙酰胆碱(acetylcholine)的浓度保持一定水平的乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase)活性抑制剂(Ariceopt、Exelon、Reminyl等)，以及采用Ca²⁺抑制神经细胞死亡的NMDA受体拮抗剂(Memantine)，但其使用目的在于缓解症状，因此具有根本性治疗效果的治疗药物的开发已成为人们迫切需求。

川楝树(Melia azaearach，Melia toosendan)属于楝科(Melia)楝属植物，其根皮或树皮叫做苦楝皮，果实为川楝子，在中国自古以来作为驱虫剂来使用，此外还具有抗菌、利尿及解热作用，另外据《东医宝鉴》记载，也可以用于生殖器和睾丸发肿疼痛、大小便不畅等疝症的治疗。据报告(Zhang et al，Acta Northwe Uni Agricult Sin，1993，21：1-5)楝树的苦楝皮或川楝子的驱虫作用是川楝素(toosendanin或者azedarachin，C₃₀H₃₈O₁₁，分子量574，Wang and Yen，J Tradit Chin Med 1959，262：46-49)选择性地抑制昆虫的摄取及分化而产生。除楝树之外，属楝科的椿树(Cedrela sinensis)也含有川楝素成分，其根或茎的皮即椿白皮用于驱虫剂或痢疾、白带症和用于止泻的止泻剂。

据报告，川楝素此外还用于诱导神经细胞的分化(Tang et al，Neurosci Res，2003，45：225-231)和癌细胞的细胞死亡(Shi and Tang，Chin J Neurosci，2004，20：461-465)。国内外有关楝树或川楝素用途的专利有：癌细胞毒性(大韩民国专利注册号第10-0112032号)、美白及除皱效果(大韩民国专利注册号第10-0345226号、美国专利注册号第06，886，856号)、杀虫作用(大韩民国专利注册号第10-0112657号，美国专利注册号第06，372，239号)以及预防过敏效果(大韩民国专利注册号第10-0750879号)等，但川楝树对痴呆的功效研究完全是空白。

发明内容

要解决的技术问题

本发明的发明人员在开展可治疗痴呆的新物质方面的研究工作中，发现含有川楝素的楝树的果实川楝子及从中分离出的活性成分即川楝素可以调节APP的代谢，进而促进对神经细胞具有保护效果的APPa的生成的同时抑制A β的生成，并利用痴呆动物模型进行实验证明确实具有改善记忆力效果，从而使本发明得以完成。

因此本发明的目的在于提供川楝素或其药学上可接受的盐对预防或治疗痴呆方面的用途。

本发明另一目的在于提供楝树提取物在预防或治疗痴呆病上的用途。

技术方案

为实现上述目的，本发明提供含有川楝素或者其药学上可接受的盐为有效成分的用于预防或者治疗痴呆的药学组合物。

为实现本发明另一目的，本发明提供川楝树或其药学上可接受的盐对制造痴呆用预防或治疗药物的用途。

为实现本发明另一目的，本发明提供将川楝素或其药学上可接受的盐对个体按需给药有效量为特征的痴呆预防或治疗方法。

为实现本发明又另一目的，本发明提供包含楝树提取物为有效成分的痴呆预防或治疗用药学组合物。

为实现本发明另一目的，本发明提供楝树提取物对制造预防或治疗痴呆用药物的用途。

为实现本发明另一目的，本发明提供将楝树提取物对所需个体按需给药有效量为特征的痴呆的预防或治疗方法。

以下对本发明详细进行描述。

化学式1表示的本发明的川楝树所具有的杀虫作用、癌细胞毒性、美白以及去皱效果是已知事实，但除此之外还具有预防或治疗痴呆的效果。而且所述川楝树的预防或治疗痴呆效果是通过本发明首次获得公开。

[化学式]1

C₃₀H₃₈O₁₁(分子量574.62)

所谓痴呆是指，成长期保持正常指标，但逐渐发生认知功能受损、人格发生变化等症状的后天性疾病。痴呆是因多种原因使脑神经受到破坏而从全面出现记忆力障碍、语言能力障碍、大小便失禁、偏执型思维、失语症等精神功能障碍，在发展过程中还会伴有忧郁症或人格障碍、攻击性精神病学症状。对此，医学界主要关注老化和遗传原因，但其发病原因和治疗方法尚未获得确定。被类为痴呆的疾病并不限于此，但包括阿尔茨海默病型痴呆症、脑血管型痴呆症、老年性痴呆以及头部损伤所致痴呆。

作为本发明的含有川楝素或其药学上可接受的盐为有效成分的组合物，只要含有川楝素有效成分，不管是什么提取物，均可成为本发明的组合物之一。例如，椿树提取物或者楝树提取物，也可以优选川楝树(Melia azedarach，Melia toosendan)提取物，最优选的是川楝子(川楝树果实)或者苦楝皮(苦楝树的根皮或者树皮)提取物。楝树属楝科(Melia)楝属植物，其根皮或树皮叫做苦楝皮，果实为川楝子，在中国自古以来作为驱虫剂来使用，此外还具有抗菌、利尿及解热作用，而且根据东医宝鉴记载可以用于生殖器和睾丸发肿疼痛、大小便不畅等疝症的治疗。本发明的楝树提取物是从楝树的果实、叶子、茎、根等所有部位均可提取制造，但最优选的是从果实、根皮或茎皮提取制造。

本发明的楝树提取物是可以采用在该业界已公开的溶剂提取法制造。提取溶剂可以从水、乙醇(酒精)和如甲醇等碳氢1或6个酒精、乙酸乙酯、二氯甲、三氯甲烷、n-核酸、乙醚、丙酮、苯等有机溶剂中选用其中之一或者使用其混合溶剂。但更好是使用水或者碳氢1或6个酒精撮。如果利用所述溶剂提取法制造提取物，则可以采用热水提取、超声波提取以及回流提取方法。但最好是，利用甲醇作为溶剂提取制造本发明的楝树提取物。提取时对于楝树和甲醇的比率没有特别的限制，但可以以1∶3～15(以重量为准)的比率添加。而且为提高提取效率，也可以用1∶5～10(以重量为准)的比率进行添加。提取温度是最好在常压下保持10～30℃之间为宜，提取时间是根据提取温度有所不同，但可以是48小时或96小时，最优先的是72小时为宜。提取时间短，无法充分提取楝树成分，提取时间过长则因蒸发而降低提取收率。因此最好是将楝树用粉碎机粉碎之后使用，并反复两次进行甲醇的提取过程，利用剩余成分再次提取，从而提高提取效率。

利用甲醇提取的提取物是可以按照已公开的方法进行分馏，从而清除杂质，提高活性成分浓度。为提高分馏效率，可以将提取物减压浓缩，分馏溶剂是可以从乙醇和甲醇等碳氢1或6个酒精、乙酸乙酯、二氯甲、三氯甲烷、n-核酸、乙醚、丙酮、苯等有机溶剂中选用其中之一或者使用其混合溶剂，也可以优选使用乙酸乙酯进行分馏。分馏物是可以直接使用，或者再进行分馏。再分馏时可以优选使用水、甲醇、n-核酸的混合溶剂。

本发明一实施例是，将粉碎得细小的川楝子与体积重量达其五倍的甲醇，利用三天的时间反复提取两次，并将其提取液过滤及减压浓缩之后悬浮于水中，处理同一体积的乙酸乙酯之后收集乙酸乙酯分馏物再进行减压浓缩。然后对浓缩的分馏物添加90～95％分馏物和同一体积的n-核酸搅拌之后收集甲醇馏分减压浓缩后取得了最终提取物(见实施例1)。

本发明的川楝素(toosendanin)可从天然分离精炼，或者通过商业途径购买使用，或者利用在该业界已公开的化学合成法制造使用。

本发明的川楝素优选地，可从天然分离精炼。更优选地，可从川楝树(Melia toosendan)分离精炼，最优选地，从楝树的果实川楝子或者根、茎之皮即苦楝皮分离精炼。按照所述方法可以从楝树萃取含有川楝素之提取物，但从提取物中分离川楝素的方法是，可以利用该业界已公开的色谱法进行分离。例如，可以将硅胶柱色谱法(Silica Column chromatography)和高效液相色谱法(HPLC：High performance liquid chromatography)分取，从而纯粹分离活性成分。

本发明的一实施例是将楝树提取物在60mesh硅树脂，从100％二氯甲、0％甲醇开始逐渐提高甲醇的混合比率，最后使用0％二氯甲、100％甲醇，并分成8个馏分而取得了馏分。然后将活性度最高的馏分(二氯甲∶甲醇＝25∶1)使用十八烷基硅键合硅树脂，利用不同的甲醇浓度进行分馏，确保活性最高的馏分，然后在同一条件下改变甲醇的浓度再次进行分馏，以确保活性最高的馏分之后利用高效液相色谱法分取，对川楝素实施了纯粹分离(见实施例2)。并采用核磁共振(NMR spectroscopy)分析和质谱法(mass spectroscopy)加以确认其分取物是否川楝树。

本发明的组合物或者楝树提取物中有效成分川楝素会阻碍β-分泌物活性，促进α-分泌物的活性，从而对β淀粉样肽的产生抑制作用，并由本发明人员首次得以公开。

阿尔茨海默病是以A β和tau蛋白质为主要致病物质，在各个神经细胞外部和内部形成老年斑和神经纤维而诱发脑组织萎缩和记忆障碍等。在A β和tau中，是A β与神经细胞死亡有密切关系，由此推测阿尔茨海默病是因某种原因从APP中生成A β的渠道被激活而引发初期症状，然后tau蛋白质促使病情快速发展(small and Duff，Neuron，2008，5：591-598)。因此首先阻断A β生成渠道才能有效预防或治疗阿尔茨海默病。A β是APP被β-分泌物切断成包含APP β和A β序列的C-末端切片β(C-terminal fragment β；CTF β)之后，γ-分泌物对CTF β产生作用而形成ACID(APP intracellular domain)和A β，因此阻碍β-分泌物活性属于预防或治疗阿尔茨海默病的方法之一。α-分泌物是与β-分泌物争着分解APP而抑制APP α的生成，而被α-分泌物分解的产物之一即APP诱导APP α的生成，从而加强α-分泌物的活性，并成为阿尔茨海默病的又一预防或者治疗方法。

本发明的组合物或者组合物中有效成分川楝素作为A β生成阻断剂，符合上述阿尔茨海默病治疗药物开发目的，即有效阻断A β的生成渠道，促进APP α生成，从而保护神经细胞。

本发明一实施例是利用蛋白质印迹通过细胞实验，确认本发明组合物中的楝树提取物或者川楝素在促进APP α的生成的同时抑制APP β的生成(见实施例5-1)，并通过细胞实验利用β淀粉样肽定量试剂盒，确认对β淀粉样肽生成的抑制作用(见实施例5-2)。

本发明另一实施例是通过动物实验，使用β淀粉样肽定量试剂盒，确认本发明的组合物中楝树提取物或者川楝树可以减少痴呆动物标本的β淀粉样肽水平(见实施例8)。

本发明的又另一实施例是通过以注射本发明的组合物诱导其痴呆的大鼠为对象的γ字型迷路试验、水中迷路试验以及被动避暗试验，确认了本发明组合中的楝树提取物或川楝素对痴呆动物标本中作为痴呆主要症状之一的记忆和认知功能低下具有的治疗作用(见实施例7)。

从而确认本发明的组合物可以有效阻断A β的生成渠道，促进APP α的生成，保护神经细胞而对痴呆具有卓越的预防或治疗效果。

本发明的另一实施例是，将多种浓度的酒精(乙醇)作为提取溶剂取得本发明组合物中的楝树提取物，对各提取物的毒性和功效进行了比较。结果确定，若将酒精作为提取溶剂提取将本发明的楝树提取物，不管其浓度如何，整体功效均显著，尤其是将提取溶剂的酒精含量调整为30％或50％，可以获得继续发挥本发明功效的同时毒性却大幅减轻的楝树提取物(见实施例9)。

因此本发明提供含有川楝素或者其药学上可接受的盐为有效成分的预防或者治疗痴呆用药学组合物。并提供含有川楝树提取物为有效成分的用于预防或治疗痴呆的药学组合物。本发明的组合物是可以具有包含楝树提取物、川楝素或者其药学上可接受的盐0.001或者99.999重量％以及剩余量载体的组合。

依照本发明的川楝素可以直接采用其本身，或者其药学上可接受的盐的形态使用。上述的‘药学上可接受的’是指，在生理学上允许并给人服药之后，不引发通常的过敏反应或者类似反应，所述盐则可优选药学上可接受的被游离酸(free acid)形成的酸加成盐。所述游离酸是可以全用有机酸和无机酸。而且所述有机酸除此之外，还可以使用柠檬酸、醋酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、甲基磺酸、乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、碳酸以及天冬氨酸。所述无机酸是可除此之外，还可以使用盐酸、溴酸、硫磺酸以及磷酸。

依照本发明药学组合物可以将川楝素或者其药学上可接受的盐或者楝树提取物可以单独含有，或者再含有一个以上药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

上述“药学上可接受”是指，生理学上容许且给人服用后，不阻碍活性成分的作用，通常不引发胃肠障碍、眩晕症等过敏反应或者与其类似反应的无毒性组合物。

药学上可接受的载体可以包含如口服用药载体，或者增加包含非口服用药载体。口服用药载体是可以包含乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。同时包含：用于缩氨酸制剂口服用药的多种药物传递物质。非口服用药载体包含：水、可适用油、食盐水、葡萄糖水、乙二醇，此外可再添加包含稳定剂和保存剂。稳定剂适宜使用亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或者抗坏血酸维生素C等抗氧化剂。保存剂适宜使用苯扎氯铵、甲基或丙烷基以及氯丁醇。本发明的药学组合物除上述成分之外，还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂等。此外，药学上可接受的载体是可以参考下一文献中记载内容(Remington’Pharmaceutical Sciences，19^th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，1995).

依照本发明包含楝树提取物、川楝素或其药学上可接受的盐为有效成分的药学组合物，可以单独含有药学上有效量的楝树提取物、川楝树或其药学上可接受的盐，或者再增加包含一个以上药学上可接受的载体。上述“药学上有效量”是指，产生比阴性对照组以上反应的量，并以可充分预防或治疗痴呆的量为优选，而且痴呆有可能是，阿尔茨海默型痴呆、脑血管性痴呆、老年痴呆以及头部损伤所致痴呆。

本发明的组物合对包括人类在内的哺乳动物，任何给药方法均可适用。例如，可以用口服或者非口服方法给药。非口服给药方法可以采用静脉、动脉、骨髓、硬脑膜、心脏、经皮、皮下、腔腔、鼻腔、肠道、局部、舌下或直肠给药方法。

本发明的药学组合物可以按照上述给药渠道，可以使用口服给药或非口服给药用制剂实现剂型化。

口服给药用制剂，本发明的组合物可以使用粉末、颗粒、片剂、丸剂、糖衣片剂、胶襄、液态、胶剂、糖浆、浆液、悬浮液等该业界已公开的方法制造成各种剂型。例如，口服用制剂，可以将活性成分和固体赋形剂混合之后粉碎，添加适宜辅助剂后加工成颗粒混合物，从而获得片剂或者糖衣片剂。适宜赋形剂，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、苏藻糖醇、麦芽糖醇等糖类；玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉和土豆淀粉等淀粉类；纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠以及羟丙基甲基纤维素等纤维素类，还有如凝胶、聚乙烯吡咯烷酮等补充剂。此外，根据情况还可以添加桥键聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、褐藻酸或者海藻酸钠等崩解剂。进一步本发明的药学组合物还可以添加抗凝集剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂以及防腐剂等。

非口服给药制剂，可以利用注射剂、霜剂、乳液剂、外用软膏剂、油剂、保湿剂、胶剂、气溶剂以及鼻腔吸入剂形态，采用该业界已公开的方法制造各种剂型。这些剂型均记录在所有制药化学上通常都公开的处方即文献(Remington’s Pharmaceutical Science，15^thEdition，1975.Mack Publishing Compnay，Easton，Pennsylvania 18042，Chapter87；Blaug，Seymour)。

本发明的药学组合物的总有效量是可按单剂量(single dose)使患者用药，也可以按多剂量(multiple dose)长期给药的分次治疗方法(fractionated treatment protocol)进行给药。本发明药学组合物根据疾病程序可以调整有效成分的含量。可优选的是，本发明的川楝素或者楝树提取物的优选总剂量为每日按患者体重1kg大约给药0.01μg或500mg，最优选的是0.1μg或者100mg。但所述川楝素或楝树提取物的剂量是根据药学组合物给药渠道和治疗次数乃至患者的年龄、体重、身体情况、性别、疾病严重度、饮食及排泄率等多种因素，决定对患者的有效给药量，因此只要掌握该领域通常知识者，都可以将所述川楝素或者楝树提取物，按照预防或者治疗痴呆的特殊用途，合理决定有效给药量。依照本发明的药学组合物，在出现本发明效果的前提下，对其剂型、给药渠道以及给药方法没有特殊限制。

本发明提供川楝树或者其药学可接受的盐对痴呆用预防或治疗剂制造的用途。

本发明提供楝树提取物对痴呆预防或治疗剂制造上的用途。

本发明还提供川楝素或其药学上接受的盐对所需个体按有效量给药为特征的痴呆预防或治疗方法。

本发明还提供将楝树提取物对所需个体给药有效量为特征的痴呆的预防或治疗方法。

本发明的川楝素或者其药学上可接受的盐、楝树提取物，可经口服、经皮、皮下、静脉或者肌肉包括在内的多种渠道，按有效量给药。所述‘有效量’指为患者给药之后可对痴呆产生治疗效果的量。

上述个体(subject)是指动物，但以哺乳动物，尤其是以包括人在内的动物为优选，也可以指动物的细胞、组织及器官。所述个体也可以是需要治疗的患者(patient)。

上述发明的楝树提取物、川楝树或者其药学上可接受的盐，可以将其本身直接给药，或者如上所述，制造成各种剂型进行给药，优选地，可给至得到所期望效果即治疗痴呆效果为止。

有益效果

因此本发明的楝树提取物或者川楝素或其药学上接受的盐为有效成分的药学组合物的用途及痴呆预防和治疗方法，对预防或治疗痴呆有效。尤其是，本发明的组合物、用途或者方法是促进APPa生成的诱导作用卓越，有效抑制A β生成而保护神经细胞，对如阿尔茨海默病等痴呆的预防或治疗具有卓越功效。随之，含有本发明的楝树提取物或者川楝素为有效成分的组合物、其用途和痴呆预防或治疗方法，可以用于针对已发生痴呆或易发生痴呆的年龄段人群的预防或治疗用药品制造等广泛领域。

附图说明

图1是表示依照本发明取得川楝素及所含川楝子提取物和馏分的过程的图式。

图2是用蛋白质印迹对川楝树以及含川楝树的各有机溶剂川楝子提取物的APP代谢物即APPa和APP β的生成产生的影响的结果(control，c：未处理提取物对照组；MeOH：川楝子甲醇提取物处理组)

图3是用蛋白质印迹对苦楝皮提取物的APP代谢物即APP β的生成产生的影响进行测量的结果。(EtOH：苦楝皮乙醇提取物处理组；MeOH：苦楝皮甲醇提取物处理组；FA：苦楝皮乙酸乙酯提取物处理组；Hexane：苦楝皮n-核酸提取物处理组；C：提取物未处理对照组)。图4是BACE1和瑞典型突变(Swedish mutation)的过度表达APP695的CHO细胞株，处理川楝子酒精提取物时，为查看Aβ40的生成以及抑制与否，用Aβ40定量试剂盒对Aβ40的量进行测定的结果图表。

图5是痴呆大鼠的γ字型迷路试验中，为查看川楝子酒精提取物改善记忆的效果，对自发交换行为量(alternation behavior，％)进行比较测量的图表(％Alternation：交换行为量(％)；Vehicle：没有提取物只投10％聚乙二醇甘油酯类乳化剂的对照组；川楝子：川楝子酒精提取物投药组)

图6是痴呆大鼠的水中迷路试验中，为阐明川楝子酒精提取物的改善记忆效果，对寻找平台的的时间进行比较测量的结果图表(逃避潜伏期(Escape latency time)(s)：去找平台所需的时间(秒)；Vehicle：没有提取物只投10％聚乙二醇甘油酯类乳化剂的对照组；川楝子；川楝子酒精提取物对照组)。

图7是痴呆大鼠的被动避暗试验中，为观察川楝子酒精提取物的改善记忆效果，对进入灰暗的屋子所需时间进行测量的结果图表(等待时间(Retention Latency time)(s)：进入灰暗的屋子所需的时间(秒)；Vehicle：没有提取物只投10％聚乙二醇甘油酯类乳化剂的对照组；川楝子：川楝子酒精提取物投药组)

图8是投川楝子酒精提取物，利用痴呆大鼠的脑组织查看A β的生成被抑制与否，用A β40定量试剂盒对大鼠脑组织中的A β40量进行测量的结果图表。

图9是为查看投川楝素的大鼠的血液中A β40的生成是否被抑制，用A β40的试剂盒，对大鼠血浆中的A β40量进行测量的结果图表(Vehicle：没有川楝树，只投入20％酒精的对照组；5mg/kg、50mg/kg：将川楝树按5mg/kg、50mg/kg分别投药的试验组。)

图10是用蛋白质印迹对依照提取溶剂的本发明组合物对APP β生成的抑制或者促进APPa生成的功效变化进行比较的结果图片。(100％酒精或30％酒精：按各百分比率酒精与水的混合溶剂提取楝树的提取物使用组；C：未处理提取物对照组)。

图11是对依照提取溶剂的本发明组合物对抑制A β生成功效的变化进行测量的结果图表(100％酒精或50％酒精：按百分比率配合的酒精和水的混合溶剂提取楝树的提取物的使用组)

具体实施方式

以下结合实施例对本发明详细进行描述。

但，以下实施例只是对本发明举例说明，本发明的内容不限于以下实施例。

<实施例1>

川楝子以及苦楝皮的提取及分馏

利用将粉碎的川楝子(烘干后重量10kg)在50L的甲醇中放置三天的方法进行了提取。将此过程反复两次并收集提取液后实施了过滤、减压浓缩。对得到的浓缩物加入10L的水使其在水中悬浮之后，添加同一体积的乙酸乙酯搅拌放置，收集乙酸乙酯溶剂馏分后再减压浓缩。为进一步分馏乙酸乙酯浓缩物，添加10升90～95％的甲醇(5～10％水)和10升n-核酸搅拌之后放置，然后收集90～95％甲醇馏分减压浓缩。提取和分馏的过程中获得的各个馏分和于活性分析，并在4℃的环境下保管，直至活性成分被分离。苦楝皮也是按同一方法提取而获得了各溶剂的提取物。

<实施例2>

从川楝子的细分馏物中分离出活性成分

从上述实施例1中获得的90～95％甲醇分馏浓缩物中实施了对活性成分的分离。浓缩物是从硅树脂(60mesh)中100％二氯甲开始逐渐增加甲醇量，最后使用100％甲醇分馏成8个细分馏物，其中确保了具有活性的3个分馏物(二氯甲∶甲醇＝25∶1，10∶1，5∶1)。将活性最高的25∶1分馏物的浓缩物在十八烷基硅烷键合的硅树脂(Biotage FLASH+^TMsystem，C18HS25+M，60A，40-63μm，FPKO-1107-16046，10ml/min)中，将MeOH的浓度从15％逐步增加到100％而进行分馏，并调查活性结果获得了具有活性的分馏物即35％和50％分馏物。并将此活性分馏物只改变MeHO的浓度(30～100％)，在同一条件下再分馏而获得活性分馏物(40～60％)，并实施浓缩，将乙腈(acetonitrile)和水的混合溶剂作为分离溶剂(acetonitrile 48％)，在使用十八烷基硅烷键合硅树脂(YMC-pack，ODS-A，150X10mm i.d.，120A，S-5μm，AA12S05-1510WT)的高效液相色谱(HPLC)中以每分钟4ml的流速对活性成分实施纯粹分离(见图1)。

然后利用核磁共振法(NMR spectroscopy)和质谱法(mass spectroscopy)对纯粹分离的活性成分结构进行分析，以及利用分子量结晶确定为化学式1的川楝素。

<实施例3>

测量川楝子酒精提取物中川楝素含量

为针对川楝子酒精提取物进行功效试验，利用指标和活性成分测量了川楝子酒精提取物中川楝素的含量。作为分析条件将含0.05％TFA(trifluoroaceticacid)的30％乙腈(acetonitrile)作为洗脱溶剂使用，柱(Column)是在利用十八烷基硅烷键合硅树脂(YMC-pack，ODS-A，150X10mmI.d.，S-5μm)的HPSL中按每分钟1ml的流速和214nm波长实施了川楝素分析。将采购的川楝素标准品用适当浓度稀释之后测量了各浓度的面积值，然后以此为准，用标准品的层析图画出面积与浓度之比的绝对标准曲线，从而确定其直线性为0.999并利用于定量。川楝树在自然界是以异构体存在，因此在上述的分析条件下分别检从15.7和20.6分检出。为更加准确定量，将川楝子乙醇提取物用蒸馏水悬浮，用乙酸乙酯溶剂分馏之后，再浓缩用于分析。并代入此标准曲线定量的结果得出川楝子酒精提取物中川楝素含量约达1.15％。

<实施例4>

测定川楝子酒精提取物的细胞毒性

用MTT法测定了细胞毒性。细胞株是使用了准备用于抑制APP β生成试验的源自HEK293的BA-3细胞株(Yeon et al，Peptides，2007，28：838-844)人血液癌细胞株即HL60以及人肝癌细胞株即HepG2。在96-well plate以1x10⁴/90μl/well的浓度分裂细胞后培养一天，然后用培养液稀释溶解于DMSO的各物质，使其最终浓度达到1％并向各细胞株处理后培养了三天的时间。培养之后用显微镜观察细胞的状态后，每well添加15μl的MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-2yl)-2，5-diphenyl-2Htetrazolium bromide，5mg/ml in PBS]溶液，在37℃的温度反应四个小时的时间，每well处理100μl的lysis buffer(0。01N HC1，10％SDS)，并37℃的温度下放置24个小时，使从中形成的formazan完全溶解后在570/652nm测量了吸光率。

结果川楝子酒精提取物在B A-3处理的最高浓度即100μg/ml中也未显示出细胞毒性，但对细胞生成的抑制效果产生了轻微诱导效果。处理川楝子酒精物的HepG2和HL60是，用显微镜观察结果没有发现细胞毒性，但对细胞生成产生了抑制效果。从而确定川楝子提取物是分别在3。2μg/ml和34μg/ml的浓度下，对各细胞生长的抑制率达到50％。

<实施例5>

细胞中川楝子提取物和川楝素对淀粉样前体蛋白(APP)代谢的抑制效果分析

<5-1>对APP β生成的抑制效果

为BACE1(β-secretase)和APP695过度表达的源自HEK293的BA-3细胞株，在Well plate的每well中占80％以上面积，使用含10％胎牛血清(fetalbovin serum，FBS)的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)进行分裂后培养一个星期。清除培养基之后对没有胎牛血清的free DMEM进行加热，使之温度达到37℃，并在各Well上分别倒入0.9ml之后，对0.1mlfree DMEM，将川楝素或者用各溶剂提取的川楝子分馏物，用适当浓度稀释处理之后培养了24小时。然后收集各试样被处理的培养基0.2ml，在8％SDS-PAGE(polyacrylamide gel以及electrophoresis)中电泳之后，使用APPa以及APP β的抗体即AB1560(monoclonal)和Rb53(polyclonal)抗体，用蛋白质印迹测量了培养液内的APPa和β量。

结果确定，川楝子甲醇、酒精、乙酸乙酯提取物对APP β的生成具有抑制效果的同时对APPa的生成产生了促进作用。根据酒精提取物的各稀释浓度，分别进行抑制APP β生成及促进APPa生成效果试验结果，用6.25μg/ml浓度处理时，与非处理组(Control，100％)相比，APPβ生成率减少了27.7％，APPa的生成则增加了131.3％，而且对于APP β，在最低浓度0.05μg/ml以下仍然显示出依赖于浓度性的抑制效果，并相反地促进APPa生成的效果。纯粹分离的川楝素也在12.5nM以下抑制APP β的生成，对APPa的生成却相反显示出促进(在0.8μM下与非处理组相比，APP β减少17.8％，APPa则增加141.5％)效果，从而确定，对促进A β生成的APP代谢具有卓越抑制效果的物质(见图2)。

楝树的树皮即苦楝皮抽取物也和川楝子同样的有机溶剂提取条件下，取得了酒精、甲醇、乙酸乙酯以及90％甲醇提取物，并对减少APP β生成的效果进行了检测。结果秒微弱于川楝子提取物，但所有提取物在12.5～6.25μg/ml中对APP β的生成均减显示出减少效果(见图3)。

<5-2>川楝子提取物抑制A β生成的效果

将BACE1(GenBank accession No；AF190725)和瑞典型突变(Swedishmutation)APP695(GenBank accession No；MIM：104760.008)基因，分别放入pcDNA3.1/myc-Hic(Invitrogen，USA)和pcDNA3.1Hygro(Invitrogen，USA)载体(Vector)，再导入CHO细胞株，利用BACE1以及过度表达瑞典型突变APP695蛋白质的细胞株，测试了川楝子提取物是否抑制A β40的生成.然后将上述CHO细胞株，按6-well plate的各well的适当数量，使用含10％胎牛血清的DMEM进行分裂并培养了一个星期.清除培养基之后对没有胎牛血清的free DMEM进行加热，使之温度达到37℃后，对每个well倒入0.9ml之后，将含有川楝素的川楝子提取物用适当浓度在0.1ml free DMEM上稀释之后培养24小时，然后分离培养基，再用BioSource公司(CA，USA)的A β定量试剂盒(Human βAmyloid(1-40)colorimetric ELISAkit，BioSource，CA)实施了定量。

结果，从10μg/ml以下川楝子酒精提取物中观察到对A β生成的抑制率达到50％(见图4)。

<实施例6>

川楝子酒精提取物的毒性试验

为阐明将含有川楝素的川楝子酒精提取物经口投药时是否诱发毒性，实施了单次毒性及四周反复投药毒性试验。

单次毒性试验，选择六周龄雄性ICR大鼠五只为一组，经口单次投药750～3,000mg/kg的川楝子酒精提取物之后，观察两周生存状况后使受试动物安乐死，然后实施剖检后发现脏器有异常表现。投放量超过1,500mg/kg以上时一些大鼠死亡而产生毒性，而投放量低于1,000mg/kg则没有出现死亡，脏器也没有出现异常，从而判断出没有毒性。

反复投药毒性，选择六周龄雄性ICR大鼠以六只为一组，每天一次连续26天反复经口投入125～1,000mg/kg的川楝子酒精提取物，同时观察其体重变化、一般症状以生存与否并使实验动物安乐死后进行剖检，结果观察到脏器有异常表现。试验结果得出了最大耐受剂量(MTD)为750-1，000mg/kg、无毒性量(NOAEL)为500mg/kg的结论。

<实施例7>

川楝子酒精提取物在痴呆动物模型中记忆力和认知功能的改善效果

将川楝子酒精提取物悬浮在10％聚乙二醇甘油酯类乳化剂中，对具有产生瑞典型突变(Swedish mutation)的淀粉样前体蛋白(APP)的形质转换痴呆大鼠，三个月反复投药300mg/kg(经口投药，一周五次，六只)之后实施了γ迷路(γmaze)、水中迷路(water maze)以及被动避暗(passive avoidance)测试，并与Vehicle组(10％labrasol投药组，五只)比较分析有无记忆改善效果。

<7-1>Y字型迷路试验

试验是向三个通道(arm)伸长形成Y字型形状，各分枝长度为25cm，高14cm，宽5cm，利用位于同一角度的Y字型迷路检测装置进行了测试。并使受试动物头部向着Y字型迷路中的一个通道端，并在通道自由地游走八分钟的时间。当痴呆大鼠的后脚完全进入通道，视为通过(arm entry)，并记录动向的交替次数(alternation)，连续通过三个通道作为实际交替次数(actual alternation)计一分，将实际交替次数用可最多交替次数(即，从总交替次数中减掉2后的值)的百分比计算后，求出自发交替行为量(alternation behavior，％)。

结果测出含有川楝素的川楝子酒精提取物投药组的自发交替行为量为62.6±3.1％，Vehicle(Vehicle，10％labrasol)投药组是53.9±3.4％，从而确定，川楝子酒精提取物投药信赖度达95％以上(p＜0.05)，其记忆改善效果约达到16.1％(见图5)。

<7-2>水中迷路试验

水中迷路试验中参考记忆(reference memory)试验是开始试验的前一天，使实验动物在没有站台的水槽内自由地游泳60秒以便实验动物适应之后实施了试验.试验是对五天时间内每天四至五次爬到水中站台的时间(escape latency，单位：秒)进行测量的方法进行，时间最长限制到60秒.进行试验第二天为止，如果没有找到站台的位置则允许在限制时间即60秒之内继续寻找平台，上到平台之后停留10秒钟。

参考记忆试验结束并过24小时之后拿开水槽内的平台，使实验运动自由地泳60秒的时间之后，再测定在原来有站台的位置停留时间的方法实施了探针测试(probe test)。

其结果，参考记忆测试中，Vehicle投药组在试验期间从寻找水槽的时间上没有出现改善，但川楝子酒精提取物投药组是，从试验的第二天开始，比Vehicle投药组更快的时间内找到了站台，而且到试验第四天时显示出最大差异(见图6)。探针测试中，川楝子投药组在放过站台的位置停留的比率为33.0±3.2％，而Vichicle投药组为14.0±5.8％，比Vichicle投药组多停留2.35倍(p＜0.05)以上而产生了统计学的显著性差异。

<7-3>被动避暗试验

被动避暗试验的试验装置是利用隔断门(guillotine door)分成两个区域，用穿梭箱(shuttle box)进行了试验。一边区域是用照明灯照亮，另一区域是没有照明灯，并用黑布包住而使其内部暗黑。第一天，将痴呆大鼠放在房间内并给予三十秒的探索时间后打开隔断门使其进入黑暗的房间，然后测定进到黑暗房间的时间(acquisition latency time)。进入黑暗的房间后关掉隔断门，通过网格地面利用三秒钟的时间施加0.5mA的电冲击而使大鼠记住电的刺激.过24小时之后，将痴呆大鼠放在亮的房间内，给予三十秒的探索时间，然后打开隔断门，使大鼠进入黑暗的房间，并测量大鼠的所有脚黑暗的房所需时间(retention latency time)，最大测量时间为300秒，从而判断出，Retention latency time越大，学习以后对被动避暗的记忆持续的时间越长。

测定大鼠学习电刺激之后进入黑暗房间的时间(retention latency time)，结果发现，川楝子酒精提取物投药组为288.8±9.2秒，Vehicle投药组是131.8±59.6秒，因此川楝子投药组的可信度达到95％以上而对被动避暗的记忆改善效果达到了220％以上(见图7)，从而确定，本发明的组合物对痴呆的记忆力和认知功能减限，具有卓越功效。

<实施例8>

川楝子酒精提取物和川楝素对生物体A β的抑制效果

<8-1>川楝子酒精提取物在形质转换痴呆大鼠中对A β的抑制效果

记忆试验结束之后，取出及提取形质转换大鼠的脑而测定了脑组织内部的A β变化.并测定取出的脑重量，添加冷却后体积重量达八倍的溶液A(5M guanidine HCI，50Mm Tris HCI)，用均质器磨脑组织使之均质化之后在室温放置三至四小时后，用离心法(16,000X g，20分钟，4℃)收集上层液而提取了脑组织。收集的上层液用溶液B(Phsophate buffered saline，5％BSA，0.03％Tween-20，Ph7.4，Protease inhibitor cocktail)稀释3200倍后使用BioSource公司(CA，USA)的A β40定量试剂盒定量为A β40。

结果，针对稀释3200倍后测量的脑组织重量的A β的测定值，在Vichicle投药组为362.5±20.7pg/ml，相反川楝子酒精提取物投药组显示为111.9±84.6pg/ml。因此判断出通过川楝子酒精提取物的投药，A β40大约减少了69％左右。

<8-2>利用Rat的川楝素对A β的抑制效果

在投放川楝素之前先取血液，然后将5及50mg/kg剂量的川楝素，在20％酒精上悬浮之后经口投药，然后过两小时之后取血液，对投药前后的血液内A β浓度变化实施的测量.并用Aβ40定量试剂盒(Mouse/Rat Amyloidβ(1-40)High Specific Assay Kit，IBL，Japan)对将收集的血液用离心法(16,000g，20分钟，4℃)收集的血浆中的A β40。

结果，对Vichicle投药组的投药前后进行比较发现，投药后A β40大约增加了40％左右，但没有出现统计学显著性差异，相反对投放5mg/kg川楝素之后投药前后进行比较发现，A β40的抑制率达到了85％以上.由此可以看出，即使投放更低剂量，对A β40仍然具有抑制效果(见图9)，从而确定，本发明的组合物可抑制A β的生成，对痴呆具有卓越的预防或治疗功效。

<实施例9>

提取溶剂的毒性及功效试验

为取得既能保留本发明组合物功效，又降低其毒性的提取物，采用改变提取溶剂酒精含量差异的方法，提取川楝子而实施了其毒性和功效试验。

<9-1>制造川楝子酒精提取物

将粉碎的10kg川楝子放入50L的100％、70％、50％和30％酒精里放置三天提取，再进行过滤及减压浓缩之后冷冻干燥而取得了川楝子酒精提取物。

<9-2>川楝子酒精提取物的反复毒性试验

选择六周龄雄性ICR大鼠，以六只为一组，按Vichicle一组和酒精浓度分别准备了三组。

将从上述<实施例9-1>中取得的川楝子酒精提取物用赋形剂即10％聚乙二醇甘油酯类乳化剂(labrasol，Gate Fosse Inc.，法国)溶解，并一天一次对大鼠实施了经口投药.然后各浓度的酒精提取物对每组实施了投药，从而使之剂量达到1000、1500、2000mg/kg。

普通症状是投药当日即投药物后六小时之前，一小时观察一次，投药后第一天开始对其普通症状实施了一天一次的观察记录。并每周两次在体重测定日期，测定动物的体重，投药结束后使绝食一夜，然后采血并实施了血液生化检查。采完血的动物是再进行剖检，观察其主要脏器有无异常。

在每组动物的测定日记录了动物平均体重和有无死亡，并求出试样的最大耐受剂量(MTD)和无毒性量(NOAEL)。此外，实施多重比较法即dunnett‘s test，观察对照组和投药组之间平均体重和血液生化数据有无差异。测验的临界区域设定为5％(*P＜0.05)。

最大耐受剂量(maximal tolerance dose，MTD)是指，将试验物质对受试动物进行投药时，与对照组相比，体重增加被抑制或上升水平在10％以内，并产生毒性症状但不能致死的最小剂量.无毒性量(No observarble adverse effect level，NOAEL)是指，毒性试验上投药物质长期不产生有害影响的最大投药量。

结果确定，如下[表1]所示，提取时酒精含量越低，无毒性量越大，而且在30％酒精提取物中最大投药剂量即使达到了2,000mg/kg，但仍未发现毒性。

[表1]

各提取溶剂的最大耐受剂量和无毒性量的测量定结果

酒精提取物	MTD(mg/kg)	MOAEL(mg/kg)
			100％酒精	＜1,000	500-750
70％酒精	＞2,000	＜1,000
			50％酒精	＞2,000	1,000-1,500
30％酒精	＞2,000	＞2,000

<9-2>川楝子酒精提取物的各提取溶剂种类的功效比较试验

关于上述<实施例9-1>中取得的川楝子酒精提取物的APP β生成减少效果、促进APPa生成效果以及抑制A β生成效果，采用与<实施例5>同样的方法实施测定。

其结果如[图10]所示，将提取溶剂用100％、70％、50％以及30％酒精提取的本发明的楝树提取物，其减少APP β生成的效果以及促进APPa生成的效果均卓越并未出现差异。而且如[图11]所示，A β抑制效果是，用30％酒精提取时，其功效约下降14％左右，但综合功效依然显示卓越。

由此确定，本发明的楝树提取物以酒精为提取溶剂提取时，不管酒精浓度如何，整体上均发挥出卓越功效，尤其是，将酒精含量调整为30％或50％的提取溶剂实施提取后得到了本发明的功效不但被保留，其毒性反而却大幅下降的结果。

下面对包含本发明的化合物的药学组合物进行说明，但其目的在于为更加具体地说明本发明，而不是对本发明进行限制。

<制剂例1>酸剂的制造

川楝子提取物20mg

乳糖100mg

滑石10mg

将上述成分混合在一起放入气密袋内，从而制造酸剂。

<制剂例2>片剂的制造

川楝子提取物10mg

玉米淀粉100mg

乳糖100mg

硬脂酸镁2mg

将上述成分混合在一起，按照通常的片剂制造方法打锭制造片剂。

<制剂例3>胶襄剂的制造

苦楝皮提取物10mg

结晶性纤维素3mg

乳糖14.8mg

硬脂酸镁0.2mg

按照通常的胶襄剂制造方法，混合上述成分后，填入凝胶胶襄而制造胶襄剂。

<制剂例4>注射剂的制造

川楝素提取物1mg

甘露糖醇180mg

注射用灭菌蒸馏水2793mg

Na₂HPO₄12H₂O 26mg

按照通常的制造方法，每一ample(2ml)按上述成分含量配合制造。

<制剂例5>药液的制造

川楝素提取物2mg

异构化糖浆10g

甘露醇5g

纯净水适量

按照通常的药液制造方法，在纯净水中加入各个成分溶解，并添加适量柠檬香，然后混合上述成分，再加入纯净水，然后整体加入纯净水，调成100ml之后倒入褐色瓶经灭菌处理而制造出药液。

工业应用性

如上所述，本发明的楝树提取物或者川楝素或其药学上可接受的盐为有效成分的药学组合物，其用途和痴呆的预防或治疗方法，对预防或治疗痴呆效果显著。尤其，本发明的组合物、用途或者方法，抑制A β生成、促进APPa生成而保护神经细胞的作用卓越，对如阿尔茨海默病等痴呆预的预防或治疗具有显著功效。因此，本发明的包含楝树提取物或者川楝树为有效成分的组合物、其用途及痴呆的预防或治疗方法，可以广泛应用于针对已患上痴呆或者易患痴呆的年龄层人群的预防或治疗药物的制造等多种领域而显示出其高工业应用性。

Claims (4)

1.一种具有化学式1的川楝素或其药学上能够使用的盐在制备痴呆预防或治疗药物中的应用。

2.楝树提取物在制备预防或治疗痴呆用药物中的应用，其特征在于：所述楝树为楝树的苦楝皮或者川楝子，所述提取物是采用乙酸乙酯、水、甲醇、乙醇以及这些溶剂的混合物中选择的溶剂提取的提取物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述痴呆是指由阿尔茨海默病型痴呆症、脑血管性痴呆症、老年痴呆及头部受损所致痴呆组成的组合中的一种以上疾病。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述痴呆是指由阿尔茨海默病型痴呆症、脑血管性痴呆症、老年痴呆及头部受损所致痴呆组成的组合中的一种以上疾病。

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