CN103675191B - 一种道地药材川楝子的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种道地药材川楝子的质量检测方法，属于医药技术领域。用以川楝素及多种苦味三萜成分如苦楝子酮、脂苦楝子醇，21-O-乙酰川楝子三醇，21-O-甲基川楝子五醇为指标，采用薄层色谱：TLC和高效液相色谱：HPLC分析方法，建立川楝子药材的质量检测方法；本发明在川楝子质量检测方法中，在进行ＴＬＣ检测同时，增加川楝素含量测定为指标，从而确保能采购到正宗的川楝子药材，确保其临床使用的有效性和安全性。

Description

一种道地药材川楝子的检测方法

技术领域

本发明涉及一种道地药材川楝子的检测方法，属于医药技术领域。

背景技术

川楝子又名金铃子，中药材，为楝科落叶乔木川楝树的成熟果实。主要产于中国的南方各地，以四川的产者最为上乘，故又名川楝子。川楝子性寒，味苦，沉降，是行气药的一种。主要入肝经，疏泄肝热，行气止痛，有除湿热、清肝火、止痛、杀虫的功能。主治：胸胁、脘腹胀痛、疝痛、虫积腹痛。治气郁而有热之证尤宜。

发明内容

本发明的目的在于解决因产地不同引起的川楝子药材检测不规范、质量差异较大的问题，从而提供一种道地药材川楝子的检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种道地药材川楝子的检测方法，它包括如下检测步骤：

用以川楝素为指标，采用薄层色谱：TLC和高效液相色谱：HPLC分析方法，建立川楝子药材的检测方法；

A）、 TLC鉴别

取待测粉末2ɡ，加水80ml，超声处理1小时，放冷，离心，取上清液，用二氯甲烷振摇提取3次，每次25 ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液；

另取川楝子对照药材2g，同法制成对照药材溶液，再取川楝素对照品，加甲醇制成每1 ml含1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶Ｇ薄板上，以重量比为16：1的二氯甲烷－甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以对二甲氨基苯甲醛试液，在105℃加热至斑点显色清新；

供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同色的斑点；

B）、含量测定

　　照高效液相色谱－质谱法测定;

　　色谱、质谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以重量比为31：69乙腈－0.01%甲酸溶液为流动相，采用单级四极杆质谱检测器，电喷雾离子化和负离子模式下选择质荷比573离子进行检测．理论板数按川楝素峰计算应不低于8000;

对照品溶液制备：取川楝素对照品，加甲醇制成每1 ml含2μg的溶液．即得;

供试品溶液制备：取待测品中粉0.25g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液2μl，与供试品溶液1－2μl，注入液相－质谱联用仪，测定，以川楝素两个峰面积之和计算，即得；

C）、线性关系考察 

分别取川楝素、苦楝子酮、脂苦楝子醇，21-O-乙酰川楝子三醇，21-O-甲基川楝子五醇对照品溶液6、5、5、5、5ml，置于25 ml量瓶中，摇匀，加甲醇定容；

吸取定容后的溶液 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ml，置10 ml量瓶中，摇匀，加甲醇定容，按上述色谱条件进样测定；

D）、精密度试验 

取混合对照品溶液适量，按上述色谱条件连续进样5次，记录峰面积;

E）、稳定性试验 

取同一供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、12 h进样，记录峰面积;

F）、重复性试验 

取同批次样品适量，分别按B）、含量测定项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件进样，记录峰面积，计算样品含量；

G）、加样回收率试验 

取已知含量的样品约0.5 g，分别加入对照品溶液，按B）、含量测定项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件进样，记录峰面积，计算样品含量和加样回收率；

H）、样品含量测定

称取川楝子样品各适量，分别按B）、含量测定项下方法制备供试品溶液；各吸取10μl分别注入HPLC仪，照上述色谱条件测定峰面积，按外标一点法计算样品中川楝素成分的含量，检测结果得出。

     本发明的有益效果：

本发明在川楝子质量检测方法中，在进行ＴＬＣ检测同时，增加川楝素含量测定为指标，从而确保能采购到正宗的川楝子药材，确保其临床使用的有效性和安全性。

具体实施方式

    下面结合实施例对本发明进行详细描述：

以川楝素及多种苦味三萜成分如苦楝子酮、脂苦楝子醇，21-O-乙酰川楝子三醇，21-O-甲基川楝子五醇为指标，采用薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC）分析方法，建立川楝子药材的质量评价标准。结果：6批川楝子的TLC中均检出川楝素的特征斑点。川楝素、苦楝子酮、脂苦楝子醇，21-O-乙酰川楝子三醇，21-O-甲基川楝子五醇的质量浓度分别在0.06－0.20　、0.003 08～0.061 54、　0.003 74～0.074 88、　0.002 90～0.057 60、0.00106－0.00856 mg/ml范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系（r均为0.999 9）；五者的平均加样回收率分别为100.00％、99.39％、99.81％，97.86%，96.98%；RSD分别为1.80％、1.11％、1.41％、1.25%、1.36%（n＝6）。结论：TLC鉴别方法专属性强；HPLC含量测定方法精密度高、重复性好、简便、快捷，可用于控制川楝子是否地道药材的检测及含量测定，使川楝子质量标准更具有科学性。

1.2 试剂

川楝素对照品（供含量测定用）与川楝子对照药材（中国食品药品检定研究院，批号分别为 110827-201008、110826-200712、120945-200707）；川楝素对照品（单位自制，经HPLC测定、面积归一化法计算纯度＞98％）；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 药材

6批川楝子药材均采自于四川遂宁市，经成都中医药大学张艺研究员鉴定为真品。川楝子样品来源见表1

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

取本品粉末2ɡ，加水80ml，超声处理1小时，放冷，离心，取上清液，用二氯甲烷振摇提取3次，每次25 ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。另取川楝子对照药材2g，同法制成对照药材溶液，再取川楝素对照品，加甲醇制成每1 ml含1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法（附录ＶＩＢ）试验，吸取上述三种溶液各10ul，分别点于同一硅胶Ｇ薄板上，以二氯甲烷－甲醇（16：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以对二甲氨基苯甲醛试液，在105℃加热至斑点显色清新。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同色的斑点。

2.2 含量测定

　　　照高效液相色谱－质谱法（附录ＶＩＤ和二部附录ＩＸＪ）测定。

色谱、质谱条件与系统适用性试验：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈－0.01%甲酸溶液（31：69）为流动相，采用单级四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ＥＳＩ)和负离子模式下选择质荷比（Ｍ／Ｚ）573离子进行检测．理论板数按川楝素峰计算应不低于8000，

对照品溶液制备：取川楝素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含2ug的溶液．即得．

供试品溶液制备：取本品中粉约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得．

测定法：分别精密吸取对照品溶液2ul，与供试品溶液1－2ul，注入液相－质谱联用仪，测定，以川楝素两个峰面积之和计算，即得．

2.3 线性关系考察 分别取上述川楝素、苦楝子酮、脂苦楝子醇，21-O-乙酰川楝子三醇，21-O-甲基川楝子五醇对照品溶液6、5、5、5、5ml，置于25 ml量瓶中，摇匀，加甲醇定容。精密吸取定容后的溶液 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ml，置10 ml量瓶中，摇匀，加甲醇定容，按上述色谱条件进样测定。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，对照品质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程分别为Y＝34.688 0X+2.530 4（r＝0.999 9，n＝5）、Y＝38.683 5X+5.112 0（r＝0.999 9，n＝5）、Y＝36.370 4X+3.797 0（r＝0.999 9，n＝5）。结果表明，川楝素、苦楝子酮、脂苦楝子醇，21-O-乙酰川楝子三醇，21-O-甲基川楝子五醇的质量浓度分别在0.06－0.20　、0.003 08～0.061 54、　0.003 74～0.074 88、　0.002 90～0.057 60、0.00106－0.00856 mg/ml范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.4精密度试验 取混合对照品溶液适量，按上述色谱条件连续进样5次，记录峰面积。结果，川楝素、苦楝子酮、脂苦楝子醇，21-O-乙酰川楝子三醇，21-O-甲基川楝子五醇的峰面积的RSD依次为1.80％、1.11％、1.41％、1.25%、1.36%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取同一供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、12 h进样，记录峰面积。结果，样品川楝素含量检测情况如下：

表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.6 重复性试验 取同批次样品适量，共6份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件进样，记录峰面积，计算样品含量。结果，川楝素、苦楝子酮、脂苦楝子醇，21-O-乙酰川楝子三醇，21-O-甲基川楝子五醇平均含量的RSD均＜2.0％（n均为6），表明本方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验 取已知含量的样品约0.5 g，共6份，精密称定，分别加入一定量的对照品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件进样，记录峰面积，计算样品含量和加样回收率，结果亦相符。

2.8 样品含量测定 称取6批次川楝子样品各适量，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液。各精密吸取10 μl分别注入HPLC仪，照上述色谱条件测定峰面积，按外标一点法计算样品中川楝素成分的含量，检测结果如下：

3 讨论

川楝子在TLC图中对应斑点上有1个主斑点颜色经常不清晰，提示可能由于水煎程度不一致，提取出的杂质量也不一样，受杂质干拢程度不一致，故经常斑点颜色不清晰。因此我公司同时通过多次液相－质谱测定川楝子药材，并与对照品相比对，发现一个主峰，恰好与川楝素出峰时间一致，含量也相近，说明此主斑点就是川楝素，且附近没有其他次峰，显示经甲醇处理后没有提取出杂质。该结果与TLC试验结果是一致的。

2010年版《中国药典》规定，川楝子药材中含川楝素含量不得低于0.060－0.20％。因此，在川楝子质量控制标准中，建议在进行ＴＬＣ检测同时，增加川楝素含量测定为指标，从而确保能采购到正宗的川楝子药材，确保其临床使用的有效性和安全性。 

Claims (1)

1.一种道地药材川楝子的检测方法，其特征在于：它包括如下检测步骤：

用以川楝素为指标，采用薄层色谱：TLC和高效液相色谱：HPLC分析方法，建立川楝子药材的检测方法；

A）、 TLC鉴别

取待测粉末2ɡ，加水80ml，超声处理1小时，放冷，离心，取上清液，用二氯甲烷振摇提取3次，每次25 ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液；

另取川楝子对照药材2g，同法制成对照药材溶液，再取川楝素对照品，加甲醇制成每1 ml含1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶Ｇ薄板上，以重量比为16：1的二氯甲烷－甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以对二甲氨基苯甲醛试液，在105℃加热至斑点显色清新；

供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同色的斑点；

B）、含量测定

　　照高效液相色谱－质谱法测定;

　　色谱、质谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以重量比为31：69乙腈－0.01%甲酸溶液为流动相，采用单级四极杆质谱检测器，电喷雾离子化和负离子模式下选择质荷比573离子进行检测．理论板数按川楝素峰计算应不低于8000;

对照品溶液制备：取川楝素对照品，加甲醇制成每1 ml含2μg的溶液．即得;

供试品溶液制备：取待测品中粉0.25g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液2μl，与供试品溶液1－2μl，注入液相－质谱联用仪，测定，以川楝素两个峰面积之和计算，即得；

C）、线性关系考察 

分别取川楝素、苦楝子酮、脂苦楝子醇，21-O-乙酰川楝子三醇，21-O-甲基川楝子五醇对照品溶液6、5、5、5、5ml，置于25 ml量瓶中，摇匀，加甲醇定容；

吸取定容后的溶液 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ml，置10 ml量瓶中，摇匀，加甲醇定容，按上述色谱条件进样测定；

D）、精密度试验 

取混合对照品溶液适量，按上述色谱条件连续进样5次，记录峰面积;

E）、稳定性试验 

取同一供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、12 h进样，记录峰面积;

F）、重复性试验 

取同批次样品适量，分别按B）、含量测定项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件进样，记录峰面积，计算样品含量；

G）、加样回收率试验 

取已知含量的样品约0.5 g，分别加入对照品溶液，按B）、含量测定项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件进样，记录峰面积，计算样品含量和加样回收率；

H）、样品含量测定

称取川楝子样品各适量，分别按B）、含量测定项下方法制备供试品溶液；各吸取10μl分别注入HPLC仪，照上述色谱条件测定峰面积，按外标一点法计算样品中川楝素成分的含量，检测结果得出。