CN113209241B - 香姜挥发油在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了香姜挥发油在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。本发明中，具有治疗非小细胞肺癌的香姜挥发油是由香姜地下根茎经水蒸气蒸馏提取得到，该挥发油对非小细胞肺癌细胞有明显增殖抑制，可通过激活p53，诱发线粒体介导的凋亡和导致G1期阻滞，进而发挥抗肿瘤生物学效应，具有治疗非小细胞肺癌等抗肿瘤新药研发的前景。

Description

香姜挥发油在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用
技术领域
本发属于生物医药领域，具体涉及香姜挥发油在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
背景技术
肺癌是常见的癌症之一，约占全球癌症总死亡人数的19％。中国肺癌的发病率为每十万人中有73.3例，在恶性肿瘤中排名第一，其中男性癌症中占27.21％，女性癌症中占21.92％，是死亡率最高的癌症(Evid Based Complement Alternat Med,2018,2018:8567905)。在肺癌总发病率中，非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)占比最高，约占85％(J BUON,2019,24(4):1470-1475)。目前化学疗法结合外科手术和放射疗法已被用于肺癌症治疗，但其副作用大，如肾毒性和神经毒性对患者的存活不利(Mol CellBiochem,2021,476(1):57-68)。因此，迫切需要开发有较小毒副作用的有效药物。
天然产物是抗肿瘤药物的重要来源。姜科植物挥发油可以作为抗肿瘤药物的来源，且已经有姜科植物莪术挥发油开发成为抗肿瘤药物：莪术油注射液。而且来源于莪术挥发油的榄香烯已经被开发成为抗肿瘤药物：榄香烯乳状注射液和口服乳，其中榄香烯乳状注射液已经用于治疗肺癌。
香姜(Alpinia coriandriodora D.Fang)为姜科(Zingiberaceae)山姜属(Alpinia)多年生草本植物，主要分布于中国的广西和湖南省(中国植物志[M].北京:北京科学出版社,1981,第16(2)卷:81)。既可药用，又可食用，具备驱风行气、发汗、温胃、止吐、祛痰、解毒、杀菌等作用，常用于治疗风寒感冒、胃脘胀痛等疾病，并可做调味香料和蔬菜(Nat Prod Bioprospect,2021,11(1):63-72；J Food Biochem,2020,44(8):e13293)。香姜在食品和药品上具有很大的开发价值，但目前对于香姜的化学成分及药理活性研究较少，未见其挥发油抗癌作用的相关报道。
发明内容
本发明的目的：提供香姜挥发油在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用，开拓了香姜挥发油的新用途，为治疗非小细胞肺癌的药物提供了新选择。
本发明还发现了香姜挥发油对人非小细胞肺癌细胞增殖的抑制作用以及诱导凋亡和细胞周期阻滞作用，并对香姜挥发油的化学成分进行鉴定。
本发明采取的技术方案如下：香姜挥发油在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用
香姜挥发油通过以下方法制备得到：
将鲜的香姜地下根茎粉碎，将粉碎的原料与蒸馏水按1:2～1:5的料液比混合，将混合物料在挥发油提取器中提取水蒸汽蒸馏3～5h，收集挥发油，无水硫酸钠除水，得到香姜挥发油。
本发明通过GC-MS确定了香姜挥发油的化学成分(详细见图1和表1)，其中主要的化学成分为(E)-2-癸烯醛((E)-2-decenal,56.3％)、(E)-2-乙酸癸酯((E)-2-Decenylacetate,19.6％)、(Z)-3-十二碳烯乙酸酯((Z)-3-Dodecenyl acetate,3.8％)、反-2-辛烯醛((E)-2-Octenal,3.6％)和反式-2-癸烯酸(trans-2-Decenoic acid,3.2％)。
所述治疗非小细胞肺癌的药物是抑制非小细胞肺癌细胞增殖的药物。
所述治疗非小细胞肺癌的药物是诱导非小细胞肺癌细胞凋亡和抑制细胞周期的药物。
所述诱导非小细胞肺癌细胞凋亡和抑制细胞周期的药物是通过激活p53，诱发线粒体介导的凋亡和导致G1期阻滞的药物。
将香姜挥发油提取物和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、脂肪乳剂、栓剂、滴丸、软膏剂剂型的药物。
本发明通过试验研究发现了香姜挥发油对人非小细胞肺癌细胞毒活性与阳性对照榄香烯乳状注射液(来源于姜科植物莪术挥发油的可用于治疗肺癌的药物)作用效果相当，同时对正常细胞的细胞毒性较低，表现出低毒和高抗肿瘤活性；对人非小细胞肺癌细胞增值有明显抑制作用；对人非小细胞肺癌细胞凋亡有促进作用；对人非小细胞肺癌细胞周期有阻滞作用。
通过采用上述技术方案，本发明首次发现了香姜挥发油在治疗非小细胞肺癌疾病方面的新用途，为治疗人非小细胞肺癌的药物提供了新选择，在制药行业具有重要的应用价值。
附图说明
图1为香姜地下根茎挥发油的GC-MS色谱图；
图2为香姜挥发油对非小细胞肺癌(A549)和正常细胞(L929)的细胞毒性对比；
图3为香姜挥发油对A549细胞克隆形成的影响；
图4为图3-6香姜挥发油对A549细胞周期的影响。(A)香姜挥发油处理后，A549细胞周期流式细胞仪检测结果，(B、C)A549细胞在不同时期(G1、S、G2)比例统计；
图5为香姜挥发油对A549细胞周期相关蛋白水平的影响。(A)香姜挥发油处理后，细胞周期相关蛋白的Western blot结果，(B-D)Western blot条带灰度值定量统计结果；
图6为香姜挥发油对A549细胞凋亡形态学观察。(A)香姜挥发油对A549细胞形态学影响，(B)AO/EB染色分析香姜挥发油诱导A549细胞的凋亡，(C)Hoechst 33258染色分析香姜挥发油诱导A549细胞的凋亡；
图7为流式细胞仪分析香姜挥发油诱导A549细胞的凋亡。(A)A549细胞用不同浓度香姜挥发油处理24h后，用Annexin V-FITC和PI染色后，通过流式细胞仪分析，(B)总凋亡细胞和活细胞比例的统计结果；
图8为JC-1染色分析香姜挥发油对A549细胞线粒体膜电位的影响；
图9为香姜挥发油对A549细胞凋亡相关蛋白Caspase 9和Caspase 3水平的影响。(A)香姜挥发油处理48h后，凋亡相关蛋白Caspase 9和Caspase 3的表达水平，(B-E)Pro-Caspase 9、Cleaved-Caspase 9、Pro-Caspase 3和Cleaved-Caspase 3条带灰度值定量统计结果；
图10为香姜挥发油对A549细胞凋亡相关蛋白水平的影响。(A)香姜挥发油处理48h后，凋亡相关蛋白的表达水平，(B-D)p53、Bax/Bcl-2和Cleaved-PARP条带灰度值定量统计结果；
图11为香姜挥发油对A549细胞Cyt C和Apaf-1蛋白水平的影响。(A)香姜挥发油处理48h后，凋亡相关蛋白Cyt C和Apaf-1的表达水平，COX IV为线粒体Cyt C内参，β-actin为Total Cyt C和Apaf-1内参，(B-D)Mitochondria Cyt C、Total Cyt C和Apaf-1条带灰度值定量统计结果。
具体实施方式
本发明的实施例：将鲜的香姜地下根茎(采收地：广西南宁；由贵州大学胡国雄教授鉴定)粉碎，将粉碎的原料与蒸馏水按1:3的料液比混合，将混合物料在挥发油提取器中提取水蒸汽蒸馏4h，收集挥发油，无水硫酸钠除水，得到香姜挥发油，密封保存于4℃冰箱
本实施例香姜挥发油的化学成分：通过GC-MS鉴定香姜挥发油的化学成分。GC-MS分析条件：进样量2μL，色谱柱为HP-5MS(60m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱，初始温度70℃(保留2min)，以2℃/min升温至180℃，再以10℃/min升温至310℃(保留14min)，运行时间：84min；汽化室温度250℃；载气为高纯He(99.999％)；柱前压18.53psi，载气流量1.0mL/min，分流，分流比10：1，溶剂延迟时间：6.0min；离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1847V；接口温度280℃；质量范围29～500amu。对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist2014和Wiley275标准质谱图，确定化学成分，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对质量分数。香姜地下根茎挥发油的化学成分如图1和表1所示，共鉴定了31种化学成分，共占总峰面积的95.8％，其中主要的化学成分为(E)-2-decenal(56.3％)、(E)-2-decenyl acetate(19.6％)、(Z)-3-dodecenyl acetate(3.8％)、(E)-2-octenal(3.6％)和trans-2-decenoic acid(3.2％)。
表1香姜地下根茎挥发油的化学成分
Figure BDA0003123534600000051
Figure BDA0003123534600000061
a计算保留指数(RI)：经C8-C30正构烷烃的混标计算的HP-5MS(60m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱上的保留指数；
b数据库保留指数(RI)：来自NIST 2017质谱数据库的保留指数；
注：基于Wiley 275和NIST 2017质谱数据库以及计算保留指数与数据库保留指数进行对比，鉴定活性成分。
tr：表述含量低于0.01％。
药理实例1：香姜挥发油对人非小细胞肺癌细胞(A549)、人前列腺癌细胞(PC-3)、人非小细胞肺癌细胞株(NCI-H1299)及正常细胞人胚肺成纤维细胞(MRC-5)和常用于细胞毒性评价的小鼠成纤细胞(L929)的细胞毒性
实验过程均使用完全培养基，即RPMI-1640培养基中，含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。选取对数期的细胞，胰酶消化后，通过血球计数板计数后，用RPMI-1640完全培养基稀释到所需的细胞浓度；80μL接种于96孔板(每空接种5×103个细胞)，置于CO2细胞培养箱中培养24h；待细胞完全稳定或贴壁后，每孔加入20μL由RPMI-1640培养基稀释的吐温-80香姜挥发油药液，阴性对照组为等体积的培养基，每组设5个平行孔，继续37℃，5％CO2培养箱中培养48h；共培养后，每孔加10μLMTT(5mg/mL)后，再于37℃5％CO2培养箱中孵育4h；取出96孔板，吸掉培养基上清液。加入DMSO 150μL，振荡10min，使DMSO完全溶解MTT反应的产物。用酶标仪读取490nm波长下的OD值，结果重复三次，取平均值。
抑制率的计算公式如下：细胞株抑制率＝[1－(样品组OD值－调零孔OD值)/(对照组OD值－调零孔OD值)]×100％。
采用SPSS 25.0分析软件，计算抑制一半细胞增殖所需样品的浓度(IC50)，使用IC50评价样品的细胞毒性。结果如表2所示，香姜地下根茎挥发油对对人非小细胞肺癌细胞(A549)(IC50＝39.38±1.59μg/mL)的细胞毒活性最佳，表现出与阳性对照榄香烯乳状注射液(IC50＝36.87±1.77μg/mL)相当的作用效果(p>0.05)，且同时对正常细胞L929(IC50＝144.87±7.91μg/mL)和MRC-5(IC50＝167.36±17.34μg/mL)的细胞毒性较低。此外，对人肿瘤细胞PC-3(IC50＝35.23±1.49μg/mL)和人非小细胞肺癌细胞株(NCI-H1299)表现出较好的细胞毒性作用。通过香姜挥发油对A549和L929细胞的抑制作用对比(如图2所示)，香姜挥发油对A549细胞作用相当于阳性对照药榄香烯乳状注射液，且对正常细胞的毒性较低，表明香姜挥发油对癌细胞具有较好的选择性，具备低毒、高抗肿瘤活性的特征。
表2香姜挥发油对肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒活性
Figure BDA0003123534600000081
药理实例2：香姜挥发油对A549细胞增殖的影响(平板克隆形成实验)
取A549对数期细胞，经0.25％胰蛋白酶消化后，用RPMI-1640(含10％胎牛血清)培养液重悬；经血球计数板计数后，按200个/孔接种于6孔板中，并吹打分散细胞，置于CO2培养箱中培养24h；丢弃培养基，按照空白组和香姜挥发油处理组，分别给药0、5、10、15、20、25μg/mL。每组设三个复孔，继续常规培养，3d后更换新鲜培养基连续培养10d；在倒置显微镜下观察，随时查看细胞增殖状态及集落形成情况，直至形成肉眼可见的细胞集落；吸弃培养基，PBS润洗两次，每孔加入800μL固定液，室温静置30min后丢弃固定液，加入800μL的0.1％结晶紫染液进行染色。避光放置15min后，丢弃染液，用蒸馏水底洗去染液，室温放置使蒸馏水挥干；将6孔板置于白色背景布下，拍照后计数，计算其单克隆率。
通过平板克隆形成实验，考察了香姜挥发油对A549细胞集落形成的影响，探究其对A549细胞增殖的抑制作用，结果分别如图3所示。与未经香姜挥发油处理的空白组相比，香姜挥发油显著的减少A549细胞集落的数量和大小(图3A)。如图3B所示，与空白组相比(克隆形成率：35.50±0.71％)，5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL和25μg/mL浓度的香姜挥发油作用于A549细胞10天后，A549细胞克隆形成率分别降低为22.25±1.06％、16.75±0.35％、11.50±1.41％、5.50±0.71％和1.75±0.35％，表明香姜挥发油以剂量依赖方式显著地降低A549细胞的克隆形成率(p＜0.001)。综上，香姜挥发油显著地减少集落的数量和大小，且以剂量依赖方式显著地降低A549细胞的克隆形成率，对A549细胞增殖具有显著的抑制作用。
药理实例3：香姜挥发油对A549细胞周期的影响
取A549对数期细胞，经血球计数板计数后，按3×105个/孔接种于6孔板中，置于CO2培养箱中培养24h；丢弃培养基，按照空白组和香姜挥发油处理组，分别给药0、20、40、80、100和160μg/mL，每组设三个复孔，继续常规培养24h；胰蛋白酶消化，收集细胞于EP管中，800r/min离心10min，弃培养基，PBS润洗，离心弃上清液后，PBS重悬细胞，计数并调整细胞浓度为1×106个/mL；取1mL细胞悬液到EP管中，离心弃上清，再PBS润洗，离心弃上清；加入Permeabilization solution(10μL)和DNA Staining solution(1mL)，涡旋振荡5～10秒混匀，室温避光孵育30min；在流式细胞仪上检测激发波长488nm处的红色荧光，进而分析细胞周期各时相。通过流式细胞仪检测了香姜挥发油对A549细胞周期的影响，结果如图4所示。与未经香姜挥发油处理的空白组相比，香姜挥发油显著地增加了G1期细胞的比例，同时显著地下调了S期和G2期细胞的比例，导致G1期阻滞。与空白组相比(G1期：45.99±0.48％)，当20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、100μg/mL和160μg/mL的香姜挥发油作用于A549细胞24h后，A549细胞G1期细胞的比例分别增加为51.26±0.38％、54.45±0.38％、59.10±0.55％、60.19±0.03％和64.82±0.68％，表明香姜挥发油以剂量依赖方式显著地增加了G1期细胞的比例(p＜0.001)。因此，香姜挥发油显著地增加了G1期细胞的比例，导致A549细胞G1期阻滞。
通过Western blot研究香姜挥发油对A549细胞周期相关蛋白表达的影响，结果如图5所示。香姜挥发油(10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL和60μg/mL)处理后，p21的表达水平显著增加；香姜挥发油以剂量依赖方式显著地抑制了A549细胞CDK2的蛋白水平(p＜0.05或p＜0.001)；此外，与CDK2形成蛋白复合物的Cyclin E2被香姜挥发油以剂量依赖方式显著地抑制(p＜0.001)。与空白组相比，香姜挥发油处理后，CDK4的表达水平显著下调(p＜0.05或p＜0.01)；与空白组相比，香姜挥发油在浓度为40μg/mL和60μg/mL时，会抑制CDK6表达水平(p＜0.05)，但在10μg/mL和20μg/mL浓度下，CDK6表达水平上升；此外，香姜挥发油以剂量依赖方式显著的抑制了A549细胞Cyclin D3的蛋白水平(p＜0.001)。综上，香姜挥发油通过上调p21的蛋白水平，同时下调CDK2、Cyclin E2、CDK4、CDK6、Cyclin D3的蛋白水平，共同作用减少了Cyclin E2-CDK2和Cyclin D3-CDK4/6蛋白复合物的形成，从而降低了Cyclin E2-CDK2和Cyclin D3-CDK4/6蛋白复合物的活性，阻碍G1期向S期的转换及G1期进程，导致G1期阻滞。
药理实例4：香姜挥发油对A549细胞凋亡的影响
(1)给药处理：取A549对数期细胞，经0.25％胰蛋白酶消化后，用RPMI-1640(含10％胎牛血清)培养液重悬；经血球计数板计数后，按5×105个/孔接种于6孔板中，置于CO2培养箱中培养24h；丢弃培养基，加入2mL含药培养液(0、20、40、80、100和160μg/mL)，继续培养48h。
(2)给药处理后，置于倒置显微镜下观察A549细胞形态学变化。
(3)如(1)给药处理后，进行AO/EB染色。将AO染液与EB染液按1:1比例混合，涡旋使其充分溶解；弃培养基，用预冷的PBS缓冲液轻柔洗一次，每孔加入800μL AO/EB染液，避光孵育5min；吸去染液，在倒置荧光显微镜下观察，拍照并分析。
(4)如(1)给药处理后，进行Hoechst 33258染色。弃培养液，每孔加入0.5mL固定液，固定10min，弃固定液，用预冷PBS洗涤两次，来回晃动数次，吸净液体；每孔加入0.5mLHoechst 33258染色液，染色5min，期间晃动数次，弃染色液，用预冷PBS洗涤两次，来回晃动数次，吸净液体；在倒置荧光显微镜下观察，拍照并分析。如图6A所示，不同浓度的香姜挥发油处理A549细胞48h后，随着香姜挥发油浓度的增加，皱缩的细胞显著增多；如图6B所示，不同浓度的香姜挥发油处理后，绿色荧光的比例逐渐减少，同时橙红色荧光的比例逐渐增多，表明凋亡细胞逐渐增多；如图6C所示，不同浓度的香姜挥发油处理后，呈现致密核的明亮蓝色荧光的细胞比例逐渐增多，具备细胞凋亡特征。以上形态学观察均表明：香姜挥发油能有效诱导A549细胞的凋亡。
采用Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪，进一步定量检测香姜挥发油诱导A549细胞凋亡作用，结果如图7所示。与空白组相比(凋亡率：3.05±0.06％)，当20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、100μg/mL和160μg/mL浓度的香姜挥发油作用于A549细胞24h后，A549细胞凋亡的比例分别增加为7.50±0.46％、15.22±0.57％、19.72±0.93％、27.06±1.29％和46.44±0.49％，表明香姜挥发油以剂量依赖方式显著地增加了凋亡的比例(p＜0.01或p＜0.001)，同时香姜挥发油显著地降低了活细胞的比例。因此，香姜挥发油以剂量依赖方式显著地诱导了A549细胞的凋亡。
线粒体膜电位的下调是细胞凋亡的标志性事件。JC-1是检测线粒体膜电位(ΔΨm)的荧光探针。当线粒体膜电位较高时，JC-1在线粒体基质中形成聚合物，产生红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1不能在线粒体基质中形成聚合物，JC-1为单体，产生绿色荧光。通过红绿荧光衡量线粒体的ΔΨm值。JC-1染色的结果如图8所示。不同浓度的香姜挥发油处理A549细胞48h后，红色荧光细胞的比例逐渐减少，绿色荧光细胞的比例逐渐增多，特别是香姜挥发油在80μg/mL和160μg/mL浓度下，细胞基本都呈现为绿色荧光。结果表明香姜挥发油能有效导致A549细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的下调，从而导致凋亡。
通过WB实验研究p53介导的凋亡通路相关蛋白的表达情况。首先研究了香姜挥发油对p53通路中Pro-Caspase 9、Cleaved-Caspase9、Pro-Caspase 3和Cleaved-Caspase 3的表达情况，如图9所示。结果表明：与未经香姜挥发油处理的空白组相比，香姜挥发油(浓度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL和60μg/mL)以剂量依赖方式显著的下调了Pro-Caspase 9的表达水平(p＜0.001)，同时以剂量依赖方式显著的上调了Cleaved-Caspase 9的表达水平(p＜0.01或p＜0.001)，表明Caspase 9被裂解激活；香姜挥发油在浓度为20μg/mL、40μg/mL和60μg/mL时，以剂量依赖方式显著的下调了Pro-Caspase3的表达水平(p＜0.001)，同时以剂量依赖方式显著的上调了Cleaved-Caspase 3的表达水平(p＜0.05或p＜0.001)，表明Caspase 3被裂解活化。因此，香姜挥发油在A549细胞通过裂解激活Caspase 9(Pro-Caspase 9下调，Cleaved-Caspase 9上调)，从而导致Caspase 3(Pro-Caspase 3下调，Cleaved-Caspase 3上调)的裂解活化。
香姜挥发油对p53、Bax、Bcl-2和Cleaved-PARP的表达情况的影响，如图10所示。结果表明：香姜挥发油(10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL和60μg/mL)处理后，p53的表达水平以剂量依赖方式显著增加，从空白组的1.00±0.25，分别增加为3.21±0.11、4.98±0.08、9.35±0.28和11.07±0.34(p＜0.01或p＜0.001)；香姜挥发油显著地上调了Bax的表达水平，同时显著地抑制了Bcl-2的表达水平，Bax与Bcl-2的比值(Bax/Bcl-2)以剂量依赖方式显著地上调(p＜0.05或p＜0.001)；香姜挥发油显著地上调了Cleaved-PARP的表达水平(p＜0.05或p＜0.001)。因此，香姜挥发油在A549细胞通过上调p53，导致Bax/Bcl-2比值增加，PARP裂解失活(Cleaved-PARP上调)。
p53介导的细胞凋亡时，Cyt C(cytochrome c，细胞色素C)从线粒体中释放到胞浆，Cyt C在dATP存在下，与Apaf-1、Caspase-9形成凋亡体，裂解激活Caspase-9。香姜挥发油对Cyt C、Total Cyt C和Apaf-1的表达情况的影响，如图11所示。结果表明：香姜挥发油处理后，线粒体中Cyt C的水平以剂量依赖方式显著下降(p＜0.01或p＜0.001)，而总蛋白中Cyt C(Total Cyt C)的水平(在香姜挥发油20μg/mL、40μg/mL和60μg/mL浓度下)显著上调(p＜0.01或p＜0.001)，表明Cyt C从线粒体中释放。同时，与空白组相比，香姜挥发油显著地上调了Apaf-1的表达水平，但无明显剂量依赖性。因此，香姜挥发油在A549细胞中导致Cyt C从线粒体中释放(Mitochondria Cyt C下调和Total Cyt C上调)，同时上调Apaf-1，从而促进凋亡体的形成。
综上所述，通过形态学观察、AO/EB染色、Hoechst 33258染色和流式细胞仪凋亡检测，结果表明香姜挥发油诱导了A549细胞凋亡；JC-1染色结果表明香姜挥发油导致线粒体膜电位(ΔΨm)下调；细胞内活性氧(ROS)测定结果表明香姜挥发油增加了ROS产生；结合p53通路凋亡相关Western Blot的结果，表明香姜挥发油诱导A549凋亡的机制如下：香姜挥发油通过激活p53，增加了ROS的产生和Bax/Bcl-2的比值，从而导致线粒体膜通透性增高，线粒体膜电位(ΔΨm)下调，线粒体释放Cyt C(Mitochondria Cyt C下调，Total Cyt C上调)到胞浆，同时上调Apaf-1，促进凋亡体的形成，从而裂解活化Caspase-9(Pro-Caspase 9下调，Cleaved-Caspase 9上调)，随后切割激活Caspase-3(Pro-Caspase 3下调，Cleaved-Caspase 3上调)，进而剪切失活PARP(Cleaved-PARP上调)，导致A549的凋亡。
综合以上药理实例，香姜挥发油导致A549细胞G1期阻滞和诱导凋亡的分子机制如下：香姜挥发油通过激活p53通路，p53↑→p21↑→Cyclin E2-CDK2和Cyclin D3-CDK4/6活性↓→G1期阻滞；香姜挥发油通过p53↑→ROS↑和Bax/Bcl-2↑→线粒体膜电位(ΔΨm)↓→线粒体释放Cyt C，同时Apaf-1↑→激活Caspase-9→Caspase-3活化→PARP失活→诱导凋亡。综上，香姜挥发油通过激活p53通路，导致A549细胞G1期阻滞和凋亡，从而抑制A549细胞增殖。

Claims (5)

1.香姜挥发油在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用，其特征在于：所述的香姜挥发油是通过以下方法获得：
将鲜的香姜地下根茎粉碎，将粉碎的原料与蒸馏水按1:2～1:5g/mL的料液比混合，将混合物料在挥发油提取器中提取水蒸气蒸馏3～5h，收集挥发油，无水硫酸钠除水，得到所述的香姜挥发油。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述治疗非小细胞肺癌的药物是抑制非小细胞肺癌细胞增殖的药物。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述治疗非小细胞肺癌的药物是诱导非小细胞肺癌细胞凋亡和抑制细胞周期的药物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述诱导非小细胞肺癌细胞凋亡和抑制细胞周期的药物是通过激活p53，诱发线粒体介导的凋亡和导致G1期阻滞的药物。
5.根据权利要求1所述的香姜挥发油在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用，其特征在于：将香姜挥发油提取物和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、脂肪乳剂、栓剂、滴丸、软膏剂剂型的药物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102258733A (zh) * 2011-07-04 2011-11-30 广东医学院 一种从高良姜提取的抗癌挥发油的制备方法及应用

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