TWI527828B - 新穎的三萜化合物及其用途 - Google Patents
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Description
本揭示內容是有關於一種新穎的三萜化合物及其用途,其可用來製備一種用以治療腎臟疾病(例如急性腎臟損害與慢性腎臟病)的藥物。
急性腎臟損害(acute kidney injury,AKI),又稱急性腎衰竭(acute kidney failure),肇因於腎臟過濾功能被迅速破壞,導致體內含氮物質的代謝物(如尿素或肌酐酸)快速累積在血液中,因而使個體出現疲累、食慾下降、頭痛、噁心或嘔吐等徵狀,並伴隨尿液量減少。AKI盛行於住院病患中,特別是重病患者。造成AKI的原因很多,例如組織缺血後再灌流、重傷、腎臟病或腎臟移植。但目前臨床上尚無明確專一的藥物可治療AKI,因此多採用支持性治療(例如,透析),以減輕症狀為主要目的。如果患者能從上述疾病中康復,往往也會發展成為長期、慢性腎臟病患者,需要依賴長期洗腎,病情嚴重的患者,甚至需要腎臟移植。
目前用來判定AKI患者的病情嚴重程度以及是否可能進展成CKD的指標是腎小球過濾率(glomerular
filtration rate,GFR)。GFR值下降往往伴隨血中尿素氮(blood urine nitrogen,BUN)與血清肌酐酸(serum creatinine,CRE)量增加,因此,若一化合物或多個化合物的組合可有效提高GFR,同時抑制BUN及CRE,將是潛在可用來製備能治療或預防腎臟疾病(包括急性腎臟損害和慢性腎臟病)藥物的先導化合物。
本揭示內容至少部分係基於發現一種自靈芝(Ganoderma lucidum)之子實體或菌絲體中單離或純化而來的新穎三萜化合物以及包含此新穎三萜化合物的組合物,其可降低與腎炎相關生化指標物含量(包括血中尿素氮和血清肌酐酸含量)以及提高腎絲球過濾率。此發現暗示本揭示內容之新穎三萜化合物以及包含此新穎三萜化合物的組合物,可作為能治療或預防腎臟疾病(包括急性腎臟損害和慢性腎臟病)之藥物。
因此,本揭示內容之第一目的是提供一種具有下式(I)結構之三萜化合物,
依據本發明實施方式,所述式(I)結構之三萜
化合物本身即可降低與腎炎相關生化指標物含量,包括血中尿素氮(blood urine nitrogen,BUN)與肌酐酸(serum creatinine,CRE)含量;以及提高腎絲球過濾率(glomerular filtration rate,GFR),因此可用來製造可治療或預防腎臟疾病的藥物。
本揭示內容之第二目的是提供一種用以治療
或預防腎臟疾病的藥學組合物。此藥學組合物包含一藥學有效量之上述式(I)結構之三萜化合物、其藥學上可接受的鹽類、酯類或溶合物;以及其藥學上可接受的載體。
依據本發明實施方式,所揭示藥學組合物可
更包含至少另一種三萜化合物,其係選自由以下物質組成的族群中:赤芝酸C(Iucidenic acid C,LAC)、赤芝酸N(Iucidenic acid N,LAN)、赤芝酸E2(Iucidenic acid E2,LAE-2)、赤芝酸A(Iucidenic acid A,LAA)、赤芝酸B(Iucidenic acid B,LAB)、赤芝酸D2(Iucidenic acid D2,LAD2)及其之組合。
依據一較佳實施方式,所揭示藥學組合物包
含上述式(I)結構之三萜化合物與LAA、LAB、LAC、LAD2、LAE2和LAN之組合,以及其藥學上可接受的載體。此外,所述藥學組合物中,式(I)結構之三萜化合物與LAC的量分別約為三萜化合物總量的5-15%(重量%);LAA與LAD2的量分別約為三萜化合物總量的15-30%(重量%);LAE2的量約為三萜化合物總量的8-15%(重量%);LAN與LAB的量分別約為三萜化合物總量的5-12%(重量%)。
適合以所述藥學組合物進行治療或預防之腎
臟疾病包含急性腎臟損害(acute kidney injury,AKI)與慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)。在一實例中,該腎臟疾病為AKI,例如急性腎臟發炎。在另一實例中,該腎臟疾病為CKD,例如慢性腎臟發炎。
若以醫藥品或藥學組合物總重量為基準,本
發明三萜化合物組合總量約占該藥學組合物總重量的0.1%至99%(重量%)。在某些實施方式中,本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的1%。在特定實施方式中,本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的5%。在其他實施方式中,本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的10%。在另外實施方式中,本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的25%。
本揭示內容之第三目的是提供一種治療腎臟
疾病的方法。所述方法包括對需要治療的個體施用一治療有效量之本發明式(I)結構之三萜化合物;或是上述的藥學組合物。依據一最佳實施方式,所述藥學組合物包含該式(I)結構之三萜化合物、其藥學上可接受的鹽類、酯類或溶合物,以及LAA、LAB、LAC、LAD2、LAE2和LAN;和其藥學上可接受的載體。適合以本發明方法進行治療的腎臟疾病包含AKI與CKD。在一實例中,該腎臟疾病為AKI,例如急性腎臟發炎。在另一實例中,該腎臟疾病為CKD,例如慢性腎臟發炎。適合以本發明方法進行治療的個體可以是哺乳動物,較佳是人類。
透過以下的詳細說明與附隨之申請專利範圍
將可更了解本揭示內容的這些及其他特徵。需知以上的概述及以下的詳細說明僅為例示,用來闡述本揭示內容,而非用以限制本揭示內容之範疇。
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂,所附圖式之說明如下:第1A圖是依據本發明一實施方式所繪示之本發明式(I)化合物抑制順鉑所誘發的腎臟細胞凋亡的情形;第1B圖是依據本發明一實施方式所繪示之本發明藥學組合物YKII-10抑制順鉑所誘發的腎臟細胞凋亡的情形;第2A圖是依據本發明一實施方式所繪示之本發明藥學組合物YKII-10於活體內抑制順鉑所誘發的血清尿素氮含量增加的情形;第2B圖是依據本發明一實施方式所繪示之本發明藥學組合物YKII-10於活體內抑制順鉑所誘發的血清肌酐酸含量增加的情形;第3圖是依據本發明一實施方式所繪示的本發明式(I)化合物與藥學組合物YKII-10分別於活體內降低脂多醣所誘發的尿素氮增加的情形;第4A圖是依據本發明一實施方式所繪示之本發明藥學組合物YKII-10於活體內抑制馬兜鈴酸所誘發的血清尿素氮含量增加的情形;
第4B圖是依據本發明一實施方式所繪示之本發明藥學組合物YKII-10於活體內抑制馬兜鈴酸所誘發的血清肌酐酸含量增加的情形;第5圖是依據本發明一實施方式所繪示的本發明藥學組合物YKII-10於活體內提高腎小球過濾率的情形;及第6圖是依據本發明一實施方式所繪示的本發明藥學組合物YKII-10於活體內提高腎功能的情形。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備,下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述;但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而,亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
以下為本說明書中所用特定名詞的說明:在本文中,「治療(treatment or treating)」一詞包括可導致欲求之藥學和/或生理效果的防止性(即,預防性)、治癒性或緩和性處置。該效果較佳是指醫療上可部分或完全治癒或防止腎臟細胞凋亡。此外,「治療」一詞在此係指基於可部分或完全減輕、延遲發生、抑制進程、減輕嚴重性、和/或減少一種特定疾病、異常和/或醫療狀況之一或多個病徵出現機率之目的,而對受測
個體(或患者),尤指具有一種醫療狀況、一種該醫療狀況之症狀、一種因該醫療狀況而引起的疾病或病症、或是對會使朝向該醫療狀況發展的先期狀況的個體,施用或施加本揭示內容的化合物或藥學組合物。亦可對尚未出現特定疾病、異常和/或醫療狀況之明顯病徵的個體,和/或僅對該特定疾病、異常和/或醫療狀況產生早期病徵的個體進行治療,以期降低產生該特定疾病、異常和/或醫療狀況相關之病理的風險。在本文中,所述病徵、疾病、異常和/或醫療狀況可以是急性腎臟損傷(acute kidney injury,AKI)或慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)。若能減少一或多個病徵或臨床指標即代表該治療是「有效」的。讚本文中,「 」
「預防(prophylaxis)」在此是指對一種未來事件的防制手段。基於本文中預防腎臟細胞因毒物或藥物進而潛藏地增加了該些腎臟細胞凋亡的文意,因此,可於個體暴露在該毒物或藥物之前、同時或之後,實施本文所述的預防性處置手段。
「一有效量(an effective amount)」一詞意將對於治療腎臟疾病的目的,此一用量在經過適當的給藥期間後,能夠達到降低血清尿素氮和肌酐酸量、減少腎臟細胞凋亡或是提高腎小球過濾率等目的。依據某些實施方式,式(I)化合物或是包含式(I)化合物的組合物是在一受測個體被暴露在會導致腎臟傷害的毒性物質(如,化療藥物、脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)或是馬兜鈴酸(Aristolochic acid I,AA-I))之前,以預防性地方式先施用至
受測個體身上。
「化合物(compound)」、「組合物(composition)」、「藥劑(agent)」或「醫藥品(medicine or medicament)」等詞在此可交替使用,且都是指當施用於一個體(人類或動物)時,能夠透過局部和/或全身性作用而誘發所亟求的藥學和/或生理反應的一種化合物或組合物。
「施用(administered、administering或、administration)」一詞在此係指直接施用所述的化合物或組合物,或施用活性化合物的前驅藥(prodrug)(例如,活性化合物的酯類)、衍生物(derivative)、或類似物(analog)等,而可於施用個體體內形成該活性化合物之一相當用量者。
本文中交替使用「個體(subject)」或「患者(patient)」等詞,其係指可接受所述化合物和/或方法治療的動物(包括人類)。「個體」或「患者」在此涵蓋了雄性與雌性兩種性別,除非另有具體說明。因此「個體」或「患者」包含任何哺乳類動物,包括,但不限於,人類、非人類的靈長類,如哺乳動物、狗、貓、馬、羊、豬、牛等,其可因利用所述化合物進行治療而獲益。適合接受本發明化合物和/或方法治療的動物較佳為人類。一般來說,「患者」一詞及「個體」一詞在本文中可彼此交替使用。
「一有效量(an effective amount)」或「一藥學有效量(a therapeutically effective amount)」兩者可互相交替使用,意指對治療對
象施用一具有療效之化合物或組合物的劑量。療效之衡量可為客觀的(利用一些試驗或標誌來衡量)或是主觀的(治療對象給予其對效果與感覺之敘述)。上述之化合物或組合物的有效劑量範圍可自約0.1毫克/公斤/天至約100毫克/公斤/天,較佳是自1毫克/公斤/天至約50毫克/公斤/天,更佳是自5毫克/公斤/天至約10毫克/公斤/天。有效劑量亦會隨著施用途徑之不同以及可能並用的其他藥劑之不同而有所改變。
在本說明書中,除非另作相反只是,否則「三萜化合物」一詞涵蓋三萜化合物及其之藥學上可接受的鹽類、酯類或溶合物。舉例來說,本揭示內容之式(I)化合物為一種三萜化合物,因此,當說明書中述及本揭示內容之式(I)化合物時,也涵蓋本揭示內容式(I)化合物之鹽類、酯類或溶合物。本文中「鹽類」一詞代表利用一種鹼與一種酸(例如,本揭示內容之新穎三萜化合物)反應後所形成的鹽類,自適當的鹼所獲得的鹽類包含鹼金屬(如鈉)、鹼土金屬(如鎂)、銨離子與N(烷基)4 +之鹽類。「酯類」一詞代表本揭示內容之三萜化合物的酯類,以式(I)化合物為例,該酯類是由式(I)化合物的羧基與一種醇類(如,直鏈或支鏈之C1-6的醇類)反應後所生成的;或是由式(I)化合物的羥基與另一種有機酸(R-COOH,其中R為直鏈或支鏈之C1-6烷基)反應後所生成的。本文中「溶合物(solvate)」一詞在此代表由一化合物(如,本揭示內容中的式(I)化合物)與其周圍的溶劑分子(如,水、乙醇等)互相反應後所形成的錯化物。在一實例中,該三萜化合物之溶合
物乃是式(I)結構之乙醇溶合物。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值,此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而,任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處,「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是,「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內,視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外,或除非另有明確的說明,當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此,除非另有相反的說明,本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值,且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。
除非本說明書另有定義,此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外,在不和上下文衝突的情形下,本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型;而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
本揭示內容至少有一部分是基於一種單離自靈芝子實體或菌絲體之新穎三萜化合物而發展出來的,所述新穎三萜化合物與包含此新穎三萜化合物的藥學組合物,具有可降低血清尿素氮和肌酐酸含量以及提高腎
絲球過濾率之特性。因此,此新穎三萜化合物與包含此新穎三萜化合物的藥學組合物是潛在可用來製造能治療或預防腎臟疾病的藥劑。
因此,本揭示內容之第一態樣是提供一種具有式(I)結構之三萜化合物,
依據本發明特定實施方式,所揭示該具有式(I)結構的三萜化合物本身即具有降低由藥物(如,順鉑或馬兜鈴酸)所引發的血清尿素氮或肌酐酸升高的能力,或是恢復因藥物(如,順鉑或馬兜鈴酸)所致之腎臟細胞凋亡現象。
本案發明人也發現一種新穎的三萜化合物組合,其中各三萜化合物均係單離自靈芝子實體或菌絲體,且此新穎的三萜化合物組合與上述式(I)化合物一樣,具有可降低由藥物(如,順鉑或馬兜鈴酸)所引發的血清尿素氮或肌酐酸升高的能力,或是恢復因藥物(如,順鉑或馬兜鈴酸)所致之腎臟細胞凋亡現象。
基於此,本揭示內容之第二目的是提供一種用以治療或預防腎臟疾病的藥學組合物。此藥學組合物
至少包含一藥學有效量之上述式(I)結構之三萜化合物;以及其藥學上可接受的載體。
依據本發明實施方式,所揭示藥學組合物可更包含至少另一種三萜化合物,其係選自由以下物質組成的族群中:赤芝酸C(Iucidenic acid C,LAC)、赤芝酸N(Iucidenic acid N,LAN)、赤芝酸E2(Iucidenic acid E2,LAE-2)、赤芝酸A(Iucidenic acid A,LAA)、赤芝酸B(Iucidenic acid B,LAB)、赤芝酸D2(Iucidenic acid D2,LAD2)及其之組合。
在某些實施方式中,所述藥學組合物中式(I)結構之三萜化合物與LAC的量分別約為總三萜化合物含量的5-15%(重量%),例如約5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5或15%(重量%),此係以組合物中所含三萜化合物的總量當作100%計算而得。在一較佳實例中,該式(I)結構之三萜化合物與LAC的量分別約為三萜化合物總量的10%。
在其他實施方式中,所述藥學組合物中LAA與LAD2的量分別約為三萜化合物總量的15-30%(重量%);例如約15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.525、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5或30%(重量%),此係以組合物中所含三萜化合物的總量當作100%計算而得。在一實例中,LAA與LAD2的量分別約為組合物中三萜化合物總量的25%。
在其他實施方式中,所述藥學組合物中LAE2的量約為三萜化合物總量的8-15%(重量%);例如約8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5或15%(重量%),此係以組合物中所含三萜化合物的總量當作100%計算而得。在一實例中,LAE2的量約為該藥學組合物中三萜化合物總量的12%(重量%)。
在某些實施方式中,所述藥學組合物中該LAN與LAB的量分別約為總三萜化合物含量的5-12%(重量%),例如約5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5或12%(重量%),此係以組合物中所含三萜化合物的總量當作100%計算而得。在一較佳實例中,該LAN與LAB的量分別約為該藥學組合物中三萜化合物總量的8.5%(重量%)。
依據一最佳實施方式,所揭示藥學組合物包含上述式(I)結構之三萜化合物、LAC、LAN、LAE2、LAA、LAB和LAD2,以及其藥學上可接受的載體;且其中上述式(I)結構之三萜化合物以及LAC、LAN、LAE2、LAA、LAB和LAD2的量分別約為總三萜化合物含量的約10%、10%、8.5%、15%、25%和25%(重量%)。
本發明之三萜化合物,包括上述式(I)結構的三萜化合物以及LAC、LAN、LAE2、LAA、LAB和LAD2均可依據實施例1所揭示方法由靈芝屬菌類中分離而來,例如由赤芝(Ganoderma lucidum)的子實體或菌絲體中分離而得。無論原料來自靈芝子實體或是菌絲體,所用的分離純化方法一般都是以溶劑(較佳是醇類溶液),在高於
室溫的溫度下進行萃取,接著將萃取物進行管柱層析,其包括但不限於高效率液態層析(HPLC)和逆相液態層析(Reverse Phase Liquid Chromatograpy)等,以及濃縮、乾燥等步驟,直到獲得該靈芝活性化合物的乾燥粉末為止。
適合以所述藥學組合物進行治療或預防之腎臟疾病包含急性腎臟損害(acute kidney injury,AKI)與慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)。在一實例中,該腎臟疾病為AKI,例如急性腎臟發炎。在另一實例中,該腎臟疾病為CKD,例如慢性腎臟發炎。
一般來說,若以醫藥品或藥學組合物總重量為基準,本發明三萜化合物總量約占該藥學組合物總重量的0.1%至99%(重量%)。在某些實施方式中,本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的1%。在特定實施方式中,本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的5%。在其他實施方式中,本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的10%。在另外實施方式中,本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的25%。
適合以本發明方法進行治療的腎臟疾病包含AKI與CKD。在一實例中,該腎臟疾病為AKI,例如急性腎臟發炎。在另一實例中,該腎臟疾病為CKD,例如慢性腎臟發炎。適合以本發明方法進行治療的個體可以是哺乳動物,較佳是人類。
可根據眾所接受的藥學製程來製備上述藥物
或藥學組合物,如Remington’s Pharmaceutical Sciences(17th edition,ed.Alfonoso R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,Pa(1985))一書中所揭示的製程。藥學上可接受的賦型劑係指可和藥學製劑中其他成分相容且與生物體相容者。
依據本發明所揭示的實施方式,可經由任何適當的給藥途徑來施用本發明所揭示的藥物或藥學組合物,例如經過口腔服用的膠囊、懸浮液或藥錠,或是以不經過腸胃道方式來施用。不經過腸胃道的施用方式包括諸如肌肉注射、靜脈血管注射、皮下注射或腹腔內注射等系統性施用方式。或是,也可透過穿皮膜方式施用,如局部皮膚塗抹或是吸入性(如,支氣管內、鼻腔內、口腔內或鼻滴劑等);或是直腸內方式施用。施用時可單獨給藥或併同習知藥學可接受輔劑一起給藥。在較佳實施方式中,可經由口服方式(如,透過食物)將本發明化合物投予個體。
若以口服方式施用,可將本發明三萜化合物或其之新穎組合配方成為內含各種輔劑(如,微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸二鈣及甘胺酸);各種崩解劑(如澱粉、藻酸及特定矽酸鹽);以及顆粒黏合劑(如,聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠及相思樹膠(acacia))的藥錠。除此外,還可包含諸如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉及滑石等的潤滑劑。與此相關的較佳材料包括乳糖或牛奶中的糖以及高分子量聚乙二醇。上述的固態劑型也可非必要地包括塗層或殼,例如腸衣塗層,以及用來改善任一藥物活性成分釋
放速率的塗層。這類塗層的實例已為此領域中人士所熟知。在一實例中,所述藥學組合物是被配方成為藥錠。在另一實例中,所述藥學組合物是被配方成為充填在軟或硬明膠膠囊內或是封裝在生物可分解之藥包內的顆粒。當使用方式是口服用懸浮液和/或特效藥液(elixirs)時,可組合活性成分與各種甜味劑或風味劑、著色劑或染料一起配方,需要時還可加入乳化劑和/或懸浮劑,以及諸如水、酒精、丙二醇、甘油等稀釋劑。在某些實施方式中,本發明藥學組合物是被配方成為適合口服的液體劑型。此類液體配方可更包括用來維持pH值的緩衝液。也可將此液體配方充填在軟膠囊內。此液體劑型可為一種溶液,懸浮液,乳化液,微乳化液,沉澱或是可攜帶本發明化合物、其之藥學上可接受的衍生物、異構物、代謝物、鹽類或溶合物之任何液體介質。此液體可被設計成能改善本發明化合物其之藥學上可接受鹽類之溶解度,以便形成一種含有藥物的乳化液或分散液。當使用這種劑型時,是將活性化合物與至少一種藥學上可接受的輔藥(包括,但不限於,上述輔藥)一起混合後形成。
若以腸胃外(parenterally)方式施用,可將本發明三萜化合物或其之新穎組合配方成為液態的藥學組合物,其可為能以靜脈內注射、肌肉內注射、皮下注射或腹膜內注射等方式施用的無菌溶液或懸浮液。可用來製造上述無菌注射溶液或懸浮液的稀釋劑包括,但不限於,1,3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液、等張性氯化鈉溶液。也可使用脂肪酸(如,油酸)及其之甘油酯衍生
物,或是天然藥學可接受的油(如,橄欖油或菜籽油)來製造可供注射用的溶液或懸浮液。這類油性溶液或懸浮液中也可包含用來稀釋的醇類或羧甲基纖維素或類似的分散劑。也可使用其他常用的界面活性劑(如,Tweens或Spans系列)或乳化劑,或藥學領域製造配方時常用來增強生物可利用性的藥劑。
亦可將本發明上述醫藥品或藥學組合物製成多種適用於黏膜給藥(mucosal application)的劑型,如經頰(buccal)和/或舌下(sublingual)藥物劑型單元,以遞送藥物穿過口腔黏膜。可使用多種生物可降解且藥學可接受的高分子輔劑,此種輔劑可使得藥學組合物具有可接受的吸附效果以及所欲的藥物釋放模式,且可和經頰和/或舌下藥物劑型單元中所含的欲施用活性成分或其他成分相容。一般來說,上述的高分子輔劑包含親水性聚合物,其可黏附至口腔黏膜的濕潤表面。高分子輔劑的實施例包括但不限於丙烯酸聚合物與共聚物(acrylic acid polymers and copolymers);水解聚乙烯醇(hydrolyzed polyvinylalcohol);聚乙烯氧化物(polyethylene oxides);聚丙烯酸酯(polyacrylates);乙烯聚合物與共聚物(vinyl polymers and copolymers);聚乙烯吡咯啶;葡萄糖(dextran);瓜膠(guar gum);果膠(pectins);澱粉;及纖維素聚合物(cellulosic polymers)。
當可理解,本發明三萜化合物或其之新穎組合的劑量會因個體而異,這不僅是因為所用的特定化合
物或組合物、給藥途徑、化合物(單獨或連同一或多種藥物)於患者體內所引發之所欲反應等因素之不同,還可能受到其他因素影響,例如:欲治療症狀的疾病狀態或嚴重程度;患者的年齡、性別或體重、患者的健康狀況;以及欲治療的病理狀態的嚴重程度、患者於同時進行的其他醫療或特殊飲食內容;以及本領域通常知識者可想到的其他因素;而負責照料的醫療人員最終可基於這些因素而判斷出適當的劑量。可調整給藥劑量與形式以提供較佳的治療反應。治療有效量同時也是指化合物或組合物所致的毒性或有害的效果不及於其所帶來的治療利益。在較佳的情形中,本發明三萜化合物之組合於投藥時,應採用適當的劑量並持續一段時間,以減少出現症狀的次數和/或嚴重程度。
當式(I)結構之三萜化合物或是本發明藥學組合物被施用至一個體身上時,所施用的有效用量約為0.1-100毫克/公斤/天個體體重間。每天可施用至該個體身上之藥學組合物的用量約為0.1、0.5、1、2、5、7、9、10、12、15、17、19、20、22、25、27、29、30、32、35、37、39、40、42、45、47、49、50、52、55、57、59、60、62、65、67、69、70、72、75、77、79、80、82、85、87、89、90、92、95、97、99、或100毫克/公斤體重;較佳是約1-50毫克/公斤體重,例如約1、2、5、7、8、9、10、12、15、17、19、20、22、25、27、29、30、32、35、37、39、40、42、45、47、49、50毫克/公斤體重;更佳是約5-10毫克/公斤體重,例如約5、7、
8、9或10毫克/公斤體重。這些劑量可以單次施用或是分成多次在一天內施用。
本揭示內容之第三目的是提供一種治療腎臟疾病的方法。所述方法包括對需要治療的個體施用一可治療腎臟疾病的藥物或組合物。當此藥物或組合物被施用至亟需治療的哺乳動物個體(較佳是人類)身上時,可傳遞出有效量之本發明式(I)結構之三萜化合物或是上述本發明的藥學組合物。此藥物可由適當的途徑,例如經口、經鼻、經肺、經皮等被動式傳遞方式給藥,或是經由靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、直腸內、眼內等方式來給藥。
以下實施例是用來闡明本揭示內容特定態樣,並幫助習知技藝者了解並實施本揭示內容。但本揭示內容範疇並不限於這些實施例中。
實施例
材料與方法
細胞培育
本研究使用MDCK大腎臟細胞株,以1.5x105個細胞/盤的密度接種在96-孔的培養盤中,並培育在經Dulbecco氏改良過之Eagle氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)中,並在培養基中都添加10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)、100單位/ml之盤尼西林、100ng/ml之鏈黴素(Invitrogen,Carlsbad,CA)、2mM L-穀氨酸和非必要胺基酸及丙酮酸鈉,並維持在37℃的潮溼環境下(5% CO2及95%空氣)。
實驗動物
本實驗使用BLb/c小鼠,飼養在無病原菌的環境下,室溫維持於22±3℃,相對濕度保持於50±20%,日夜週期維持12/12小時,並可自由取用飲水及食物。動物飼料使用實驗鼠飼料5001(Laboratory Rodent Diet 5001)(購自PMI® Nutrition International,Inc.,MO,USA)。動物飲水則使用煮沸過之自來水。所有動物實驗操作,皆遵循中華實驗動物學會出版之「實驗動物管理與使用指南」之規範。
實施例1 本發明化合物與藥學組合物
1.1 分離及純化式(I)化合物
將乾重為50g的赤芝子實體以粉粹機碎裂後,將赤芝粉末置於震盪萃取裝置,並加入乙醇,其比率為赤芝子實體粉末乾量:酒精體積=1:24,而後以37℃浸煮一天後濃縮。連續數次重複前述萃取步驟,所得的萃取液經過濾、合併與減壓濃縮抽乾後,得產率約10%之5克赤芝子實體醇溶粗萃物。將上述所得之赤芝子實體醇溶粗萃物,以40℃恆溫之真空乾燥系統隔夜抽濾去除殘餘溶
劑。
在上述所得之乾重5.0克赤芝子實體醇溶粗萃物,加入含等體積水之乙酸乙酯(ethyl acetate)進行萃取,得另一水層溶液以及乙酸乙酯萃取層溶液,將此乙酸乙酯萃取層溶液濃縮乾燥後,以40℃恆溫之真空乾燥系統隔夜抽濾去除殘餘溶劑,可得產率約佔總赤芝子實體醇溶粗萃物乾重40%(2克)的赤芝子實體乙酸乙酯萃取物。
將上述所得乾燥的赤芝乙酸乙酯萃取物,以酒精溶解後,以半製備級HPLC進行分離,移動相為氰甲烷/2%醋酸(1/2~1/4),可得式(I)化合物(8mg),其產率為0.4%。
式(I)化合物的13C、1H、和異核多鍵結關聯性核磁頻譜(Heteronuclear Multiple Bond Correlation,HMBC)資料如下:
MS(EI,20eV),m/z(rel.int.):460[M+](53.56),442(22.56),339(16.46),322(100),304(46.41);HRMS m/z=460.2834(C27H40O6之計算分子量:460.2819)
IR νmax 3445,1736,1707,1661cm-1
UV(MeOH)λmax 252nm
熔點:124-126℃
1.2 製備含有式(I)化合物之藥學組合物YKII-10
本揭示內容中特定可治療腎臟疾病的藥學組合物YKII-10係依據下表2所示配方,將實施例1.1分離之新穎的式(I)化合物與其他習知的三萜化合物混合成一均勻混合物後而製得,該些三萜化合物係可依據任何已公開的分離或純化方法,自靈芝子實體或菌絲體中分離或純化而得。
實施例2 式(I)化合物及YKII-10藥學組合物可有效緩解或改善順鉑所誘導的腎臟發炎
在本實施例中,以順鉑(cisplatin)來誘發活體外或活體內腎臟細胞凋亡,接著再施以本發明式(I)化合物或是YKII-10組合物,以評估其治療腎臟疾病的功效。
2.1 順鉑所誘導的腎臟細胞凋亡
以1×105個細胞/培養孔的密度,將MDCK大腎臟細胞接種於平底的6孔培養盤中,於培養箱中培養過夜待細胞貼附後,以50M之順鉑(Cisplatin)預先處理細胞4小時,再分別加入式(I)化合物(50μg/mL或100μg/mL)或實施例1之YKII-10藥學組合物(25-100μg/mL)以處理細胞,24小時後直接於培養液中添加50nM之DiOC6染劑進行粒線體膜電位染色,於37℃下反應30分鐘,再以PBs清洗細胞兩次,使用倒立螢光顯微鏡觀察粒線體膜電位染色之情形並拍照記錄,凋亡之腎臟細胞無法被DioC6染色,藉此評估細胞凋亡與否。結果分別繪示於第1A和1B圖中。
如第1A圖柱狀圖顯示,單獨使用式(I)化合物(50μg/mL),即可有效恢復順鉑所誘導產生的腎小管細胞膜電位下降,當濃度提高到100μg/mL,則可逆轉膜電位下降超過8成,使趨於控制組的膜電位。類似的,若施用不同劑量的YKII-10藥學組合物(25-100mg/Kg),同樣也可有效地恢復腎小管細胞膜電位下降,且其恢復程度隨著
YKII-10藥學組合物劑量增加而增加(第1B圖)。由此可知,本發明式(I)化合物或是包含式(I)化合物的藥學組合物YKII-10可有效逆轉腎小管細胞凋亡,因此可用來緩解或治療腎臟炎。
2.2 順鉑所誘導的小鼠腎臟發炎
在本實施例中,挑選6週大之C57BL/6小鼠,實驗組每日以口服方式給予實施例1.2之YKII-10藥學組合物(10mL/Kg),連續5天,對照組小鼠則給予蒸餾水,所有動物於第2天以腹腔注射方式給予試驗小鼠順鉑(15mg/kg,i.p.)一次,3天後採集小鼠血液,血液經離心取得血清後利用生化分析儀(TOSHIBA,TBA-40FR)測量血清尿素氮(blood urine nitrogen,BUN)、血清肌酐酸(creatinine,CRE)等數值,以評估小鼠腎功能情況。結果繪示於第2圖中。
如第2A及2B圖顯示,以口服方式對實驗動物施用本發明實施例1.2之YKII-10藥學組合物(10mL/Kg)可有效降低與發炎相關的血清生化指標,包括BUN和CRE,使其接近控制組,表示包含式(I)化合物的本發明藥學組合物可有效用來緩解或治療腎臟炎。
實施例3 式(I)化合物及實施例1之YKII-10藥學組合物可有效緩解或改善活體內脂多醣所誘導的腎炎
在本實施例中,以脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)來誘發小鼠腎臟發炎(kidney inflammation),接著再施以本發明式(I)化合物或YKII-10組合物,以評估其治療腎
臟發炎的功效。
本試驗使用6週齡之BLb/c小鼠,試驗前一天,將動物依體重分組,分組後確認各組間體重無統計上顯著差異。試驗開始後,每天由腹腔注射LPS(2.5mg/Kg)至小鼠體內,連續注射5天,以誘發小鼠腎臟產生發炎。同時,並以口服方式每天一次給予實驗組小鼠實施例1.1之式(I)化合物(100mg/Kg)或是實施例1.2之YKII-10組合物(劑量為250mg/Kg)),控制組小鼠則給予蒸餾水。分別在試驗開始後第5天及第10天採集動物尿液,並以ARKRAY尿液分析儀測定其中的尿蛋白含量,以評估小鼠的腎臟功能。結果繪示於第3圖中。
如第3圖柱狀圖顯示,對於LPS誘導產生的小鼠腎臟發炎,無論是單獨使用式(I)化合物(100mg/Kg)或是與其他已知三萜化合物並用(如,給予實施例1.2之YKII-10藥學組合物(250mg/Kg)),均能有效地降低實驗動物尿液中的蛋白量,表示本發明式(I)化合物或是包含式(I)化合物的藥學組合物YKII-10可有效緩解或治療腎臟炎。
實施例4 實施例1之YKII-10藥學組合物可有效緩解或改善活體急性腎臟損害
在本實施例中,以馬兜鈴酸(Aristolochic acid I,AA-I)來誘發小鼠產生急性腎臟損害(acute kidney injury),接著再施以本發明實施例1.2之YKII-10藥學組合物,以評估其治療急性腎臟損害的功效。
4.1 AA-I誘導腎功能傷害動物模式
挑選6週大之Balb/c小鼠,每日以口服方式
給予小鼠AA-I(2.5mg/kg)連續5日,實驗組小鼠於試驗開始即以口服方式投與實施例1.2之YKII-10藥學組合物(300mg/kg)每日一次,連續給予12日,對照組則給予蒸餾水。於第12天採集小鼠血液,經離心取得血清後利用生化分析儀(TOSHIBA,TBA-40FR)測量尿素氮(BUN)、肌酐酸(Creatinine,CRE)等數值,以評估小鼠腎功能。結果繪示於第4A及4B圖中。
由第4圖結果顯示,本發明實施例1.2之YKII-10藥學組合物可有效降低AAI所誘發產生的BUN及CRE,表示本發明實施例1.2的藥學組合物YKII-10可有效緩解或治療急性腎臟損害。
4.2 腎小球過濾率(glomerular filtration rate,GFR)測試
在本實施例中,利用以腎絲球為唯一排泄途徑之螢光標記菊糖(lnulin),注射入小鼠體內,藉由活體螢光影像偵測儀監測螢光的消散速率進而反應出腎絲球過濾效率。
挑選6週大之Balb/c小鼠,YKII-10+AAI實驗組小鼠給予藥品(劑量為300mg/Kg))連續8日,於第4日腹腔注射AA-I(2.5mg/kg)連續5日;YKII-10實驗組小鼠給予藥品(300mg/kg)連續8日;AA-I實驗組小鼠給予蒸餾水3天後,於第4日腹腔注射AA-I(2.5mg/kg)連續5天,對照組則給與蒸餾水。試驗進行8天後,將螢光標記菊糖(GFR-Vivo 680)(2 x 10-9莫耳)打入小鼠體內,藉由Perkin Elmer活體螢光影像偵測儀(FMT 4000)於注射後第1、5、
15、30、45分鐘偵測螢光影像,計算小鼠體內殘留的螢光標記菊糖(lnulin)濃度,進而計算出腎絲球過濾曲線,比較四組小鼠的腎小球過濾效率。結果顯示於第5圖。
第5圖柱狀圖顯示當小鼠被暴露在AAI處理下,腎絲球過濾率(GFR)從原來正常值(約250μL/分鐘)驟降10倍至約25μL/分鐘,若以藥學組合物YKII-10進行治療,雖無法完全逆轉AAI所造成的急性腎臟損害,但仍可有效地提升GFR約4倍左右,至約100μL/分鐘。
實施例5 實施例1之YKII-10藥學組合物可有效緩解或改善活體慢性腎臟病
在本實施例中,藉由手術切除實驗動物部分腎臟,使其腎臟功能下降至約正常動物的1/6,接著再施以本發明實施例1.2之YKII-10藥學組合物,以評估其提升腎臟功能的功效,藉此反應出本發明實施例1.2之YKII-10藥學組合物對治療慢性腎臟病的功效。
挑選8週大之成年雄性大鼠,隨機分為實驗組與對照組(每組3隻大鼠),每組動物均以手術切除左側腎臟2/3,讓動物休息一週後,再切除右腎,使試驗動物腎功能下降至約正常動物的1/6,以模擬慢性腎臟病患的腎功能狀況。手術後第二週開始投藥,實驗組動物每天給予300毫克/公斤體重之實施例1.2之YKII-10藥學組合物,對照組則給予水,同時由動物尾部採血,測定實驗動物之血中肌酐酸含量,透過以下方程式換算成eGFR(estimated GFR),以評估腎功能,並以未進行實驗前之eGFR作為100%腎功能之基準線:
eGFR(毫升/分鐘/1.73平方公尺)=186x(肌酐酸數值)-1.154x(30)-0.203接著,每兩週採血測定肌酐酸含量,並經由同樣公式換算成eGFR,結果顯示於第6圖
如第6圖結果顯示,投藥之初,試驗動物的腎功能約為正常大鼠的44%,手術後6週,投藥組實驗動物的腎功能已明顯提升至正常大鼠的59%,約增加15%,而對照組則無變化,經T-test計算第六週實驗組與對照組數據有顯著差異具有統計上的意義。
綜上所述,本揭示內容之新穎三萜化合物(即,式(I)化合物)以及包含式(I)化合物之藥學組合物是潛在可用來治療急性或慢性腎臟疾病的藥物。
當可理解上述實施方式與實施例僅為例示,且熟習此技藝者可對其進行各種修飾。上文提出之說明書、實施例與資料的目的在於使本說明書的結構完備,並作為實作本發明之例示。雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上,然其並非用以限定本揭示內容,任何熟習此技藝者,在不脫離本揭示內容之精神和範圍內,當可作各種之更動與潤飾,因此本揭示內容之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
Claims (7)
- 一種具有下式(I)結構之三萜化合物的用途,其係用以製備治療腎臟疾病之醫藥品,其中該式(I)化合物的結構如下:
- 一種用於減緩或治療腎臟疾病的藥學組合物,包含一有效量之三萜化合物混合物以及一藥學上可接受的載體,其中該三萜化合物混合物包含一式(I)化合物
- 如請求項2所述的藥學組合物,其中該赤芝酸C的量約為該藥學組合物中三萜化合物混合物總量的5-15%(重量%)。
- 如請求項2所述的藥學組合物,其中赤芝酸A與赤芝酸D2的量分別約為該藥學組合物中三萜化合物混合物總量的15-30%(重量%)。
- 如請求項2所述的藥學組合物,其中赤芝酸E2的量約為該藥學組合物中三萜化合物混合物總量的8-15%(重量%)。
- 如請求項2所述的藥學組合物,其中赤芝酸B與赤芝酸N的量約為該藥學組合物中三萜化合物混合物總量的5-12%(重量%)。
- 如請求項2所述的藥學組合物,其中所述腎臟疾病是急性腎臟損傷或是慢性腎臟病。
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