TWI439273B

TWI439273B - 以靈芝酸保護心臟免於壞死或損傷之方法與組成物

Info

Publication number: TWI439273B
Application number: TW101148186A
Authority: TW
Inventors: Fan E Mo; Qian Yu Kuok
Original assignee: Microbiological Res Foundation R O C; Univ Nat Cheng Kung
Priority date: 2012-12-19
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2014-06-01
Also published as: TW201424735A

Description

以靈芝酸保護心臟免於壞死或損傷之方法與組成物

本發明是有關於一種靈芝酸混合物的新穎用途，具體而言，本發明係有關於以該靈芝酸混合物來製造一種可防止心臟壞死或損傷之藥劑或藥學組合物的用途。

心臟衰竭乃是心臟無法提供充足的血液與氧氣至體內其它組織時所引起的心血管疾病，其過程會造成心臟細胞損傷或壞死。在我國一直以來，心臟疾病一直位居國人十大死因之前三名，然而，在已開發國家中，患有心臟衰竭的人占人口總數的2%，且其患病率隨著年齡增加而呈現上升趨勢。目前，造成年齡65歲以上個體住院的最主要原因是心臟衰竭，此外，此疾病亦為醫療照護成本提升的主要因素。

對抗心臟疾病之主要方針可分為二，預防及治療。目前，市面上常見用來預防心臟疾病之營養保健品為魚油(Omega-3)，其主要是預防血液凝塊的形成，同時具有穩定心跳、血糖、以及降低血脂肪的效果。而心臟衰竭的治療方法，主要是透過藥劑來恢復心臟功能，例如血管收縮素轉化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme(ACE)inhibitors)、血管緊縮素II受體拮抗劑(angiotensin II receptor blockers,ARBs)、利尿劑(diuretics)、毛地黃糖苷(digitalis glycosides)、β-受體阻斷劑(beta blocker)以及直接作用的血管擴張劑(direct acting vasodilators)，用以改善血管收縮能力。然而，使用藥物經常伴隨有副作用(例如高血壓、腎功能異常以及身體活動障礙)產生，造成用藥上的限制。對於藥物治療無效之嚴重心衰竭(亦即，壞死)患者，或可採用換心手術為其治療方法。然而，目前器官捐贈者的來源及數量仍極為有限。

有鑑於此，相關領域需要一種可預防或改善因心臟負荷過度所造成的壞死或損傷的藥劑或組合物。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本發明部分係基於發明人首度靈芝酸混合物能夠有效地防止心臟壞死或損傷。因此，本發明一態樣是有關於一種靈芝酸混合物的新穎用途，其可用於製備可防止心臟壞死或損傷之藥劑或藥學組合物。

依據本發明多個實施方式，本發明之靈芝酸混合物可依據本案發明人先前揭示於台灣專利第I369998之萃取方法製得。在一實施方式中，所述靈芝是松杉靈芝(Ganoderma tsugae )，特別是指採收後不超過4-8小時，且未經乾燥處理過的松杉靈芝。上述萃取方法係以一極性溶液來萃取新鮮靈芝子實體，包含：在室溫下將該新鮮靈芝子實體浸泡在該極性溶液至少2-16小時；升高該內含新鮮靈芝子實體之極性溶液的溫度至不超過約100℃的溫度，並攪拌萃取液約1-4小時，最後再進行減壓濃縮。所述極性溶液可以是由一種有機溶劑與水組成之混合溶液，例如由乙醇與水組成之體積濃度50%至95%的乙醇溶液。在一較佳實施方式中，該極性溶液為95%(體積%)乙醇溶液。

在一實施方式中，此方法的萃取率約達20%(重量%)，所得乾燥靈芝粉末中含有至少約6%的靈芝酸類化合物，其包含以下化合物：靈芝酸A、靈芝酸A之衍生物、靈芝酸D及其組合，其中靈芝酸A之衍生物包括GB、GC、GD、GE、GC5、GC6和GG。在另一較佳實例中，所得乾燥靈芝粉末中含有至少約10%的靈芝酸類化合物。

依據另一實施方式，所述之靈芝酸混合物之冷凍乾燥粉末之總三萜類含量約為20%。

依據可任選的實施方式，本揭示內容之靈芝是松杉靈芝(Ganoderma tsugae)、赤芝(Ganoderma lucidum)或以上之混合物。

依據本揭示內容之實施方式，心臟壞死或損傷係由心肌纖維化(cardiac fibrosis)、高血壓(hypertension)、心肌梗塞(myocardial infarction)、心肌缺血(myocardial ischaemia)、擴大性心肌病變(dilated cardiomyopathy)、肥厚性心肌病變(hypertrophic cardiomyopathy)、限制性心肌病變、(restrictive cardiomyopathy)、負荷性心肌病變(stress cardiomyopathy)、糖尿病性心肌病變(diabetic cardiomyopathy)或萊克多巴胺所引起的細胞凋亡。

本發明的另一態樣係有關於一種用以防止心臟壞死或損傷之醫學組合物，其包含一有效量之本發明靈芝酸混合物及一藥學上可接受的載體。

若以上述藥學組合物總重量為基準，本發明靈芝酸混合物約占該藥學組合物總重量的0.1%至99%(重量%)。在某些實施方式中，本發明靈芝酸混合物的量至少約為該藥學組合物總重量的1%。在特定實施方式中，本發明靈芝酸混合物的量至少約為該藥學組合物總重量的5%。在其他實施方式中，本發明靈芝酸混合物的量至少約為該藥學組合物總重量的10%。在另外實施方式中，本發明靈芝酸混合物的量至少約為該藥學組合物總重量的25%。

在某些實施方式中，上述本發明之醫藥品或是藥學組合物中更包括另一種已知可用於改善心臟功能之藥劑。此類可改善或恢復心臟功能藥劑的實施例包括，但不限於：血管收縮素轉化酶抑制劑、血管緊縮素II受體拮抗劑、利尿劑、毛地黃糖苷、β-受體阻斷劑、直接作用的血管擴張劑以及本領域已知的其他類似藥物。血管收縮素轉化酶抑制劑的實施例包含，但不限於，卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、利欣諾普(lisinopril)、雷米普利(ramipril)以及其他類似藥物。血管緊縮素II受體拮抗劑的實施例包含，但不限於，纈沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisarta)、洛沙東(losartan)、艾比沙坦(irbesartan)、阿齊沙坦(azilsartan)、奥美沙坦(olmesartan)和其他類似藥物。利尿劑的實施例包含，但不限於，弗洛西邁(furosemide)、布米他奈(bumetanide)、托拉塞米(torsemide)、氫氯苯噻(hydrochlorothiazide)、美托拉腙(metolazone)、螺環固醇內酮(spironolactone)和其他類似藥物。毛地黃糖苷的實施例包含，但不限於，毛地黃毒素(digitoxin)、毛地黃(digoxin)、拉诺辛(lanoxin_和其他類似藥物。β-受體阻斷劑的實施例包含，但不限於，醋丁洛爾(acebutolol)、比索洛爾(bisoprolol)、博立克(esmolol)、普潘奈(propranolol)、阿替洛爾(atenolol)、拉貝洛爾(labetalol)、卡利索普若多錠(carvedilol)、美多心安(metoprolol)、奈必洛爾(nebivolol)、布新洛爾(bucindolol)和其他類似藥物。直接作用的血管擴張劑的實施例包含，但不限於，肼酞嗪(hydralazine)、二硝酸異山梨醇(isosorbide dinitrate)和其他類似藥物。

據此，本發明另一態樣係提供一種防止心臟壞死或損傷之方法，其包括對罹患有心臟壞死或損傷之個體或健康的個體施用或投予一治療有效量或一預防有效量之本發明藥學組合物，以減緩或預防心臟壞死或損傷之病徵。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。同時，在此處「至少一」以及「一或多」等詞彙當包含一、二、三或更多種。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數界是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施方式的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

「有效量」(effective amount)一詞在此處係指一藥物的用量足以產生欲求的療效反應。具體的有效量取決於多種因素，如欲治療的特定狀況、患者的生理條件(如，患者體重、年齡、性別或過去的病史)、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以克、毫克或微克為單位)或表示成藥物重量與體重之比例(其單位為毫克/公斤(mg/kg))。

在此處「治療」(treatment)，包括所施用之預防性質(如預防性(prophylactic)、治療性質或緩解性質(palliative)的處置。

此處所述的「治療有效量」(therapeutically effective amount)一詞係指在所用藥劑中，活性成分的含量使其能夠在必需的時期內有效地達到防止心臟細胞凋亡。

此處所述的「預防有效量」(prophylactically effective amount)一詞係指在所用藥劑中，活性成分的含量使其能夠在有效地達到預防心臟細胞的損傷或凋亡。

此處所述的「藥學上可接受」(pharmaceutically acceptable)一詞係指一般認為「通常認為具安全性(generally regarded as safe)」(亦即，生理上可耐受的)的分子和/或組合物，當施用於人類時，通常不會產生過敏或類似的不良反應(例如，腸胃不適、頭暈、以及類似的症狀)。較佳為，如此處所述的「藥學上可接受」(pharmaceutically acceptable)一詞，係指經過政府專責機構所核准的，或是依據相關藥典所記載的可適用於動物，特別是人類的分子和/或組合物。

本說明書中「藥物」(agent)或「藥劑」(medicament)等詞彙可互換使用，且均係指稱一種於投予一個體(人類或動物)可透過局部或全身性的作用，而誘發所欲的藥學和/或生理反應。

在此處，「投予」、「給藥」、「施用」等被動或主動式動詞與名詞(包含“administered”、“administering”或“administration”)可互換使用，且係指稱將本發明之化合物或藥學組合物直接投予一個體，或將可於個體體內形成與上述活性化合物相當數量的前驅藥、衍生物或類似物投予一個體。

「個體」(subject)或「患者」(patient)等詞係指可利用本發明提出之組合物和/或方法來治療、處置的動物，包含人類。除非特別指明，「個體」或「患者」涵蓋雄性與雌性動物。因此，「個體」或「患者」包含任何正常健康的個體或伴有心臟壞死或損傷的個體。

在此處「防止心臟壞死或損傷」一詞係指於一期間內對一個體施用一組合物或方法，相較於沒有施用該組合物或該方法的個體而言，能有效防止心肌細胞損傷或凋亡。此外，「改善(improve or ameliorate)」一詞係指減緩心臟壞死或損傷的徵狀。

本發明至少部分是基於不可預期地發現包含特定組成之靈芝酸混合物，能有效的保護心肌細胞免於凋亡，因此可用來製備防止心臟壞死或損傷之藥劑或藥學組合物。

本發明之靈芝酸混合物，可以依據台灣專利第I369998號(陳發明人等人於2009年1月21日所申請)所所揭示之萃取方法萃取而成，此專利案之內容，已納入為本案參考文獻。或是，本發明之靈芝酸混合物可以依據陳等人所揭示於以下文獻之方法進行萃取：「Chen,D.H.,Chen,W.K.D.Determination of ganoderic acids in triterpenoid constituents ofGanoderma tsugae.J.Food Drug Anal. 2003,11,195-201」。

一般來說，用以製備本發明之靈芝酸混合物的靈芝原料，可以是松杉靈芝(Ganoderma tsugae )、赤芝(Ganoderma lucidum )或其之混合物。在一較佳實施方式中，是以松杉靈芝，且特別是指採收後不超過4-8小時，且未經乾燥處理過的松杉靈芝，來製備本發明所需之靈芝酸混合物。在可任選的實施方式中，可將上述靈芝原料與一極性溶液互相混合後，經特定萃取步驟，取得靈芝酸混合物。

具體而言，在可任選的實施方式中，本發明之靈芝酸混合物可以藉由以下所述方法所製得。

首先，在室溫下將該新鮮靈芝子實體浸泡在極性溶液中至少2-16小時；加熱該內含新鮮靈芝子實體之極性溶液的溫度至不超過約100℃的溫度，較佳是約50℃的溫度，並攪拌萃取液約1-4小時。所述極性溶液可以是由一種有機溶劑與水組成之混合溶液，例如由乙醇與水組成之體積濃度50%至95%的乙醇溶液。在一較佳實施方式中，該極性溶液為95%(體積%)乙醇。

在一非必要的實施方式中，亦可將該萃取物再濃縮和/或乾燥，取得經乾燥後的靈芝粉末。在一實例中，此方法的萃取率約達20%(重量%)，所得乾燥靈芝粉末中含有至少約6%的靈芝酸類化合物，其包含以下化合物：A、B、C、C5、C6、D、E、G及靈芝烯酸D(ganoderenic acid D)。

本發明的另一態樣是提供一種可防止心臟壞死或損傷之藥學組合物，此藥學組合物包含一藥學有效量之本發明靈芝酸混合物及其藥學上可接受的載體。更明確地說，適用於本發明之靈芝酸混合物係指根據本發明各種實施方式以及台灣專利第I369998號(陳發明人等人於2009年1月21日所申請)所述方法分離出所述靈芝酸混合物。在一實施方式中，此藥學組合物也可作為用來治療患有心臟壞死或神經損傷之非人類哺乳動物的獸醫用藥。

一般來說，本發明靈芝酸混合物的含量佔整體藥學組合物重量的約0.1%至99%(重量%)。在某些實施方式中，本發明式靈芝酸混合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少1%(重量%)。在一些實施方式中，本發明靈芝酸混合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少5%(重量%)。在另一些實施方式中，本發明靈芝酸混合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少10%(重量%)。在又另一些實施方式中，本發明靈芝酸混合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少25%(重量%)。

在某些實施方式，本發明所述之藥學組合物更包含一種已知可用於改善心臟功能之藥劑。此類可改善或恢復心臟功能藥劑的實施例包括，但不限於：血管收縮素轉化酶抑制劑、血管緊縮素II受體拮抗劑、利尿劑、毛地黃糖苷、β-受體阻斷劑、直接作用的血管擴張劑以及本領域已知的其他類似藥物。血管收縮素轉化酶抑制劑抑制劑的實施例包含，但不限於，卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、利欣諾普(lisinopril)、雷米普利(ramipril)以及其他類似藥物。血管緊縮素II受體拮抗劑的實施例包含，但不限於，纈沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisarta)、洛沙東(losartan)、艾比沙坦(irbesartan)、阿齊沙坦(azilsartan)、奥美沙坦(olmesartan)和其他類似藥物。利尿劑的實施例包含，但不限於，弗洛西邁(furosemide)、布米他奈(bumetanide)、托拉塞米(torsemide)、氫氯苯噻(hydrochlorothiazide)、美托拉腙(metolazone)、螺環固醇內酮(spironolactone)和其他類似藥物。毛地黃糖苷的實施例包含，但不限於，毛地黃毒素(digitoxin)、毛地黃(digoxin)、拉諾辛(lanoxin_和其他類似藥物。β-受體阻斷劑的實施例包含，但不限於，醋丁洛爾(acebutolol)、比索洛爾(bisoprolol)、博立克(esmolol)、普潘奈(propranolol)、阿替洛爾(atenolol)、拉貝洛爾(labetalol)、卡利索普若多錠(carvedilol)、美多心安(metoprolol)、奈必洛爾(nebivolol)、布新洛爾(bucindolol)和其他類似藥物。直接作用的血管擴張劑的實施例包含，但不限於，肼酞嗪(hydralazine)、二硝酸異山梨醇(isosorbide dinitrate)和其他類似藥物。

可根據眾所接受的藥學製程來製備上述藥劑或上述藥學組合物，如Remington’s Pharmaceutical Sciences(17th edition,ed.Alfonoso R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,Pa(1985))中所述的製程。藥學上可接受的賦型劑係指可和製劑中其他成分相容且與生物體相容者。

本發明靈芝酸混合物可經由口服(如，口服用膠囊、懸浮液或藥錠)、或腸胃外(parenterally)等適當方法施用。腸胃外(parenterally)施用方式包括例如肌肉內注射、靜脈注射、皮下注射或腹膜內注射等系統性方式施用。施用時可單獨給藥或併同習知藥學可接受輔劑一起給藥。在較佳實施方式中，可經由口服方式(如，透過食物)將本發明靈芝酸混合物投予個體。

若以口服方式施用，可將本發明靈芝酸混合物配方成為內含各種輔劑(如微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸二鈣及甘胺酸)；各種崩解劑(如澱粉、藻酸及特定矽酸鹽)；以及顆粒黏合劑(如，聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠及相思樹膠(acacia))的藥錠。除此之外，還可包含諸如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉及滑石等的潤滑劑。此固態配方也可當作填充劑用於明膠膠囊內，與此相關的較佳材料包括乳糖或牛奶中的糖以及高分子量聚乙二醇。當使用方式是口服用懸浮液和/或特效藥液(elixirs)時，可組合活性成分與各種甜味劑或風味劑、著色劑或染料一起配方，需要時還可加入乳化劑和/或懸浮劑，以及諸如水、酒精、丙二醇、甘油等稀釋劑。

若以腸胃外(parenterally)方式施用，可將本發明化合物配方成為液態的藥學組合物，其可為能以靜脈內注射、肌肉內注射、皮下注射或腹膜內注射等方式施用的無菌溶液或懸浮液。可用來製造上述無菌注射溶液或懸浮液的稀釋劑包括，但不限於，1,3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液、等張性氯化鈉溶液。也可使用脂肪酸(如，油酸)及其之甘油酯衍生物，或是天然藥學可接受的油(如，橄欖油或菜籽油)來製造可供注射用的溶液或懸浮液。這類油性溶液或懸浮液中也可包含用來稀釋的醇類或羧甲基纖維素或類似的分散劑。也可使用其他常用的界面活性劑(如，Tweens或Spans系列)或乳化劑，或藥學領域製造配方時常用來增強生物可利用性的藥劑。

亦可將本發明之上述醫藥品或藥學組合物製成多種適用於黏膜給藥(mucosal application)的劑型，如經頰(buccal)和/或舌下(sublingual)藥物劑型單元，以遞送藥物穿過口腔黏膜。可使用多種生物可降解且藥學可接受的高分子輔劑，此種輔劑可使得藥學組合物具有可接受的吸附效果以及所欲的藥物釋放模式，且可和經頰和/或舌下藥物劑型單元中所含的欲施用活性成分或其他成分相容。一般來說，上述的高分子輔劑包含親水性聚合物，其可黏附至口腔黏膜的濕潤表面。高分子輔劑的實施例包括但不限於丙烯酸聚合物與共聚物(acrylic acid polymers and copolymers)；水解聚乙烯醇(hydrolyzed polyvinylalcohol)；聚乙烯氧化物(polyethylene oxides)；聚丙烯酸酯(polyacrylates)；乙烯聚合物與共聚物(vinyl polymers and copolymers)；聚乙烯吡咯啶；葡萄糖(dextran)；瓜膠(guar gum)；果膠(pectins)；澱粉；及纖維素聚合物(cellulosic polymers)。

因此，本發明也提供用來治療或預防哺乳類(特別是人類)心臟壞死或損傷的方法，包括對該個體施用所述內含本發明靈芝酸混合物之醫藥品或藥學組合物。這類醫藥品或藥學組合物較佳是經由可有效傳送所述組合物中活性成分(即，靈芝酸混合物)的途徑而施用至一哺乳類(較佳是人類)身上適當或可產生欲求效果的位置。適當的施用途經可以是，例如主動或被動地經口或經皮膜等方式；或是以經腸胃外的方式，如直腸栓劑、皮下注射、靜脈內注射、肌肉內注射、腹膜內注射。此外，也可將本發明靈芝酸混合物與其他活性藥劑一同施用。

當可理解，本發明靈芝酸混合物的劑量會因患者而異，這不僅是因為所用的靈芝酸混合物或組合物、給藥途徑、靈芝酸混合物(單獨或連同一或多種藥物)於患者體內所引發之所欲反應等因素之不同，還可能受到其他因素影響，例如：欲治療症狀的狀態或嚴重程度；患者的年齡、性別或體重、患者的健康狀況；以及欲治療的病理狀態的嚴重程度、患者於同時進行的其他醫療或特殊飲食內容；以及本領域通常知識者可想到的其他因素；而負責照料的醫療人員最終可基於這些因素而判斷出適當的劑量。可調整給藥劑量與形式以提供較佳的治療反應。治療有效量同時也是指靈芝酸混合物或組合物所致的毒性或有害的效果不及於其所帶來的治療利益。在較佳的情形中，本發明靈芝酸混合物或組合物於投藥時，應採用適當的劑量並持續一段時間，以使得症狀的數目和/或嚴重性得以降低。

下文舉出多種實施例來闡明本發明之部分態樣，以使本發明所屬技術領域中具有通常知識者能藉以實踐本發明。因此不應將這些實施例視為對本發明範圍之限制。本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於此處提的說明，當可在不需過度推衍的情形下運用本發明。此處提及的所有文獻，皆視為已完全引用而成為本說明書的一部份。

實施例 材料與方法 細胞培養

在下列實施例中，為了證實本發明之靈芝酸混合物對於心肌細胞之影響，本實驗採用心肌母細胞株H9c2進行試驗，若無進一步說明，該細胞以含葡萄糖/血清之DMEM培養液(即，Dulbecco's Modified Eagle Medium)，置於37℃培養箱進行培養。

建立心臟壞死動物模式

本實驗是採用BALB/c小鼠(每隻重量約25-27公克，購自成功大學實驗動物中心)進行測試。

首先，將異丙基腎上腺素以單次皮下注射方式注入小鼠體內(10mg/Kg)，以誘發小鼠產生心臟壞死，接著，將心臟壞死的小鼠，依據各實施例之實施方式，隨機分配至各組別中。

實驗動物係飼養於動物室中，飼育環境有溫度與濕度控制，光：暗循環期間分別為12小時：12小時。動物可自由食用實驗室的標準鼠飼料和自來水。所有動物實驗均遵照「動物保護法」第十六條規定的準則，並由國立成功大學實驗動物照護與使用委員會審核認可。

實施例1 靈芝酸保護心肌細胞免於缺乏養分所造成之細胞凋亡

為了證實靈芝酸混合物具有保護心肌細胞免於細胞凋亡之效果；將H9c2細胞以本發明之靈芝酸混合物(0.15微克/毫升)處理2小時，之後，再以去除葡萄糖/血清之DMEM培養液培養24小時，最後以DAPI(即，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole))螢光染劑進行染色，在螢光顯微鏡下觀察細胞是否有染色體濃縮現象，來判斷細胞是否出現細胞凋亡，並將結果進行統計分析。結果示於第1圖。

在本實驗中共分為三組，分別為G/S(+)組、為G/S(-)組及GA+G/S(-)組，G/S(-)組為以去除葡萄糖/血清培養液培養之H9c2細胞；G/S(+)為以含葡萄糖/血清培養液培養之H9c2細胞；而GA+G/S(-)則為以本發明之靈芝酸處理之去除葡萄糖/血清培養液培養之H9c2細胞。以上各組依據「材料與方法」所述之步驟，進行細胞培養。

如第1圖所示，相較於G/S(+)組，G/S(-)組細胞凋亡情形最為嚴重，其細胞凋亡率增加近3倍，然而，相較於G/S(+)組，GA(+)G/S(-)組之凋亡率無明顯差異，故證實本發明之靈芝酸混合物可以有效保護H9c2細胞免於因長時間缺乏養份所導致的凋亡現象，因而能提高細胞存活率。

實施例2 靈芝酸混合物可抑制細胞凋亡訊息傳遞分子p38之活化

於此實施例中，透過訊息傳遞分子p38之表現量，來評估本發明之靈芝酸混合物的效果。因P38訊息傳遞分子可以被活性氧物質(reactive oxygen species,ROS)刺激磷酸化而活化，引發下游一連串訊息傳遞，進而引發細胞死亡，因此，p38之活性(磷酸化)可用來評估本發明之靈芝酸是否能藉由抑制P38以保護心肌細胞免於凋亡之效果。

與實施例1類似，H9c2細胞先經本發明之靈芝酸混合物(15微克/毫升)處理2小時後，再以去除葡萄糖/血清之培養液培養細胞約24小時。接著進行蛋白質純化，以西方墨點法觀察磷酸化p38(phospho-p38,p-p38)及總p38(total p38,t-p38)量，並以β-微管蛋白(β-tubulin)為組間蛋白定量標準。與實施例1類似，本實驗同樣分為四組，載體組、GAs組、G/S(-)組以及GA(+)G/S(-)組。載體組為以含葡萄糖/血清培養液培養之H9c2細胞；GAs組為以本發明之靈芝酸混合物處理之含葡萄糖/血清培養液培養之H9c2細胞；G/S(-)組為以去除葡萄糖/血清培養液培養之H9c2細胞；以及GA(+)G/S(-)組為以本發明之靈芝酸混合物處理之缺乏葡萄糖/血清培養液培養之H9c2細胞。以上各組均依據「材料與方法」所述步驟，進行細胞培養。結果如第2圖所示。

如第2圖所示，相較於載體組及G/S(-)組，GAs組及GA+G/S(-)組之磷酸化p38量較低，故證實本發明之靈芝酸混合物不僅能減少正常狀態下細胞內p38磷酸化，還可抑制因缺乏養分而升高的p38磷酸化。

實施例3 本發明之靈芝酸混合物可保護心肌細胞免於大量氧化負荷引發之細胞凋亡與其訊息傳遞分子

本實驗以過氧化氫(hydrogen peroxide,H₂ O₂ )直接模擬心肌細胞處於大量氧化負荷刺激環境，藉以評估本發明靈芝酸混合物是否具有抗氧化而保護心肌細胞免於凋亡之效果。

在本實驗中，將H9c2細胞以本發明之靈芝酸混合物(0.15微克/毫升)處理2小時，再加入過氧化氫(200 mM)處理50分鐘，以DAPI進行染色，在螢光顯微鏡下觀察細胞是否有因凋亡所產生的染色體聚縮現象，並將結果進行統計分析。

本實驗中共分為四組，載體組、GAs組、H₂ O₂ 組以及H(+)GAs組。載體組為以含葡萄糖/血清培養液培養之H9c2細胞；GAs組為以本發明之靈芝酸混合物處理之含葡萄糖/血清培養液培養之H9c2細胞；H₂ O₂ 組為以過氧化氫處理之H9c2細胞；以及H(+)GAs組為以本發明之靈芝酸混合物預先處理，再加入過氧化氫處理之H9c2細胞。以上各組依據「材料與方法」所述之步驟，進行細胞培養。

結果如第3圖所示，載體組和GAs組皆沒有明顯凋亡的細胞，但H₂ O₂ 組之結果顯示，在施用過氧化氫後，會造成大量心肌細胞凋亡，而相較於H(+)GAs組，預先處理本發明之靈芝酸混合物，再施用過氧化氫可使細胞凋亡的數目明顯減少，顯示本發明之靈芝酸混合物可以保護心肌細胞免於H₂ O₂ 造成之傷害。

此外，本實施例同時進行p38磷酸化之偵測，以評估本發明之靈芝酸混合物於大量氧化負荷之環境下，是否可以抑制P38活化，以保護心肌細胞免於氧化負荷引起的傷害。

分別純化前述各組之蛋白質，並以西方墨點法觀察磷酸化p38以及總p38蛋白量之變化。結果如第4圖所示，相較於H₂ O₂ 組，H(+)GAs組磷酸化p38佔總p38之比值較低，具有抑制p38活化之效果。從結果可知過氧化氫會增加心肌細胞凋亡及p38磷酸化，而本發明之靈芝酸混合物可以降低p38磷酸化並維護細胞存活。

實施例4 靈芝酸可有效降低過度心臟負荷所引起小鼠心肌病變

為了證實本發明化合物能夠改善心臟功能，將異丙基腎上腺素(isoproterenol,ISO)注入實驗動物體內，引發心跳加速造成心臟過度負荷而損傷。接著，以本發明之靈芝酸混合物或載體來治療該實驗動物。最後，以組織染色觀察本發明之靈芝酸混合物，對於心臟組織的影響。

將心臟壞死小鼠，隨機分成二組，分別施用本發明之靈芝酸混合物(500 mg/kg)(GAs組)或二甲亞碸溶劑(dimethyl sulfoxide,DMSO)(DMSO組)，以皮下注射之方式，每日一次，兩天後取小鼠心臟切片，並以TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling)染色(紅色)標訂正行凋亡之細胞，再以肌鈣蛋白I(Troponin I)染色(綠色)標定心肌細胞，DAPI染色(藍色)來顯示細胞核。以上實驗動物依據「材料與方法」所述之步驟，進行飼養。

如第5圖所示，染色經定量後顯示，同時給予靈芝酸之組別能有效降低由ISO刺激所造成之心肌細胞死亡。

實施例5 靈芝酸透過抑制死亡因子FasL來保護心臟免於受到ISO所造成之心臟損傷

於此實施例中，評估本發明之靈芝酸混合物是否可以抑制死亡因子FasL之表現量。

將實驗動物分為四組，分別為載體組、GAs組、ISO+DMSO組、及ISO+GAs組。

於ISO+DMSO組，將DMSO以皮下注射之方式施用至心臟壞死小鼠體內(10毫克/公斤)；而ISO+GAs組，將靈芝酸混合物以皮下注射方式施用至心臟壞死的小鼠體內(500毫克/公斤)，經過24小時後，再次以相同方式及劑量注射靈芝酸混合物至小鼠體內。此外，載體組、GAs組則分別單獨施用PBS溶液及本發明之靈芝酸混合物。以上實驗動物依據「材料與方法」所述步驟進行。各組於實驗進行第48小時，將小鼠犧牲，取出心臟組織，將其脫水並滲蠟包埋後切片，利用免疫化學染色偵測死亡因子FasL之表現量(陽性反應心肌細胞呈現磚紅色)。

如第6圖所示，於ISO+DMSO組可觀察到FasL在部分受傷區域之周圍，表現量顯著，相較於ISO+GAs之組別，其FasL表現量較低。由此結果顯示，在ISO的藥物刺激下，會促使心肌細胞產生FasL，進而使心臟細胞走向凋亡造成損傷。而在同時處理GAs時，可減少ISO引起之FasL表現量，而降低心肌細胞凋亡保護心臟

實施例6 本發明靈芝酸混合物能防制萊克多巴胺對心肌細胞之毒性作用

本實驗以萊克多巴胺(Ractopamine)促使心肌細胞死亡，評估本發明之靈芝酸混合物是否具有保護心肌細胞免於凋亡之效果。

在本實驗中，將H9c2細胞以本發明之靈芝酸混合物(500 μM)處理2小時，再加入萊克多巴胺Rac,(1 mM)處理12 小時。本實驗中共分為四組，載體組、GAs組、Rac組以及GAs+R組。載體組為以含葡萄糖/血清培養液培養之H9c2細胞；GAs組為以本發明之靈芝酸混合物處理之含葡萄糖/血清培養液培養之H9c2細胞；Rac組為以萊克多巴胺處理之H9c2細胞；以及GAs+R組為以本發明之靈芝酸混合物預先處理，再加入萊克多巴胺處理之H9c2細胞。以上各組依據「材料與方法」所述之步驟，進行細胞培養。

如第7圖所示，GAs+R組細胞死亡大幅降低到接近未處理的載體組。顯示靈芝酸混合物幾乎完全去除了萊克多巴胺對心肌細胞的毒性。

綜上所述，可知利用本發明之靈芝酸混合物，於體外試驗中，可抑制P38訊息傳遞因子的活化，進而防止因缺乏養分或氧化壓力所造成的心肌細胞凋亡，且本發明之靈芝酸混合物亦可用來預防萊克多巴胺對心肌細胞所產生之毒性。此外，在心臟損傷動物模式中，本發明之靈芝酸混合物亦有顯著之保護效果，能降低FasL的表現量，減緩心臟組織細胞死亡的現象。故，以上數據證實本發明之靈芝酸混合物能有效防止心臟壞死或損傷。

儘管本發明之範疇所設置之數值範圍和參數為近似值，但在此所揭示之特定實施例，盡可能精確呈現。然而，因各個試驗測量具有標準差，故任何數值存在著特定的誤差值。

當可理解，上文的說明與實施方式僅為本發明之例示，且習知技藝人士可對其進行各種修飾。以上的說明文字、實驗例資料提供了本發明例示性實施方式的結構與用法。雖然上文某種程度數了本發明的多種實施方式，或提及了一或多種具體的實施方式，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖為依據本發明一實施方式，施用載體或本發明之靈芝酸混合物至缺乏養分之H9c2細胞後，細胞凋亡率的柱狀圖；第2圖為依據本發明一實施方式，施用載體或本發明之靈芝酸混合物至缺乏養分之H9c2細胞後，p38訊息傳遞因子的活化；第3圖為依據本發明一實施方式，施用載體或本發明之靈芝酸混合物處理之H9c2細胞，再施以過氧化氫處理後，細胞凋亡率的柱狀圖；第4圖為依據本發明一實施方式，施用載體或本發明之靈芝酸混合物處理之H9c2細胞，再施以過氧化氫處理後，p38訊息傳遞因子的活化；第5圖為依據本發明一實施方式，對心臟壞死小鼠施用載體或本發明靈芝酸混合物其心臟組織經過TUNEL、Troponin I以及DAPI三種染色檢測細胞凋亡的照片；第6圖為依據本發明一實施方式，對心臟壞死小鼠施用載體或本發明靈芝酸混合物，其心臟組織經過免疫組織化學染色，觀察FasL之表現量的照片；以及第7圖為依據本發明一實施方式，施用載體或本發明之靈芝酸混合物處理之H9c2細胞，再施以萊克多巴胺處理後，細胞凋亡率的柱狀圖。

Claims

一種靈芝酸(ganoderic acids)混合物於製造一種可防止心臟壞死或損傷之藥劑的用途，其中該靈芝酸混合物至少包含靈芝酸A、B、C、C5、C6、D、E、G及靈芝烯酸D(ganoderenic acid D)。
如請求項1所述的用途，其中該靈芝酸混合物是由一種包含以下步驟之方法所製備而成：(a)在室溫下將新鮮靈芝子實體浸泡在95%乙醇溶液中2-16小時；(b)升高該內含新鮮靈芝子實體之95%乙醇溶液的溫度至不超過100℃，並攪拌萃取1-4小時；以及(c)減壓濃縮該步驟(b)之萃取液。
如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該方法更包括在該步驟(c)之後，對該經過減壓濃縮之萃取液，實施一冷凍乾燥處理，以獲得該靈芝酸混合物之冷凍乾燥粉末。
如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該靈芝酸混合物之冷凍乾燥粉末之總三萜類含量為20%。
如申請專利範圍第2項所述之用途，其中在步驟(b)，該內含新鮮靈芝子實體之95%乙醇溶液的溫度是升高至約50℃。
如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該靈芝是松杉靈芝(Ganoderma tsugae )、赤芝(Ganoderma lucidum )或其之混合物。
如請求項1所述的用途，其中該心臟壞死或損傷是由以下任一狀況所引起：心肌纖維化、高血壓、心肌梗塞、心肌缺血、擴大性心肌病變、肥厚性心肌病變、限制性心肌病變、負荷性心肌病變、糖尿病性心肌病變、或萊克多巴胺所引起的細胞凋亡。
如請求項7所述的用途，其中該心臟壞死或損傷係由負荷過大或萊克多巴胺所引起的細胞凋亡所引起的。