CN113491701A - 含灵芝酸的特应性、牛皮癣或皮肤炎症的治疗、预防或减轻用组合物及其制备方法 - Google Patents
含灵芝酸的特应性、牛皮癣或皮肤炎症的治疗、预防或减轻用组合物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及新型灵芝酸的制备方法、灵芝酸的特应性、牛皮癣或皮肤炎症治疗预防或减轻用组合物，本发明的有效成分或含其的组合物不同于现有类固醇类物质及抗组胺剂，牛皮癣、特应性、皮肤炎症预防、治疗或减轻效果优良且无副作用。
Description
技术领域
本说明书涉及新型灵芝酸的制备方法、灵芝酸的特应性、牛皮癣或皮肤炎症的治疗、预防或减轻用组合物。
背景技术
慢性炎症性皮肤疾病是指因环境遗传性诱因发生的皮肤过敏反应而出现的疾病。身体为了在受到外部刺激时自我保护而具有去除异物质且调节诱发的炎症反应的免疫反应，免疫系统出现异常的情况下发生免疫疾病。炎症性皮肤疾病是由于与皮肤相关的免疫系统反应而发生的，其中包括过敏性皮炎、过敏性鼻炎、哮喘、过敏性结膜炎、特应性麻疹等(Donald Y.M.Leung et al,J.Clin Invest.,113(5)651-657(2004))。
已知对于特应性皮炎而言遗传性影响较大，而2018年健康保险审查评价院的调查结果显示因特应性皮炎而接受诊疗的国内患者数量达到94万2,927人，其中20岁以上的成人占42.7％。据判断这种成人特应性皮炎由于居住及办公环境的变化、社会压力等引发的情况相比于遗传影响更大。
作为其他皮炎疾病之一的牛皮癣是皮肤内细胞的非正常活动引起的疾病，目前还未查明发病原因。牛皮癣(Psoriasis)是银白色银屑伴随丘疹的常见自我免疫皮肤疾病，分布或程度因个人而异，而且具有全身性剥离、红斑、瘙痒感、干燥感和灼热感等多种症状。虽然全世界都有发生但因人种及种族而有显著的频率差异，虽然临床结果可能有多种，但一般呈现好转与恶化反复持续的形态。牛皮癣的发病机制目前还未完全查明，但已有炎症细胞浸润、免疫活性化分子增加、Th1及Th17反应、炎症相关细胞因子的非正常变化等炎症起到重要作用的研究结果。这种牛皮癣是因为形成角质的皮肤细胞相比于一般正常皮肤过度受到刺激而迅速增加，从而层层发生如皮屑的角质。不同于特应性皮炎，其发病率在成人非常高且主要发生于肘部与膝盖。据报道，主要症状为小米样皮疹和厚角质。
目前使用的皮肤疾病治疗剂处方为抑制作为过敏反应产物的组胺的分泌或抑制作为过敏症状之一的炎症反应的类固醇剂及抗组胺剂。这种特应性疾病治疗软膏并非预防及抑制根本性的炎症的生成的机制，长期使用的情况下会引发副作用。已知类固醇剂引发肥胖、糖尿、高血压、抑郁症等，抗组胺剂引发抑郁症、注意力集中障碍、无力症、嗜睡、性功能障碍等副作用，因此注重可用于特应性疾病的天然物材料的发掘及通过它们开发治疗剂。
皮肤炎症始于内部外部因素引起的刺激导致皮肤屏障出现异常而被诱导的信号分子也就是细胞因子(cytokine)。细胞因子主要生成于作为免疫细胞的T细胞(T cell)与巨噬细胞(macrophage)，白介素(interleukins)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisfactor-α,TNF-α)、干扰素-γ(interferon gamma,IFNγ)等(SM Opal et al,CHEST,117(4)1162-1172,2000)。
趋化因子(chemokine)是从受伤的组织、感染细菌或病毒的组织等分泌的低分子蛋白质的一种，起到白血球诱因作用及激活作用，根据分子内四个半胱氨酸残基分类，大致分类为CXCL、CCL、CX3CL及XCL。并且，已知S100A7、S100A8及S100A9等S100钙结合蛋白质位于染色体1q21的S100基因簇内且与牛皮癣有关。
对此，为了确认皮肤炎症疾病预防及治疗效果而重视趋化因子(CXCL8、CCL5、CCL20)与细胞因子(IL-6、IL-23/p19)、S100钙结合蛋白质(S100A7、S100A8、S100A9)等要素表达抑制。
然而，目前采用的对特应性、牛皮癣或皮肤炎症疾病有效果的物质有类固醇剂或抗组胺剂，已知这种治疗物质如上引起多种副作用。并且，这种治疗物质抑制作为所述疾病的症状的组胺的生成步骤，因此不具有预防或抑制根本性的炎症的生成的效果。
因此，为了治疗特应性、牛皮癣或皮肤炎症而需要开发抑制更根本性的炎症机制的同时减少副作用的治疗剂。
【现有技术文献】
【专利文献】
(专利文献0001)韩国公开专利10-2009-0018886号
发明内容
技术问题
为了解决上述问题，本发明确认了从天然物提取的成分中灵芝酸对引起特应性、牛皮癣及皮肤炎症的趋化因子(CXCL8、CCL5、CCL20)与细胞因子(IL-6、IL-23/p19)、S100钙结合蛋白质(S100A7、S100A8、S100A9)等要素表达具有优良的抑制作用，从而得到了本发明。
为此，根据本发明的一个方面，提供一种特应性、牛皮癣或皮肤炎症的预防、治疗或减轻用组合物，其中含有的效成分为灵芝酸。
并且，根据本发明的一个方面，提供一种特应性、牛皮癣或皮肤炎症的预防、治疗或减轻用组合物的制备方法，其中所述组合物中含有的效成分为灵芝酸。
并且，根据本发明的一个方面，提供一种特应性、牛皮癣或皮肤炎症的预防、治疗或减轻用灵芝酸的制备方法。
本发明的目的不限于以上所述的目的。可通过以下说明更明确本发明的目的，可通过权利范围记载的手段及组合实现。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供一种皮肤炎症的预防、治疗或减轻用组合物，其中含有的有效成分为灵芝酸(ganoderic acid)或其衍生物。
根据本发明的一个方面，提供一种特应性的预防、治疗或减轻用组合物，其中含有的有效成分为灵芝酸(ganoderic acid)或其衍生物。
根据本发明的一个方面，提供一种牛皮癣的预防、治疗或减轻用组合物，其中含有的有效成分为灵芝酸(ganoderic acid)或其衍生物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述灵芝酸或其衍生物为选自灵芝酸eta(GAeta)、丁基灵芝酸A(BGAA)、灵芝酸C2(GAC2)、灵芝酸A(GAA)、灵芝酸G(GAG)、灵芝烯酸B(GDAB)、灵芝酸B(GAB)、灵芝烯酸K(GDAK)、灵芝酸K(GAK)、灵芝烯酸D(GDAD)、灵芝酸D(GAD)、灵芝酸H(GAH)、灵芝酸C6(GAC6)及赤芝酸D中的任意一种以上的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述灵芝酸或其衍生物从灵芝(ganode rmalucidum)的提取物分离或获得的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述灵芝的提取物为乙醇提取物的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述灵芝的提取物是在30至80℃温度下提取2至40小时得到的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述有效成分抑制趋化因子、细胞因子及S100钙结合蛋白质中任意一种以上的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述趋化因子为CXCL8、CCL5及CCL20中任意一种以上，所述细胞因子为IL-6及IL-23/p19中任意一种以上，所述S100钙结合蛋白质为S100A7、S100A8及S100A9中任意一种以上的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述组合物为药学组合物的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述组合物为化妆料组合物的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述组合物为保健食品组合物的组合物。
根据本发明的另一方面，提供一种皮肤炎症、特应性或牛皮癣的预防、治疗或减轻用灵芝酸或其衍生物的制备方法，包括在30至80℃温度下利用乙醇溶剂提取灵芝(ganoderma lucidum)2至40小时的步骤。
根据本发明的另一方面，提供一种所述提取的步骤为超声波提取的制备方法。
根据本发明的另一方面，提供一种还包括再溶解提取后获得的粗提取物的步骤的制备方法。
技术效果
本发明的有效成分或含其的组合物具有优良的牛皮癣预防、治疗或减轻效果。
本发明的有效成分或含其的组合物具有优良的特应性预防、治疗或减轻效果。
本发明的有效成分或含其的组合物具有优良的皮肤炎症预防、治疗或减轻效果。
本发明的有效成分或含其的组合物不同于现有的类固醇类物质及抗组胺剂，无副作用且具有优良的牛皮癣、特应性、皮肤炎症预防、治疗或减轻效果。
本发明的有效成分或含其的组合物能够在mRNA水平上显著减少作为皮肤角质细胞的HeCaT细胞中诱发炎症的因子也就是炎症性细胞因子(IL-6、S100A7、S100A8、S100A9、CCL5、CCL20、CXCL8)的表达量。
作为本发明的有效成分的灵芝酸或其衍生物的制备方法能够以极高的收率获得所述有效成分。
本发明的效果不限于上述效果。应理解本发明的效果包括能够通过以下说明推导的所有效果。
附图说明
图1为示出本发明实施例1的灵芝提取物及其分离物的制备过程的示意图；
图2为按照实验例1用UPLC-QTOF-MS/MS分析本发明实施例1的灵芝提取物的成分的结果；
图3为本发明实施例1的半定量分析结果；
图4a至图4c为本发明实验例2的细胞毒性确认结果；
图5为本发明实验例3中在各提取条件下提取物的IL-6基因表达抑制结果；
图6为本发明实验例3中各提取条件下提取物的S100A7基因表达抑制结果；
图7a至7c为测定在40℃12小时、55℃12小时、24小时、70℃1小时这些特定条件下提取的提取物的皮肤炎症活性相关基因的表达活性的结果。
具体实施方式
应理解，在无其他明确说明的前提下，本说明书中使用的表示成分、反应条件、成分的含量的所有数字、值及/或表达是反应本质上不同于这些数字时得到这些值所发生的测定的多种不确定性的近似值，因此所有情况下都用术语“约”进行修饰。并且，本说明书中公开数值范围的情况下，这种范围是连续的，无其他明确说明的前提下包括从这种范围的最小值到含最大值的所述最大值的所有值。并且，这种范围指代整数的情况下，若无其他明确限定，则包括从最小值到含最大值的所述最大值的所有整数。
本说明书中，记载的范围有关变量的情况下，应理解所述变量包括含所述范围记载终点的记载范围内的所有值。例如，范围“5至10”不仅包括5、6、7、8、9、及10这些值，还包括6至10、7至10、6至9、7至9等任意下位范围，5.5、6.5、7.5、5.5至8.5及6.5至9等记载范围的范畴内的适当的整数之间的任意值。并且例如，“10％至30％”这一范围不仅包括10％、11％、12％、13％等值及至30％的所有整数，还包括10％至15％、12％至18％、20％至30％等任意的下位范围，10.5％、15.5％、25.5％等记载范围的范畴内的适当的整数之间的任意值。
以下对本发明进行具体说明。
灵芝酸是由三个环己烷环与一个环戊烷环构成的典型的三萜系成分，不仅增进抗氧化、抗糖尿、抗肥胖及消炎等生理活性，还增进免疫机能，尤其是消炎活性优良的成分。据报告显示，作为灵芝(Ganoderma lucidum)主要功能性成分的灵芝酸至今有约120个成分，根据现有的研究，连接于碳号3、7、11、12、15号的羟基、羰基、乙酰基等作用基的种类及与否出现不同的生理活性。然而，还没有关于灵芝酸在哪些条件下对皮肤炎症有效果的报告。
本申请涉及具有显著的皮肤炎症效果的灵芝(ganoderma lucidum)提取物及提取方法，经确认，本发明的灵芝提取物在mRNA水平上减少作为皮肤角质细胞的HeCaT细胞中诱发炎症的因子也就是炎症性细胞因子(IL-6、S100A7、S100A8、S100A9、CCL5、CCL20、CXCL8)的表达量。
现有的作为合成消炎药的固醇剂引起呕吐、消化不良等副作用，因此对天然消炎药的关心及需求在上升。为此，本发明的发明人发明了高含有灵芝的消炎活性成分也就是灵芝酸，而且消炎活性增进的灵芝提取物制备法，从而能够提供含高含量的灵芝酸的组合物。
以下对本发明的多种方面进行说明。
本发明的一个方面提供一种含有的有效成分为灵芝酸(ganoderic acid)或其衍生物的皮肤炎症预防、治疗或减轻用组合物。
本发明的一个方面提供一种含有的有效成分为灵芝酸(ganoderic acid)或其衍生物的特应性预防、治疗或减轻用组合物。
本发明的一个方面提供一种含有的有效成分为灵芝酸(ganoderic acid)或其衍生物的牛皮癣预防、治疗或减轻用组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述有效成分的含量为0.1重量％至90重量％的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述灵芝酸或其衍生物为选自灵芝酸eta(GAeta)、丁基灵芝酸A(BGAA)、灵芝酸C2(GAC2)、灵芝酸A(GAA)、灵芝酸G(GAG)、灵芝烯酸B(GDAB)、灵芝酸B(GAB)、灵芝烯酸K(GDAK)、灵芝酸K(GAK)、灵芝烯酸D(GDAD)、灵芝酸D(GAD)、灵芝酸H(GAH)、灵芝酸C6(GAC6)及赤芝酸D中的任意一种以上的组合物。
根据本发明的一个方面，所述灵芝酸或其衍生物从灵芝(ganoderma lucid um)的提取物分离或获得的组合物。
在本说明书中，“提取物”是指从天然物提取其中的成分得到的物质，与提取的方法、成分的种类无关地都包括在内。例如，是包括利用水或有机溶剂从天然物提取的溶解到溶剂的成分得到的物质、仅提取天然物的特定成分得到的物质等广义概念。根据本发明的一个实现例，不对所述有机溶剂进行特殊限制，可以是甲醇、乙醇、异丙醇、n-丙醇、n-丁醇及异丁醇等C1～C5的低级醇、甘油、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇等多元醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、苯、n-己烷、二乙醚、二氯甲烷、氯仿等烃类溶剂、及石油醚、乙酸甲酯、苯、己烷、氯仿、二氯甲烷、二甲醚、乙酸乙酯等非极性有机溶剂等。
根据本发明的一个方面，提供一种所述提取物是利用水、C1-C5醇、丙酮、丙酮水溶液或C1-C5醇水溶液提取的提取物的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述C1-C5醇利用选自由甲醇、乙醇、异丙醇、n-丙醇、n-丁醇及异丁醇构成的群组的任意一种以上的组合物。
根据本发明的一个方面，所述C1-C5醇水溶液及丙酮水溶液的浓度分别独立为10％至90％(v/v)的组合物。
根据本发明的一个方面，所述有效成分的含量可以是组合物总重量的0.001至90重量％。在一个实现例中，所述有效成分的含量可以是组合物总重量的0.001重量％以上、0.01重量％以上、0.1重量％以上、1重量％以上、1.1重量％以上、1.5重量％以上、2重量％以上、3重量％以上、5重量％以上、10重量％以上、20重量％以上或30重量％以上。并且，所述灵芝提取物的含量可以是组合物总重量的90重量％以下、85重量％以下、80重量％以下、70重量％以下、50重量％以下、40重量％以下、30重量％以下、20重量％以下、10重量％以下、5重量％以下、4重量％以下、3重量％以下、2重量％以下、1重量％以下、0.1重量％以下或0.05重量％以下。
根据本发明的一个方面，提供一种所述灵芝的提取物为乙醇提取物的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述灵芝的提取物是在30至80℃的温度提取2至40小时的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述灵芝的提取物是在30至60℃的温度提取2至15小时的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述灵芝的提取物是在35至45℃的温度提取10至14小时的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述灵芝的提取物是在50至60℃的温度提取10至14小时的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述有效成分抑制趋化因子、细胞因子及S100钙结合蛋白质中任意一种以上的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述趋化因子为CXCL8、CCL5及CCL20中任意一种以上，所述细胞因子为IL-6及IL-23/p19中任意一种以上，所述S100钙结合蛋白质为S100A7，S100A8及S100A9中任意一种以上的组合物。
根据本发明的一个方面，提供一种所述组合物为药学组合物的组合物。本发明的药学组合物还含有制备药剂通常使用的适当的载体、赋形剂及/或稀释剂，可制备成适合口服或非口服给药的医药品制剂形态。并且，可使用本发明的药学组合物通过一般方法制备药学剂型。关于剂型的制备，可以将活性成分与载体混合在一起，或者用载体稀释，或者封入胶囊或其他容器形态的载体内。因此剂型可以是片剂、丸剂、散剂、胶囊剂、酏剂(Elixir)、混悬剂、乳剂、液剂、糖浆、气雾剂、软质或硬质明胶胶囊剂、注射用溶液或混悬液、软膏剂、霜剂、凝胶剂或洗剂等形态。
本发明的药学组合物中可包含的适当的载体、赋形剂及稀释剂可以是例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油。并且，还可以包括制备剂型时通常使用的填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂、防腐剂等。可采用本领域已知的方法将本发明的药剂组合物剂型化成向哺乳动物给药后活性成分迅速、持续或延迟放出。
本发明的药学组合物的给药量因患者的状态及体重、疾病程度、药物形态、给药路径及期间而异，但可以由本领域技术人员适当选择。相对于患者的体重，活性成分的范围可以是0.001mg/㎏至500mg/㎏，优选的是按0.001至200mg/㎏给药。给药可每日给药一次，或者可分多次给药。所述给药量在任何方面都不限制本发明的范围。
根据本发明的一个方面，提供一种所述组合物为化妆料组合物的组合物。
所述化妆品组合物的剂型不受特殊限制，可根据目的适当选择。例如，可制备成选自由润肤水、皮肤柔软剂、爽肤水、收敛剂、乳液、牛奶乳液、水分乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、补水霜、护手霜、粉底、精华液、营养精华液、面膜、肥皂、清洁泡沫、清洁乳液、洁面乳、身体乳及身体清洁剂构成的群组的任意一种以上的剂型，但不限于此。
本发明的剂型为糊、霜或凝胶的情况下可利用动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、胶黄芪、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石粉或氧化锌等载体成分。
本发明的剂型为粉或喷雾的情况下可利用乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末作为载体成分，尤其是喷雾的情况下，还可以包含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚之类的推进剂。
本发明的剂型为溶液或乳液的情况下，利用溶剂、溶剂化剂或乳浊剂、例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂族酯、聚乙二醇脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。
本发明的剂型为混悬液的情况下可利用水、乙醇或丙二醇之类的液态稀释剂、乙氧基异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯(Polyoxyethylene sorbitol ester)及聚氧乙烯山梨醇酐酯(Polyoxyethylene sorbitan ester)之类的混悬剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或胶黄芪等作为载体成分。
本发明的剂型为含界面-活性剂的清洁剂的情况下，可采用脂肪族醇硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙磺酸盐、咪唑啉衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、亚麻碱衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯等作为载体成分。
所述有效成分的含量不受特殊限制，含量可以是组合物总重量的0.001至100重量％。所述有效成分满足所述含量的情况下，能够起到优良的效果且无副作用。
所述化妆品组合物中还可以包含选自由功能性添加物及一般化妆品组合物中包含的成分。可以含从由水溶性维生素、油溶性维生素、高分子肽、高分子多糖、鞘脂和海藻提取物构成的群组中所选择的成分作为所述功能性添加物。
本发明的化妆品组合物除了所述功能性添加物之外还可以根据需要配有一般化妆品组合物中包含的成分。此外，包含配合成分可以是油脂成分、保湿剂、润肤剂、界面活性剂、有机及无机颜料、有机粉体、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物提取物、pH调整剂、酒精、色素、香料、血液循环促进剂、冷感剂、制汗剂、纯净水等。
根据本发明的一个方面，提供一种组合物，所述组合物为保健食品组合物。
本发明的保健食品组合物含所述有效成分，其种类方面无特殊限制。所述食品的例子有饮料、肉类、香肠、面包、小点心、饼、鲜食、巧克力、糖果类、小吃类、饼干类、披萨、拉面、其他面类、口香糖类、冰淇淋类等乳酪产品、各种调料、饮料、酒精饮料及维生素复合剂、乳制品和乳加工品等，此外还包括通常意义上的保健食品。作为活性成分的灵芝提取物或从中分离的溶剂分离物可直接添加到食品或与其他食品或食品成分一起使用，可按照常规方法适当地使用。可根据使用目的(预防或改善用)合理确定有效含量，含量可以是保健食品总重量的0.001至70重量％范围。而以健康及卫生为目的或以健康调节为目的长期摄取的情况下，所述量可以是所述范围以下，由于在安全性方面不成任何问题，因此有效成分的使用量也可以是所述范围以上。例如，制备成保健饮料的情况下，除所述活性成分以外还可以包含制备饮料时通常使用的添加剂如天然碳水化物或香味剂等。所述天然碳水化物可包括单糖(例如葡萄糖、果糖)、二糖(例如，麦芽糖、蔗糖等)及多糖类(例如糊精、环糊精等)之类的一般的糖及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。所述天然碳水化物的含量可以是保健食品总重量的1至20重量％，优选为5至10重量％范围。所述香味剂可包括天然香味剂(奇异果甜蛋白(thaumatin)、甜叶菊(stevia)提取物、莱鲍迪甙A(Rebaudioside A)、甘草酸(Glycyrrhizin)等)及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜等)。此外还可以包含多种营养剂、维生素、矿物(电解质)、风味剂(合成或天然风味剂)、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳氧化剂等。并且，还可以包含用于制备天然果汁及果汁饮料及蔬菜饮料的果肉。这种添加剂的含量不受特殊限制，含量可以是保健食品总重量的0.1至20重量％范围。
根据本发明的另一方面，提供一种皮肤炎症、特应性或牛皮癣的预防、治疗或减轻用灵芝酸或其衍生物的制备方法，包括在30至80℃的温度利用乙醇溶剂提取灵芝(ganoderma lucidum)2至40小时的步骤。
根据本发明的另一方面，提供一种所述提取的步骤为超声波提取的制备方法。
根据本发明的另一方面，提供一种所述方法还包括再溶解提取后获得的粗提取物的步骤的制备方法。
以下通过具体实施例对本发明进行更具体的说明。以下实施例只是用于帮助理解本发明，本发明的范围不限于此。
实施例
实施例1:制备灵芝提取物
在本实施例中利用灵芝(Ganoderma lucidum)，用乙醇通过超声波提取机提取。具体如下制备灵芝提取物。
对灵芝的子实体热干燥后，将灵芝约2g在100％乙醇以介意温度条件(40、55及70℃)利用超声波提取机提取多种时间(1、3、6、12及24小时)。通过氮浓缩机对用滤纸对溶液进行过滤得到的滤液(Filtrate)进行浓缩得到粗提取物约0.2g。图1为示出灵芝提取物及其分离物的制备过程的示意图。
[实验例]
实验例1:灵芝酸含量分析
利用DMSO再溶解在实施例1制备的粗提取物，为了UPLC-QTOF-MS/MS分析而通过分析用0.2μm膜滤器再过滤一次。
(1)含量分析
连接安捷伦的UPLC 1290infinity系列/6470三重四极杆质谱(Triple quadrupole)MS进行了灵芝酸分析，分析条件如表1所示。
【表1】
(2)分析结果
UPLC-QTOF-MS/MS分析结果如图2所示，检测及分析了共19个成分。
在灵芝酸eta(GAeta；RT＝15.179分钟，C30H44O8，m/z 532)、丁基灵芝酸A(BGAA；RT＝16.183分钟，C34H52O7，m/z 572)、灵芝酸C2(GAC2；RT＝17.228分钟，C30H46O7，m/z517)及灵芝酸A(GAA；RT＝28.159，C30H44O7，m/z 515)情况下，确认到了类似的分裂图案。目前已有报告表明这些成分有D环的特征性分裂，对此进行了定性分析。
灵芝酸G(GAG；RT＝20.556分钟，C30H44O8，m/z 532)、灵芝烯酸B(GDAB；RT＝20.965分钟，C30H42O7，m/z 514)、灵芝酸B(GAB；RT＝22.753分钟，C30H44O7，m/z 516)、灵芝烯酸K(GDAK；RT＝24.227分钟，C32H44O9，m/z 572)、灵芝酸K(GAK；RT＝25.604分钟，C32H46O9，m/z 574)、灵芝烯酸D(GDAD；RT＝34.453分钟，C30H44O7，m/z 512)及灵芝酸D(GAD；RT＝38.331分钟，C30H42O7，m/z 514)的情况下，有报告表明呈以碳编号7及15号上附有羟基的形态的C环与D环的特征性分裂图案。
此外，关于具有与灵芝酸H(GAH；RT＝28.731分钟，C32H44O9，m/z)相似的骨架的灵芝酸C6(灵芝酸H的碳12号脱乙酰化的形态)、及赤芝酸D(灵芝酸H的碳3号被氧化而附有醇基的形态)，参考D环的特征性分裂图案与灵芝酸H的分裂图案进行了分析。
(3)半定量分析
根据以上定性分析结果，利用AgilentMassHunterWorkstation程序实施了半定量分析。定量分析结果如以下表2-4及图3所示。
【表2】
【表3】
【表4】
发现在不同的提取条件下，灵芝酸成分的含量和比例不同。
尤其40℃与55℃提取物的情况下，不同时间所对应的灵芝酸成分的含量不同，在12小时提取物中GAG、GAB、GDAK、GAK及GAH的含量最高。但是24小时长时间提取的情况下成分的含量减少。从而可知提取灵芝酸的适当提取时间也不同。
实验例2:确认细胞毒性效果
对在实施例1制备的灵芝酸提取物，利用细胞培养测定了细胞增殖效果。
细胞毒性实验是按照文献(Mosmann T.et al,J.Immunol.Meth.,6555-63(1983))记载的方法实施的。细胞增殖及毒性试验中使用的培养基为在含10％FBS(胎牛血清，培养基(Gibco))的杜氏改良Eagle培养基(DMEM，Dulbeco″s Modified Eagle″s Medium/highglucose，培养基(Gibco))中将成人皮肤细胞株(KCLB，HaCaT；角质形成细胞(Keratinocytecell))在96-孔板按1x102细胞/ml的数量接种使用。接种24小时后更换成未添加FBS的培养基并按浓度(3、10、30ug/ml)添加灵芝酸提取物后在37℃5％CO2培养器(incubator)培养24小时，向对照组只添加培养液。培养结束后通过DPBS洗涤细胞，并添加0.5mg/ml浓度的MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物，日本同仁化学研究所ZY903]溶液(1ml/孔)后，在37℃CO2培养器经过2小时后去除培养基，并用DPBS再次洗涤。其中，分别添加DMSO(二甲亚砜，Sigma D4540)100μl后在550nm测定吸光度，通过以下数学式1的算式算出了细胞毒性率。
数学式1
实验结果如图4a至图4c所示。
由图4a至图4c的结果可知，含本发明的灵芝酸提取物的提取物的情况下，浓度越高则细胞生存率越低，在30ug/ml浓度具有毒性。并且，在不同的提取条件下具有不同的细胞毒性。
实验例3:分析基因表达
细胞增殖及毒性试验中使用的培养基为在含10％FBS(胎牛血清，培养基(Gibco))的杜氏改良Eagle培养基(DMEM，Dulbeco″s Modified Eagle″s Medium/high glucose，培养基(Gibco))中将成人皮肤细胞株(KCLB，HaCaT)在6-孔板按1x106细胞/ml的数量接种使用。与10ug/ml的样品混合培养一小时后放入50ng/ml rhIL-17a与10ng/ml rhTNF-α并培养24小时诱导了皮肤炎症。
利用RNeasy试剂盒(凯杰，MD，USA)提取RNA后，将1ug的RNA用于反转录系统(逆向辅助第一链cDNA合成试剂盒的cDNA；赛默飞世尔科技，MA，USA)合成了cDNA。之后利用所述cDNA实施定量PCR测定了各基因的表达水平。用于本PCR的引物如表5所示。
【表5】
| No. | 引物名称 | 序列 |
| 1 | H_Q_IL-1b_F | TGAGCTCGCCAGTGAAATGA |
| 2 | H_Q_IL-1b_R | AGATTCGTAGCTGGATGCCG |
| 3 | H_Q_IL-6_F | TTCGGTCCAGTTGCCTTCTC |
| 4 | H_Q_IL-6_R | TCTTCTCCTGGGGGTACTGG |
| 5 | H_Q_IL-23p19_F | ACAGAAGCTCTGCACACTGG |
| 6 | H_Q_IL-23p19_R | GTTGTCCCTGAGTCCTTGGG |
| 7 | H_Q_IFN-y_F | GGGAAGCGAACAAGGAGTCA |
| 8 | H_Q_IFN-y_R | CTGGGATGCTCTTCGACCTC |
| 9 | H_Q_TNF-a_F | TCTTCTCGAACCCCGAGTGA |
| 10 | H_Q_TNF-a_R | GGGTTTGCTACAACATGGGC |
| 11 | H_Q_CCL5_F | CAGTCGTCTTTGTCACCCGA |
| 12 | H_Q_CCL5_R | TCTTCTCTGGGTTGGCACAC |
| 13 | H_Q_CCL20_F | TGTCAGTGCTGCTACTCCAC |
| 14 | H_Q_CCL20_R | CCGTGTGAAGCCCACAATAA |
| 15 | H_Q_S100A7_F | GCACAAATTACCTCGCCGAT |
| 16 | H_Q_S100A7_R | TGCTTGTGGTAGTCTGTGGC |
| 17 | H_Q_S100A8_F | AAGGGGAATTTCCATGCCGT |
| 18 | H_Q_S100A8_R | AGGACACTCGGTCTCTAGCA |
| 19 | H_Q_S100A9_F | CATGCTGATGGCGAGGCTAA |
| 20 | H_Q_S100A9_R | CCCTCGTGCATCTTCTCGTG |
| 21 | H_Q_GAPDH_F | GAAGGTGAAGGTCGGAGTC |
| 22 | H_Q_GAPDH_R | GAAGATGGTGATGGGATTTC |
利用SYBR green的实时(real-time)PCR是利用StepOne实时PCR系统(应用生物系统，福斯特城，CA，USA)进行的，将GAPDH用作管家基因并通过比较CT(comparative CT)方法进行了分析。
用于本发明的引物以报告表明趋化因子(CCL5、CCL20)与细胞因子(IL-6、IL、IL-23/p19)、S100钙结合蛋白质(S100A7、S100A8、S100A9)等影响特应性皮炎与癫痫的发生机制的蛋白质为对象。
实验结果如图5及图6所示。参见图5及图6的结果可知，白介素-6(IL-6)、S100A7等表达抑制活性在本发明的灵芝酸提取物的情况下，在其他条件下低，而在40℃下12小时与55℃下1-24小时的提取物的情况下mRNA水平方面具有优良的消炎活性。
可知在40℃下12小时这一特定条件下，在mRNA水平方面优良的消炎活性抑制白介素-6(IL-6)、S100A7等的表达。在55℃下6小时、12小时条件下IL-6表达抑制活性在1小时、3小时、6小时、12小时、24小时的所有条件下具有显著的S100A7抑制活性。70℃条件的情况下作为短时提取的1小时、3小时条件下确认到S100A7的抑制活性。从而以在40℃12小时、55℃12小时24小时，70℃1小时具有优良活性的条件下提取的提取物为对象确认了多种基因表达活性。
皮肤炎症的情况下活性化的路径复杂，因此利用多种引物确认了对消炎活性是否有效果。实验结果如图7a至图7c所示。如图7a至图7c所示，在40℃提取12小时的灵芝提取物消炎活性高，尤其CCL5、S100A8、S100A9的情况下相比于阴性对照组其活性优良。
以上参见附图对本发明的实施例进行了说明，但本领域的普通技术人员应当理解其可以在不变更本发明的技术思想或必要技术特征的前提下可以以其他多种形态实施。因此应理解以上说明的实施例为全面例示，而不是进行限定。
<110> 韩国科学技术研究院
<120> 含灵芝酸的特应性、牛皮癣或皮肤炎症的治疗、预防或减轻用组合物及其制备方法
<130> DP-2020-0028
<160> 22
<170> 合作专利(KoPatentIn 3.0)
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
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gaagatggtg atgggatttc 20
Claims (15)
1.一种皮肤炎症预防、治疗或减轻用组合物，其中，含有的有效成分为灵芝酸(ganoderic acid)或其衍生物。
2.一种特应性预防、治疗或减轻用组合物，其中含有的有效成分为灵芝酸(ganodericacid)或其衍生物。
3.一种牛皮癣预防、治疗或减轻用组合物，其中，含有的有效成分为灵芝酸(ganodericacid)或其衍生物。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的组合物，其中：
所述灵芝酸或其衍生物为选自由灵芝酸eta(GAeta)、丁基灵芝酸A(BGAA)、灵芝酸C2(GAC2)、灵芝酸A(GAA)、灵芝酸G(GAG)、灵芝烯酸B(GDAB)、灵芝酸B(GAB)、灵芝烯酸K(GDAK)、灵芝酸K(GAK)、灵芝烯酸D(GDAD)、灵芝酸D(GAD)、灵芝酸H(GAH)、灵芝酸C6、乙酰基灵芝酸F及赤芝酸D中的任意一种以上。
5.根据权利要求1至3中任意一项所述的组合物，其中：
所述灵芝酸或其衍生物为从灵芝(ganoderma lucidum)的提取物分离或获得的。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中：
所述灵芝的提取物为乙醇提取物。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中：
所述灵芝的提取物是在30至80℃的温度下提取2至40小时得到的。
8.根据权利要求1至3中任意一项所述的组合物，其中：
所述有效成分抑制趋化因子、细胞因子及S100钙结合蛋白质中任意一种以上。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中：
所述趋化因子为CCL5及CCL20中任意一种以上，
所述细胞因子为IL-6及IL-23/p19中任意一种以上，
所述S100钙结合蛋白质为S100A7、S100A8及S100A9中任意一种以上。
10.根据权利要求1至3中任意一项所述的组合物，其中：
所述组合物为药学组合物。
11.根据权利要求1至3中任意一项所述的组合物，其中：
所述组合物为化妆料组合物。
12.根据权利要求1至3中任意一项所述的组合物，其中：
所述组合物为保健食品组合物。
13.一种皮肤炎症、特应性或牛皮癣预防、治疗或减轻用灵芝酸或其衍生物的制备方法，其中，包括：
在30至80℃的温度下利用乙醇溶剂对灵芝(ganoderma lucidum)提取2至40小时的步骤。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其中：
提取的所述步骤为超声波提取。
15.根据权利要求13所述的制备方法，其中，所述方法还包括再溶解提取后获得的粗提取物的步骤。
Applications Claiming Priority (2)
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| JPH11180889A (ja) * | 1997-12-15 | 1999-07-06 | Buhei Kono | 霊芝からの抽出成分を含有する皮膚炎治療用薬液 |
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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