CN101190935A

CN101190935A - 用于病毒性感染的化合物

Info

Publication number: CN101190935A
Application number: CNA2006100706087A
Authority: CN
Inventors: 黄振华
Original assignee: Individual
Current assignee: Jilin Jinsheng Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2006-12-01
Filing date: 2006-12-01
Publication date: 2008-06-04
Anticipated expiration: 2026-12-01
Also published as: CN101190935B

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及具有抗病毒等活性的新化合物或其立体异构体及其盐，这些化合物或其立体异构体的制备方法，含有这些化合物或其立体异构体及其盐作为必需的活性成分的药物组合物，以及这些化合物或其立体异构体及其盐在制备治疗和/或预防病毒性感染和肝脏疾病的药物中的应用。本发明的化合物或其立体异构体具有显著的抗病毒作用，尤其是乙型肝炎病毒和人免疫缺陷病毒，同时具有显著的抗急性和慢性肝损伤的活性。

Description

用于病毒性感染的化合物

1、技术领域

本发明涉及具有抗病毒等活性的新化合物或其立体异构体及其盐，这些化合物或其立体异构体的制备方法，含有这些化合物或其立体异构体及其盐作为必需的活性成分的药物组合物，以及这些化合物或其立体异构体及其盐在制备治疗和/或预防病毒性感染和肝脏疾病的药物中的应用，属于医药技术领域。

2、背景技术

病毒感染引起多种疾病，严重危害人类的健康和生命。据不完全统计，约60％的流行性传染病由病毒引起。已发现对人有致病性的病毒达1200多种，其中发病率最高、危害性最大的是20世纪80年代发现的人类免疫缺陷病毒(HIV)所致的艾滋病(AIDS)和乙型肝炎病毒(HBV)引起的慢性乙型肝炎(CHB)。

自20世纪80年代初发现首例AIDS病例以来，AIDS横行全球，严重威胁人类的健康和生存，至2003年底全球有4000多万人患有AIDS或者属病毒携带者，约300万人由于AIDS死亡。AIDS已经成为人类的第四大死亡原因。我国卫生部2003年公布中国HIV感染者84万，AIDS患者8万，死亡近20万人。我国HIV病毒感染者正以30％～40％的速度递增，AIDS已成为我国重点控制的重大疾病之一。

据世界卫生组织统计，2000年全球约有3.5亿人为慢性肝炎患者或乙型肝炎病毒(HBV)携带者，每年有100多万人死于和肝炎、肝硬化、肝癌有关的疾病。我国是病毒性肝炎的高发区，HBV携带者有1.2亿人，占世界HBV感染人数的1/3，其中慢性乙型肝炎病人约为3000万，约10％～20％可发展为肝硬化，1％～5％可演变为肝癌。目前α-干扰素和拉米夫定为国际公认的疗效较好的抗乙肝病毒的药物，但有半数以上的患者经治疗后长期不愈，免疫调节药物亦难以清除病毒，致使病毒在肝细胞内长期复制活动，肝组织持续损害，肝功能持续异常。因此保护肝细胞，改善肝功能是治疗慢性乙型肝炎(CHB)重要的必不可少的一个方面。

3、发明内容

HIV所致的艾滋病和HBV所致的慢性乙型肝炎已经成为严重危害人类的健康和生命的疾病，为了提高AIDS和CHB患者的生存质量，有效的治疗AIDS和CHB，我们的药物研究人员进行了许多探索，致力于寻找新的抗病毒药物。

我们研究合成了大量新化合物，通过药理实验研究筛选发现，本发明的新化合物具有显著的抗病毒活性，同时具有显著的抗急性和慢性肝损伤的作用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了如式(I)所示的化合物或其立体异构体及其盐：

其中，

Y为鸟嘌呤-9-基、腺嘌呤-9-基、2，6-二氨基嘌呤-9-基、2-氨基嘌呤-9-基或其1-去氮杂、3-去氮杂或8-氮杂类似物，或者为胞嘧啶-1-基、尿嘧啶-1-基、胸腺嘧啶-1-基或其3-去氮杂类似物；

R¹为H、F、Cl、Br或I；

R²、R³、R⁴各自为独立的羟基，或者取代或未被取代的C_1-6的直链或支链的烷基、烯基或烷羟基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基、己基、乙烯基、1-丙稀基、2-丙稀基、异丙稀基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基；其中，所述的取代基可以为羟基，氨基，硝基，氟，氯，溴，碘，C_1-6的直链或支链的烷基或烯基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基、己基、乙烯基、1-丙稀基、2-丙稀基、异丙稀基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基，C_6-10的芳基，选自苯基、α-萘基或β-萘基，C_1-4直链或支链的烷基酰氨基，选自甲酰氨基、乙酰氨基、丙酰氨基、丁酰氨基，C_1-4直链或支链的烷氧基羰基，选自甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、丁氧基羰基、异丁氧基羰基；

R⁵为取代或未被取代的C_1-6的直链或支链的烷基或烯基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基、己基、乙烯基、1-丙稀基、2-丙稀基、异丙稀基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基；其中，所述的取代基可以为羟基，氨基，硝基，卤素，选自氟、氯、溴、碘，C_1-4的直链或支链的烷基或烯基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、乙烯基、1-丙稀基、2-丙稀基、异丙稀基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、异丁烯基。

优选的化合物为：

Y为鸟嘌呤-9-基、腺嘌呤-9-基、2，6-二氨基嘌呤-9-基、2-氨基嘌呤-9-基、胞嘧啶-1-基、尿嘧啶-1-基或胸腺嘧啶-1-基；

R¹为H、F、Cl或Br；

R²、R³、R⁴各自为独立的羟基，或者取代或未被取代的C_1-4的直链或支链的烷基、烯基或烷羟基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、乙烯基、1-丙稀基、2-丙稀基、异丙稀基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、异丁烯基、羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基；所述的取代基同上所述；

R⁵为取代或未被取代的C_1-4的直链或支链的烷基或烯基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、乙烯基、1-丙稀基、2-丙稀基、异丙稀基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、异丁烯基；所述的取代基同上所述。

进一步优选的化合物为：

Y为鸟嘌呤-9-基、腺嘌呤-9-基、胞嘧啶-1-基、尿嘧啶-1-基或胸腺嘧啶-1-基；

R¹为H、F或Cl；

R²、R³、R⁴各自为独立的羟基，或者取代或未被取代的C_1-3的直链或支链的烷基、烯基或烷羟基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、乙烯基、1-丙稀基、2-丙稀基、异丙稀基、羟甲基、羟乙基、羟丙基；所述的取代基同上所述；

R⁵为取代或未被取代的C_1-4的直链或支链的烷基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基，所述的取代基同上所述。

更进一步优选的化合物为：

Y为鸟嘌呤-9-基、腺嘌呤-9-基或胞嘧啶-1-基；

R¹为H、F或Cl；

R²为甲基或羟甲基；

R³为甲基或羟甲基；

R⁴为甲基、羟基或羟甲基；

R⁵为甲基、乙基、丙基或异丙基。

最优选的化合物为：

Y为鸟嘌呤-9-基；R¹为H；R²为甲基；R³为甲基；R⁴为甲基；R⁵为乙基或异丙基。即：

11′-氧代-18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]乙氧基]-甲基磷酸单酯(以下简称化合物A)，结构式如下所示：

11′-氧代-18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]丙氧基]-甲基磷酸单酯(以下简称化合物B)，结构式如下所示：

18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]乙氧基]-甲基磷酸单酯(以下简称化合物C)，结构式如下所示：

18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]并氧基]-甲基磷酸单酯(以下简称化合物D)，结构式如下所示：

上述化合物的结构中含有多个手性碳，手性碳上的基团可以为α或β构型，所以可以有多种立体异构体，尤其是其18位的α-H可以变为β-H，如式(II)所示，其中X、Y、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵的含义同上所述。

上述化合物或其立体异构体的结构中含有羧基，为了提高其水溶性或稳定性等可以成盐，包括：金属盐，例如钠盐、钾盐、锂盐、镁盐、钙盐、锌盐、铋盐、铝盐、银盐、铜盐、铁盐、锰盐、钴盐、镧盐、钐盐等，尤其是钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐、铋盐、铝盐；铵盐；有机胺盐，例如葡甲胺盐、精氨酸盐、赖氨酸盐、组氨酸盐、鸟氨酸盐等；根据化合物的不同，可以是单盐、二盐、三盐或复合盐。

本发明化合物可以通过下列工艺制备，但不仅限于下列工艺：

将结构式(IV)所示化合物(其中Y、R⁵的含义同上所述)悬浮于DMF中，加入三乙胺，升温后搅拌下分批缓慢加入结构式(III)所示化合物或其异构体(其中X、R¹、R²、R³、R⁴的含义同上所述)，搅拌反应一定时间，反应液冷却，加入去离子水，搅拌后析出固体，过滤，滤饼用乙酸乙酯溶解后转入分液漏斗中，用水洗涤，然后将有机层用1mol/l的HCl提取，合并酸水层，冰浴冷却下用饱和Na₂CO₃溶液调节pH后，用乙酸乙酯提取，合并乙酸乙酯层并用饱和氯化钠溶液洗涤，有机层干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得粗品，加入乙醇，搅拌加热溶解后加活性炭脱色，趁热过滤，滤液自然析晶，过滤，得本发明化合物或其异构体。

本发明进一步要求保护上述化合物或其立体异构体在制备治疗和/或预防病毒性感染的药物中的应用。本发明化合物或其立体异构体具有显著的抗病毒活性。药理实验表明，本发明化合物对鸭DHBV病毒具有显著抑制作用，并且停药后无明显的反跳现象；小鼠给药本发明化合物后5％血清在MT-4细胞内培养对HIV-1 IIIB P24抗原有显著抑制作用。实验结果表明，本发明化合物对HBV和HIV均有显著抑制作用，具有显著的抗病毒活性。

本发明进一步要求保护上述化合物或其立体异构体在制备治疗和/或预防肝脏疾病的药物中的应用。本发明化合物或其立体异构体具有显著的保肝活性。药理实验表明，本发明化合物可以显著降低四氯化碳致急性肝损伤后小鼠血清中的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平，并减轻肝组织损伤，对CCl₄中毒小鼠肝损伤具有显著保护作用；本发明化合物可以显著降低四氯化碳致慢性肝损伤大鼠血清中的ALT、AST和透明质酸(HA)的水平，显著降低肝组织中羟脯氨酸(Hyp)的含量，降低肝脏病变程度，可显著改善肝功能，减轻肝纤维化。实验结果表明，本发明化合物对急性和慢性肝损伤有显著保护作用。

本发明还进一步要求保护包括上述化合物或其立体异构体及其盐作为必需的活性成分与药学上可接受的载体的药物组合物，为临床上或药学上可接受的任一剂型；可以肠胃外、口服、经皮给药等方式施用于需要这种治疗的患者，优选为口服制剂或注射剂。上述药物组合物中含有生理有效量的本发明的任化合物或其立体异构体及其盐(以本发明化合物或其立体异构体及其盐计)2mg～2g，例如可以是2mg、5mg、7mg、8mg、10mg、15mg、17mg、20mg、25mg、28mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、53mg、56mg、60mg、70mg、80mg、85mg、90mg、100mg、110mg、120mg、125mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、0.2g、0.25g、0.3g、0.34g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、2g等。

用于肠胃外给药时，可制成注射剂。注射剂系指药物制成的供注入体内的溶液、乳液或混悬液及供临用前配制或稀释成溶液或混悬液的粉末或浓溶液的无菌制剂，注射剂可分为注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。注射液系指药物制成的供注射入体内用的无菌溶液型注射液、乳液型注射液或混悬型注射液，可用于肌内注射、静脉注射、静脉滴注等；其规格有1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、50ml、100ml、200ml、250ml、500ml等，其中供静脉滴注用的大体积(一般不小于100ml)注射液也称静脉输液。注射用无菌粉末系指药物制成的供临用前用适宜的无菌溶液配制成澄清溶液或均匀混悬液的无菌粉末或无菌块状物，可用适宜的注射用溶剂配制后注射，也可用静脉输液配制后静脉滴注；无菌粉末用溶媒结晶法、喷雾干燥法或冷冻干燥法等制得。注射用浓溶液系指药物制成的供临用前稀释供静脉滴注用的无菌浓溶液。

制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，可选用水性溶剂或非水性溶剂。最常用的水性溶剂为注射用水，也可用0.9％氯化钠溶液或其他适宜的水溶液；常用的非水性溶剂为植物油，主要为供注射用大豆油，其他还有乙醇、丙二醇、聚乙二醇等的水溶液。配制注射剂时，可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂，如渗透压调节剂、pH值调节剂、增溶剂、填充剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等。常用的渗透压调节剂包括氯化钠、葡萄糖、氯化钾、氯化镁、氯化钙、山梨醇等，优选氯化钠或葡萄糖；常用的pH值调节剂包括醋酸-醋酸钠、乳酸、枸橼酸-枸橼酸钠、碳酸氢钠-碳酸钠等；常用的增溶剂包括聚山梨酯80、丙二醇、卵磷脂、聚氧乙烯蓖麻油等；常用的填充剂包括乳糖、甘露醇、山梨醇、右旋糖酐等；常用的抗氧剂有亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等；常用抑菌剂为苯酚、甲酚、三氯叔丁醇等。注射剂常用容器有玻璃安瓿、玻璃瓶、塑料安瓿、塑料瓶等。

用于口服时，可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。片剂系指药物与适宜的辅料混匀压制而成的圆片状或异形片状的固体制剂，以口服普通片为主，另有含片、舌下片、口腔贴片、咀嚼片、分散片、可溶片、泡腾片、缓释片、控释片与肠溶片等。胶囊剂系指药物或加有辅料充填于空心胶囊或密封于软质囊材中的固体制剂，依据其溶解与释放特性，可分为硬胶囊(通称为胶囊)、软胶囊(胶丸)、缓释胶囊、控释胶囊和肠溶胶囊等。丸剂系指药物与适宜的辅料均匀混合，以适当方法制成的球状或类球状固体制剂，包括滴丸、糖丸、小丸等。颗粒剂系指药物与适宜的辅料制成具有一定粒度的干燥颗粒状制剂，可分为可溶颗粒(通称为颗粒)、混悬颗粒、泡腾颗粒、肠溶颗粒、缓释颗粒和控释颗粒等。口服溶液剂系指药物溶解于适宜溶剂中制成供口服的澄清液体制剂。口服混悬剂系指难溶性固体药物，分散在液体介质中，制成供口服的混悬液体制剂，也包括干混悬剂或浓混悬液。糖浆剂系指含有药物的浓蔗糖水溶液。

制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。常用填充剂包括淀粉、糖粉、磷酸钙、硫酸钙二水物、糊精、微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、甘露醇等；常用粘合剂包括羧甲基纤维素钠、PVP-K30、羟丙基纤维素、淀粉浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲纤维素、胶化淀粉等；常用崩解剂包括干淀粉、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等；常用润滑剂包括硬脂酸镁、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶等。

本发明化合物或其立体异构体及其盐与现有技术相比，具有以下优点：

(1)首次提供了具有显著抗病毒等活性的新化合物，尤其是11′-氧代-18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]乙氧基]-甲基磷酸单酯、11′-氧代-18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]丙氧基]-甲基磷酸单酯、18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]乙氧基]-甲基磷酸单酯、18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]并氧基]-甲基磷酸单酯，丰富了临床用药品种。

(2)药理实验表明，本发明化合物对鸭DHBV病毒具有显著抑制作用，且停药后无明显的反跳现象，小鼠给药本发明化合物后5％血清在MT-4细胞内培养对HIV-1 IIIB P24抗原有显著抑制作用，有显著的抗病毒作用。

(3)药理实验表明，本发明化合物对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤和大鼠慢性肝损伤均有显著保护作用，有显著抗急性和慢性肝损伤的作用。

(4)本发明化合物具有显著的抗HBV和HIV活性，并且具有显著的保肝活性，具有很好的临床应用价值。

以下通过实验例来进一步阐述本发明化合物的有益效果。本发明化合物具有下列有益效果，但不应将此理解为本发明化合物仅具有下列有益效果。

以下实验例中用化合物A代替11′-氧代-18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]乙氧基]-甲基磷酸单酯，化合物B代替11′-氧代-18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]丙氧基]-甲基磷酸单酯，化合物C代替18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]乙氧基]-甲基磷酸单酯，化合物D代替18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]并氧基]-甲基磷酸单酯。

实验例1 本发明化合物抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的作用

受试动物：1日龄北京鸭，雌雄兼用。

供试品：生理盐水：市购；

化合物A胶囊：15mg；

化合物B胶囊：15mg；

化合物C胶囊：15mg

化合物D胶囊：15mg。

给药剂量：见表1，模型组给予氯化钠注射液。

实验方法：1日龄北京鸭腹腔注射DHBV-DNA阳性病毒血清，每只0.1ml，接种1周后，分别颈外静脉抽血，经斑点杂交检测筛选出感染阳性鸭，饲养至2周龄作为实验动物。将感染成功的阳性鸭50只，随机分为5组，每组10只，分别为模型组和各给药组。感染后第13天开始，模型组每日灌胃给予生理盐水20ml/kg，各给药组按表1所示剂量用生理盐水稀释至所需浓度灌胃给药20ml/kg，每日1次，连续10天，停药观察3天。分别于给药前、给药5天、给药10天、停药3天颈外静脉抽血，分离血清于-20℃保存待检。采用斑点杂交法测定血清DHBV-DNA的变化，斑点值为volume(volume＝intensity×mm²)。

实验结果：见表1。模型组给予生理盐水后鸭血清DHBV-DNA滴度无明显降低，化合物A、化合物B、化合物C、化合物D各给药组给药5天、10天鸭血清DHBV DNA滴度均极显著降低(p＜0.01)，停药3天后各组DHBV-DNA水平无明显升高。

表1 给药本发明化合物前后鸭血清DHBV-DNA水平的比较(X±S，n＝10)

与给药前相比较：^**p＜0.01。

用DHBV感染鸭作为乙型肝炎动物模型来研究人类乙型肝炎发病机理、病毒复制过程及筛选有效的治疗药物，已为国内外学者所公认。1～3日龄雏鸭感染DHBV可维持长期病毒血症而无明显的自然转阴现象，我们应用1日龄雏鸭经腹腔感染DHBV的方法来建立鸭乙型肝炎动物模型进行本发明化合物抗乙肝病毒疗效的研究。实验结果表明，本发明化合物对鸭DHBV病毒具有显著抑制作用，并且停药后无明显的反跳现象，表明本发明化合物对病毒性肝炎有显著疗效。

实验例2 本发明化合物对D-氨基半乳糖(DAG)致大鼠急性肝损伤的保护作用

受试动物：健康大鼠，60只，体重200～220g，雌雄兼用，随机分为6组，每组10只。

供试品：氯化钠注射液：250ml∶2.25g，山东长富洁晶药业有限公司；

化合物A注射液：5ml∶125mg；

化合物B注射液：5ml∶125mg；

化合物C注射液：5ml∶125mg；

化合物D注射液：5ml∶125mg。

给药剂量：见表2。

实验方法：大鼠按体重随机分为正常对照组、模型组和各给药组，每组10只。正常对照组和模型组每日腹腔注射给予氯化钠注射液20ml/kg，各给药组按表2所示剂量用氯化钠注射液稀释至所需浓度腹腔注射给药20ml/kg，每日1次，连续10天。正常对照组在最后一次给药1h后，腹腔注射氯化钠注射液，其余各组均腹腔注射1.25％的D-氨基半乳糖800mg/kg。24h快速断头采血，分离血清，测定血清谷丙转氨酶(ALT)水平；取肝脏，测定肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化物(LPO)水平，并作病理组织学检查。

表2 本发明化合物对DAG致急性肝损伤大鼠的作用(X±S，n＝10)

与正常对照组相比较：^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型组相比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01。

实验结果：

(1)对血清ALT水平的影响：见表2。与正常对照组相比较，模型组大鼠血清中ALT极显著升高(p＜0.01)。与模型组相比较，化合物A、化合物B、化合物C、化合物D各给药组大鼠血清中ALT水平均极显著降低(p＜0.01)。

(2)对肝组织中SOD活性和LPO含量的影响：与正常对照组相比较，模型组大鼠肝组织中的SOD活性显著降低(p＜0.05)，LPO含量极显著升高(p＜0.01)。与模型组相比较，化合物A、化合物B、化合物C、化合物D各给药组大鼠肝组织中的SOD活性显著升高(p＜0.05)，基本恢复正常水平，LPO含量极显著降低(p＜0.01)，与正常水平接近。

(3)对肝脏病理变化的影响：模型组大鼠可见肝细胞弥漫性肿胀，细胞核不规则，染色质凝集，线粒体肿胀，粗面内质网排列不规则，脱颗粒，糖原减少，溶酶体及脂滴增多，部分区域肝细胞可见坏死性改变，细胞膜破裂，肿胀变性的细胞器游离于细胞外。化合物A、化合物B、化合物C、化合物D各给药组大鼠可见肝细胞轻度肿胀，细胞核形态规则，染色质分布均匀，线粒体轻度肿胀，线粒体结构模糊，基质密度增加，粗面内质网排列较规则，糖原分布正常，偶见脂滴，溶酶体少见，细胞膜完整。

结论：血清ALT是分布在肝内最多的一种酶，当肝细胞坏死仅1％时，血清中酶的活性即可显著增加。模型组大鼠与正常对照组比较，血清中ALT的活性显著升高。经本发明化合物治疗后，大鼠血清中ALT的活性明显下降，虽还未降至正常，但反映了肝细胞的坏死程度有显著改善。表明，本发明化合物能使细胞膜通透性降低，抑制细胞内酶的释放，从而改善肝损失。

自由基损伤和脂质过氧化能使肝损伤不断加重，构成恶性循环。模型组大鼠肝组织肝组织中的SOD活性显著降低，而本发明化合物治疗组大鼠肝组织肝组织中的SOD活性显著高于模型组。模型组大鼠肝组织中LPO水平明显升高，而本发明化合物治疗组大鼠肝组织肝组织中的LPO水平显著下降。表明，本发明化合物能增强清除自由基的能力，并具有抗氧化作用，从而保护肝细胞。

实验例3 本发明化合物对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的作用

供试品：生理盐水：市购；

化合物A胶囊：170mg；

化合物B胶囊：170mg；

化合物C胶囊：170mg；

化合物D胶囊：170mg。

给药剂量：见表3，正常对照组及模型组给予生理盐水。

实验方法：大鼠按体重随机分为正常对照组、模型组和各给药组，每组10只。除正常对照组外，所有动物腹部皮下注射25％CCl₄橄榄油液2ml/kg，正常对照组注射等量橄榄油，每周2次，连续13周。各组于给CCl₄第5周起给药，正常对照组和模型组灌胃组予生理盐水20ml/kg，各给药组按表3所示剂量用生理盐水稀释至所需浓度灌胃给药20ml/kg，每天1次，连续至第13周。末次给药24h后，处死动物，取血分离血清测定血清ALT、AST、透明质酸(hyaluronic acid，HA)含量，分离肝左叶组织测定羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)含量及病理切片观察。

实验结果：(1)对血清ALT和AST水平的影响：结果见表3。与正常对照组相比较，模型组大鼠血清转氨酶水平均极显著升高(p＜0.01)，ALT水平约为正常对照组的59倍，AST水平约为正常对照组的28倍。与模型组相比较，化合物A、化合物B、化合物C、化合物D各给药组大鼠血清中ALT和AST水平均极显著降低(p＜0.01)。

(2)对血清HA和肝组织Hyp含量的影响：结果见表3。与正常对照组相比较，模型组大鼠血清HA含量极显著升高(p＜0.01)；Hyp含量极显著增加(p＜0.01)，约为正常对照组的6倍。与模型组相比较，化合物A、化合物B、化合物C、化合物D各给药组大鼠血清中HA和Hyp含量均极显著降低(p＜0.01)，Hyp含量约为正常对照组的2倍。

表3 本发明化合物对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响(X±S，n＝10)

与正常对照组相比较：^##p＜0.01；与模型组相比较：^**p＜0.01。

(3)对肝组织病理变化的影响：正常对照组大鼠肝组织结构完整清晰，肝小叶规则，肝细胞形态排列正常，在中央经脉周围放射状分布。模型组大鼠肝小叶内桥型坏死范围广并累及多个小叶呈多小叶坏死，纤维分隔形成伴小叶结构紊乱，形成早期肝硬化或肝硬化，多数大鼠出现严重皮脂囊肿。化合物A、化合物B、化合物C、化合物D各给药组大鼠肝小叶内肝细胞变性、出现坏死，少数伴有桥型坏死，部分大鼠肝组织汇管区周围轻度碎屑坏死，小叶内肝细胞变性，点、灶状坏死，可见嗜酸小体，汇管区周围纤维化，纤维分隔形成，但小叶结构保留，部分大鼠肝组织为分隔伴小叶结构紊乱，而无肝硬化，未见皮脂囊肿。

结论：本实验以CCl₄引起慢性肝损伤，模型组大鼠肝组织呈早期肝硬化或肝硬化，多数大鼠形成严重的皮脂囊肿。而本发明化合物治疗组大鼠无一例出现皮脂囊肿，提示本发明化合物具有很强抗脂肪变性、防止肝细胞坏死的作用。实验表明，本发明化合物可使肝组织损伤显著减轻，生化学上则反映为ALT、AST活力降低，Hyp含量降低。

HA是反映肝细胞功能及肝纤维化进程的实用指标，其升高幅度与肝纤维化改变成正相关。模型组大鼠血清HA含量显著升高，而本发明化合物均能抑制血清HA的升高，表明本发明化合物具有改善肝功能，减轻肝纤维化的作用。

综上所述，本发明化合物具有显著的抗肝纤维化作用，对慢性肝损伤具有显著治疗作用。

实验例4 本发明化合物抗HIV的活性

供试品：生理盐水：市购；

化合物A胶囊：170mg；

化合物B胶囊：170mg；

化合物C胶囊：170mg；

化合物D胶囊：170mg。

实验方法：小鼠按体重随机分为各给药组，每组15只。给药前禁食禁水14小时，化合物A、B、C、D按350mg/kg用生理盐水稀释至所需浓度灌胃给药20ml/kg。给药后分别于不同时间摘眼球取血(每一时间取血5只)，分离血清，4℃保存，灭活处理后在细胞内培养测定其抑制HIV-1活性。96孔细胞培养板内同时加入含5％小鼠血清的细胞培养液、2×10⁵细胞/ml的MT细胞及100TCID₅₀的HIV-1IIIB病毒液，每种浓度重复2孔；同时设病毒对照孔和空白对照孔。置37℃、5％CO₂和饱和湿度培养箱内培养，每天观察细胞病变。培养4天(96小时)后吸细胞培养上清液，细胞用MTT染色；上清液经适当释后，按HIV-1P24抗原剂试剂盒提供的操作步骤测定HIV-1P24抗原，给药物组与阴性对照组比较，计算含药血清对HIV-1P24抗原的抑制率(抑制率％＝(阴性对照组OD-给药物组OD)/(阴性对照组OD-空白对照组OD)×100％)。

实验结果：在MT-4细胞培养96小时内，各组给药小鼠血清(终浓度为5％)未见致细胞病毒变。灌胃给药后，小鼠血清在MT-4细胞内培养抑制HIV-1 IIIB的作用见表4。小鼠给药化合物A、B、C、D后，5％血清在MT-4细胞内培养对HIV-1 IIIB P24抗原具有显著的抑制作用，给药后45min时抑制率大于90％，80min时大于75％，240min时大于55％。

表4 小鼠给药后5％血清在MT-4细胞内培养对HIV-1 IIIB P24抗原的抑制率

结论：体内抗HIV-1作用研究结果表明，灌胃给药后，5％小鼠血清对人传代T淋巴细胞MT-4细胞无毒性作用；给药后4小时内5％小鼠血清在MT-4细胞内培养对HIV-1具有明显地抑制作用，且持续时间较长。表明，本发明化合物具有显著的抗HIV的活性，且对人体的毒性较小。

4、具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。以下实施例中各剂型的辅料可以用药学上可接受的辅料替换，或者减少、增加。

以下实施例中用化合物A代替11′-氧代-18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]乙氧基]-甲基磷酸单酯，化合物B代替11′-氧代-18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]丙氧基]-甲基磷酸单酯，化合物C代替18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]乙氧基]-甲基磷酸单酯，化合物D代替18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]并氧基]-甲基磷酸单酯。

实施例1 羟基-11′-氧代-18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]乙氧基]- 甲基磷酸单酯的制备

将9-(膦酰甲氧基-乙基)腺嘌呤27.3g(0.1mol)悬浮于DMF100mL中，加入三乙胺50g，升温至50℃后搅拌下分批缓慢加入3β-羟基-11-氧代-18β，20β-齐墩果烷-12-烯酸47.1g(0.1mol)，搅拌反应12h，反应液冷却，加入去离子水300ml，搅拌后析出固体，过滤，滤饼用200ml乙酸乙酯溶解后转入分液漏斗中，水20ml×3洗涤，然后将有机层用1mol/l的HCl50ml×3提取，合并酸水层，冰浴冷却下用饱和Na₂CO₃溶液调节pH为6后，用60ml×3乙酸乙酯提取，合并乙酸乙酯层并用饱和氯化钠溶液洗涤，有机层干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得固体状物粗品，将上述粗品加入乙醇200ml，搅拌加热溶解后加0.5g活性炭脱色，趁热过滤，滤液自然析晶，过滤，得白色固体35.3g，即11′-氧代-18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]乙氧基]-甲基磷酸单酯，收率48.6％。

元素分析(C₃₈H₅₆N₅O₇P)：C：62.76％，H：7.85％，N：9.54％，P：4.18％(理论：C：62.88％，H：7.78％，N：9.65％，P：4.27％)。

实施例2 11′-氧代-18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]丙氧基]-甲基磷酸单酯的制备

参照实施例1中的制备方法，将9-(2-膦酰甲氧基-乙基)腺嘌呤替换为9-(2-膦酰甲氧基-丙基)腺嘌呤，得11′-氧代-18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]丙氧基]-甲基磷酸单酯34.9g，收率：47.1％。

元素分析(C₃₉H₅₈N₅O₇P)：C：63.19％，H：7.98％，N：9.41％，P：4.12％(理论：C：63.31％，H：7.90％，N：9.47％，P：4.19％)。

实施例3 18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]乙氧基]-甲基磷酸单酯的制备

参照实施例1中的制备方法，将3β-羟基-11-氧代-18β，20β-齐墩果烷-12-烯酸替换为3β-羟基-18β，20β-齐墩果烷-12-烯酸，得18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]乙氧基]-甲基磷酸单酯32.2g，收率：45.4％。

元素分析(C₃₈H₅₈N₅O₆P)：C：64.02％，H：8.28％，N：9.81％，P：4.30％(理论：C：64.11％，H：8.21％，N：9.84％，P：4.35％)。

实施例4 18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]并氧基]-甲基磷酸单酯的制备

参照实施例1中的制备方法，将9-(2-膦酰甲氧基-乙基)腺嘌呤替换为9-(2-膦酰甲氧基-丙基)腺嘌呤，将3β-羟基-11-氧代-18β，20β-齐墩果烷-12-烯酸替换为3β-羟基-18β，20β-齐墩果烷-12-烯酸，得18′β，20′β-齐墩果烷-12′-烯酸-3′β-O-[2-[(腺嘌呤)-9-基]并氧基]-甲基磷酸单酯33.4g，收率：46.0％。

元素分析(C₃₉H₆₀N₅O₆P)：C：64.43％，H：8.39％，N：9.59％，P：4.24％(理论：C：64.53％，H：8.33％，N：9.65％，P：4.27％)。

实施例5 本发明化合物片的制备

1、处方：

处方1：

化合物A、B、C或D 7g

微晶纤维素 50g

预胶化淀粉 100g

10％PVP K30乙醇液适量

硬脂酸镁 3g

共制备 1000片

处方2：

化合物A、B、C或D 14g

微晶纤维素 50g

预胶化淀粉 100g

10％PVP K30乙醇液适量

硬脂酸镁 3g

共制备 1000片

处方3：

化合物A、B、C或D 170g

微晶纤维素 80g

预胶化淀粉 150g

10％PVP K30乙醇液适量

硬脂酸镁 3g

共制备 1000片

2、制备工艺：

原料和辅料分别粉碎过80目筛备用；制粒溶液制备：取PVP K30加浓度为30～95％药用乙醇制成5～10％的溶液；取原料和辅料混匀，加入制粒溶液适量制软材，20目制粒，50～70℃干燥后，18目整粒，加入硬脂酸镁混匀；测定颗粒含量，压片，随机检测片重；成品全检，包装入库。

实施例6 本发明化合物胶囊的制备

1、处方：

处方1：

化合物A、B、C或D 15g

微晶纤维素 50g

预胶化淀粉 100g

10％PVP K30乙醇液适量

硬脂酸镁 3g

共制备 1000片

处方2：

化合物A、B、C或D 63g

微晶纤维素 50g

预胶化淀粉 100g

10％PVP K30乙醇液适量

硬脂酸镁 3g

共制备 1000片

处方3：

化合物A、B、C或D 170g

微晶纤维素 80g

预胶化淀粉 150g

10％PVP K30乙醇液适量

硬脂酸镁 3g

共制备 1000片

2、制备工艺：

原料和辅料分别粉碎过80目筛备用；制粒溶液制备：取PVP K30加浓度为30～95％药用乙醇制成5～10％的溶液；取原料和辅料混匀，加入制粒溶液适量制软材，20目制粒，50～70℃干燥后，18目整粒，加入硬脂酸镁混匀；测定颗粒含量，胶囊填充，随机检测装量；成品全检，包装入库。

实施例7 本发明化合物颗粒的制备

1、处方：

处方1：

化合物A、B、C或D 15g

糖粉 1000g

2％HPMC50％乙醇溶液适量

共制备 1000包

处方2：

化合物A、B、C或D 42g

糖粉 1000g

2％HPMC50％乙醇溶液适量

共制备 1000包

处方3：

化合物A、B、C或D 125g

糖粉 900g

2％HPMC50％乙醇溶液适量

共制备 1000包

处方4：

化合物A、B、C或D 340g

糖粉 1700g

2％HPMC50％乙醇溶液适量

共制备 1000包

2、具体步骤：

将原料和辅料粉碎过100目筛，备用；按照处方量称取原料和辅料，将原料与糖粉以等量递加的方法混合均匀，加入2％HPMC50％乙醇溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材，过20目筛制粒，60℃烘干，过18目筛整粒；取样，半成品化验颗粒中主药的含量，确定装量，分装；成品全检，包装入库。

实施例8 本发明化合物水针的制备

1、处方：

处方1：

化合物A、B、C或D 14g

聚山梨酯80 10g

注射用水 2000ml

共制备 1000支

处方2：

化合物A、B、C或D 170g

聚山梨酯80 50g

注射用水 2000ml

共制备 1000支

处方3：

化合物A、B、C或D 340g

聚山梨酯80 100g

注射用水 5000ml

共制备 1000支

处方4：

化合物A、B、C或D 125g

聚山梨酯80 50g

注射用水 10000ml

共制备 1000支

2、制备工艺：

将生产用安瓿配液用容器具、仪器设备等进行清理、除菌、除热原；按处方称取原料和辅料，取聚山梨酯80加配液量80％的注射用水，搅拌溶解；加入配液量0.05％的针用活性炭，搅拌15min，过滤，脱炭，向溶液中加入原料，搅拌溶解，测定并调节溶液的pH值，补加注射用水至全量，定容；药液经过0.22μm的微孔滤膜精滤，检查澄明度，半成品检验；将药液装于安瓿中，100℃流通蒸汽灭菌30min，检漏，灯检；成品全检，包装入库。

Claims

1.如下式所示的化合物或其立体异构体及其盐：

其中，

X为

R¹为H、F、Cl、Br或I；

R²、R³、R⁴各自为独立的羟基，或者取代或未被取代的C_1-6的直链或支链的烷基、烯基或烷羟基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基、己基、乙烯基、1-丙稀基、2-丙稀基、异丙稀基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基；其中，所述的取代基选自羟基，氨基，硝基，卤素，C_1-6的直链或支链的烷基或烯基，C_6-10的芳基，C_1-4直链或支链的烷基酰氨基，C_1-4直链或支链的烷氧基羰基；

R⁵为取代或未被取代的C_1-6的直链或支链的烷基或烯基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基、己基、乙烯基、1-丙稀基、2-丙稀基、异丙稀基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基；其中，所述的取代基选自羟基，氨基，硝基，卤素，C_1-4的直链或支链的烷基或烯基。

2.如权利要求1所述的化合物或其立体异构体及其盐，其中，

X为

R¹为H、F、Cl或Br；

R²、R³、R⁴各自为独立的羟基，或者取代或未被取代的C_1-4的直链或支链的烷基、烯基或烷羟基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、乙烯基、1-丙稀基、2-丙稀基、异丙稀基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、异丁烯基、羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基；

R⁵为取代或未被取代的C_1-4的直链或支链的烷基或烯基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、乙烯基、1-丙稀基、2-丙稀基、异丙稀基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、异丁烯基。

3.如权利要求2所述的化合物或其立体异构体及其盐，其中，

X为

R¹为H、F或Cl；

R²、R³、R⁴各自为独立的羟基，或者取代或未被取代的C_1-3的直链或支链的烷基、烯基或烷羟基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、乙烯基、1-丙稀基、2-丙稀基、异丙稀基、羟甲基、羟乙基、羟丙基；

R⁵为取代或未被取代的C_1-4的直链或支链的烷基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基。

4.如权利要求3所述的化合物或其立体异构体及其盐，其中，

X为

Y为鸟嘌呤-9-基、腺嘌呤-9-基或胞嘧啶-1-基；

R¹为H、F或Cl；

R²为甲基或羟甲基；

R³为甲基或羟甲基；

R⁴为甲基、羟基或羟甲基；

R⁵为甲基、乙基、丙基或异丙基。

5.如权利要求4所述的化合物或其立体异构体及其盐，其中，

X为

Y为鸟嘌呤-9-基；

R¹为H；

R²为甲基；

R³为甲基；

R⁴为甲基；

R⁵为乙基或异丙基。

6.如权利要求1～5所述的任一化合物或其立体异构体及其盐，其特征在于，所述的盐为金属盐，选自钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐、铋盐、铝盐中的一种或几种；或铵盐；或有机胺盐，选自葡甲胺盐、精氨酸盐、赖氨酸盐、组氨酸盐、鸟氨酸盐。

7.如权利要求1～5所述的任一化合物或其立体异构体及其盐在制备治疗和/或预防病毒性感染的药物中的应用。

8.如权利要求1～5所述的任一化合物或其立体异构体及其盐在制备治疗和/或预防肝脏疾病的药物中的应用。

9.如权利要求1～5所述的任一化合物或其立体异构体及其盐作为必需的活性成分与药学上可接受的载体的药物组合物。

10.如权利要求9所述的药物组合物为口服制剂或注射剂。