CN102046165A - 治疗纤维化紊乱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用一种或多种苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物来预防和/或治疗纤维化紊乱的组合物和方法。
Description
背景技术
病理性纤维化是指组织的异常增生、硬化和/或结疤,其特征是,细胞外基质成分(包括胶原)过度沉积。纤维化典型地是由慢性炎症引起,慢性炎症中会同时出现炎症、组织改建和修复过程。除了病原学和临床上的明显表现之外,大部分的慢性纤维化紊乱普遍有持续性的刺激或促进因素,其包括:持续性感染、自体免疫反应、变态反应、化学损伤、放射和组织损伤。刺激或促进因素维持增长因子、蛋白水解酶、血管生成因子和成纤维化因子的生成,其刺激结缔组织成分的沉积,结缔组织成分的沉积会逐渐改建和破坏正常组织结构。一些疾病,例如先天性肺纤维化、肝硬化、心血管纤维化、系统硬化和肾炎、增生组织改建和纤维化,最终会导致器官衰竭和坏死。
发明内容
本发明涉及用于治疗纤维化紊乱的组合物和方法。本发明还部分涉及苯并[c]苯并吡喃-6-酮化合物(benzo[c]chromen-6-one compounds)及其药物组合物,其在涉及纤维化的疾病中证实有治疗效果。
在另一实施例中,本发明还涉及对需要的对象给予有效治疗量的一种或多种本发明所述的组合物。在另一方面,目标对象已经被诊断患有纤维化紊乱。
从下述的实施例的详细说明中,本发明的其它特征和优点将显而易见。
附图说明
图1A-1F是对照连接视网膜的照片。A和B是H-E染色石蜡切片的光学显微照片,其显示了在注射溶剂(vehicle)(A)和药物(drug)(B)的正常眼睛中的正常视网膜形态。C和D是来自脱离3天或7天且接受眼内溶剂注射的动物眼睛内的连接的视网膜区域的激光扫描共聚焦图像;E和F是来自脱离3天或7天且接受眼内药物注射的动物眼睛内的连接的视网膜区域的激光扫描共聚焦图像。
图2A-2D是用抗波形纤维蛋白(波形蛋白抗体,anti-vimentin)(细胞,绿色)、抗溴脱氧尿苷(抗-BrdU)(分化细胞,dividing cells,红色)、抗植物凝集素B4(小神经胶质细胞和巨噬细胞,蓝色)标记的脱离视网膜的视网膜切片的激光共聚焦图像;
图4是表示视网膜脱离后视网膜下神经胶质疤痕的数目的柱形图;
图5是表示视网膜脱离后视网膜下神经胶质疤痕的长度的柱形图;
图6是表示视网膜脱离后免疫相关性细胞的数目的柱形图;
图7是表示视网膜脱离后外核层(ONL)的平均厚度的柱形图;
图8A是未脱离视网膜的视网膜切片的照片;
图8B和8C是未用化合物处理的脱离的视网膜的视网膜切片的照片;
图8D-8F是用化合物处理的脱离的视网膜的视网膜切片的照片;
图9是表示每mm脱离视网膜的分化细胞数目的柱形图;
图10A是未脱离视网膜的视网膜切片的照片;
图10B是未用化合物处理的脱离的视网膜的视网膜切片的照片,其示出视网膜下纤维化;
图10C是用化合物处理的脱离的视网膜的视网膜切片的照片,其示出无纤维化;
图11是Western免疫印迹(Western Blot)图,其示出Palomid 529对人肺纤维原细胞的分化介质的作用;及
图12是Western免疫印迹(Western Blot)图,其示出Palomid 529对人肺纤维原细胞的信号转导作用。
具体实施方式
大部分的慢性纤维化紊乱普遍有持续性的刺激或促进因素,其包括:持续性感染、自体免疫反应、变态反应、化学损伤、放射和组织损伤。刺激或促进因素维持增长因子、蛋白水解酶、血管生成因子和成纤维化因子的生成,其刺激结缔组织成分的沉积,结缔组织成分取代正常的薄壁组织。一些疾病,例如先天性肺纤维化、肝硬化、心血管纤维化、系统硬化和肾炎、增生组织改建和纤维化,最终会导致器官衰竭和坏死(表1)。威恩·托马斯(Wynn,TA),″Cellular and Molecular Mechanisms of Fibrosis″,J Pathol,214:199-210(2008)(细胞和分子纤维化机制)。
表1.受纤维化和可能的影响因素影响的主要组织
●肝脏-世界范围内病毒性肝炎、血吸虫病和酒精中毒引起硬化。
●肺-间质肺疾病(ILD)包括不同类的紊乱,其中肺部感染和纤维化是最终的共同的病理表现。存在多于150种不同病因的ILD,其包括:肉状瘤病(arcoidosis)、硅肺病(silicosis)、药物反应和感染,以及胶原质血管病,例如风湿性关节炎和系统性硬化症(硬皮病,scleroderma)。先天性肺纤维化—最常见的的ILD类型—的病因未知。
●肾脏疾病-糖尿病损伤肾脏并形成疤痕,其能够导致功能逐渐丧失。未治愈的高血压能够导致肾脏疾病。
●心血管疾病-心脏病发作之后,疤痕组织会损伤心脏泵血的能力。高血压、动脉粥样硬化和再狭窄(restenosis)也会导致心血管疾病。
●眼睛-黄斑变性、视网膜和玻璃体视网膜病变会引起失明。
●皮肤-包括瘢痕瘤和肥厚性疤痕。系统性硬化症和硬皮病、烧伤和遗传因素也可以引起皮肤疾病。
●胰腺-了解很少,但可能由自体免疫/遗传引起。
●肠-克罗恩氏病(Crohn′s disease)/炎性肠病。致病生物引起。
●脑-阿尔茨海默氏病、AIDS。
●骨髓-癌症和衰老。
●多器官纤维化-(a)由于外科手术并发症;在内脏之间可形成疤痕组织,引起挛缩、疼痛和不孕不育(有些情况下);(b)化疗药物诱发的纤维化;(c)由癌症治疗/意外暴露引起的放射诱发纤维化;(d)机械损伤。
在本发明中,说明了有关眼睛和肺的纤维化的示例,可以理解到,纤维化由一系列事件诱发以相似的方式在多种组织中出现。本发明要求保护苯并[c]苯并吡喃-6-酮化合物(benzo[c]chromen-6-one compounds)及其药物组合物对涉及纤维化的疾病具有治疗作用。本发明还要求保护苯并[c]苯并吡喃-6-酮化合物及其药物组合物对Akt/mTOR信号转导路径的抑制对涉及纤维化的疾病具有治疗作用。
本发明涉及用于预防和/或治疗与纤维化相关的疾病的组合物和方法。本发明还涉及一系列化学组合物,其对纤维化疾病具有治疗作用。在具体方面,本发明还涉及苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物,其对纤维化疾病具有治疗作用。
术语“衍生物”是本技术领域的技术人员所公知的。例如,衍生物可以理解为由结构类似的另一化合物经一步或多步反应得到的化合物,例如如表2所示的苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物(参见下文)。
本发明涉及一种治疗组方,其包含一种或多种对治疗纤维化紊乱有用的组合物。纤维化紊乱是由细胞外基质的异常形成而引起。纤维化紊乱的例子包括肺纤维化、系统性硬化症、硬皮病、增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy)、肝硬化和系膜增生性细胞紊乱(mesangial proliferative cell disorders)。纤维化紊乱的其他例子包括胰腺和肺的囊肿性纤维化、心内膜纤维化(endomyocardial fibrosis)、先天性肺纤维化、纵膈纤维化(mediastinal fibrosis)、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、肾源性系统纤维化症、进行性大块纤维化(煤矿工人尘肺的并发症)和注射纤维化(其可作为(尤其是儿童)肌肉注射的并发症发生)。进一步的与纤维化相关的情况包括弥漫性肺实质性疾病(diffuse parenchymal lung disease)、输精管切除术后疼痛综合症、肺结核(其会引起肺纤维化)、镰状细胞贫血症(其会引起脾纤维化)和风湿性关节炎。
肝硬化的特征是,细胞外基质组分增加,导致形成肝疤痕。肝硬化会引起例如肝脏硬化的疾病。病毒感染例如肝炎也会引起细胞外基质增加而形成肝疤痕。
系膜紊乱是由系膜细胞的异常增生形成的。系膜肥大增生细胞紊乱包括各种人类肾病,例如血管球性肾炎(glomerulonephritis)、糖尿病肾病(diabetic nephropathy)、恶性肾硬化(malignant nephrosclerosis)、血栓性微血管病综合症(thrombotic microangiopathy syndromes)、移植排斥反应(transplant rejection)和肾小球病变(glomerulopathies)。
根据本发明,提供包含式I的药物组合物:
其中,
R1=H或者烷基;
R2=H、OH、O-烷基、氨基、O-杂环(O-heterocyc)、O-芳基、O-取代烷基,其中取代基例如是卤(halo)、芳基(aryl)或杂芳基(heteroaryl)、O-Ac、O-PO3、O-SO3,或OSO2NH2;
R3=H、OH、O-烷基、O-CH2芳基、O-CH2杂芳基、O-烷芳基、O-酰基或硝基;
R4=H、烷基、CH2芳基、取代烷基、OH、O-烷基、O-芳基、O-CH2芳基、O-CH2杂芳基、O-酰基、OPO3、OSO3或OSO2NH2;
R5=H、氧、芳基、羟基、烷基或O-烷基;
R6=H;
R7=H、酰基、取代烷基,其中取代基例如是羟基或磺酰基(sulfamoyl)、烷基、O-烷基或O-取代烷基,其中取代基是O-PO3或OS03;
R8=H;及
X=O、N或S。
根据本发明,提供包含式II的药物组合物:
其中
R1=H或烷基;
R2=H、O-烷基、OH、氨基、O-杂环(O-heterocyc)、O-芳基、O-取代烷基,其中取代基例如是卤(halo)、芳基或杂芳基、O-Ac、O-PO3、O-SO3或OSO2NH2;
R3=H、O-烷基、O-取代烷基,其中取代基是芳基或杂芳基、OH、O-酰基或硝基;
R4=H、烷基、CH2芳基、取代烷基、OH、O-烷基、O-芳基、OCH2芳基、OCH2杂芳基、O-酰基、OPO3、OSO3或OSO2NH2;
R5=H、芳基、杂芳基或取代烷基;及
R6=H、烷基或芳基。
根据本发明,提供有包含式III的药物组合物:
其中,
R1=烷基或H;
R2=烷基或H;
R3=乙酰基;及
R4=H或烷基。
根据本发明,提供包含IV的药物组合物:
其中,
R1=H或F;
R2=H或硝基;
R3=H;
R4=H;及
R5=烷基、取代烷基或芳基。
根据本发明,提供包含有效治疗量的一种或多种苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物的药物组合物,其衍生物的结构如下表2所示:
表2:苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物的结构式
表2中的每个苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物通过“SG”后面跟有数字的名称来区别。在本文它们被交替称为“Palomid”后面跟有同样数字的名称,即,本申请中术语“SG”和“Palmid”可交替使用。
表2中的化合物具有抗纤维化活性。本技术领域的技术人员将理解到,本发明包括具有抗纤维化活性的其它苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物。
本发明还涉及包含本文所述的一种或多种组合物或其前药组成的植入体或其它装置,其中,组合物或前药加入生物可降解的或生物不可降解的剂型中用以缓释。生物不可降解的剂型通过物理或者机械过程来控释药物,而这种剂型本身却不会降解。生物可降解的剂型设计成能通过体内的自然过程被逐渐地水解或溶解,从而使掺入的药物或者前药逐渐地释放。生物可降解的和生物不可降解的剂型以及将药物制成控释剂型的过程对于本领域的技术人员来说都是公知的。这些植入体或者装置可以被植入在需要输送处附近,例如,在异常细胞外基质的位点上。
本发明还涉及共轭前药及其用途。更具体地说,本发明涉及苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物的共轭物以及这种共轭物在预防或治疗与非特异性的细胞外基质形成有关的情形中的用途。
本发明还提供了与生物活性改良剂共轭的苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物的共轭前药,例如其肽、抗体或片段或体内可水解的酯比如甲酯、磷酸酯或硫酸酯基团,以及酰胺或氨基甲酸酯。修饰可以包括用磷酸基修改羟基。由于使衍生物发生了明显的变化而丧失了生物活性,该衍生物将不具有活性。然而,这种修饰却得到了更好的溶解性,水溶性更好,其有利于通过血液输送或便于口服从而使其到达发挥活性的地方。一旦其进入到需要发挥活性的微环境中,修饰基团会通过自然过程裂解掉,即,需要发挥活性处的内源酶。可选择地,也可以仅使衍生物保持在一个较好的系统浓度的状态,其然后再在体循环中降解,并因此增强其活性。将苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物结合到随疾病而定的有活性的前药中,能显著改善治疗一种或多种上文提到的疾病情形的效力和选择性。
除了本发明的化合物外,本发明的药物组合物还可以包含一种或多种对治疗上文提到的一种或多种病情有效的药剂或与这些药剂联合给药(同时或先后)。
此外,可以将苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物或其前药加入生物可降解的或不可降解的剂型中用以缓释。例如,将该制剂植入肿瘤位点需要输送的位置或异常血管附近。可选择地,药物制剂可以被包在具有提供特异性的化学组成部分的载体内。例如,该组成部分可以是抗体或者某些其它指引和促进活性药剂输送到所需位置的分子。
本发明还涉及苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物或其前药在制备用于预防或治疗与任何非典型形成纤维化组织(即形成异常细胞外基质)相关的疾病的药物中的应用。
本发明还涉及包含根据本发明的苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物或其前药的药物组合物连同药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的给药方式。
该药物组合物还可以用于预防或治疗与纤维化疾病或紊乱有关的状况。本发明还涉及预防或治疗任何以非典型形成细胞外基质为特征的纤维化疾病或紊乱相关的状况的方法,所述方法包括对需要这样的预防或治疗的对象给予有效量的根据本发明所述的苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物或其前药。应理解到的是,所述状况的预防或治疗包括所述状况的改善。
“有效量”是指能部分或完全减轻与特定疾病或综合病症相关的症状的有效治疗量。比较熟练的专业人员根据治疗情况、给药途径以及其它对于本领域的技术人员来说是公知的相关因素可以很容易地确定该量。这样的技术人员很容易就能确定出合适的剂量、给药方式和给药频率。
苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物或其前药的药学上可接受的盐可以以任何常规的方式来制备。体内可水解的酯,比如甲酯、磷酸酯或硫酸酯基以及酰胺或氨基甲酸酯可以以任何常规的方式来制备。
可以使用公知的技术将苯并[c]苯并吡喃-6-酮衍生物或其前药加入生理上可接受的制剂中,而且这些制剂可以通过标准途径给药。组合物可以通过但不仅限于局部、口服、直肠或胃肠道外如静脉内、皮下或肌肉途径的方式给药,此外,组合物还可以被制成缓释制剂,将该制剂植入需要输送处附近,例如,在皮肤疾病或老化皮肤处,或在异常血管的附近。组合物的剂量会依治疗的情况、使用的具体衍生物以及其他临床因素比如体重和主体的情况以及化合物的给药途径而定——所有的这些都是本领域技术人员所了解的。例如,本领域的技术人员能够参照标准教程,比如Remington(雷明顿)的《Pharmaceuticals Sciences》(《药剂学》)第17版(这里以参考引用的方式将其全部教导合并于此),来确定如何制备制剂以及如何给药。
上述制剂包括但不仅限于那些适于口服、直肠、鼻腔、吸入、局部(包括但不仅限于皮肤、经皮、口腔和舌下)、阴道或胃肠道外(包括但不仅限于皮下、肌内、静脉内、皮内、眼内(包括但不限于玻璃体内、结膜下、Tenon囊下、经巩膜)、气管内和硬膜外)以及吸入给药的制剂。上述制剂可以用单位剂量形式方便地呈现,并且可以通过常规的制药技术来制备。这样的技术包括将活性成分和药物载体或赋形剂混合在一起的步骤。通过将液体载体或极细的固体载体或者这两者与活性成分均匀、密切地混合在一起来制备上述制剂,如果需要,然后再将产物成型。
本发明适合口服给药的制剂可以呈现为离散的单元,比如各含有预定量活性成分的胶囊剂、扁囊剂或片剂;粉末或颗粒;水性液或非水液中的溶液或混悬液;或水包油型液体乳剂或油包水型乳剂等。
片剂可以优选与一种或多种助剂一起被压缩或模塑制成。压制片可以在适合的机器中将易流动形态的活性成份比如粉末或颗粒,优选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合在一起,通过压缩制成。模制片可以在适合的机器中将用惰性液体稀释剂润湿的粉碎化合物的混合物通过模塑制成。片剂还可以选择包衣或刻痕,并且可以制成使其中的活性成份缓释或控释的制剂。
适合于经口给药的制剂包括含有在调味基质、通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶中的成分的锭剂(lozenge);含有在惰性基质比如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶中的活性成份的软锭剂(pastille);以及含有以合适的液体载体给药的成分的含漱液。
适合于皮肤局部给药的制剂可以是包含在制药上的、药妆品的或化妆品的可接受载体中给药的成分的软膏剂、乳膏剂、凝胶剂和糊剂。一种可行的给药系统是含给药成分的经皮贴剂。
直肠给药的制剂可以是具有合适基质的栓剂,该基质包含如可可脂或水杨酸盐。
载体为固体的适合于鼻腔给药的制剂包括具有粒度在例如20至500微米范围内的粗粉,该制剂以鼻腔吸入的方式给药,例如通过从贴近鼻子的装有粉末的容器经鼻腔通道快速吸入。合适的制剂包括其载体是用于给药的液体,例如包括活性成份的水或油溶液的鼻喷雾剂或鼻滴剂。
适合于阴道给药的制剂可以是除了活性成份之外还包含比如本技术领域中公知的适当的载体成份的阴道栓剂、棉塞(tampons)、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂。
适合于吸入的制剂可以是除了活性成份之外还包含比如本领域技术领域中公知的载体成份的薄雾剂(mists)、粉尘剂(dusts)、粉末剂(powders)或喷雾剂。
适合于胃肠道外给药的制剂包括水和非水无菌注射液,该注射液可以包含抗氧化剂、缓冲液、抗菌剂和使该制剂与目标受体的血液等张的溶质;以及水和非水无菌混悬液,其可以包括助悬剂和增稠剂。该制剂可以盛装在例如密封的安瓿和小瓶的单剂量或多剂量容器中,并且可以是冻干储存、仅需在使用前加入无菌液体如注射用水的冻干状态。现配的注射液和混悬液可以由无菌的上述各种粉末、颗粒和药片制备。
可接受的单位剂量的制剂是那些包含给药成分的如上所述的每日剂量或单位、每日分剂量或其适当部分的制剂。
除了上面提到的成分外,本发明的制剂还可以包括考虑到所针对的制剂类型而所需的本技术领域的其它常规试剂,例如,适合于口服给药的制剂可以包括调味剂。
本发明包括约100%至约90%纯异构体的组合物。另一方面,本发明涉及约90%至约80%纯异构体的组合物。另一方面,本发明涉及约80%至约70%纯异构体的组合物。另一方面,本发明涉及约70%至约60%纯异构体的组合物。更进一步的方面,本发明涉及约60%至约50%纯异构体的组合物。然而,标为α或β的立体化学异构体可以是两者任意比例的混合物,这可以由本领域的技术人员在化学上实现。此外,本发明所包括的是经典的和非经典的生物电子等排原子和取代基置换,并且是本领域技术人员所公知的。这种生物电子等排的置换包括例如用=O取代=S或=NH。
根据本发明所用的已知化合物以及根据本发明的新化合物的前体可以购自商业来源,比如西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。根据本发明的其它化合物可以根据本领域的技术人员所熟知的已知方法合成。
组织制备
如Eibl et al等人所述(Eibl KH,et al,The effect of alkylphosphocholines on intraretinal proliferation initiated by experimental retinal detachment.Invest Ophthalmol Vis Sci.2007;48:1305-11(烷基胆碱磷酸对由实验性视网膜脱离引起的视网膜内增殖的作用))在成年新西兰红色兔中引起视网膜脱离。简单地说,肌肉注射药物甲苯噻嗪(3mg/kg)和氯胺酮(15mg/kg)的组合物用于麻醉和镇痛。补充镇痛通过在眼睛局部滴加丙美卡因提供。0.25%浓度的透明质酸钠(Healon;Pharmacia,Piscataway,NJ)平衡盐溶液(BSS;Alcon,Ft.Worth,TX)通过神经视网膜和PRE之间的玻璃移液管灌注。Healon是必须的,其用于防止视网膜的自动脱离,0.25%是维持脱离更长周期的最稀浓度。移液管的外径接近100μm,其通过切口插入眼睛,该切口在睫状体扁平部下方几毫米处做出,以防止移液管接触到晶状体。右眼中大约有一半的下视网膜脱离,留下上部连接区域作为内对照。左眼作为未注射的对照。在完成脱离后,立即在玻璃体内注射溶于50μl平衡盐溶液(BSS)的600μg Palomid 529。脱离后第3天,对实验(右)眼的玻璃体注射溶于50μlBSS的10μg BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷,Sigma,St Louis,MI)。在3天和7天脱离实验的第3天均进行BrdU玻璃体内注射,因为之前已有证明在此时间内增生反应最强。在脱离的眼睛内的连接的视网膜区域作为用BrdU标记的对照视网膜。在第3天或第7天注射BrdU 4小时后应用戊巴比妥钠(120mg/ml,rV)对动物实施安乐死。在3天和7天实验中皆应用三只动物。摘除眼球后,眼睛用4%多聚甲醛固定至少24小时(在0.IM二甲胂酸钠缓冲液中,pH 7.4;Electron Microscopy Sciences,Fort Washington,PA)。为了确定药物的潜在毒性作用,六只额外的动物的正常眼睛中接受溶剂注射(vehicle,BSS,n=3)或药物注射(drug,n=3)。这些动物在第15天接受安乐死,眼睛用4%多聚甲醛固定,且整个眼睛浸入石蜡中,以进行光显微检测。所有的试验程序按照眼科和视力研究中的动物使用ARVO声明(ARVO statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)和圣巴巴拉的加利福尼亚大学的动物研究中心的指南(the guidelines of the Animal Resource Center of the University of California,Santa Barbara)进行。
免疫细胞化学技术/光显微技术
免疫细胞化学技术如Eibl等人所述实施,本申请中对其稍微进行了改进。从每只眼睛内的3个脱离的区域中切出大约3mm2的视网膜组织片。组织用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,包埋入低熔点琼脂糖(5%,Sigma,St.Louis,MI)中并用组织切片机切成100μm的切片(Technical Products International,Polysciences,Warrington,PA)。切片在正常驴血清(1∶20)中孵育,在PBS,0.5%牛血清蛋白,0.1%triton X-100和0.1%叠氮化物(=PBTA)中4℃摇床过夜。次日,切片用2N HCL预处理一小时,作为BrdU的抗原修复步骤。在PBTA中冲洗后,加入第一抗体和植物凝集素,在PBTA中4℃摇床过夜,应用抗-BrdU(1∶200,Accurate Chemical and Scientific Corp.,Westbury,NY)检测分化细胞,应用波形蛋白抗体(1∶500;Dako,Carpinteria,CA)确认细胞,及应用植物凝集素B4、Griffonia Simplicifolia(1∶50;Vector Labs,Burlingame,CA)标记小神经胶质细胞和巨噬细胞。在PBTA中冲洗第一抗体后,将第二抗体(链霉亲合素CY5、驴-抗-鼠CY3和驴-抗-鼠CY2;Jackson hnmunoResearch,West Grove,PA)一起加入,每一种在PBTA中的比例为1∶200,4℃摇床过夜。次日用PBTA冲洗切片,用溶于甘油的5%N-丙基没食子酸盐固定到载玻片上,加入核染料Hoechst(烟酸己可碱染剂)(1∶5000;Invitrogen,Carlsbad,CA)染色,并在OLYMPUS Fluoview 500激光扫描共聚焦显微镜下观察。整只眼睛的石蜡切片切成4μm,并用苏木素伊红(H-E)复染色,用Olympus BX60显微镜上的数码照相机拍照。因为对来自每个组中的三只不同的动物的整个眼睛进行了包埋和切片,能够在单个切片中观察视网膜的整个长度,选择对照动物和实验动物中相似的视网膜区域进行拍照。
定量
从每一个实验组(用溶剂和药物处理过)的三只动物中获得至少60个1024x1024像素分辨率的单个平面共聚焦图像。在所有动物中检查相似的视网膜位置。为了对药物处理对增生的作用定量,用3天和7天时间点的共聚焦图像确定每毫米的视网膜中抗-BrdU标记的细胞核的数目。为了对药物处理对视网膜下神经胶质疤痕形成的作用定量,疤痕定义为位于巩膜到OLM的持续细胞生长的区域,其也用波形蛋白抗体标记。计算在7天动物中的每毫米的视网膜的疤痕的数目并测定其长度,因为在3天动物中未观察到擦痕。为了确定ONL的宽度,用荧光核染料(Hoescht)对切片进行染色,并用基于统计学的聚类方法自动分割ONL(Byun J,Ph.D.thesis,″Quantitative analysis and modeling of confocal retinal images″.Univ.Calif.Santa Barbara,June 2007(″共聚焦视网膜图像的定量分析和建模″))。然后将对照视网膜中的ONL宽度与溶剂注射和药物注射的眼睛中的视网膜的ONL宽度进行对比。只能检测7天时间点的,因为与3天时间点的相比,有更多的光感受器细胞死亡。用相同的切片对上述的所有反应定量。
连接视网膜的分析
用光显微镜对石蜡包埋的正常视网膜进行检测及用共聚焦显微镜对脱离的眼睛内的用各种抗体标记的连接视网膜的区域进行检查,以确定药物的可能的副作用(图1)。在石蜡切片中,在溶剂和药物处理的正常视网膜之间没有观察到视网膜组织的不同(图1A、B)。此外,波形蛋白抗体和植物凝集素B4标记在3天和7天时间点溶剂和药物处理的连接视网膜之间表现相似;所有组中,在细胞内从神经节细胞层(GCL)延伸到外核层(ONL)5的波形蛋白抗体标记(绿色)和小神经胶质细胞(蓝色)仅存在于视网膜的内部(图1C-F)。标记样式与在未处理的正常眼睛中的标签样式相似,不同之处仅在于在溶剂和药物注射的眼睛中的玻璃体中巨噬细胞的存在。最后,在溶剂或药物处理的视网膜中均未观察到抗-BrdU标记。这些数据表明,药物对视网膜、具有活性的细胞、小神经胶质细胞的形态都未引起大的副作用。
脱离视网膜的分析
图1A-1F是对照连接视网膜的照片。A、B是H-E染色石蜡切片的光学显微照片,其显示了在注射溶剂(A)和注射药物(B)的正常眼睛中的正常视网膜形态。C和D是来自脱离3天或7天且接受眼内溶剂注射的动物眼睛内的连接的视网膜区域的激光扫描共聚焦图像;E和F是来自脱离3天或7天且接受眼内药物注射的动物眼睛内的连接的视网膜区域的激光扫描共聚焦图像。切片用波形蛋白抗体(细胞,绿色)、抗-BrdU(分化细胞,红色)和植物凝集素B4(小神经胶质细胞和巨噬细胞,蓝色)标记。观察到波形蛋白抗体标记从GCL延伸到ONL,但未观察到抗-BrdU标记,植物凝集素B4标记的内视网膜中的小神经胶质细胞突和在玻璃体(蓝色标记的OS是非特异性的)中的巨噬细胞。OS:外切片;ONL:外核层;INL:内核层;GCL:神经节细胞层。横线表示20μm。
图2A-2D是实验性脱离视网膜的激光扫描共聚焦图像照片。视网膜切片的激光扫描共聚焦图像用波形蛋白抗体(细胞,绿色)、抗-BrdU(分化细胞,红色)和植物凝集素B4(小神经胶质细胞和巨噬细胞,蓝色)标记。(A)在注射溶剂脱离3天,波形蛋白抗体标记穿过ONL延伸到外界层,抗-BrdU标记主要存在于内核层(ENL)的细胞核中,植物凝集素B4标记存在于整个视网膜的小神经胶质细胞中和视网膜下腔的巨噬细胞中。(B)在注射溶剂脱离7天,细胞的波形蛋白抗体标记延伸到视网膜下腔(括号),抗-BrdU标记存在于整个视网膜的分散的核及视网膜下腔中,且植物凝集素B4标记存在于视网膜的众多小神经胶质细胞和视网膜下腔的巨噬细胞中。在Palomid 529处理3天和7天的视网膜中(C、D),抗-vimentin标记贯穿ONL延伸,仅偶尔延伸到视网膜下腔(括号,D),抗-BrdU标记很少,植物凝集素B4标记存在于整个视网膜和视网膜下腔。间或可以看到用抗-BrdU和植物凝集素标记的小神经胶质细胞(箭头,D)。观察到,药物处理的脱离视网膜(C,D)与溶剂处理的脱离视网膜相比,还保留了更多的正常形态。ONL:外核层;INL:内核层;GCL:神经节细胞层。横线表示50μm。
在注射溶剂3天的眼睛的脱离视网膜区域中,抗-vimentin标记(绿色)延伸到外界层(OLM),使得细胞增厚,破坏了视网膜内的外观(图2A;与脱离3天+溶剂的视网膜对比,图1C)。在此期间在视网膜下腔内未观察到细胞生长。植物凝集素B4标记的小神经胶质细胞(蓝色)变圆,并分散于整个视网膜,而仅在视网膜下腔内观察到巨噬细胞(蓝色)。大部分的抗-BrdU标记的Miiller细胞核(红色)存在于内核层(INL;图2A)。在第7天,波形蛋白抗体标记的Miiller细胞突频繁延伸到视网膜下腔(括号;图2B)。抗-BrdU标记的核(“出生”于第3天)基本上存在于外视网膜(即,INL的末梢)和视网膜下神经胶质疤痕中。
药物处理的眼睛中脱离后的第3天和第7天,抗-BrdU标记的核的出现大大减少(图2C、D)。与非脱离对照相比,波形蛋白抗体标记稍微增加,细胞增厚(与图1E、D相比),但其在任一时间点都很少延伸到视网膜下腔;若其延伸到视网膜下腔,其大小会大大缩小(括号,图2D)。此外,细胞的外观未被破坏,在溶剂注射对照脱离中典型地观察到横向分支,其或许有利于形成整个视网膜的更加有序的外观。当然,除了与脱离有关的病理学特征外,视网膜并未出现其它病理学特征。最后,在药物处理的眼睛内具有较少的小神经胶质细胞和巨噬细胞(图2C、D)。
定量分析
在脱离3天的时间点,抗-BrdU标记的细胞核的平均数目从溶剂处理的对照眼睛中的10.79/mm/细胞核明显降低到药物处理后的1.19(图3)。在7天时间点,其数目从对照组的9.83/毫米视网膜降到药物处理后的1.49(图3)。视网膜下疤痕的平均数目从对照组视网膜的2.03/毫米降低到药物处理的视网膜的0.39(图4)。仅对7天时间点定量,因为在3天时间段中在对照组和药物处理动物中均未出现疤痕。7天的对照眼睛中的视网膜下疤痕的平均长度是131.28μm,在药物处理眼睛中降低到1.01μm(图5)。
具体地,图4是表示视网膜脱离后视网膜下神经胶质疤痕数目的柱形图。与溶剂处理视网膜相比,在脱离后药物处理7天的视网膜中,每毫米视网膜的波形蛋白抗体标记的视网膜神经胶质疤痕的平均数目显著降低。误差线用标准误差SD表示。
具体地,图5是表示视网膜脱离后视网膜下神经胶质疤痕的长度的柱形图。与溶剂处理视网膜相比,在脱离后药物处理7天的视网膜中,波形蛋白抗体标记的视网膜下疤痕的平均长度显著降低。误差线用标准误差SD表示。
在对照视网膜或处理视网膜中,免疫相关细胞(小神经胶质细胞和巨噬细胞)都很少结合BrdU,因此,为了定量这种反应,植物凝集素B4标记的细胞的总数目以每毫米视网膜计算。在7天时间点,细胞的总数目从对照眼睛中的平均43.9/毫米视网膜降低到药物处理视网膜的24.5/毫米视网膜(图6)。
具体地,图6是表示视网膜脱离后免疫相关细胞的数目的柱形图。与溶剂处理的视网膜相比,在脱离后药物处理7天的视网膜中,每毫米视网膜的植物凝集素B4标记的巨噬细胞和小神经胶质细胞的平均数目显著降低。误差线用标准误差SD表示。
因为药物处理眼睛中外视网膜呈现得更加有序,如细胞的波形蛋白抗体标记(将图2A、B与图2C、D进行比较)所示,因此,试图通过测定ONL的宽度确定是否会显示更多的光感受器。脱离七天后,ONL的平均厚度在统计学上显著降低,其从正常视网膜中的34.45μm降低到溶剂处理脱离视网膜中的19.40μm(<1.27E-11;图7)。与正常的连接视网膜相比,在药物处理的脱离视网膜中,ONL的厚度在统计学上也显著降低到27.21μm(p<0.001)。但是,在用药物处理的脱离视网膜中ONL的厚度显著大于用溶剂处理的脱离视网膜中ONL的厚度(27.21μm vs.19.40μm;p<8.81 E-06),其表明Palomid 529在脱离后对光感受器具有一定援救作用。
具体地,图7是表示脱离后外核层(ONL)的平均厚度的柱形图。用Palomid 529处理的脱离7天的视网膜中的ONL的厚度大于用溶剂处理的脱离7天的视网膜的厚度,但是与对照视网膜相比,两个脱离组中ONL的厚度都显著降低。误差线用标准误差SD表示。
会导致视网膜脱离的两个潜在的致盲条件是增生性玻璃体视网膜病变(PVR)和视网膜下纤维化、玻璃体上的细胞膜的形成或视网膜的光感受器表面的形成。当前,唯一的治疗途径是外科手术移除膜。但是,这包含外科手术的干涉,且并非长久之计,因为第二膜经常复发。可以在复位术期间给予理想的药理学辅助,以抑制膜的形成或可选择地在膜移除期间给予理想的药理学辅助,以抑制组织的持续生长。迄今为止,还没有证实药理学方法在抑制这一过程中的临床效果。在本发明中,仅在动物模型中注射Palomid 529就能够降低脱离诱发的增生、细胞随后的肥大和在视网膜下腔的生长。此外,不存在与眼内释放药物相关的明显毒性,实际上,在Palomid 529处理的脱离视网膜中的ONL的厚度表明其对光感受器具有一定的神经保护作用。因此,该药物能够用于治疗多种相关的人类视网膜疾病,其涉及增生和/或光感受器细胞死亡。
典型地,PVR被认为是包含不希望的细胞增生、细胞扩散和收缩的状况。实际上,从患有PVR的患者分离出的膜中已经观察到分化细胞。但是,动物模型的数据中显示,除了增生,细胞的生长和肥大或许还通过提供细胞架而在反应中起作用,包含多种细胞类型的更加复杂的膜能够在细胞架上生长。细胞的增生和肥大开始于脱离后的前几天。一周后,增生降低到低水平,但是这些细胞的细胞突在视网膜下腔继续延伸,只要视网膜保持脱离就很明显。视网膜前膜在玻璃体中生长也是这样。细胞在视网膜复位后开始在玻璃体表面生长,但脱离后不生长。复位明显降低了增生反应,但是膜沿着玻璃体视网膜表面持续生长,因为在复位后,数周到数月内基本能观察到大的膜。PVR和视网膜下纤维化是增生和细胞生长的复杂组合,这一事实可以解释为何仅针对增生的药物(例如5-氟尿嘧啶)在减少人类患者的视网膜前膜形成方面没有效果。Palomid通过Akt/mTOR路径起作用,其已经显示能够调节增生和细胞扩散。这可以提供Palomid在脱离的兔模型中显著降低增生和视网膜下神经胶质过多症的机制,虽然其作用的准确机制尚未知晓。可推测的是,Palomid直接对细胞起作用,因为细胞是经历分化数量最多的细胞类型。Palomid 529可以直接或间接地增加光感受器存活。已经显示,PI3K/Akt信号路径的激活能够通过抑制光诱发的光感受器细胞凋亡对视网膜起到神经保护的作用,这表明药物实际上是直接作用于光感受器。
Palomid 529在玻璃体内具有至少3个月的预期半衰期,从而能够观察在脱离后7天对增生和疤痕形成的作用。药物快速清除(例如5-氟尿嘧啶)在防治PVR时会使其失效。在加入Palomid 529后,视网膜下疤痕的平均数目显著降低了4倍,其长度降低了至少20倍。这表明,药物不仅降低了Miiller细胞在视网膜下腔的生长,还降低了细胞突起实际到达腔中的伸展度。这与观察到的在处理的眼睛中视网膜内的Miiller细胞呈现更少的分支和弯曲相关联(参照图2C、D),表明Palomid在这种情况下对细胞扩散的作用转变为对细胞肥大的作用。临床上,Palomid529能够抑制疤痕的形成,还降低已经存在的疤痕的整体生长。最后,Palomid529还降低小神经胶质细胞/巨噬细胞反应,因为这些细胞在激活时非常容易迁移,所以这可能是药物的抗扩散作用的结果。
总之,此处的数据表明,Palomid 529是一种有效的降低增生和神经胶质细胞生长及视网膜脱离诱发的光感受器细胞死亡的制剂,因此,提供了一种用于改善修复孔性视网膜脱离的整体效果的新途径。
实施例2:实验性视网膜脱离后应用Palomid 529作为Akt/mTOR路径的抑制剂降低细胞增生和神经胶质疤痕形成
方法:在有色兔的右眼中实施实验性视网膜脱离。在视网膜脱离后当天玻璃体内注射溶解于50微升PBS的600毫克Palomid 529,或仅注射PBS。每只兔子在第3天在玻璃体内接受10微克的BrdU。动物在第3天或第7天处死,在此时将组织固定在多聚甲醛中,包埋在琼脂糖中,并切成100微米的切片。这些切片用抗-BrdU标记,以检测分化细胞,用抗-vimentin标记,以鉴定细胞。标记用Olympus Fluoview共聚焦显微镜成像,分析形成的数码照片来确定增生细胞的数目及视网膜下神经胶质疤痕的数目和长度。
结果:在对照脱离中,细胞组成大部分用BrdU标记的细胞,且是形成生长入神经胶质下腔内的神经胶质疤痕的细胞。数据显示,在3天(图8A-8F)和7天(图10A-10C)时间点BrdU标记的细胞/mm的数量在统计学上都显著降低。在3天时间点,在对照动物和药物处理动物中均未观察到神经胶质疤痕,但是,在第7天,视网膜下疤痕的数目和大小都显著降低。
结论:数据表明,在视网膜脱离的兔子模型中,Palomid 529是一种有效的细胞增生和神经胶质疤痕生长抑制剂。因此,抑制Adt/mTOR信号转导路径是一种降低脱离诱发的增生的策略,且提供一种用于相关的人类疾病如增生性玻璃体视网膜病变的新颖治疗方案。
实施例3:Palomid 529对人肺成纤维细胞中的中介体的分化和信号转导的作用
已知的是转化生长因子-β1(TGFβ1)和α-凝血酶(α-Thrombin)与纤维化疾病的发病机理有关。在肺纤维化的体外模型中,TGF-β1刺激人肺纤维原细胞的肌成纤维细胞的分化,其特征是表达收缩性平滑肌(SM)特异性蛋白如SM-α-肌动蛋白。TGF-β1还刺激SM-α-肌动蛋白在人肺纤维原细胞中的表达,其同时诱导血清反应因子(SRF)的表达和活性。增加的具有SM-肌动蛋白的收缩性基因表达作为标记(marker),增加的SRF5、增加的结缔组织生长因子(CTGF)和增加的基质基因(例如纤粘连蛋白)是在肌成纤维细胞分化中观察到的作用的例子。用TGF-β1刺激诱导肌成纤维细胞分化,从而增加分化的标记。
Palomid 529抑制人肺成纤维细胞中TGF-β1刺激的CTGF的增加(30μM Palomid 529中的浓度为18%)、SRF的增加(30μM Palomid 529中的浓度为29%)和SM-α-肌动蛋白的增加(30μM Palomid 529中的浓度为65%),请参照图11。
图11示出Palomid 529对人肺成纤维细胞中的中介体的分化的作用。人肺成纤维细胞在TGF-β1刺激之前用Palomid 529预处理30分钟。图中示出抗CTGF、SRG、SM-α-肌动蛋白和β-肌动蛋白的Western免疫印迹。用扫描软件Scion Image(Scion Corporation,Frederick,MD)将Western免疫印迹的泳带数字化,以进行文中所述的抑制百分比的数值计算。图中示出的β-肌动蛋白在任一样品中没有显著变化,因为彼此均在11%范围内。
如图11所示,肌成纤维细胞至少部分通过Akt/mTOR路径中的信号转导蛋白的激活而诱导激活。尽管α-凝血酶刺激人肺成纤维细胞并没有使磷酸化的AKT水平增加超过基本水平,但Palomid 529能够在无论是否存在α-凝血酶(基本水平的AKT磷酸化)时使AKT的磷酸化降低15%。参照图12,图中示出的TGF-β1刺激的AKT磷酸化超过基本水平的19%。Palomid 529抑制了27%的TGF-β1刺激的AKT磷酸化,包括降低13%的基本水平的磷酸化。
图12示出Palomid 529对人肺成纤维细胞的信号转导的作用。人肺成纤维细胞用TGF-β1或α-凝血酶在存在30μM Palomid 529的情况下刺激处理1小时,以影响信号转导蛋白的激活。p-AKT(S473)和AKT的水平通过Western免疫印迹检测。用扫描软件Scion Image(Scion Corporation,Frederick,MD)将Western免疫印迹的泳带数字化,以进行文中所述的抑制百分比的数值计算。示出的β-肌动蛋白在任一样品中没有显著变化,因为彼此均在10%范围内。
Claims (10)
1.一种用于预防或治疗以多余细胞外基质形成为特征的疾病的方法,其特征在于,包含对哺乳动物给予治疗量的一种或多种选自由式I、式Ⅱ、式III和式IV组成的群组的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述组合物是式Ⅰ的组合物:
其中,R1是H或者烷基;
R2是H、OH、O-烷基、氨基、O-杂环、O-芳基、O-Ac、O-PO3、O-SO3、OSO2NH2或O-取代烷基,其中所述取代基是卤、芳基或杂芳基;
R3是H、OH、O-烷基、O-CH2芳基、O-CH2杂芳基、O-烷芳基、O-酰基或硝基;
R4是H、烷基、CH2芳基、取代烷基、OH、O-烷基、O-芳基、O-CH2芳基、O-CH2杂芳基、O-酰基、OPO3、OSO3或OSO2NH2;
R5是H、氧、芳基、羟基、烷基或O-烷基;
R6是H;
R7是H、酰基、烷基、O-烷基、取代烷基,其中所述取代基是羟基或磺酰基或O-取代烷基,其中所述取代基是O-PO3或OS03;
R8是H;及
X是O、N或S。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述组合物还包含可接受的运送载体。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述疾病是纤维化紊乱。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述纤维化紊乱选自于由下述组成的群组:肺纤维化、系统性硬化症、硬皮病、增生性玻璃体视网膜病变、肝硬化、胰腺和肺的囊肿性纤维化、心内膜纤维化、先天性肺纤维化、纵膈纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、肾源性系统纤维化症、进行性大块纤维化、注射纤维化、血管球性肾炎、糖尿病肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病综合症、移植排斥反应、肾小球病变、弥漫性肺实质性疾病、输精管切除术后疼痛综合症、肺结核、镰状细胞贫血引起的脾纤维化和风湿性关节炎。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述系膜紊乱选自下述组成的组:血管球性肾炎、糖尿病肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病综合症、移植排斥反应和肾小球病变。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述给予方式包括局部、口服、鼻腔、直肠或非肠道给予所述一种或多种组合物。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述一种或多种组合物与植入剂联合。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述一种或多种组合物与装置联合。
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