CN106692289A - 半枝莲醇提物的医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药学领域,特别是涉及一种半枝莲醇提物的医药用途,所述半枝莲醇提物含0.1~20wt%野黄芩苷。本发明的半枝莲醇提物可用于治疗糖尿病性视网膜病。
Description
技术领域
本发明涉及医药保健品领域,特别是涉及一种中药植物提取物的医药用途。
背景技术
糖尿病性视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病性微血管病变中最重要的表现之一,是一种具有特异性改变的眼底病变,是糖尿病的严重并发症之一。临床上根据是否出现视网膜新生血管为标志,将没有视网膜新生血管形成,但是发生血-视网膜屏障(BRB)渗漏以及视网膜炎性损伤的糖尿病性视网膜病变称为非增殖性糖尿病性视网膜病变(nonproliferative diabetic retinopathy,NPDR)(或称单纯型或背景型),这是DR病变的早期阶段;而将有视网膜新生血管形成的糖尿病性视网膜病变称为增殖性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR),这是DR病变的晚期阶段。前者主要表现为视网膜散在微血管瘤、点片状出血、硬性渗出、黄斑水肿、血-视网膜屏障的破坏等;后者则表现为视网膜或视乳头新生血管形成,且向玻璃体生长,易发生玻璃体出血和牵拉视网膜脱离,最终导致视网膜脱落,失明。
半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲Scutellaria barbata D.Don的干燥全草,原产于南美洲,主要分布于阿根廷、巴西南部、乌拉圭以及中国大陆等地。其味辛、苦,性寒,具有清热解毒、化瘀利尿的功效,临床上主要用于治疗疔疮肿毒、咽喉肿痛、跌扑伤痛、水肿、黄疸及虫蛇咬伤。化学成分分离鉴定显示,半枝莲的主要化学成分为黄酮类化合物,还含有二萜类化合物、多糖类、生物碱及甾体等成分,其中野黄芩苷是黄酮类化合物中含量最多的化合物,也是半枝莲的有效成分。现代药理学研究表明,半枝莲具有抗菌、抗肿瘤、保肝及抗肝纤维化等活性。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种半枝莲醇提物的新用途。
具体地说,本发明的第一方面是提供了一种半枝莲醇提物在制备预防或者治疗糖尿病性视网膜病的药物或食品中的应用,所述半枝莲醇提物含0.1~20wt%野黄芩苷。
在一优选例中,所述的半枝莲醇提物含4.06wt%野黄芩苷
在另一优选例中,所述的糖尿病性视网膜病为非增殖性糖尿病性视网膜病。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述,本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明
图1半枝莲醇提物(SC)对糖尿病小鼠体重和血糖的影响(A)体重;(B)血糖;(n=16)###P<0.001vs.空白对照;
图2半枝莲醇提物(SC)对糖尿病小鼠BRB渗漏的影响(n=6)###P<0.001vs.空白对照;***P<0.001vs.糖尿病组;
图3半枝莲醇提物(SC)降低糖尿病小鼠血清中升高的IL-1β、TNF-α含量(n=10)#P<0.05vs.空白对照;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs.糖尿病组;
图4半枝莲醇提物(SC)对糖尿病小鼠视网膜中NF-κB p65亚单位磷酸化及核转位的影响(n=8)###P<0.001vs.空白对照;*P<0.05,***P<0.001vs.糖尿病组;
图5不同批次的半枝莲醇提物(SC)对糖尿病小鼠BRB渗漏的影响(n=6)###P<0.001vs.空白对照;***P<0.001vs.糖尿病组。
具体实施方式
本发明的问世部分是基于这样一个意外发现:中药半枝莲的醇提物可以显著改善STZ诱导的小鼠糖尿病视网膜病的炎性损伤和BRB渗漏。因此,本发明的半枝莲醇提物可望开发成为一种预防或者治疗糖尿病视网膜病的药物。
进而,本发明的第一方面是提供了半枝莲醇提物在制备预防或者治疗糖尿病性视网膜病的药物或食品中的应用,所述半枝莲醇提物含0.1~20wt%野黄芩苷。
较优选地,所述的半枝莲醇提物含4.06wt%野黄芩苷。
较优选地,所述的糖尿病性视网膜病为非增殖性糖尿病性视网膜病。
如本领域的技术人员所知,作为药典中半枝莲之鉴别及含量测定的指标成分,野黄芩苷(Scutellarin,SC)具有如下结构式:
野黄芩苷(Scutellarin)
CAS:27740-01-8,分子式:C21H18O12,分子量:462.37
本发明的半枝莲醇提物可通过商业途径从成都曼斯特生物科技有限公司,南京泽朗生物技术有限公司等处购买获得,亦用本领域的常规方法从半枝莲中提取获得,例如:将中药半枝莲用20~95%乙醇浸泡后等回流提取制得。
本发明的半枝莲醇提物,可以单独使用,或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的半枝莲醇提物及可药用载体。较佳地,本发明的药物组合物含有0.1-99.9%重量百分比的作为活性成分的本发明的半枝莲醇提物。“可药用载体”不会破坏本发明的半枝莲醇提物的药学活性,同时其有效用量,即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。
所述可药用载体包括但不限于:软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。
其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。
本发明的半枝莲醇提物以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等;非肠道给药制剂包括注射液等;局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。优选为口服制剂。
本发明的半枝莲醇提物以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。
除了制成药剂之外,亦可在本发明的半枝莲醇提物加入抗氧化剂、色素、酶制剂等各种食品添加剂,按本领域的常规方法制成保健食品。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例1半枝莲醇提物中野黄芩苷(Scutellarin,SC)含量的测定
1.1实验材料和方法
半枝莲醇提物的制备:秤取不同批次共4批次的半枝莲药材各1000g,打粉或裁剪为适宜药物提取的颗粒、碎片,加十倍体积80%乙醇浸泡2小时,回流提取2小时,提取3次,合并3次滤液,减压浓缩,烘干,即为半枝莲醇提物(SE)。
对照品溶液的制备:取野黄芩苷对照品适量,精密称定,加甲醇配成1mg/ml的溶液,混匀,即得对照品溶液。
供试品溶液的制备:精密称取半枝莲醇提物浸膏于容量瓶中,加80%乙醇至约25mL,超声提取60min,恢复到室温后加80%乙醇定容至25mL,混匀后,用0.45μm有机相滤膜滤过,即得(10℃以下保存)。
野黄芩苷(Scutellarin,SC)含量测定:色谱柱为Sepax HP-C18column(4.6×250mm,5μm);流动相条件为甲醇-水-醋酸=35:61:4(v/v/v),流速为1.0mL/min,等度洗脱;进样体积为5μL;柱温为25℃;检测波长为335nm。
1.2实验结果
表1不同批次半枝莲醇提物中野黄芩苷的百分含量
实施例2:半枝莲醇提物(SE)改善糖尿病视网膜病的活性及其机理
2.1实验材料和方法
2.1.1动物:SPF级C57小鼠,雄性,体重18-24g,购自中国科学院上海实验动物中心。动物合格证编号:SCXK(沪)2012-0002。饲养于上海中医药大学SPF级动物房,饲养一周后使用。饲养条件为:温度22±1℃,湿度55±5%,12小时光暗循环,饲料与水消毒后自由摄取。实验严格按照国家和上海中医药大学动物中心动物使用管理条例进行。
2.1.2药物的配制:取适量半枝莲浸膏溶于0.5%CMC-Na中,灌胃给药,浓度为100mg/kg和200mg/kg。
2.1.3动物实验:
(1)将0.1M柠檬酸溶液与柠檬酸三钠溶液以14:11的比例混匀,调混合液PH至4.3-4.5,待用。称取适量STZ粉末,避光溶解,使之成为5.5mg/ml的溶液,立即给予已禁食12h的小鼠腹腔注射,0.1ml/10g,最终给予STZ的剂量为55mg/kg,连续给药5天。
(2)末次给药一周后用割尾法测小鼠血糖浓度,血糖值≥16.7mmol/L(250mg/dl)视为造模成功。将造模成功的小鼠随机分为3组:DR模型组(DR model组)、半枝莲醇提物100mg/kg组、半枝莲醇提物200mg/kg组,每组16只。另外未i.p STZ的16只正常C57小鼠作为正常组(Control组)。每两周检测一次体重和血糖变化。
(3)造模成功1个月后开始给药(0.1ml/10g),半枝莲醇提物100mg/kg组、半枝莲醇提物200mg/kg组分别给予不同浓度的半枝莲醇提物溶液,终剂量分别为:100mg/kg,200mg/kg,Model组给予同体积的溶媒对照,给药1个月后每组取6只小鼠进行伊文氏蓝实验,其它剩余10只小鼠用戊巴比妥钠(30mg·kg-1,腹腔)麻醉,从腹主动脉取血,并摘取眼球,迅速剥离视网膜组织后冷冻储存备用。
2.1.4伊文氏蓝渗漏实验:将伊文氏蓝溶解于PBS中,配制浓度为0.2g·L-1的溶液。小鼠腹腔注射(10ul·g-1)配制的伊文氏蓝溶液,注射后2h用PBS灌注小鼠左心室彻底去除血管内残留的伊文氏蓝染料,然后迅速摘取眼球剥取视网膜组织置离心管中,将视网膜组织冷冻干燥后称取重量,接下来将视网膜组织与120ul甲酰胺在70℃孵育18h提取伊文氏蓝染料,将该提取液离心两次(10000g,4℃),小心吸取合并上清,使用分光光度计在620nm测定该上清液的吸光度值。伊文氏蓝染料在甲酰胺提取物中的量是根据预先制作的标准曲线计算所得,结果以伊文氏蓝含量除以干燥视网膜重量的形式表达。
2.1.5酶联免疫分析实验:全血于室温静置2h后,于4℃,4000g离心15min,分离上层血清,按照试剂盒说明书检测TNF-α和IL-1β的含量。
2.1.6胞浆胞核蛋白的提取:根据试剂盒使用说明,用胞浆/胞核蛋白抽提试剂盒提取视网膜组织中胞浆和胞核部分的蛋白,并使用BCA蛋白定量试剂盒测定样本的蛋白浓度,将所有样品统一到相等的蛋白浓度。
2.1.7蛋白电泳实验:制备好的蛋白样本通过SDS-PAGE胶进行电泳,将胶上蛋白转印至PVDF膜,用含5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭1h后,加入一抗,4℃孵育过夜。洗去一抗后,与二抗室温孵育1h,TBST洗去过量抗体后,加入化学发光液进行显像,蛋白条带用GeneTools图像分析软件进行定量。
2.1.8统计分析:实验数据用均数±标准误表示,采用SPSS16.0统计软件进行分析,以One-Way ANOVA方式进行方差分析,两两比较采用LSD法,P<0.05表示差异具有显著性
2.2实验结果
2.2.1半枝莲醇提物(SE)对糖尿病小鼠血糖和体重的影响
从图1可见,半枝莲醇提物各剂量组均不能改善糖尿病小鼠体重的减轻,也不能降低升高的血糖。说明半枝莲醇提物没有明显改善糖尿病的药效活性。
2.2.2半枝莲醇提物(SE)对糖尿病小鼠视网膜BRB渗漏的影响
由图2可见,STZ诱导的糖尿病小鼠视网膜中伊文氏蓝渗漏值明显升高(P<0.001),而半枝莲醇提物(100、200mg·kg-1)均对此有显著的改善作用(P<0.001)。血视网膜屏障(BRB)的损坏是非增殖性糖尿病视网膜病的特征。我们的研究表明:半枝莲醇提物可缓解BRB损伤导致的渗漏,因此具有改善糖尿病视网膜病,特别是非增殖性糖尿病视网膜病的药效活性。
2.2.3半枝莲醇提物(SE)降低糖尿病小鼠血清中升高的IL-1β、TNF-α含量
由图3所示,STZ诱导的糖尿病小鼠血清中白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量明显高于正常组(P<0.05)。与其对比,半枝莲醇提物(100,200mg·kg-1)给药后血清中IL-1β、TNF-α含量的升高均得到不同程度的降低(P<0.01,P<0.001)。我们的研究表明:半枝莲醇提物可通过抑制促炎因子的释放,减轻视网膜炎性损伤,改善糖尿病视网膜病。
2.2.4半枝莲醇提物(SE)对糖尿病小鼠视网膜中NF-κB p65磷酸化及核转位的影响
如图4A-C所示,与正常组比较,STZ诱导糖尿病小鼠视网膜组织中磷酸化NF-κB p65蛋白的表达明显增加(P<0.001),并且胞核中NF-κB p65蛋白的表达也明显增加(P<0.001)。与之相比,半枝莲醇提物(200mg·kg-1)给药后可以降低升高的磷酸化NF-κB p65蛋白的表达(P<0.001)。半枝莲醇提物(100,200mg·kg-1)给药还降低了胞核中增加的NF-κB p65蛋白的表达(P<0.05,P<0.001),但对胞浆中p65蛋白的表达无明显的影响。NF-κB是机体重要的炎性损伤调控因子。我们的研究表明:半枝莲醇提物可通过抑制NF-κB信号通路,减轻糖尿病视网膜病的视网膜炎性损伤。
实施例3:不同批次半枝莲醇提物(SE)改善糖尿病视网膜病的药效活性
3.1实验材料和方法
3.1.1动物:SPF级C57小鼠,雄性,体重18-24g,购自中国科学院上海实验动物中心。动物合格证编号:SCXK(沪)2012-0002。饲养于上海中医药大学SPF级动物房,饲养一周后使用。饲养条件为:温度22±1℃,湿度55±5%,12小时光暗循环,饲料与水消毒后自由摄取。实验严格按照国家和上海中医药大学动物中心动物使用管理条例进行。
3.1.2药物的配制:取适量不同批次的半枝莲醇提物浸膏溶于0.5%CMC-Na中,灌胃给药,浓度为100mg/kg。
3.1.3动物实验:
(1)将0.1M柠檬酸溶液与柠檬酸三钠溶液以14:11的比例混匀,调混合液PH至4.3-4.5,待用。称取适量STZ粉末,避光溶解,使之成为5.5mg/ml的溶液,立即给予已禁食12h的小鼠腹腔注射,0.1ml/10g,最终给予STZ的剂量为55mg/kg,连续给药5天。
(2)末次给药一周后用割尾法测小鼠血糖浓度,血糖值≥16.7mmol/L(250mg/dl)视为造模成功。将造模成功的小鼠随机分为5组:DR模型组(DR model组)、半枝莲醇提物(SE)组、半枝莲醇提物-1(SE-1)组,半枝莲醇提物-2(SE-2)组,半枝莲醇提物-3(SE-3)组,每组6只。另外未i.p STZ的6只正常C57小鼠作为正常组(Control组)。
(3)造模成功1个月后开始给药(0.1ml/10g),分别给予不同批次的半枝莲醇提物溶液,剂量为:100mg/kg,Model组给予同体积的溶媒对照,给药1个月后进行伊文氏蓝实验检测血视网膜屏障(BRB)的渗漏。
3.1.4伊文氏蓝渗漏实验:将伊文氏蓝溶解于PBS中,配制浓度为0.2g·L-1的溶液。小鼠腹腔注射(10ul·g-1)配制的伊文氏蓝溶液,注射后2h用PBS灌注小鼠左心室彻底去除血管内残留的伊文氏蓝染料,然后迅速摘取眼球剥取视网膜组织置离心管中,将视网膜组织冷冻干燥后称取重量,接下来将视网膜组织与120ul甲酰胺在70℃孵育18h提取伊文氏蓝染料,将该提取液离心两次(10000g,4℃),小心吸取合并上清,使用分光光度计在620nm测定该上清液的吸光度值。伊文氏蓝染料在甲酰胺提取物中的量是根据预先制作的标准曲线计算所得,结果以伊文氏蓝含量除以干燥视网膜重量的形式表达。
3.2实验结果
由图5可见,STZ诱导的糖尿病小鼠视网膜中伊文氏蓝渗漏值明显升高(P<0.001),而SE(100mg·kg-1)、SE-1(100mg·kg-1)、SE-2(100mg·kg-1)和SE-3(100mg·kg-1)均对此有显著的改善作用(P<0.001)。血视网膜屏障(BRB)的损坏是非增殖性糖尿病视网膜病的特征。我们的研究表明:本发明的各批次的半枝莲醇提物均可以缓解BRB损伤导致的伊文氏蓝渗漏,因此其具有改善糖尿病视网膜病,特别是非增殖性糖尿病视网膜病的药效活性。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而,应理解的是,在不偏离本发明精神之前提下,本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰,所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。
Claims (3)
1.半枝莲醇提物在制备预防或者治疗糖尿病性视网膜病的药物或食品中的应用,所述半枝莲醇提物含0.1~20wt%野黄芩苷。
2.如权利要求1所述的半枝莲醇提物的应用,其中所述的半枝莲醇提物含4.06wt%野黄芩苷。
3.如权利要求1所述的半枝莲醇提物的应用,其中所述的糖尿病性视网膜病为非增殖性糖尿病性视网膜病。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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