TWI623328B - 杞菊地黄丸的使用於視網膜缺血及其相關疾病，病況或病狀的治療 - Google Patents

杞菊地黄丸的使用於視網膜缺血及其相關疾病，病況或病狀的治療 Download PDF

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Abstract

本發明係關於一種組合物用於製備治療視網膜缺血或其相關疾病、病況或病症的藥物之用途，其中該組合物係由一杞菊地黄丸，其中該杞菊地黄丸包括一熟地黃、一山茱萸、一山藥、一茯苓、一牡丹皮、一澤瀉、一枸杞及一菊花所組成。

Description

杞菊地黄丸的使用於視網膜缺血及其相關疾病，病況或病狀的治療
本發明係關於杞菊地黄丸(一種傳統中國處方用藥，其係由熟地黃、山茱萸、山藥、茯苓、牡丹皮、澤瀉、枸杞及菊花所組成)的使用於視網膜缺血的治療上。本發明更具體地涉及一包含杞菊地黄丸的組合物之使用用於視網膜缺血及其相關疾病，病況或病狀的治療及/或預防。
視網膜血管阻塞(retinal vascular occlusion)、青光眼(glaucoma)、糖尿病性視網膜病(diabetic retinopathy)和老年性黃斑部病變(age related macular degeneration；AMD)都與視網膜缺血相關。而視網膜血管阻塞包括如中心或分支視網膜動脈阻塞(central or branch retinal artery occlusion；CRAO or BRAO)。該定義的眼部病症經常導致嚴重的併發症。是以，視網膜缺血性損傷的治療是非常重要的。
無軸突細胞(Amacrines)及其神經元突起(neuronal processes)易受缺血再灌注(ischemia plus reperfusion；I/R)之影響。於缺血再灌注(I/R)後，米勒細胞(Müller cell)內的中間絲蛋白(vimentin)/膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein；GFAP)之免疫標記會增 強。基質金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9；MMP-9)是蛋白水解酶並能夠降解細胞外基質。缺血也已顯示會導致視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell；RGC)的死亡，其與MMP-9的量增加有關。另一方面，第一型血紅素氧化酶(heme oxygenase-1；HO-1)是一參與對氧化壓力(oxidative stress)及缺氧(hypoxia)的進行反應之誘導型異構物。HO-1的表現增加似乎能夠藉由抗氧化活性提供一對視網膜缺血別或老年性黃斑部病變之保護作用。
有絲分裂活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases；MAPKs)是訊息傳遞路徑上關鍵性蛋白激酶。此外，MAPK亞科的主要成員(如JNK、p38及ERK1/2)與神經損傷及疾病有關。因MAPK蛋白(p38)會被各種壓力(包括缺血和氧化壓力)所刺激，故已顯示與細胞凋亡過程有關。
“杞菊地黄丸”(Chi-Ju-Di-Huang-Wan；CJDHW；台灣台北之順天堂藥廠股份有限公司)是中國傳統的中草藥配方，其由“六味地黃丸”配方(熟地黃(Rehmanniae Radix Preparata)、山茱萸(Corni Fructus)、山藥(Rhizoma Diocoreae)、茯苓(Poria)、牡丹皮(Cortex Moutan Redicis)及澤瀉(Alismatis Rhizoma))加上枸杞(Fructus Lycii)及菊花(Chrysanthemi Flos))所組成。有時，將蜂蜜額外添加於配方中以加強風味，並讓老人和小孩容易吞服(Chang YH,Lin HJ,Li WC：Clinical evaluation of the traditional chinese prescription Chi-Ju-Di-Huang-Wan for dry eye.Phytother Res 2005,19：349-354)。“杞菊地黄丸”據報導能有效治療乾眼症。“杞菊地黄丸”是淚膜(tear film)的有效穩定劑，並降低角膜上皮的異常情況。然而，杞菊地黄 丸作用之相關治療機制仍然未知。配方中已知活性化合物包括抗氧化劑玉米黃素(zeaxanthin)和葉黃素(lutein)(其存在於枸杞和菊花中)，和海藻糖(trehalose)(其出現於熟地黃)。
本發明探討杞菊地黄丸(Chi-Ju-Di-Huang-Wan；CJDHW)是否能夠減輕視網膜缺血性損傷，以及藉由電生理、視網膜厚度、膽素乙醯基轉換酶(Choline acetyltransferase；ChAT)免疫組織化學染色、中間絲蛋白(vimentin)/膠質原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein；GFAP)免疫組織化學染色(以米勒細胞(Müller cell)為指標)、螢光金回溯視網膜神經節細胞(RGC)的標記、TUNEL染色(針對凋亡細胞)、Bcl-2/HO-1/磷酸化-p38(P-p38)/MMP-9蛋白表現量分析及以酶譜(zymography)計算MMP-9的活性、以及測量Thy-1和MMP-9的mRNA表現量以評估其功效。
所定義的視網膜缺血性改變包括以下特徵：視網膜電位圖(ERG)的b波振幅的減小，內層視網膜厚度變薄，膽素乙醯基轉換酶(Choline acetyltransferase；ChAT)免疫標記減少，中間絲蛋白/膠質原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein；GFAP)的免疫反應性增強，神經節細胞層出現更多的凋亡細胞，以及少數的視網膜神經節細胞。此外，在缺血性視網膜上分別發現Thy-1及基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的mRNA表現量減少和增加。更進一步，當第一型血紅素氧化酶(heme oxygenase-1；HO-1)、磷酸化p38(P-p38)、有絲分裂活化蛋白質激酶(mitogen-activated protein kinase；MAPK)及MMP-9增加時，B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)的蛋白表現量降低。重要的是，以4.2g/kg/天的杞菊地黄丸(CJDHW)先處理可 顯著地調節缺血誘發的變化。特別是，CJDHW和2 nmole的SB203580(p38 MAPK抑制劑)兩者一起可減弱與缺血有關的P-p38和MMP-9的增加。
本發明藉由視網膜電位圖(electroretinography)(b波指標性米勒細胞(Müller cell)和雙極細胞(bipolar cell))、免疫組織化學染色(ChAT標記的無軸突細胞、中間絲蛋白/GFAP標記Müller細胞、螢光金標記的視網膜神經節細胞(RGC))、組織病理學(視網膜厚度測量、RGC層中的TUNEL陽性細胞)、西方墨點法(Bcl-2、HO-1、P-p38及MMP-9)和即時PCR分析(Thy-1和HO-1)證實大鼠之視網膜各種缺血性改變。重要的是，於缺血加再灌注(I/R)前以杞菊地黄丸(CJDHW)處理可明顯調節所有這些定義的缺血性相關特徵。
CJDHW藉由保留視網膜電生理功能(圖1A至1B)，抵消內層視網膜厚度的減少或膽鹼神經元死亡(圖2A至2J和圖3A至3J；表2和3)，減少米勒細胞、中間絲蛋白/GFAP神經膠細胞活化(圖4A至4R)，使RGC層的凋亡細胞數量下降(表4)以及鈍化Thy-1的mRNA的下調(圖6和表6)和使透過螢光金標記所偵測到RGC死亡下降(圖5A至5J；表5)以保護抵抗視網膜缺血性損傷。如目前西方墨點法分析結果(圖7和表7)，CJDHW是能夠保護缺血性損傷的視網膜細胞，如無軸突細胞和神經節細胞(圖3A至3J，圖5A至5J和圖6；表3、5及6)；故它很可能是，至少在某一部分，因為HO-1過度表達與抗氧化作用有關(圖7和表7)。最重要的是，透過CJDHW和SB203580(p38 MAPK抑制劑)兩者一起抑制缺血MMP-9的量增加及活性增強(圖7和圖8)。
在這樣的情況下，一個合理的結論是：CJDHW能夠透過抗 氧化作用和經由抗凋亡作用(分別增加HO-1和Bcl-2的量)給予視網膜缺血的神經保護。尤其，CJDHW也顯示經由p38 MAPK以下調MMP-9來保護防止視網膜缺血。
在本發明中，顯示出當患者有老年性黃斑部病變(AMD)或糖尿病之家族病史，及/或當有和中心或分支視網膜動脈阻塞(CRAO或BRAO)相關的誘發因子，即高血壓、冠狀/頸動脈疾病、高血脂症或心臟瓣膜疾病時，先給予CJDHW作為預防方法上有臨床上重要性。
本發明的電生理結果指出缺血後給予CJDHW明顯減弱視網膜缺血相關視覺機能障礙(b波降低)。所以，杞菊地黄丸(CJDHW)在預防或緩解急性和可能早期慢性視網膜缺血性損傷之神經元傷害是有用的。因此，CJDHW可以是一個有效的方法，用以保護防止所定義的對視力有威脅之視網膜缺血性疾病，例如中心視網膜動脈阻塞、中心視網膜靜脈阻塞、其它視網膜血管阻塞症，青光眼性視神經病變(glaucomatous optic neuropathy)、糖尿病性視網膜病和濕性老年性黃斑部病變(wet age related macular degeneration；wAMD)。
因此，本發明提供一種組合物用於製備治療視網膜缺血或其相關疾病、病況或病症的藥物之用途，其中該組合物包含一杞菊地黄丸(Chi-Ju-Di-Huang-Wan；CJDHW)，其中該杞菊地黄丸由熟地黃(Rehmanniae Radix Preparata)、山茱萸(Corni Fructus)、山藥(Rhizoma Diocoreae)、茯苓(Poria)、牡丹皮(Cortex Moutan Redicis)、澤瀉(Alismatis Rhizoma)、枸杞(Fructus Lycii)及菊花(Chrysanthemi Flos)所組成。於一具體實施例中，該組合物進一步包含一蜂蜜。於一具體實施例中，其中 該視網膜缺血的該相關疾病、病況或病症包含視網膜血管阻塞(retinal vascular occlusion)、青光眼(glaucoma)、糖尿病性視網膜病(diabetic retinopathy)或老年性黃斑部病變(age related macular degeneration)。因為視網膜是中樞神經系統的延伸，故本領域的技術人員可以合理地推斷本組合物可以進一步用於治療腦部缺血(brain ischemia)(中風(stroke))。較佳的是，該藥物作用在哺乳動物；更佳的是，該哺乳動物為人類。較佳的是，該藥物係經口服投藥。
於一具體實施例中，該組合物的治療有效量包含該杞菊地黄丸的劑量範圍從約1g/kg/天到10g/kg/天(克/公斤體重/天)。於另一具體實施例中，該組合物的治療有效量包含該杞菊地黄丸的劑量範圍從約1g/kg/天至約5g/kg/天。於又一具體實施例中，該組合物的治療有效量包含杞菊地黄丸的劑量範圍從約2.8g/kg/天至約4.2g/kg/天。在另一實施例中，該組合物的治療有效量包含杞菊地黄丸的劑量範圍從約2.8g/kg/天至約4.2g/kg/天以口服方式給予囓齒動物。
值得注意的是，上述的劑量主要是透過口服給藥方式用於大鼠上。因此，如果需要治療的個體是人類，則該劑量應根據本領域中習知的轉換方法重新計算。例如，大鼠(標準體重為0.2kg)和人類(標準體重70kg)之間的劑量的轉換可以如下所示：1(g/kg)X 0.2 X 56/70=0.16(g/kg)；2.8(g/kg)X 0.2 X 56/70=0.448(g/kg)；4.2(g/kg)X 0.2 X 56/70=0.672(g/kg)； 5(g/kg)X 0.2 X 56/70=0.8(g/kg)；或10(g/kg)X 0.2 X 56/70=1.6(g/kg)。
也就是說，用於大鼠上1至10g/kg(克/公斤體重)的劑量大約等於使用於人類身上0.16至1.6g/kg(克/公斤體重)。
因此，於一具體實施例中，杞菊地黄丸對人類的劑量範圍可從約0.1g/kg/天至約2g/kg/天、從約0.16g/kg/天至約1.6g/k/天、從約0.16g/kg/天至約0.8g/kg/天、從約0.4g/kg/天至約0.7g/kg/天、或從約0.448g/kg/天至約0.672g/kg/天。
圖1A及1B顯示視網膜電位圖(ERG)，其為杞菊地黄丸(CJDHW)對視網膜缺血加再灌注(I/R)的作用。圖1A：相較於控制組的假程序之視網膜(假程序；sham)，在I/R-+-媒劑組之代表性動物因接受壓力誘發視網膜缺血及先給予媒劑(Vehicle)，其ERG之b波振幅出現相當程度的減少。顯示每個界定的組別之大鼠先給予CJHDW(2.8g/kg/天(I/R+CJDHW 2.8)；4.2g/kg/天(I/R+CJDHW 4.2))減少劑量反應反作用。圖1B：相較於假程序之控制組，I/R+媒劑組於缺血後第1，3，5和7天的b波率顯著減少(*p<0.05)。先給予2.8g/kg/天(I/R+CJDHW 2.8)和4.2g/kg/天(I/R+CJDHW 4.2)的CJDHW可達到呈現劑量反應且顯著使缺血誘發的減少衰減(†p<0.05)。該結果以平均值±標準誤差(SEM)表示(數量為5)。
圖2A至2J表示各種視網膜層的厚度。這些圖顯示來自大約相同的偏心度之視網膜的切片。圖2A或圖2F分別為假程序後第1天(sham 1 day)或第7天(sham 7 day)的控制組的視網膜。圖2B或圖2G分別先以媒劑(Vehicle)處理之缺血加再灌注後第1天(I/R 1 day+Vehicle)或第7天(I/R 7 day+Vehicle)的視網膜。相較於控制組的視網膜(圖2A及2F)，以先給予媒劑之缺血性視網膜的內視網膜(內核層(INL)，內叢層(IPL)和神經節細胞層(GCL))之厚度呈現相當程度的變薄(圖2B及2G)。以2.8g/kg/天及4.2g/kg/天的杞菊地黄丸(CJDHW)先處理並受缺血加再灌注的動物可緩減內視網膜層的變薄(I/R 1 day+CJDHW 2.8(圖2C)、I/R 7 day+CJDHW 2.8(圖2H)、I/R 1 day+CJDHW 4.2(圖2D)及I/R 7 day+CJDHW 4.2(圖2I))。比例尺=50μm。此處呈現來自相似偏心率之切片上的各種視網膜層的厚度之形態分析(圖2E及2J)。相較於控制組的視網膜(sham 1 day及sham 7 day)，於以媒劑先處理的缺血性視網膜，其整個視網膜層、內核層(INL)和內叢層(IPL)的厚度顯著降低。此外，當以2.8及4.2g/kg/天的CJDHW先處理之缺血性視網膜會以劑量依賴性形式且顯著地降低衰減。結果以實驗的數量之平均值±標準誤差(SEM)表示(數量為4~6)。*：與控制組的眼有顯著差異(p<0.05)。†：與I/R 1 day+Vehicle組或I/R 7 day+Vehicle組有顯著差異(p<0.05)。Total：整個視網膜。
圖3A至3J表示膽素乙醯基轉換酶(Choline acetyltransferase；ChAT，以紅色表示)免疫組織化學染色。在假程序的第1天(sham 1 d(圖3A))及第7天(sham 7d(圖3F))的視網膜中，無軸突細胞體(以短箭頭表示)位於內核層(inner nuclear layer；INL)和神經節細胞層(ganglion cell layer；GCL)內；無軸突細胞體的神經突(以長箭頭表示)在內叢層(inner plexiform layer；IPL)顯示兩個清楚的描繪區段。 視網膜缺血加再灌注1天或7天可引起IPL的ChAT免疫標記顯著減少，以及ChAT所標記的無軸突細胞體的數目少許多；而先給予媒劑並不影響所界定的缺血性改變(I/R 1d+Vehicle(圖3B)；I/R 7d+Vehicle(圖3G))。然而，先給予2.8g/kg/天及4.2g/kg/天的杞菊地黄丸(CJHDW)可明顯減緩這種缺血性改變(I/R 1d+CJDHW2.8(圖3C)；I/R 7d+CJDHW 2.8(圖3H)；I/R 1d+CJDHW 4.2(圖3D)；I/R 7d+CJDHW 4.2(圖3I))。ChAT免疫標記圖像與4,6-二脒基-2-苯基吲哚-二氫化氯(4,6-diamidine-2-phenylindole dihydrochloride；DAPI，以藍色表示，圖3A至3D；圖3F至3I)的圖像合併。假程序或缺血性手術後1天(圖3E)及7天(圖3J)中，每一條代表平均值±SEM(數量為6)。*代表有顯著(p<0.05；sham對I/R 1d+Vehicle；sham對I/R 7d+Vehicel)。†代表有顯著(p<0.05；I/R 1d＋Vehicel對I/R 1d+CJDHW 2.8或I/R 1d+CJDHW 4.2；I/R 7d+Vehicel對I/R+7d CJDHW 2.8或I/R 7d+CJDHW 4.2)。比例尺為35μm。
圖4A至4R顯示中間絲蛋白(vinmemtin)免疫組織化學染色。在假程序後的第1天(sham 1d(圖4B))或第7天(sham 7d(圖4K))中，以中間絲蛋白免疫標記(以綠色表示)證實米勒細胞(Müller cell)在神經節細胞層(ganglion cell layer；GCL，以箭頭表示)的末支(end feet)和米勒細胞的突起在內叢層(inner plexiform layer；IPL，以箭號表示)、內核層(inner nuclear layer；INL)和外核層(outer nuclear layer；ONL)。相較於假程序的視網膜，抗中間絲蛋白免疫標記在先給予媒劑(Vehicle)後第1天及第7天增加(I/R 1d+Vehicle(圖4C)；I/R 7d+Vehicle(圖4L))。這種增加會被以2.8g/kg/天(I/R 1d+CJDHW 2.8(圖4D)；I/R 7d+CJDHW 2.8 (圖4M))或4.2g/kg/天(I/R 1d+CJDHW 4.2(圖4E)；I/R 7d+CJDHW 4.2(圖4N))的杞菊地黄丸(CJDHW)所減緩。假程序的視網膜上之細胞核以4,6-二脒基-2-苯基吲哚-二氫化氯(4,6-diamidine-2-phenylindole dihydrochloride；DAPI)進行免疫標記(以藍色表示)(圖4A及圖4J)。膠質原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein；GFAP)免疫組織化學染色。與經假程序後第1天及第7天的控制組之視網膜相比(sham 1d(圖4F)；sham 7d(圖4O))，抗GFAP免疫標記在先給予媒劑後第1天及第7天亦增加(I/R 1d+Vehicle(圖4G)；I/R 7d+Vehicle(圖4P))。這種增加會被以2.8g/kg/天(I/R 1d+CJDHW 2.8(圖4H)；I/R 7d+CJDHW 2.8(圖4Q))或4.2g/kg/天(I/R 1d+CJDHW 4.2(圖4I)；I/R 7d+CJDHW 4.2(圖4R))的CJDHW所減弱。比例尺為25μm。
圖5A至5J顯示螢光金標記。顯微鏡圖像顯示於假程序後第1天及第7天(sham 1d(圖5A)；sham 7d(圖5F))，或先給予媒劑(Vehicle)(I/R 1d+Vehicle(圖5B)；I/R 7d+Vehicle(圖5G))或2.8g/kg/天及4.2g/kg/天之杞菊地黄丸(CJDHW)(I/R 1d+CJDHW 2.8(圖5C)；I/R 7d+CJDHW2.8(圖5H)；I/R 1d+CJDHW 4.2(圖5D)；I/R 7d+CJDHW 4.2(圖5I))缺血再灌注後第1及7天之視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell；RGC)的密度。每一條以平均值±SEM表示(圖5E及5J；數量為3)。**表示顯著差異(p<0.01；sham對I/R 1d+Vehicle或I/R 7d+Vehicle)；†表示顯著差異(p<0.05；I/R 1d+Vehicle對I/R 1d+CJDHW 4.2；I/R 7d+Vehicle對I/R 7d+CJDHW4.2)。比例尺為25μm。
圖6表示Thy-1(A)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9；MMP-9)(B)及β-肌動蛋白(β-actin)的mRNA表現量。在視網膜缺血加再灌注(I/R)後24小時，從假程序(sham)之視網膜或給予媒劑(水)、低劑量(2.8g/kg/天)/高劑量(4.2g/kg/天)之杞菊地黄丸(CJDHW)的缺血性視網膜中萃取且分離全部的mRNA。評估每一個所界定的化合物對Thy-1/MMP-9之mRNA濃度(除以β-肌動蛋白的mRNA表現量)的影響。**代表有顯著(p<0.01；假程序對I/R+媒劑)。†或††代表分別對Thy-1有顯著(p<0.05；I/R+媒劑對I/R+CJDHW 4.2)或對MMP-9有顯著(p<0.01；I/R+媒劑對I/R+ CJDHW 4.2)。結果以平均值±SEM表示(Thy-1：數量為5；MMP-9：數量為3~4)。
圖7顯示西方墨點法(western blotting)。抗Bcl-2(A1)、第一型血基質氧化酶(heme oxygenase-1；HO-1)(B1)，磷酸化-p38(phosphorylated-p38；P-p38)(C1)、MMP-9(D1)及β-肌動蛋白的抗體分別以26kDa、34.6kDa，43kDa、92~96kDa及43kDa的條帶表示。每一條代表Bcl-2(數量為4~9，A2)、HO-1(數量為4，B2)、P-p38(數量為5~9，C2)或MMP-9(數量為5，D2)對β-肌動蛋白(β-actin)的比率。*或†分別代表有顯著(p<0.05；假程序(sham)對I/R+媒劑(I/R+Vehicle))或顯著(p<0.05；I/R+媒劑對I/R+CJDHW 4.2；I/R+媒劑對SB203580)。此外，對於P-p38來說，**或††/†分別代表有顯著(p<0.01；假程序對I/R+媒劑)或顯著(p<0.01和p<0.05；I/R+媒劑對SB203580和I/R+媒劑對I/R+CJDHW 4.2)。結果以平均值±SEM表示。
圖8顯示凝膠酶譜(Gel zymography)。(A)為明膠酶譜的一個例子，其用於透過光密度(densitometry)定量分析MMP-9之定量蛋白表 現量。72及97kDa之明膠分解的條帶(gelatinolytic band)分別對應MMP-2和活化的MMP-9。第1行：假程序之視網膜(假程序；sham)；第2行：以媒劑(Vehicle)先處理之缺血性視網膜(I/R+媒劑)；第3行：以SB203580(p38 MAPK抑制劑)先處理的缺血性視網膜(I/R+SB203580)；第4和5行：分別為以4.2g/kg/天(I/R+CJDHW 4.2)和2.8g/kg/天的杞菊地黄丸(CJDHW)(I/R+CJDHW 2.8)先處理之缺血性視網膜。(B)中每一條以平均值±SEM表示(數量為4~5)。**表示有顯著(p<0.01；假程序對I/R+媒劑)。††代表有顯著(p<0.01；I/R+媒劑對I/R+CJDHW 4.2；I/R+Vehicle對SB203580)。†代表有顯著(p<0.05；I/R+媒劑對I/R+CJDHW 2.8)。與MMP-9的結果相反，當以媒劑或CJDHW 4.2/CJDHW 2.8先處理之缺血後24小時後測量MMP-2的表現量，發現有與控制組(假程序)相似的蛋白質表現量。
下列實施例並非限制，且僅作為本發明的不同面向及特色的代表。
實施例1 方法
動物
振興醫院(CHGH；臺北；臺灣)的實驗動物照護及使用委員會同意所有的動物實驗(批准文號：CHIACUC 102-08)，其遵守視覺與眼科研究協會(Association for Research in Vision and Ophthalmology)之視覺與眼科研究上使用動物聲明。Wistar大鼠(BioLasco，台北，台灣)飼養於動物房中，其維持濕度：40至60%、溫度：19至23℃、光暗循環週期為 12小時、換氣次數為每小時12-15次之環境。食物和水則讓牠們任意採食。
動物麻醉及安樂死
以克他明(ketamine，100mg/kg)及甲苯噻嗪(xylazine，5mg/kg)進行麻醉，其透過腹腔注射的方式給予動物。採用人道方式(根據1986年的科學程序法案；Scientific Procedures Acts 1986)，將戊巴比妥鈉(sodium pentobarbitone)(>140mg/kg)以腹腔給藥方式犧牲動物。
視網膜缺血模式的建立
麻醉後，將動物(200至250克)固定於一立體定位儀上。用一連接生理食鹽水瓶之30號的針頭穿刺進大鼠的眼睛之前房，以升高並誘發出120毫米水銀柱的高眼球內壓(high intraocular pressure；HIOP)，維持60分鐘。透過眼部基底白化(pale eye fundus)之檢測以確認缺血性損傷的誘發情況(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708；Peng PH,Chao HM,Juan SH,Chen CF,Liu JH,Ko ML：Pharmacological preconditioning by low dose cobalt protoporphyrin induces heme oxygenase-1 overexpression and alleviates retinal ischemia-reperfusion injury in rats.Current eye research 2011,36：238-246)。控制組中大鼠的眼睛接受假程序，即大鼠的眼壓並未升高。
藥物供應
在高眼球內壓(HIOP)損傷手術的前或後，每天給予可口服攝取的水、低攝取量的杞菊地黄丸(CJDHW)(2.8g/kg/天，CJDHW 2.8)或高攝取量的杞菊地黄丸(4.2g/kg/天，CJDHW 4.2)連續7天，直到犧牲 動物為止。下列大鼠的正常眼睛作為對照組。眼睛遭受缺血手術的受測試大鼠餵食相關量的杞菊地黄丸(I/R+CJDHW 2.8；I/R+CJD HW4.2)或”相同”量的媒劑(Vehicle)(I/R+Vehicle)。舉例來說，餵食重量250g的大鼠低劑量杞菊地黄丸(0.7g/0.5ml水/天)、高劑量杞菊地黄丸(1.05g/3.5ml水/天)或3.5ml的水。
於用1%的睫狀肌麻痺劑(tropicamide)及2.5%的脫羥腎上腺素(phenylephrine)使瞳孔擴大後，利用一連接25μl注射器的30號的針頭進行玻璃體內注射(intravitreal injection)。在某些情況下，於壓力誘發視網膜缺血的15分鐘前，於缺血眼睛上施行玻璃體內注射4μl的濃度2nmol之SB203580(Calbiochem公司，聖地亞哥，加州)或媒劑(等體積的二甲亞碸(DMSO))。
閃爍視網膜電位圖測量
記錄缺血手術前(作為第0天)及缺血手術後(給予適當的化合物)第1，3，5和7天所有的動物的視網膜電位圖(electroretinogram；ERG)的數據。大鼠需經至少對黑暗適應8小時，且ERG記錄過程中處於麻醉狀態，並用1%的睫狀肌麻痺劑(tropicamide)及2.5%的脫羥腎上腺素(phenylephrine)使其瞳孔擴大。每隻大鼠的眼睛前2公分放置一閃光燈(strobe)以誘發出0.5Hz的刺激。在10kHz時以每2秒的時間間隔內連續記錄15次的反應，並將這些反應擴大且平均；其依據先前所述(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708)。已被廣泛接受的是b波反應出視網膜內層及雙極細胞(bipolar cell)的功能。為了進行比較，經處理後缺 血性視網膜的b波振幅除以未處理的對側正常視網膜的b波振幅以計算出b波率(b-wave ratio)(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708)。
蘇木素-伊紅染色
於視網膜缺血再灌注後第1或7天，於角膜的12點鐘方向以絲線縫合以對眼球做上記號；然後將眼球摘除並放入於4%三聚甲醛(paraformaldehyde)中於4℃下固定24小時。固定後，移除眼球前端部分，且將含有視盤的眼球後端部分透過一系列梯度設計的乙醇進行脫水，再包埋於石蠟中。進行蘇木素(hematoxylin)-伊紅(eosin)染色(HE stain)(Schatz A,Arango-Gonzalez B,Fischer D,Enderle H,Bolz S,Röck T,Naycheva L,Grimm C,Messias A,Zrenner E：Transcorneal electrical stimulation shows neuroprotective effects in retinas of light-exposed rats.Invest Ophthalmol Vis Sci 2012,53：5552-5561)，沿著垂直子午線(vertical meridian)切出5μm厚的切片，並於顯微鏡(Leica公司，海德堡，德國)下進行觀察。
為了量化視網膜缺血性損傷，測量不同層的厚度。整個視網膜厚度(從內限界膜(inner limiting membrane)到視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium；RPE)層)、內視網膜厚度(從內限界膜到內核層(inner nuclear layer；INL))和內叢層(inner plexiform laye；IPL)的厚度皆被測量，所有測量均從視盤開始約1000μm進行測定。每個眼睛取三個切片進行平均。此外，為了適當地探究四組(假程序組(sham)、I/R+媒劑(I/R+Vehicle)、I/R+CJDHW 2.8及I/R+CJDHW 4.2)之間厚度的任何差異， 研究人員於不知組織的來源的情形下進行各種厚度的測量。
免疫螢光分析
於大鼠犧牲後，於該大鼠心內灌注生理鹽水(w/v)。於其後，回收視網膜切片，並浸泡於4%三聚甲醛(paraformaldehyde)中固定45分鐘，再浸入30%的蔗糖溶液內以進行冷凍切片(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708)。收集先給予杞菊地黄丸(CJDHW)或媒劑之視網膜缺血，或假程序後第1及7天的視網膜切片。將視網膜樣本與初級抗體(包括如先前所述之羊的抗膽素乙醯基轉換酶(ChAT)之多株抗體、小鼠的抗中間絲蛋白(vimentin)的單株抗體及兔的抗膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)的多株抗體(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708))一同培養至過夜。之後，將視網膜樣本與二級抗體(包括如先前所述之玫瑰紅(rhodamine)共軛之兔的抗山羊抗體，異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate)共軛的山羊的抗小鼠之免疫球蛋白G(IgG)或螢光蛋白(FITC)共軛的山羊的抗兔之免疫球蛋白G(IgG)(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708))一同培養。同時，如前所述細胞核用4,6-二脒基-2-苯基吲哚-二氫化氯(4,6-diamidine-2-phenylindole dihydrochloride；DAPI)進行染色(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708)。如先前所述， 利用螢光顯微鏡以評估視網膜樣本(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708)。
末端脫氧核苷酸轉移酶調介脫氧尿苷三磷酸切口末端標記染色(TUNEL)分析
於缺血加再灌注(I/R)手術後的第1天及第7天，移除大鼠眼睛進行末端脫氧核苷酸轉移酶調介脫氧尿苷三磷酸切口末端標記染色(Terminal deoxynucleotidyl-transferase(TdT)-mediated dUTP nick end-labeling；TUNEL)(原位細胞死亡偵測試劑(In situ Cell Death Detection Kit)，螢光素；羅氏，曼海姆，德國)以研究細胞凋亡。視網膜樣本以10%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定24小時。視網膜樣本浸泡於蛋白酶K(proteinase K，25μg/ml)，隨後於25℃下在過氧化氫(H2O2)/甲醇中培育5分鐘以使內生性過氧化酵素(endogenous peroxidases)失去活性。陰性和陽性對照組如先前所述進行測量(Peng PH,Chao HM,Juan SH,Chen CF,Liu JH,Ko ML：Pharmacological preconditioning by low dose cobalt protoporphyrin induces heme oxygenase-1 overexpression and alleviates retinal ischemia-reperfusion injury in rats.Current eye research 2011,36：238-246)。用三羥甲基氨基甲烷緩衝食鹽水(Tris buffered saline)洗滌後，視網膜樣本於37℃下在末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)酵素/標記反應混合物中浸泡90分鐘。藉由TdT酵素使地高辛-dUP(digoxigenin-dUTP)與DNA的3'-OH末端結合促使反應開始，接著於與過氧化物酶(peroxidase)共軛的抗地高辛抗體中培養。一旦透過一終止緩衝液終止標記反應的進行，該視網膜切片進 行一以二甲基聯苯胺(3,3' diaminobenzidine)作為顯色過氧化物酶受質的標準辣根過氧化酵素(streptavidin-horseradish peroxidase；HRP)的反應，並用甲基綠(methyl green)對比染色。每個視野下之TUNEL陽性細胞的平均數如前所述計算(Peng PH,Chao HM,Juan SH,Chen CF,Liu JH,Ko ML：Pharmacological preconditioning by low dose cobalt protoporphyrin induces heme oxygenase-1 overexpression and alleviates retinal ischemia-reperfusion injury in rats.Current eye research 2011,36：238-246)。
視網膜神經節細胞的回溯標記
其如前所述，於麻醉後，在大鼠的頭皮製造2公分的切口，並鑽出兩個小孔以深入頭蓋骨顱(Peng PH,Chao HM,Juan SH,Chen CF,Liu JH,Ko ML：Pharmacological preconditioning by low dose cobalt protoporphyrin induces heme oxygenase-1 overexpression and alleviates retinal ischemia-reperfusion injury in rats.Current eye research 2011,36：238-246)。接著，透過微量滴管將2μl的5%螢光金(fluorogold)(Sigma-Aldrich公司)注射入頭蓋骨下深度3.8、4.0和4.2mm的位置。視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell；RGC)回溯免疫標記三天後，於動物的右眼進行高眼球內壓(HIOP)手術，而對側眼則進行假程序手術。輕輕取出視網膜，將其固定，解剖並如前所述進行後續動作(Peng PH,Chao HM,Juan SH,Chen CF,Liu JH,Ko ML：Pharmacological preconditioning by low dose cobalt protoporphyrin induces heme oxygenase-1 overexpression and alleviates retinal ischemia-reperfusion injury in rats.Current eye research 2011,36：238-246)。RGC的平均密度定義為計算全部RGC數量佔總視網膜面積之比率(Peng PH, Chao HM,Juan SH,Chen CF,Liu JH,Ko ML：Pharmacological preconditioning by low dose cobalt protoporphyrin induces heme oxygenase-1 overexpression and alleviates retinal ischemia-reperfusion injury in rats.Current eye research 2011,36：238-246)。
各種視網膜的mRNA濃度之測量
利用即時反轉錄聚合酵素鏈反應(real-time PCR)技術對Thy-1和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的視網膜mRNA濃度進行研究(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708)。於先給予上述化合物之視網膜缺血手術或假程序手術後一天，將動物犧牲並對視網膜取樣進行處理如先前所述(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708)。萃取視網膜的RNA，且於2μg的去氧核糖核酸酶(DNase)處理的RNA中進行第一鏈互補DNA(complementary DNA；cDNA)的合成。第一鏈cDNA隨後進行即時PCR。PCR和循環的進行如先前的指示(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708)。利用β-肌動蛋白(β-actin)為內部控制組進行相對定量。此過程將mRNA目標(target)(Ct)的測量標準化，並對總RNA的量之變化考量應用到每個反應(△Ct)上。相對Thy-1/MMP-9的量之差異是以相對於關於校準儀之控制組的倍率變化進行測量(△△Ct)。mRNA量的相對測量是基於2-△△Ct的公式作說明(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708)。從AB應用生物系統公司(AB Applied Biosystems)購買PCR試劑、軟體和機器。收集的結果是由每個管理員一個一個進行比較，並測量相對應於控制組的總百分比之變化。如表1中所述，以下的PCR之寡核苷酸引子(oligonucleotide primer)(β-actin、Thy-1及MMP-9)是從MISSION BIOTECH(台北，台灣)所購得。
F：正向(forward)；R：反向(reverse)；s：秒
西方墨點分析
於先給予相關化合物之視網膜缺血手術或假程序手術後一天，將動物犧牲。回收視網膜樣本，並於溶解緩衝液及哺乳動物蛋白提取試劑(Pierce，IL)中進行超聲波處理(sonicate)。如先前所述，等量變性蛋白(30μg/20μl/孔)於十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺膠凝體電泳中處理(SDS-PAGE；Bio-Rad公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)(Chao HM,Chuang MJ,Liu JH,Liu XQ,Ho LK,Pan WHT,Zhang XM,Liu CM,Tsai SK,Kong CW,Lee SD,Chen MM,Chao FP：Baicalein protects against retinal ischemia by antioxidation,antiapoptosis,downregulation of HIF-1alpha,VEGF,and MMP-9 and upregulation of HO-1.J Ocul Pharmacol Ther 2013,29：539-549)。硝酸纖維素印跡(nitrocellulose blots；NC)於4℃下與各種初級抗體浸泡12小時，其中該初級抗體包含：小鼠單株抗體[AC-15]抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體(1：5000；Abcam公司，劍橋，英國)、兔單株抗體Bcl-2(50E3；1：1000；細胞信號，丹弗斯，MA 01923，美國)、小鼠單株抗體HO-1(Ab 13248)(1：1000；Abcam公司公司，劍橋，英國)，小鼠單株抗體P-p38 MAPK(1：1000；細胞信號，丹弗斯，MA 01923，美國)、兔單株抗體p38 MAPK(1：1000；細胞信號，丹弗斯，MA 01923，美國)和兔單株抗體MMP-9(EP1255Y；1：1000；Abcam公司，劍橋，英國)。如前所述，該印跡於37℃下與相關的二級抗體、辣根過氧化物酶共軛的山羊之抗兔或抗小鼠的IgG(1：5000或1：2000，Amersham公司)浸泡1小時。最後，於膜上建立和暴露(Chao HM,Chuang MJ,Liu JH,Liu XQ,Ho LK,Pan WHT,Zhang XM,Liu CM,Tsai SK,Kong CW,Lee SD,Chen MM,Chao FP：Baicalein protects against retinal ischemia by antioxidation,antiapoptosis,downregulation of HIF-lalpha,VEGF,and MMP-9 and upregulation of HO-1.J Ocul Pharmacol Ther 2013,29：539-549)，然後掃視密度以評估各蛋白質的量。
凝膠酶譜法(Gel zymography)
用前述之西方墨點分析法之類似的方法製備蛋白質樣本；然後這些樣本用含有0.1%明膠(gelatin)之10%Tris-甘胺酸膠作為蛋白酶受質 進行裝載到和分離(Marecko I,Cvejie D,Selemetjev S,Paskas S,Tatic S,Paunovic I,Savin S：Enhanced activation of matrix metalloproteinase-9 correlates with the degree of papillary thyroid carcinoma infiltration.Croat Med J 2014,55：128-137)。透過電泳分離後，將凝膠於室溫下在復性緩衝液(renaturation buffer)(2.7%的Triton X-100於中蒸餾水中)中以輕微振盪培養30分鐘。倒掉復性緩衝液，以顯影緩衝液(developing buffer)(50mmol/L的Tris base，40mmol/L的鹽酸，200mmo/L的氯化鈉，5mmol/L的氯化鈣，0.2%的Brij 35)取代。以顯影緩衝液均衡30分鐘後，將凝膠於37℃下在新鮮的顯影緩衝液培養48小時。於顯影後，以0.5%考馬斯藍(Coomassie blue)R-250將凝膠染色30分鐘，然後適當地脫色。然後透過掃描光密度法對可見條帶進行分析。
統計分析
三個或以上的組別以單向變異數分析(ANOVA)進行比較。進一步以杜克多重比較測試(Tukey multiple-comparison test)來比較控制組(例如，媒劑處理之缺血性視網膜)和其他組(例如，杞菊地黄丸處理之缺血性視網膜)。p值<0.05時，定義為有顯著差異。
結果
杞菊地黄丸對b波的影響
圖1A及1B顯示杞菊地黄丸(CJDHW)對視網膜缺血加再灌注(I//R)的影響，其係根據視網膜電位圖(electroretinogram；ERG)的結果。在假程序的視網膜(假程序(sham)，圖1A)中，ERG的b波計算在0.98mV。視網膜缺血加再灌注1天後，b波大大地下降。這種下降並不受先給予 媒劑(Vehicle)的影響(I/R+媒劑：0.11mV，圖1A)。然而，先給予CJDHW(I/R+CJDHW 2.8g/kg/天；I/R+CJDHW 4.2g/kg/天)會呈現劑量反應形式抵消缺血所誘發的b波下降之情況，且b波值分別提高至0.26和0.39mV(於缺血加再灌注(I/R)後1天)。
如圖1B所示(數量為5)，與缺血前b波率(作為基準線，0天：0.95±0.04)相比，先給予媒劑的I/R(I/R+媒劑)後第1、3、5及7天，存在b波率明顯下降之情況(第1天：0.44±0.03；第3天：0.44±0.02；第5天：0.37±0.02；第7天：0.38±0.01)(p<0.05)。然而，在先給予杞菊地黄丸(CJDHW)(I/R+CJDHW)後，存在劑量反應相關形式(2.8g對4.2g/kg/天)和顯著(p<0.05；在2.8及4.2g/kg/天)地緩解缺血誘發的b波率下降之情況，於缺血後第1天(0.66±0.03對0.72±0.03)、第3天(0.70±0.02對0.78±0.02)、第5天(0.68±0.02對0.80±0.01)及第7天(0.69±0.02對0.81±0.01)。此外，缺血前b波率(第0天)記錄為0.99±0.05對0.93±0.05。
另一方面(未示於圖中；數量為5)，當與缺血前之b波率(第0天作基準線：1.04±0.04)相比，I/R後第7天與缺血後給予媒劑，b波率顯著下降(0.34±0.08)(p<0.05)。相反地，I/R後第7天與缺血後給予CJDHW，會有濃度依賴性(2.8對4.2g/kg/天)且顯著(p<0.05；4.2g/kg/天)地改善缺血所誘發的b波率下降之情況(0.56±0.07與0.61±0.07)。
當對ERG的b波率進行比較時(假程序的眼對另一側的正常眼)，於假程序前(第0天)與假程序後(第1、3、5及7天)之ERG的b波率 之間並無顯著差異。
CJDHW對HE染色的各種視網膜層之厚度的影響
圖2A至2J及表2顯示4組來自相似偏心度(從視盤偏1mm)的視網膜切片(數量為4~6)，其中可看出當與假程序之視網膜相比(假程序後第1天(sham 1 day)：整個視網膜：174.0±1.66μm，內核層(INL)：40.08±1.43μm，內叢層(IPL)：41.29±1.01μm(圖2A及2E)；假程序後第7天(sham 7 day)：整個視網膜：180.25±1.77μm，INL：38.10±0.57μm，IPL：38.38±0.58μm(圖2F及2J))，先給予媒劑(Vehicle)之缺血加再灌注1和7天(I/R 1 day+Vehicle(圖2B及2E)對I/R 7 day+Vehicle(圖2G及2J))之INL(33.13±1.44μm對24.74±1.61μm)、IPL(36.06±0.76μm對20.34±0.80μm)及整個視網膜(162.42±2.98μm對141.02±4.24μm)的厚度均顯著變薄(* p<0.05；* * p<0.01)。以CJDHW劑量依賴性的動物處理(於2.8g/kg/天有些微的影響；I/R 1 day+CJDHW 2.8之整個視網膜：165.95±4.40μm，INL：37.52±1.05μm，IPL：37.16±2.28μm(圖2C及2E)；I/R 7 day+CJDHW 2.8之整個視網膜：156.18±3.96μm，INL：29.23±2.71μm，IPL：26.20±1.80μm(圖2H及2J))顯著(†p<0.05；††p<0.01；在4.2g/kg/天)抵消缺血加再灌注之效果(I/R 1 day+CJDHW 4.2之整個視網膜：172.25±2.51μm，INL：38.99±1.85μm，IPL：39.14±0.92μm(圖2D及2E)；I/R 7 day+CJDHW 4.2之整個視網膜：171.78±5.19μm，INL：34.45±2.01μm，IPL：33.53±0.92μm(圖2I及2J))。遭受視網膜缺血及接收不同界定試劑之眼睛的各種分層之厚度的定量分析示於圖2E及2J。在缺血後的第7天，相比於假程序組(sham：76.48±0.70μm)，缺血明顯減少內視網膜層 之厚度(INL+IPL：45.08±1.28μm)。這顯著減少的量可被CJDHW以劑量反應形式顯著性地降低(2.8g/kg/天：55.43±3.81μm；4.2g/kg/天：67.98±2.74μm，未示於圖中)。
§與控制組的視網膜相比(假程序後第1或7天(sham 1 day，數量為8；sham 7 day，數量為6))，先給予媒劑之視網膜缺血加再灌注1或7天(I/R 1 day+Vehicle，數量為4；I/R 1 day+Vehicle，數量為5)之整個視網膜、INL及IPL的厚度有顯著下降(* p<0.05；** p<0.01)。相反地，以CJHDW先處理會以劑量依賴性形式(在2.8g/kg/天有些微功效，I/R+CJDHW 2.8，數量為4)及顯著抑制這種顯著下降的情況(†P<0.05；††P<0.01；I/R+CJDHW 2.8；I/R+CJDHW 4.2，數量為4)。結果以平均值±SEM表示(μm)。CJDHW 4.2：4.2g/kg/天的CJDHW；INL：內核層；IPL：內叢層。
CJDHW對ChAT免疫標記的影響
在圖3A至3J和表3(數量=6)中，於假程序後第1及7天(控制組：圖3A及3E；圖3F及3J)，在內核層(inner nuclear layer；INL)和神經節細胞層(ganglion cell layer；GCL)上，膽素乙醯基轉換酶(ChAT)免疫標記(以紅色表示)與無軸突細胞體(amacrine cell body)(以短箭頭表示)有相關(假程序後1天(sham 1d)：34.33±2.70個細胞/視野(圖3A及3E)；假程序後7天(sham 7d)：36.83±2.73個細胞/視野(圖3F及3J))；此外，其如前所述，於內叢層(inner plexiform layer；IPL)中，其神經突起以2階層圖像(2-strata picture)呈現(以長箭頭表示)(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708)。在經歷先給予媒劑之缺血視網膜上，且於視網膜缺血加再灌注1和7天後，無軸突細胞體的免疫標記幾乎不存在(I/R 1d+Vehicel：12.67±1.15個細胞/視野(圖3B及3E)；I/R 7d+Vehicel：13.17±1.66個細胞/視野(圖3G及3J)。此外，IPL的免疫反應急劇下降。最重要的是，當先給予低劑量(2.8g/kg/天)或高劑量(4.2g/kg/天)的CJDHW時，會呈現劑量反應形式使I/R的作用顯著衰減(I/R 1d+CJDHW 2.8g/kg/天：28.33±0.88個細胞/視野(圖3C及3E)；I/R 7d+CJDHW 2.8g/kg/天：23.50±1.41個細胞/視野(圖3H及3J)；I/R 1d+CJDHW 4.2g/kg/天：31.67±1.59個細胞/視野(圖3D及3E)；I/R 7d+CJDHW 4.2g/kg/天：28.50±1.88個細胞/視野(圖3I及3J))。
表3、膽素乙醯基轉換酶(ChAT)免疫標記 §與控制組的視網膜相比(假程序(sham)後第1或7天)，先給予媒劑之視網膜缺血加再灌注(I/R 1 day+Vehicle)1或7天之內核層及神經節細胞層中每個視野下ChAT免疫標記的無軸突細胞數量顯著降低(* p<0.05)。與此相反，藉由以CJHDW先處理會以劑量依賴性形式(在2.8g/kg/天有些微功效，I/R+CJDHW 2.8)及顯著抑制這種顯著下降的情況(†P<0.05；I/R+CJDHW 2.8；I/R+CJDHW 4.2)。結果以平均值±SEM表示(μm；數量為6)。CJDHW 4.2：4.2g/kg/天的CJDHW；INL：內核層；IPL：內叢層。
CJHDW對中間絲蛋白或GFAP免疫反應性的影響
如圖4A至4R所示，假程序後第1和7天(控制組：sham 1d(圖4B)；sham 7d(圖4K))，米勒細胞(Müller cell)的突起之中間絲蛋白(vimentin)免疫標記從末支(end foot)延伸至內叢層(IPL)以及進入內核層(INL)和外核層(outer nuclear layer；ONL)，其如前所述(Chao HM,Chen IL,Liu JH：S-allyl L-cysteine protects the retina against kainate excitotoxicity in the rat.Am J Chin Med.2014,42(3)：693-708)。先給予媒劑之I/R後第1及7天，抗中間絲蛋白的免疫標記增強(I/R 1d+Vehicle(圖4C)；I/R 7d+Vehicle(圖4L))。然而，先給予低劑量(I/R 1d+CJDHW 2.8g/kg/天(圖4D)；I/R 7d+CJDHW 2.8g/kg/天(圖4M))或高劑量(I/R 1d+CJDHW 4.2 g/kg/天(圖4E)；I/R 7d+CJDHW 4.2g/kg/天(圖4N))的CJDHW可減緩缺血造成的影響。利用4,6-二脒基-2-苯基吲哚-二氫化氯(DAPI)(以藍色呈現(圖4A及4J))對正常控制組的細胞核進行免疫染色。
當與控制組的視網膜(sham 1d(圖4F)；sham 7D(圖4O))相比時，已先給予媒劑(Vehicle)之視網膜缺血後第1及7天，其抗膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)免疫反應性也增強(I/R 1d+Vehicle(圖4G)；I/R 7d+Vehicle(圖4P))。藉由先給予低劑量(I/R 1d+CJDHW 2.8g/kg/天(圖4H)；I/R 7d+CJDHW 2.8g/kg/天(圖4Q))或高劑量(I/R 1d+CJDHW 4.2g/kg/天(圖4I)；I/R 7d+CJDHW 4.2g/kg/天(圖4R))的CJDHW可使這種增強失效。
CJDHW對RGC層中凋亡細胞的出現之影響
在表4中(數量為5)，和假程序後第1及7天的控制組的視網膜相反(sham 1d和sham 7d：無TUNEL陽性細胞)，先給予媒劑之缺血後第1及7天的視網膜於視網膜神經節細胞(RGC)層上有明顯較多的TUNEL陽性細胞出現(I/R+Vehicel第1天：1.40±0.25個細胞/視野；第7天：1.4±0.24個細胞/視野)(** p<0.01)。當已先給予低劑量或高劑量的CJDHW之缺血後第1及7天會呈現劑量反應形式且顯著地減緩這種增加(於2.8g/kg/天時具有較少影響；於I/R+CJDHW 2.8第1天：0.80±0.20個細胞/視野；第7天：0.80±0.37個細胞/視野)(I/R+CJDHW 4.2第1天：0.40±0.25個細胞/視野；第7天：0.60±0.24個細胞/視野；†p<0.05)。
表4、TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶調介脫氧尿苷三磷酸切口末端標記)
視網膜神經節細胞回溯之螢光金免疫標記
在圖5和表5(數量為3)，於假程序(sham)後第1和7天之視網膜神經節細胞(RGC)的密度為1952.16±72.33(sham 1d)和1737.23±87.72個細胞/平方公釐(mm2)(sham 7d)。相比之下，先給予媒劑之視網膜缺血後第1和7天，其RGC的密度明顯降低至929.01±77.94(I/R 1d+Vehicel)和887.73±91.32(I/R 7d+Vehicel)。這種降低會以劑量反應的方式被減緩(於2.8g/kg/天時具有較少的影響；I/R 1d+CJDHW 2.8：1112.65±94.74個細胞/平方公釐；I/R 7d+CJDHW2.8：941.89±22.47個細胞/平方公釐)。當給予高劑量的CJDHW時，這種減緩會更明顯(I/R+1d CJDHW 4.2g/kg/天：1691.36±137.16；I/R 7d+CJDHW 4.2g/kg/天：1389.02±30.72)。
N：細胞數量
CJDHW於Thy-1及MMP-9之視網膜的mRNA濃度的影響
如圖6和表6所示(Thy-1：數量為5；MMP-9：數量為3~4)，在與控制組之假程序的視網膜相比，於視網膜缺血24小時後，先給予媒劑之缺血性視網膜的Thy-1和MMP-9的比率明顯改變(**p<0.01)。和先給予媒劑之缺血性視網膜相比，經歷先給予CJDHW之缺血性視網膜呈現相關劑量反應形式(於2.8g/kg/天時有些微效果)且明顯地使MMP-9的過量表現無效(4.2g/kg/天；p<0.05)並減弱Thy-1的抑制表現(4.2g/kg/天；p<0.05)。
CJDHW對活體內視網膜蛋白(即相對於β-肌動蛋白的蛋白表現量之Bcl-2、HO-1、P-p38 MAPK及MMP-9)之蛋白表現量的影響
如圖7和表7所示(Bcl-2的數量為4~9；HO-1的數量為4；P-p38的數量為5~9；MMP-9數量為5)，與控制組的假程序之視網膜相反(於假程序後24小時)，先給予媒劑(vehicle)之視網膜缺血加再灌注24小時出現B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2；Bcl-2)的比率顯著下降之情況(* p<0.05)，或第一型血紅素氧化酶(heme oxygenase-1；HO-1)、磷酸化p38(P-p38)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的比率顯著增加(*p<0.05或**p<0.01)。相反的，在先給予CJHDW及/或SB203580(p38 MAPK抑制劑)後，這些顯著的變化會以呈現劑量反應形式(於CJDHW 2.8時有些微效果)，並 顯著改變(I/R+CJDHW 2.8或I/R+CJDHW 4.2，†P<0.05；I/R+SB203580，†P<0.05或††p<0.01)，以及進一步的顯著增加HO-1的蛋白表現量(I/R+CJDHW 4.2，†p<0.05)。儘管有上述的變化，和各界定的組別交叉比對後，在視網膜上的總p38蛋白的表現量保持不變(未顯示數據)。
當藉由酶譜(zymography)檢測在視網膜中MMP-9的活性(圖8及表8；數量為4~5)，與假程序之對照組的視網膜(假程序；sham)(假程序後24小時)相反，先以媒劑(DMSO)處理的缺血性視網膜(I/R+媒劑(I/R+vehicle))於缺血後24小時的MMP-9反應明顯增強(**p<0.01)。然而，相對於先給予媒劑的缺血性視網膜，先給予CJDHW或SB203580(p38 MAPK抑制劑)的缺血性視網膜證明一相關的劑量反應形式(於2.8g/kg/天CJDHW有些微影響)且顯著緩解MMP-9活性的增加(I/R+CJDHW 4.2和I/R+SB203580，†† p<0.01)。
一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之方法乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。
本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。
說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。
在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本 發明之申請專利範圍內。
<110> 趙效明 謝志強
<120> 杞菊地黄丸的使用於視網膜缺血及其相關疾病，病況或病狀的治療
<130> 2629-CHM-TW
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌動蛋白正向引子
<220>
<221> 引子結合
<222> (1)..(20)
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌動蛋白反向引子
<220>
<221> 引子結合
<222> (1)..(20)
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thy-1正向引子
<220>
<221> 引子結合
<222> (1)..(20)
<400> 3
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thy-1反向引子
<220>
<221> 引子結合
<222> (1)..(21)
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基質金屬蛋白酶9正向引子
<220>
<221> 引子結合
<222> (1)..(20)
<400> 5
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基質金屬蛋白酶9反向引子
<220>
<221> 引子結合
<222> (1)..(23)
<400> 6

Claims (8)

  1. 一種組合物用於製備治療非由糖尿病引起之視網膜缺血或其相關疾病、病況或病症的藥物之用途，其中該組合物係由一杞菊地黄丸，其中該杞菊地黄丸包括一熟地黃(Rehmanniae Radix Preparata)、一山茱萸(Corni Fructus)、一山藥(Rhizoma Diocoreae)、一茯苓(Poria)、一牡丹皮(Cortex Moutan Redicis)、一澤瀉(Alismatis Rhizoma)、一枸杞(Fructus Lycii)及一菊花(Chrysanthemi Flos)所組成。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物進一步包含一蜂蜜。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該視網膜缺血的該相關疾病、病況或病症包含視網膜血管阻塞(retinal vascular occlusion)、青光眼(glaucoma)或一老年性黃斑部病變(age related macular degeneration)。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該藥物作用在哺乳動物。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該哺乳動物是人類。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該杞菊地黄丸的劑量範圍為0.1至2克/公斤體重/天。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該杞菊地黄丸的劑量範圍為0.4至0.7克/公斤體重/天。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該藥物係經口服投藥。
TW105138952A 2015-11-27 2016-11-25 杞菊地黄丸的使用於視網膜缺血及其相關疾病，病況或病狀的治療 TWI623328B (zh)

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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103230556A (zh) * 2013-05-15 2013-08-07 周富贵 一种治疗肝硬化、肝癌的中药及其制作方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040058015A1 (en) * 2000-06-01 2004-03-25 Yuanjin Tao Compositions and methods for treating eye discomfort and eye disease
CN1362183A (zh) * 2001-01-02 2002-08-07 杨孟君 一种纳米杞菊地黄制剂药物及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103230556A (zh) * 2013-05-15 2013-08-07 周富贵 一种治疗肝硬化、肝癌的中药及其制作方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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何扳龍等,"杞菊地黄丸治療2 型糖尿病背景型視網膜病變的 近、遠期療效觀察",中國醫藥導報,2009 年8 月第6 卷第24 期,第83、118頁.
劉國君,"杞菊地黄丸對糖尿病視網膜病變的保護作用",河北中醫藥學報, 2012 年第27 卷第1 期,第45～46頁.
劉國君,"杞菊地黄丸對糖尿病視網膜病變的保護作用",河北中醫藥學報, 2012 年第27 卷第1 期,第45～46頁. 何扳龍等,"杞菊地黄丸治療2 型糖尿病背景型視網膜病變的 近、遠期療效觀察",中國醫藥導報,2009 年8 月第6 卷第24 期,第83、118頁. *

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