JP2024504413A - 視神経疾患治療用複合体、その調製方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
視神経疾患を治療するためのtFNA-miR22複合体が開示され、この複合体は、1:(1-4)のモル比に従って四面体DNAおよびmiR-22から構成される。tFNA-miR22は、網膜神経節細胞のアポトーシスを効果的に抑制し、脳由来神経栄養因子(BDNF)の放出を促進することで、網膜神経節細胞の良好な保護効果を実現することができる。tFNA-miR22を視神経保護薬の調製に使用することで、緑内障を含む神経変性視神経疾患の治療が促進され、tFNA-miR22は非常に高い応用性を有している。
Description
本発明は、生物医学の分野に属する。本発明は、特に、視神経疾患の治療のための複合体、その調製方法および使用に関するものである。
緑内障は、視神経およびその視覚路を脅かし、傷つけることで視覚機能障害を引き起こす疾患群であり、世界の不可逆的な失明原因の第一位となっている。原発開放隅角緑内障は、網膜神経節細胞(RGC)とその軸索の進行性の損傷を特徴とする特定のタイプの視神経疾患であり、特徴的な視神経萎縮および視野欠損を伴うものである。緑内障は潜行性の傾向があり、緩慢に進行し、初期には明らかな症状がなく、視野が徐々に狭くなって失明するまでに至る。中国には2100万人近い緑内障患者がおり、630万人近い失明者と1000万人以上の視覚障害者とを生み出すことになるであろう。
現在、緑内障の主な治療法は、内科的または外科的に眼圧(IOP)を下げ、視神経の損傷を遅延させることである。しかしながら、眼圧を下げるだけでは、網膜神経節細胞死による視神経損傷を完全かつ効果的に予防または回復することはできない。緑内障の患者の中には、眼圧を制御しても網膜神経節細胞の損傷が進行し続け、有効な治療が行われないと完全に視野が失われる場合がある。
視神経保護は、緑内障の治療の難所であると同時に、近年の眼科研究の最先端の活発な分野でもある。現在、臨床で通常使用されているプロスタグランジン、β受容体遮断薬、アドレナリン作動薬、炭酸脱水酵素阻害薬、およびピロカルピンなどの縮瞳薬は、いずれも眼圧降下薬であり、神経保護薬は不足しているのが現状である。
四面体DNA(TDN)は、四面体フレームワーク核酸(tFNA)および四面体DNAナノ構造体とも呼ばれ、4つの一本鎖DNAが変性および再変性を経て、鎖間の塩基対が相補的に形成された四面体のナノ構造体である。これは、合成が容易で生体親和性が高く、通常、特定の薬物のキャリアーとして使用される。特許文献1は、神経幹細胞の増殖、分化および/または移動を促進するための四面体DNAの使用を開示するが、視神経の保護に対する四面体DNAの効果については開示していない。
特許文献2は、網膜神経節細胞の酸化ストレスを防止する薬剤の調製のための四面体DNAの使用を開示し、四面体DNA単独またはmiR-155との複合体が湿性黄斑変性症(AMD)の治療に利用できることを示している。
miR-22は、最も頻繁に研究されているマイクロRNAのうちの1つとして、心臓リモデリング、細胞周期制御、増殖、および分化などの様々な生物学的プロセスに関与し、神経細胞のアポトーシス抑制および脳由来神経栄養因子(BDNF)関連シグナル伝達経路の制御への関与、ならびに各種腫瘍細胞の増殖、侵入、および移動抑制などの様々な抗神経変性および抗腫瘍効果を有する。Romano等は、miR-22が緑内障を予測するための標的遺伝子であることを明らかにしたが、緑内障を治療するための標的遺伝子としてmiR-22を使用することは開示されていない(非特許文献1)。
まとめると、緑内障の治療に四面体DNAやmiR-22を使用した報告はまだなく、ましてや緑内障の治療に視神経保護薬として両者を併用した報告はない。緑内障の治療の困難さを克服するためには、視神経疾患を効果的に治療可能な神経保護薬のさらなる開発が急務となっている。
Romano GL, Platania CB, Forte S, Salomone S, Drago F, Bucolo C. MicroRNA target prediction in glaucoma. Prog Brain Res. 2015;220:217-40.
本発明の課題は、視神経疾患の治療薬を提供することにある。
本発明は、四面体DNAとmiR-22とを1:(1乃至4)のモル比で含む視神経疾患治療用複合体を提供する。
本発明の四面体DNAは、DNA塩基配列設計、相補的対合原理、および各鎖の自動ハイブリダイゼーション組み合わせによって形成される四面体形状の3次元DNAナノ構造体である。本発明において、4つの一本鎖のDNAは、SEQ ID NO.1乃至SEQ ID NO.4に示すヌクレオチド配列を有する。四面体DNAの一本鎖の末端にマイクロRNAを連結することで、四面体DNAとマイクロRNAとの複合体を形成する。本発明において、特定のマイクロRNAは、miR-22である。
さらに、四面体DNAは、相補的塩基対形成を介して4つの一本鎖DNAにより形成され;4つの一本鎖DNAは、それぞれSEQ ID NO.1乃至4に示す配列から1対1で選択される配列を有し;一本鎖DNAのうちの1つまたは2つまたは3つまたはそれぞれの末端はmiR-22に連結され;miR-22はSEQ ID NO.5に示す配列を有する。
さらに、上記miR-22は、四面体DNA構造体を形成する4つの一本鎖DNAのうちの1乃至4つの一本鎖DNAに対して1つ以上の化学結合で連結されている。
さらに、miR-22と一本鎖DNA(複数可)との間にはリンカー配列が存在する。リンカー配列は、ヌクレオチド配列、好ましくはデオキシリボヌクレオチド配列、より好ましくは-TTTTT-であり、これは5個の連続したチミン・デオキシヌクレオチドからなる配列である。
また、本発明は、上記複合体の調製方法であって、四面体DNAの4つの一本鎖DNAを変性させるのに十分な温度で10分よりも長く維持した後に、2乃至8℃に温度を下げ、20分よりも長く維持し;上記した4つの一本鎖DNAのうちの1つ以上をmiR-22に連結する方法を提供する。
さらに、4つの一本鎖の四面体DNAを95℃で10分間維持した後に、4℃に温度を下げ、20分間維持する。
また、本発明は、視神経疾患を治療するための医薬品の調製において上記複合体を使用する。さらに、前記視神経疾患治療薬は、視神経保護薬であり;好ましくは、視神経疾患は、網膜神経節細胞損傷、および/または網膜神経節細胞アポトーシスに関連付けられる。本薬剤は、網膜神経節細胞の損傷を遅延させ、網膜神経節細胞のアポトーシスを抑え、網膜神経節細胞の生存を促進することができ;より好ましくは、前記網膜神経疾患は脳由来神経因子(BNDF)関連シグナル伝達経路と関連付けられており、本薬剤はBDNFの放出を促進できる。
さらに、視神経疾患は緑内障であり、特に、原発性開放隅角緑内障である。
また、本発明は、上記の視神経疾患治療用複合体および薬学的に許容される賦形剤を含有する、視神経疾患治療用医薬組成物を提供する。
また、本発明は、本発明の四面体DNAおよびmiR-22の複合体または本発明の医薬組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、視神経疾患の治療および/または予防のための方法を提供する。視神経疾患は、好ましくは緑内障である。
実験の結果、本発明の四面体DNAとmiR-22との複合体であるtFNA-miR22は、N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)によって誘導される網膜神経節細胞のアポトーシスを効果的に抑制し、脳由来神経栄養因子(BDNF)の放出を促進し、網膜神経節細胞の保護作用を十分に発揮できることが分かった。tFNA-miR22を視神経保護薬の調製に応用することで、緑内障を含む神経変性視神経疾患の治療に役立つと考えられ、相当高い応用性が期待される。
もちろん、本発明の上記内容によれば、本発明の上記基本的な技術的思想を逸脱することなく、当該分野における一般的な技術常識および慣用手段に従って、他の様々な形態の修正、置換、あるいは改変を行うことができることは明らかである。
以下、本発明の上記内容について、実施例による具体的な実施形態によりさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明の上記課題の範囲を以下の実施例に限定するものと解釈されるべきではない。上記発明の内容に基づいて実施される全ての技術は、本発明の範囲に属するものである。
本発明で使用する原料および装置は、周知の製品であり、市販されているものである。
実施例1.tFNAとmiR-22との複合体(tFNA-miR22)の合成
4つのDNA一本鎖(うち1つは末端がmiR22に接続されている)(S1、S2、S3-miR22、S4)を、TM Buffer(10mMのTris-HCl, 50MmのMgCl2,pH=8.0)に、4つのDNA一本鎖それぞれについて最終濃度が1000nMになるように溶解し、十分に混合し、95℃まで急速加熱して10分間維持し、その後4℃に急速冷却して20分間以上維持し、tFNA-miR22を得た。
4つの一本鎖(5’→3’)の配列は以下の通りであった:
4つのDNA一本鎖(うち1つは末端がmiR22に接続されている)(S1、S2、S3-miR22、S4)を、TM Buffer(10mMのTris-HCl, 50MmのMgCl2,pH=8.0)に、4つのDNA一本鎖それぞれについて最終濃度が1000nMになるように溶解し、十分に混合し、95℃まで急速加熱して10分間維持し、その後4℃に急速冷却して20分間以上維持し、tFNA-miR22を得た。
4つの一本鎖(5’→3’)の配列は以下の通りであった:
S1:
ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGA
(SEQ ID NO.1)
ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGA
(SEQ ID NO.1)
S2:
ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTC
(SEQ ID NO.2)
ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTC
(SEQ ID NO.2)
S3:
ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATC
(SEQ ID NO.2)
ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATC
(SEQ ID NO.2)
S3:
ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATC
(SEQ ID NO.3)
ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATC
(SEQ ID NO.3)
S4:
ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCC
(SEQ ID NO.4)
ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCC
(SEQ ID NO.4)
miR-22:
AAGCUGCCAGUUGAAGAACUG
(SEQ ID NO.5)
AAGCUGCCAGUUGAAGAACUG
(SEQ ID NO.5)
S3-miR22-3p:
AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-TTTTT-ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATC
(SEQ ID NO.6)
AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-TTTTT-ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATC
(SEQ ID NO.6)
ここで、S1の5’末端には、tFNA-22を追跡するためのCy5蛍光標識基が任意に連結されていた。
2.識別
キャピラリー電気泳動およびPAGE電気泳動により、複数のDNA一本鎖、および合成tFNA-miR22が検知された。tFNAおよびtFNA-miR22の形態は、透過型電子顕微鏡で検知した。tFNAおよびtFNA-miR22のゼータ電位および粒子径は、動的光散乱法により検知した。
キャピラリー電気泳動およびPAGE電気泳動により、複数のDNA一本鎖、および合成tFNA-miR22が検知された。tFNAおよびtFNA-miR22の形態は、透過型電子顕微鏡で検知した。tFNAおよびtFNA-miR22のゼータ電位および粒子径は、動的光散乱法により検知した。
3.識別結果
図1乃至3に示すように、電気泳動の結果、tFNA-miR22バンドの分子量は、一本鎖DNAおよび四面体DNAの分子量よりも相当高く、一本鎖DNAが一体的に集合していることが示された。
図1乃至3に示すように、電気泳動の結果、tFNA-miR22バンドの分子量は、一本鎖DNAおよび四面体DNAの分子量よりも相当高く、一本鎖DNAが一体的に集合していることが示された。
図4A乃至図5Dに示すように、透過型電子顕微鏡で四面体構造粒子を検知した。動的光散乱法により、tFNAのゼータ電位は5.6、粒子径は17.96nm、tFNA-miR22のゼータ電位は8.23mV、粒子径は17.18nmであり、tFNA-miR22は正常に合成され安定していたことが分かった。
本発明の有益な効果について、実験例により以下にさらに説明する。実験例に関与するtFNAは、実施例1の方法で調製した。
実験例1:損傷を受けた網膜神経節細胞によるtFNA-miR22の取り込み
1.実験方法
1.1 最適なモデル化濃度の検証(視神経節細胞損傷の生体外シミュレーション)
RGC-5細胞(マウス網膜神経節細胞の一種)を96ウェルプレートで、ウェル当たり1*104個で群培養した。各群を異なる濃度のN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)で1時間処理した後に、完全培地で24時間培養し、CCK-8アッセイにより細胞活性を検知した。その結果,4mMのNMDAの薬物阻害率は約40%であることがわかり、よって、4mMを最適なモデリング濃度として選択した(図6Aおよび図6B)。
1.2 薬剤の最適な抗細胞損傷濃度の試験(細胞増殖実験)
RGC-5細胞を96ウェルプレートで、ウェル当たり1*104個で群培養した。ブランク群を除く各実験群は、4nMのNMDAで1時間処理した後に、0nM、62.5nM、125nM、および250nMのtFNAおよび実施例1で調製したtFNA-miR22、ならびに一本鎖miR-22をそれぞれ含む培養液でさらに24時間培養された。サンプルを採取し、CCK-8アッセイで細胞活性を検知した。その結果、tFNAを62.5nMでは明らかな増殖効果はなかったが、この濃度のtFNA-miR22はRGC-5細胞の増殖を有意に促進した。さらに、NMDA対照群の細胞生存率と比較してtFNA-miR22で処理した細胞生存率の増殖比は、NMDA対照群の細胞生存率と比較してmiR22またはtFNA単独の細胞生存率の増殖比の合計よりもさらに高く、これは、miR22とtFNAとを組み合わせたtFNA-miR22が、NMDA損傷神経節細胞の増殖を促進する相乗的な役割を担っていることを示している。したがって、この実験では62.5nMが最適な薬物濃度として選択された (図6D)。
1.3 損傷した細胞への物質取り込み試験
4mMのNMDAで1時間処理したRGC-5細胞をグループ分けし、続いてCy5標識した一本鎖miR-22(62.5nM)およびtFNA-miR22(62.5nM)にそれぞれ3時間、6時間、12時間、24時間曝露および処理し、損傷群(すなわちtFNAおよびtFNA-miR22で未処理)と比較検討した。全群をリン酸緩衝液で3回洗浄し、フローサイトメトリーで検知した。その結果、tFNA-miR22の蛍光強度は6時間後にピークに達することが分かった(図11)。そこで、上記の方法で6時間処理したRGC-5細胞を選択して細胞スライドを作成し、一本鎖miR-22およびtFNA-miR22の取り込みを免疫蛍光染色で観察した。
1.1 最適なモデル化濃度の検証(視神経節細胞損傷の生体外シミュレーション)
RGC-5細胞(マウス網膜神経節細胞の一種)を96ウェルプレートで、ウェル当たり1*104個で群培養した。各群を異なる濃度のN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)で1時間処理した後に、完全培地で24時間培養し、CCK-8アッセイにより細胞活性を検知した。その結果,4mMのNMDAの薬物阻害率は約40%であることがわかり、よって、4mMを最適なモデリング濃度として選択した(図6Aおよび図6B)。
1.2 薬剤の最適な抗細胞損傷濃度の試験(細胞増殖実験)
RGC-5細胞を96ウェルプレートで、ウェル当たり1*104個で群培養した。ブランク群を除く各実験群は、4nMのNMDAで1時間処理した後に、0nM、62.5nM、125nM、および250nMのtFNAおよび実施例1で調製したtFNA-miR22、ならびに一本鎖miR-22をそれぞれ含む培養液でさらに24時間培養された。サンプルを採取し、CCK-8アッセイで細胞活性を検知した。その結果、tFNAを62.5nMでは明らかな増殖効果はなかったが、この濃度のtFNA-miR22はRGC-5細胞の増殖を有意に促進した。さらに、NMDA対照群の細胞生存率と比較してtFNA-miR22で処理した細胞生存率の増殖比は、NMDA対照群の細胞生存率と比較してmiR22またはtFNA単独の細胞生存率の増殖比の合計よりもさらに高く、これは、miR22とtFNAとを組み合わせたtFNA-miR22が、NMDA損傷神経節細胞の増殖を促進する相乗的な役割を担っていることを示している。したがって、この実験では62.5nMが最適な薬物濃度として選択された (図6D)。
1.3 損傷した細胞への物質取り込み試験
4mMのNMDAで1時間処理したRGC-5細胞をグループ分けし、続いてCy5標識した一本鎖miR-22(62.5nM)およびtFNA-miR22(62.5nM)にそれぞれ3時間、6時間、12時間、24時間曝露および処理し、損傷群(すなわちtFNAおよびtFNA-miR22で未処理)と比較検討した。全群をリン酸緩衝液で3回洗浄し、フローサイトメトリーで検知した。その結果、tFNA-miR22の蛍光強度は6時間後にピークに達することが分かった(図11)。そこで、上記の方法で6時間処理したRGC-5細胞を選択して細胞スライドを作成し、一本鎖miR-22およびtFNA-miR22の取り込みを免疫蛍光染色で観察した。
2.結果
図10A乃至11に示すように、細胞フローサイトメトリーの結果、24時間以内に、tFNA-miR22の蛍光強度は6時間で55.3%のピークに達し、処理時間の増加とともに40.4%まで徐々に減少し、一本鎖miR-22の蛍光強度は処理時間とともに徐々に増加し、24時間で33.5%のピークに達することが確認された。図11の免疫蛍光染色の結果、6時間後のRGC-5の細胞質および核周囲にtFNA-miR22が広く集積し、一本鎖miR-22は主に細胞膜の表面に付着していることが確認された。
図10A乃至11に示すように、細胞フローサイトメトリーの結果、24時間以内に、tFNA-miR22の蛍光強度は6時間で55.3%のピークに達し、処理時間の増加とともに40.4%まで徐々に減少し、一本鎖miR-22の蛍光強度は処理時間とともに徐々に増加し、24時間で33.5%のピークに達することが確認された。図11の免疫蛍光染色の結果、6時間後のRGC-5の細胞質および核周囲にtFNA-miR22が広く集積し、一本鎖miR-22は主に細胞膜の表面に付着していることが確認された。
以上の結果から、tFNA-miR22は損傷を受けたRGC-5細胞により迅速かつ効率的に取り込まれる一方、tFNAに結合していないmiR-22はRGC-5細胞には取り込まれにくいことが分かった。
実験例2:tFNA-miR22によるNMDA誘発細胞傷害の抑制
1.実験方法
RGC-5細胞を4mMのNMDAで1時間処理した後に、62.5nMの一本鎖miR-22、tFNAまたはtFNA-miR22で24時間処理し、以下のように検知した:
1)細胞の形態は位相差顕微鏡で観察した;
2)細胞周期はフローサイトメトリーで検知した;
3)細胞アポトーシス率は、フローサイトメトリーで検知した;
4)Bax、カスパーゼ3、Bcl-2の発現を免疫蛍光法およびウェスタンブロットで検知した。
RGC-5細胞を4mMのNMDAで1時間処理した後に、62.5nMの一本鎖miR-22、tFNAまたはtFNA-miR22で24時間処理し、以下のように検知した:
1)細胞の形態は位相差顕微鏡で観察した;
2)細胞周期はフローサイトメトリーで検知した;
3)細胞アポトーシス率は、フローサイトメトリーで検知した;
4)Bax、カスパーゼ3、Bcl-2の発現を免疫蛍光法およびウェスタンブロットで検知した。
2.結果
1)図6Cにより、tFNA-miR22は顕著な細胞毒性を示さず、tFNA-miR22の生物学的安全性が良好であることが示された。
2)図6Eは、tFNAおよび一本鎖miR-22と比較して、tFNA-miR22は網膜神経節細胞の形態を有意に保護できることを示す。
3)図12は、tFNAおよび一本鎖miR-22と比較して、tFNA-miR22は細胞の分裂を制御することにより、細胞の自己再生を有意に促進できることを示している。また、NMDA処理細胞の分裂が影響を受け、対照群と比較して、NMDA群ではG2-M期の細胞の割合が相当減少し、tFNAまたはmiR22単独処理後に、G2-M期の細胞の割合がさらに減少したことが明確に分かる。しかしながら、tFNA-miR22で処理すると、G2-M期の細胞の割合が有意に増加し、NMDA干渉のない対照群に匹敵するほどであった。tFNAとmiR-22との併用は、これらを単独で使用する場合と比較して、逆の効果があることがわかる。これらは互いに相乗効果を発揮し、細胞の分裂および自己再生を相当促進することができる。
4)図13乃至17は、tFNA-miR22が、tFNAや一本鎖miR-22と比較して、NMDA誘発アポトーシスを抑制できること、すなわち、tFNA-miR22がNMDA誘発のアポトーシスタンパク質カスパーゼおよびBaxの発現量上昇を抑え、NMDA誘発の抗アポトーシスタンパク質BCL-2の発現量下降を抑えることを示した。
1)図6Cにより、tFNA-miR22は顕著な細胞毒性を示さず、tFNA-miR22の生物学的安全性が良好であることが示された。
2)図6Eは、tFNAおよび一本鎖miR-22と比較して、tFNA-miR22は網膜神経節細胞の形態を有意に保護できることを示す。
3)図12は、tFNAおよび一本鎖miR-22と比較して、tFNA-miR22は細胞の分裂を制御することにより、細胞の自己再生を有意に促進できることを示している。また、NMDA処理細胞の分裂が影響を受け、対照群と比較して、NMDA群ではG2-M期の細胞の割合が相当減少し、tFNAまたはmiR22単独処理後に、G2-M期の細胞の割合がさらに減少したことが明確に分かる。しかしながら、tFNA-miR22で処理すると、G2-M期の細胞の割合が有意に増加し、NMDA干渉のない対照群に匹敵するほどであった。tFNAとmiR-22との併用は、これらを単独で使用する場合と比較して、逆の効果があることがわかる。これらは互いに相乗効果を発揮し、細胞の分裂および自己再生を相当促進することができる。
4)図13乃至17は、tFNA-miR22が、tFNAや一本鎖miR-22と比較して、NMDA誘発アポトーシスを抑制できること、すなわち、tFNA-miR22がNMDA誘発のアポトーシスタンパク質カスパーゼおよびBaxの発現量上昇を抑え、NMDA誘発の抗アポトーシスタンパク質BCL-2の発現量下降を抑えることを示した。
以上の結果から、tFNA-miR22は、網膜神経節細胞に対して良好な生体安全性および保護効果を有することが示された。tFNA-miR22は、細胞の分裂を制御し、細胞の自己再生を促進し、抗アポトーシスタンパク質BCL-2の発現を増加させてプロアポトーシスタンパク質カスパーゼ3およびBaxの発現を低減できることからNMDAによる細胞損傷を低減し、細胞保護の役割をさらに果たすようになり、tFNAまたは一本鎖miR-22単独よりも相当優れた効果を有している。
実験例3:TrkB/BDNFシグナル伝達経路に対するtFNA-miR22の影響
1.実験方法
RGC-5細胞を実験例2の方法に従って処理し、以下のように検知した:
1)BDNFおよびTrkbタンパク質は、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光法により検知した;
2)BDNFおよびNtrk2の発現量をRT-PCRで検知した;
3)ERK1/2、p-ERK1/2、CREBおよびp-CREBタンパク質は、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光法により検知した。
RGC-5細胞を実験例2の方法に従って処理し、以下のように検知した:
1)BDNFおよびTrkbタンパク質は、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光法により検知した;
2)BDNFおよびNtrk2の発現量をRT-PCRで検知した;
3)ERK1/2、p-ERK1/2、CREBおよびp-CREBタンパク質は、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光法により検知した。
2.結果
1)図18A乃至18Cのウェスタンブロットの検知により、tFNA-miR22処理細胞ではBDNFおよびTrkBの量が有意に上昇することが示された。図18Dおよび図18Eのリアルタイム定量PCRの結果から、tFNA-miR22処理細胞では、Ntrk2およびBDNFの遺伝子発現が他の群と比較して有意に増加したことが示された。
2)図19A乃至19Cのウェスタンブロットの検知により、tFNA-miR22処理細胞ではERKおよびCREBの総タンパク質がある程度増加し、ERK1/2およびCREBのリン酸化を促進できることが示された。
3)図20乃至23に示した上記タンパク質の免疫蛍光法による検知結果は、ウェスタンブロットによる検知結果と一致した。
1)図18A乃至18Cのウェスタンブロットの検知により、tFNA-miR22処理細胞ではBDNFおよびTrkBの量が有意に上昇することが示された。図18Dおよび図18Eのリアルタイム定量PCRの結果から、tFNA-miR22処理細胞では、Ntrk2およびBDNFの遺伝子発現が他の群と比較して有意に増加したことが示された。
2)図19A乃至19Cのウェスタンブロットの検知により、tFNA-miR22処理細胞ではERKおよびCREBの総タンパク質がある程度増加し、ERK1/2およびCREBのリン酸化を促進できることが示された。
3)図20乃至23に示した上記タンパク質の免疫蛍光法による検知結果は、ウェスタンブロットによる検知結果と一致した。
本実験例の目的は、tFNA-miR22が視神経保護作用を発揮するメカニズムをさらに確認することにある。
脳由来成長因子(BDNF)は、特に網膜神経節細胞に対して強力な神経保護作用を発揮する物質である。BDNFは緑内障の重要な神経栄養因子のうちの1つである。BDNFは、その受容体であるTrkBに結合することで、細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK)を活性化し、cAMP応答要素結合タンパク質(CREB)のリン酸化につながり、これにより神経細胞の生存に関連付けられる様々な遺伝子の転写を誘導し、細胞の生存を促進し得る。
以上の結果から、tFNA-miR22はTrkBを選択的に活性化し、下流のシグナル伝達経路(ERK-CREB)を活性化することで、BDNFの放出を促進し、細胞損傷を低減し細胞の生存を促進することが分かった。
実験例4:NMDA誘発視神経損傷モデルマウスのtFNA-miR22による治療
1.実験方法:
NMDA誘発視神経損傷モデルの確立
1)実験動物の選択およびグループ分け:実験対象は、6週齢の健康なオスのC57BL/6Jマウスで、体重は18乃至20gであった。診察の結果、明らかな頚部の曲がりはなく、角膜は透明で、虹彩の血管は明瞭で、瞳孔は大きく丸く、光の反射に敏感であった。実験動物を乱数表法によりABCDE5群にランダムに分け、それぞれブランク対照群、NMDA損傷群、tFNA単独処理群(62.5nM)、miR-22単独処理群、tFNA-miR22処理群(62.5nM)とした。
2)集団治療:マウスを十分に麻酔した後に、各群のマウスの両目を実験眼とし、眼球表面を10%ヨウ素チンキで消毒した。手術用顕微鏡下で、32G針を角膜側縁から1mmの位置に穿刺し、10μLマイクロシリンジで硝子体腔内に2μLの薬剤を注射した。A群:手術なしの正常マウス;B群:最終濃度20μMの生理食塩水で調製したNMDAを2μL注射;C群:NMDA(20μM)1μL+tFNAs(62.5nM)1μLを注射;D群:NMDA(20μM)1μL+miR-22(62.5nM)1μLを注射;E群:NMDA(20μM)+tFNAs-miR22(62.5nM)1μLを注射。術後、結膜嚢にエリスロマイシン眼軟膏を塗布した。視神経の一部を残したまま眼球を摘出する手術の7日後に動物を犠牲にした。以下の形態学的検査を実施した:
A)網膜の組織変化をHE染色で観察した;
B)全網膜フラットマウントの免疫蛍光染色:RGCのカウント;
C)BDNFおよびTkrbの発現は、ルーチン網膜切片の免疫組織化学的IHC染色により観察した。
NMDA誘発視神経損傷モデルの確立
1)実験動物の選択およびグループ分け:実験対象は、6週齢の健康なオスのC57BL/6Jマウスで、体重は18乃至20gであった。診察の結果、明らかな頚部の曲がりはなく、角膜は透明で、虹彩の血管は明瞭で、瞳孔は大きく丸く、光の反射に敏感であった。実験動物を乱数表法によりABCDE5群にランダムに分け、それぞれブランク対照群、NMDA損傷群、tFNA単独処理群(62.5nM)、miR-22単独処理群、tFNA-miR22処理群(62.5nM)とした。
2)集団治療:マウスを十分に麻酔した後に、各群のマウスの両目を実験眼とし、眼球表面を10%ヨウ素チンキで消毒した。手術用顕微鏡下で、32G針を角膜側縁から1mmの位置に穿刺し、10μLマイクロシリンジで硝子体腔内に2μLの薬剤を注射した。A群:手術なしの正常マウス;B群:最終濃度20μMの生理食塩水で調製したNMDAを2μL注射;C群:NMDA(20μM)1μL+tFNAs(62.5nM)1μLを注射;D群:NMDA(20μM)1μL+miR-22(62.5nM)1μLを注射;E群:NMDA(20μM)+tFNAs-miR22(62.5nM)1μLを注射。術後、結膜嚢にエリスロマイシン眼軟膏を塗布した。視神経の一部を残したまま眼球を摘出する手術の7日後に動物を犠牲にした。以下の形態学的検査を実施した:
A)網膜の組織変化をHE染色で観察した;
B)全網膜フラットマウントの免疫蛍光染色:RGCのカウント;
C)BDNFおよびTkrbの発現は、ルーチン網膜切片の免疫組織化学的IHC染色により観察した。
2.結果
1)図8のHE染色の結果、tFNAs-miR22処理後に、網膜の厚みが有意に増加し、神経節細胞の数が有意に増加したことが確認された。
2)図9にフラットマウントの免疫蛍光染色結果を示す。tFNAs-miR22処理後に、神経節細胞数は統計的有意差をもって有意に増加した。tFNA-miR22処理群の神経節細胞数はNMDA対照群に比べ有意に増加し、tFNAまたはmiR22単独処理後の神経節細胞数はNMDA処理群に比べほぼ変化が無かった。
3)図24にIHC染色結果を示す:tFNAs-miR22処理後に、網膜におけるBDNFおよびTkrbの発現が有意に増加した。
1)図8のHE染色の結果、tFNAs-miR22処理後に、網膜の厚みが有意に増加し、神経節細胞の数が有意に増加したことが確認された。
2)図9にフラットマウントの免疫蛍光染色結果を示す。tFNAs-miR22処理後に、神経節細胞数は統計的有意差をもって有意に増加した。tFNA-miR22処理群の神経節細胞数はNMDA対照群に比べ有意に増加し、tFNAまたはmiR22単独処理後の神経節細胞数はNMDA処理群に比べほぼ変化が無かった。
3)図24にIHC染色結果を示す:tFNAs-miR22処理後に、網膜におけるBDNFおよびTkrbの発現が有意に増加した。
このことから、tFNA-miR22群は、他の群と比較して視神経節細胞の生存率を有意に増加させたことが分かり、本発明のtFNA-miR22複合体は視神経保護作用を有し、緑内障を含む神経変性視神経疾患の治療に使用することができ、tFNAおよびmiR-22単独よりも有意に優れた効果を示し、両者が相乗的な効果を有することが示された。
以上のことから、本発明は、緑内障を含む神経変性視神経疾患の治療に使用可能な神経保護薬であって、四面体DNAとmiR-22を1:(1乃至4)のモル比で含むtFNA-miR22からなる神経保護薬を提供する。tFNA-miR22は、損傷を受けたRGC-5細胞に有効に取り込まれるのみならず、網膜神経節細胞のアポトーシスを効果的に抑制し、脳由来神経因子(BDNF)の放出を促進し、網膜神経節細胞に良好な保護作用を発揮することができる。
Claims (14)
- 視神経疾患治療用複合体であって、四面体DNAとmiR-22とを1:(1乃至4)のモル比で含むことを特徴とする複合体。
- 前記四面体DNAが、相補的塩基対形成を介して4つの一本鎖DNAから形成され;前記4つの一本鎖DNAの配列が、SEQ ID NO.1乃至4に示される配列からそれぞれ選択され;前記四面体DNAが、その1つ以上の一本鎖末端で前記miR-22に連結され、前記miR-22がSEQ ID NO.5に示される配列を有することを特徴とする請求項1に記載の複合体。
- 前記miR-22が、前記四面体DNAの構造を形成する4つの一本鎖DNAのうちの1乃至4つに化学結合で連結されていることを特徴とする請求項1または2に記載の複合体。
- 前記miR-22と連結された前記一本鎖DNAとの間にリンカー配列が存在することを特徴とする請求項3に記載の複合体。
- 前記リンカー配列が-TTTTT-であることを特徴とする請求項4に記載の複合体。
- 前記四面体DNAを形成する4つの一本鎖DNAを変性させるために十分な温度に10分よりも長く置いた後に、2乃至8℃に温度を下げて20分よりも長く置くことを特徴とする請求項1乃至5のいずれか1項に記載の複合体の調製方法であって、前記4つの一本鎖DNAのうちの1つ以上が前記miR-22と連結していることを特徴とする複合体の調製方法。
- 前記四面体DNAを形成する前記4つの一本鎖DNAを95℃で10分間置いた後に、4℃まで20分間かけて温度を下げることを特徴とする請求項6に記載の調製方法。
- 視神経疾患の治療のための薬剤の調製における、請求項1乃至5のうちのいずれか1項に記載の前記複合体の使用。
- 前記視神経疾患の前記治療のための前記薬剤は、視神経保護薬であることを特徴とする請求項8に記載の使用。
- 前記視神経疾患は、網膜神経節細胞損傷および網膜神経節細胞アポトーシスに関連付けられる疾患から選択されることを特徴とする請求項8に記載の使用。
- 前記視神経疾患が、脳由来神経原性因子関連シグナル伝達経路の調節と関連付けられていることを特徴とする請求項10に記載の使用。
- 前記視神経疾患は緑内障であることを特徴とする請求項8に記載の使用。
- 請求項1乃至4のうちのいずれか1項に記載の前記複合体および薬学的に許容される賦形剤を含有することを特徴とする視神経疾患治療用医薬組成物。
- 請求項1に記載の前記複合体または請求項13に記載の前記医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、視神経疾患を治療する方法。
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