KR20200137499A

KR20200137499A - 녹내장의 예방 또는 치료용 펩타이드 및 이의 용도

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Publication number: KR20200137499A
Application number: KR1020190063975A
Authority: KR
Inventors: 김유석; 김명환; 김영인; 임택주; 임형준
Original assignee: 주식회사 아이바이오코리아
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2020-12-09

Abstract

본 발명은 녹내장의 예방 또는 치료용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 녹내장의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 녹내장의 예방 또는 치료용 펩타이드는 망막신경절세포의 세포사멸을 억제하고, 시신경 유두 조직의 함몰 또는 변성을 억제하며, 망막신경절세포층에서의 망막신경절세포 소실을 억제하는 활성이 있을 뿐만 아니라 시신경 손상에 의해 과도하게 활성화된 성상교세포(Astrocyte) 또는 미세아교세포(Microglia)의 활성을 억제할 수 있어, 녹내장을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 의약품 및 건강기능식품에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

녹내장의 예방 또는 치료용 펩타이드 및 이의 용도{Peptide for treating or preventing of glaucoma and use thereof}

본 발명은 녹내장의 예방 또는 치료용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

녹내장은 안방수(眼房水)의 순환 장해에 의해 안방수가 축적되고, 지속적으로 안압이 상승하여 시신경이 압박됨으로써, 일시적 또는 영구적인 시야 결손, 시력 저하를 일으키는 것으로 알려져 있는 안질환으로, 일반적인 발병 원인은 안압 상승으로 알려져 있지만, 이밖에 안압이 정상치여도 시신경에 장해가 나타나는 저안압 녹내장, 안압이 높아도 시신경 장애가 나타나지 않는 고안압증도 알려져 있다.

특히, Mohammadali Almasieh 등의 연구결과에 따르면, 모든 형태의 녹내장의 병리생리학에서 망막절 세포(Retinal ganglion cells, RGCs)와 같은 시신경 세포의 사멸이 일어나며, RGC의 사멸을 야기하는 축삭돌기 손상이 활성산소 슈퍼옥사이드에 의해 촉진된다고 보고된 바 있다.

따라서 신경 세포들에서 산화 스트레스를 방지하여 세포 사멸을 억제하는 물질은 녹내장의 발병 및 진행을 억제할 수 있는 치료제로서 활용될 수 있다.

한편, 현재 녹내장의 치료를 위한 방법으로는 약물치료, 레이저 치료, 수술 치료를 수행하고 있으며, 약물 치료로 부작용을 회피하는 국소 투여인 점안제가 주로 사용되고 있고, 임상에서 사용되고 있는 녹내장 치료약에는 교감신경 작동약(α2 아고니스트, 비선택적 아드레날린 작동약 등), 부교감신경 작동약, 교감신경 억제약(α1 블로커, β 블로커, α1 β 블로커 등), 탄산탈수효소 저해약, 고장(高張) 침투압약 등이 있지만, 최근 안압 강하 작용이 강하고 부작용이 비교적 적은 프로스타글란딘계 약제가 제1의 선택약으로 부상하고 있다. 그러나 아직까지 근본적으로 시신경 세포의 사멸을 억제할 수 있는 녹내장의 치료약은 개발되지 못하고 있는 실정이다.

대한민국 공개특허 10-2018-0045845

이에 본 발명자들은 시신경 세포인 망막신경절 세포에서 발생하는 활성산소의 생성을 억제할 수 있고, 망막신경절 세포의 세포사멸을 억제할 수 있으며, 염증물질을 생성하는 활성화된 미세아교세포 및 성상교세포의 활성을 저해하여 녹내장을 효과적으로 개선, 예방 및 치료할 수 있는 치료제로서의 신규 펩타이드를 고안함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 녹내장의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 녹내장의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 녹내장의 치료방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 녹내장의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드는, 망막 유래 광수용체 세포 또는 망막신경절세포의 세포사멸 억제; 시신경 유두 조직의 함몰 또는 변성 억제; 또는 망막신경절세포층에서의 망막신경절세포의 소실 억제; 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드는, 시신경 손상에 의해 활성화된 성상교세포(Astrocyte) 또는 미세아교세포(Microglia)의 활성을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 녹내장의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 녹내장의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 투여는 안구 내, 눈 주위, 안구, 경구, 전신 또는 국소로 투여하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 녹내장의 예방 또는 치료용 펩타이드는 망막신경절세포의 세포사멸을 억제하고, 시신경 유두 조직의 함몰 또는 변성을 억제하며, 망막신경절세포층에서의 망막신경절세포 소실을 억제하는 활성이 있을 뿐만 아니라 시신경 손상에 의해 활성화된 성상교세포(Astrocyte) 또는 미세아교세포(Microglia)의 활성을 억제할 수 있어, 녹내장을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 의약품 및 건강기능식품에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 펩타이드에 의한 세포독성을 확인하기 위해, 본 발명의 펩타이드를 농도별(0.5, 1, 2.5, 5 및 10 μg/mL)로 처리한 후, 세포생존율 변화를 확인한 결과이다.
도 2는 글루탐산에 의해 유도되는 세포사멸에 대한 본 발명의 펩타이드의 세포보호를 확인한 세포생존율 분석 결과이다.
도 3은 글루탐산에 의해 유도되는 세포사멸에 대한 본 발명의 펩타이드의 세포보호를 확인한 TUNEL 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 마우스 동물모델을 이용하여 수행한 실험스케줄을 나타낸 것이다.
도 5는 정상마우스군, 녹내장 유발마우스군 및 녹내장 유발마우스에 본 발명의 펩타이드를 투여한 군을 대상으로, 안압의 변화를 시간별로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 펩타이드 투여직후(0 주차) 망막전위도검사 결과를 나타낸 것으로, 6a는 왼쪽 눈의 분석 결과를 나타낸 것이고, 6b는 오른쪽 눈의 분석 결과를 나타낸 것이다. 또한, 도 6a~도 10b까지의 도면에서 검은색 선은 정상마우스 군을 나타낸 것이고, 파란색 선은 녹내장 유발 마우스군을 나타낸 것이며, 빨간색 선은 녹내장 마우스 군에 본 발명의 펩타이드를 투여한 군을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 펩타이드 투여 후 4주차 망막전위도검사 결과를 나타낸 것으로, 7a는 왼쪽 눈의 분석 결과를 나타낸 것이고, 7b는 오른쪽 눈의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 펩타이드 투여 후 8주차 망막전위도검사 결과를 나타낸 것으로, 8a는 왼쪽 눈의 분석 결과를 나타낸 것이고, 8b는 오른쪽 눈의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 펩타이드 투여 후 12주차 망막전위도검사 결과를 나타낸 것으로, 9a는 왼쪽 눈의 분석 결과를 나타낸 것이고, 9b는 오른쪽 눈의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 펩타이드 투여 후 16주차 망막전위도검사 결과를 나타낸 것으로, 10a는 왼쪽 눈의 분석 결과를 나타낸 것이고, 10b는 오른쪽 눈의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 녹내장 발병 마우스에 본 발명의 펩타이드 투여 시, 손상된 시신경유두 조직의 개선 정도를 H&E 염색방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 녹내장 발병 마우스에 본 발명의 펩타이드 투여 시, 손상된 시신경유두 조직에서의 세포사멸 억제 여부를 확인하기 위해 cleaved Caspase-3 발현세포를 형광현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 13은 녹내장 발병 마우스에 본 발명의 펩타이드 투여 시, 손상된 시신경유두 조직에서의 세포사멸 억제 여부를 확인하기 위해 TUNEL 분석을 수행하고 형광현미경으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 녹내장 유발 시 발생하는 망막신경절 세포손상에 대하여 본 발명의 펩타이드가 망막신경절 세포보호 활성이 있는지 확인하기 위하여, 녹내장 유발 마우스에 본 발명의 펩타이드를 투여한 후, H&E 염색을 통하여 망막신경절세포층 내 망막신경절세포 소실 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 녹내장 유발 시 발생하는 망막신경절 세포손상에 대하여 본 발명의 펩타이드가 망막신경절 세포보호 활성이 있는지 확인하기 위하여, 녹내장 유발 마우스에 본 발명의 펩타이드를 투여한 후, 망막신경절세포의 지표인자인 Brn3a 의 항체를 이용하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 시신경 손상이 일어난 DBA/2 마우스의 활성화된 성상교세포를 본 발명의 펩타이드가 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 본 발명의 펩타이드를 녹내장 유발 마우스에 투여한 후, 활성화된 성상교세포의 지표인 GFAP의 발현수준을 GFAP 항체를 이용하여 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 녹내장 유발 시 염증물질을 생성하는 활성화된 미세아교세포의 활성을 본 발명의 펩타이드가 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 본 발명의 펩타이드를 녹내장 유발 마우스에 투여한 후, 활성화된 미세아교세포의 지표인 Iba-1의 발현수준을 Iba-1 항체를 이용하여 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

녹내장은 황반변성 및 당뇨망막 병증과 함께 실명을 여기하는 주요 3대 질병으로 알려져 있으며, 최근 고령인구의 급속한 증가로 인해 녹내장 유병율은 지속적으로 증가하고 있다.

이에 본 발명자들은 녹내장을 근본적으로 예방 및 치료할 수 있는 새로운 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 녹내장을 효과적으로 예방, 개선 및 치료할 수 있는 펩타이드를 고안하였다.

따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 녹내장의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 특징이 있다.

본 발명에 따른 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 첫 번째 아미노산이 히드록시 프롤린(Hydroxy proline)인 펩타이드일 수 있으며, 바람직하게는 히드록시 프롤린(Hydroxy proline)-GQDGLAGPK 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 상기 본 발명의 펩타이드가 녹내장의 치료 가능성이 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였는데, 먼저 글루탐산을 처리하여 세포사멸을 유도시킨 시신경 세포(마우스 망막 유래의 광수용체 세포)에 본 발명의 펩타이드를 처리한 군과 처리하지 않은 군을 대상으로 세포사멸 정도를 분석한 결과, 본 발명의 펩타이드를 처리한 군이 처리하지 않은 군에 비해 세포사멸이 현저하게 억제되어 있는 것으로 나타났다(도 2 및 도 3 참조).

따라서 이러한 결과를 통해, 본 발명의 펩타이드가 시신경 세포, 특히 망막 유래 광수용체 세포의 세포사멸을 억제할 수 있으며 세포 보호 활성이 있음을 알 수 있었다.

또한 본 발명의 다른 일실시예에서는, 본 발명의 펩타이드가 녹내장에 의해 손상된 망막의 기능을 회복시킬 수 있는지 확인하기 위해, 녹내장이 유발된 마우스에 본 발명의 펩타이드를 투여한 후, 16주차에 걸쳐 망막위전도 검사를 수행하였다.

그 결과, 녹내장이 유발된 DBA/2 마우스에서 본 발명의 펩타이드 투여 후 8주차부터 좌안 및 우안 모두에서 감소된 b-wave의 크기가 유의하게 증가되는 것으로 나타났고, 16주차에는 거의 정상과 유사하게 회복되는 것으로 나타났다(도 6a~10b 참조).

이러한 결과로 본 발명의 펩타이드가 녹내장이 진행됨에 따라 손상된 망막의 기능 및 이로 인한 시야 결손을 회복시킬 수 있으며 망막을 보호할 수 있어, 본 발명의 펩타이드를 녹내장의 예방 또는 치료를 위한 치료제로 사용 가능함을 알 수 있었다.

한편, 녹내장이 발병하면 시신경의 손상에 따라 시신경유두(optic nerve head)에서 구조적인 진행성 변성이 발생한다고 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 시신경유두의 손상 또는 변성을 억제할 수 있는지 분석한 결과, 녹내장이 발병된 마우스의 시신경 유두에서는 시신경 유두부분이 함몰되고 신경섬유층의 두께가 얇아지는 현상이 발생한 것으로 나타난 반면, 본 발명의 펩타이드가 투여된 마우스 군에서는 이러한 현상이 완화되는 것을 확인할 수 있었으며, 시신경유두 조직에서의 세포사멸(apoptosis)도 억제할 수 있음을 알 수 있었다(도 11~도13 참조).

또한, 녹내장은 망막신경절세포층 (gaglion cell layer; GCL)에서의 망막신경절세포 (retinal gaglion cell; RGC)의 소실(loss)과 시신경 손상에 의한 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 망막신경절세포의 소실과 시신경 손상을 억제할 수 있는지 확인한 결과, 녹내장에 의한 망막신경절세포의 소실을 효과적으로 억제할 수 있으며, 감소된 망막신경절세포의 수를 증가시켜 망막신경절세포의 소실과 손상을 효과적으로 완화 및 개선시킬 수 있다는 것을 확인하였다(도 14 및 15 참조).

또한 과도하게 활성화된 성상교세포(astrocyte)에 의한 glial scar 형성은 망막신경절세포의 축색돌기 재생을 물리적 화학적으로 저해하고 신경을 더 손상시키는 인자들을 발현시킨다. 이에 본 발명의 펩타이드가 과도하게 활성화된 성상교세포의 활성을 저해할 수 있는지를 성상교세포의 활성화 지표로 알려진 GFAP (glial fibrillary acidic protein)의 발현정도로 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 펩타이드를 투여한 군이 녹내장에 의해 발현이 증가된 GFAP의 발현을 억제하는 것으로 나타났고, 녹내장에 의해 두꺼워진 돌기와 뻗어나간 돌기의 수를 억제하는 것으로 나타났다(도 16 참조).

뿐만 아니라, 녹내장이 발병되면 미세아교세포가 활성화되고, 이로 인해 망막신경절세포 및 신경조직을 손상시키는 염증물질의 생성이 증가한다. 한편, 본 발명의 펩타이드를 투여한 경우, 미세아교세포의 활성 지표인 Iba-1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1)에 양성반응을 보이는 세포가 감소되고 거의 발견되지 않는 것으로 나타났다(도 17 참조).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 망막 유래 광수용체 세포 또는 망막신경절세포의 세포사멸 억제 활성을 가지며, 시신경 유두 조직의 함몰 또는 변성을 억제하고, 망막신경절세포층에서의 망막신경절세포의 소실을 억제할 뿐만 아니라 시신경 손상에 의해 활성화된 성상교세포(Astrocyte) 또는 미세아교세포(Microglia)의 활성을 억제하여, 녹내장을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 녹내장의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 본 발명의 펩타이드는 약학적 조성물 총 100 중량부에 대하여 0.1 내지 50 중량부로 함유될 수 있다.

상기 약학조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

또한 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 펩타이드의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 녹내장의 치료방법을 제공할 수 있다.

상기 투여는 앞서 기술한 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여방법과 동일할 수 있으며, 바람직하게 상기 투여는 안구 내, 눈 주위, 안구, 경구, 전신 또는 국소로 투여할 수 있다.

또한, 상기 개체는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니며, 개, 고양이, 돼지, 소, 말 등의 포유동물을 모두 포함할 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 녹내장의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.

상기 건강식품은 상기 펩타이드 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<준비예>

① 펩타이드 합성

본 발명의 하기 실험에서 사용한 펩타이드는 히드록시 프롤린-GQDGLAGPK 펩타이드(Hydroxy proline-GQDGLAGPK; 서열번호 1)로 (주)바이오셀트란(강원도, 대한민국)에 의뢰하여 제작한 것을 사용하였다.

② 실험동물준비

15주령 C57BL/6 마우스 15마리와 DBA/2 마우스 30마리를 Charles River Laboratories Japan으로부터 구매하여(오리엔트 바이오 수입) 1주일 동안 인제대학교 부산백병원 인당생명의학연구원 동물실험실 마우스 사육실 환경에 적응시킨 후, 사용하였으며, 순화기간 후 각각의 시험에 맞추어 대조물질과 시험물질을 투여하였다. 본 발명에서 사용한 상기 DBA/2 마우스는 Gpnmb (glycosylated protein nmb)와 Tyrp1 (Tyrosinase-related protein 1) 유전자의 열성돌연변이로 인해 점진적인 안압증가와 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell; RGC)의 소실 특성을 갖는 녹내장 질환모델로 사용되는 동물모델이며, C57BL/6은 녹내장 발병동물인 DBA/2 마우스에 대한 대조군 (naive group)으로 사용하였다.

③ 통계분석

모든 실험의 측정치는 Prism5를 통하여 통계 분석하였으며, 각 데이터의 일원 배치법(one-way ANOVA)에 의한 분산 분석을 수행하고 결과를 평균과 표준편차로 나타내었다. 또한 Turkey’s t-test를 통하여 사후 분석하여 유의 수준 0.05 이하(p<0.05)에서 유효성을 분석하였다.

<실시예 1>

본 발명의 펩타이드에 대한 세포독성 분석

본 발명에서 제작한 녹내장 예방 또는 치료용 펩타이드에 대한 세포독성 여부를 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다. 이를 위해 마우스 망막으로부터 광수용체 세포를 수득한 후, 배양된 상기 세포에 본 발명의 펩타이드를 배지에 희석하여 농도별(0, 0.5, 1, 2.5, 5, 10μg/mL)로 세포에 처리하고 24시간 배양하였다. 이후 분석시약(CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit)을 1시간 동안 처리하여 상대적인 세포생존율을 비교 분석하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 고안한 녹내장 예방 또는 치료용 펩타이드는 상기 처리한 모든 처리군에서 세포생존율에 유의적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타나, 세포독성을 유발하지 않음을 알 수 있었다.

<실시예 2>

본 발명의 펩타이드에 대한 세포보호 활성 및 세포사멸 억제활성 분석

녹내장에서 망막신경절 세포는 글루탐산에 의해 세포 사멸이 유도되는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명의 녹내장 치료용 펩타이드가 글루탐산에 의한 망막신경절세포의 세포 사멸을 억제하여 세포를 보호하는 활성이 있는지를 분석하였다. 이를 위해 마우스 유래 망막신경절세포를 포함하는 배지에 본 발명의 펩타이드와 5 mM의 글루탐산을 첨가하고 24시간 배양한 후, 세포증식 분석용 시약(CellTiter96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit)을 처리하고 1시간 뒤 세포생존율을 분석하였다.

또한, 글루탐산에 의한 세포사멸 억제 효과를 TUNEL assay와 DAPI 염색 분석을 수행하여 분석하였다. 구체적으로 세포사멸(apoptosis)의 정량적 분석을 DeadEndTM Fluorometric TUNEL System으로 확인하였다. 마우스 망막 유래의 광수용체 세포를 포함하는 배지에 1μM의 본 발명에 따른 펩타이드를 첨가하여 1 시간 동안 전 처리한 후, 5mM의 글루탐산이 포함된 배지로 8시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 2번 세척하고 10% 포르말린으로 15분간 고정시켰다. 고정된 세포를 0.1% Triton® X-100에 10분간 노출시키고, 세포를 형광이 포함된 dUTP로 반응시켜 절단된 DNA 부분을 염색한 후 DAPI가 포함된 마운팅(mounting) 용액과 함께 슬라이드에 고정시키고 세포사멸이 나타나고 있는 세포를 형광현미경을 통하여 확인하였다.

상기와 같은 실험결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 글루탐산만을 첨가한 군은 세포 사멸이 정상에 비해 현저하게 감소되는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 펩타이드를 처리한 군에서는 글루탐산에 의한 세포사멸이 억제되는 것으로 나타났다.

또한, 상기 표 1 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 글루탐산만 처리된 세포에서는 많은 수의 핵에서 TUNEL-양성 반응이 나타나 세포사멸이 발생한 것을 알 수 있었고, 반면 본 발명의 펩타이드가 전 처리된 군에서는 TUNEL-양성 반응이 현저하게 감소한 것으로 나타나 세포사멸이 효과적으로 억제된 것을 확인할 수 있었다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 글루탐산에 의한 망막 광수용체 세포의 세포사멸 및 세포손상을 억제하여 세포를 보호하는 활성이 있음을 알 수 있었다.

<실시예 3>

녹내장 유발 마우스모델에서 본 발명의 펩타이드 투여에 따른 개선 및 치료 효능 분석

상기 실시예의 in vitro 결과를 통해 본 발명의 펩타이드가 녹내장을 예방, 개선 및 치료할 수 있다는 가능성을 확인하였고, 나아가 본 발명자들은 녹내장이 유발된 마우스 동물모델에 본 발명의 펩타이드를 투여하여, 실질적으로 녹내장을 치료할 수 있는지를 분석하였다.

이를 위해, 마우스 동물을 이용한 실험은 다음과 같은 실험스케줄에 따라 진행하였다(도 4 참조). 상기 준비예에 기재된 C57BL/6 마우스(대조군 마우스)와 DBA/2 마우스(녹내장 유발마우스)를 동물 입수일로부터 1주일 동안 사육실 환경에 순화시켰고, 순화기간을 마친 후, 본 발명의 펩타이드를 안구 내 투여하였는데, 안구 내 투여는 마우스를 마취한 후 34 gauge needle을 이용하여 양안의 유리체 내에 2μl (2ug/eye)씩 2주마다 IVT(Intravitreal triamcinolone injection) 방법으로 투여하였다.

또한, C57BL/6 마우스 및 DBA/2 마우스에 본 발명의 펩타이드 대신 투여한 베히클(vehicle)은 hIgG (Human IgG)(㈜뉴라클사이언스사 제품)을 사용하였고, 본 발명의 펩타이드는 분말 형태의 펩타이드를 PBS에 1mg/ml의 농도로 녹여 사용하였다.

녹내장의 치료 효능 분석은 안압측정(IOP) 및 망막전위검사(ERG) 분석을 통해 확인하였다.

<3-1> 안압측정

안압은 마우스 동물들의 순화기간 후 측정을 시작하여 4주 간격으로 16주 동안 총 5회 측정하였다. 안압 측정은 호흡 마취한 마우스를 Tonometer 제조사의 설명서에 따라 측정하였으며 6회 측정 후 제시되는 평균값을 기록하였다. 안압측정계 자체에서 표시되는 표준편차가 3.5 이상으로 나올 시에는 다시 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 녹내장이 유발된 DBA/2 마우스의 안압은 정상 마우스에 비해 증가하는 것으로 나타났다. 한편, 녹내장이 유발된 DBA/2 마우스에 본 발명의 펩타이드를 투여한 마우스 군에서의 안압 변화는 펩타이드 투여 0주차에서는 정상 마우스와 유의적인 차이가 없었고, 이후 4주차부터 유의적인 증가를 보이기 시작하여 16주차까지 안압이 지속적으로 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 펩타이드 투여에 의한 안압 하강 효과는 관찰되지 않았으므로 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드 투여가 증가된 안압을 저하시키지는 않다는 것을 알 수 있었다.

한편, 녹내장의 근본적 원인은 시신경 손상에 의하여 야기되는 질병으로 안압이 정상인 경우에도 발생할 수 있다고 알려져 있어, 안압조절만이 근본적인 치료 방법이 될 수는 없다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 녹내장 치료를 위한 중요한 요소인 시신경 손상으로부터의 보호 효과가 있는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<3-2> 망막전위도 검사

망막전위도 검사는 마우스의 양안에 트로페린 점안액를 20μl씩 점안하여 산동시킨 후 흡입마취하여 제조사의 설명서에 따라 검사를 수행하였다. 전극을 각각 두피, 꼬리 및 각막에 접촉시킨 후 일정량의 단일백색광 자극을 주어 망막전위도검사를 수행하였다. 망막을 자극한 반응값과 a-wave의 골에서부터 b-wave의 정점까지로 정한 진폭을 측정하여 이를 망막 기능의 지표로 평가하였다.

망막전위도 검사는 망막내의 bipolar 세포의 기능을 나타내는 b-wave를 분석함으로써 망막의 기능 이상 및 시야 결손 여부를 유추할 수 있다. 망막의 기능 이상 및 시야 결손에 있어서 본 발명의 펩타이드의 효과를 보기 위하여, 마우스들의 망막전위도를 20주 동안 4주 간격으로 측정하였고, 마우스의 좌안 및 우안을 각각 -0.9, 0.3, 1.2 log cd×s/m²의 빛에 각각 노출시켜 얻어진 반응을 분석하여 수치화하였다. 또한, 각 실험군의 측정치는 IBM사의 SPSS 23.0을 통하여 one-way analysis of variance와 Tukey’s test로 분석하였고, 정상군(C57BL/6 마우스)과의 유의적인 통계차이를 보이는 실험군은 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001로 나타내었으며, PBS만 투여된 대조군과의 유의적인 통계차이를 보이는 실험군은 #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 로 나타내었다.

상기 망막전위도 분석 결과, 도 6a~ 도 10b에 나타낸 바톼 같이, 본 발명의 펩타이드를 투여하기 전, 즉 0주차에서는 각 실험군별 마우스들의 망막전위도 간의 유의적인 변화는 확인되지 않았다(도 6a 및 6b). 본 발명의 펩타이드를 투여 후 4주부터 C57BL/6 마우스에 비해 DBA/2 마우스의 망막전위도가 유의적으로 감소하기 시작하여 펩타이드 투여 후 16주차까지 망막전위도의 감소는 지속되는 것으로 나타났다. 한편, 본 발명의 펩타이드 투여 후 8주 후부터, 좌안의 경우 1.2 log cd×s/m2의 자극 처리, 우안의 경우 0.3 및 1.2 log cd×s/m²의 자극처리 시, 대조군(녹내장 발병 마우스군)에 비하여 본 발명의 펩타이드를 녹내장 발병 마우스군에 처리한 군에서 망막전위도가 유의적으로 높아지는 것으로 나타났다(도 8a 및 8b). 또한, 펩타이드 투여 12주 후에는, 0.3 및 1.2 log cd×s/m2의 자극에서 본 발명의 펩타이드 투여군의 b wave 수치가 대조군 대비 유의적으로 증가하는 것으로 나타났고(도 9a 및 9b), -0.9 log cd×s/m²의 자극에서는 투여 12주까지 실험군 간의 b wave의 수치에 유의적인 변화를 확인할 수 없었다. 본 발명의 펩타이드 투여 16주 후에는 우안의 -0.9 log cd×s/m²의 자극을 제외한 모든 자극에 대하여 본 발명의 펩타이드가 투여된 녹내장 발병 마우스의 좌안 및 우안 모두에서는 망막전위도가 유의성 있게 증가하여 거의 정상 수준으로 회복되는 것으로 나타났다(도 10a 및 10b).

이 결과를 통하여 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 녹내장이 유발된 마우스에 투여 시, 녹내장의 진행으로 약화된 망막의 기능을 회복시킬 수 있음을 확인하였고, 특히 본 발명의 펩타이드 투여 8주부터는 망막의 기능이 회복되어 16주차까지는 거의 정상 수준에 가깝게 개선 및 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4>

조직학적 분석을 이용한 본 발명의 펩타이드에 대한 녹내장 개선 또는 치료 효능 분석

나아가 본 발명자들은 상기 실시예 3에서 사용한 마우스 동물 모델을 이용하여 본 발명의 펩타이드가 녹내장을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는지를 조직학적 분석을 통해 확인하였다. 조직학적 분석에 따른 각 실험방법과 결과는 다음과 같다.

<4-1> 실험방법

① 조직준비

상기 실시예 3에서 사용한 마우스 동물모델로부터 안구를 적출하고 이를 10% 포르말린에 3일 동안 고정하였고, 안구를 일회용 카세트(embedding cassette)에 넣어 자동침투화 기계(Tissue Processor)로 자일렌 및 파라핀 침투과정을 수행하였다. 이와 같이 조직처리가 완료된 조직은 60℃로 설정된 조직포매기계(Tissue Embedding System)의 조직탱크로 옮기고, 카세트 내 안구조직을 열판(hot plate) 위에 준비된 철제 몰드(mold)로 옮긴 후 안구조직을 적절한 방향으로 위치시켜 냉각판(cold plate)에서 결정화시켜주었다. 이후 카세트를 열판 위에 두고 파라핀(paraffin wax)을 부은 뒤 냉각판(cold plate)에서 굳혀 파라핀 블락 (block)을 만들었다. 이후 포매된 조직을 Rotary Microtome으로 5 μm 두께로 절단하여 슬라이드에 부착하고, 48℃ Flattening Table 또는 Slide Warmer 기계에서 건조시켜 조직 슬라이드를 제조하였다.

② Hematoxylin 및 Eosin 염색

상기 준비된 조직 슬라이드를 다업계에 공지된 Hematoxylin 및 Eosin 염색 방법을 이용하여 조직을 염색하였고, 염색된 조직은 봉입제 용액(VectaMount)을 사용하여 커버글라스를 씌워 봉입하였으며, 가상현미경(NanoZoomer)으로 관찰하여 분석하였다.

③ Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-END Labeling (TUNEL) 어세이

TUNEL 어세이는 제조사의 설명서에 따라 kit를 사용하여 다음과 같이 시행하였다. 키트의 탈파라핀 과정을 거친 후, 4% formaldehyde로 고정 과정을 시행한 다음, rTdT Enzyme incubation buffer에서 37°C 1시간 동안 반응한 뒤, 2X SSC buffer에 15분 노출시켜 반응을 종료시켰다. 염색된 조직은 DAPI가 포함된 봉입제 용액 (DAPI Fluoromount-G)을 사용하여 커버글라스를 씌워 봉입 후, 형광현미경으로 관찰하여 분석하였다.

④ Immunohistochemistry (IHC) 염색

조직의 면역염색은 다음과 같이 수행하였다. 먼저 탈파라핀 및 함수 과정을 상기 기술된 방법에 따라 수행한 후, Antigen Retrieval Solution을 100 ℃에서 중탕한 후 증류수로 세척하였다. 이후 3% H2O2가 들어있는 MeOH에 30분간 반응시키고, Cleaved Caspase-3에 대한 1차 항체를 4℃에서 overnight 반응시킨 뒤 TBS로 10분간 3회 세척하였다. 이후 HRP-Rabbit/Mouse EnVision Dual Link kit의 2차 항체를 사용하여 1시간 반응 후, TBS로 10분간 3회 세척한 다음, DAB substrate chromogen reagent에 1분 반응시킨 후 흐르는 물로 세척하였다. 그런 뒤, Mayer’s hematoxylin으로 30초 간 염색한 후 흐르는 물에 세척하고, 봉입제 용액 (VectaMount)을 사용하여 커버글라스를 씌워 봉입하여 가상현미경 (NanoZoomer)으로 관찰하여 분석하였다.

⑤ Immunofluorescence (IF) 염색

조직의 형광면역염색은 다음과 같이 시행하였다.

먼저, 탈파라핀 및 함수 과정을 상기 기술된 과정으로 수행하고, Antigen Retrieval Solution을 100 ℃에서 중탕한 후 증류수로 세척하였다. 이후 Permeabilization solution (PBS + 0.3% Triton X-100)에 10분 반응하여 투과(permeabilization) 과정을 거친 다음, 상온에서 1% BSA와 5% donkey serum이 들어간 PBST (PBS + 0.1% Tween 20)에 1시간 블록킹 하였다. GFAP 또는 Iba-1에 대한 1차 항체가 포함된 PBST에서 4℃에서 밤새도록 반응시킨 뒤 PBS로 10분간 3회 세척하였다. 형광이 붙어있는 2차 항체(secondary antibody)가 포함된 PBST에서 상온에서 1시간 반응 후 PBS로 10분간 3회 세척하고, 염색된 조직은 DAPI가 포함된 봉입제 용액(DAPI Fluoromount-G)을 사용하여 커버글라스를 씌워 봉입 후, 형광현미경으로 관찰하여 분석하였다.

⑥ Flat-mounted 망막조직 준비 및 IF 염색

적출한 마우스의 안구를 10% formalin에 하루 고정시킨 후 안구조직에서 각막과 수정체를 제거하고 망막만 따로 분리하였다. 준비된 망막 조직의 면역염색은 다음과 같이 시행하였다. 즉, 5% donkey serum이 포함된 Perm/Block solution (PBS + 3% Triton X-100 + 0.2% BSA)에 1시간 반응한 후, Brn3a에 대한 1차 항체(Table 1 참고)가 포함된 PBST를 사용하여 4℃에서 overnight 반응시킨 뒤 PBST로 15분간 4회 세척하였다. 이후 2차 항체가 포함된 PBST에서 상온에서 1시간 반응 후 PBST로 15분간 4회 세척하고, 염색된 망막조직을 나비모양으로 절개하여 슬라이드 위에 펼쳐 놓은 뒤(flat-mounting dissection), 봉입제 용액(ClearMount Mounting Solution)을 사용하여 커버글라스를 씌워 봉입 후, 공초점 현미경(Confocal Microscope)으로 관찰하여 분석하였다.

또한, 상기 기술된 실험방법에서 사용된 각 항체에 대한 정보는 상기 표 2에 기재된 바와 같다.

<4-2> 본 발명의 펩타이드에 의한 시신경 손상 회복

녹내장이 발병하면, 시신경유두(optic nerve head)에서 구조적인 진행성 변성이 일어난다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 시신경유두 변성을 억제할 수 있는지, Hematoxylin 및 Eosin 염색법, TUNEL 염색 및 형광현미경 관찰로 분석하였다.

그 결과, 16주 동안 녹내장이 유발된 마우스에 본 발명의 펩타이드를 투여하고, 실험 마우스들로부터 적출한 망막조직을 대상으로 분석한 결과, 녹내장이 유발된 DBA/2 마우스는 정상군에 비해 시신경 유두부분의 함몰(cupping 또는 excavation 현상, 빨간색 원 표시 부위)이 일어난 것으로 나타났고, 상대적으로 신경섬유층(nerve fiber layer)의 두께가 얇아진 것이 관찰되었다. 한편, 본 발명의 펩타이드를 처리한 군에서는 시신경 유두부분의 함몰이 완화된 것으로 나타나 녹내장의 조직학적 변성들이 완화되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 11 참조).

또한, 손상된 시신경유두 조직에서의 세포사(apoptosis) 정도를 확인하기 위해 초기 세포사(early apoptosis) 지표인 Caspase-3 및 말기 세포사(late apoptosis) 지표인 TUNEL 염색을 수행한 결과, 녹내장이 유발된 DBA/2 마우스에서는 함몰된 시신경 유두부분에 세포사멸을 유도하는 cleaved Caspase-3의 발현이 증가되어 있는 것으로 나타났고(도 12 참조), TUNEL-양성반응을 보이는 세포가 집중적으로 관찰되었으나(도 13 참조, 노란색 화살표:TUNEL 양성세포), 본 발명의 펩타이드를 처리한 군에서는 cleaved Caspase-3가 발현되는 세포 및 TUNEL-양성반응을 보이는 세포의 수가 현저하게 감소하는 것으로 나타나, 본 발명의 펩타이드가 시신경유두 조직의 손상을 효과적으로 개선 및 회복시켜 녹내장을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

<4-3> 본 발명의 펩타이드에 의한 망막 신경절 세포의 손상회복

녹내장의 병리기전은 망막신경절세포층(gaglion cell layer; GCL)에서의 망막신경절세포 (retinal gaglion cell; RGC)의 소실(loss)과 시신경 손상에 의한 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 망막층에서의 H&E 염색 및 면역염색법을 이용하여 본 발명의 펩타이드에 대한 손상된 망막 신경절 세포의 회복 여부를 분석하였다.

그 결과, 망막층에서의 H&E 염색을 통하여 망막신경절세포층 내 망막신경절세포 소실을 확인해본 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 정상군에 비해 녹내장이 유발된 DBA/2 마우스에서는 망막신경절세포의 소실이 많이 일어났으나(도 14에서 화살표로 표시된 부분), 본 발명의 펩타이드를 처리한 군에서는 망막신경절세포의 소실이 감소되어 검은색의 망막신결정세포가 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 망막신경절세포의 지표로 알려져 있는 Brn3a (brain-specific homeobox/POU domain protein 3)의 발현을 망막조직 전체(flat-mounted retina)에서 Brn3a에 대한 항체를 이용하여 공초점 현미경으로 망막신경절세포의 손상을 분석하였다. 여기서 Brn3a는 설치류 망막에서 망막신경절세포에 축적되는 전사인자로, 망막신경절세포에 손상이 일어나게 되면 그 발현이 감소되는 것으로 알려져 있다.

염색 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 녹내장이 발병된 DBA/2 마우스는 정상군에 비해 Brn3a를 발현하고 있는 망막신경절세포의 수가 감소된 것으로 나타났으나, 녹내장이 발병된 DBA/2 마우스에 본 발명의 펩타이드를 처리한 군에서는 Brn3a의 발현이 다시 증가하여 감소된 망막신경절세포의 수가 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 이러한 결과들을 통해 본 발명의 펩타이드가 녹내장에서 관찰되는 망막신경절세포의 손상 및 소실을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.

<4-4> 본 발명의 펩타이드에 의한 신경교세포(neuroglia)의 변화분석

① 성상교세포(Astrocyte) 변화분석

과도하게 활성화된 성상교세포에 의한 신경교질반흔(glial scar) 형성은 망막신경절세포의 축색돌기 재생을 물리적 화학적으로 저해하고 신경을 더 손상시키는 인자들을 발현한다고 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 녹내장이 유발된 DBA/2 마우스에서 활성화된 성상교세포에 대한 본 발명의 펩타이드 영향을 분석하기 위해, 망막조직 전체(flat-mounted retina)에서의 GFAP 발현 수준을 GFAP에 대한 항체를 이용한 공초점 현미경 분석으로 관찰하였다.

그 결과, 녹내장이 유발된 DBA/2 마우스는 정상군보다 활성화된 성상교세포들이 증가하여 GFAP 형광염색 시, 더 두꺼워진 돌기(processes)가 관찰되었고 더 많은 수의 돌기들이 뻗어나가는 것이 관찰되었다. 반면 본 발명의 펩타이드를 처리한 군에서는 녹내장 유발 마우스 군에 비해 활성화된 성상교세포의 활성이 현저하게 감소한 것으로 나타났다(도 16 참조).

② 미세아교세포(Microglia) 변화분석

녹내장의 병리학적 조직변화에는 면역-염증(immune-inflammatory) 반응이 동반되는데 여기에 glial 세포의 일종인 미세아교세포가 관여한다. 활성화된 미세아교세포에 의해 과도하게 생성되는 염증물질들(proinflammatory cytokines)은 망막신경절세포 및 신경조직을 손상시켜 녹내장을 유발시키고 더 악화시킨다. 따라서 본 발명의 펩타이드가 염증물질을 생성하는 활성화된 미세아교세포의 활성을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 미세아교세포의 Iba-1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1)의 항체를 이용하여 공초점 현미경으로 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 녹내장이 유발된 마우스 군에서는 Iba-1에 양성을 보이는 세포가 정상군에 비해 월등히 증가되어 있는 것으로 나타났고, 반면 본 발명의 펩타이드를 처리한 군에서는 Iba-1을 발현하는 세포가 현저히 감소되어 정상 수준과 유사한 정도로 관찰되었다.

이상의 결과를 통해 본 발명자들은 녹내장이 유발된 마우스에 본 발명의 펩타이드를 투여한 결과, 녹내장에 의한 시신경유두 부분의 손상을 회복시킬 수 있고, 세포사멸을 억제할 수 있으며, 망막신경절세포의 손상 및 소실을 억제할 뿐만 아니라, 시신경 손상에 반응하여 과도하게 활성화된 성상교세포 및 미세아교세포의 활성을 완화시켜 glia 세포들로부터 분비되는 신경 독소 및 염증물질로부터 망막신경절세포 및 시신경 조직의 손상을 보호하는 효과가 있음을 확인하였다.

그러므로 이상과 같은 결과로 본 발명의 펩타이드는 녹내장을 예방, 개선 및 치료할 수 있는 새로운 치료제로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> KPC Co., Ltd. <120> Peptide for treating or preventing of glaucoma and use thereof <130> NPDC78492 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Pro Gly Gln Asp Gly Leu Ala Gly Pro Lys 1 5 10

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 녹내장의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는,
망막 유래 광수용체 세포 또는 망막신경절세포의 세포사멸 억제;
시신경 유두 조직의 함몰 또는 변성 억제; 또는
망막신경절세포층에서의 망막신경절세포의 소실 억제; 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 녹내장의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는,
시신경 손상에 의해 활성화된 성상교세포(Astrocyte) 또는 미세아교세포(Microglia)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 녹내장의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는, 녹내장의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 녹내장의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제5항에 있어서,
상기 펩타이드는,
망막 유래 광수용체 세포 또는 망막신경절세포의 세포사멸 억제;
시신경 유두 조직의 함몰 또는 변성 억제; 또는
망막신경절세포층에서의 망막신경절세포의 소실 억제; 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 녹내장의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제5항에 있어서,
상기 펩타이드는,
시신경 손상에 의해 활성화된 성상교세포(Astrocyte) 또는 미세아교세포(Microglia)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 녹내장의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 녹내장의 치료방법.
제8항에 있어서,
상기 투여는 안구 내, 눈 주위, 안구, 경구, 전신 또는 국소로 투여하는 것을 특징으로 하는, 녹내장의 치료방법.