TWI744683B - 短合成胜肽及其治療視網膜退化性疾病和/或組織損傷的用途 - Google Patents

Abstract

在此揭示用以治療視網膜退化性疾病或組織損傷之合成胜肽及包含所述胜肽之組合物。在此也揭示一種治療視網膜退化性疾病或組織損傷的方法，藉由施用本揭示內容組合物至一有需要接受治療之個體，其中所述組合物含有一治療有效量之合成胜肽。

Description

短合成胜肽及其治療視網膜退化性疾病和/或組織損傷的 用途

本揭示內容是基於發現短合成胜肽具神經保護作用，和/或組織修復及再生作用，因此所述合成胜肽可用於治療或預防視網膜退化性疾病或組織損傷的領域。

視網膜退化是由視網膜或視網膜色素上皮細胞(retinal pigment ephitelium,RPE)之進行性及最終死亡所造成。造成視網膜退化的原因很多，包含動脈或靜脈阻塞、糖尿病視網膜病變、晶狀體後纖維組織增生/早產兒視網膜病變或疾病(通常為遺傳性疾病)。該些疾病可能以多種不同方式呈現，例如，視力受損、夜盲、視網膜剝離、光敏感、管狀視覺以及周邊視覺喪失至視覺完全喪失。視網膜退化存在於多種不同的疾病中，包含網膜色素病變(RP)、老年黃斑部病變(AMD)、糖尿病視網膜病變、白內障、急性紫外線視網膜病變和青光眼。

軟組織(例如，血管、皮膚、肌肉骨骼組織)損傷是非常常見的損傷，其包括例如皮膚性(如，缺血性傷口、糖尿病性傷口、創傷性傷口、燒傷、皮膚潰爛和外科傷口)；血管性(如，血管疾病、血管損傷和血管發育不良)；整形(如，涉及修復、增大或美體)；肌肉疾病(如，發炎性、神經性和肌原性肌肉疾病；和肌肉營養不良)；和結締組織性(例如，肌腱和韌帶)之損傷。其他軟組織損傷症狀還包括皮膚老化或暴露於壓力(如，暴露於紫外光或污染等條件)中，進而減緩組織修復和細胞再生。皮膚衰老的徵狀非常明顯，包含出現皺紋、皮膚色素沈澱的變化、彈性和緊緻度喪失，以及組織鬆弛。

有鑑於此，本領域亟需一種用以治療和/或預防視網膜退化性疾病和/或需要組織修復和再生狀況之改良醫藥品和/或方法。

原則上，本揭示內容是關於發展新穎化合物和/或治療視網膜退化性疾病和/或組織損傷的方法。

基於此，本揭示內容第一態樣是關於提供一種能夠治療視網膜退化性疾病或組織損傷之短合成胜肽。所述短合成胜肽由胺基酸序列X₁X₂X₃X₄EX₅(序列編號：1)所組成，其中，X₁是絲胺酸(S)或丙胺酸(A)；X₂是白胺酸(L)、丙胺酸(A)或異白胺酸(I)；X₃是甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)或天冬醯胺酸(N)；X₄是丙胺酸(A)、甘胺酸(G)或麩胺酸(E)；X₅是麩醯胺酸(Q)、丙胺酸(A)或天冬醯胺酸(N)； X₂、X₃、X₄和X₅分別左旋胺基酸，而X₁和E分別是左旋胺基酸或右旋胺基酸；以及當序列編號：1具有SLGAEQ(序列編號：9)之序列時，該絲胺酸(S)或該麩胺酸(E)是右旋胺基酸。

依據可任選的實施方式，所述合成胜肽之胺基酸序列的N-端被乙醯化，且C-端被醯胺化。

依據某些實施方式，X₁是絲胺酸(S)、X₂是白胺酸(L)、X₃是甘胺酸(G)、X₄是丙胺酸(A)、X₅是麩醯胺酸(Q)，以及所述合成胜肽具胺基酸序列SLGAEQ(序列編號：9，本文以「6-mer」表示)。

依據其他較佳實施方式，具有序列編號：12、13、14、15、17、19、20、21、22或26中任一胺基酸序列。在一實施例中，X₁是丙胺酸(A)、X₂是白胺酸(L)、X₃是甘胺酸(G)、X₄是丙胺酸(A)、X₅是麩醯胺酸(Q)，以及所述合成胜肽具有序列編號：12之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Sa」)。在其他實施例中，X₁是絲胺酸(S)、X₂是丙胺酸(A)、X₃是甘胺酸(G)、X₄是丙胺酸(A)、X₅是麩醯胺酸(Q)、以及所述合成胜肽具有序列編號：13之胺基酸序列(以下稱為「6-mer La」)。在又一其他實施例中，X₁是絲胺酸(S)、X₂是白胺酸(L)、X₃和X₄分別是丙胺酸(A)、X₅是麩醯胺酸(Q)，以及所述合成胜肽具有序列編號：14之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Ga」)。在其他實施例中，X₁是絲胺酸(S)、X₂是白胺酸(L)、X₃是甘胺酸(G)、X₄是甘胺酸(G)、X₅是麩醯胺酸(Q)，以及所述合成胜肽具有序列編號：15之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Ag」)。在又一其他實施例，X₁是絲胺酸(S)、X₂是白胺酸(L)、X₃是甘胺酸(G)、X₄和X₅分別是丙胺酸(A)，以及所述合成胜肽具有序列編號：17之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Qa」)。在另一實施例中，X₁是絲胺酸(S)、X₂是異白胺酸(I)、X₃是甘胺酸(G)、X₄是丙胺酸(A)、X₅是麩醯胺酸(Q)，以及所述合成胜 肽具有序列編號：19之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Li」)。在其他實施例中，X₁是絲胺酸(S)、X₂是白胺酸(L)、X₃是纈胺酸(V)、X₄是丙胺酸(A)、X₅是麩醯胺酸(Q)，以及所述合成胜肽具有序列編號：20之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Gv」)。在其他實施例中、X₁是絲胺酸(S)、X₂是白胺酸(L)、X₃是天冬醯胺酸(N)、X₄是丙胺酸(A)、X₅是麩醯胺酸(Q)，以及所述合成胜肽具有序列編號：21之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Gn」)。在又一其他實施例中，X₁是絲胺酸(S)、X₂是白胺酸(L)、X₃是甘胺酸(G)、X₄是麩胺酸(E)、X₅是麩醯胺酸(Q)，以及所述合成胜肽具有序列編號：22之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Ae」)。在又一實施例中，X₁是絲胺酸(S)、X₂是白胺酸(L)、X₃是甘胺酸(G)、X₄是丙胺酸(A)、X₅是天冬醯胺酸(N)，以及所述合成胜肽具有序列編號：26之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Qn」)。

在其他實施例中，6-mer之X₁和麩胺酸(E)分別是左旋胺基酸或右旋胺基酸，並且其他胺基酸殘基皆為左旋胺基酸。在一實施例中，6-mer之X₁是右旋丙胺酸(以下稱為「6-mer dS」)。在又一實施例中，6-mer之麩醯胺酸(Q)是右旋胺基酸(以下稱為「6-mer dE」)。

本揭示內容之第二態樣是用於提供一種用於治療網膜退化性疾病或組織損傷之醫藥品和/或組合物。所述醫藥品或組合物包含一有效量的如上所述之合成胜肽，以及一藥學上可接受載體。

依據某些較佳的實施方式，所述合成胜肽具有序列編號：9之胺基酸序列(以下稱為6-mer)。依據其他較佳的實施方式，所述合成胜肽具有序列編號：12、13、14、15、17、19、20、21、22或26中任一胺基酸序列。在一實施例中，所述合成胜肽具有序列編號：12之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Sa」)。在其他實施例中，所述合成胜肽具有序列編號：13之胺基酸序列(以下稱為「6-mer La」)。在其他實施例中，所述合成胜肽具有序列編號：14之胺基 酸序列(以下稱為「6-mer Ga」)。在其他實施例中，所述合成胜肽具有序列編號：15之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Ag」)。在又一實施例中，所述合成胜肽具有序列編號：17之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Qa」)。在另一實施例中，所述合成胜肽具有序列編號：19之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Li」)。在其他實施例中，所述合成胜肽具有序列編號：20之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Gv」)。在又一其他實施例中，所述合成胜肽具有序列編號：21之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Gn」)。在另一實施例中，所述合成胜肽具有序列編號：22之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Ae」)。在又一實施例中，所述合成胜肽具有序列編號：26之胺基酸序列(以下稱為「6-mer Qn」)。

在某些實施方式中，所述6-mer合成胜肽(序列編號：9)具有至少一右旋胺基酸殘基。在較佳的實施方式中，所述6-mer之第二、第三、第四和第六個胺基酸殘基分別是左旋胺基酸，並且第一和第五個胺基酸殘基是左旋胺基酸或右旋胺基酸。在一實施例中，6-mer之第一個胺基酸殘基是右旋丙胺酸(6-mer dS)。在其他實施例中，6-mer之第五個胺基酸殘基是右旋麩胺酸(6-mer dE)。

本發明醫藥品或組合物治療的視網膜退化性疾病可以是糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)、糖尿黃斑水腫(diabetic macular edema)、老年黃斑部病變(age-related macular degeneration,AMD)、網膜色素病變(retinitis pigmentosa,RP)、白內障(cataracts)、青光眼(glaucoma)或急性紫外線視網膜病變(acute UV retinopathy)。

本發明醫藥品或組合物治療的組織損傷可以是乾眼症(DED)或視網膜缺血/再灌流損傷。

本揭示內容之醫藥品或組合物，可經由下列方式施用至所述個體：血管傳遞(intravascular delivery)(例如，注射(iniection)或灌注(infusion))、 經口(oral)、腸內(enteral)、直腸(rectal)、肺(pulmonary(例如，吸入(inhalation))、經鼻(nasal)、局部施用(topical)(包含，經皮(transdermal)、經頰(buccal)以及舌下(sublingual))、膀胱內(intravesical)、玻璃體內(intravitreal)、腹膜內(intraperitoneal)、陰道(vaginal)、經腦傳遞(brain delivery)(例如，腦室注射(intracerebroventricular)和顱內注射(intracerebral))、經CNS傳遞(例如，鞘內(intrathccal)、椎旁(perispinal)和椎內(intra-spinal))或腸外(parenteral)(例如，皮下(subcutaneous)、肌肉內(intramuscular)、靜脈內(intravenous)和皮內(intradermal))、黏膜給藥(transmucosal administration)，或藉由移植(implant)或其他習知的給藥途徑施用。

本揭示內容之第三態樣是關於一種治療患有視網膜退化性疾病或組織損傷之個體的方法。所述方法包含以下步驟：施用本揭示內容任一實施方式所示之醫藥品或組合物至所述個體，以改善或減緩視網膜退化性疾病或組織損傷相關疾病和/或症狀。

在上述所有實施方式中，所述個體是人類。

在較佳的實施方式中，本發明合成胜肽施用至個體的量為0.01-100毫克/公斤。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖為分析本發明短合成胜肽對於麩胺酸誘導Neuro-2a細胞死亡的效果。細胞預先以合成胜肽處理4小時。於暴露在麩胺酸(100mM)6小時後，測量LDH釋放至Neuro-2a細胞培養基的量，結果以平均值±SD表示(n=6)。*P<0.05 vs.溶劑/經麩胺酸處理的細胞。

第2圖為6-mer dS藉由STAT3依賴方式誘導C2C12細胞中的生存素(survivin)表現。(A)免疫墨點法的結果顯示6-mer dS或5-mer dS對於STAT3磷酸化之影響。STAT3作為上樣控制組。(B)以不同長度之合成胜肽或STAT3抑制劑誘導生存素基因表現之Real-time qPCR分析的結果。*P<0.002 vs.經溶劑處理的細胞。

第3圖為利用丙胺酸掃瞄所創造出的6-mer變異物對於誘導C2C12細胞中生存素mRNA的結果。進行三次獨立分析，結果以平均值±S.D.表是。*P<0.04 vs.溶劑控制組。

第4圖為利用右旋胺基酸創造出的6-mer變異物對於誘導C2C12細胞中生存素mRNA的結果。進行三次獨立分析，結果以平均值±S.D.*P<0.05 vs.溶劑控制組。

第5圖為利用胺基酸置換創造出的6-mer變異物對於誘導C2C12細胞中生存素mRNA的結果。進行三次獨立分析，結果以平均值±S.D.*P<0.05 vs.溶劑控制組。

第6圖為6-mer dS對於ARPE-19對抗4-HNE誘導細胞凋亡之保護效果。細胞去除血清24小時，再以6-mer dS(20μM)或溶劑進行前處理，暴露於4-HNE(25μM)中24小時。以TUNEL(terminal deoxy-nucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling)染色(綠點)測定細胞凋亡，並以Hoechst 33258(藍點)進行複染。(A)為三次獨立試驗之代表性結果。(B)以TUNEL陽性細胞的 數量除以2000個計數細胞定量細胞死亡的百分率。a：P<0.00003 vs.經溶劑處理之細胞。b：P<0.0006 vs.經溶劑/4-HNE處理之細胞。

第7圖為I/R損傷經/未經6-mer變異物治療後20小時，大鼠眼睛視網膜TUNEL染色的代表性影像。視網膜切片以TUNEL(綠色)染色和Hoechst 33258(藍色)複染。GCL，神經節細胞層(ganglion cell layer)；INL，內核層(inner nuclear layer)；ONL，外核層(outer nuclear layer)。

第8圖為I/R損傷經/未經6-mer dS處理後14天，大鼠眼睛視網膜切片經蘇木精和伊紅(H&E)染色的代表性影像。在控制組和6-mer dS+I/R組中，GCL和INL組織清晰且良好。原始倍率×200。

第9圖為未缺血(控制組)和I/R損傷後兩週缺血性視網膜中微膠細胞和星狀細胞免疫染色的代表性影像。視網膜切片經Iba-1(綠色；微膠細胞標記)、GFAP(綠色；星狀細胞標記)和Hoechst 33258(藍色)染色。所述影像是從三個獨立試驗並於400×放大倍率而得。

第10圖為I/R損傷後兩週，對側眼(假手術組(sham))和缺血性視網膜中的退化毛細管之代表性影像。大鼠視網膜微血管以異凝集素GS-IB4(紅色)染色並以Hoechst 33258(藍色；外被細胞核染色)複染。箭頭為無核且管細之退化毛細管。本實驗經三次獨立試驗。原始倍率×400。

第11圖為於STZ注射後第二週以載體或6-mer dS眼滴劑治療之糖尿病小鼠視網膜平固式(flat mounted)視網膜之代表性螢光影像。利用腹腔注射FITC-BSA測定血管通透性。箭頭所指之處為視網膜中血管出血處，該處有FITC-BSA堆積。視網膜中出血區域的數量，以平均值±SD表示(每組n=6)。原始倍率×200。*P<0.007 vs.載體/STZ組。

第12圖為於STZ注射後第二週以載體或6-mer dS眼滴劑治療之糖尿病小鼠和假手術組小鼠視網膜中GFAP陽性星狀細胞的代表性螢光影像。數 據從三次獨立試驗而得(每組n=6)。原始倍率×400。*P<0.0002 vs.載體/STZ組。

第13圖為6-mer變異胜肽對於角膜上皮細胞上皮損傷的影響。C57BL6小鼠飼養於人工環境室(CEC)14天，誘導其眼球表面破壞產生(第0天)，接著以6-mer變異胜肽或載體治療乾眼症4天(第4天)。(A)第0天和第4天小鼠角膜螢光染色之代表性影像(B)藉由螢光染色程度決定角膜上皮細胞受損之分數。數值每組以平均值±SD表示(n=10)。*P<0.000001 vs.6-mer dS組(第0天)。

第14圖為6-mer變異胜肽對於兔子眼角膜上皮細胞中高滲透壓誘導促發炎基因表現的影響。完成三次獨立試驗，數據以平均值±SD表示。*P<0.003 vs.溶劑控制組。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

1.定義

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

在此處「胜肽」一詞係指胺基酸殘基所組成的聚合物。「合成胜肽」一詞則代表此胜肽並未包含存在於自然界的完整蛋白質分子。此種胜肽之所以是「合成的」，表示其乃是由人類利用技術手段所得，譬如化學合成、重 組遺傳技術或將整個抗原切段。於本說明書中，任何胺基酸殘基於一胜肽中的位置係由該胜肽的N端起算。當未具體指出胺基酸為右旋或左旋胺基酸，所述胺基酸可以是左旋胺基酸或者是左或右旋胺基酸，除非上下文明示所述胺基酸為特定異構物。本文中胺基酸的符號與相領域技術人士所使用的胺基酸縮寫相同。

在此，蛋白質/胜肽胺基酸序列的些微變異皆為本發明權利範圍所涵蓋。舉例來說，變異的胺基酸序列至少保留70%、71%、72%、73%、75%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%以及99%的相似度。本發明合成胜肽可經由修飾以改變胜肽特徵且不影響其生理活性。舉例而言，某些胺基酸經改變和/或刪除後，不會影響本揭示內容所述胜肽之生理活性(即，治療視網膜退化性疾病和/或組織損傷的功效)。具體而言，胺基酸的保守性置換是可被預期的。所述保守性置換是指胺基酸側鏈被同一類的胺基酸所取代。一般而言，編碼的胺基酸分類如下：(1)酸性胺基酸=天冬胺酸(aspartate)、麩胺酸(glutamate)；(2)鹼性胺基酸=賴胺酸(lysine)、精胺酸(arginine)、組胺酸(histidine)；(3)非極性胺基酸=丙胺酸(alanine)、纈胺酸(valine)、白胺酸(leucine)、異白胺酸(isoleucine)、脯胺酸(proline)、苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)、色胺酸(tryptophan)；以及(4)未帶電極性胺基酸=甘胺酸(glycine)、天冬醯胺酸(asparagine)、麩醯胺酸(glutamine)、半胱胺酸(cysteine)、絲胺酸(serine)、酥胺酸(threonine)、酪胺酸(tyrosine)。在較佳的實施例中、所述胺基酸的分類為：絲胺酸(S)和酥胺酸(T)為脂肪族羥基族(aliphatic-hydroxy family)；天冬醯胺酸(N)以及麩醯胺酸為含醯胺族(amide-containing family)；丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)以及異白胺酸(I)為脂肪族(aliphatic family)；以及苯丙胺酸(F)、色胺酸(W)和酪胺酸(Y)為芳香族(aromatic family)。舉例而言，可以預期的是以異白胺酸(I)或纈胺酸(V)取代白 胺酸(L)、以麩胺酸(E)取代天冬胺酸(D)、以絲胺酸(S)取代酥胺酸(T)、或以一結構相似的胺基酸取代一胺基酸，此一置換不會對胺基酸分子的結合或其特性產生重大影響，特別是所述置換並未包含胺基酸的框架區域(framework site)。可藉由分析胜肽衍生物的專一性活性，確定胺基酸的修飾是否改變一功能性胜肽。所屬技術領域中具有通常知識者可製備蛋白質/胜肽的片段或類似物。較佳的片段或衍生物的氨端或羧端出現於功能區域附近。在一實施例中，本發明合成胜肽中的一個胺基酸殘基(例如，天冬胺酸(D)、纈胺酸(V)或苯丙胺酸(F))被非極性胺基酸殘基保守性置換(例如，被丙胺酸(A)置換)。在其他實施例中，本發明合成胜肽中的一胺基酸殘基被其右旋胺基酸殘基保守性置換，例如，左旋絲胺酸(S)和左旋麩胺酸(E)分別被相對應的右旋胺基酸殘基所取代。

所述「治療(treatment)」一詞係指預防性(如，預防用藥)、療癒性或緩和性的處置，藉以達到所欲的藥學和/或生理學效果；例如，神經保護作用或促進組織修復或再生。上述的效果是指能夠部分或完全地治癒或預防個體出現所述疾病的症狀。所述「治療(Treatment)」包含預防、治療或減緩一哺乳類的疾病，尤其是人類。所述治療包含：(1)預防(如，預防用藥)、治療或減緩一個體的疾病或症狀，其中所述個體可能患有疾病但尚未被診斷；(2)抑制一疾病(即，降低疾病發展)；或(3)治癒一疾病(即，減少與所述疾病相關的症狀)。

所述「施用(administered)(administering)(administraion)」一詞係指將本發明之製劑(即，化合物或組合物)提供給個體。所述傳遞方式包含，但不限於，靜脈內、肌肉內、腹膜內、動脈內、顱內、結膜內或皮下傳遞方式。在某些實施方式中，本發明合成胜肽和/或其類似物可配製成直接施用於角膜表面的眼滴劑。在其他實施方式中，本發明合成胜肽和/或其類似物可配製成直接施用於皮膚的軟膏或乳液。在又一實施方式中，本發明的合成胜肽和/或 其類似物可配置成粉狀，施用前與適合的載體混合(如，緩衝溶液)，例如，靜脈注射。

在此處，「有效量(effective amount)」一詞係指一成分的用量足以招致欲求的反應或效果，即，能有效治療疾病。以治療視網膜退化性疾病為例，一製劑(如，化合物、合成胜肽、編碼治療胜肽的核酸)，其能用以降低、預防、延緩或治癒視網膜退化性疾病的相關症狀。相似地，以治療需要組織修復或再生的症狀為例，一製劑(如，化合物、合成胜肽、編碼治療胜肽的核酸)，其能用以降低、預防、延緩病徵。或能夠有效促進組織修復或再生。一製劑的有效量不必然能夠治癒一疾病或症狀，但能延緩、阻礙或預防疾病或症狀的發生，或延緩疾病或症狀相關的病徵。所述治療有效量可分成一、二或更多劑量於單一施用劑量型式，且可於一指定期間內施用一次、二次或更多次。

所述「個體(subject)」或「患者(patient)」一詞可交互使用，且在此係指可接受本揭示內容之合成胜肽和/或方法的動物(包含，人類)。所述「哺乳類(mammal)」一詞涵蓋哺乳綱的所有成員，包含：人類、靈長類動物、家畜和農畜。舉例而言，所述家畜或農畜可以是兔子、豬、羊和牛。所述哺乳類亦可涵蓋動物園或競賽用動物、寵物，以及齧齒類(如，小鼠和大鼠)。除非另有指明，「個體」或「患者」一般包含雄性與雌性。再者，所述「個體」或「患者」包含可從本揭示內容的治療方法得到良好治療效果的動物。舉例而言，所述「個體」或「患者」包含，但不限於，人類、大鼠、小鼠、天竹鼠、豬、猴子、豬、羊、牛、馬、狗、貓、鳥和禽類。在一實例中，所述患者為人類。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已儘可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指 實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

2.較佳實施方式

本揭示內容部分基於發現短合成胜肽能夠治療和/或預防個體患有視網膜退化性疾病或組織損傷。因此，本發明提供一種含有新穎合成胜肽之方法和組合物，其能夠用以治療和/或預防視網膜退化性疾病或組織損傷。

2.1 本發明合成胜肽

本揭示內容短合成胜肽係由所述胺基酸序列X₁X₂X₃X₄EX₅(序列編號：1)所組成，其中，X₁是絲胺酸(S)或丙胺酸(A)；X₂是白胺酸(L)、丙胺酸(A)或異白胺酸(I)；X₃是甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)或天冬醯胺酸(N)；X₄是丙胺酸(A)、甘胺酸(G)或麩胺酸(E)；X₅是麩醯胺酸(Q)、丙胺酸(A)或天冬醯胺酸(N)；X₂、X₃、X₄和X₅分別左旋胺基酸，而X₁和E分別是左旋胺基酸或右旋胺基酸。

在可任選或非必要地實施方式中，所述胺基酸序列之N-端被乙醯化並且該胺基酸序列之C-端被醯胺化。

依據一較佳的實施方式，本揭示內容之合成胜肽具有胺基酸序列SLGAEQ(序列編號：9，6-mer)。較佳地，所述6-mer合成胜肽含至少一右旋胺基酸殘基，因而產生其右旋類似物。在一較佳的實施方式中，所述6-mer中的絲胺酸是右旋胺基酸(6-mer dS)。在其他較佳的實施方式中，所述6-mer中的麩胺酸是右旋胺基酸(6-mer dE)。

依據其他實施方式，所述6-me合成胜肽具有一保留性置換，因而產生一類似物其具有序列編號12、13、14、15、17、19、20、21、22或26中任一胺基酸序列。

本發明合成胜肽如表一所示：

依據較佳實施方式，6-mer(序列編號：9)之第六個胺基酸殘基(即，麩醯胺酸(Q))不可以被其他胺基酸殘基所取代，否則所述合成胜肽將失去其神經保護活性。在一實施方式中，將6-mer第六個胺基酸殘基(Q)刪除後所產生的5-mer合成胜肽(序列編號：10)，已失去6-mer胜肽所具有的顯著神經保護活性。

依據其他實施方式，6-mer(序列編號：9)之第一、第二、第三、第四和第六個胺基酸殘基可分別被保留性胺基酸殘基所取代。在一實施方式中，所述6-mer之第一個胺基酸殘基(即，絲胺酸(S))被丙胺酸(A)取代，而產生具序列編號：12胺基酸序列之合成胜肽(以下稱為「6-mer Sa」)。在其他實施方式中，所述6-mer第二個胺基酸殘基(即，白胺酸(L))被丙胺酸(A)取代，而產生具序列編號：13胺基酸序列之合成胜肽(以下稱為「6-mer La」)。此外，6-mer合成胜肽中的白胺酸(L)被異白胺酸(I)取代，，而產生具序列編號：19胺基酸序列之合成胜肽(以下稱為「6-mer Li」)。在其他實施方式中，所述6-mer 第三個胺基酸殘基(即，甘胺酸(G))被丙胺酸(A)取代，而產生具序列編號：14胺基酸序列的合成胜肽(以下稱為「6-mer Ga」)。此外，所述6-mer的甘胺酸(G)被纈胺酸(V)所取代，而產生具序列編號：20胺基酸序列的合成胜肽(以下稱為「6-mer Gv」)。在又一其他實施方式中，，所述6-mer第四個胺基酸殘基(即，丙胺酸(A))被甘胺酸(G)取代，而產生具序列編號：15胺基酸序列的合成胜肽(以下稱為「6-mer Ag」)。此外，所述6-mer的丙胺酸(A)被麩胺酸(E)取代，而產生具序列編號：22胺基酸序列的合成胜肽(以下稱為「6-mer Ae」)。在另一實施方式中，所述6-mer第六個胺基酸殘基(即，麩醯胺酸(Q))被丙胺酸(A)取代，而產生具序列編號：17胺基酸序列的合成胜肽(以下稱為「6-mer Qa」)。此外，所述6-mer中的麩醯胺酸(Q)被天冬醯胺酸(N)所取代，而產生具序列編號：26酸序列的合成胜肽(以下稱為「6-mer Qn」)。

依據其他實施方式，所述6-mer合成胜肽具有至少一右旋胺基酸殘基，特別是位於胜肽序列第2、3、4和6個位置上之胺基酸殘基須為左旋胺基酸，而胜肽序列上第1和第5個位置上的胺基酸殘基可以是左旋胺基酸或右旋胺基酸。在某些實施方式中，所述6-mer的第1和5個位置上的胺基酸殘基分別是右旋胺基酸，因而產生上表一所述6-mer的右旋類似物。

本發明合成胜肽可藉由先前技術中任一標準胜肽合成方法來製造。在一實施方式中，本發明合成胜肽係依據操作手冊以固相胜肽合成器(ABI433A胜肽合成器；Applied Biosystems Inc.；Life Technologies Corp.；Foster City,CA,USA)進行合成。

此外，本發明合成胜肽可利用重組技術所製備。舉例而言，可將編碼本發明胜肽的核酸克隆於一表現載體中，其係以可操作性地方式將一適合於宿主細胞內表現本發明胜肽之調控序列與本發明胜肽連接。將所述載體引入至合適的宿主細胞內，以表現所述胜肽。可利用硫酸銨沈澱和管柱層析等方 法從宿主細胞中純化該經表現的重組胜肽。所製備而成的胜肽可依據以下實施例揭示的方法測試其活性。

上述核酸或多核苷酸可利用已知的生物降解聚合物微粒或微囊傳遞裝置傳送。另外，亦可利用常規方法以脂質體包覆核酸，以供宿主吸收所述核酸。所述多核苷酸可單獨載入或與其他組織專一性抗體共同載入至所述傳遞載體中。此外，亦可製成一分子接合物(molecular conjugate)，其係由質體或其他載體以靜電或共價力連結聚-L-賴胺酸。此外，本發明亦可利用已知的組織專一性轉錄調節元件(tissue-specific transcriptional regulatory elementst)，進行組織專一性標定。也可在不使用傳遞載體的情形下將「裸DNA(naked DNA)」傳遞至肌肉內、皮內或皮下的位置，以進行胞內表現(in vivo expression)。

本發明合成胜肽的N端或C端可以進行修飾。舉例而言，N端修飾包含，但不限於，N-醣基化(N-glycated)、N-烷基化(N-alkylated)和N-乙醯化(N-acetylated)胺基酸。一終端修飾包含聚乙烯二醇化(pegylation)。在一實例中，C端修飾為一C端醯胺化胺基酸。在可任選的實施方式中，一或多個胜肽鍵結可以被一非胜肽鏈所取代，個別的胺基酸基團的修飾，可藉由試劑處理，以與特定的側鏈或終端殘基反應。

於所述合成胜肽可經由化學修飾，於多個不同的部位加入不同的官能基。官能基可以被添加至所述合成胜肽的終端。在某些實施方式中，所述官能基能改善胜肽一或多個特性的活性，例如，改善合成胜肽的穩定性、效能或選擇性；改善所述合成胜肽通過細胞膜和/或組織屏障的穿透效率；改善組織定位能力；降低毒性或清除率；以及改善抵抗細胞幫浦的排除，以及其他類似的活性。在非限制的實施例中，適當的官能基能用以傳遞胜肽黏附至細胞上。舉例來說，降低胜肽的親水性，以及增加其親脂性，這些可任選地官能基於活體內裂解較佳，例如在胞內以水解或酵素分解的方式裂解皆可。水解保護 基包含酯、碳酸酯以及氨基甲酸酯保護基。胺保護基包含烷氧基以及芳氧羰基。羧酸保護基包含脂族(aliphatic)、苯基(benzylic)和芳酯(aryl esters)。

可以保守性或非保守性置換方式，以「擬胜肽有機基團(peptidomimetic organic moiety)」取代本發明合成胜肽中任一胺基酸殘基。在可任選的較佳實例中，所述擬胜肽有機基團與取代的胺基酸於必要的部位具有類似的立體空間、電子或構型特性，且被視為保守性置換。可任選地以擬胜肽來抑制酵素造成胜肽降解或其他降解過程。在可任選和較佳的實例中，所述胜肽可藉由有機合成技術產生。在非限制的實施例中，合適的擬胜肽包含醯胺之同電子排列體(isosteres of amide bonds)、3-氨-2-丙二酮-6-羧酸(3-amino-2-propenidone-6-carboxylic acid)、羥基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸酯(hydroxyl-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-carboxylate)，以及組氨酸異喹啉羧酸(histidine isoquinolone carboxylic acid)。

合成胜肽的任一部分可非必要地經化學修飾，例如，添加官能基。所述修飾可任選地於合成本發明胜肽的期間完成。所述修飾包含，但不限於羧甲基化(carboxymethylation)、乙醯化(acylation)、磷酸化(phosphorylation)、醣基化(glycosylation)或脂醯化(fatty acylation)。

2.2 用以治療視網膜退化性疾病和/或需組織修復或再生相關症狀的組合物

本發明合成胜肽適用於治療罹患視網膜退化性疾病和/或組織損傷之個體，其中組織損傷需進行組織修復或再生。本發明另一態樣是提供一種用於治療視網膜退化性疾病和/或組織損傷之醫藥品，其中所述醫藥品含有本發明合成胜肽。

在一實施方式中，所述醫藥品是用於治療視網膜退化性疾病，特別是糖尿病視網膜病變、糖尿黃斑水腫、老年黃斑部病變(AMD)、網膜色素病變(RP)、青光眼或急性紫外線視網膜病變。

在其他實施方式中，所述醫藥品是用於治療組織損傷，特別是乾眼症(DED)或視網膜缺血)/再灌流損傷(retinal ischemia/reperfusion(I/R)injury)。

在所述醫藥品之製備上，可將所屬技術領域中已知的藥學可接受載體、賦形劑或安定劑與適量的本發明之合成胜肽混合製成一組合物。在特定的實施方式中，所述合成胜肽係選自於上述任一胜肽，包含但不限於6-mer、6-merSa、6-merLa、6-merGa、6-merAg、6-merQa、6-merLi、6-merGv、6-merGn、6-merAe、6-merQn、6-merdS、6-merdE及其組合。

所述醫藥品或組合物中本發明胜肽的含量隨著使用的胜肽而有所不同。所述組合物中的胜肽含量約為0.001%至10%(重量%)；例如，約0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2.、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.9、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0%。在一較佳的實施方式中，所述胜肽的含量約為0.001%至5%(重量%)；例如，約0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、 2.2.、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.9、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0%。

所屬技術領域中已知有多種藥學可接受載體、賦形劑或安定劑能夠適用於本發明之合成胜肽，包含但不限於，非毒性惰性固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包封劑或配方助劑。一般的藥學可接受載體可以是水、或生理食鹽水。舉例而言，藥學可接受載體包含，但不限於，糖類，例如，乳糖、葡萄糖或蔗糖；澱粉，例如，玉米澱粉；纖維素及其衍生物，例如，羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)、乙基纖維素(ethyl cellulose)和醋酸織維素(cellulose acetate)；黃蓍膠粉末(powdered tragacanth)；麥芽(malt)；明膠(gelatin)；滑石(talc)；賦形劑，例如，可可脂(cocoa butter)和栓劑蠟(suppository waxes)；油類，例如，花生油(peanut oil)、棉籽油(cottonseed oil)、紅花油(safflower oil)、芝麻油(sesame oil)、橄欖油(olive oil)、玉米油(corn oil)和大豆油(soybean oil)；二醇類(glycols)，例如，丙二醇(propylene glycol)；酯類(esters)，例如，油酸乙酯(ethyl oleate)和月桂酸乙酯(ethyl laurate)；瓊脂(agar)；緩衝劑(buffering agents)，例如，氫氧化鎂(magnesium hydroxide)和氫氧化鋁(aluminum hydroxide)；藻酸(alginic acid)；以及其它製劑，例如，非毒性潤滑劑(toxic lubricants)(如，月桂基硫酸鈉(lauryl sulfate)、硬脂酸鎂(magnesium stearate))、著色劑(coloring agent)、釋放劑(releasing agents)、調味劑(flavoring agents)、防腐劑(preservative)以及抗氧化劑(antioxidants)。所述組合物可包含抗生素或抗黴菌劑。

本揭示內容之醫藥品或組合物的施用途徑包括：經由血管傳遞(例如，注射或灌注)、經口、腸內、直腸、肺(例如，吸入)、經鼻、局部施用(包含經皮，經頰以及舌下)、膀胱內、玻璃體內、腹膜內、陰道、經腦傳遞(例如，腦室注射和顱內注射)、經CNS傳遞(例如，鞘內、椎旁和椎內)或腸外(例 如，皮下、肌肉內、靜脈內和皮內)、黏膜給藥或藉由移植或其他習知的給藥途徑。

適用於口服的藥學組合物，可以是離散劑型，包含但不限於，丸劑、片劑、錠劑、硬式或軟式膠囊；或製成一分散粉末或顆粒；或製成一溶液或懸浮液，例如，溶液或懸浮液。舉例而言，水溶性或油性懸浮液、乳劑、糖漿、酏劑或腸內配方。所述組合物可以製成單一劑量或多劑量劑型，例如，密封瓶或安瓿，以凍乾條件並添加無菌液體載體(例如，水或食鹽水)儲存。

適用於腸外途徑施用的藥學組合物可以被製成液體或非液體無菌注射劑型，藉由混合或分散本發明合成胜肽與一無菌溶液，例如，林格氏溶液、食鹽水、1,3-丁二醇以及乙醇等。在可任選地實施例中，非揮發油、脂肪酸、合成單一或雙甘油酯皆可作為溶劑。所述組合物可藉由過濾器過濾使之無菌。

適用於局部和皮膚途徑施用的藥學組合物，可以被製成軟膏(ointments)、糊劑(pastes)、乳霜(creams)、乳液(lotions)、凝膠(gels)、貼片(patches)或噴霧劑(sprays)等劑型。眼部劑型、耳滴劑和眼滴劑皆屬於本發明涵蓋範疇。依據某些實施方式，本發明的組合物可局部施用至眼部。隨著患者疾病的嚴重程度和類型不同，本發明合成胜肽的施用至患者的劑量為約1微克/公斤體重至約100毫克/公斤體重(如，0.1-50毫克/公斤體重)例如，1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、 820、830、840、850、860、870、880、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1,000微克/公斤；或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100毫克/公斤。每日或每週的施用劑量為約1毫克/公斤至約20毫克/公斤或更高。，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50毫克/公斤。為達到上述任一局部施用之目的，，每日施用一次至數次(如，每日施用4、6、8或更多次)。

藥學組合物可以製成適用於肺部施用的劑型，例如，粉塵(dusts)或氣霧(mists)，譬如可利用壓力定量(pressurized metered dose)裝置來產生氣溶膠、氣霧或粉塵。

本發明所提供的組合物可以是一套組。可以理解的是本發明所述套組係作為一產品，其包含本發明合成胜肽和/或其他治療性化合物，經包裝而形成所述組合物，以利組合物的運送、儲存和同時或連續施用。因此，本發明套組可包含一或多個含本發明之合成胜肽的安瓿，以將本發明胜肽製成單一劑量或多劑量形式。所述套組更包含一載體，用以溶解本發明所述合成胜肽；例如，水溶液介質物，即生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、葡萄糖和氯化鈉。水溶性介質，如，乙醇、聚乙二醇(polyethylene glycol)、丙基 乙二醇(propylethylene glycol)。若有必要，非水溶性載體亦可適用本發明。本套組的其他物件為一包裝盒，用以包裝本發明之各組成物。適用於本發明之包裝盒的材料可以是玻璃、塑膠(聚乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯極其類似物)、瓶子、小罐子、紙、束袋或其類似物。

本發明套組可更包含說明書，其中記載本發明各種配方的施用方式(如，同時施用、連續施用、個別施用)。因此，本發明之套組可更包含如何施用(如，同時施用、連續施用、個別施用)本發明中不同成分的說明書。所述說明書可以是紙張或為可被讀取的電子媒介物，例如，電子儲存媒體(磁碟、磁帶或其類似物)、光學媒體(CD-ROM，DVD)及其類似物。所述媒體可額外或非必要的附加網路頁面，以提供上述說明資訊。

2.3 治療視網膜退化性疾病和/或需要組織修復或再生之疾病

如上所述，本發明所揭示的內容能有效治療和/或預防視網膜退化性疾病和/或組織損傷。

因此，本發明是關於一種治療和/或預防視網膜退化性疾病和/或組織損傷之方法，其包含施用一包含本發明之合成胜肽的一醫藥品或組合物至一有需要的個體，其中所述合成胜肽係由胺基酸序列X₁X₂X₃X₄EX₅(序列編號：1)所組成，且其中，X₁是絲胺酸(S)或丙胺酸(A)；X₂是白胺酸(L)、丙胺酸(A)或異白胺酸(I)；X₃是甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)或天冬醯胺酸(N)；X₄是丙胺酸(A)、甘胺酸(G)或麩胺酸(E)；X₅是麩醯胺酸(Q)、丙胺酸(A)或天冬醯胺酸(N)；X₂、X₃、X₄和X₅分別左旋胺基酸，而X₁和E分別是左旋胺基酸或右旋胺基酸；以及當序列編號：1具有SLGAEQ(序列編號：9)之序列時，該絲胺酸(S)或該麩胺酸(E)是右旋胺基酸；以及一藥學上可接受載體。

在可任選的實施方式中，合成胜肽胺基酸序列之N-端被乙醯化並且該胺基酸序列之C-端被醯胺化。

當施用本發明醫藥品和/或組合物至所述個體，能夠減緩或減輕與所述視網膜退化性疾病和/或需要組織修復或再生疾病和/或症狀相關的病徵。

在特定的實施方式中，所述合成胜肽是選自於上述胜肽之群組中，其包含但不限於6-mer Sa、6-mer La、6-mer Ga、6-mer Ag、6-mer Qa、6-mer Li、6-mer Gv、6-mer Gn、6-mer Ae、6-mer Qn、6-mer dS、6-mer dE及其組合。

依據一實施方式，本發明是關於一種治療視網膜退化性疾病的方法，特別是用於治療糖尿病視網膜病變、老年黃斑部病變(AMD)、網膜色素病變(RP)、青光眼或急性紫外線視網膜病變，並且所述方法包含施用施用本發明的醫藥品或組合物至有需要的個體。

依據其他實施方式，本發明是關於一種治療組織損傷的方法，其中所述組織損傷需經組織修復或再生。組織損傷特別是指乾眼症(DED)、骨關節炎、急性肌腱斷裂、皮膚創傷、皮膚老化、皺紋、脫髮或視網膜缺血/再灌注(I/R)損傷，並且所述方法包含施用本發明的醫藥品或組合物至有需要的個體。

在所有的實施方式中，適合接受治療的個體為人類。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。

實施例

材料和方法

材料

杜氏改良培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)和胎牛血清(FBS)購自Invitrogen(Carlsbad,CA)。磷酸化Stat3(Phospho-Stat3)(Tyr705)抗體和STAT3抗體購自Cell Signaling Technology(Danvers,MA)。STAT3胜肽抑制劑(NO.573096)和STAT3抑制劑V(NO.573099)購自Calbiochem(La Jolla,CA)。麩胺酸、二甲亞碸(DMSO)、鏈佐黴素(STZ；S0130)、異硫氰酸螢光素-牛血清白蛋白(FITC-BSA)，以及本實驗所有的化學品皆購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。短合成胜肽是以GenScript(Piscataway,NJ)合成，並且每一胜肽的NH₂端及COOH端分別經乙醯化和胺基化修飾，以改善其穩定性，接著以質譜儀定性(純度：>95%)。

細胞培養

C2C12小鼠肌纖維母細胞株和Neuro-2a小鼠神經母細胞株皆購自美國菌種中心(ATCC，Manassas，VA)。細胞培養於DMEM高葡萄糖培養基中。ARPE-19細胞(人類視網膜色素上皮細胞株)培養於DMEM/F12(杜氏改良培養基和Ham's F12；1：1混合)。所有的培養基額外添加10% FBS、4mM 1-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鹽、100U/ml盤林西林-100μg/ml鏈黴素，培養環境為37℃，5% CO₂大氣環境下。

評估Neuro-2a細胞死亡之方法

將Neuro-2a細胞接種於48孔培養盤(1.5×10⁵細胞/孔)，培養24小時，再以0.5ml之含本發明胜肽(20μM)之新鮮2% FBS-DMEM培養基(0.5ml培養基含7μg之6-mer)繼續培養4小時。接著，將100mM之麩胺酸(取自於1M儲存液且PBS作為溶劑)添加至細胞中，再培養6小時。測量受損細胞釋放至培養基中的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性，以評估麩胺酸誘導細胞 死亡的定量結果。利用PicoProbe^TM LDH-細胞毒性螢光分析套組(Catalog # K314-500；BioVision)及其操作手冊測量LDH活性。以自動微量盤分析儀(UVmax；Molecular Devices,San Francisco,CA)測量螢光產物(Ex/Em=535/587nm)評估LDH活性。

西方墨點法分析

依照公開文獻(Yang YC等，BMC Cancer 2007；7：216)所示步驟進行細胞裂解、分劃和SDS-PAGE電泳。在此所使用的抗體為Phospho-Stat3和STAT3(1：1000倍稀釋)之抗體。以合適的IgG-HRP次級抗體(Santa Cruz Biotechnology)和ECL試劑(Amersham Biosciences)偵測標的蛋白。

即時定量聚合酶連鎖反應(Quantitative Real-time PCR)

利用TRIzol(Invitrogen)從細胞中萃取總RNA。利用oligo(dT)引子和反轉錄酶(Superscript III；Invitrogen)，以總RNA(1μg)於50℃經50分鐘進行cDNA合成。簡言之，cDNA之定量是利用DNA Master SYBR Green I套組(Roche)於LightCycler(Roche,Mannheim,Germany)中所完成，循環條件為：初始變性溫度為95℃，10分鐘，接著進行40個循環(95℃，10秒、60℃，10秒、和72℃，10秒)，最終置於72℃溫度下。數據以△△Ct計算。所述基因表現以GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)之表現進行校正。PCR引子為小鼠生存素正股引子：5'-TGCCACGATGGTGATGAAAC-3'(序列編號：27)、反股引子：5'-TGACGGGTAGTCTTTGCAGT-3'(序列編號：28)(登錄號：NM_001012273.1；PCR產物：136bp)；小鼠GAPDH正股引子：5'-AACGGATTTGGCCGTATTGG-3'(序列編號：29)、反股引子：5'-CATTCTCGGCCTTGACTGTG-3'(序列編號：30)(NM_001289726.1；149bp)。為了分析兔子發炎性基因表現，PCR引子為兔子TNF-α正股引子：5'-CCTGTGCCTCCCTTCACTTA-3'(序列編號：31)、反股引子：5'- CCCTTAGGGAGCAGAGGTTC-3'(序列編號：32)(登錄號：NM_001082263.1)；兔子IL-1β正股引子：5'-CCTGTTCTTTGAGGCCGATG-3'(序列編號：33)、反股引子：5'-GCCGGAAGCTCTTGTTGTAG-3'(序列編號：34)(NM_001082201.1)；兔子GAPDH正股引子5'-AGGTCATCCACGACCACTTC-3'(序列編號：35)、反股引子5'-GTGAGTTTCCCGTTCAGCTC-3'(序列編號：36)(登錄號：NM_001082253.1)。PCR產物和GAPDH mRNA對照物之循環閾值用以計算mRNA之相對量。

動物實驗

在此所有實驗過程經馬偕紀念醫院審查委員會同意並遵循視覺及眼科學學術研究會議(ARVO)所訂定的動物實驗眼科和視覺研究相關規定。

視網膜缺血-再灌注(I/R)動物模型

實驗步驟經馬偕紀念醫院審查委員會同意。手術過程於無菌環境下完成。將Sprague-Dawley成鼠(10週齡)(初始體重=312±11克)以腹腔注射的方式施用賽拉嗪(10毫克/公斤)進行犧牲。將胜肽溶於0.85%生理食鹽水(1mM)，在誘導I/R之前，利用微量注射器(31-G)以結膜下注射(subconjunctival injection)方式施用胜肽。生理食鹽水作為載體控制組。於注射胜肽或載體後4小時，完成I/R大鼠之製備。以0.5%托吡卡胺(tropicamide)和0.5%去氧腎上腺素(phenylephrine)散瞳。利用加熱毯使大鼠體溫保持在37℃。瞳孔散大後，右眼前房以連接生理鹽水之27號針進行插管。將儲存袋(reseryoir)置於眼睛上方150公分，使眼內壓(intraocular pressure)(IOP)升高至110mmHg，並且藉由觀察虹膜白化和視網膜紅反射喪失確認視網膜缺血。於缺血90分鐘後，移除插管，眼內壓(IOP)回復至正常值，進而恢復視網膜動脈血液供應，並誘導再灌注損 傷產生。藉由紅反射確認再灌注。於術前和術後眼睛局部施用0.4%鹽酸氧丁卡因(oxybuprocaine hydrochloride)(1或2滴)和氧氟沙星眼用凝膠(Ofloxacin ophthalmic gel)(0.3%)以進行角膜麻醉。大鼠左眼進行假手術(sham procedure)作為動物內控制(intra-animal control)。

I/R誘導視網膜損傷之組織學評估

於I/R損傷後14天，利用過量的戊巴比妥(pentobarbital)(靜脈注射100毫克/公斤體重)犧牲大鼠(每組n=6)，角膜12點鐘位置以絲線縫合標記眼球，接著進行眼球摘除，並以4%多聚甲醛(paraformaldehyde(PFA)進行固定(4℃，24小時)。經固定後，移除前段，眼球含視盤之後方以連續梯度之乙醇進行脫水並以石蠟包埋。於蘇木和伊紅(H&E)染色，利用切片機沿縱向經線(vertical meridian)通過視神經頭切取複數切片(5μm厚)，於配有CCD照相機(200×)之光學顯微鏡下觀察(Leica,Heidelberg，Germany)。為了量化視網膜I/R損傷程度，本實驗測量了視網膜中央總厚度(OT，在GCL至ONL之間)、內核層(INL)和外核層(ONL)。利用線性細胞密度(每200μm之細胞)計算神經節細胞層(GCL)中的細胞數。每隻眼睛取三個部份平均，並取六隻眼睛的平均值記錄之，作為每組的代表值。

I/R損傷視網膜之TUNEL染色

於I/R後20小時，以過量的戊巴比妥(pentobarbital)犧牲大鼠(每組n=6)。眼球經摘除後以4% PFA固定(4℃，24小時)。以石蠟包埋經固定之視網膜。為了鑑別視網膜細胞凋亡，去除切片(厚度5μm)(通過視盤)上的石蠟，復水，以蛋白酶K(20μg/mL)處理10分鐘，利用TUNEL套組(terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick-end labeling-based kit)(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,IN)並依據其操作手冊完成凋亡細胞之免疫螢光染色。以Hoechst 33258複染7分鐘來定位細胞核。於配備有CCD 照相機(Zeiss AxioCam HRm,Zeiss)(×400，6個視野/樣本)之螢光顯微鏡(epifluorescence microscope)(Zeiss Axioplan 2 imaging；Zeiss,Oberkochen,Germany)下觀察切片，並且以Axiovert軟體(Zeiss AxioVision Release 4.8.2,Zeiss)進行定量。每隻眼睛取三個部份平均，並取六隻眼睛的平均值記錄之，作為每組的代表值。

免疫螢光染色

經去除石蠟之視網膜切片以含10%羊血清和5%胎牛血清之PBST(0.5% TritonX-100)於室溫下處理20分鐘，以阻斷非特異性染色。利用對抗膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)(GFAP)(1：100稀釋)或Iba-1(1：100稀釋)初級抗體於37℃培育3小時完成染色。接著以標記有適當螢光物之二級抗體(1：500稀釋)於37℃培育1小時，接著以Hoechst 33258複染6分鐘。切片再經PBST潤洗三次，以FluorSave^TM試劑(Calbiochem)固定，再以螢光顯微鏡(epifluorescence microscope)(Zeiss Axioplan 2 imaging；Zeiss,Oberkochen,Germany)下觀察。每隻眼睛取三個部份平均，並取六隻眼睛的平均值記錄之，作為每組的代表值。

視網膜脈管之製備與分析

於I/R損傷後14天，以過量的戊巴比妥(pentobarbital)犧牲大鼠(每組n=6)，以4% PFA固定眼球(4℃，隔夜)，將視網膜分離，以PBST滲透5分鐘，水洗至隔夜，將其置於玻片上並以2.5%胰蛋白酶(50μl,Invitrogen,Carlsbad,CA)於37℃培育30分鐘，偶爾輕晃混合。將非血管細胞從脈管上刷掉，並用PBS沖洗。切片以異凝集素GS-IB4(Alexa Fluor 568 conjugate,1：200稀釋，Thermo Fisher Scientific)於37℃處理1小時進行染色，接著以Hoechst 33258複染10分鐘，以PBST潤洗，再以FluorSave^TM試劑固定，於螢光顯微鏡(epifluorescence microscope)(200×)下觀察。長度方向上皆無外皮細胞之小血管 被鑑定為退化的微血管，並以視網膜區域之每平方公釐記錄之。每隻眼睛取十個部份平均，並取六隻眼睛的平均值記錄之，作為每組的代表值。

糖尿病小鼠視網膜中血管異常之測量

於第1天和第3天腹腔注射鏈佐黴素(streptozotocin)(STZ；200毫克/公斤體重)至糖尿病小鼠。STZ以0.1M之檸檬酸緩衝液(citrate buffer)(pH 4.5)新鮮製備。於注射後，提供小鼠10%蔗糖至隔夜，避免突發性低血糖休克。於一週後(第7天)，非空腹血糖>500毫克/dl之小鼠定義為糖尿病小鼠，供實驗使用。以平衡鹽溶液(balanced salt solution,BSS)作為胜肽載體(Alcon,Novartis)。局部施用6-mer類似物眼滴劑(溶於BSS，200μM)至眼睛，施用方式為一日三次。於兩週後(第14天)，小鼠腹腔注射FITC-BSA(100毫克/公斤)經30分鐘測定視網膜的血管病灶(出血區域)處。接著實驗動物以吸入CO₂之方式犧牲，摘除眼球並以4% PFA固定(4℃，隔夜)，並將其平放固定於玻片上得到光學切片。視網膜中的血管病灶處之評分是藉由螢光顯微鏡(epifluorescence microscopy)(200×)下觀察玻片樣本之四個視網膜象限。在視網膜中央處和周邊處每一象限內採集三個顯微鏡視野，並且數據以病灶處/視網膜之平均數呈現。

乾眼症動物模型

動物

本實驗採用七至八週齡的C57BL/6小鼠(每隻體重約18至25克)。實驗過程經馬偕紀念醫院審查委員會同意並遵循視覺及眼科學學術研究會議(ARVO)所訂定的動物實驗眼科和視覺研究相關規定。

誘導乾眼症

將小鼠置入於人工環境室(controlled environment chamber；CEC)中14天，並依據Barabino等人(IVOS(2005)46(8),2766-2771)所揭示的實驗 步驟，誘導小鼠產生乾眼症。置入CEC的小鼠暴露在一濕度相對較低的環境下，相對濕度(RH)<25%；溫度為20至22℃；空氣流量為15公升/分；每日12小時。控制組的小鼠置於正常的環境(RH>50%；空氣流量為0；溫度為20-22℃)並經過相同的期間。

治療

利用一般人工淚液製劑，即，1%羧甲基纖維素(carboxymethylcelllulose,CMC)溶於平衡鹽溶液(balanced salt solution,BSS)作為所述胜肽載體。局部施用胜肽(100μM，約0.7μg胜肽溶於10μl眼滴劑中以治療單眼)或1% CMC載體至眼睛，一日三次。為了測試本發明合成胜肽對於乾眼症是否會產生任何治療作用，小鼠置於CEC飼育14天且不接受局部治療，接著再以本發明胜肽治療4天。

角膜螢光染色

腹腔注射舒泰(zoletil)(6mg/kg)和賽拉嗪(3mg/kg)混合物麻醉動物。利用局部螢光素(Fluor-I-Strip,Ayerst Laboratories,Philadelphia,PA)染色測定角膜上皮損傷。角膜螢光染色以裂隙燈顯微鏡(slit-lamp biomicroscope)，於鈷藍光(cobalt blue light)下觀察，並以數位相機擷取影像。角膜染色以單盲方式計分，計分方式如下：無點狀染色，分數為0；低於1/3角膜被染色，分數為1；2/3或低於2/3角膜被染色，分數為2；以及當高於2/3角膜被染色，分數為3(Horwath-Winter J 2013)。

角膜上皮細胞培養和治療

從紐西蘭白兔(6月齡)分離角膜輪部上皮幹細胞(Limbal stem epithelial cells,LSEC)，以DMEM/F-12基礎培養基細胞懸浮培養連續培養14天使細胞分化成上述之角膜樣上皮細胞(Ho等人，Stem Cell.2013；31：1775)。LSEC(2×10⁵細胞/孔，6孔盤)以混合有6-mer變異胜肽(20μM)的基礎培養基 (含2% FBS)處理6小時，接著直接以90mM NaCl處理，使細胞處於高滲透(HOP)環境下。經3小時後，以定量即時PCR(quantitative real-time PCR)評估HOP誘導腫瘤壞死因子(TNF)-α和白介素-1β(IL-1β)之表現。培養於DMEM/F-12基礎培養基之細胞(309mOsm)作為陰性對照。

統計

結果取自於三次獨立試驗。所用數值以mean±SD表示。利用Mann-Whitney試驗進行兩組間之比較。P<0.05為具有顯著性。

實施例1 神經保護胜肽之鑑定和特性

1.1神經保護胜肽之鑑定

在此實施例中，合成表二所示之系列短合成胜肽，並依據「材料與方法」一節所述方法於Neuro-2a神經母細胞中以麩胺酸誘導細胞死亡來評估神經保護效果。此外，每一個合成胜肽(序列編號：2-11)之第一個胺基酸殘基(即，絲胺酸)為右旋胺基酸，以增加其對於蛋白酶的抗性。

簡而言之，細胞以特定胜肽(即，序列編號：2至11任一序列)進行前處理(4小時)，再以100mM麩胺酸處理6小時。以市售乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)細胞毒性分析套組偵測細胞死亡。結果示於第1圖。

如第1圖所示，麩胺酸隨時間逐漸導致細胞死亡(7.6±0.8%；添加麩胺酸之胜肽溶劑DMSO作為陽性控制組)。值得注意的是結果顯示只有6-mer-dS胜肽(SLGAEQ；序列編號：9)對於Neuro-2a細胞展現保護效力，而胺基酸殘基多於6個的胜肽(即，13-mer dS至7-mer dS(序列編號：2至8)和胺基酸殘基少於6個的胜肽(即，5-mer dS或4-mer dS(序列編號：10或11)無任何細胞保護效力(1.5±0.5% vs.8.2±006%-11.4±0.3%)。

結果顯示在6-mer dS(SLGAEQ；序列編號：9)中第六個胺基酸殘基是關鍵殘基，其保留6-mer之神經保護活性。結果也顯示精胺酸(R)殘基(7-mer dS之最後一個胺基酸；序列編號：8)可能對6-mer之生物功能有抑制作用。

1.2 分析6-mer dS胜肽之特性

1.2.1 6-mer dS胜肽誘導經STAT3依賴方式表現生存素

生存素(Survivin)是STAT3(信號轉導子和轉錄激活子)之轉錄標的，其對於缺血過程中神經存活極為重要。因此，本實施例研究STAT3訊號對於6-mer dS之神經保護效力的影響。結果示於第2圖。

西方墨點分析的結果顯示藉由6-mer dS刺激C2C12肌母細胞，於刺激後5-20分鐘造成STAT3磷酸化。相反地，5-mer dS無展現相同或類似的效力(第2圖，(A))。

再者，相較於經溶劑處理的C2C12細胞，經6-mer dS刺激後3小時，C2C12細胞中生存素mRNA的量顯著上升2.6-倍(第2圖，(B))。經其他胜肽(即，序列編號：2-8或10-11任一序列)處理之C2C12細胞之結果無此類誘導效果。

本實施例亦使用其他已知的藥學抑制劑包含STAT3pep和STAT3抑制子V來探索生存素誘導之分子機制。real-time qPCR分析結果顯示經STAT3抑制劑(即，STAT3pep或STAT3 inhibitor V)前處理的細胞中，藉由6-mer dS所誘導的生存素mRNA表現被抑制，自2.6-倍至1.3-倍(第2圖，(B))。

綜上，本實施例的結果顯示6-mer dS胜肽是透過活化STAT3訊號路徑誘導生存素表現，以發揮神經保護作用。

1.2.2 麩胺酸殘基對於6-mer dS胜肽誘導生存素表現之重要性

為了進一步研究6-mer dS胜肽中胺基酸殘基的重要性，分別利用丙胺酸掃瞄和胺基酸置換產生6-mer變異物，其中6-mer dS胜肽的胺基酸殘基被丙胺酸或其右旋胺基酸系統性地取代，或者是被突變；所產生的6-mer變異物示於表三至表五。

類似實施例1.2.1之方法，利用C2C12細胞生存素mRNA的表現量作為評估表三至表五中6-mer變異物的指標。簡而言之，以6-mer變異物(20μM)處理低血清培養基中的C2C12細胞6小時。依據Real-time qPCR分析的結果顯示在生存素誘導方面，6-mer Sa(1.7-倍)、6-mer La(1.5-倍)、6-mer Ga(1.6-倍)、6-mer Ag(1.5-倍)和6-mer Qa(1.6-倍)能夠保留部份6-mer dS活性(*P<0.004vs.溶劑對造組；第3圖)。實驗結果可以證實麩胺酸(E)殘基被丙胺酸所取代，將嚴重損害6-mer的活性。

關於非天然胺基酸(右旋胺基酸)取代所產生的6-mer變異物之功能，Real-time qPCR分析顯示，相較於溶劑控制組，絲胺酸(S)被其右旋胺基酸殘基所取代能夠增加生存素mRNA的量(第4圖，dS vs.溶劑)，以6-mer dS作為陽性對照組，而當白胺酸(L)、丙胺酸(A)或麩醯胺酸(Q)被其相對應之右旋胺 基酸殘基所取代時，將顯著阻礙生存素基因誘導活性(第4圖，6-mer-dL、dA或dQ vs 6-mer dS)。麩胺酸(E)經其右旋胺基酸殘基所取代可中度誘導生存素mRNA量(第圖4，dE vs 6-mer dS)，其中該量仍顯著高於溶劑對照組。

胺基酸通常以側鏈(即，R基)之特性區分，因此，本實驗例之突變是以在R基中展現類似特性之其他胺基酸置換6-mer的胺基酸殘基(參見表五)。Real-time qPCR分析的結果示於第5圖，結果顯示相較於溶劑控制組，以異白胺酸(I)取代白胺酸(L)(6-mer Li)、以天冬醯胺酸(N)取代甘胺酸(G)(6-mer Gn)、以纈胺酸(V)取代甘胺酸(G)(6-mer Gv)，以麩胺酸(E)取代丙胺酸(A)(6-mer Ae)，或以天冬醯胺酸(N)取代麩醯胺酸(Q)(6-mer Qn)分別誘導生存素mRNA的量為2.1、1.5、2.3、1.5-和2.1-倍(第5圖；*P<0.05)。相對地，以酥胺酸(T)取代絲胺酸(S)(6-mer St)、以異白胺酸(I)取代丙胺酸(A)(6-mer Ai)、以絲胺酸取代丙胺酸(A)(6-mer As)，或是以天冬胺酸(D)取代麩胺酸(E)(6-mer Ed)會嚴重損害生存素mRNA誘導作用(即，相同或低於基本量)。

整體來說，實驗結果顯示6-mer dS(序列編號：9)6個胺基酸殘基中有5個殘基對於胺基酸取代有耐受性，而麩胺酸殘基(E)是6-mer胜肽具神經保護活性的關鍵。

實施例2 6-mer dS、6-mer Sa、6-mer Li、6-mer Gv和6-mer Qn保護視網膜對抗視網膜缺血/再灌注損傷

有多種眼疾例如，視網膜血管阻塞、急性青光眼、糖尿病視網膜病變、老年黃斑部病變(AMD)、視網膜剝離和早產兒視網膜病變與視網膜缺血/再灌注(I/R)損傷有關，該些疾病可能導致患者失明。視網膜缺血通常是由微血管所導致的，使得視網膜區域中的能量耗盡，接著自然再灌注會誘導強氧化壓力產生。經I/R損傷數小時後，將發生發炎反應及細胞死亡。基本上，這些生理反應會導致視神經和視網膜血管退化。

在此實施例中，利用「材料和方法」一節所述之I/R損傷大鼠模型研究6-mer變異胜肽對於神經視網膜細胞和視網膜血管系統之神經保護效力。簡而言之，於誘導I/R損傷前4小時，注射6-mer變異胜肽(1mM，120μl)至Sprague-Dawley鼠結膜下空間(subconjunctival space)。以增加眼內壓(IOP)至110mmHg(90分鐘)誘導I/R損傷，接著進行再灌注(20小時)。再以TUNEL染色評估視網膜細胞凋亡量。此外，在I/R損傷後14天，以H&E染色分析視網膜形態。結果摘要於第6圖至第10圖，以及表六至九。

請參見第6圖，其顯示6-mer dS或6-mer dE對於4-羥基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)誘導ARPE-19細胞凋亡之保護效力。4-羥基-2-壬烯醛(4-HNE)是脂質氧化的產物，被認為是最難以對付能夠與多種細胞標的形成加成物的反應醛之一，特別是參與氧化還原訊號傳遞之蛋白。值得注意的是，已有研究證實4-HNE能夠藉由損害ATPase活性影響粒腺體(如，破壞耗氧量)，甚至是觸發早發凋亡。實驗結果顯示6-mer dS能夠抑制4-HNE誘導之凋亡，並且6-mer dS的功效優於6-mer(第6圖，(B))。

I/R損傷經/未經6-mer胜肽(6-mer dS或6-mer St)處理的眼睛視網膜影像示於第7圖。以載體(vehicle)處理的假手術組(sham group)，經TUNEL染色的結果顯示視網膜細胞核為陰性；以載體處裡之I/R組中內核層(INL)、外核層(ONL)和神經節細胞層(GCL)中觀察到大量的螢光。相反地，以6-mer dS處裡的眼睛，於鼠視網膜TUNEL染色的結果中僅有少部份的綠色螢光核，而6-mer St無相同的功效(即，阻斷I/R誘導的視網膜細胞凋亡)。值得注意的是，參見表六所示，I/R損傷前結膜下注射6-mer Sa、6-mer Li、6-mer Gv或6-mer Qn胜肽能夠降低I/R誘導的視網膜細胞凋亡。

表六 鼠眼發生I/R損傷後20小時視網膜內TUNEL-陽性細胞數量之定量分析

請參見第8圖，該圖為I/R損傷後經/未經6-mer dS處理之眼睛，其視網膜區域經H&E染色的照片。於I/R損傷後14天，H&E染色視網膜橫切面結果顯示，相較於假手術控制組，載體I/R組之視網膜厚度減少。再者，相較於假手術控制組，I/R損傷之眼睛經單一結膜下注射6-mer dS能夠改善整體視網膜厚度，由此可見經6-mer dS處理能夠有效預防I/R-誘導之視網膜退化。在統計的結果而言，6-mer dS+I/R組整體視網膜、INL和ONL的厚度顯著大於載體+I/R組和控制組的結果(P>0.05)(表七)。本實施例的結果可以證實6-mer dS於I/R誘導之早期(20小時)能夠避免視網膜細胞凋亡，藉此於I/R損傷發生後14天能保持整體視網膜的厚度。本實驗例的結果亦可證實6-mer變異物有神經保護功效，能夠延緩視網膜退化。

發炎反應是I/R損傷延遲期之通常特徵，導致視網膜細胞死亡，進而破壞血管-視網膜屏障(BRB)。視網膜發炎與數個視網膜疾病相關，例如糖尿病視網膜病變和青光眼。微膠細胞和星狀細胞為視覺系統(視網膜、視神經和大腦視覺中心)固有的免疫細胞，且為反應炎症壓力之主要效應細胞。

如第9圖所示，於I/R損傷後第14天，視網膜發炎之免疫螢光染色結果顯示，相較於控制組，在經載體處理之I/R損傷眼睛中發現Iba-1-陽性微膠細胞(microglia)和GFAP-陽性星狀細胞(astrocyte)被顯著活化，而經6-mer dS處理之眼睛Iba-1-陽性微膠細胞和GFAP-陽性星狀細胞之活化較不顯著。此外，在所有組別中，發現此二效應細胞位於靠近GCL和沿著內視網膜邊緣處。平均而言，相較於6-mer dS+I/R組，在載體+I/R組中所觀察到的微膠細胞和星狀細胞的量明顯增加(表八)。綜上，6-mer dS能夠有效抑制視網膜中藉由I/R刺激微膠細胞和星狀細胞之病理性活化作用。

在視網膜I/R損傷模型中，視網膜內皮細胞和外被細胞(pericyte)死亡將造成無細胞微血管產生。為了測定於I/R損傷後，經6-mer dS處理是否能夠有效保護視網膜血管系統，整個視網膜分別利用異凝集素GS-IB4(結合至內皮細胞之螢光標記異凝集素)和Hoechst 33258(標記細胞核的螢光染劑)染色。相較於控制組(經假試驗之對側眼)，在經載體處理之I/R損傷的眼睛中無細胞微血管的數量上升(第10圖)。經6-mer dS處理減少了退化的微血管數量。無細胞微血管的定量結果摘要於表九。此外，無論是以載體或6-mer dS處理之對側眼的假手試驗中，對於視網膜血管系統皆無細胞毒性。總言之，6-mer dS胜肽能夠防止I/R誘導的視網膜微血管損傷。

綜合以上結果，I/R動物模型的研究顯示6-mer變異物(含6-mer dS、6-mer Sa、6-mer Li、6-mer Gv和6-mer Qn)可分別保護視網膜對抗I/R誘導的神經和血管損害，以及視網膜發炎反應。再者，動物研究結果指出結膜下注射6-mer變異物，能夠作為治療I/R-誘導視網膜損傷的潛在治療方案。

實施例3 6-mer dS能夠保護糖尿病小鼠視網膜血管系統

經I/R誘導的視網膜於顯微鏡下的外觀與糖尿病視網膜病變中無細胞微血管類似。為了評估6-mer dS對於糖尿病視網膜病變潛在效益，局部施用6-mer dS或載體眼滴劑至STZ-誘導之糖尿病小鼠的眼睛，每日施用三次，共 14天。以偵測異硫氰酸螢光素-牛血清白蛋白(FITC-BSA)外滲，研究視網膜血管的異常。顯微影像的結果顯示以載體處理的糖尿病小鼠的視網膜中有數個出血區域(第11圖)，而以6-mer dS眼滴劑處理的眼睛，其血管病灶數減少(2.8±0.6，6-mer dS vs.8.2±1.5，載體控制組)。

在視網膜中，內皮細胞、外被細胞和星狀細胞共同形成內視網膜微血管網絡中的血管-視網膜屏障。在糖尿病鼠中，星狀細胞參與擴增發炎反應的過程，進而導致視網膜的血管滲漏。請參見第12圖，該圖為STZ注射後第14天視網膜GFAP免疫螢光染色的結果，其顯示在載體/STZ組(相較於控制組)中，GFAP-陽性星狀細胞被大量活化，而在6-mer dS/STZ組中則較不明顯(數量/400×視野：24.3±2.7 vs.11.0±1.4)。由此可以證實，6-mer dS能夠有效抑制糖尿病小鼠視網膜中星狀細胞病理性活化。

非增殖性糖尿病視網膜病變(NPDR)長久以來一直存在著缺乏適當治療方法的問題，這對於防止患者進一步發展成增殖性糖尿病視網膜病變(PDR)和/或糖尿黃斑水腫(DME)極為重要。6-mer dS眼滴劑在糖尿病視網膜病變的早期能夠有效預防視網膜發炎和血管異常，並且能夠將新療法發展至臨床應用。

實施例4 6-mer dS促進角膜傷口癒合

重度乾眼症(DED)是經常伴隨角膜上皮細胞受損。在此實施例中，本實施例依照「材料和方法」所述的步驟建立鼠乾眼症模型，以評估6-mer變異胜肽對於受損角膜的治療效果。

簡言之，小鼠置入可控環境室(controlled environment chamber,CEC)中14天(設為第0天)，誘導角膜表面角膜破裂。利用角膜螢光染色評估角膜表面的損傷，並且染色分數為2之動物(小鼠置於CEC14天之後)，以胜肽進行治療。用以治療乾眼症之6-mer變異胜肽的配方如材料與方法所述。於6-mer dS治療4天後，於角膜螢光染色的結果發現，相較於第0天的染色分數，經治療的角膜螢光染色分數大幅降低(分數：經治療：1.4±0.2 vs.第0天：3±0；第圖13)。另外，施用載體、6-mer dA或6-mer St治療4天未產生治療功效。

眾所皆知的是在乾燥壓力誘導之乾眼動物中是藉由發炎反應所誘導和/或促使眼睛表面受損。在促發炎介質中，研究指出抑制IL-1β和TNF-α有助於減輕動物乾眼的症狀。此外，在乾眼症中淚液滲透壓上升被認為是誘導發炎和眼部表面受損的核心機制。

為了調查6-mer變異物是否能夠抑制角膜上皮細胞中高透壓對於促發炎基因表現的影響，分離兔角膜上皮細胞並經培養擴增，接著在細胞培養於高滲透壓培養基(463mOsM；添加90mM NaCl)前，先以6-mer變異物胜肽(20μM)處理6小時。培養在基礎培養基(309mOsm)中的細胞作為陰性控制組。

於細胞培養於高滲透壓培養基3小時後，利用Real-time qPCR測定促發炎媒介物(包含TNF-α和IL-1β之之基因表現)之mRNA量。結果顯示，相較於基礎培養基(僅含溶劑)中的細胞培養物，TNF-α和IL-1β mRNA顯著向上調節12.8和4.5倍(第14圖)。然而，利用6-mer dS、6-mer Sa或6-mer Gv前處理6小時的細胞，其TNF-α和IL-1β被大幅度抑制。

發炎是造成乾眼症發生的主要因子。所述結果可以證實6-mer dS、6-mer Sa和6-mer Gv確實可作為抗發炎製劑，改善角膜傷口癒合。

綜上，上述實施例的結果可以證實本揭示內容之胜肽與有神經保護功效，可用來治療和/或預防與神經退化疾病(如，視網膜缺血/再灌流損傷、傷口癒合、乾眼症等)相關的疾病或症狀。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原 理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

<110> 台灣基督長老教會馬偕醫療財團法人馬偕紀念醫院

<120> 短合成胜肽及其治療視網膜退化性疾病和/或組織損傷的用途

<130> P4002-TW

<160> 26

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> VARIANT

<222> 1

<223> Xaa is Ser or Ala

<220>

<221> VARIANT

<222> 2

<223> Xaa is Lau,Ala or Ile

<220>

<221> VARIANT

<222> 3

<223> Xaa is Gly,Ala,Val or Asn

<220>

<221> VARIANT

<222> 4

<223> Xaa is Ala,Gly or Glu

<220>

<221> VARIANT

<222> 6

<223> Xaa is Gln,Ala or Asn

<400> 1

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；13-mer-dS

<400> 2

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；12-mer-dS

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；11-mer-dS

<400> 4

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；10-mer-dS

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；9-mer-dS

<400> 6

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；8-mer-dS

<400> 7

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；7-mer-dS

<400> 8

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer-dS

<400> 9

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；5-mer-dS

<400> 10

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；4-mer-dS

<400> 11

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer Sa

<400> 12

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer La

<400> 13

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer Ga

<400> 14

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer Ag

<400> 15

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer Ea

<400> 16

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer Qa

<400> 17

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer St

<400> 18

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer Li

<400> 19

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer Gv

<400> 20

<210> 21

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer Gn

<400> 21

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer Ae

<400> 22

<210> 23

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer Ai

<400> 23

<210> 24

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer As

<400> 24

<210> 25

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer Ed

<400> 25

<210> 26

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成；6-mer Qn

<400> 26

Claims (8)

1. 一種合成胜肽，具有序列編號：9、12、13、14、15、17、19、20、21、22或26中任一胺基酸序列，其中當序列編號：1具有SLGAEQ(序列編號：9)之序列時，該絲胺酸(S)或該麩胺酸(E)是右旋胺基酸。
2. 如請求項1所述之合成胜肽，其中該胺基酸序列之N-端被乙醯化並且該胺基酸序列之C-端被醯胺化。
3. 一種藥學組合物，包含如請求項1所述之合成胜肽和一藥學上可接受載體。
4. 如請求項3所述之藥學組合物，其中該藥學上可接受載體是選自於以下所組成之群組中：液體、凝膠、乳霜和軟膏。
5. 一種合成胜肽用以製備可治療視網膜退化性疾病或組織損傷之醫藥品的用途，其中該該合成胜肽具有序列編號：9、12、13、14、15、17、19、20、21、22或26中任一胺基酸序列，且其中當序列編號：1具有SLGAEQ(序列編號：9)之序列時，該絲胺酸(S)或該麩胺酸(E)是右旋胺基酸。
6. 如請求項5所述之用途，其中該胺基酸序列之N-端被乙醯化並且該胺基酸序列之C-端被醯胺化。
7. 如請求項5所述之用途，其中該視網膜退化性疾病是糖尿病視網膜病變、老年黃斑部病變(AMD)、網膜色素病變(RP)、青光眼或急性紫外線視網膜病變。
8. 如請求項5所述之用途，其中該組織損傷是乾眼症(DED)或視網膜缺血/再灌流損傷。

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