CN110025765B

CN110025765B - 软骨细胞的细胞外基质来源的肽

Info

Publication number: CN110025765B
Application number: CN201910099020.1A
Authority: CN
Inventors: 梁在郁
Original assignee: Eyebio Korea
Current assignee: Eyebio Korea
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2017-02-09
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2037-02-09
Also published as: EP3539559B1; JP6770169B2; WO2017175963A1; US10532084B2; US20190111112A1; EP3441081B1; CN110025765A; CN109310731A; AU2017247626B2; AU2019200063B2; ES2819030T3; CN109310731B; EP3539559A1; ES2822289T3; AU2019200063A1; JP2019519597A; US20190100572A1; US10709768B2; AU2017247626A1; JP2019065013A

Abstract

本发明涉及一种具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽，具体而言，本发明提供了一种从动物软骨细胞来源的细胞外基质分离的基于II型胶原蛋白α1的肽及其应用。

Description

软骨细胞的细胞外基质来源的肽

本申请是申请日为2017年2月9日、发明名称为“软骨细胞的细胞外基质来源的肽”的申请号为201780035505.3的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种新的肽及其应用。

背景技术

细胞外基质(ECM)是组织中除细胞外的其余成分，其由细胞分泌的各种结构分子和功能分子的三维组合组成，并且由于其特性和功能尚未完全确定，因此无法对其进行人工合成。细胞外基质在维持细胞环境中扮演重要角色，同时还能决定组织的物理性质(如牵引力、抗压强度和组织形状的弹性)，并控制渗透压、离子的渗透性等。

此外，细胞外基质具有很多生长因子和细胞因子，并在决定细胞功能方面扮演重要角色，并且特别是，其调节胎儿和生长阶段的细胞的分化或者为组织生长提供方向，同时增加或减少细胞粘附和代谢活动。

细胞外基质具有：用于决定组织的物理性质的蛋白质，如胶原蛋白和弹性蛋白；以及用于连接细胞和细胞外基质的糖蛋白，如纤连蛋白、层粘连蛋白；以及充当支撑物以保持体积的多种蛋白聚糖，如硫酸软骨素。细胞外基质通过维持组织的形状和体积，并与组织中的细胞积极相互作用，得以作为独特的组织或器官来维持和发挥功能。然而，细胞外基质的组成和结构尚未完全阐明。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种新的肽，所述肽通过抑制或改善由角膜的炎症、新生血管化、浑浊和纤维化引起的病理变化，能够预防或治疗眼表疾病。

技术方案

本发明提供了具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽。

本发明提供了用于预防或治疗眼表疾病的药物组合物，所述药物组合物包含具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽作为活性成分。

本发明提供了用于预防或治疗黄斑变性的药物组合物，所述药物组合物包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽作为活性成分。

本发明提供了用于预防或治疗干眼症的药物组合物，所述药物组合物包含具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽作为活性成分。

有益效果

本发明的新的肽已被证实降低角膜浑浊、新生血管化和纤维化；并在由碱烧伤诱导眼表病理变化的动物模型中抑制炎症诱导因子的表达；并且通过有效地抑制视网膜和脉络膜(其中已诱导了组织变化)中的血管生成来预防和改善黄斑变性；以及抑制或改善角膜上皮细胞的病理变化，所述病理变化如眼球泪液量的减少、角膜表面的不规则性和结膜杯状细胞的缺失；并因此能够提供包含所述肽作为活性成分的组合物作为用于预防或治疗眼部疾病的药物组合物。

附图说明

图1为合成的羟脯氨酸-GQDGLAGPK肽的报告。

图2示出了使用HPLC对羟脯氨酸-GQDGLAGPK肽的纯度进行分析的结果。

图3示出了通过离子质谱对羟脯氨酸-GQDGLAGPK肽的分子量进行确认的结果。

图4示出了确认Hyp-GQDGLAGPK在用碱烧伤的兔角膜中的作用的结果；图4A是在碱烧伤后第0天、第7天和第17天通过显微镜(SZX7，Olympus，Tokyo，日本)拍摄的兔角膜的照片(比例尺＝10mm)；图4B为示出角膜新生血管化程度的图表；以及图4C为示出角膜浑浊度的图表。所述图表示出了各测试组的平均值±标准偏差(n＝5)，并通过t检验，相比于碱烧伤组的值，*P<0.05被视为是显著的。

图5示出了确认Hyp-GQDGLAGPK对用碱烧伤的兔角膜的厚度变化的影响的结果；图5A为通过虚拟显微镜(NanoZoomer 2.0RS，Hamamatsu，日本)拍摄的组织切片的照片(比例尺＝1mm)；以及图5B为示出角膜厚度的图表。

图6示出了在通过Masson三色染色法对眼部成纤维细胞进行免疫染色后用虚拟显微镜(NanoZoomer 2.0RS，Hamamatsu，日本)拍摄的照片(比例尺＝100μm)，从而确认Hyp-GQDGLAGPK对用碱烧伤的兔角膜纤维化变化的影响；并且以褐色显示的部分为成纤维细胞。

图7示出了确认Hyp-GQDGLAGPK对用碱烧伤的兔中的血管生成标志物的作用的结果，且图7为通过虚拟显微镜(NanoZoomer 2.0RS，Hamamatsu，日本)拍摄的用特异性抗体CD31、FGF和VEGF进行免疫染色的组织切片的照片(比例尺＝300μm)。

图8示出了确认Hyp-GQDGLAGPK对用碱烧伤的兔中的炎症标志物的作用的结果，且图8为在用特异性抗体(如巨噬细胞、TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-6和MMP-9)对组织切片进行免疫组化染色后通过虚拟显微镜(NanoZoomer 2.0RS，Hamamatsu，日本)拍摄的照片(比例尺＝300μm)。

图9示出了确认在用胶原蛋白、GDRGD(CPI)和羟脯氨酸-GQDGLAGPK(CPII)处理的HUVEC细胞中对血管生成的抑制作用的结果。

图10示出了确认激光照射后14天内由激光照射引起的血管生成和组织塌陷的程度的结果。

图11示出了对脉络膜血管新生化的抑制作用：由激光照射动物模型后，用浓度为2μg、10μg和20μg的胶原蛋白或浓度为2μg-20μg的GDRGD(CPI)和羟脯氨酸-GQDGLAGPK(CPII)处理所述动物模型。

图12示出了确认对脉络膜血管新生化的抑制作用的结果：由激光照射动物模型后，分别用浓度为5μg的阿瓦斯汀(Avastin)或羟脯氨酸-GQDGLAGPK(CPII)处理所述动物模型。

图13示出了实时RT-PCR的结果，确认了VEGF、ICAM和MCP-1的基因表达水平：由激光照射动物模型后，分别用浓度为5μg的阿瓦斯汀或羟脯氨酸-GQDGLAGPK(CPII)处理所述动物模型，并在激光照射14天后从视网膜和脉络膜提取RNA。

图14示出了确认所获得的视网膜和脉络膜提取物中的VEGF、VEGFR-1(Flt-1)、VEGR-2(Flk-1)和血管生成素2的蛋白质表达水平的蛋白质印迹的结果：由激光照射动物模型后，分别用浓度为5μg的阿瓦斯汀或羟脯氨酸-GQDGLAGPK(CPII)处理所述动物模型，并在激光照射14天后进行提取。

图15示出了作为以平均值±标准差表示的定量结果的由在NOD.B10.H2b小鼠中用生理盐水、Hyp-GQDGLAGPK、胶原蛋白、CsA、DQS和HA进行的处理引起的各小鼠的泪滴量的变化，其中去除了干燥应激。通过向NOD.B10.H2b小鼠的眼中注射生理盐水、Hyp-GQDGLAGPK、胶原蛋白、CsA、DQS和HA，持续3天、5天、7天和10天，并测量小鼠的泪滴量。^*P<0.05vs.DS10D组；^#P<0.05vs.生理盐水组；^§P<0.05vs.Hyp-GQDGLAGPK处理组；

CsA处理组；

DQS处理组；^&P<0.05vs.HA处理组。

图16示出了Hyp-GQDGLAGPK肽对角膜表面屈曲的作用；图16A示出了在NOD.B10.H2b小鼠(DS)中用生理盐水、Hyp-GQDGLAGPK、胶原蛋白、CsA、DQS和HA处理3天、5天、7天和10天的各组的眼部图像结果(比例尺＝1mm)，其中去除了干燥应激；以及图16B示出了作为以平均值±标准差表示的定量结果的用生理盐水、Hyp-GQDGLAGPK、胶原蛋白、CsA、DQS和HA处理的小鼠的角膜表面的光滑度评分的变化。^*P<0.05vs.DS 10D组；^#P<0.05vs.生理盐水组；^§P<0.05vs.Hyp-GQDGLAGPK处理组；

CsA处理组；^&P<0.05vs.HA处理组。

图17示出了Hyp-GQDGLAGPK肽对角膜上皮细胞脱落的作用；图17A示出了苏木精和伊红染色的结果(比例尺＝100μm)，确认了向NOD.B10.H2b小鼠的角膜给予生理盐水、Hyp-GQDGLAGPK、胶原蛋白、CsA、DQS和HA后10天的角膜上皮细胞脱落程度；以及图17B为示出角膜上皮细胞脱落程度的定量结果，以平均值±标准差表示(^*P<0.05vs.DS 10D组)。

图18示出了Hyp-GQDGLAGPK肽对结膜杯状细胞分布的作用；图18A示出了向其给予生理盐水、Hyp-GQDGLAGPK、胶原蛋白、CsA、DQS和HA的NOD.B10.H2b小鼠的结膜的PAS染色结果(比例尺＝200μm)；以及图18B为示出了结膜杯状细胞分布程度的定量结果，以平均值±标准差表示(^*P<0.05vs.DS 10D组)。

图19示出了NOD.B10.H2b小鼠的泪腺中的TNF-α、ICAM-1、VCAM-1、MMP-2和MMP-9表达水平的免疫组化分析的结果，并且该结果确认了通过向小鼠给予生理盐水、Hyp-GQDGLAGPK、胶原蛋白、CsA、DQS和HA并经过10天后的炎症因子的表达程度(比例尺＝100μm)，其中去除了干燥应激。

具体实施方式

本发明提供了具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽。

所述肽的第一个氨基酸可为羟脯氨酸(Hyp)，并且更优选地，所述肽可为羟脯氨酸-GQDGLAGPK。

所述肽可来源于II型胶原蛋白α1，且所述II型胶原蛋白α1可从动物软骨细胞来源的细胞外基质分离。

所述软骨细胞来源的细胞外基质可从由动物软骨来源的软骨细胞分泌形成的软骨细胞来源的细胞外基质和/或软骨组织中分离，并且所述动物可选自于由猪、马、牛、绵羊、山羊和猴所组成的组，但不限于此。

本发明所述的“肽”是其中至少两个α-氨基酸通过肽键相连的化合物，并且根据组成氨基酸的数目被称为二肽、三肽或四肽。且寡肽具有约10个以下的肽键，而多肽具有许多肽键。

本发明所述的肽采用化学方法(Peptide Chemistry,A practical Textbook，Mikos Bodansky，Springer-Verlag，Berlin)进行制备。例如，肽通过固相技术(Roberge JY等(1995)，Science 269:202-204)合成，从树脂切下并通过高效液相色谱纯化(如，Creighton(1983)，Proteins Structures and Molecular Principles，WH Freeman andCo,New York NY)。

本发明还提供了用于预防或治疗眼表疾病的药物组合物，所述药物组合物包含具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽作为活性成分。

所述眼表疾病可为选自于由角膜浑浊、角膜新生血管化、角膜炎症和角膜纤维化所组成的组中的任一种。

根据本发明的一个实例，被诱导碱烧伤的动物模型在碱烧伤后立即显现出角膜浑浊(如图4A所示)，并且在碱烧伤7天后角膜新生血管化和浑浊增加，但用生理盐水或Hyp-GQDGLAGPK肽分别将其中已确诊角膜血管生成和浑浊的动物模型处理10天(碱烧伤后17天)，并且对照组的角膜浑浊评分显著增加到3.0±0.0(如图4B和图4C所示)，而在用肽处理的实验组中观察到浑浊度减小(如图4B所示)。

根据本发明的另一实例，进行Masson三色染色来确认Hyp-GQDGLAGPK肽对由碱烧伤引起的角膜纤维化的作用，并且如图6所示，确认了在碱烧伤的对照组的情形中，在碱烧伤的基质区域内褐色成纤维细胞的形成增加，但在用Hyp-GQDGLAGPK肽处理的实验组中，成纤维细胞的增加被抑制。此外，进行H&E染色来确认由碱烧伤引起的角膜组织学改变，结果确认了在角膜中碱烧伤诱导上皮增生、炎症细胞浸润、发作性水肿(seizure edema)和新生血管化(参见图7上方部分)。

然而，关于组织学变化，用Hyp-GQDGLAGPK肽处理的实验组表现出提升的改善效果，并且如图5A所示，H&E染色结果显示在经肽处理的组织内，新生血管化得以显著改善。

根据本发明的另一实例，为了确认各肽对炎症标志物表达的作用，针对炎症特异性标志物(例如巨噬细胞、TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-6和MMP-9)对角膜切片进行免疫组化染色，且结果如图8所示，碱烧伤增加了巨噬细胞在上皮、上皮下膜和增生性基质中的表达，而用Hyp-GQDGLAGPK肽处理的实验组有效地抑制了巨噬细胞的表达。此外，在碱烧伤组中观察到了炎症细胞因子(包括TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1黏附分子)的表达，但在经肽处理的实验组中炎症因子的表达减少。而且，在碱烧伤组的角膜中强烈地观察到MMP-9的表达，而在经肽处理的实验组中，MMP-9的表达受到抑制。

由这些结果证实了Hyp-GQDGLAGPK肽对预防或治疗角膜浑浊、角膜血管生成、角膜炎症和角膜纤维化而言是有效的。

所述具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽可来源于从软骨细胞来源的细胞外基质(CDEM)中分离的II型胶原蛋白α1。

具体而言，所述软骨细胞来源的细胞外基质可从由动物软骨来源的软骨细胞分泌形成的软骨细胞来源的细胞外基质和/或软骨组织中分离，并且所述动物可选自于由猪、马、牛、绵羊、山羊和猴所组成的组，但不限于此。

所述具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽可以是其第一个氨基酸为羟脯氨酸的肽，更优选的是羟脯氨酸(Hyp)-GQDGLAGPK。

基于100重量份的总的药物组合物，可以以0.1重量份至50重量份的量包含所述具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽。

所述药物组合物可为选自于由如下所组成的组中的任一种制剂：滴眼液、注射剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、凝胶剂、糖浆剂、混悬剂、乳剂、滴剂和液体剂。

此外，本发明可提供用于预防或治疗黄斑变性的药物组合物，所述药物组合物包含具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽作为活性成分。

所述肽可来源于II型胶原蛋白α1。

所述具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽可为其第一个氨基酸是羟脯氨酸的肽，并且更优选为羟脯氨酸-GQDGLAGPK。

所述肽可通过抑制眼睛的新生血管化来预防或治疗黄斑变性，且所述黄斑变性可为年龄相关性黄斑变性，但不限于此。

根据本发明的一个实例，用激光照射小鼠以损伤其眼球，并在14天后摘取眼球用于H&E染色。

如图10所示，结果证实了处于激光照射部位的组织塌陷并形成血管生成。另一方面，如图11所示，在激光照射后分别用2μg的胶原蛋白、CPI和CPII处理的实验组中，CNV病变减轻。

此外，将羟脯氨酸-GQDGLAGPK(CPII)(CPII在体外管形成实验中具有最佳的抗血管生成能力)的脉络膜新生血管的抑制作用与阿瓦斯汀(阳性对照组)的脉络膜新生血管的抑制作用进行比较，且如图11所示，病变大小比对照组的显著减小，并且确认与阳性对照组(用相同浓度的阿瓦斯汀处理)的病变大小相似。

根据上述结果，羟脯氨酸-GQDGLAGPK肽可表现出对由血管生成引起的年龄相关性黄斑变性具有优异的治疗作用。

本发明还提供了用于预防或治疗干眼症的药物组合物，所述组合物包含具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列的肽作为活性成分。

所述具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽可来源于II型胶原蛋白α1。

具体而言，所述肽可为分离自软骨细胞来源的细胞外基质(CDEM)的肽，所述软骨细胞来源的细胞外基质可从动物软骨来源的软骨细胞分泌形成的软骨细胞来源的细胞外基质和/或软骨组织中分离，并且所述动物可选自于由猪、马、牛、绵羊、山羊和猴所组成的组，但不限于此。

所述肽可为其第一个氨基酸是羟脯氨酸的肽，并且更优选为羟脯氨酸(Hyp)-GQDGLAGPK。

所述肽能够恢复由干燥应激引起的泪液生成减少和角膜表面不均衡，并抑制角膜上皮细胞的脱落和炎症因子的产生。

根据本发明的一个实例，如图15所示，暴露至干燥应激的小鼠中的泪液的量比正常组(0.22±0.01μL)低约85.5％(DS 10D组，0.03±0.01μL，p<0.05)，但在去除干燥应激后，经Hyp-GQDGLAGPK处理的小鼠中处理10天后的泪液量(0.23±0.02μL)增加了7.9倍(p<0.05)，确认其比阴性对照组(生理盐水处理组)(0.08±0.01μL)高约2.8倍(p<0.05)，以及比阳性对照组(胶原蛋白处理组)(0.13±0.02μL)高约1.7倍(p<0.05)。

此外，Hyp-GQDGLAGPK处理组的泪液量分别比CsA处理组、DQS处理组和HA处理组的泪液量(0.13±0.02μL，0.16±0.02μL，0.14±0.01μL)高1.7倍(p<0.05)、1.4倍(p<0.05)和1.6倍(p<0.05)，并因此证实了Hyp-GQDGLAGPK在改善泪液量方面比在目前市场上可获取的干眼症治疗药物更加有效。

基于100重量份的总的药物组合物，可以以0.1重量份至50重量份的量包含所述肽。

所述药物组合物可为选自于由如下所组成的组中的任一种试剂：滴眼液、注射剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、凝胶剂、糖浆剂、混悬剂、乳剂、滴剂和液体剂。

在本发明的另一实施方式中，包含所述肽作为活性成分的用于预防或治疗眼表疾病的药物组合物可进一步包含选自于由如下所组成的组的至少一种添加剂，所述添加剂适用于在药物组合物的制造中常规使用：载体、赋形剂、崩解剂、甜味剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、滑性改性剂(slip modifiers)、矫味剂、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂。

载体、赋形剂和稀释剂的具体实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲丙酸酯、滑石、硬脂酸镁以及矿物油。用于口服给予的固体制剂可包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且这些固体制剂可通过在组合物中混合至少一种赋形剂(如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等)来制备。而且，除了简单的赋形剂之外，还可使用润滑剂，如硬脂酸镁和滑石。用于口服给予的液体制剂的实例包括混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂等；并且除了通常用作简单的稀释剂的水和液体石蜡之外，还包括各种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂。用于肠胃外给予的制剂包括无菌的水性溶液、非水性溶液、混悬剂、乳剂、冻干制剂、栓剂等。非水性溶液或混悬剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射酯(如油酸乙酯)等。可使用witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂精、甘油明胶等作为栓剂的基质。

根据本发明的一个实施方式，所述药物组合物可通过如下途径以常规方式向受试者给予：静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、动脉内、腹膜内、胸骨内、经皮、鼻内、吸入、局部、直肠、口服、眼内或皮内。

所述肽的优选剂量根据受试者的状况和体重、疾病的类型和程度、药物形式、给药途径和给药期而改变，并可由本领域技术人员适当进行选择。根据本发明的一个实施方式，每日剂量可为0.01mg/kg-200mg/kg、特别是0.1mg/kg-200mg/kg、更特别为0.1mg/kg-100mg/kg，但不限于此。给药可每日一次或分成数个剂量进行给予，这并不限制本发明的范围。

在本发明中，“受试者”可以是哺乳动物(包括人)，但不限于这些实例。

实施例

下文中将结合以下实施例对本发明进行详细描述。但应当指出的是，以下实施例是用于对本发明进行说明，而不是旨在对本发明的范围进行限制。提供本发明的实施例是为了向本领域技术人员更充分地描述本发明。

<实验实施例1>眼表疾病动物模型的制造

根据仁济大学医学院批准的动物实验手册和ARVO声明(No.:2014-028)进行用于眼和视觉研究的动物实验。

从Samtako公司(Osan，韩国)购买了26只2.0kg-2.5kg的新西兰白兔，然后将盐酸氯胺酮(30mg/kg体重，Huons，Jecheon，韩国)和盐酸甲苯噻嗪(2.5mg/kg，Bayer KoreaLtd.，Seoul，韩国)的混合物注入肌肉进行全身麻醉，并使用盐酸丙美卡因滴眼液(AlconInc.，Seoul，韩国)进行局部麻醉。

之后，将1N NaOH浸泡过的8mm滤纸暴露至兔子右角膜中心1分钟，以制备碱烧伤模型，并且在烧伤7天后，对由碱烧伤造成的角膜血管生成及角膜浑浊进行确认。

将兔子随机分为碱烧伤组(n＝5)和肽处理组(n＝5)。碱烧伤组中，每日给予生理盐水4次；而肽治疗组中，每日给予10mg/mL Hyp-GQDGLAGPK肽4次；并将左眼设为对照组。

在给予各处理物质10天后，进行H&E染色、Masson三色染色和免疫组化以确认纤维化、血管生成、炎症及角膜结构变化。

<实验实施例2>角膜新生血管化和角膜浑浊的鉴定

对角膜新生血管化和角膜浑浊进行临床评估。

从0分到3分评估角膜新生血管化的程度：没有血管生成为0分；血管生成处于角膜外周为1分；血管生成扩张至瞳孔边缘为2分；且血管生成扩张至瞳孔边缘以外的角膜中心为3分。当由于相当大的浑浊和广泛的睑球粘连而难以评估角膜新生血管化的程度时，将角膜血管生成评估为3分。

同样地，从0分到3分评估角膜浑浊：透明角膜(其中虹膜部分清晰可见)为0分；虹膜部分中局部浑浊为1分；瞳孔边缘和虹膜部分看起来差时为2分；且虹膜部分和瞳孔部分完全浑浊为3分。

<实验实施例3>Masson三色染色

将眼球用3.5％多聚甲醛固定，洗涤并储存于70％乙醇中，直至获得石蜡包埋的组织切片(6μm)。为了使胶原蛋白纤维化和纤维化等级可见，对切片进行Masson三色染色，并通过虚拟显微镜(NanoZoomer 2.0RS，Hamamatsu，日本)拍摄切片的图像。

<实验实施例4>组织学分析的化学染色

对于组织学分析，将眼球用3.5％多聚甲醛固定，然后固着入OCT(optimalcutting temperature)复合物(Tissue-Tek，Sakura Fine Technical Co.,Ltd.，Tokyo，日本)中冷冻在液氮中。

将样品在4％甲醛中固定24小时，干燥，然后固着入石蜡中。随后，制备厚度为8μm的组织切片，进行苏木精/伊红(H&E)染色，并通过虚拟显微镜(NanoZoomer 2.0RS，Hamamatsu，日本)对切片进行拍照。

<实验实施例5>免疫组化分析

将组织切片切成厚度为6μm并用于免疫组化分析。

首先，将组织切片用3.5％多聚甲醛固定，并用0.1％Triton X-100和2％灭活的牛血清白蛋白(BSA；全部来自Sigma，St.Louis，MO)渗透，然后用以下的一抗在4℃下孵育过夜：抗CD31一抗(1:1,000；Abcam Inc.，Cambridge，MA)、抗bFGF一抗(1:1,000；BiossInc.Woburn，MA)、抗IL-1β一抗、抗IL-6一抗(1:1,000；Cloud-Clone Corp.，Houston，TX)、抗MMP-9一抗、抗ICMA-1一抗、抗TNFα一抗、抗巨噬细胞/单核细胞一抗(1:1,000；AbnovaCrop.，台北，台湾省，中国)和抗VEGF-A一抗(Abbiotec，San Diego，CA)。

之后，将二抗在切片中孵育45分钟，然后用二氨基联苯胺(DAB)色素原使免疫应答可见，并且将切片在室温下用Mayer苏木素(Sigma)对比染色30秒。

将染好的切片通过虚拟显微镜(NanoZoomer 2.0RS，Hamamatsu，日本)进行拍摄。

<实验实施例6>成管试验(Tubing assay)

通过使用人血管内皮细胞(HUVEC)的成管试验证实了羟脯氨酸-GQDGLAGPK的抗血管生成作用。

将HUVEC细胞用钙黄绿素-AM进行染色，并且然后分配至Matrigel包被的48孔板，用不同浓度的胶原蛋白、CPI和CPII连同50ng/ml的重组人VEGF一起处理，于37℃孵育4小时后，通过荧光显微镜(Leica)观察管的形成，并通过Image lab软件(Bio-RadLaboratories)分析管的长度。

<实验实施例7>脉络膜新生血管化(CNV)和实验动物的建模

从Orient Bio购得C57BL/6小鼠，并按照ARVO和仁济大学批准的关于用于眼睛和视觉研究的动物使用的指南(No.2013-053)。将6周龄的C57BL/6小鼠用二极管绿色激光器(532nm，150mW，0.1s，50μM，凝结器)处理以损伤视网膜视神经区域。激光照射后，立即将CPI、CPII及阳性对照组阿瓦斯汀溶解在PBS中，并各自每天向眼球内给予5mg，持续5天。使用5只小鼠各自的双眼进行各实验组的以上实验。

<实验实施例8>组织学分析

为了观察由激光引起的组织变化，将小鼠眼睛摘取并用10％福尔马林固定，且深深地固着入OCT混合物中。

用苏木精和伊红(H&E)对经上述方法处理的8μm组织样品进行染色，且通过虚拟显微镜(NanoZoomer 2.0RS，Hamamatsu，日本)进行拍照并分析。

<实验实施例9>视网膜-脉络膜平置(flat-mount)

在激光照射14天后，实施视网膜-脉络膜平置来确认CPII对CNV病变大小的抑制作用。将小鼠麻醉，并在后眼窝注入100ml的25mg/ml的FITC-葡聚糖。30分钟后，对小鼠进行安乐死，并且将眼球摘取并用10％的福尔马林固定，然后将角膜和晶状体移出并平置于盖玻片上。通过荧光显微镜(Leica)观察用FITC-葡聚糖染色的新生血管，并通过Image J程序测量病变的大小。

<实验实施例10>定量实时RT-PCR分析

为了证实羟脯氨酸-GQDGLAGPK对新生血管化相关基因表达的抑制作用，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从摘取的小鼠眼球的视网膜和脉络膜混合物中提取RNA，并通过使用oligo(dT)引物和逆转录酶合成cDNA。使用表1中所示的特异性引物组(COSMOGENETECH，韩国)和SYBR Green PCR 2×PreMix(Enzynomics)对PCR产物进行扩增，并且对于PCR条件，将样品于95℃孵育10分钟；并进行40次PCR循环：95℃15秒，60℃30秒和72℃15秒。使用2-(DDCT)方法计算相对定量[Livak and Schmittgen，2001；DDCT＝(CT，目标-CT，肌动蛋白)处理组(CT，目标-CT，肌动蛋白)对照组]。

[表1]

<实验实施例11>蛋白质印迹

将小鼠视网膜和脉络膜的混合物溶解于含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物的Pro-PREP缓冲液(iNtRON)中，并提取蛋白质。

将提取的蛋白质用BCA测定试剂盒(Pierce)进行定量，并与SDS凝胶上样缓冲液混合，并通过在100℃煮沸5分钟使其变性。将蛋白质在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，并转移到硝酸纤维素膜(Millipore)，且随后用于封闭非特异性蛋白的结合，将膜在5％的脱脂奶中孵育1小时，并用VEGF、Flk-1、Flt-1、血管生成素-2和β-肌动蛋白(Santa CruzBiotechnology)作为一抗处理来进行常规的免疫印迹。之后，通过ECL试剂盒(Advansta)和多凝胶DOC系统检测免疫反应性蛋白。

<实验实施例12>干眼症和实验动物的建模

NOD.B10.H2^b小鼠购买自Jackson实验室(Bar Harbor，ME，USA)。根据ARVO和仁济大学批准的关于用于眼睛和视觉研究的动物使用的指南(No.:2014-029)进行动物实验。将12-16周龄的NOD.B10.H2^b小鼠暴露至40％-50％的环境湿度，且每天使用风扇通风18小时作为干燥应激，并皮下注射0.5mg/0.2mL的毒蕈碱型受体阻滞剂。此外，于上午9点、12点、下午3点和下午6点每日4次轮流地将氢溴酸东莨菪碱(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo.)注射于小鼠臀部，持续10天。将用上述方法处理的小鼠在10天后进行安乐死，并且在实验期间不限制动物行为及食物和水的摄入。

眼部干燥应激10天后，停止东莨菪碱的注射，并转到正常的湿度和温度环境，以及去除干燥应激。将10mg/ml Hyp-GQDGLAGPK和胶原蛋白溶解在生理盐水中，每天给药5次，每次5μL，持续10天；以及将生理盐水和0.1％HA给予眼球，每天5次，持续10天。在使用小鼠双眼的6个实验组的各组中使用3只小鼠，并且重复所有实验。

<实验实施例13>泪液量的检测

通过已报道的使用苯酚红浸渍的棉线(Zone-Quick，Oasis，Glendora，CA)的方法对泪液生成进行测量(Villareal AL，Farley W，Pflugfelder SC.Effect of topicalophthalmic epinastine and olopatadine on tear volume in mice.Eye ContactLens.2006；32(6):272-276.)。使用医用镊子来测量泪液的量，并将线置入眼角侧20秒，且线通过被泪液润湿变为红色，用显微镜(SZX7；Olympus Corp，Tokyo，日本)进行观察，以毫米表示。将测量的毫米级泪腺液与由用预期小鼠泪液量的碱性溶液(1500mL 0.9％盐和5mL5N NaOH)浸泡20秒的棉线表示的标准曲线进行比较。

<实验实施例14>角膜表面弯曲度(bendability)的评估

关于角膜表面的曲率，对动物进行麻醉后，从立体显微镜(SZX7；Olympus)的光纤环照射获得白环的反射图像。通过对反射在数字图像的白环中的角膜上皮细胞的不规则进行分级来评价角膜的光滑度。通过将反射环划分为4个象限并按照不规则的程度分为5级来计算角膜不规则的严重度的评分。无不规则为0级；1/4(四分之一)不规则为1级；2/4(四分之二)不规则为2级；3/4(四分之三)不规则为3级；整体不规则为4级；以及严重不规则为5级；并因此对所有的环进行确认。

<实施例1>蛋白质分析和肽合成

动物软骨细胞来源的细胞外基质的蛋白质分析在生物医学质谱中心(DiatechKorea Co.，Ltd.，Seoul，韩国)的Baek组进行。

如图1所示，通过上述蛋白质分析获得对应于II型胶原蛋白α1蛋白的部分氨基酸序列的羟脯氨酸-GQDGLAGPK(Hyp-GQDGLAGPK；SEQ ID NO:1)，并在BIOCELTRAN(Chuncheon，韩国)合成肽。

进行HPLC来确认所合成的羟脯氨酸-GQDGLAGPK的纯度，并且结果如图2所示，确认羟脯氨酸-GQDGLAGPK肽以99.3％的纯度合成。

此外，作为通过离子质谱确认羟脯氨酸-GQDGLAGPK肽的分子量的结果，如图3所示，确认羟脯氨酸-GQDGLAGPK肽的分子量为654.99。

<实施例2>通过肽对角膜新生血管化及角膜浑浊的改变的鉴定

在角膜的碱烧伤7天后，对角膜新生血管化及浑浊进行临床评估。

结果如图4A所示，确认了碱烧伤后角膜立即发生角膜浑浊，并在碱烧伤7天后，角膜新生血管化及浑浊增加。

在确认角膜新生血管化和浑浊之后，用生理盐水或Hyp-GQDGLAGPK肽处理10天(碱烧伤17天后)，使得对照组的角膜浑浊度评分显著增加至3.0，而且新生血管化评分为2.8(如图4B和图4C所示)，表明新生血管越过瞳孔边缘延伸至角膜中心。

另一方面，如图4B所示，确认经肽处理的实验组中显示出对浑浊度的降低效果。

以上结果证实了Hyp-GQDGLAGPK肽在抑制角膜浑浊方面是有效的。

<实施例3>通过肽对角膜厚度的改变的确认

使用NDP view程序(Hamamatsu，USA)分析由虚拟显微镜(Nano Zoomer 2.0RS，Hamamatsu，日本)拍摄的经H&E染色的切片的角膜厚度。

结果，确认了碱烧伤后角膜厚度从正常范围的526.6μm增加至960.6μm，如图5B所示。

然而，在Hyp-GQDGLAGPK肽处理10天后，确认相比于在碱烧伤组，在经肽处理的实验组中角膜厚度降低至550.0μm(p<0.05)。

<实施例4>肽对角膜纤维化的抑制作用的鉴定

进行Masson三色染色来确认Hyp-GQDGLAGPK肽对通过碱烧伤诱导的角膜纤维化的作用。

结果如图6所示，确认碱烧伤对照组通过碱烧伤增加了基质部分中的褐色成纤维细胞的形成，但证实了在用Hyp-GQDGLAGPK肽处理的实验组中，成纤维细胞的增加受到抑制。

以上结果证实了Hyp-GQDGLAGPK肽抑制成纤维细胞的增加，并且对抑制角膜纤维化而言是有效的。

<实施例5>肽对角膜新生血管化的抑制作用的鉴定

进行H&E染色来确认由碱烧伤引起的角膜的组织学变化。

结果，确认了通过碱烧伤在角膜中诱导上皮增生、炎症细胞浸润、发作性水肿和新生血管化(参见图7的上方部分)。

然而，对于上述组织学变化，用Hyp-GQDGLAGPK肽处理的组显示出提升的改善作用，并且如图5A所示，H&E染色结果也显示了经肽处理的组织中新生血管化得以显著改善。

由以上结果证实了Hyp-GQDGLAGPK肽影响新生血管化，因此，用Hyp-GQDGLAGPK肽处理经碱烧伤的角膜，并使用角膜新生血管化的特异性标志物CD31、FGF和VEGF对角膜切片进行免疫染色。

结果如图7所示，确认了新生血管化标志物CD31、FGF和VEGF在碱烧伤的成纤维基质细胞中强力表达。

然而，在经肽处理组的上皮、上皮下膜及基质中观察到CD31、FGF和VEGF的显著减少。

由以上结果证实了，Hyp-GQDGLAGPK肽在抑制角膜新生血管化方面是有效的。

<实施例6>肽的抗炎症作用的鉴定

作为上述H&E染色的结果，证实了通过碱烧伤使炎症细胞渗透进角膜。因此，为了确认各肽对炎症标志物的表达的影响，用炎症特异性标志物(如巨噬细胞、TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-6和MMP-9)在角膜切片中进行免疫染色。

如图8所示，结果证实了碱烧伤增加巨噬细胞在上皮、上皮下膜和增生性基质中的表达，而在用Hyp-GQDGLAGPK肽处理的实验组中，巨噬细胞的表达被有效地抑制。此外，在碱烧伤组中，炎症细胞因子(包括TNFα、IL-1β、IL-6和ICAM-1粘附分子)的表达增加，但在经肽处理的实验组中，炎症细胞因子的表达减少。而且，在碱烧伤组的角膜中强烈地观察到MMP-9的表达，而在经肽处理的实验组中，MMP-9的表达被抑制。

<实施例7>肽对新生血管化的抑制作用的确认

为证实羟脯氨酸-GQDGLAGPK的抗血管生成作用，进行了使用人血管内皮细胞(HUVEC)的成管试验。

结果如图9所示，经VEGF处理的组的管形成比未经VEGF处理的组的管形成增加约至少1.5倍，而用胶原蛋白、CPI和CPII处理的实验组显示出对血管生成的显著抑制。特别地，CPII以浓度依赖的方式抑制管形成并且减少至与未经VEGF处理的组的血管生成几乎相同的程度。还证实了其与阿瓦斯汀(年龄相关性黄斑变性的治疗药品)处理组的水平相似。

<实施例8>肽对脉络膜新生血管化的抑制作用的确认

以与实验实施例7相同的方式通过激光照射小鼠眼球，并在激光照射14天后，摘取眼球并进行H&E染色。

结果如图10所示，确认了位于激光照射部位的组织塌陷并形成血管生成。另一方面，如图3所示，在通过眼内注射分别用胶原蛋白、CPI和CPII处理5天(全部以2μg进行处理)的实验组中，CNV病变减小。

为了比较羟脯氨酸-GQDGLAGPK(CPII)(CPII在体外管形成实验中具有最好的抗血管生成功效)对脉络膜新生血管化的抑制作用与阿瓦斯汀阳性对照组对脉络膜新生血管化的抑制作用，激光照射后立即眼内分别注射5μg的CPII和阿瓦斯汀，连续5天。激光照射后14天摘取眼球，并用FITC-葡聚糖对血管进行染色，以及进行平置实验来测量CNV病变大小。

结果如图11所示，CPII处理组的病变大小显著减小，小于对照组；并确认了其与以相同浓度的阿瓦斯汀处理的阳性对照组的病变大小相似。

<实施例9>肽对新生血管化相关基因和蛋白的抑制作用的确认

激光照射小鼠14天后，从视网膜和脉络膜中提取RNA以通过实时RT-PCR对基因表达进行分析。

结果如图12所示，在激光处理组中，VEGF(典型的新生血管化相关基因)的表达增加了约55倍，而在阿瓦斯汀处理组和CPII处理组中，VEGF的表达减少至与未经激光处理组相似的水平。

另一方面，在激光处理组中，ICAM基因和MCP-1基因分别增加了约300倍和约10倍，而在CPII处理组中，ICAM基因和MCP-1基因也显著减少。

同样，为了评价CPII对新生血管化相关蛋白标志物表达的作用，在激光照射14天后，从视网膜和脉络膜中提取蛋白，以进行VEGF、VEGFR-1(Flt-1)、VEGR-2(Flk-1)和血管生成素2的免疫印迹。

结果如图13所示，证实了通过激光照射显著增加血管生成促进因子血管生成素2、VEGFR-1和VEGFR-2的表达。特别地，VEGF的表达明显增加，已知VEGF在新生血管化中发挥最重要的作用。然而，在CPII处理的实验组中，上述蛋白的表达明显减少，并与阿瓦斯汀(年龄相关黄斑变性的治疗药品)基本上相似。

<实施例10>确认泪液生成作用

通过苯酚红浸渍的棉线对泪液生成的程度进行测量。

如图15所示，结果证实了，相比于正常组(0.22±0.01μL)，通过干燥应激使NOD.B10.H2^b小鼠的泪液量减少约85.5％(DS 10D组，0.03±0.01μL，p<0.05)的显著水平。另一方面，在消除干燥应激后，在用Hyp-GQDGLAGPK处理的组(0.23±0.02μL)中，泪液量在处理后10天增加了7.9倍(p<0.05)，并且比用生理盐水处理的阴性对照组(0.08±0.01μL)增加了约2.8倍(p<0.05)，以及比用胶原蛋白处理的阳性对照组(0.13±0.02μL)增加了约1.7倍(p<0.05)。

此外，与干眼症的治疗药品CsA(环孢素A；0.13±0.02μL)、DQS(Diquas；0.16±0.02μL)和HA(Hyaluni；0.14±0.01μL)相比，Hyp-GQDGLAGPK处理组的泪液量分别增加了1.7倍(p<0.05)、1.4倍(p<0.05)和1.6倍(p<0.05)。

由以上结果证实了Hyp-GQDGLAGPK将减少的泪液量恢复至比市售干眼症的治疗药品更高的水平。

<实施例11>确认角膜表面的弯曲度

对各实验组中的角膜曲率的程度进行定量以确认角膜表面的弯曲度。

如图16所示，结果确认了暴露于干燥应激下10天的小鼠的角膜表面的曲率比正常角膜(0.33±0.58分)高约13倍(4.33±0.58分，p<0.05)。另一方面，去除干燥应激后，在用Hyp-GQDGLAGPK处理的组中，第10天的角膜表面的弯曲度(2.0±0分)显著减少了53.8％(p<0.05)，其比用生理盐水处理的阴性对照组(3.33±1.53分)减少了40％(p<0.05)，以及比用胶原蛋白处理的阳性对照组(3.67±1.16分)减少了45.5％(p<0.05)。

此外，与干眼症治疗药品CsA、DQS和HA(3.33±0.58分；3.0±1.0分；3.0±0分)处理组相比，角膜表面曲率的程度分别减少了40％(p<0.05)、33.3％(p<0.05)和33.3％(p<0.05)。

由以上结果证实了Hyp-GQDGLAGPK在改善角膜表面的曲率方面比干眼症治疗药品更有效。

<实施例12>抑制角膜上皮细胞脱落的作用的确认

为了确认肽对角膜上皮细胞脱落的作用，对各实验组的小鼠角膜进行H&E染色。

结果如图17所示，通过干燥应激使角膜的上皮细胞脱落增加了24倍(2.29±0.57/0.1mm²，p<0.05)。另一方面，去除干燥应激后，Hyp-GQDGLAGPK处理组中的角膜上皮细胞脱落降低了83.3％(p<0.05)(0.38±0.17/0.1mm²)。此外，角膜上皮细胞脱落比用生理盐水处理的阴性对照组(1.33±0.17/0.1mm²)减少了71.4％(p<0.05)，以及比用胶原蛋白处理的阳性对照组(0.86±0.29/0.1mm²)减少了55.6％(p<0.05)。

此外，相比于用干眼症治疗药品CsA、DQS和HA处理的组(1.52±0.33/0.1mm²；0.095±0.17/0.1mm²；1.71±0/0.1mm²)，其分别减少了75％(p<0.05)、60％(p<0.05)和77.8％(p<0.05)。

由以上结果证实了Hyp-GQDGLAGPK在降低角膜上皮细胞脱落方面比干眼症治疗药品更有效。

<实施例13>对结膜杯状细胞分布的作用的确认

对干眼症小鼠中的由滴眼液引起的结膜杯状细胞的分布进行观察。

结果如图18所示，与正常结膜(14.38±0.44/0.1mm²)相比，干燥应激导致杯状细胞减少了58.2％(6.02±0.29/0.1mm²，p<0.05)。另一方面，在去除干燥应激后，在Hyp-GQDGLAGPK处理组中，杯状细胞(13.9±0.83/0.1mm²)恢复了2.3倍(p<0.05)，其比用生理盐水处理的阴性对照组(5.43±0.29/0.1mm²)增加了2.6倍(p<0.05)，以及比用胶原蛋白处理的阳性对照组(11.05±0.33/0.1mm²)增加了1.3倍(p<0.05)。

此外，与干眼症治疗药品CsA、DQS和HA处理组(11.14±0.76/0.1mm²；8.86±0.29/0.1mm²；8.67±0.17/0.1mm²)相比，其分别恢复了1.2倍(p<0.05)、1.5倍(p<0.05)和1.6倍(p<0.05)。

根据以上结果，除生理盐水处理组以外，其余处理组中的结膜中的杯状细胞的分布得以改善，但杯状细胞被证实在Hyp-GQDGLAGPK处理组的结膜中显著增加。

<实施例14>干眼症小鼠模型中的抗炎症作用的确认

在泪腺中进行TNF-α、ICAM-1、VCAM-1、MMP-2和MMP-9的免疫染色，以评估Hyp-GQDGLAGPK在干眼症小鼠模型中对炎症反应因子的表达的作用。

结果如图19所示，通过干燥应激使得泪腺中的炎症细胞因子TNF-α以及粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达明显增加，通过干燥应激还使得泪腺的MMP-2和MMP-9显著增加。但在经Hyp-GQDGLAGPK处理的小鼠模型的泪腺中，炎症相关因子的表达明显降低，并且证实了与用干眼症治疗药品CsA、DQS和HA处理的小鼠模型相比，其受到显著抑制。

虽然已经结合目前被认为实践性的示例性实施方式对本发明进行了描述，将理解的是，本发明并不限于所公开的实施方式，相反，本发明旨在涵盖各种修改和等同布置，所述修改和等同布置被包括在所附的权利要求书的精神和范围内。

<110> 韩国视角生物株式会社（EYEBIO KOREA）

<120> 软骨细胞的细胞外基质来源的肽

<130> ADP-2016-0100

<160> 1

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 羟脯氨酸-GQDGLAGPK

<400> 1

Pro Gly Gln Asp Gly Leu Ala Gly Pro Lys

1 5 10

Claims

1.由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的肽在制造用于预防或治疗黄斑变性的药物组合物方面的用途，其中，所述肽的第一个氨基酸为羟脯氨酸。

2.如权利要求1所述的用途，其中，所述肽抑制眼部新生血管化。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中，基于100重量份的所述药物组合物的总量，以0.1至50重量份的量包含所述由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的肽。

4.如权利要求1或2所述的用途，其中，所述药物组合物为选自于由如下所组成的组中的任一制剂：颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、凝胶剂、混悬剂和液体剂。

5.如权利要求4所述的用途，其中，所述药物组合物为选自于由如下所组成的组中的任一制剂：注射剂、糖浆剂、乳剂和滴剂。

6.如权利要求4所述的用途，其中，所述药物组合物为滴眼液。