KR101438744B1 - 아디포넥틴을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 또는 염증성 안구표면 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아디포넥틴을 유효성분으로 포함하는 안(eye) 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 유효성분으로 이용되는 아디포넥틴은 눈물생성을 촉진시키고, 각막표면의 불규칙성을 완화시키며, 안구표면 및 눈물샘에서 염증성 사이토카인을 감소시킬 뿐 아니라 결막 술잔세포의 수를 증가시킴으로써 궁극적으로 안구건조증, 염증성 안질환 및 콘택트렌즈 사용에 기인한 눈의 부작용과 같은 안질환에 대해 예방 또는 치료 활성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 조성물은 콘택트렌즈 착용에 기인한 비 세균성 염증 및 안 접촉 윤활 활성을 갖는 세정제 및 윤활제로서 이용될 수 있다.

Description

아디포넥틴을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 또는 염증성 안구표면 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for Preventing or Treating of Dry Eyes or Inflammatory Eye Surface Diseases Comprising Adiponectin as Active Ingredient}

본 발명은 아디포넥틴을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 또는 염증성 안구표면 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 인공 눈물 조성물에 관한 것이다.

건성안(안구건조증)은 우리나라 성인의 20%에서 발생되는 흔한 질환으로, 단순한 눈물부족이 아닌, 눈물과 안구표면(각막 및 결막)의 염증에 의해 안구의 불편감, 시력저하, 눈물층의 불안정성을 유발하여 안구표면에 손상을 줄 수 있는 질환으로 알려져 있다. 이 질환은 안구통증, 불규칙한 각막 표면, 흐리고 변동폭이 커진 시력(blurred and fluctuating vision) 및 증가된 각막 궤양의 위험성과 같은 특징을 가진다고 알려져 있으나, 발병 과정에 대해서는 아직 완전히 밝혀지지 않은 상태이다. 그러나, 염증 세포 침윤, 면역 활성화 분자 및 접착 분자의 증가된 발현, Th1 및 Th17 반응, 세포사멸 마커 및 케모카인으로 특징지어지는 건성안 질환에서 염증이 중요한 역할을 담당한다는 것을 뒷받침하는 연구결과들이 증가하고 있다.

아디포넥틴은 호르몬 단백질로 주로 지방 조직으로부터 분비되며 비만-관련 대사 및 심혈관 장애에서 아디포사이토카인 보호와 같은 다면발현성(pleiotropic) 효과를 나타내며 인슐린 저항성의 약화, 아테롬성 동맥경화증 및 심장 리모델링과 연관되어 있다. 증가된 항-염증 사이토카인 IL-10 및 IL-1 수용체 안타고니스트 레벨 및 감소된 프로-염증 IL-6, TNF-α 및 IFN-γ을 볼 때, 아디포넥틴은 항-염증 효과를 갖는다고 사료된다.

아디포넥틴은 대식세포의 식작용 활성을 감소시키며, 케모카인 및 케모카인 수용체의 생산을 억제하며, TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), 인터루킨-6(interleukin-6), 인터페론-γ(interferone-gamma) 등의 염증성 사이토카인을 억제하여, 항당뇨병, 항동맥경화증, 항종양형성 및 항염증 효과가 있다고 알려져 있다. 또한, 포도막염, 류마티스 관절염 같은 만성 염증 질환에서 아디포넥틴이 항-염증 효과를 나타낸다는 것은 여러 임상 연구를 통해 알려져 있다. 류마티스 관절염과 같은 만성 염증 질환의 발병에 있어서 아디포넥틴이 중요하다는 것은 알려져 있으나, 건성안 질환에서의 아디포넥틴의 역할에 대해서는 거의 알려진 바가 없으며, 아디포넥틴을 안과적 치료목적으로 눈에 적용한 결과를 보고한 문헌은 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 다양한 안질환을 예방 또는 치료하는 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 아디포넥틴이 안구 건조 동물모델에서 눈물생성을 촉진시키고, 각막표면의 불규칙성을 완화시키며, 안구표면 및 눈물샘에서 염증성 사이토카인을 감소시킬 뿐 아니라 결막 술잔세포의 수를 증가시킴으로써 안구건조증 및 염증성 안질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 안질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 인공 눈물 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 콘택트렌즈용 세정, 윤활 또는 패키징(packaging) 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유효성분으로 포함하는 안(eye) 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 다양한 안질환을 예방 또는 치료하는 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 아디포넥틴이 안구 건조 동물모델에서 눈물생성을 촉진시키고, 각막표면의 불규칙성을 완화시키며, 안구표면 및 눈물샘에서 염증성 사이토카인을 감소시킬 뿐 아니라 결막 술잔세포의 수를 증가시킴으로써 안구건조증 및 염증성 안질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 규명하였다.

아디포넥틴을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 안구 건조 동물모델에서 눈물의 양을 증가시키고, 각막 표면의 평탄정도를 호전시키며, 결막 내 IL-β, IL-6, TNF-α, INF-γ, MIG(CXCL9) 농도 및 CD4+ CXCR3+ 세포를 감소시키고, 결막 술잔세포의 밀도를 증가시킴으로써, 궁극적으로 안구건조증 및 염증성 안질환의 예방 또는 치료 활성을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 안질환은 안구건조증, 염증성 안질환 및 콘택트렌즈 사용에 기인한 눈의 부작용이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 염증성 안질환은 감염성 안질환, 알러지성 안질환, 각막염, 결막염, 포도막염, 마이봄선 기능 부전, 스티븐스 존슨 증후군 및 쇼그렌 증후군이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 콘택트렌즈 사용에 기인한 눈의 부작용은 콘택트렌즈 착용에 기인한 안구 불편함, 건조감, 화끈거리는 느낌, 찌르는 듯한 느낌 및 비 세균성 염증이다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있으며, 보다 바람직하게는 점막 투여 또는 점안 투여이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)을 감소시킨다.

본 발명에서 염증성 사이토카인은 바람직하게는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TNF-α, TNF-β, TGF-β(transforming growth factor-β), MIG(CXCL9) 또는 인터페론(interferons, IFNs)이고, 보다 바람직하게는 IL-1, IL-6, TNF-α, 인터페론 또는 MIG이며, 보다 더 바람직하게는 IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ 또는 MIG이다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 건성안 마우스 모델에 본 발명의 아디포넥틴을 처리한 경우, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ 및 MIG와 같은 염증성 사이토카인의 레벨이 현저하게 감소하였다. 이러한 염증성 사이토카인의 감소는 염증 반응을 억제시키며, 결과적으로 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 결막 술잔세포(conjunctival goblet cell) 수를 증가시킨다. 눈물은 점액층, 수성층 및 지방층의 3가지 성분으로 구성되는데, 이중 한 가지 성분이라도 부족하게 되면 눈물막이 불안정하여 안구건조증이 발생할 수 있다. 이 가운데 점액층은 주로 결막의 술잔세포에서 분비되는 점액성분으로 각막 및 결막을 엷게 덮어 눈물막이 눈 표면에 고정되게 한다. 하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 아디포넥틴을 점막 투여한 경우, 결막 술잔세포의 밀도가 증가하였고 이는 결과적으로 눈물 생성을 촉진시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 각막 표면의 불규칙성을 감소시킨다. 각막 표면의 불규칙성은 각막 질환 및 손상 또는 수술에 의해 발생할 수 있다. 하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 아디포넥틴은 건성안 및 염증성 질환 등으로부터 발생할 수 있는 각막표면의 불규칙성을 감소시킨다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 안(eye) 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있으며, 보다 바람직하게는 점막 투여 또는 점안 투여이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이고, 보다 바람직하게는 0.01-80 mg/kg(체중)이며, 가장 바람직하게는 0.1-60 mg/kg(체중)이다. 또한, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 특히, 점안 투여의 경우에는, 0.001 내지 3%(w/v, 이하 동일), 바람직하게는 0.01 내지 1% 정도의 제제를 1일 1회 내지 수회 점안한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물의 제형은 용액, 현탁액, 시럽제, 에멀젼, 리포좀, 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제, 서방형제제 점안제(eye drop), 캅슐제, 콘택트렌즈 세정제 및 콘택트렌즈 윤활제이고, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

구체적으로 투여경로에 따라, 경구 투여용 고체 제형으로는 캡슐제, 정제, 환제, 산제 및 과립제가 포함된다. 이러한 고체 제형에서, 활성 화합물은 하나 이상의 불활성 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체(예, 나트륨 시트레이트 또는 인산이칼슘) 및/또는 a) 충진제 또는 증량제(예, 전분, 락토즈, 슈크로즈, 글루코즈, 만니톨 및 규산), b) 결합제(예, 카복시메틸셀룰로즈, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 슈크로즈 및 아라비아고무), c) 보습제(예, 글리세롤), d) 붕해제(예, 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염 및 탄산나트륨), e) 액상지연제(예, 파라핀), f) 흡수 촉진제(예, 사급 암모늄 화합물), g) 습윤제(예, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트), h) 흡수제(예, 카올린 및 벤토나이트 점토) 및 i) 윤활제(예, 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트 및 이들의 혼합물)와 혼합될 수 있다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우에 제형은 또한 완충제를 포함할 수 있다.

또한, 락토즈 또는 밀크 슈가와 같은 부형제뿐만 아니라 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용한 연질 및 경질 젤라틴 캡슐에 충진제로서 사용될 수 있다.

정제, 당의정, 캡슐제, 환제 및 과립제의 고체 투여형은 장용피 및 기타 약제 분야에 잘 알려진 피복과 같은 피복물 및 쉘로 제조될 수 있다. 이들은 임의로 혼탁화제를 함유할 수 있으며, 또한 이들이 장관의 특정 부위에서 임의로 지연된 방식으로 활성 성분만을 방출하거나 활성 성분을 우선적으로 방출하도록 조성될 수 있다. 또한 필요한 경우 활성 화합물은 하나 이상의 상기된 부형제와 미세 캡슐 형태로 존재할 수 있다.

특히, 점안 투여의 경우, 본 발명의 조성물을 정제수, 등장화제(예를 들면, 염화나트륨, 글리세린 등), 계면활성제(예를 들면, 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 등), 방부제(예를 들면, 에데트산나트륨, 소르브산나트륨 등), 완충제(예를 들면, 인산나트륨 등), pH 조정제(예를 들면, 염산, 수산화나트륨 등) 등의 관용의 제약상 필요한 성분과 혼합하여, 통상법에 준하여 점안약의 형태로 제제화함으로써 수득된다. 액성으로서는 중성부근의 pH(pH 5 내지 8)로 조정하는 것이 바람직하고, 또한 삼투압도 1 부근으로 조정하는 것이 바람직하다.

경구 투여용 액체 제형으로는 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 용제, 현탁제, 시럽제 및 엘릭서제가 포함된다. 활성 화합물 이외에, 액체 제형은 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제(예, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸 포름아미드, 오일(특히, 면실유, 땅콩, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유), 글리세롤, 테트라하이드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 솔비탄의 지방산 에스테르 및 이들의 혼합물과 같이 본 분야에 흔히 사용되는 불활성 희석제를 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 습윤제, 유화제, 현탁화제, 감미제, 풍미제 및 방향제와 같은 보조제를 함유할 수 있다.

비경구 주사를 위해 적합한 제형은 생리학적으로 허용되는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤 등), 식물성 기름(올리브유), 주사용 유기 에스테르(예, 에틸 올레에이트) 및 이들의 적합한 혼합물이 포함된다.

또한, 본 발명의 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 각종 항균제 및 항진균제(예, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 솔브산 등)에 의해 미생물의 작용을 억제할 수 있다. 또한 당, 염화나트륨 등과 같은 삼투압조절제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 흡수 지연제(예, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)를 사용하여 주사용 약제의 흡수를 지연시킬 수 있다.

현탁제는 활성 화합물이외에 현탁화제(예, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 및 솔비탄 에스테르, 미세결정 셀룰로즈, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 한천-한천 및 트라가칸트 또는 이들의 혼합물 등)를 함유할 수 있다.

일부 경우에 약물의 효과를 지속시키기 위해, 피하 또는 근육 내 주사로부터 약물의 흡수를 서서히 하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 수용성이 낮은 결정형 또는 비결정형 물질의 액체 현탁액을 사용함으로써 달성될 수 있다. 이때 약물의 흡수 속도는 용해 속도에 좌우되며, 용해 속도는 결정 크기 및 결정 형태에 좌우된다. 한편, 비경구 투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 약물을 오일 비히클내에 용해시키거나 현탁시킴으로써 달성된다.

주사용 데포우 형태는 약물의 미세캡슐 매트릭스를 폴리락타이드-폴리글리콜라이드와 같은 생체분해성 중합체로 형성함으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비율 및 사용된 특정 중합체의 성질에 따라, 약물의 방출 속도를 조절할 수 있다.

다른 생체분해성 중합체의 예로는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)이 포함된다. 또한, 데포우 주사용 제형은 약물을 체조직 적합성인 리포좀 또는 마이크로에멀젼내에 포획시킴으로써 제조된다.

주사용 제형은 예를 들면 세균-보유 필터를 통해 여과하거나, 멸균화제를 사용직전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사용 매질 중에 용해시키거나 분산시킬 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 혼입시킴으로써 멸균시킬 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구투여(바람직하게는 정맥 또는 점안 투여)제형으로 제조되는 경우, 그 제형은 리포좀, 서방형 제제 또는 점안제이다.

본 발명의 약제학적 조성물을 리포좀에 내포(encapsulation)시켜 약물 전달을 위한 제형의 안정성을 제공할 수 있다. 본 발명에 이용되는 리포좀은 폴리올, 계면활성제, 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다(Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, (XIV),p.33et seq.(1976)).

리포좀에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자이리톨 및 솔비톨을 포함하며, 가장 바람직하게는 프로필렌 글리콜이다.

리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있고, 바람직하게는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용된다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트를 포함한다. 비이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알콕시레이티드알킬에테르, 알콕시레이티드알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르를 포함한다. 가장 바람직하게는, 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리솔베이트류가 이용된다.

리포좀의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질로 이용된 것으로서, 천연 인지질 (예: 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질 (예: 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 보다 바람직하게는, 상기 레시틴은 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜 콜린의 양이 23-95%, 그리고 포스파디딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다.

리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C12-22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이다.

리포좀의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 성분들을 포함하는 혼합물을 고압 호모게나이저에 적용하여 제조된다.

이렇게 제조된 리포좀 시스템은 여러 종류의 난용성 물질을 녹임과 동시에 불안정한 물질을 안정화시켜 약물 전달을 극대화하는 장점을 가지고 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 지속적으로 유효성분의 유효 혈중농도를 유지함으로써 약제의 복용횟수를 줄여 복약순응도를 높일 수 있도록 서방형 제제로 제조될 수 있다.

서방형제제는 본 발명의 유효성분이외에 서방화 담체 및 기타 보조제를 포함하여 제제화된다. 본 발명에서 사용되는 서방화 담체는 당업계에 공지된 다양한 서방화 담체를 이용할 수 있으나, 바림직하게는 폴리에틸렌옥사이드이다.

또한, 기타보조제로서 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 희석담체가 포함될 수 있다. 이러한 목적으로 사용되는 희석담체의 예로는 락토오즈, 덱스트린, 전분, 미세결정성 셀룰로오즈, 인산일수소칼슘, 탄산칼슘, 당류 및 이산화규소 등이 있으며, 그밖에 유동성을 증가시키기 위해 스테아린산 아연 또는 마그네슘과 같은 활택제나 제약분야에서 사용가능한 다른 보조제를 포함시킬 수도 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유효성분으로 포함하는 인공 눈물 조성물을 제공한다.

본 발명의 인공 눈물 조성물에 유효성분으로 이용되는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질은, 상술한 본 발명의 안질환의 예방 또는 치료용 조성물에 이용되는 유효성분과 동일하므로, 명세서의 과도한 번잡성을 피하기 위하여 중복 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인공 눈물 조성물에 이용되는 유효성분은 눈물샘에서 눈물 분비를 촉진하여 안구건조증의 예방 또는 치료 활성을 나타낸다.

본 발명의 인공 눈물 조성물은 전해질, 비이온성 계면활성제, 항균제, 보레이트 및 폴리올 복합체 또는 저분자량의 아미노산을 추가적으로 포함할 수 있다.

인공 눈물 조성물에 포함되는 전해질은 천연 눈물을 자극하기 위하여 이용되며, 천연 눈물에 포함된 이온을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 이용되는 전해질에는 포타슘, 칼슘, 마그네슘 및 아연이 있으며, 그 농도는 U.S. Pat. No. 5,403,598에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물에 이용되는 비이온성 계면활성제는 본 발명 조성물의 표면 장력을 감소시켜 각막 표면에 용액이 골고루 퍼지도록 한다. 비이온성 계면활성제는 당업계에 공지된 다양한 계면활성제를 포함하나, 바람직하게는 15 이상의 HLB 값을 갖는 폴리솔베이트 80(Tween 80)과 같은 폴리솔베이트류, 및 에틸렌디아민에 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드를 첨가하여 제조된 블록 공중합체이다. 본 발명에 이용된 계면활성제의 양은 약 38 내지 약 45 dynes/cm의 표면 장력을 갖는 조성물을 제공하기 위한 충분한 양을 의미하고, 상기 범위의 표면 장력은 천연 눈물의 표면 장력에 상응한다.

본 발명의 인공 눈물 조성물은 1회 투여(single-dose) 또는 분할 투여(multi-dose) 제품으로 제조될 수 있다. 제품화 이후 조성물의 무균 상태를 유지하기 위하여 1회 투여 제품은 항균 보존제가 불필요하나 분할 투여 제품은 필요할 수 도 있다.

본 발명의 조성물에 이용되는 항균 보존제로서, 바람직하게는 폴리쿼터늄-1이고, 그 함량은 0.1 내지 10 ppm이다. 본 발명의 조성물에서 항균 보존제의 항균 활성을 개선시키기 위하여 추가적으로 보레이트/폴리올 복합체 또는 저분자량의 아미노산을 포함한다.

보레이트/폴리올 복합체의 함량은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.5 내지 6.0 중량 %이고, 바람직하게는 1.0 내지 2.5 중량 %이다. 보레이트와 폴리올의 몰비는 1:0.1 내지 1:10이고, 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.5이다. 본 발명에 이용되는 보레이트는 붕산(boric acid), 붕산의 염 및 다른 약제학적으로 허용되는 보레이트, 또는 이들의 조합을 의미하며, 바람직하게는 붕산, 소듐 보레이트, 포타슘 보레이트, 칼슘 보레이트, 마그네슘 보레이트 및 이들의 이다. 폴리올은 당업계에 공지된 다양한 폴리올을 포함하며, 바람직하게는 당, 당 알콜 및 당 산이고, 보다 바람직하게는 만니톨, 솔비톨, 프로필렌 글리콜 및 글리세롤이며, 가장 바람직하게는 글리세롤이다.

항균 활성의 개선을 위하여 본 발명의 조성물에 이용되는 저분자량의 아미노산의 함량은 0.01 내지 2.5 w/v %, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1.0 w/v %이고, 분자량은 바람직하게는 75 내지 250이며, 보다 바람직하게는 글라이신이다.

본 발명의 인공 눈물 조성물은 눈과 양립할 수 있는 pH 및 삼투압을 갖도록 제조된다. 바람직하게는 pH는 6.8 내지 7.8이고 삼투압은 250 내지 350 mOsm/kg이다.

본 발명의 조성물을 눈에 적용하는 경우 편안함 및 조성물의 체류 시간을 증가시키기 위해서, 개선된 점성을 가지도록 본 발명의 인공 눈물 조성물을 제조한다. 바람직하게는 점성은 1 내지 20 cps이고 보다 바람직하게는, 2 내지 20 cps이며, 가장 바람직하게는 5 내지 20 cps이다.

본 발명의 인공 눈물 조성물은 안구 건조증의 예방 또는 치료하기 위하여 각막에 국소적으로 적용될 수 있고, 눈 습윤제 또는 눈 윤활제로서 이용되며 각막에 한 두 방울 떨어뜨려 적용된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유효성분으로 포함하는 콘택트렌즈용 세정, 윤활 또는 패키징(packaging) 조성물을 제공한다.

본 발명의 콘택트렌즈용 세정 조성물은 주된 성분으로 계면활성제 및 보조 성분으로 상기 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 세정 작용을 가지는 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 비이온성 및 양쪽성(amphoteric) 계면활성제를 비롯하여 당업계에 공지된 다양한 계면활성제를 주된 세정제로서 포함한다. 대표적인 음이온성 계면활성제는, 지질, 단백질, 및 다른 콘택트렌즈 침적물에 대해 우수한 세정 활성을 제공하는 황산염화된 계면활성제 및 설폰산염화된 계면활성제와, 이들의 생리적 허용염을 포함한다. 그 예로는 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 라우레쓰(laureth) 설페이트(황산염화되고 에톡실화된 라우릴 알콜의 나트륨염), 암모늄 라우레쓰 설페이트(황산염화되고 에톡실화된 라우릴 알콜의 암모늄염), 나트륨 트리데세쓰 설페이트(황산염화되고 에톡실화된 트리데실 알콜의 나트륨염), 나트륨 도데실벤젠 설포네이트, 2나트륨 라우릴 또는 라우레쓰 설포숙시네이트(설포숙신산의 라우릴 또는 에톡실화된 라우릴 알콜 1/2 에스테르의 이나트륨염), 2나트륨 올레아미도 설포숙시네이트, 및 디옥틸 나트륨 설포숙시네이트(2-에틸헥실 알콜과 설포숙신산의 디에스테르의 나트륨염)를 포함한다.

우수한 세정 활성을 갖는 비이온성 계면활성제는 바스프 코오포레이션 사에서 상품명 플루로닉(예, Pluronic P104 또는 L64)으로 시판되고 있는 다양한 계면활성제를 포함하여, 특정 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체(폴록사머) 계면활성제를 포함한다.

본 발명의 조성물은 양이온성 계면활성제를 포함할 수 있고, 대표적인 양이온성 계면활성제로는 트리4차(triquaternary) 인산염 에스테르 등이 있다. 또한, 본 조성물은 양쪽성(amphoteric) 계면활성제를 함유할 수 있고, 이미 다졸린 유도체 및 N-알킬아미노산 등이 있다.

본 발명의 콘택트렌즈용 윤활 조성물에서 상기 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 상술한 바와 같이 눈물샘에서 눈물의 분비를 촉진하므로, 이로 인해 분비된 눈물은 콘택트렌즈 표면에 눈물막을 형성하여 윤활 역할을 한다. 따라서 상기 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 윤활 조성물에 있어, 특히 유효성분으로 이용될 수 있다.

본 발명의 콘택트렌즈 패키징 조성물은 콘택트렌즈 저장용으로 사용되는 수용액이고, 일반적으로 염수, 기타 완충 용액 및 탈이온수를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 패키징 조성물은 염화나트륨, 붕산나트륨, 인산나트륨, 인산수소나트륨, 인산이수소나트륨 또는 이의 상응하는 칼륨염을 포함하는 염 함유 염수이다. 이들 성분은 일반적으로 산과 염기의 첨가가 pH 변화를 비교적 적게 일으키도록 배합되어 산 및 이의 짝염기를 포함하는 완충 용액을 형성한다. 완충 용액은 추가로 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 수산화나트륨, 2,2-비스(하이드록시메틸)-2,2',2"-니트릴로트리에탄올, n-트리스(하이드록시메틸)메틸-2-아미노에탄설폰산, 시트르산, 시트르산나트륨, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 아세트산, 아세트산나트륨 및 이들의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 아디포넥틴을 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명에서 유효성분으로 이용되는 아디포넥틴은 눈물생성을 촉진시키고, 각막표면의 불규칙성을 완화시키며, 안구표면 및 눈물샘에서 염증성 사이토카인을 감소시킬 뿐 아니라 결막 술잔세포의 수를 증가시킴으로써 궁극적으로 안구건조증, 염증성 안질환 및 콘택트렌즈 사용에 기인한 눈의 부작용과 같은 안질환에 대해 예방 또는 치료 활성을 나타낸다.

(c) 본 발명의 조성물은 콘택트렌즈 착용에 기인한 비 세균성 염증 및 안 접촉 윤활 활성을 갖는 세정제 및 윤활제로서 이용될 수 있다.

도 1은 실험적 건성안(experimental dry eye, EDE) 유도 후 5일 및 10일 째 EDE 실험대조군, BSS (balanced salt solution) 처리군, 0.001% 아디포넥틴 처리군 및 0.01% 아디포넥틴 처리군에서 눈물 양을 측정한 결과이다. *P < 0.05, **P < 0.01 EDE 대조과 비교. †P < 0.05, ††P < 0.01 BSS 처리군과 비교.
도 2는 EDE 유도 후 5일 및 10일 째 EDE 실험대조군, BSS 처리군, 0.001% 아디포넥틴 처리군 및 0.01% 아디포넥틴 처리군의 각막 평탄정도(A), 대표도(B)를 나타낸 그림이다. *P < 0.05, **P < 0.01 EDE 대조군과 비교. †P < 0.05, ††P < 0.01 BSS 처리군과 비교.
도 3은 EDE 유도 후 10일 째 EDE 실험대조군, BSS 처리군, 0.001% 아디포넥틴 처리군 및 0.01% 아디포넥틴 처리군의 결막 술잔세포 밀도를 PAS(periodic acid-Schiff) 염색법으로 측정한 결과이다. †P < 0.05, ††P < 0.01 BSS 처리군과 비교. 스케일 바 = 20 μm.
도 4는 대조군의 결막에서 아디포넥틴의 수용체(receptor) AdiopR1과 AdipoR2를 면역조직화학염색법으로 확인한 결과이다. 스케일 바= 50 μm
도 5는 EDE 실험대조군, BSS 처리군, 0.001% 아디포넥틴 처리군 및 0.01% 아디포넥틴 처리군의 결막(A) 또는 눈물샘(B) 절편에서 TNF-α를 면역조직화학염색법으로 확인한 결과이다. TNF-α는 DAP(3,3’-diaminobenzidine peroxidase, 갈색) 염색으로 가시화하였으며, 대조염색으로 마이어 헤마토자일린(Mayer's hematoxylin, 청색)을 이용하였다. 스케일 바= 50 μm(결막), 200 μm(눈물샘)
도 6은 EDE 실험대조군, BSS 처리군, 0.001% 아디포넥틴 처리군 및 0.01% 아디포넥틴 처리군의 결막(A) 및 눈물샘(B)에서 CD4+ CXCR3+ T 세포에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

건성안 마우스 모델 및 실험 과정

본 발명에서 실시한 실험의 모든 프로토콜은 전남대학교 의과대학 동물실험윤리위원회로부터 허가되었으며, 실험동물의 유지 및 인 비보 실험은 기관의 가이드라인 및 안과 및 시력 연구에서의 동물사용에 대한 ARVO 규정을 준수하여 실시하였다.

실험에는 6-8주령 자성(female) C57BL/6 마우스를 이용하였다. EDE(experimental dry eye)는 하루 18시간 동안 30% 습도 및 대기 노출 조건하에 0.5 mg/0.2 mL 스코폴라민 브롬화수소산염(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 하루 4차례(오전 8시, 11시, 오후 2시 및 5시) 피하 주사함으로써 유도하였다. 실험기간 동안에 동물의 행동, 음식 및 물 섭취는 제한되지 않았다. 마우스는 다음의 5개 그룹으로 분배하였다: 미처리(untreated, UT) 대조군; EDE 대조군(점안액 미투여군); EDE 및 BSS(BSS; Alcon, Forth Worth, TX); EDE 및 0.001% 아디포넥틴; EDE 및 0.01% 아디포넥틴. 아디포넥틴 점안액은 (globular)아디포넥틴/(globular)아르코30 용액(R&D systems, Mineapolis, MN)을 BSS에 희석하여 제조하였다. 모든 치료군은 하루 4차례 2 μl의 점안액을 처리하였다. 눈물 양 및 각막표면의 평탄정도는 EDE 유도 후 5일 및 10일째에 측정하였다. EDE 유도 후 10일째에 마우스를 안락사 시킨 다음, 다중 면역비드 어세이(multiplex immunobead assay), 조직학 실험, 면역조직화학염색 및 유동 세포 분석법을 수행하였다. 실험 그룹은 각각 10마리의 실험동물로 구성되었으며(총 20개의 안구), 모든 실험은 반복적으로 실시하였다.

눈물 생산 측정

눈물 양은 페놀-레드 함침 면사(Zone-Quick, Oasis, Glendora, CA)를 이용하여 종래에 알려진 방법에 따라 측정하였다. 간단히 설명하면, 면사를 겸자(forcep)로 집어 눈 양쪽 끝 측면에 20초간 둔다. 눈물 양은 눈물에 의해 적색으로 변한 젖은 면사의 길이를 현미경(SMZ 1500; Nikon, Melville, NY)으로 관찰하여 측정한다. 표준곡선은 길이를 양(volume)으로 환산하여 도출하였다.

각막표면의 평탄정도 측정

마우스 안락사 후 입체 줌 현미경(SMZ 1500; Nikon)의 광섬유 링 조명장치로부터 백색 링의 반사된 이미지를 즉시 촬영하였다. 각막표면 평탄도는 2명의 촬영자로부터 촬영된 디지털 이미지에서 각막 상피에 반사된 백색 링의 불규칙성(distortion)에 대해 등급을 매김으로써 평가하였다. 각막 이상 증상 점수(corneal irregularity severity score)는 반사된 링에서 4등분 범위에 기초한 5점 스케일을 이용하여 계산하였다: 0, 불규칙성 없음; 1, 링에서 1/4에서 불규칙성 나타남; 2, 1/2에서 불규칙성 나타남; 3, 3/4에서 불규칙성 나타남; 4, 4분면에서 모두 불규칙성 나타남; 5, 심각한 불규칙성이 나타남, 구별 불가능한 링은 없었음.

다중 면역비드 어세이(Multiplex Immunobead Assay)

결막 및 눈물샘에서 IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ 및 MIG의 레벨은 다중 면역 비드 어세이(Luminex 200; Luminex Corp., Austin, TX)를 이용하여 측정하였다. 결막 및 눈물샘 조직은 각 그룹의 샘플에 단백질분해효소 억제제를 포함하는 용해 버퍼를 30분간 처리하여 수득하였다. 세포 추출물은 원심분리한 후, 상등액을 분리하여 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다. IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ 또는 MIG(Panomics, Santa Clara, CA)에 특이적인 마우스 단일클론 항체를 포함하는 사이토카인 비드 혼합물이 들어있는 웰에 상등액을 분주하고 60분간 반응시켰다. 표준곡선은 웰에 사이토카인을 단계 희석법으로 첨가하여 측정함으로써 도출하였다. 플레이트에 비오틴이 부착된 항체를 넣고 상온에서 30분간 반응시켰다. 어세이 버퍼로 3회 세척한 후, 반응물에 스트렙타비딘-피코에리스린을 첨가하고 분석 시스템(xPONENT, Austin, TX)을 이용하여 측정하였다.

조직학적 분석

눈물의 점액을 분비하는 결막 술잔세포(conjunctival goblet cell)의 밀도를 측정하기 위해 안구 및 눈물샘은 수술로 절제하여 4% 파라포름알데하이드에 고정시킨 시킨 다음 파라핀 블록을 제작하였다. 6 μm 두께로 절단하고 PAS(periodic acid-Schiff)로 염색하였다. 각 실험 그룹의 4 마리 마우스로부터 샘플을 제작하였고, 실험 결과는 디지털 카메라가 장착된 현미경(Olympus, 일본)을 이용하여 촬영하였다. 상부 및 하부 결막에서 술잔세포(goblet cell) 밀도는 이미지-분석 소프트웨어(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)를 이용하여 각 눈 샘플로부터 수득한 3개 섹션에서 100 μm 당 술잔세포의 숫자로 측정하였다.

면역조직화학 분석

면역조직화학법은 결막 및 눈물샘에서 TNF-α 양성 세포를 검출하고, 양성 세포의 수를 계산하기 위해 수행하였다. 눈 및 눈물샘은 수술로 절제하고 4% 파라포름알데하이드에 담가 4℃에서 하룻밤 동안 정치시킨 다음 세척 및 탈수 과정을 거쳐 파라핀 블록으로 제작하였고, 6 μm 두께로 절단하여 마운팅하였다. 고정 후, 0.3% H₂O₂를 포함하는 PBS에 10분간 담가 내재적인 퍼록시다아제(endogenous peroxidase)를 소광(quenching)시켰다. 아비딘/비오틴 블록(Vector Laboratories, Burlingame, CA)을 이용하여 10분간 순차적 블로킹을 수행함으로써 비특이적 염색을 억제하였다. 섹션은 20% 정상 혈청을 포함하는 PBS에 45분간 담가 블로킹한 다음, 단일클론 고트 항-TNF-α 항체(Santa Cruz, 독일)를 상온에서 1시간동안 처리하였다. 세척 후, 비오티닐화 마우스 항-고트 2차 항체를 처리한 다음, 3,3’-디아미노벤지딘 퍼록시다아제 기질(NovaRed; Vector Laboratories, Burlingame, CA)을 처리하고 Mayer’s 헤마토자일린으로 대조염색하였다.

유세포분석(flow cytometry)

유세포분석은 결막 및 눈물샘으로부터 결막내염증성 CD4+ CXCR3+ T 세포의 숫자를 계산하기 위해 수행하였다. 결막 및 눈물샘 조직은 각 그룹으로부터 수득한 다음 PBS 담가두었다. 조직은 가위를 이용하여 절단한 다음 0.5 mg/mL 콜라겐 분해효소 타입 D(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 처리하고 37℃에서 60분간 교반하였다. 조직은 시린지 플런저로 분쇄한 다음 100 μm 포어 사이즈의 세포 여과기에 통과시켰다. 여과 후 수득한 세포는 1,500 rpm에서 7분간 원심분리하고, 1% BSA(bovine serum albumin)을 포함하는 PBS로 부유시켜 세척한 다음 트리판 블루 염색하여 세포 수를 계산하였다. 세포에 플루오르세인이 결합된 항-CD4 항체(BD Biosciences, San Jose, CA), 피코에리트린이 결합된 항-CXCR3 항체(BD Biosciences) 및 아이소타입 대조군 항체를 처리하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 유세포분석에는 FACSCalibur cytometer with CellQuest software(BD Biosciences)를 이용하였다.

통계학적 분석

결과는 표준오차(± SEM)로 나타냈으며, 실험 그룹간 차이에 대한 통계학적 유의성은 ANOVA(one-way analysis of variance) 검정, 터키 사후 검정, SPSS 17.0 소프웨어(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 결정하였다. 0.05 이하의 P 값은 통계학적 유의성을 갖는 것으로 판단하였다.

실험결과

눈물 생산 분석

EDE 실험대조군에서의 눈물 양은 미처리(UT)군과 비교하여 EDE 유도 후 5일째에 현저하게 감소하였다(P<0.01). BSS 처리군(P=0.41 EDE 대조군과 비교)의 EDE 유도 후 5일째 눈물 양은 0.02 ± 0.02 μL였으며, 0.001% 아디포넥틴 처리군(P<0.05 EDE 대조군 또는 BSS 처리군과 비교)은 0.03 ± 0.01 μL, 0.01% 아디포넥틴 처리군(P<0.05 EDE 대조군 또는 BSS 처리군과 비교)은 0.03 ± 0.02 μL이었다. 0.001%와 0.01% 아디포넥틴 처리군은 5일과 10일째 모두에서 건성안 대조군과 BSS 처리군에 비해 눈물의 양이 유의하게 증가하였다. 모든 그룹에서 EDE 유도 후 10일째의 눈물 양은 5일째 측정한 결과와 유사하였다(도 1).

각막 표면 이상의 변화

EDE 실험대조군에서의 각막의 평탄정도는 미처리군(UT)과 비교하여 EDE 유도 후 5일 째 현저하게 감소하였다(P<0.01). BSS 처리군(P=0.63 EDE 대조군과 비교)의 EDE 유도 후 5일째 각막의 평탄정도는 2.68± 0.80이었으며, 0.001% 아디포넥틴 처리군(P<0.05 EDE 대조군 또는 BSS 처리군과 비교)은 1.21± 0.62, 0.01% 아디포넥틴 처리군(P<0.05 EDE 대조군 또는 BSS 처리군과 비교)은 1.10 ± 0.53이었다. 0.001%와 0.01% 아디포넥틴 치료군은 5일과 10일째 모두에서 건성안 대조군과 BSS군에 비해 각막표면의 평탄정도가 유의하게 호전되었다. 모든 그룹에서 EDE 유도 후 10일째 각막의 평탄정도는 5일째 측정한 결과와 유사하였다(도 2a-b).

결막 조직 및 눈물샘에서 염증 사이토카인 레벨

결막 및 눈물샘에서 IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ 및 MIG의 농도는 EDE 유도 후 10일째에 현저하게 증가하였다(P<0.05). BSS 처리군에서 나타난 사이토카인의 농도는 EDE 대조군과 비교하였을 때, 큰 차이를 나타내지 않았다(표 1-2). 그러나, 0.001% 및 0.01% 아디포넥틴 처리군은 EDE 대조군 또는 BSS 처리군과 비교하여 IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ 및 MIG 수치가 현저히 감소하였다(P<0.05).

결막에서의 IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ 및 MIG의 농도

-	IL/1β (pg/ml)	IL-6 (pg/ml)	TNF-α (pg/ml)	IFN-γ (pg/ml)	MIG (μg/ml)
UT	1.19±0.51**††	0.87±0.23**†	0.52±0.28**††	21.87±4.02**††	1.96±0.61**††
EDE	6.25±1.15	2.87±0.98	1.34±0.58	45.56±8.77	4.53±0.89
BSS	7.30±2.21	1.99±0.23	1.07±0.48	42.87±5.98	4.87±1.01
0.001% 아디포넥틴	1.25±0.56**††	1.13±0.56**††	0.55±0.34**††	30.78±5.07*†	2.87±0.56*†
0.01% 아디포넥틴	1.22±0.60**††	0.97±0.43**††	0.57±0.33**††	31.36±4.98*†	2.27±0.53*†

UT: 미처리군(untreated)

*P < 0.05, **P < 0.01 EDE 대조군과 비교. †P < 0.05, ††P < 0.01 BSS 처리군과 비교.

눈물샘에서의 IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ 및 MIG의 농도

-	IL/1β (pg/ml)	IL-6 (pg/ml)	TNF-α (pg/ml)	IFN-γ (pg/ml)	MIG (μg/ml)
UT	22.57±5.39**††	30.54±8.10**††	0.61±0.41**††	83.78±14.21*†	40.06±10.21**††
EDE	46.52±7.19	69.15±10.89	3.24±0.97	145.72±28.95	86.91±19.26
BSS	42.21±6.99	55.46±14.87	3.01±1.05	110.49±25.33	65.82±11.50
0.001% 아디포넥틴	32.33±7.13*†	35.53±8.66**††	0.85±0.30**††	93.12±15.24*†	48.10±16.36**††
0.01% 아디포넥틴	31.22±7.20*†	33.17±7.67**††	0.80±0.32**††	89.36±14.68*†	42.08±17.23**††

UT: 미처리군(untreated)

*P < 0.05, **P < 0.01 EDE 대조군과 비교. †P < 0.05, ††P < 0.01 BSS 처리군과 비교.

결막 술잔세포 밀도 분석

EDE 유도 10일 후, 결막 술잔세포의 밀도는 현저하게 감소하였다. BSS 처리군에서 술잔세포 밀도는 EDE 대조군과 비교하였을 때, 큰 차이를 나타내지 않았다. 그러나, 0.001% 및 0.01% 아디포넥틴 처리군은 EDE 대조군 또는 BSS 처리군과 비교하여 현저히 높은 세포 밀도를 나타냈다(P<0.05)(도 3a-b).

결막 조직 및 눈물샘에서 TNF -α 발현

EDE 유도 후, 결막 표피 및 눈물샘에서 TNF-α에 대한 면역조직화학 염색은 증가되었으나, BSS 처리 마우스 샘플에서는 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, 0.001% 및 0.01% 아디포넥틴 처리군에서 결막 및 눈물샘 조직의 TNF-α에 대한 면역조직화학 염색은 감소하였다(도 5a-b).

유세포 분석

결막 및 눈물샘에서 CD4+ CXCR3+ T 세포의 백분율은 EDE 유도 후 10일째에 현저하게 증가하였다(P<0.05). 결막에서의 EDE 대조군에서 CD4+ CXCR3+ T 세포의 백분율은 58.91 ± 20.21%이고, BSS 처리군은 57.29%± 19.37% (P=0.68 EDE 대조군과 비교), 0.001% 아디포넥틴 처리군(P<0.05 EDE 대조군 또는 BSS 처리군과 비교)은 32.51%± 12.45%, 0.01% 아디포넥틴 처리군(P<0.05)은 30.71%± 12.55% 을 나타냈다. 눈물샘에서의 EDE 대조군에서 CD4+ CXCR3+ T 세포의 백분율은 67.51%± 24.6%이고, BSS 처리군은 62.46%± 21.30%(P=0.32 EDE 대조군과 비교), 0.001% 아디포넥틴 처리군(P<0.05 EDE 대조군 또는 BSS 처리군과 비교)은 39.26%± 13.60%, 0.01% 아디포넥틴 처리군(P<0.05)은 30.35%± 11.87% 을 나타냈다. 다른 군들에 비해 0.001%와 0.01% 아디포넥틴 치료군에서 결막 내 CD4+ CXCR3+ T 세포의 수가 감소하였다. EDE, BSS, 0.001% 및 0.01% 아디포넥틴 처리군의 대표 샘플로부터 수득한 CD4+ CXCR3+ T 세포 백분율 히스토그램은 도 6a-b와 같다.

논의

아디포넥틴 수용체는 아디포넥틴 수용체1(AdipoR1), 아디포넥틴 수용체2(AdipoR2) 및 T-카데린을 포함하는데, 이러한 아디포넥틴 수용체는 말초 조직 및 기관에 널리 분포되어 있다. 최근 연구에서는 아디포넥틴 수용체가 랫트의 눈에도 분포하고 있다는 것이 알려졌다. AdipoR1은 구면(globular) 아디포넥틴에 대해 높은 친화도를 가지며, 전장 아디포넥틴에 대해서는 낮은 친화도를 갖는다. 반면, AdipoR2는 전장 및 구면 아디포넥틴에 대해 중간정도의 친화도를 갖는다. T-카데린은 절단형 수용체(truncated receptor)로 아디포넥틴의 헥사머 및 고분자 올리고머 형태에 결합할 수 있다. AdipoR1 및 AdipoR2는 플렉스트린 상동영역, 포스포티로신 도메인 및 루신 지퍼 모티프(APPL1)를 포함하는 어댑터 단백질과 상호작용하며, 수용체의 N-말단 세포 내 도메인에 결합한다. 아디포넥틴의 수용체 결합은 AMPK(adenosine monophosphate-activated protein kinase)의 활성화 및 p38 MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase)와 같은 다양한 신호전달 분자들의 활성화를 유발한다. AMPK의 활성화는 NFκB(nuclear factor κ B) 신호전달을 억제하며, 내피세포에서 염증 조절자로서의 기능을 나타낸다고 알려져 있다.

혈청 및 관절 낭액 아디포넥틴 레벨은 정상 또는 골관절염 환자와 비교할 때, 이러한 형태의 관절염을 갖는 환자에게서 현저하게 높다. 게다가, 혈청 아디포넥틴 농도는 류마티스 관절염의 심각성 정도와 관련이 있다. 아디포넥틴 AdipoR1, AdipoR2 mRNA 및 단백질은 류마티스 활막세포에 존재하며, 관절에서 아디포넥틴은 측분비(paracrine) 작용을 한다. 아디포넥틴을 이용한 활막세포(synovial fibroblast) 치료는 p38 MAPK 신호전달 과정을 통해 IL-6, pro-MMP-1(pro-matrix metalloproteinase-1), 기질 분해 효소 MMP-1의 전구체의 생산을 유도한다는 것이 알려져 있다. 아디포넥틴은 AdipoR1 면역반응성 증가를 통해, 급성 바이러스성 심근염의 발생을 억제할 수 있으며, 안지오텐신-Ⅱ 유도 심장비대를 약화시킨다.

본 발명자들은 건성안 마우스 모델에서 눈물 생산, 안구표면 이상, 결막 및 눈물샘에서 염증 사이토카인, 결막 술잔세포 밀도 및 결막 CD4+ CXCR3+ T 세포에 있어서 아디포넥틴 점안액의 효과를 평가하였다. EDE 유도 후 5일 및 10일째 눈물양 및 EDE 유도 후 10일째 결막 술잔세포 밀도는 EDE 대조군 및 BSS 처리군과 비교하였을 때, 0.001% 및 0.01% 아디포넥틴 처리군에서 보다 높았다. 5일 및 10일에 각막 평탄정도 및 결막 조직 및 눈물샘에서의 IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ 및 MIG 농도, 결막 상피 또는 눈물샘에서 TNF-α 발현 및 EDE 유도 10일 후 결막 및 눈물샘에서의 CD4+ CXCR3+ T 세포 비율은 EDE 대조군 및 BSS 처리군과 비교하였을 때, 0.001% 및 0.01% 아디포넥틴 처리군에서 보다 낮았다. BSS 처리군 및 EDE 대조군 간 매개변수(parameter)에는 통계학적으로 유의한 차이가 없었다. EDE 마우스에 0.001% 및 0.01% 아디포넥틴 처리하였을 경우, 임상학 및 조직학적 변수에 있어서 개선된 효과를 나타냈다. 아디포넥틴 효과를 평가한 종래 연구와 비교하였을 때, 본 발명의 동물실험 결과는 여러 다른 특징들을 나타냈다. 먼저, 본 발명자들은 자연발생 건성안 및 SS-라이크 염증을 유도하는 NOD(non-obese diabetic) 마우스와 같은 자가면역 민감성 마우스와 비교하여 자연발생 자가면역에 대해 민감하지 않은 C57BL/6 마우스에서 건성안을 유도하였다. 본 발명자들의 종래 연구결과에 따르면, C57BL/6 마우스에서 건조 스트레스를 제거한 후에 EDE는 반전될 수 있으나, 자가면역 NOD 마우스에서는 변함없이 유지되었다. 자가면역 마우스 모델에서 레미케이드(infliximab)의 국소적 치료 효과를 평가하는 연구가 앞으로 요구된다.

본 발명자들은 실험적 건성안에 대한 치료로서 아디포넥틴 점안액의 국소적 적용을 처음으로 도입하였다. 아디포넥틴 치료법은 말초혈에서 T 세포 수용체-매개 Th1 세포 및 케모카인 활성화를 증가시키고, 염증 조직으로 병원성 T 세포가 이동하는 것을 막음으로써 타겟 조직의 염증반응을 억제하여 결과적으로 항-염증 효과를 나타낸다. 아디포넥틴의 국소적 적용은 염증이 발생한 안구 표면에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다. 이러한 특징들에 따르면, 아디포넥틴의 국소적 적용은 건성안과 같은 안구 표면 염증 치료에 보다 효율적일 수 있다. 앞으로, 건성안 환자에 있어 국소 아디포넥틴 치료의 효과에 대한 임상적 연구가 필요하다. 결론적으로, 0.001% 및 0.01% 아디포넥틴 점안액은 눈물 생산 및 안구 표면 이상을 개선시키며, 염증 사이토카인 및 안구 표면에서 Th1 세포를 감소시키고, 건성안 마우스 모델에서 각막 술잔세포 밀도를 증가시킨다. 본 발명의 결과는 TNF-α 억제제로서 아디포넥틴이 건성안 질병 치료에 유용하다는 것을 나타낸다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, Chonnam University <120> Compositions for Preventing or Treating of Eye Diseases <130> PN120390 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 247 <212> PRT <213> Adipocyte complement-related protein Acrp30 <400> 1 Met Leu Leu Leu Gln Ala Leu Leu Phe Leu Leu Ile Leu Pro Ser His 1 5 10 15 Ala Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val 20 25 30 Pro Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly 35 40 45 His Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr 50 55 60 Pro Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys 65 70 75 80 Gly Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly 85 90 95 Phe Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Ala Ala Tyr 100 105 110 Met Tyr Arg Ser Ala Phe Ser Val Gly Leu Glu Thr Arg Val Thr Val 115 120 125 Pro Asn Val Pro Ile Arg Phe Thr Lys Ile Phe Tyr Asn Gln Gln Asn 130 135 140 His Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Asn Ile Pro Gly Leu 145 150 155 160 Tyr Tyr Phe Ser Tyr His Ile Thr Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val 165 170 175 Ser Leu Phe Lys Lys Asp Lys Ala Val Leu Phe Thr Tyr Asp Gln Tyr 180 185 190 Gln Glu Lys Asn Val Asp Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu His Leu 195 200 205 Glu Val Gly Asp Gln Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Asp Gly Asp His 210 215 220 Asn Gly Leu Tyr Ala Asp Asn Val Asn Asp Ser Thr Phe Thr Gly Phe 225 230 235 240 Leu Leu Tyr His Asp Thr Asn 245 <210> 2 <211> 1276 <212> DNA <213> Adipocyte complement-related protein Acrp30 mRNA, complete cds <400> 2 ctctaaagat tgtcagtgga tctgacgaca ccaaaagggc tcaggatgct actgttgcaa 60 gctctcctgt tcctcttaat cctgcccagt catgccgaag atgacgttac tacaactgaa 120 gagctagctc ctgctttggt ccctccaccc aagggaactt gtgcaggttg gatggcaggc 180 atcccaggac atcctggcca caatggcaca ccaggccgtg atggcagaga tggcactcct 240 ggagagaagg gagagaaagg agatgcaggt cttcttggtc ctaagggtga gacaggagat 300 gttggaatga caggagctga agggccacgg ggcttccccg gaacccctgg caggaaagga 360 gagcctggag aagccgctta tatgtatcgc tcagcgttca gtgtggggct ggagacccgc 420 gtcactgttc ccaatgtacc cattcgcttt actaagatct tctacaacca acagaatcat 480 tatgacggca gcactggcaa gttctactgc aacattccgg gactctacta cttctcttac 540 cacatcacgg tgtacatgaa agatgtgaag gtgagcctct tcaagaagga caaggccgtt 600 ctcttcacct acgaccagta tcaggaaaag aatgtggacc aggcctctgg ctctgtgctc 660 ctccatctgg aggtgggaga ccaagtctgg ctccaggtgt atggggatgg ggaccacaat 720 ggactctatg cagataacgt caacgactct acatttactg gctttcttct ctaccatgat 780 accaactgac tgcaactacc catagcccat acaccaggag aatcatggaa cagtcgacac 840 actttcagct tagtttgaga gattgatttt attgcttagt ttgagagtcc tgagtattat 900 ccacacgtgt actcacttgt tcattaaacg actttataaa aaataatttg tgttcctagt 960 ccagaaaaaa aggcactccc tggtctccac gactcttaca tggtagcaat aacagaatga 1020 aaatcacatt tggtatgggg gcttcacaat attcgcatga ctgtctggaa gtagaccatg 1080 ctatttttct gctcactgta cacaaatatt gttcacataa accctataat gtaaatatga 1140 aatacagtga ttactcttct cacaggctga gtgtatgaat gtctaaagac ccataagtat 1200 taaagtggta gggataaatt ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa agaaaaactt tagagcacac 1260 tggcggccgt tactag 1276

Claims (12)

1. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 또는 염증성 안구표면 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 안구표면 투여 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 결막 술잔세포(conjunctival goblet cell) 수를 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 각막 표면의 불규칙성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. (a) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 안구건조증 또는 염증성 안구표면 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 시럽제, 에멀젼, 리포좀, 산제, 분말제, 과립제, 정제, 서방형제제, 점안제(eye drop), 캡슐제, 콘택트렌즈 세정제 및 콘택트렌즈 윤활제로 구성된 군으로부터 선택된 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유효성분으로 포함하는 인공 눈물 조성물.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 유효성분은 눈물샘에서의 눈물 분비를 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
12. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유효성분으로 포함하는 콘택트렌즈용 세정, 윤활 또는 패키징(packaging) 조성물.

Images