DE4041059A1 - Arthritis-unterdrueckende peptide sowie diese enthaltende pharmazeutische zubereitungen - Google Patents
Arthritis-unterdrueckende peptide sowie diese enthaltende pharmazeutische zubereitungenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein die Arthritis und die Synovitis
unterdrückendes Peptid und dessen Bruchstücke sowie Derivate
und pharmazeutische Zubereitungen, die mindestens ein solches
Peptid enthalten.
Die chronische Polyarthritis ist eine Autoimmunerkrankung mit
unbekannter Ätiologie, an der etwa 1% der Gesamtbevölkerung
erkranken. Davon sind Frauen etwa 2 bis 4 mal häufiger be
troffen als Männer. Bei dieser Krankheit wird durch eine
Fehlsteuerung des Immunsystems die dünne Synovialmembran der
Gelenke angegriffen.
Bislang ist es üblich von dieser Krankheit befallene Patien
ten mit nichtsteroidalen antinflammatorischen Mitteln wie
Salicylate, insbesondere Acetylsalicylsäure oder Indometacin
zu behandlen. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Appli
kation von Goldverbindungen wie Gold-Natrium-Thiomalat oder
Gold-Thioglycose. Auch die Anwendung von Kortikostereoiden
und von Immunsuppressiva wie Cyclophosphamid, Methotrexat und
Azathioprin sind möglich. Alle diese bekannten Therapieformen
weisen jedoch mehr oder weniger schwere Nebenwirkungen auf,
so daß diese nicht uneingeschränkt zur Therapie eingesetzt
werden können. Darüberhinaus zeigen nur etwa 75% der
Patienten bei einer solchen konservativen Therapie während
des 1. Krankheitsjahres eine Besserung und etwa 10% werden
trotz entsprechender Behandlung schließlich behindert. Es be
steht daher ein großer Bedarf an der Bereitstellung weiterer
Mittel zur Behandlung der Arthritis.
Aus Trentham et al J. Exp. Med. (1977) 146, Seite 857 ist es
bekannt, daß an einem experimentellen Tiermodell Arthritis
ausgelöst werden kann. Dabei wird Mäusen Collagen II appli
ziert, wodurch eine Autoimmunerkrankung ausgelöst wird, die
sich in der Ausbildung einer Arthritis manifestiert. Es ist
bekannt, daß für die Auslösung dieser Autoimmunerkrankung le
diglich die alpha 1 (II)-Kette des Collagens verantwortlich
ist. Es ist außerdem bekannt, daß das die Arthritis auslösen
de Antigen auf dem sogenannten CB11-Fragment liegt, das mit
tels CNBr-Spaltung des Collagen II erhältlich ist.
Aus Linda K. Myers et al, J. Exp. Med. (1989), 170, 1199-2010
ist ein Epitop bestehend aus den Aminosäuren 122-147
bekannt, das auf CB11 liegt und daß bei vorheriger Verabrei
chung dieser Aminosäuresequenz die Induktion von Arthritis
unterdrückt werden kann.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß auf dem die
Arthritis induzierenden CB11-Fragment ein weiteres, die Art
hritis unterdrückendes Epitop vorliegt.
Die Erfindung betrifft daher ein Peptid mit der Aminosäurese
quenz
R₁-Ala-Gly-R₂-Gly-Ala-Pro-Gly-R₃
worin
R₁ = H oder -Gly-Phe-Pro-Gly-Gln-Asp-Gly-Leu- oder Gly-Phe-Ala-Gly-Gln-Ala-Gly-Pro-,
R₂ = -Pro-Lys- oder -Ala-Thr und
R₃ = H oder -Glu-Arg- oder Arg-Pro
R₁ = H oder -Gly-Phe-Pro-Gly-Gln-Asp-Gly-Leu- oder Gly-Phe-Ala-Gly-Gln-Ala-Gly-Pro-,
R₂ = -Pro-Lys- oder -Ala-Thr und
R₃ = H oder -Glu-Arg- oder Arg-Pro
ist, sowie dessen Bruchstücke und immunologisch aktive Deri
vate und pharmazeutisch verträgliche Salze davon. Bevorzugte
Peptide sind
Gly-Phe-Pro-Gly-Gln-Asp-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Lys-Gly-
Ala-Pro-Gly-Glu-Arg,
Gly-Phe-Ala-Gly-Gln-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Thr- Gly-Ala-Pro-Gly-Arg-Pro,
Ala-Gly-Pro-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Arg.
Gly-Phe-Ala-Gly-Gln-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Thr- Gly-Ala-Pro-Gly-Arg-Pro,
Ala-Gly-Pro-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Arg.
Die erfindungsgemäßen Peptide leiten sich von den Aminosäuren
316-333 der alpha 1 (II)-Kette des Collagens ab und umfassen
auch solche Derivate dieser Aminosäuresequenzen die von Typ
II spezifischen T-Zellinien erkannt werden.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind mittels bekannten bioche
mischen Verfahren erhältlich wie z. B. der enzymatischen Ver
dauung bekannter Proteine, insbesondere des Collagens oder
mittels dem Fachmann bekannter synthetischer Verfahren wie
der Biosynthese mittels geeigneter RNA oder der Synthese nach
Merrifield. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß sich
mit den erfindungsgemäßen Peptiden die durch Collagen II sti
mulierte Proliferation von entsprechend sensibilisierten T-
Zellen hemmen läßt. Die Erfindung betrifft daher auch eine
pharmazeutische Zubereitung, die die erfindungsgemäßen
Peptide enthält.
Überraschenderweise hat es sich auch gezeigt, daß sich die
mittels Collagen stimulierte T-Zellenproliferation auch durch
die Zugabe von solchen Antikörpern hemmen läßt, die gegen das
inhibierende Antigen selbst gerichtet sind. Die Erfindung be
trifft daher auch pharmazeutische Zubereitungen, die solche
Antikörper und/oder die erfindungsgemäßen Peptide enthalten.
Dabei können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikör
per enthalten sein. Ein geeigneter Antikörper ist der mono
klonale Antikörper C1 der frei erhältlich ist (Zellinie,
Hinterlegungsnummer ECACC Nr. 89083001, R. Holmdahl, K.
Rebin, L. Klareskog, E. Larssen, H. Wigzell. Arthritis &
Rheumatism. 29: 400-410 (1986).
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung ist beson
ders zur Behandlung von Arthritis und Autoimmunkrankheiten
geeignet. Die Erfindung soll durch die folgenden Beispiele
in Verbindung mit den Figuren näher erläutert werden.
Fig. 1 zeigt hierbei ein Proliferationsexperiment, bei dem
monoklonale Antikörper (C1 und D3) dem T-Zellklon C9
zugesetzt wurden. Als Antigen wurden natives menschliches
Collagen Typ II (HC II) oder denaturiertes menschliches
Collagen Typ II (DN-HC II) gemeinsam mit autologen Antigen
präsentierenden Zellen zugesetzt. Die biologische Antwort des
Klons wurde in Zählimpulsen (counts per minute, cpm) nach
radioaktiver Markierung von Tymidin s gemessen.
Fig. 2 zeigt einen Versuch, bei dem verschiedene Collagen II-
Peptide einem Proliferationsexperiment mit dem Klon C9
zugesetzt wurden. Die Peptidkonzentrationen sind in der Figur
gegeben. Nur das erfindungsgemäße Peptid und vor allem dessen
Carboxyterminales Dekapeptid hemmen konzentrationsabhängig
die HCII-ausgelöste Immunantwort des Klons C9.
Hemmung der Collagen II-bedingten Stimulation menschlicher T-
Zellen durch ein synthetisches Peptid.
Es wurde ein Peptid mit der Sequenz,
Gly-Phe-Pro-Gly-Gln-Asp-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Lys-Gly- Ala-Pro-Gly-Glu-Arg,
synthetisiert, wobei allgemein bekannte Verfahren Verwendung fanden.
Es wurde ein Peptid mit der Sequenz,
Gly-Phe-Pro-Gly-Gln-Asp-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Lys-Gly- Ala-Pro-Gly-Glu-Arg,
synthetisiert, wobei allgemein bekannte Verfahren Verwendung fanden.
Aus menschlichem peripheren Blut wurden mit Hilfe einer Dich
tegradientenseparation mononukleäre Zellen präpariert und mit
humanem nativem Collagen Typ II stimuliert. Das menschliche
Collagen Typ II wurde entsprechend einer Vorschrift von K.
von der Mark, M. van Mencel, H. Wiedemann, Eur. J. Biochem.
124: 57 (1982) hergestellt und gereinigt und in einer
Konzentration von 10 µg/ml Zellkulturmedium eingesetzt. Auf
diese Weise wurden menschliche T-Zellinien und nach einer
Klonierung mit der Grenzverdünnungsmethode auch menschliche
T-Zellklone mit Spezifität für humanes Collagen Typ II
erzeugt. Die Herstellung menschlicher T-Zellklone ist den
Fachleuten bekannt und u. a. in folgenden Publikationen
beschrieben worden: 1. Emmrich, F., J. Thole, J. van Embden,
S.H.E. Kaufmann: A recombinant 64 kD protein of
mycobacterium bovis BCG specifically stimulates human T4
clones reactive to mycobacterial antigens. J. Exp. Med. 163
(1986) 1024-1029. 2. Enmrich, F., S.H.E. Kaufmann: Human T
cell clones with reactivity to Mycobacterium leprae as tools
for the characterization of potential vaccines against
leprosy. Infection and Immunity 51 (1986) 879-883.
In Fig. 1 ist ein Experiment mit dem T-Zellklon C9 beschrie
ben. 2×104 Zellen des T-Zellklons und 5×104 autologe mo
nonukleäre Zellen, die nach Dichtegradientenzentrifugation
frisch gewonnen waren, wurden mit 10 µg/ml nativen Humancol
lagen Typ II und verschiedenen Konzentrationen des zuvor syn
thetisierten Peptides kokultiviert. Die verwendeten
Peptidkonzentrationen sind auf der Abszisse in Fig. 1 gege
ben. Als Zellkulturmedium wurde RPMI 1640 (Fa. Gibco), unter
Zusatz von 100 µg/ml Streptomycin und 100 units/ml Penicillin
und dem Zusatz von 25 mmol Hepespuffer sowie 10% humanes Se
rum verwendet. Alle Zellkulturen wurden in Triplikaten ange
setzt und mit Kontrollen verglichen, die ohne Zusatz von
Collagen Typ II bzw. unter Zusatz von anderen synthetischen
Peptiden angesetzt wurden. Nach 5 Tagen wurde däs Experiment
beendet und die DNS-Synthese im untersuchten T-Zellklon mit
Hilfe des Einbaues von radioaktivem 3H Thymidin bestimmt
(Emmrich et al. J. Exp. Med. 163 (1986) 1024-1029. Emmrich et
al. Infection and Immunity 51 (1986) 879-883).
Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß sowohl natives wie auch Hit
zedenaturiertes menschliches Collagen Typ II den untersuchten
T-Zellklon C9 stimuliert. Bei Zugabe steigender Mengen des
synthetischen erfindungsgemäßen Peptides wird diese Stimula
tion zunehmend gehemmt. Kontrollpeptide, die ebenfalls von
der menschlichen Kollegen Typ II Sequenz abgeleitet wurden,
zeigten diesen Effekt nicht. Aus Fig. 1 ist auch ersichtlich,
daß bei Verwendung zweier Peptide, die das erfindungsgemäße
Peptid nochmals unterteilen, der Bereich mit der Sequenz
AGPKGAPGER die wesentliche Hemmung bewirkte.
Die Proliferation des bereits erwähnten menschlichen T-Zell
klons C9 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durch die Auf
nahme von radioaktiv markiertem 3H-Thymidin bestimmt. Das
Experiment wurde wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Anstelle des synthetischen Peptides wurde jedoch der monoklo
nale Antikörper C1 zugesetzt. C1 ist aus der Zellinie Nr.
ECACC Nr. 89083001 erhältlich. Der Antikörper C1 erkennt ein
Epitop im Bereich des Collagenfragmentes CB11, das durch Se
quenzierung tryptischer Fragmente von CB11 bestimmt wurde.
Die Sequenz entspricht dem unter Beispiel 1 erwähnten Peptid.
(R. Holmdahl, K. Rubin, L. Klareskog, E. Larssen, H. Wigzell:
Characterization of the antibody response in mice with type
II collagen-induced arthritis, using monoclonal anti-type II
collagen antibodies. Arthrits & Rheumatism 29: 400-410
(1986). E.J. Miller: Isolation and characterization of the
cyanogen bromide peptides from the α1 (II) chain of chicken
cartilage collagen. Biochemistry 10: 3030. H. Burkhardt, R.
Holmdahl, R. Deutzmann, H. Wiedemann, H. von der Mark, S.
Goodman, K. von der Mark: Identification of a major antigenic
epitope on CNBr-fragment 11 of type II collagen recognized by
murine autoreactive B cells. Eur. J. Immunol. (in press)).
Die Konzentration des Antikörpers C1, die im Experiment
eingesetzt wurde, ist auf der Abszisse der Fig. 2 angegeben.
Die T-Zellstimulation des Klones C9 läßt sich mit steigender
Zugabe des Antikörpers C1 hemmen. Dies ist nicht der Fall,
wenn hitzedenaturiertes Collagen Typ II zur Stimulation ver
wendet wird, oder wenn ein anderer monoklonaler Antikörper
(D3) eingesetzt wird, der ein Epitop im Bereich des Collagen
II Fragmentes CB10 erkennt. Dies zeigt an, daß C1 nicht di
rekt die T-Zellstimulation beeinflußt, sondern durch seine
Bindung an das native Collagen Typ II die Antigen-Prozessie
rung durch präsentierende Zellen dahingehend beeinflußt, daß
die Stimulation menschlicher T-Zellen gehemmt wird. C1 bindet
nicht an denaturiertes Collagen II, demnach ist der darge
stellte Effekt mit denaturiertem Collagen Typ II nicht zu er
zielen.
Claims (7)
1. Peptid mit der Aminosäuresequenz
R₁-Ala-Gly-R₂-Gly-Ala-Pro-Gly-R₃worin
R₁ = H oder -Gly-Phe-Pro-Gly-Gln-Asp-Gly-Leu- oder Gly-Phe-Ala-Gly-Gln-Ala-Gly-Pro-,
R₂ = -Pro-Lys- oder -Ala-Thr und
R₃ = H oder -Glu-Arg- oder Arg-Proist, sowie dessen Bruchstücke und dessen immunologisch aktive Derivate und pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
R₁ = H oder -Gly-Phe-Pro-Gly-Gln-Asp-Gly-Leu- oder Gly-Phe-Ala-Gly-Gln-Ala-Gly-Pro-,
R₂ = -Pro-Lys- oder -Ala-Thr und
R₃ = H oder -Glu-Arg- oder Arg-Proist, sowie dessen Bruchstücke und dessen immunologisch aktive Derivate und pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
2. Peptide nach Anspruch 1 mit der Sequenz
Gly-Phe-Pro-Gly-Gln-Asp-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Lys-Gly-
Ala-Pro-Gly-Glu-Arg.
3. Peptid nach Anspruch 1 mit der Sequenz
Gly-Phe-Ala-Gly-Gln-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Thr-
Gly-Ala-Pro-Gly-Arg-Pro.
4. Peptid nach Anspruch 1 mit der Sequenz
Ala-Gly-Pro-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Arg.
5. Pharmazeutische Zubereitung enthaltend mindestens ein
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß diese Antikörper enthalten, die mit dem die Amino
säuren 317 bis 333 umfassenden Epitop des CB11-Fragments
von menschlichem Collagen II reagieren.
7. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie ein oder mehrere monoklonale Antikörper der im
Anspruch 6 definierten Spezifität enthält.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19904041059 DE4041059A1 (de) | 1990-12-20 | 1990-12-20 | Arthritis-unterdrueckende peptide sowie diese enthaltende pharmazeutische zubereitungen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19904041059 DE4041059A1 (de) | 1990-12-20 | 1990-12-20 | Arthritis-unterdrueckende peptide sowie diese enthaltende pharmazeutische zubereitungen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE4041059A1 true DE4041059A1 (de) | 1992-06-25 |
Family
ID=6420945
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19904041059 Withdrawn DE4041059A1 (de) | 1990-12-20 | 1990-12-20 | Arthritis-unterdrueckende peptide sowie diese enthaltende pharmazeutische zubereitungen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE4041059A1 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107073076A (zh) * | 2014-11-11 | 2017-08-18 | 株式会社日皮 | 免疫活化剂、细胞性免疫活化剂及t细胞增殖剂 |
| CN109310731A (zh) * | 2016-04-08 | 2019-02-05 | 韩国视角生物株式会社 | 软骨细胞的细胞外基质来源的肽 |
-
1990
- 1990-12-20 DE DE19904041059 patent/DE4041059A1/de not_active Withdrawn
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US20190111112A1 (en) * | 2016-04-08 | 2019-04-18 | Eyebio Korea | Chondrocyte extracellular matrix-derived peptide |
| EP3441081A4 (de) * | 2016-04-08 | 2019-09-18 | Eyebio Korea | Peptid aus extrazellulärer chondrozytenmatrix |
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| US10709768B2 (en) * | 2016-04-08 | 2020-07-14 | Eyebio Korea | Chondrocyte extracellular matrix-derived peptide |
| CN109310731B (zh) * | 2016-04-08 | 2022-03-29 | 韩国视角生物株式会社 | 软骨细胞的细胞外基质来源的肽 |
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