CN107073076A - 免疫活化剂、细胞性免疫活化剂及t细胞增殖剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种包含平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽的免疫活化剂。对血液中的T细胞数、CD8阳性CD28阳性T细胞数、CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比、初始T细胞数、初始T细胞/记忆性T细胞比、B细胞数以及NK细胞数这7项的测定值赋予预先根据免疫力而设定的3个等级的评分1(免疫力低)、2(免疫力为中等)、3(免疫力高)中的任一种，将对上述7项所赋予的评分合计以作为免疫力评分，上述的免疫活化剂可以提高以该免疫力评分为指标的免疫力。

Description

免疫活化剂、细胞性免疫活化剂及T细胞增殖剂

技术领域

本发明涉及一种包含平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽的免疫活化剂、细胞性免疫活化剂及T细胞增殖剂。

背景技术

因免疫力降低而导致对各种疾病的抵抗力下降时，容易罹患癌症及各种感染症。免疫力会因公害或化学物质、运动等环境因素、饮食、年龄增加、压力等而降低。如果能够防止免疫力的降低、或者提高免疫力，则能够降低疾病的患病率。在使免疫力降低的因素中，环境及年龄增加不容易通过自身的意志来改善，但通过服用免疫活化剂，可以提高免疫力。

作为提高免疫力的物质，有阿富汗产的甘草(Glycyrrhiza glabla)的乙酸提取物(专利文献1)。据报道，在以促有丝分裂活性(淋巴细胞的母细胞化反应)为指标，研究由各种酵母及生药提取的多糖体组分对免疫系统的影响时，在乙酸酸性下由甘草提取的组分、特别是将阿富汗产的甘草的热水提取物进行除蛋白并用醇沉淀、再将沉淀物用乙酸提取而得到的组分(AL－4组分)中确认到了强的促有丝分裂活性。

另外，还有一种以来自甘蔗的提取物作为有效成分的癌症免疫活化剂(专利文献2)。其使用来自甘蔗的提取物，在检测有效成分时，以增强自然杀伤细胞对癌细胞的细胞毒活性的组分、或者增强干扰素γ的产生能力的组分为基准，评价癌症免疫活化。

而且，还有一种增进体内IgA的产生的乳酸菌制剂，其包含增进体内的IgA的产生、并抑制病原性细菌增殖的屎肠球菌(Enterococcus faecium)NHRD IHARA(FERM BP－11090)的培养物等(专利文献3)。由于IgA是防止病原微生物在体内附着以及防止过敏性物质的侵入、吸收的粘膜免疫系统的主角、婴幼儿及老人等体力下降的人对病原菌等来自外部的异物的抵抗力弱、以及由生活环境的变化等产生的压力导致肠道粘膜免疫降低等，因此以IgA产生量为指标，选择增强其产生量的物质。

而且，还有一种来自江蓠属红藻类的免疫增强剂(专利文献4)。将处于静止期的淋巴细胞引入生长、增殖状态的触发效果称作促有丝分裂刺激，是作为生物体对异物(抗原)的免疫反应的关键的重要现象。以促有丝分裂刺激功能为指标，选择该活性高的组分作为有效成分。

另外，还有一种含燕麦及/或其加工物和加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)的免疫增强剂(专利文献5)。将腹腔巨噬细胞和脾细胞进行共培养，在加入了卵清蛋白作为免疫原的培养基中添加、未添加乳酸菌和添加、未添加燕麦而获得的实验体系中，测定反映巨噬细胞活化的NO^2-离子产生量，以其作为免疫活性的评价标准。

另外，还有一种以除去了皮及内脏的海参类提取物作为免疫增强剂的产品(专利文献6)。评价脑神经修复作用、神经生长作用、胰岛素游离作用、免疫增强作用、侵害性疼痛抑制作用、神经性疼痛抑制作用、糖尿病性知觉异常改善作用、溃疡抑制作用，以具有其中的至少一种作用的组分作为有效成分。

另外，还有一种以由咖啡提取物得到的、来自咖啡的阿拉伯半乳聚糖(Coffee AG；Cof－AG)作为有效成分的免疫活化剂(专利文献7)。以巨噬细胞样细胞株RAw264、J774.1、小鼠脾细胞、小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠树突细胞中的任一种免疫担当细胞的增殖促进效果作为评价标准，在有效成分中鉴定上述免疫活化活性较来自落叶松的阿拉伯半乳聚糖高的组分。

而且，还有一种包含水母胶原蛋白的免疫球蛋白产生促进剂(专利文献8、非专利文献1)。其是以在增强免疫活性的同时对变态反应没有影响的免疫活性增强为目的而提出的。对小鼠经口给予换算成人为0.3g/天的水母提取物时，可促进派尔集合淋巴结(Peyer'spatch)淋巴细胞、肠系膜淋巴结淋巴细胞及脾脏淋巴细胞等淋巴细胞的增加，另外，在派尔集合淋巴结淋巴细胞中添加水母提取物进行培养时，可促进IgG、IgA及IgM等免疫球蛋白的产生。另外，非专利文献1记载着：将水母胶原蛋白与牛跟腱胶原蛋白进行比较时，水母胶原蛋白具有优异的抗体产生能力，而比进行了胶原蛋白酶处理的肽分子量大的胶原蛋白的抗体产生活性优异。此外，在水母提取物中，除胶原蛋白以外，还包含粘蛋白(参照专利文献11)，上述文献中记载的效果是由包含粘蛋白的水母提取物产生的效果。

这里，免疫系统是指，在生物体内识别病原体或癌细胞等非自身物质或异常细胞并将其排除、以保护生物体远离疾病的机构。除抗体及补体等血中蛋白质以外，各种淋巴细胞及由淋巴细胞释放的细胞因子等也相互关联，形成复杂的网络。而且，参与免疫系统的细胞种类繁多，有T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、巨噬细胞等，T细胞还可以进一步细分，有辅助T细胞、杀伤T细胞、抑制T细胞等。作为准确掌握人的免疫能力的方法，有人提出了下述方法：以由生物体分离的外周血单核细胞集团中的CD4阳性T细胞数与CD8阳性T细胞数或CD25阳性T细胞数之比为指标，评价上述生物体的免疫能力(专利文献9)。在细胞障碍性试验中，由于效应细胞的保存状态会对试验结果产生影响，因此旨在开发即使采血后经过某种程度的时间也可正确地评价免疫能力的技术。据报道，以血液单核细胞集团中的CD4阳性·CD25阳性T细胞数的比例为指标时，可以高精度地评价生物体的免疫能力。

而且，由于免疫机制的复杂性，淋巴细胞数的增减无法直接反映免疫力，鉴于此还提出了一种能够高精度地评价综合免疫力的免疫力评价方法(专利文献10、非专利文献2)。专利文献10记载的免疫力评价方法是指，对各受试者的血中所含的T细胞数、T细胞增殖系数、CD4阳性T细胞数/CD8阳性T细胞数比(以下，仅称作CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比)、初始T细胞数、初始T细胞数/记忆性T细胞数比(以下，仅称作初始T细胞/记忆性T细胞比)、IL－2细胞因子产生能力、IFN－γ细胞因子产生能力、IL－4细胞因子产生能力、B细胞数、以及NK细胞数等免疫细胞标志物的评价进行打分，以它们的总计值作为免疫力评分。将根据免疫力而预先设定的多个等级与上述免疫力评分进行对比时，可以综合性地评价免疫力。

现有技术文献专利文献

专利文献1：日本专利第2918564号公报

专利文献2：日本专利第4484267号公报

专利文献3：日本专利第4565057号公报

专利文献4：日本专利第4581082号公报

专利文献5：日本专利第5095912号公报

专利文献6：日本专利第5107043号公报

专利文献7：日本专利第5348716号公报

专利文献8：日本特开2010－173937号公报

专利文献9：日本专利第5144950号公报

专利文献10：日本专利第4608704号公报

专利文献11：国际公开第2014/030323号

非专利文献

非专利文献1：T.SUGAHARA等人,“Immunostimulation Effect of JellyfishCollagen”,Biosci.Biotechnol.Biochem.,2006年9月7日,第70卷,9号,第2131－2137页

非专利文献2：广川等人,“综述关于免疫功能的评价判定及其恢复”,Biotherapy,(2009),23(1),第1－12页

非专利文献3：Utsuyama M.等人,“Age－related Changes in Subpopulationsof Peripheral Blood Lymphocytes in Healthy Japanese Population”,Handbook onImmunosenescence Springer Netherlands,(2009),第203－218页,图3

非专利文献4：笹月健彦监督翻译,免疫生物学(原著第5版),南江堂,2003年10月15日发行,第76－77页,第223－225.

发明内容

技术问题

胶原蛋白是分子量为300,000的具有三重螺旋结构的蛋白质。在胶原蛋白分解物中，若将具有凝胶化能力的组分称作“明胶”，则将分子量较明胶低的、例如平均分子量为1,000～20,000的分解物称作“胶原蛋白肽”。由于明胶多用于食品，因此将其进行低分子化而获得的胶原蛋白肽的安全性高。另一方面，非专利文献1中记载着：虽然水母胶原蛋白具有抗体产生能力，但在牛跟腱胶原蛋白中抗体产生能力弱，未分解的胶原蛋白的抗体产生活性比胶原蛋白肽优异。水母由软骨组织构成，以II型胶原蛋白作为主要成分。II型胶原蛋白具有如下特征：与I型胶原蛋白相比，含有3倍量的羟赖氨酸，并含有1/2量的羟脯氨酸。因此，深入研究胶原蛋白肽，如果能够鉴定可活化免疫力的胶原蛋白肽，则可以提供安全的免疫活化剂。

免疫活化属全身性作用，综合且概括性地评价免疫力并不容易。专利文献1～8、非专利文献1记载的免疫增强剂等不过是以促有丝分裂活化、癌症免疫活化、病原性细菌的增殖抑制、巨噬细胞活化等为指标。专利文献9记载的免疫能力的评价方法也不过是以经时性变化小的CD4阳性细胞数与CD8阳性细胞数、以及CD25阳性细胞数之比作为评价对象来评价细胞障碍性。在这方面，专利文献10记载的方法是将多个项目的实测值对应着免疫力进行打分、合计，可以说是概括性的免疫力的指标。但是，免疫力的提高是不限于患者、就连健康人也要求的特性。希望通过还能够确切地掌握健康人的免疫力的手段适当地进行评价。

胸腺等免疫相关性脏器较其他脏器更易受年龄增加的影响，成为免疫力降低的一个因素。例如，胸腺形成不全者无法形成T细胞，无法发挥获得性免疫应答。因此，如果可以增加T细胞数，则可以补偿因年龄增加而导致的T细胞数的下降，进而可以增强免疫力。因此，希望开发一种包含胶原蛋白肽的T细胞增殖剂及细胞性免疫活化剂。

鉴于上述现状，本发明的目的在于：提供一种免疫活化力优异、且包含特定的胶原蛋白肽的免疫活化剂、细胞性免疫活化剂。

另外，本发明的目的还在于：提供一种包含特定的胶原蛋白肽的T细胞增殖剂。

解决问题的方案

本发明人等在以根据免疫系统所关联的多个细胞数等的变动算出的免疫力评分为指标评价胶原蛋白肽的口服效果时，发现平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽会提高上述免疫评分、并使T细胞数增加，从而完成了本发明。

即，本发明提供一种免疫活化剂，其包含平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽。

另外，本发明还提供上述免疫活化剂，其中上述胶原蛋白肽为I型胶原蛋白。

另外，本发明还提供上述免疫活化剂，其中上述胶原蛋白肽来自鱼鳞。

另外，本发明还提供上述免疫活化剂，其中上述胶原蛋白肽的等电点为7.0～9.5。

另外，本发明还提供上述免疫活化剂，其中肽的N末端氨基酸为甘氨酸的胶原蛋白肽为总胶原蛋白肽的60～85摩尔％。

另外，本发明还提供上述免疫活化剂，在对血中的T细胞数、CD8阳性CD28阳性T细胞数、CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比、初始T细胞数、初始T细胞/记忆性T细胞比、B细胞数及NK细胞数这7项的测定值赋予预先根据免疫力而设定的3个等级的评分1(免疫力低)、2(免疫力为中等)、3(免疫力高)中的任一种，并将赋予上述7项的评分合计而形成免疫力评分时，上述免疫活化剂可提高该免疫力评分。

另外，本发明还提供一种细胞性免疫活化剂，其包含上述任一项的免疫活化剂。

而且，本发明还提供一种T细胞增殖剂，其包含平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽。

发明效果

根据本发明，通过经口服用平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽，可以增加T细胞数，活化免疫力。

具体实施方式

本发明涉及包含平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽的免疫活化剂及T细胞增殖剂。通过服用上述胶原蛋白肽，可以提高免疫力。另外，还可以增加健康人的T细胞数。下面，详细说明本发明。

(1)胶原蛋白肽

胶原蛋白以3条多肽链的三重螺旋结构作为基本単位，是构成生物体的真皮、韧带、腱、骨、软骨等的蛋白质。构成胶原蛋白分子的氨基酸具有－Gly－X－Y－(X、Y表示氨基酸)所示的、被称作所谓的“胶原蛋白样序列”的一级结构。在本发明中，虽然使用平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽，但在胶原蛋白的分解中，除胶原蛋白酶以外，还可以使用来自根霉属、来自曲霉属、来自芽孢杆菌属、来自链霉菌属的内切蛋白酶、以及其他的蛋白分解酶，这些酶可以用酸或碱进行水解、或者将它们并用。优选为酶法、或者是酶法与酸或碱并用。本发明中使用的胶原蛋白肽可以来自罗非鱼、鲷、鲑鱼等鱼类、鸟类、猪、牛、其他的任一种动物种，还可以由鱼鳞、真皮、腱、骨等任一种组织中提取。优选来自鱼鳞、猪、牛、鸟。另外，已知胶原蛋白有I型～XXVIII型，可以是任一种类型。优选为I型胶原蛋白。胶原蛋白肽的提取方法也可以是酸提取、碱提取、酶提取、将它们组合的方法等任一种方法。胶原蛋白肽的等电点根据制备方法而不同，在本发明中，等电点优选为7.0～9.5，更优选为7.5～8.5。当等电点处于上述范围时，服用时的溶解性优异。此外，I型胶原蛋白肽的氨基酸组成包含约33mol％的甘氨酸、各约10mol％的脯氨酸及羟脯氨酸、以及约1摩尔％的羟赖氨酸，水母胶原蛋白虽然包含约33mol％的甘氨酸，但另一方面脯氨酸及羟脯氨酸各为5摩尔％，比哺乳动物低，还包含3摩尔％的羟赖氨酸，具有II型胶原蛋白的特征。

本发明中使用的胶原蛋白肽的平均分子量为2,000～12,000，优选为3,000～8,000，更优选为5,000～7,000。经口服用的胶原蛋白肽在分解成氨基酸后被吸收到生物体内，其中一部分以二肽或三肽的状态存在于血液中。二肽或三肽的种类根据所使用的胶原蛋白肽而不同。例如，经胶原蛋白酶分解的胶原蛋白肽以Gly－X－···－X－Y作为主成分，经其他酶分解的胶原蛋白肽以X－Y－···－Y－Gly或Y－Gly－···－Gly－X作为主成分。由于N末端氨基酸或C末端氨基酸不同，所以肽链外切酶的作用不同，在体内生成的二肽或三肽量发生变化。在本发明中，可以适合使用含60～85摩尔％、更优选60～80摩尔％、特别优选65～75摩尔％的N末端氨基酸为甘氨酸的胶原蛋白肽的胶原蛋白肽。这种肽链外切酶或肽链内切酶的作用还受到胶原蛋白肽的平均分子量的影响，生物体内的二肽或三肽等的生成率也不同。在本发明中，已知通过使用平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽，使健康人血中的T细胞数等增加，提高了免疫力评分。此外，平均分子量是指重均分子量。

(2)剂型、服用方法及对象

本发明的免疫活化剂及T细胞增殖剂以平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽作为主成分。在不损及其效果的范围内，可以添加矫味矫臭剂、赋形剂、增稠剂、甜味剂、植物提取物、维生素类。

剂型以确保胶原蛋白肽的稳定增稠剂性为条件，可以是粉末、颗粒、丸剂、胶囊剂、片剂、液体制剂、混悬剂、其他的任一种剂型。当为粉末或颗粒时，优选可溶于水或热水、并且即使将其溶液冷却也不会发生凝胶化。

以换算成上述胶原蛋白肽量计算，1日的服用量为0.1～30g、更优选为2～10g。作为胶原蛋白的特征性氨基酸，有羟脯氨酸，在计算胶原蛋白肽的含量时，可以以羟脯氨酸量为基准估算胶原蛋白肽量。1日可以分数次服用。

本发明的免疫活化剂通过经口给药来服用。可以在用餐前后、用餐期间、其他的任一时期服用，可以将其混入食材中进行烹调，摄取如此烹调而得到的食材，或者将其撒在烹调过的食材中进行摄取。

给药对象除了健康人以外，还可以是免疫力降低的高龄者、适于活化免疫力的患者。如后述实施例所示，即使是免疫力处于正常范围的健康人，也可以增加其血中T细胞数、CD4阳性T细胞数、CD8阳性T细胞数，活化免疫力。因此，以维持健康为目的进行服用，可以降低疾病的患病率。

(3)免疫活化剂

本发明的免疫活化剂可以提高以后述的“免疫力评分”为指标的免疫力。采用“免疫力评分”作为综合且概括性地评价免疫力的指标。评价依据双盲实验法进行。这是为了防止安慰剂效果及评价者的成见等。而且，数据分析不仅是指服用前后的统计分析，还通过试验药服用组与安慰剂组的组间比较进行分析。这是为了客观且准确地评价免疫力。本发明中的「免疫力评分」遵照专利文献10记载的“免疫力评分”。对血中的T细胞数、CD8阳性CD28阳性T细胞数、CD4T阳性细胞/CD8阳性T细胞比、初始T细胞数、初始T细胞/记忆性T细胞比、B细胞数及NK细胞数这7项的测定值赋予预先根据免疫力而设定的3个等级的评分1(免疫力低)、2(免疫力为中等)、3(免疫力高)中的任一种，合计对上述7项所赋予的评分。

参与免疫的淋巴细胞大致分为T细胞数、B细胞数及NK细胞数。T细胞大致分为CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞、或者初始T细胞和记忆性T细胞，CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比或初始T细胞/记忆性T细胞比作为细胞性免疫的指标。另外，已知CD8阳性CD28阳性T细胞数随着年龄的增加而减少(非专利文献2、非专利文献3)。因此，在计算免疫力评分时，以上述7项作为测定项目。在本发明中，其特征在于：包含“CD8阳性CD28阳性T细胞数”作为构成免疫力评分的项目。在健康人中，免疫力取决于免疫细胞的老幼。在计算免疫力评分时，由于评价项目中包含“CD8阳性CD28阳性T细胞数”，因此可以作为包括健康人在内的广泛范围的服用者的免疫力活化的指标。

免疫力评分的最低评分为7、最高评分为21。预先制作累积了多个受试者的大量的健康状态、患病种类、年龄、性別、血中T细胞数、CD8阳性CD28阳性T细胞数、CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比、初始T细胞数、初始T细胞/记忆性T细胞比、B细胞数、NK细胞数、及其他测定值的标准化数据库，根据各项的累积相对频率，对上述7项的测定值设定对应于免疫力的3个等级的划分。

例如，通过划分为累积相对频率不足10(％)、累积相对频率为10以上且不足40(％)、以及累积相对频率为40(％)以上的3个等级、并从免疫力低的划分向免疫力高的划分逐渐分配大的分数来进行。以累积相对频率为10(％)和40(％)的值作为基准，当累积相对频率为10(％)以下时分配显示免疫力为低水平的评分1，当累积相对频率为10以上且不足40(％)时分配显示免疫力为中等水平的评分2，当累积相对频率为40(％)以上时分配显示免疫力为充分高的水平的评分3。虽然累积相对频率所对应的各项目值根据标准化数据库中存储的数据数而变动，但在数据数达到一定以上时则达到平衡。

例如，在标准化数据库中存储的平均累积相对频率为10(％)的血中T细胞数为717个、平均累积相对频率为40(％)的血中T细胞数为1177个的情况下，若测定的血中T细胞数的值不足717，则作为T细胞数给予评分1分，若为717个以上且不足1177个则给予评分2分，若为1177个以上则给予评分3分。除T细胞数以外，对于CD8阳性CD28阳性T细胞数、初始T细胞数、初始T细胞/记忆性T细胞比、B细胞数、NK细胞数也可以同样地进行打分。

另一方面，由于CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比例的数值增加与免疫力的增加不一致，因此进行与上述不同的打分。具体而言，以累积相对频率不足10(％)作为评分1(分)，以累积相对频率为10以上且不足40(％)作为评分2(分)、以累积相对频率为40以上且不足80(％)作为评分3(分)、以累积相对频率为80以上且不足90(％)作为评分2(分)、以累积相对频率为90(％)以上作为评分1(分)。累积相对频率为80以上且不足90(％)时给予评分2(分)、累积相对频率为90(％)以上时给予评分1(分)，这是由于CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比例处于随着年龄的增加而一同增加的趋势。

设定上述7项的测定值所对应的评分，使在免疫被活化的条件下评分均增加。因此，可以根据免疫力评分的高低来评价免疫力被活化的程度。

在单独的测定项目中，免疫力评分适合于判定偏差大的免疫力。由于各项目的测定值被分数化，所以在给药组和非给药组这两组中可以减小标准偏差，可以在统计学上具有显著差异地评价有效性。

此外，上述的累积相对频率10(％)、40(％)、80(％)的数值是通过分析上述标准化数据库中累积的数据、并由其与免疫力的相关性而算出的值，只是例示而已。可以根据摄取免疫活化剂的动物种及生存环境、以及其他条件而适当选择。

在本发明中，根据试验药给药组在服用前后的统计学显著差异、安慰剂组在服用前后的统计学显著差异评价了通过双盲实验得到的数据。在实施例中，通过服用胶原蛋白肽，与服用前相比，使免疫力评分提高了5.5％(p＝0.002(t检验))。另一方面，安慰剂组在服用8周前后的免疫力评分提高了0.3％(p＝0.877(t检验))。通过服用胶原蛋白肽，与服用安慰剂相比，免疫力评分在统计学上显著提高，暗示了免疫力被活化。而且，为了抵消胶原蛋白肽服用组与安慰剂服用组的组间差异，利用ANCOVA进行了组间比较。其结果，根据p＝0.030(ANCOVA)的统计学显著性概率，判明了与服用安慰剂相比，通过服用胶原蛋白肽使免疫力评分提高。如上所述，通过双盲实验法的数据收集、t检验及ANCOVA分析可知：平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽在统计学上具有显著差异地使免疫力评分较安慰剂给药组有所提高，将免疫力活化。

此外，在本发明中，“免疫力评分”是免疫力被活化的指标，并不意味着本发明的免疫活化剂使根据免疫力评分进行评价的上述7项均得到改善。

(4)T细胞增殖剂

平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽可以使血中T细胞数增加。在实施例中，通过服用胶原蛋白肽，与服用前相比，使T细胞数增加了约9％(p＝0.017(t检验))。对胶原蛋白肽服用组和安慰剂组在服用8周后利用ANCOVA进行组间比较时，与服用安慰剂相比，以p＝0.079(ANCOVA)的统计学显著性概率使T细胞数增加。

生物体通过免疫机制识别病原体等非自身物质及癌细胞等异常细胞并将其排除，从而防御罹患各种疾病。无论患病与否，各种淋巴细胞根据其功能或生物体环境等其他条件而发生活性及总数的变动。由于生活环境及饮食习惯等的差异，淋巴细胞数也存在个体差异。上述的平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽可以增加健康人的血中T细胞数。

T细胞在骨髄等一级造血器官中产生后经胸腺分化成熟，是作为获得性免疫的中心司令部的细胞。胸腺形成不全者无法形成T细胞，无法发挥获得性免疫应答。免疫功能下降的原因有年龄增加、压力、饮食习惯、运动及其他环境因素，而年龄增加是无法避免的因素之一。由于胸腺及脾脏较其他脏器更快地萎缩，因此认为T细胞数因年龄增加而减少，免疫力降低。

另一方面，还已知T细胞数和嗜中性粒细胞数、嗜酸性粒细胞数一起随着炎症或感染而增加(非专利文献4)。平均粒径为2,000～12,000的胶原蛋白肽虽然会使T细胞数或CD8阳性CD28阳性T细胞数显著增加，但不会使嗜中性粒细胞数或嗜酸性粒细胞数增加。在对抗感染等的免疫活化时，血中T细胞数、嗜中性粒细胞数及嗜酸性粒细胞数增加。上述胶原蛋白肽通过不同于感染时的免疫亢进机制使T细胞数增加。虽然作用机制的细节尚不清楚，但推测是恢复、维持骨髄等一级器官及胸腺等二级器官的功能。

此外，作为因年龄增加而减少的淋巴细胞，有CD8阳性CD28阳性T细胞。平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽可以使CD8阳性CD28阳性T细胞数增加。参与病毒感染等的细胞障碍性T细胞是由CD8阳性CD28阳性细胞分化的，因此通过增加CD8阳性CD28阳性T细胞，可以期待着抑制病毒感染及罹患癌症。

T细胞根据所谓的细胞性免疫而担负着生物体的防御机制。推测平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽会提高免疫力评分，使T细胞数或CD8阳性CD28阳性T细胞数增加，活化基于细胞性免疫的免疫系统。在这方面，本发明的免疫活化剂是T细胞增殖剂，可谓是细胞性免疫活化剂。

根据本发明的免疫活化剂，可以补偿年龄增加所伴随的免疫力降低。而且，可活化免疫系统细胞的异物排除机制，避免罹患由病原菌或癌细胞引起的特定疾病或者对抗它们。因此，除健康人以外，对于维持免疫功能降低的患者或高齢者的健康也有效。另外，对于因细胞性免疫能力下降而发病的难治性感染症或癌症、以及过敏性疾病的预防和治疗也有效。

实施例

接下来，列举实施例以具体说明本发明，但这些实施例对本发明没有任何限制。

(制造例)

将已脱钙处理的罗非鱼鱼鳞水洗后投入热水中使其溶胀，提取来自I型胶原蛋白的明胶。向该明胶液中添加来自微生物的食品用蛋白酶(内切蛋白酶)进行水解。作为蛋白酶，使用来自根霉属、来自曲霉属、来自芽孢杆菌属、来自链霉菌属的胶原蛋白分解酶。加热使酶失活后，进行过滤以及通过离子交换进行脱盐，通过喷雾干燥形成微粉。所得的胶原蛋白肽的重均分子量为5,900、等电点为7.5～8.5、N末端氨基酸为甘氨酸的肽的含有率为65～75摩尔％。使用造粒机将其成型成颗粒状，添加0.2％的香料，作为试验药。得到的颗粒剂在冷水中易溶，通过修订日本药局法“明胶”确认试验确认其不具有凝胶化能力。

(实施例1)

试验委托给株式会社ORTHO MEDICO，依照双盲实验法进行。

以登记的75名作为筛选对象，从中选出50名(46.1±6.6岁)，分成试验药服用组和安慰剂组两组，每组各25名，使筛选兼给药前检查时的免疫力评分的平均值和标准偏差在组间不存在显著差异。试验药服用组使用的试验药是通过制造例制造的、来自罗非鱼I型胶原蛋白的平均分子量为5,900的胶原蛋白肽颗粒(含0.2％的香料)。另外，安慰剂组使用的安慰剂是糊精粉末(含0.2％的香料)。两组均按照1次5g、1日2次(早饭后和晚饭后)溶解于半杯左右的水或热水中服用。此外，服用期间为8周。

此外，受试者不包括具有以下各情形者：(a)具有恶性肿瘤、心功能不全、心肌梗塞的治疗既往史者；(b)心房颤动、心律不齐、肝功能障碍、肾功能障碍、脑血管障碍、风湿病、糖尿病、脂质异常症、高血压、其他慢性疾病的治疗中者；(c)经常服用包括汉方药在内的药品者；(d)对胶原蛋白、明胶、药品过敏者；(e)有花粉症的既往史者；(f)吸烟者；(g)习惯性地摄取维生素剂、矿物质、胶原蛋白、透明质酸、胎盘、葡萄糖胺、软骨素等补品、氧水、氢水等功能水、维生素强化米、光牌富碘鸡蛋等营养强化食品者；(h)1周有2天以上食用鱼皮、鸡腿肉、鸡翅尖、皮胶原蛋白、牛筋等含大量明胶的食材、食品者；以及(i)具有怀孕中、哺乳中、或者在试验期间有怀孕的意思者。

在服用期间的前后采血，计量T细胞数、CD8阳性CD28阳性T细胞数、CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比、初始T细胞数、初始T细胞/记忆性T细胞比、B细胞数、NK细胞数，算出免疫力评分。此外，除上述以外，还同时测定了嗜中性粒细胞数、淋巴细胞数、CD4阳性T细胞数、CD8阳性T细胞数、记忆性细胞数、嗜酸性粒细胞数、嗜碱性粒细胞数。试验药服用组的免疫细胞数等的变动见表2，安慰剂组的免疫细胞数等的变动见表3。

由于服用期间长达8周，所以因季节变化及其他因素，在试验药服用组、以及安慰剂组中均可存在于服用前后产生统计学显著差异的项目。为了抵消这种变化，对试验开始前后的数据进行试验药给药组与安慰剂组的组间比较。表4及表5是通过试验药服用组与安慰剂组的ANCOVA检验得到的服用开始前后的组间比较结果。表4是服用8周后的试验药服用组与安慰剂组的组间比较，表5是试验开始前的组间比较。表4所示的组间比较是将试验开始前的测定值投入协变量中，以服用后的测定值为对象，采用单因素ANCOVA，以服用8周后的测定值为对象而进行的。

此外，试验药服用组和安慰剂组这两组在服用前后进行了身体测定、理学检查、血液检查、尿检查、外周血液检查、自觉症状及内科检查。没有确认到服用试验药所伴随的医学上存在问题的变化。

(结果)

(1)受试者是无恶性肿瘤等既往症、无风湿病或花粉症及其他过敏症状的健康人。观察这些受试者的试验药服用组在给药前后的淋巴细胞数的变化时，如表2所示，嗜中性粒细胞数、淋巴细胞数、T细胞数、B细胞数、NK细胞数均增加，在T细胞中CD4阳性T细胞数、CD8阳性T细胞数、CD8阳性CD28阳性T细胞数、记忆性T细胞数的值均增加。只有初始T细胞数减少，但其减少也不过2.3％。此外，CD4阳性T细胞和D8阳性T细胞同时增加，结果是CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比减少了16.4％。CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比的减少意味着免疫力亢进。它们复合的结果是，免疫力评分增加了5.5％。此外，免疫力评分提高的统计学显著性概率p值低至0.002(t检验)。结果显示：通过服用平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽，受试者的免疫力评分大致均匀地提高。

(2)观察安慰剂组在给药前后的淋巴细胞数的变动时，如表3所示，虽然观察到淋巴细胞数、B细胞数、NK细胞数均增加，但增加率不及试验药服用组，T细胞数没有变化，嗜中性粒细胞数减少。另外，虽然CD8阳性T细胞数增加，但CD4阳性T细胞数没有变化，其结果，CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比减少了11.8％。CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比的减少意味着免疫力亢进。安慰剂给药前后的免疫力评分的提高不过0.3％，反映了上述结果。

(3)在形成免疫力评分的7项中，检测到统计学显著性概率p＜0.1的项目如下：在试验药给药组中有T细胞数、CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比、初始T细胞/记忆性T细胞比、CD8阳性CD28阳性T细胞数、B细胞数、NK细胞数(参照表2)，在安慰剂组中有CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比、初始T细胞数、初始T细胞/记忆性T细胞比、B细胞数、NK细胞数(参照表3)。仅在试验药服用组中检测到了统计学显著性概率p＜0.1的项目仅有T细胞数和CD8阳性CD28阳性T细胞数。推测出因服用胶原蛋白肽而引起的免疫力评分的提高依赖于T细胞数的增加和CD8阳性CD28阳性T细胞数的增加。试验药给药组的T细胞数的增加率为8.8％(p＝0.017)，CD8阳性CD28阳性T细胞数的增加率为15.3％(p＝0.039)。结果显示：通过服用平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽，受试者的T细胞数、CD8阳性CD28阳性T细胞数大致均匀地提高。若胸腺等免疫器官萎缩，则CD8阳性CD28阳性T细胞数减少，因此推测通过增加CD8阳性CD28阳性T细胞数，能够补偿因胸腺萎缩而导致的免疫功能下降。

(4)如表4所示，当服用胶原蛋白肽达8周时，相对于安慰剂组，在免疫力评分中检测到了p＝0.03的统计学显著性概率(ANCOVA)。此外，如表5所示，在试验开始前，安慰剂组与试验药给药组间的统计学显著性概率p为0.647。由此显示：通过服用胶原蛋白肽，即使根据组间比较(ANCOVA)，免疫力评分在统计学上也显著提高。

(5)如表4所示，检测到了试验药给药组和安慰剂组的T细胞数的增加在p＝0.079的统计学显著性概率(ANCOVA)下不同。如表5所示，试验开始前的统计学显著性概率为p＝0.889。由此显示：通过服用胶原蛋白肽，与安慰剂组相比，T细胞数在统计学上显著增加。此外，嗜中性粒细胞数、嗜酸性粒细胞数、嗜碱性粒细胞数的组间显著性概率p分别为0.315、0.896、0.117(参照表4)，没有检测到明确的不同。因此，推测T细胞数的增加并不是源于伴有嗜中性粒细胞数、嗜酸性粒细胞数、嗜碱性粒细胞数的增加的感染或炎症。

[表1]

[表2]

[表3]

[表4]

[表5]

在不脱离本发明的广义的精神和范围的情况下，本发明可以采用各种实施方式及变形。另外，上述实施方式用于说明本发明，其并不限定本发明的范围。即，本发明的范围通过权利要求范围来显示，而不是由实施方式来显示。而且，在权利要求范围内及与其同等的发明意义的范围内实施的各种变形也视为本发明的范围内。

本发明基于2014年11月11日提出的日本国专利申请2014－229355号。参照日本国专利申请2014－229355号的说明书、权利要求范围、附图整体而纳入本说明书中。

Claims (8)

1.一种免疫活化剂，其包含平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽。

2.根据权利要求1所述的免疫活化剂，其中，所述胶原蛋白肽为I型胶原蛋白。

3.根据权利要求1所述的免疫活化剂，其中，所述胶原蛋白肽来自鱼鳞。

4.根据权利要求1所述的免疫活化剂，其中，所述胶原蛋白肽的等电点为7.0～9.5。

5.根据权利要求1所述的免疫活化剂，其中，肽的N末端氨基酸为甘氨酸的胶原蛋白肽为总胶原蛋白肽的60～85摩尔％。

6.根据权利要求1所述的免疫活化剂，其中，在对血中的T细胞数、CD8阳性CD28阳性T细胞数、CD4阳性T细胞/CD8阳性T细胞比、初始T细胞数、初始T细胞/记忆性T细胞比、B细胞数及NK细胞数这7项的测定值赋予预先根据免疫力而设定的3个等级的评分1即免疫力低、2即免疫力为中等、3即免疫力高中的任一种，并将对所述7项赋予的评分合计而作为免疫力评分时，所述免疫活化剂可提高该免疫力评分。

7.一种细胞性免疫活化剂，其包含权利要求1～6中任一项所述的免疫活化剂。

8.一种T细胞增殖剂，其包含平均分子量为2,000～12,000的胶原蛋白肽。