TWI586357B - The use of poultry crude protein extract for the preparation of compositions for enhancing immunity - Google Patents
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Description
本發明提供一種禽類粗蛋白萃取物，特別係一種禽類粗蛋白萃取物用於製備增強免疫力之組合物的用途。
於高度現代化、繁忙緊迫及空氣汙染的社會環境下，人們容易發生免疫異常、自體免疫性疾病(autoimmune disease)及癌症等，且這些疾病發生在臺灣正逐年增加中。免疫機能異常包括淋巴細胞功能減弱及異我辨認機能異常等，這些異常可能涉及營養、生理、神經系統及內分泌失調所致，導致失調而造成免疫機能異常。
因此，如何從日常生活中預防此類疾病之發生，一直是食品、營養保健與醫學界之重大課題。於過去研究發現，飲食中之某些特定成分與免疫系統之功能息息相關。何種物質或成分才可增強免疫力，以提供消費者之參考。
有鑑於此，本發明提供一種禽類粗蛋白萃取物用於製備增強免疫力之組合物的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物係一禽類肉品經由高溫高壓萃取，再經由油水分離去除油脂後而獲得，且該禽類粗蛋白萃取物至少包含支鏈胺基酸(Branched-chain amino acid，BCAA)、組胺酸(Histidine)、酥胺酸(Threonine)、離胺酸(Lysine)以及苯丙胺酸(Phenylalanine)。
本發明另提供一種禽類粗蛋白萃取物用於製備刺激脾臟細胞增生之組合物的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物係一禽類肉品經由高溫高壓萃取，再經由油水分離去除油脂後而獲得，且該禽類粗蛋白萃取物至
少包含支鏈胺基酸(Branched-chain amino acid，BCAA)、組胺酸(Histidine)、酥胺酸(Threonine)、離胺酸(Lysine)以及苯丙胺酸(Phenylalanine)。
本發明另提供一種禽類粗蛋白萃取物用於製備刺激細胞激素分泌之組合物的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物係一禽類肉品經由高溫高壓萃取，再經由油水分離去除油脂後而獲得，且該禽類粗蛋白萃取物至少包含支鏈胺基酸(Branched-chain amino acid，BCAA)、組胺酸(Histidine)、酥胺酸(Threonine)、離胺酸(Lysine)以及苯丙胺酸(Phenylalanine)。
本發明另提供一種禽類粗蛋白萃取物用於製備降低血清中非特異性抗體IgE含量之組合物的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物係一禽類肉品經由高溫高壓萃取，再經由油水分離去除油脂後而獲得，且該禽類粗蛋白萃取物至少包含支鏈胺基酸(Branched-chain amino acid，BCAA)、組胺酸(Histidine)、酥胺酸(Threonine)、離胺酸(Lysine)以及苯丙胺酸(Phenylalanine)。
本發明另提供一種禽類粗蛋白萃取物用於製備增加自然殺手細胞及吞噬細胞活性之組合物的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物係一禽類肉品經由高溫高壓萃取，再經由油水分離去除油脂後而獲得，且該禽類粗蛋白萃取物至少包含支鏈胺基酸(Branched-chain amino acid，BCAA)、組胺酸(Histidine)、酥胺酸(Threonine)、離胺酸(Lysine)以及苯丙胺酸(Phenylalanine)。
本發明另提供一種禽類粗蛋白萃取物用於製備刺激B及T細胞增生之組合物的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物係一禽類肉品經由高溫高壓萃取，再經由油水分離去除油脂後而獲得，且該禽類粗蛋白萃取物至少包含支鏈胺基酸(Branched-chain amino acid，BCAA)、組胺酸(Histidine)、酥胺酸(Threonine)、離胺酸(Lysine)以及苯丙胺酸(Phenylalanine)。
本發明另提供一種禽類粗蛋白萃取物用於製備降低抗原特異性IgG及IgM含量之組合物的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物係一禽類
肉品經由高溫高壓萃取，再經由油水分離去除油脂後而獲得，且該禽類粗蛋白萃取物至少包含支鏈胺基酸(Branched-chain amino acid，BCAA)、組胺酸(Histidine)、酥胺酸(Threonine)、離胺酸(Lysine)以及苯丙胺酸(Phenylalanine)。
本發明另提供一種禽類粗蛋白萃取物用於製備遲發過敏反應之組合物的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物係一禽類肉品經由高溫高壓萃取，再經由油水分離去除油脂後而獲得，且該禽類粗蛋白萃取物至少包含支鏈胺基酸(Branched-chain amino acid，BCAA)、組胺酸(Histidine)、酥胺酸(Threonine)、離胺酸(Lysine)以及苯丙胺酸(Phenylalanine)。
在本發明之一實施例中，其中該禽類粗蛋白萃取物進一步包含酪胺酸及甲硫胺酸。
在本發明之一實施例中，其中該禽類粗蛋白萃取物之有效劑量為每日攝取至少20mL。
在本發明之一實施例中，其中該禽類肉品來源為雞、鴨、鵝或鴿子。
承上所述，本發明之禽類粗蛋白萃取物用於製備增強免疫力之組合物的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物經由活體外細胞模式和活體內動物模式，證實刺激初代脾臟細胞增生、刺激細胞激素分泌、降低血清中非特異性抗體IgE含量、增加自然殺手細胞及吞噬細胞活性、降低血清中抗原特異性IgG及IgM含量。因此，本發明之禽類粗蛋白萃取物無論在活體外細胞試驗或活體內動物試驗，均具有免疫調節功能。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第一圖係為本發明之禽類粗蛋白萃取物在細胞實驗中對脾臟細胞增生評估之數據圖。
第二圖係為本發明之禽類粗蛋白萃取物在動物實驗中對脾臟細胞增生評估之數據圖。
第三圖顯示本發明之禽類粗蛋白萃取物對脾臟細胞B細胞含量之影響。
第四圖顯示本發明之禽類粗蛋白萃取物對增加血液中顆粒球數目及增加動物體對外來抗原之吞噬作用之影響。
第五圖顯示本發明之禽類粗蛋白萃取物對增加自然殺手細胞活性之影響。
第六圖顯示本發明之禽類粗蛋白萃取物對特異性小鼠T細胞增殖影響。
第七圖顯示本發明之禽類粗蛋白萃取物特異性小鼠遲發性過敏反應(delayed-type hypersensitivity)之影響。各處理組數值標示之小寫英文如不相同代表組間具有顯著性差異，顯著水準訂為P<0.05。
本發明之禽類粗蛋白萃取物用於製備增強免疫力之組合物的用途，本發明為評估禽類粗蛋白萃取物對免疫功能之影響，分別進行細胞模式及動物模式，以活體外及活體內探討本發明之禽類粗蛋白萃取物對非特異性免疫反應之影響。
本發明之實驗結果以平均值(mean)±標準偏差(standard deviation，S.D.)表示。數據分析以單因子變異數分析(one-way ANOVA)比較各組間之差異，再以鄧肯式多變域分析法(Duncan’s multiple range method)進行顯著性差異之比較。統計之顯著性均以p<0.05為標準。
本文所述之禽類粗蛋白萃取物包含雞、鴨、鵝及鴿子等禽類之粗蛋白萃取物。
本發明選用15週齡的白色番鴨畜試1號，經屠宰後置於溫度-2℃至7℃的環境下驗收與原物料處理，挑選肉色正常且表面無滲出液、無異味，肉質富彈性的鴨肉裝入壓力鍋後，以設定溫度95℃，減壓濃縮滴取10小時，再經油水分離、85℃熱充填，最後於121℃滅菌15分鐘後獲得本發明之禽類粗蛋白萃取物。
本發明進一步將實施例1製備的鴨禽類粗蛋白萃取物及以相同方法製備的雞禽類粗蛋白萃取物進行成分分析，結果如表一、表二所示，鴨禽類粗蛋白萃取物的胺基酸含量高於雞禽類粗蛋白萃取物，其蛋白質含量也優於雞禽類粗蛋白萃取物，其中以酥胺酸、酪胺酸、白胺酸、離胺酸等胺基酸的含量明顯的高於雞禽類粗蛋白萃取物，尤其白胺酸為人體所必需之胺基酸，因為該些胺基酸無法由肝臟中合成，必須藉由額外的攝取才能獲得；其可降低疲憊感，對有在進行體能鍛鍊者而言，白胺酸為α-酮異己酸(α-ketoisocaproate，KIC)以及β-羥基-β-甲基丁酸鹽複合物(beta-hydroxy beta-methylbutyrate,HMB)的前驅物，可以增進運動能力，加速肌肉疲勞的恢復速度。再者，在營養成分分析中進一步證實本發明之禽類粗蛋白萃取物不含反式脂肪且飽和脂肪脂含量極少，有益人體健康。
本發明之禽類粗蛋白萃取物以真空冷凍乾燥後，儲存於-20℃備用。於禽類粗蛋白萃取物對BALB/c小鼠免疫初代細胞非特異性免疫反應試驗中，為將凍乾之禽類粗蛋白萃取物粉末回溶於RPMI 1640培養基中，配製成不同濃度(1、2、4、6及8mg/mL)以供細胞實驗使用。於禽類粗蛋白萃取物對BALB/c小鼠非特異性免疫反應試驗中，分別以去離子水配製不同濃度之禽類粗蛋白萃取物(3.03、9.09及18.18mL/kg/day)使用於動物試驗。
若免疫細胞正常增生，應可增強免疫反應，為瞭解本發明之禽類粗蛋白萃取物對免疫細胞是否有作用，因此，取BALB/c小鼠脾臟細胞與禽類粗蛋白萃取物共同培養。先以不同濃度(1、2、4、6及8mg/mL)之禽類粗蛋白萃取物與BALB/c小鼠脾臟細胞於37℃下培養3天，以細
胞毒性測試法(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)測定其細胞增生變化，並以可誘發免疫反應的脂多醣體(LPS)、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)做為刺激B細胞及T細胞之正對照組，以及位以任何試劑處理的細胞作為空白組。
首先，以CO2使小鼠窒昏，於無菌下打開小鼠腹腔，取出脾臟，置於培養皿，加入2mL HBSS，以無菌針筒尾端將脾臟擠壓磨碎，使成懸浮液，吸取懸浮液至15mL離心管中，以1500rpm離心，移除上清液，留取細胞沉澱物，輕輕拍散細胞後加入1mL紅血球溶解緩衝液(RBC lysis buffer)，靜置1分鐘後使紅血球溶解，以1500rpm離心7分鐘，去除上清液，加入適量RPMI 1640培養基，並以台盼藍(trypan blue)染色法計數細胞總數，調整細胞密度至1 x 107個細胞數/mL培養基。
本發明利用細胞毒性測試法(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)之測定脾臟細胞數目，其原理為利用活細胞粒線體中脫氫酶(dehydrogenase)，將MTT之四氮雜茂(tetrazolium)環打斷形成甲瓚(formazan)，使MTT變為紫色，以顏色深淺代表細胞多寡。取經上述處理之BALB/c小鼠脾臟初代細胞，為懸浮性細胞。取50μL細胞密度為1 x 107細胞數目/mL於96孔盤中，加入50μL之RPMI1640培養基及分別以各種刺激物處理，包含可誘發免疫反應的脂多醣體(LPS)、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)以及以不同濃度(1、2、4、6及8mg/mL)禽類粗蛋白萃取物，置於37℃，5% CO2培養箱中培養24、48及72小時後，加入10μL MTT，並於37℃反應3小時後，以800rpm離心10分鐘，移去上清液，每個孔洞加入100μL以異丙醇配置的0.04N HCl，反應30分鐘，以酵素免疫分析儀(ELISA reader)測定其於540nm下之吸光值。以其吸光值大小表示細胞增生數目多寡。
結果如第一圖所示，於本試驗中，本發明之禽類粗蛋白萃取物於濃度8mg/mL培養48小時，明顯具有誘發脾臟增生之效果，且優於可誘發免疫反應的脂多醣體(LPS)、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)。
細胞激素為免疫調節物質，可活化細胞或造成發炎反應，其在免疫系統中扮演傳遞各細胞間的訊息傳遞的角色，即細胞間具溝通作用之可溶性物質，參與許多重要的免疫反應，包括發炎反應、對病毒的防禦、特異異T細胞及B細胞的增殖。本發明先以活體外試驗模式探討禽類粗蛋白萃取物對BALB/c小鼠之脾臟細胞調節作用。藉由細胞激素分泌量可反應細胞整體的免疫調節，以作為探討免疫活性物質之指標。本發明將BALB/c小鼠分離出之脾臟初代細胞與不同濃度(1、2、4、6及8mg/mL)禽類粗蛋白萃取物共同培養，在不同時間(24、48及72小時)下對細胞激素介白素(interleukin，IL)-2、4、5、6、10、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factors，TNF)-α及干擾素(Interferon，IFN)-γ分泌的影響，並以可誘發免疫反應的脂多醣體(LPS)、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)做為刺激B細胞及T細胞之正對照組，以及位以任何試劑處理的細胞作為空白組。
首先，將0.5mL脾臟細胞(1 x 107細胞數目/mL)加入至24孔盤中，並分別加入0.5mL各種刺激物處理，包含可誘發免疫反應的脂多醣體(LPS)、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)以及以不同濃度(1、2、4、6及8mg/mL)禽類粗蛋白萃取物，於37℃培養24、48及72小時後，取其上清液，保存於-80℃中，留待日後測定細胞激素分泌量。
結果如表三至表九所示，與空白組比較，無論培養24、48及72小時，本發明之禽類粗蛋白萃取物刺激介白素(interleukin，IL)-2、4、5、6、10、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factors，TNF)-α及干擾素(Interferon，
IFN)-γ分泌量並無顯著性差異；且本發明之禽類粗蛋白萃取物對刺激脾臟細胞分泌TNF-α之影響，表示本發明之禽類粗蛋白萃取物無刺激脾臟細胞分泌TNF-α之能力。其中經由表六可發現本發明之禽類粗蛋白萃取物刺激脾臟細胞分泌細胞激素IL-6較多，於6mg/mL禽類粗蛋白萃取物刺激24小時，IL-6分泌量為197.09pg/106脾臟細胞數。
本發明自樂斯科生物科技公司購得40隻雄性BALB/c小白鼠為實驗動物(六週齡，重約16至17g)，並飼養於小鼠專用飼養籠內，飼養環境為室溫與溼度控制於23±2℃、55±10%的條件下並配合通風設備，及控制12小時明暗循環。先以固形飼料飼養小白鼠，並進行一週適應期，隨機分成四組每組十隻動物，分別為餵食蒸餾水的空白組、餵食3.03mL/kg/day本發明之禽類粗蛋白萃取物為低劑量組、9.09mL/kg/day本發明之禽類粗蛋白萃取物為中劑量組、18.18mL/kg/day本發明之禽類粗蛋白萃取物為高劑量組。實驗期間為八週，實驗期間，於每日早上10點管灌餵食受試樣品，並於週一及週四記錄其飼料攝食量，另外供應充足之蒸餾水予以自由攝取。
本發明禽類粗蛋白萃取物對非特異性免疫反應進行實驗，因此，實驗動物並未經特別處理，僅以管餵方式每天額外供給BALB/c小鼠3.03、9.09及18.18mL/kg之禽類粗蛋白萃取物，依禽類粗蛋白萃取物的總支鏈胺基酸(100mL禽類粗蛋白萃取物含有0.5g總支鏈胺基酸)為活性成分，於動物試驗中管餵劑量，分別為3.03、9.09及18.18mL/kg/day，相當於60kg的人每日攝取量為20、60及120mL。
結果如表十所示，額外供給禽類粗蛋白萃取物，對小鼠體重有增加之趨勢。在相對組織重量方面，餵食禽類粗蛋白萃取物濃度於3.03至8.18mL/kg範圍下，對心臟、肝臟、脾臟及腎臟之相對重量與空白組相較，並無顯著差異，顯示此濃度範圍下，本發明之禽類粗蛋白萃取物不具有毒性效應。
本發明為探討給予禽類粗蛋白萃取物對免疫細胞反應之影響，分離給予不同劑量之禽類粗蛋白萃取物之小鼠脾臟細胞，進行細胞增生及細胞激素變化之測定。細胞激素之測定是以生物素-抗生物素蛋白系統(avidin-biotin conjugates system)酵素免疫連結分析法(ELISA)進行。分別與免疫反應的脂多醣體(LPS)、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)及不同濃度(1、2、4、6及8mg/mL)禽類粗蛋白萃取物共同培養24、48及72小時後，取其上清液測定IL-2及IL-6等細胞激素。依eBiosience商業套組進行測定，於96孔平底微量分析盤中，每個孔洞注入100μL抗細胞激素單株抗體(溶於被覆緩衝液(Coating Buffer))中，置於4℃冰箱放置隔夜。以PBS緩衝液洗三次，移除未結合於盤底的單株抗體，加入200μL阻斷溶液(blocking solution)以減少非特異性結合，於室溫下反應至少2小時後，以PBST緩衝液洗四次並拍乾，每個孔洞加入100μL已知濃度的標準品或細胞培養液，室溫下反應2小時或4℃至隔夜，以PBST緩衝液洗4次，加入適當稀釋之具有連結生物素抗細胞激素二級抗體至100μL，室溫下反應2小時，以PBST緩衝液洗7次，拍乾後每孔加入100μL的受質TMB，待適當時間的呈色反應後，每孔加入50μL的2.5%硫酸溶液，以終止呈色反應，利用酵素免疫分析儀測定其於450nm下之吸光值。依照標準品之吸光值與已知濃度繪出標準曲線及方程式，再以內插法換算待測樣品中的細胞激素濃度即可。而脾臟細胞增生與上述細胞實驗同樣利用細胞毒性測試法(MTT)測試。
給予不同劑量禽類粗蛋白萃取物對BALB/c小鼠脾臟細胞
增生之影響，如第二圖所示，在LPS及PHA刺激下，3.03、9.09及18.18mL/kg之禽類粗蛋白萃取物均能增加脾臟細胞增生。
給予禽類粗蛋白萃取物後觀察脾臟細胞分泌細胞激素變化，如表十一至表十七，IL-5、IL-6及TNF-α分泌量增加。其中，IL-5為第二型T輔助細胞(Th2)所分泌，顯示給予禽類粗蛋白萃取物使小鼠免疫反應傾向第二型T輔助細胞(Th2)免疫反應，可能有利於對抗細胞外多細胞寄生蟲的免疫反應。
表十三、給予不同劑量之禽類粗蛋白萃取物6周後對BALB/c小鼠脾臟細胞
表十六、給予不同劑量之禽類粗蛋白萃取物6周後對BALB/c小鼠脾臟細胞
由MTT試驗結果已知小鼠脾臟細胞可被禽類粗蛋白萃取物活化增生，為了解主要作用細胞，本發明利用頸椎脫臼法分別犧牲老鼠，將脾臟取出並製備成單一細胞懸浮液，更進一步利用Tris-氯化銨(Ammonium chloride)緩衝液將紅血球懸浮，而白血球則利用Hank's溶液清洗三次後再進行下一步的實驗。
本試驗先以禽類粗蛋白萃取物與BALB/c小鼠脾臟細胞於37℃ 5% CO2培養箱中共同培養3天，第2天後添加溴化去氧尿苷(Bromodeoxyuridine，Brdu)，培養至第3天時，進行雙色染色，以異硫氰酸
螢光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)結合抗-Brdu抗體及藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)結合抗B220，對B細胞染色；以異硫氰酸螢光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)結合抗-Brdu抗體及藻紅蛋白(PE)結合抗CD3抗體，對T細胞染色，染色後上流式細胞儀(Fluorescence-activated cell sorter，FACS)分析，計算在不同象限內細胞比率，計算B細胞或T細胞增生百分比，結果如第三圖所示，於空白組(未添加禽類粗蛋白萃取物)未經純化之脾臟細胞含有44.70% B細胞，而經低、中、高劑量的禽類粗蛋白萃取物(3.03至18.18mL/kg/day)處理後，未經純化之脾臟細胞分別含有43.77、39.25及35.52%B細胞。由此結果顯示，本發明之禽類粗蛋白萃取物主要為刺激B細胞增生。
小鼠血清收集後保存於-80℃，直至分析時才取出解凍，免疫球蛋白含量分析是生物素-抗生物素蛋白系統(avidin-biotin conjugates system)酵素免疫連結分析法(ELISA)進行。依eBiosience商業套組進行測定，於96孔平底微量分析盤中，每孔洞注入100μL抗細胞激素單株抗體(溶於被覆緩衝液(Coating Buffer))，置於4℃冰箱放置隔夜。以PBS緩衝液洗三次，洗除未結合於盤底的單株抗體，加入200μL阻斷溶液(blocking solution)以減少非特異性結合，於室溫下反應至少2小時後，以PBST緩衝液清洗4次並拍乾，每個孔洞加入100μL已知濃度的標準品或細胞培養液，室溫下反應2時或4℃至隔夜，以PBST緩衝液清洗4次，加入適當稀釋之具有連結生物素抗細胞激素二級抗體至100μL，室溫下反應2小時，以PBST緩衝液洗7次，拍乾後每孔加入100μL的受質TMB，待適當時間的呈色反應後，每孔加入50μL的2.5%硫酸溶液，以終止呈色反應，利用酵素免疫分析儀測定其於450nm下之吸光值。依照標準品之吸光值與已知濃度繪出標準曲線及方程式，再以內插法換算待測樣品中的免疫球蛋白濃
度即可。
結果如表十八所示，當給予禽類粗蛋白萃取物後，發現可降低血清中IgE，IgE增加表示體內過敏免疫反應增加，當血清中IgE產生增加時，會與其標的細胞肥大細胞(mast cell)或嗜鹼細胞(basophil)上高親和力的IgE受體FcεRI結合，當外界抗原再度進入，即活化這兩種細胞釋放發炎物質，因此，血清中IgE的增加可視為過敏反應之最直接指標之一。本發明證實禽類粗蛋白萃取物可顯著降低血清中特異性IgE之含量，因此，本發明之禽類粗蛋白萃取物是否對特定抗原致敏的過敏反應具有抑制的效果，是值得進一步探討的問題。
將已培養好之自然殺手細胞的標的細胞(YAC-1細胞株)，先與3-十八烷基-2-[3-(3-十八烷基-2(3H)-苯並惡唑-2-亞基)-1-丙烯-1-基]苯並惡唑高氯酸鹽(DioC18)培養4小時後，以PBS清洗細胞，再分別加入不同數目之單核球與目標細胞(target cell)一起培養4小時後，再以碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染劑染細胞核，以流式細胞儀進行分析。
取小鼠全血以ORPEGEN Pharma PHAGOTEST套組測定，此套組包含螢光素(FITC)標記易受調理素作用細菌(E.Coli-FITC)及所有需
要之試劑。實驗用之試管預先冰浴，血液樣本混勻後分別各取50μL加到對照組及測試組試管底部，冰浴10分鐘後加入10μL E.Coli-FITC，震盪均勻，對照組繼續置於冰浴中，測試組試管置於37℃水浴30分鐘後，移至冰浴；另外每個孔洞添加100ng裂素佛波十四酸酯乙酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)(Sigma)至全血中(37℃，30分鐘)刺激顆粒細胞。兩組樣品加入50μL淬滅溶液(quenching solution)，震盪均勻再加入1.5mL沖洗溶液，震盪均勻後，以250×g離心10分鐘，倒掉上清液，清洗兩次，加入1mL裂解溶液，混合均勻後，室溫下靜置20分鐘，再以250×g離心10分鐘，去上清液，再以1.5mL沖洗溶液清洗一次，加入100μL DNA染色溶液混合，冰浴下避光10分鐘，於60分鐘內，以流式細胞儀評估所有粒性白細胞(granulocytes)之吞噬能力及整體細胞之吞噬能力。
於吞噬細胞活性方面，如第四圖所示，禽類粗蛋白萃取物於3.03至18.18mL/kg劑量範圍下，具有潛在增加血液中顆粒球數目及增加動物體對外來抗原之吞噬作用。在自然殺手細胞活性方面，如第五圖所示，禽類粗蛋白萃取物可增加自然殺手細胞活性，且呈劑量一反應效應。
本發明為評估實施例1製備的禽類粗蛋白萃取物是否對特定抗原致敏的過敏反應具有抑制的效果，進一步探討本發明之禽類粗蛋白萃取物對非特異性免疫反應之影響。
本發明選用6至8週BALB/c雄性小鼠，依一般試驗動物飼養管理法將飼養環境設定為溫度23±2℃，相對濕度40至60%及光照12小時亮、12小時暗，並給予動物充足飼料(chow diet)及飲水，動物經一周之適應期，始行試驗。
本發明以隨機方式將動物分成五組，分別為：空白組(餵食
蒸餾水)、對照組(以卵白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏及餵食蒸餾水)、低(3.03mL/kg/day)、中(9.09mL/kg/day)及高(18.18mL/kg/day)劑量禽類粗蛋白萃取物實驗組(以OVA致敏及餵食禽類粗蛋白萃取物)，每組10隻，共50隻。餵食一個月後，先採血作為整個實驗過程的基本值，再以OVA進行腹腔注射(intraperitoneal injection)，以得到抗體生成的曲線圖及時間表，而OVA致敏老鼠，以得到OVA特異性IgG及IgM的產生。致敏模式為每隻老鼠先注射2μL弗氏完全佐劑(Complete Freunds Adjuvant)入腹腔內，兩週後再腹腔注射6μL弗氏完全佐劑(Incomplete Freunds Adjuvant)為追加致敏，定期採血以追蹤血清中OVA特異性。於試驗結束後，採其血清及脾臟進行以下試驗。
本發明針對禽類粗蛋白萃取物對特異性免疫反應進行實驗，以OVA為特定抗原，評估BALB/c小鼠經3.03、9.09及18.18mL/kg/day之禽類粗蛋白萃取物處理後心臟、肝臟、脾臟及腎臟等組織相對重量之變化。結果顯示，餵食禽類粗蛋白萃取物濃度於3.03至18.18mL/kg範圍下及經OVA處理後，對心臟、肝臟、脾臟及腎臟之相對重量與空白組相較，並無顯著差異，顯示此濃度範圍下，本發明之禽類粗蛋白萃取物無毒性效應。
首先以100μL的10μg/mL OVA覆蓋在ELISA盤上置放在4℃過夜。翌日將抗原沖洗乾淨後加上200μL 1%含血清蛋白的PBS緩衝液(BSA-PBS)來當阻斷性溶液，置於室溫2小時或4℃過夜。將1% BSA-PBS沖洗乾淨後加入欲測的血清樣本，置於室溫2小時。再加入生物塑聯結性兔子對抗老鼠IgG或IgM抗體，再靜置2小時。沖洗乾淨後再加入avidin聯結過氧化酵素(avidin-linked peroxidase)，靜置2小時。最後加入ABTS顯色劑呈色約30分鐘，以5% SDS停止反應後判讀其吸光值。
本發明以OVA為特定抗原，如表二十所示，禽類粗蛋白萃取物於高劑量(18.18mL/kg/day)下，可降低血清中抗原特異性IgG及IgM濃度。IgG抗體會使免疫反應傾向第二型T輔助細胞(Th2)免疫反應，增加過敏機會。
本發明將2×106/mL脾臟細胞置於96孔盤中，再加入RPMI 1640培養基或添加有OVA的培養基，置於37℃的CO2培養箱兩天後，
每個孔洞加入1μCi 3H-胸苷(thymidine)，繼續培養20小時後，以細胞收集器收集細胞於濾紙上，濾紙風乾後，以閃爍計數儀測3H-thymidine含量，以計算細胞增生能力。
結果如第六圖所示，在OVA及植物血凝素(PHA)刺激下，經不同劑量禽類粗蛋白萃取物(3.03、9.09及18.18mL/kg/day)處理後，於波長570nm下其吸光值皆顯著上升，證實禽類粗蛋白萃取物能促進T細胞增殖。
將分離出的淋巴球以2×106/mL的濃度置於24孔盤中，以已知濃度的OVA抗原共同培養來刺激淋巴球。培養24至48小時後，取上層液以測定其淋巴介質分泌量。淋巴介質的測定是利用三明治酵素連結免疫吸附法(sandwich-ELISA)。是先利用一個抗淋巴介質的抗體先覆蓋在ELISA盤上，在4℃靜置一晚。進行實驗前先以1% PBS-BSA處理，再加以清洗。然後將欲測定之上清液加到ELISA盤上，置於室溫兩小時後再加入生物素(biotin)聯結的抗淋巴介質抗體。室溫靜置2小時後再加入avidin聯結過氧化酵素(avidin-linked peroxidase)，靜置2小時後，加入受質呈色。
給予禽類粗蛋白萃取物後細胞激素變化，如表二十一所示，介白素(interleukin，IL)-4分泌量增加。
本發明先將卵蛋白以皮下注射方式注入小鼠左後肢，經4天後測量其足蹼腫脹厚度。再將卵蛋白以皮下注射方式注入小鼠右後肢，經24小時後測量其足蹼腫脹厚度。比較空白組、對照組與實驗組小鼠之足蹼厚度增加數值，作為遲發性過敏反應之分析依據。
結果如第七圖所示，經OVA處理後之小鼠與空白組(未經OVA及禽類粗蛋白萃取物處理)相較其足蹼腫脹厚度顯著增加，分別為2.2及3.0mm。而經不同劑量禽類粗蛋白萃取物處理(3.03、9.09及18.18mL/kg)處理後可改善小鼠足蹼腫脹厚度分別為2.7、2.4及2.5mm，證實本發明之禽類粗蛋白萃取物可減緩遲發性過敏反應。
同時，本發明亦針對以實施例1相同方法製備的雞禽類粗蛋白萃取物進行免疫功能之分析，證實雞禽類粗蛋白萃取物亦可有效改善致敏小鼠之免疫能力，其可顯著增加T細胞、調節型T細胞、CD8+T細胞及B細胞表現、提升自然殺手細胞活性，增加Th1相關激素(IFN-γ、IL-2)的分泌，增加Th2相關激素(IL-4、IL-5)的分泌，也可促進血清中免疫球蛋白IgG含量上升，綜合上述結果，本發明之禽類粗蛋白萃取物具有調節免疫球蛋白生成、增加Th1激素分泌的能力、及增加自然殺手細胞活性能力。
綜合上述，本發明為評估禽類粗蛋白萃取物對免疫功能之影響，分別進行活體外細胞模式和活體內動物模式，探討禽類粗蛋白萃取物對非特異性免疫及特異性免疫反應之影響。於活體外非特異性免疫反應結果顯示，禽類粗蛋白萃取物於濃度8mg/mL與脾臟初代細胞共同培養48
小時，為刺激初代脾臟細胞增生之最佳時間，另禽類粗蛋白萃取物於濃度6mg/mL反應24小時後分泌細胞激素介白素(interleukin，IL)-6分泌量為197.09pg/106脾臟細胞數。非特異性免疫反應動物試驗中，禽類粗蛋白萃取物劑量於3.03至18.18mL/kg/day範圍下可刺激脾臟細胞增生，細胞激素分泌顯示，正常免疫反應傾向Th2反應；給予禽類粗蛋白萃取物劑量於3.03至18.18mL/kg/day範圍下亦使小鼠血清中非特異性抗體IgE下降、增加自然殺手細胞及吞噬細胞活性。特異性免疫反應以OVA為特定抗原，給予禽類粗蛋白萃取物於3.03至18.18mL/kg/day範圍可降低小鼠血清中OVA抗原特異性IgG及IgM含量。因此，本發明之禽類粗蛋白萃取物無論在活體外細胞試驗或活體內動物試驗，均具有優異的免疫調節功能。
Claims (11)
- 一種禽類粗蛋白萃取物用於製備增強免疫力之組合物的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物係一禽類肉品經由85~105℃之高溫高壓萃取9~11小時，再經由油水分離去除油脂後而獲得，且該禽類粗蛋白萃取物至少包含支鏈胺基酸(Branched-chain amino acid，BCAA)、組胺酸(Histidine)、酥胺酸(Threonine)、離胺酸(Lysine)以及苯丙胺酸(Phenylalanine)。
- 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物能夠刺激脾臟細胞增生。
- 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物能夠刺激Th1與Th2相關細胞激素之分泌。
- 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物能夠降低血清中非特異性抗體IgE含量。
- 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物能夠增加自然殺手細胞及吞噬細胞活性。
- 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物能夠刺激B及T細胞增生。
- 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物能夠降低抗原特異性IgG及IgM含量。
- 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該禽類粗蛋白萃取物能夠減緩遲發性過敏反應。
- 如申請專利範圍第1項至第8項任一項所述之用途，其中該禽類粗蛋白萃取物進一步包含酪胺酸及甲硫胺酸。
- 如申請專利範圍第1項至第8項任一項所述之用途，其中該禽類粗蛋白萃取物之有效劑量為每日攝取至少20mL。
- 如申請專利範圍第1項至第8項任一項所述之用途，其中該禽類肉品來 源為雞、鴨、鵝或鴿子。
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| CN115624183B (zh) * | 2022-09-30 | 2024-04-09 | 浙江李子园食品股份有限公司 | 一种用于缓解牛乳过敏的组氨酸制剂及其应用 |
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