DE68919266T2

DE68919266T2 - Immunstimulierende Guaninderivate, Zusammenstellungen und Verfahren.

Info

Publication number: DE68919266T2
Application number: DE68919266T
Authority: DE
Inventors: Robert Chen; Michael Dr Goodman
Original assignee: Scripps Clinic and Research Foundation
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1988-05-05
Filing date: 1989-05-04
Publication date: 1995-06-01
Anticipated expiration: 2009-05-05
Also published as: EP0341066B1; DE68919266D1; PT90464B; EP0341066A2; CA1320196C; ATE113957T1; JP2790846B2; AU619539B2; ES2063125T3; DK217289D0; GR3015018T3; EP0341066A3; US5093318A; DK170780B1; IE891463L; DK217289A; JPH0256496A; PT90464A; IE66321B1; AU3399989A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Immunantwort verstärkende Verbindungen (Immunstimulanzien) und insbesondere auf Guaninnukleosidderivate, die an den 7- und 8-Positionen des Guaninrings substituiert sind, sowie auf Zusammensetzungen, die diese Derivate enthalten, und Verfahren zu deren Verwendung.

Hintergrund der Erfindung

Das Immunsystem eines Tieres setzt sich aus zahlreichen Elementen zusammen, die getrennt und/oder gemeinsam dahingehend wirken, Substanzen, die von dem System als für den tierischen Wirt fremd erkannt werden, entgegenzuwirken, zu eliminieren oder zu neutralisieren. Im allgemeinen, aber nicht notwendigerweise, hat die vom Immunsystem als fremd erkannte Substanz ihren Ursprung außerhalb des Wirtes. Beispiele solcher exogenen Substanzen sind infektiöse Bakterien und die Nebenprodukte ihrer zellulären Aktivität, Viruspartikel und deren Proteine, durch Insektenstiche injizierte Proteine und ähnliches. Bei Autoimmunerkrankungen, beispielsweise rheumatoider Arthritis, erkennt das Immunsystem des Wirtes vom Wirt hergestellte Proteine oder selbst hergestellte Proteine als fremd.
Die hauptsächlichen Effektoren des Immunsystems sind die Leukozyten, die Lymphozyten aus dem Thymus (T-Zellen), im Knochenmark hergestellte Lymphozyten (B-Zellen), Neutrophile, die unter anderem Enzyme herstellen, die oxidierende Mittel machen, wie Wasserstoffperoxid, die zytotoxische Wirkungen auf Bakterien haben, und Makrophagen, die die fremde Substanz oder das Antigen den T-Zellen präsentieren sowie ein Protein erzeugen, das Interleukin-1 genannt wird, das die T-Zellentransformation zu T-Helferzellen unterstützt, umfassen. Weiterhin spielt auch das Komplement, das eine komplexe Mischung aus Proteinen ist, die in geordneter, kaskadenähnlicher Weise auf die fremde Substanz wirken, eine Hauptrolle bei Immunantworten.
B-Zellen können von T-Zellen unter anderem durch die Gegenwart von Immunglobulinen auf ihren Membranoberflächen unterschieden werden. Diese Immunglobuline wirken als Antikörper.
Es gibt fünf bekannte Klassen von Immunglobulinen, die auf der Grundlage von fünf antigenisch verschiedenen Proteinen für die schweren Ketten, die einen Teil des Immunglobulinmoleküls ausmachen, als IgA, IgD, IgE, IgG und IgM identifiziert werden. B-Zellen tragen weiterhin Nicht-Immunglobulinzellmarker, einschließlich eines Komplementrezeptors (CR), eines Rezeptors für den Fc-Teil von Immunglobulin (FcR), I-Region-assoziierter Antigene (Ia) und eines Satzes von Differenzierungsantigenen (Lyb 1-7), die von allen Antiseren identifiziert werden und mit verschiedenen Aspekten der B-Zellreifung und -aktivierung korrelieren. Diese Marker sind für die phänotypische Identifizierung von B-Zellen nützlich.
Während die B-Zellimmunglobuline mit der fremden Substanz oder dem Antigen wechselwirken, wird von den T-Zellen und insbesondere von den T-Helferzellen angenommen, daß sie notwendig sind, um B-Zellen zu stimulieren, sich zu teilen und zu Antikörper sezernierenden Zellen für die humorale Immunität zu differenzieren. Die Suppressor-T-Zellen tragen zur Regulation der humoralen Immunität bei, während zytotoxische T-Zellen und T- Zellmediatoren vom Typ der verzögerten Hypersensitivität die hauptsächlichen Effektoren der zellvermittelten Immunität sind.
T-Zellen tragen als Lyt 1, 2 und 3 sowie als L3T4 bezeichnete Antigene, die mit den T-Zellfunktionen in Zusammenhang stehen. T-Helferzellvorläufer haben den Phänotyp Lyt 1&spplus;, 2&supmin;, 3&supmin;, L3T4T. Es sind dies Zellen, die normalerweise an der Aktivierung und Regulation von B-Zellen beteiligt sind.
Von T-Helferzellen ist bekannt, daß sie die Aktivierung und Differenzierung von Immunglobulin sezernierenden B-Zellen unterstützen, nachdem die B-Zellen eine erste Botschaft vom aktivierenden antigenen Agens erhalten haben. Die Art und Weise, mittels derer die T-Zellen die zweite Botschaft der B-Zellvermehrung, der Aktivierung und Differenzierung an die B-Zellen geben, ist jedoch derzeit nicht vollständig verstanden.
Cyclisches Guanosin-3',5'-Monophosphat (cGMP) ist als natürlich auftretendes Mittel mit dem Bereitstellen der erforderlichen zweiten Botschaft für die B-Zellproliferation in Verbindung gebracht worden. Von cyclischem 8-Bromguanosin-3',5'-Monophosphat (8-BrcGMP) ist festgestellt worden, daß es ein schwaches synthetisches, intrazelluläres Lymphozytenmitogen ist.
Die Immunantwort kann durch artifizielle Suppression (Immunsuppression) oder Verstärkung (Immunpotenzierung oder Immunstimulation) modifiziert werden. Eine Immunsuppression, d.h. eine artifiziell induzierte, verringerte Reaktivität, kann mit sechs allgemeinen Verfahren erhalten werden: (1) Verabreichen eines Antigens, (2) Verabreichen von spezifischen Antiseren oder Antikörpern, (3) Verwendung anderer biologischer Reagenzien, wie z.B. Antilymphozytenantiseren, (4) Verwendung von Wirkstoffen oder Hormonen, (5) Bestrahlung und (6) operative Entfernung des lymphoiden Gewebes. Die Immunpotenzierung kann die Verabreichung eines Mittels umfassen, das eine Zunahme der Geschwindigkeit, mit der sich die Immunantwort entwickelt, eine Zunahme der Intensität oder des Ausmaßes der Antwort, eine Verlängerung der Antwort oder die Entwicklung einer Antwort auf eine andernfalls nichtimmunogene Substanz bewirkt.
Die Mittel, von denen bekannt ist, daß sie die Immunantworten verstärken, werden im allgemeinen Adjuvanzien genannt, und sie können in zwei allgemeine Klassen eingeteilt werden: (1) solche, die eine allgemeine Potenzierung ergeben, d.h. Substanzen, die sowohl die zellulären als auch die humoralen Immunantworten für eine große Vielzahl von Antigenen verstärken, und (2) solche, die eine spezifische Potenzierung ergeben, d.h. Substanzen, die nur spezifische Antworten auf bestimmte Antigene verstärken.
Substanzen, die als Adjuvanzien wirken können, können in die folgenden Kategorien eingeteilt werden: (1) Wasser- und Ölemulsionen, z.B. Freund's Adjuvans, (2) synthetische Polynukleotide, (3) Hormone, Wirkstoffe und cyclische Nukleotide, (4) Endotoxine, (5) proteinähnliche Lymphokine und Monokine, wie z.B. die Interleukine.
Eine Substanz, welche befähigt ist, die Immunantwort spezifisch zu potenzieren, ist der Transferfaktor, nämlich ein dialysierbarer Leukozytenextrakt (DLE), der aus peripheren Human-Leukozyten gewonnen worden ist. Es ist berichtet worden, daß der Transferfaktor eine gewisse Wirksamkeit bei Patienten mit Immundefekten und eine mögliche Wirksamkeit bei Krebspatienten sowie bei Patienten mit begrenzten Immundefektzuständen zeigt. Die Wirkungsweise dieser speziellen Substanz ist aber bis jetzt noch nicht exakt geklärt.
Bei einigen Krankheiten und physiologischen Zuständen, wie z.B. bei AIDS, X-gebundenen Agammaglobulinämien, Seneszenz und wirkstoffinduzierter Immunsuppression, fehlt die B-Zellaktivierung und -differenzierung und/oder besteht nur auf einem verringerten Niveau, wodurch die Immunantwort des Wirtes vermindert wird. Diese Erkrankungen und Zustände sind repräsentativ für immunsupprimierte Zustände. Wenn eine verstärkte Aktivierung und Differenzierung bewirkt werden kann, so zielt sie hier auf eine vorteilhafte Verringerung der Manifestation der Krankheit und/oder auf die Verbesserung des Zustandes des Patienten ab.
Ein immunpotenzierter Zustand kann durch die körperliche Verfassung nach einer Impfung veranschaulicht werden. Hier ist die Immunantwort infolge einer antigenischen Antwort bereits gesteigert, könnte aber vorteilhaft noch weiter gesteigert werden, um einen verbesserten Grad und/oder eine längere Dauer der Immunität zu erreichen.
In der gemeinsam übertragenen US-PS 4 539 205 (Goodman und Weigle) ist die Modulation tierischer, zellulärer Antworten mit 8-substituierten Guaninderivaten, die 9-1' an eine Aldose mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen in der Aldosekette (dem Ring) gebunden sind, beschrieben. Die in dieser Patentschrift beschriebenen zellulären Modulationen beziehen sich größtenteils auf Immunmodulation, wie z.B. die Adjuvanswirkung bei der Erzeugung der primären und sekundären Immunantworten. Die Aktivität gegen bestimmte Neoplasie-Zustände sowie eine T-Zell-ersetzende Aktivität, eine IL-1-ähnliche Aktivität auf Thymozyten, und die Induktion der Freisetzung lysosomaler Enzyme aus Neutrophilen werden ebenfalls offenbart. Die 8-Substituenten in diesen Molekülen haben, bezogen auf Wasserstoff, elektronenziehende induktive Wirkungen. So wurden Halogen, Mercapto oder sein Thioxotautomer, Acylmercapto, Alkylsulfido, Nitro, Cyano, Keto, Halogenmethyl und Methylenoxyalkyl und ähnliche als nützlich offenbart, während von elektronenschiebenden Substituenten, beispielsweise einer Aminogruppe, festgestellt wurde, daß sie inaktiv sind.
Weiterhin ist in der gemeinsam übertragenen US-PS 4 643 992 und in der dieser entsprechenden, veröffentlichten EPA Nr. 83 306 791.1 die Verwendung von Derivaten von 8- Hydroxyguanin (8-Oxoguanin), 7-Methyl-8-oxoguanin und 7-Methyl- 8-thioxoguanin bei der Modulation zellulärer Antworten in Tieren beschrieben. Weitere Ergebnisse unter Verwendung von Guaninderivaten, die in der US-PS 4 539 205 offenbart sind, sind auch in der US-PS 4 643 992 beschrieben, ebenso wie ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von Guaninderivaten, die erstmals in jener Patentschrift offenbart sind.
Darüber hinaus sind verschiedene Publikationen und Buchkapitel von einigen der Erfinder dieser Erfindung und ihren Mitarbeitern publiziert worden, die sich auf noch weitere Wirkungen der in der US-PS 4 643 992 offenbarten und beanspruchten Verbindungen beziehen. Beispielhaft für solche Publikationen sind Goodman, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 179:479 (1985); Goodman, J. Immunol., 136:3335 (1986); Goodman und Weigle in Purine Metabolism In Man, Part B, Nyhan und Thompson, Hrsg., Plenum Press, New York, Seiten 451 und 443 (1986); Goodman und Weigle, J. Immunol., 135:3284 (1985); Goodman und Wolfert, Immunol. Res., 5:71 (1986); Goodman, J. Immunol., 136:3335 (1986); Goodman, J. Immunol., 137:3753 (1986); und Goodman und Hennen, Cell. Immunol., 102:395 (1986).

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Es werden 7,8-disubstituierte Guaninnukleoside (Guanosinderivate) zur Verstärkung der Immunantwort in menschlichen und tierischen Zellen verwendet. Die substituierten Guaninnukleoside haben eine der folgenden Formel entsprechende Struktur:
worin X O, S, Se oder NCN ist; R¹ ein heteroatomsubstituierter Kohlenwasserstoffrest ist, der länger als eine Ethylgruppe und kürzer als eine Decylgruppe ist und bei physiologischen pH-Werten frei von Ionenladungen ist; R² und R³ die gleichen oder verschiedene Reste darstellen, welche aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Hydroxyl-, Niedrigalkoxy-, Niedrigalkanoyloxy- und Benzoxygruppen besteht, oder R² und R³ zusammengenommen einen Niedrigalkylidendioxyrest darstellen; und R&sup4; ein Rest ist, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, Niedrigalkanoyl- und Benzoylgruppen besteht. Bevorzugte Guanosinderivate dieser Erfindung sind jene, in welchen X für O oder S steht und der Rest R¹ eine Gesamtlänge (einschließlich seines Heteroatom-Substituenten) aufweist, die größer als Ethyl und kleiner als etwa Heptyl ist. Besonders bevorzugte Guanosinderivate sind 7-(2-Chlorethyl)-8-oxoguanosin, 7-Carbethoxymethyl-8-oxoguanosin, 7-Carbamoylmethyl-8-oxoguanosin, 7-Methoxyethyl-8-oxoguanosin, 7-(4-Nitrobenzyl)-8-oxoguanosin, 7-(4-Methoxybenzyl)-8-oxoguanosin und 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-8-oxoguanosin. Pharmazeutisch annehmbare, nicht- toxische Basenadditionssalze solcher Verbindungen sind ebenfalls umfaßt.
Eine Immunantwort-verstärkende Zusammensetzung, die eine Verdünnungsmittelmenge eines physiologisch verträglichen Trägers zusammen mit einer Potenzierenden (oder immunstimulierenden) wirksamen Menge eines oben beschriebenen, heteroatomsubstituierten Guaninnukleosidderivates als Wirkstoff enthält, ist von dieser Erfindung ebenfalls umfaßt.
Ein Verfahren zum Verstärken einer Immunantwort, insbesondere einer Antigen-spezifischen Immunantwort, ist ebenfalls umfaßt. Dazu werden Leukozyten in einem wäßrigen Medium, nämlich in einer Kultur (in vitro) oder in vivo, mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die eine immunstimulierende Menge eines vorstehend beschriebenen Guaninnukleosidderivates enthält. Der Kontakt zwischen der Zusammensetzung und den Leukozyten wird für einen Zeitraum aufrechterhalten, der ausreichend ist, daß die in Kontakt gebrachten Zellen die Verstärkung ihrer Immunantwort manifestieren können. Die in Kontakt gebrachten Leukozyten sind bevorzugt B-Lymphozyten.
Die vorliegende Erfindung hat verschiedenerlei Nutzen und Vorteile.
Ein hervorragender Nutzen der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß ihre Verbindungen im allgemeinen effizienter sind, d.h. eine ähnliche Antwort bei einer niedrigeren Dosis oder eine verstärkte Antwort bei einer gegebenen Dosis im Vergleich zu zuvor bekannten Guanosinimmunstimulanzien ergeben.
Ein Vorteil der Erfindung ist weiterhin, daß die Verwendung einer ihrer Zusammensetzungen die für die B-Lymphozytenaktivierung und -differenzierung als Antwort auf eine erste (antigene) Botschaft notwendige zweite Botschaft zur Verfügung stellen kann.
Ein weiterer Nutzen der Erfindung besteht darin, daß eine verstärkte Immunantwort sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit einer T-Helferzellaktivität bewirkt werden kann. Eine verstärkte Immunantwort wird daher sowohl in T-Zell-abhängigen als auch in T-Zell-unabhängigen Systemen festgestellt.
Ein weiterer Vorteil dieser Erfindung besteht darin, daß die besonderen immunsupprimierten und immundefekten Zustände und Krankheitsmanifestationen verbessert werden können und/oder durch Anwendung der Erfindung verringert werden können.
Noch weitere Vorzüge und Vorteile der Erfindung werden dem Fachmann aus der folgenden Diskussion ersichtlich werden.
Anthropomorphe Beschreibungen, wie z.B. das Senden und Erhalten von Botschaften durch und an Chemikalien und Zellen, werden hierin für beschreibende Zwecke als Hilfe zum Verständnis der beobachteten Phänomene verwendet.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

I. Einführung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein die Immunantwort verstärkendes Mittel (einen Immunstimulator), das (der) das Immunsystem des Wirtsäugetieres, an das es (er) verabreicht wird, sowie Leukozyten in Zellkultur stimuliert. Die besonders betroffene Immunstimulation ist für das immunisierende Antigen vorwiegend Antigen-spezifisch.
Bei der Untersuchung der Wirkungen einiger als Mitogen beschriebener Guanosinderivate, z.B. von cyclischem Guanosin- 3',5'-monophosphat und dessen 8-Bromderivat, wurde festgestellt, daß eine neue Klasse von Guaninnukleosidderivaten mit niedrigem Molekulargewicht, wenn sie in einer wirksamen Menge als Wirkstoff einer Zusammensetzung, die eine Verdünnungsmittelmenge eines physiologisch verträglichen Trägers enthält, vorhanden sind, bemerkenswerte Wirkungen bei der Modulation der Antworten von Säugetierzellen ergeben. Die Verstärkung Antigen-spezifischer, humoraler Immunantworten, die zu einer starken Adjuvanswirkung, T-Zell-ersetzender-Faktor-ähnlicher Aktivität und Immunrekonstitutionsaktivität führten, sind besondere Beispiele der zellulären Antworten, bei denen eine Modulation festgestellt wurde. Diese Verbindungen und Verfahren zu ihrer Anwendung sind in den US-PSen 4 539 205 und 4 643 992 offenbart.
Von den erfindungsgemäßen Verbindungen ist festgestellt worden, daß sie überraschenderweise aktiver sind als die in den oben genannten zwei Patentschriften angegebenen Verbindungen. Die Befunde einer gesteigerten Aktivität waren aus einer Anzahl von Gründen überraschend.
Die aktivste Verbindung, die in den oben genannten US-PSen offenbart ist, war 7-Methyl-8-oxoguanosin (7m8oGuo), sowohl als Leukozytenmitogen als auch als Antigen-spezifisches Adjuvans. Wie im folgenden erörtert werden wird, sind Mitogenität und Adjuvanswirkung Phänomene, die nicht notwendigerweise im Zusammenhang stehen.
Angesichts der im folgenden erhaltenen Daten war es überraschend, daß 7m8oGuo eine im Vergleich zu Verbindungen wie 8- Hydroxyguanosin (erwähnt als sein Tautomer, 8-Oxoguanosin; 8oGuo), oder 8-Mercaptoguanosin (erwähnt als 8MGuo oder als sein Tautomer, 8-Thioxoguanosin) verstärkte Aktivität aufwies. Genauer gesagt, zeigten nachfolgende Daten, von denen einige nachstehend angeführt sind, daß die Aktivität (sowohl die Mitogenität als auch die Adjuvanswirkung) einer Reihe von 8- substituierten Guanosinen mit zunehmender Größe der 8- Substituentengruppe abnahm.
Da die Methylgruppe von 7m8oGuo an den Guanosinring benachbart zur 8-Position gebunden ist, an der ein Effekt der Substituentengröße festgestellt wurde, würde somit von der Addition dieser Gruppe oder irgendeiner Gruppe an der 7-Position, an der zuvor kein Substituent war, angenommen werden, daß sie ebenfalls eine Abnahme der Aktivität verursacht, schon allein deshalb, weil das fragliche Molekül an einer zu der größenempfindlichen Ringposition benachbarten Position größer war. Die gesteigerte Adjuvanswirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen mit noch größeren Substituenten an der 7-Position des Guanosinrings im Verhältnis zu 7m8oGuo war noch überraschender.

II. Die Verbindungen

Die hier in Betracht gezogenen, immunstimulierenden Verbindungen sind 7,8-disubstituierte Guaninnukleosidderivate (hier auch als Guanosine oder Guanosinderivate bezeichnet). Diese Verbindungen haben Strukturen, die der unten gezeigten Formel I entsprechen:
worin X O, S, Se oder NCN ist ;
R¹ ein heteroatomsubstituierter Kohlenwasserstoffrest ist, der eine Gesamtlänge aufweist, die länger als eine Ethylgruppe und kürzer als eine Decylgruppe ist, und der bei physiologischen pH-Werten frei von Ionenladungen ist;
R² und R³ die gleichen oder verschiedene Reste darstellen, welche aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Hydroxyl, Niedrigalkoxy, Niedrigalkanoyloxy und Benzoxy besteht, oder R² und R³ zusammengenommen einen Niedrigalkylidendioxyrest darstellen; und
R&sup4; ein Rest ist, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, Niedrigalkanoyl und Benzoyl besteht.
Bemerkt sei, daß die Ribosylgruppe in der obigen Formel als in der 1-Position dieses Ringes gebunden dargestellt sein soll, wobei diese Bindung in der Beta-Konfiguration vorliegt. Außerdem sei bemerkt, daß die D-Form der Ribosylgruppe vorgesehen sein soll.
Bevorzugte Guanosinderivate sind jene, in welchen X für O oder S steht, R¹ eine Länge aufweist, die größer als Ethyl ist, und kleiner als etwa Heptyl ist, und R² und R³ von Niedrigalkylidendioxy verschieden sind. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform steht X für O, ist R¹ aus einer Gruppe ausgewählt, die aus 2-Chlorethyl (-CH&sub2;CH&sub2;Cl), Carbethoxymethyl (-CH&sub2;CO&sub2;C&sub2;H&sub5;), Carbamoylmethyl (-CH&sub2;CONH&sub2;), Methoxyethyl (-CH&sub2;CH&sub2;OCH&sub3;), 4-Nitrobenzyl, 4-Methoxybenzyl und 2,3- Dihydroxypropyl besteht, stehen R² und R³ für Hydroxyl, und ist R&sup4; Wasserstoff. In höchstem Maße bevorzugt steht X für O, stellt R¹ 4-Nitrobenzyl oder 2-Chlorethyl dar, stellen R² und R³ Hydroxyl dar, und ist R&sup4; Wasserstoff.
Wie weiter oben bereits erwähnt worden ist, hat ein Rest R¹ eine Länge, die größer als jene einer Ethylgruppe ist, und der Rest R¹ umfaßt somit heteroatomsubstituierte Ethylgruppen, worin der Substituent eine Größe hat, die größer als jene eines Wasserstoffatoms ist. Ein Rest R¹ hat auch eine Länge, die geringer als jene einer Decylgruppe ist. Dies bedeutet, daß R¹ ein heteroatomsubstituierter Kohlenwasserstoffrest mit einer Länge der längsten Kette, einschließlich des Substituenten, ist, die größer als die einer gesättigten Zweikohlenstoffkette ist, und die kürzer als die einer gesättigten Zehnkohlenstoffkette ist; wobei jede Länge entsprechende Wasserstoffatome einschließt. Eine heteroatomsubstituierte Kohlenwasserstoffgruppe, welche einfach als ein heteroatomsubstituiertes Propyl, Butyl, Hexyl, Decyl oder ähnliches bezeichnet wird, ist als einen normalen, geradkettigen Kohlenwasserstoffrest aufweisend zu verstehen. Heteroatomsubstituierte, verzweigtkettige Reste werden durch gewöhnlich verwendete, numerische oder abgekürzte Präfixe angezeigt, wie z.B. 2-Propyl bzw. Isopropyl.
Heteroatomsubstituierte Kohlenwasserstoffrestkettenlängen werden entlang der längsten Kette in dem Substituenten gemessen. Diese längste Kette kann die Heteroatom-Substituentengruppe umfassen oder auch nicht. Diese Längen können leicht unter Verwendung publizierter Bindungswinkel, Bindungslängen und Atomradien berechnet werden, um, je nach Bedarf, Längen von gestaffelten Kettenformen der Reste zu zeichnen und zu messen; oder indem Modelle unter Verwendung kommerzieller Kits gebaut werden, deren Bindungswinkel, Längen und Atomradien im Einklang mit akzeptierten, publizierten Werten stehen. Angenäherte Substituentenlängen können außerdem dadurch abgeschätzt werden, daß die Längen, Bindungswinkel und Atomradien ungesättigter Bindungen sowie jene der Atome eines Heteroatom-Substituenten als die gleichen wie jene gesättigter Kohlenstoffatome angenommen werden, obgleich die oben erwähnten Meßarten bevorzugt sind.
R¹ ist ein heteroatomsubstituierter Kohlenwasserstoffrest mit einer bestimmten Länge, der frei von einer Gruppe ist, die bei physiologischen pH-Werten Ionenladungen schafft. Der 7-heteroatomsubstituierte Rest ist daher frei von Amino oder Carbonsäuregruppen oder von anderen basischen oder sauren Gruppen, deren pka-Werte solche sind, daß das Molekül bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung tragen würde.
Kohlenwasserstoffe und Kohlenwasserstoffreste können grob in aliphatische und aromatische Reste eingeteilt werden. Brauchbare aliphatische Reste umfassen (i) gesättigte Alkane (Alkylreste) und (ii) mono-ungesättigte Alkene und Alkine (Alkenyl- und Alkinylreste). Für jeden Typ von aliphatischem Rest existieren cyclische, geradkettige und verzweigtkettige Reste. Brauchbare aromatische Reste sind Aralkanreste, die einen mit einer aliphatischen Gruppe verbundenen aromatischen Ring enthalten. In einem vorgesehenen R¹-Rest ist weiterhin jeder dieser Kohlenwasserstoffreste mit einem Heteroatom (Nicht-Kohlenstoff- oder Nicht-Wasserstoffatom) substituiert.
Die Reste R¹ haben eine Länge, die größer als jene einer Ethylgruppe ist, und sie haben eine Länge, die kürzer als jene einer Decylgruppe ist. Ist der Rest R¹ ein heteroatomsubstituierter Alkylrest, dann können diese Alkylreste daher als heteroatomsubstituierte Niedrigalkylreste bezeichnet werden. Die heteroatomsubstituierten C&sub2;-C&sub8;-Alkylreste umfassen mehrere Glieder aus einer Klasse, welche hierin als "Niedrigalkyl"-Reste, welche in heteroatomsubstituierten Alkylresten verwendbar sind, wie dies nachstehend erörtert ist, bezeichnet wird. Daher ist es angemessen, an dieser Stelle niedrige Alkylreste zu erörtern.
Gruppen und Reste, die hierin als "niedrig" bezeichnet werden, enthalten 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome und enthalten vorzugsweise 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatome. Diese Definition trifft auf die Verwendung des Wortes "niedrig", so wie es für jeden der Reste R¹, R², R³ und R&sup4; verwendet wird, zu.
Niedrige Alkylreste umfassen beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, t-Butyl, n-Pentyl, 3-Methyl-2-butyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, neo-Pentyl, n- Hexyl, 1-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 2-Hexyl, 3-Hexyl und ähnliche. Die Gruppe der heteroatomsubstituierten C&sub2;-C&sub8;-Alkylreste von R¹ umfaßt entsprechend heteroatomsubstituierte Methylreste aus der Gruppe der niedrigen Alkylreste und sie umfaßt weiterhin heteroatomsubstituierte Heptyl-, Octyl- und Nonylreste sowie weitere Reste, wie z.B. einen heteroatomsubstituierten 2-Methylheptylrest, die heteroatomsubstituierte, alkylsubstituierte Niedrigalkylreste sind. Da in höherem Maße bevorzugte Reste R¹ eine Länge haben, die größer als Ethyl und kleiner als etwa Heptyl ist, umfassen in höherem Maße bevorzugte Niedrigalkylreste für R¹ ein entsprechend heteroatomsubstituiertes Methyl sowie substituiertes Propyl, Butyl, Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl und dgl.
Substituierte Alkylreste R¹ umfassen halogensubstituiertes C&sub2;-C&sub8;-Alkyl, Hydroxy- und Polyhydroxy-C&sub2;-C&sub6;-alkyl, C&sub2;-C&sub6;-Alkylen-niedrigalkylcarboxylat, Di-niedrigalkylether (niedrigalkoxyniedrigalkyl) und unsubstituierte Niedrigalkoxy-C&sub1;-C&sub7;- alkylcarbonylreste, sowie Mono- und Di-niedrigalkylniedrigalkylcarboxamidoreste, in welchen der Carboxamidogruppenteil des Restes die Formel CONR&sup5;R&sup6; hat. Diese Reste R¹ sind nachstehend erörtert.
Hydroxy-C&sub2;-C&sub6;-alkylreste umfassen 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl, 3-Hydroxypropyl, 3-Hydroxy-2-butyl, 3-Hydroxy-2,2- dimethylpropyl, 6-Hydroxyhexyl und dgl.
Eine andere Gruppe von substituierten Alkylresten R¹ ist eine Untergruppe von Hydroxy-C&sub2;-C&sub6;-alkylresten, welche C&sub3;-C&sub6;- Reste sind, welche eine Hydroxylgruppe enthalten, welche um zwei Kohlenstoffatome von einem weiteren Substituenten beabstandet ist, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Azido-, Ether- und Thioethersubstituenten besteht, wobei die Ether- und Thioethergruppen bis zu etwa 3 Kohlenstoffatome enthalten. Diese Untergruppe kann als Reaktionsprodukt eines Epoxides mit einem Nukleophilen betrachtet werden. Die aus dem Epoxid und dem Nukleophilen gebildete Hydroxylgruppe ist in höchstem Maße bevorzugt an eine Dreikohlenstoffkette gebunden, wie dies durch die Reaktion von Epichlorhydrin oder Epibromhydrin mit einem entsprechenden Guanosin und durch die anschließende Umsetzung des so entstandenen Epoxides mit dem Nukleophilen geschaffen wird.
Polyhydroxy-C&sub3;-C&sub6;-alkylreste umfassen 2,3-Dihydroxypropyl, 3,4-Dihydroxybutyl, Sorbityl und dgl. Den Fachleuten wird klar sein, daß die vorgesehenen Polyole nicht mehr als eine Hydroxylgruppe an jedem Kohlenstoffatom der Niedrigalkylgruppe enthalten.
Halogensubstituierte C&sub2;-C&sub8;-Alkylreste enthalten vorzugsweise ein oder mehrere Chlor-, Brom-, Fluor- oder Iodatome, welche an einen C&sub2;-C&sub8;-Alkylrest gebunden sind. Beispielhafte halogensubstituierte Reste umfassen 2-Chlorethyl, 2,2,2-Trifluorethyl, 2-Brombutyl, 2-Chlorhexyl, 2,3-Dichloroctyl, einen perhalogensubstituierten Kohlenwasserstoffrest und dgl.
Niedrigalkylcarboxylreste umfassen die oben beschriebenen Niedrigalkylreste, welche weiterhin eine Carboxylgruppe (-CO&sub2;H) als Substituent enthalten. Ein 7-CH&sub2;CO&sub2;H-Rest wird somit als ein carboxylsubstituierter Methylrest angesehen. Niedrigalkylcarboxylreste sind als solche nicht als R¹-Substituenten vorgesehen, da sie dem Guaninderivat bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung verleihen. Ester- und Amidderivate von Niedrigalkylcarboxylresten sind jedoch vorgesehen.
Niedrigalkoxyniedrigalkylcarbonylreste können als Ester von Niedrigalkylcarboxylresten mit Niedrigalkylalkoholen, wie z.B. Methyl-, Ethyl-, Isopropyl-, t-Butyl- und Neopentylalkohol, angesehen werden. Beispielhafte Niedrigalkylcarboxylreste umfassen Carboxylmethyl, 2-Carboxylethyl, 2-Carboxylhexyl und dgl. Beispielhafte Niedrigalkoxyniedrigalkylcarbonylreste umfassen Carbethoxymethyl (auch als Carboethoxymethyl bekannt), 3-Isopropoxycarbonylpropyl, 4-Hexyloxycarbonylpentyl und dgl.
Unsubstituierte, mono- und diniedrigalkylsubstituierte Amino-niedrigalkyl-carbonyl- (Niedrigalkylcarboxamido, in welchem der Carboxamidogruppenteil des Restes die Formel CONR&sup5;R&sup6; aufweist) -Reste können dahingehend betrachtet werden, daß sie aus einer 7-Substituenten-niedrigalkyl-carboxylgruppe und Ammoniak sowie Mononiedrigalkyl- oder C&sub2;-C&sub3;-Alkanolamin bzw. einem Di-niedrigalkyl- oder Di-C&sub2;-C&sub3;-Alkanolamin gebildet worden sind, wobei die Niedrigalkylreste wie oben beschrieben sind, und die C&sub2;-C&sub3;-Alkanolteile 2-Hydroxyethyl, 3-Hydroxypropyl oder 2-Hydroxypropyl sind. Beispiele für solche Amine sind Methylamin, Propylamin, sec-Butylamin, Hexylamin, Dimethylamin, Methylethylamin, Butylhexylamin, 2-Hydroxyethylamin (Ethanolamin), 2-Hydroxypropylamin (Isopropanolamin), Diethanolamin, Diisopropanolamin, Methylethanolamin, 3-Propanolamin und dgl. Amide von cyclischen sekundären Aminen, welche fünf oder sechs Atome im Ring aufweisen, können dahingehend angesehen werden, daß sie aus einer Niedrigalkylcarboxylgruppe und einem cyclischen sekundären Amin, wie z.B. Pyrrolidin, Morpholin, Piperidin, Pyrrol oder 4-Methylpiperazin, gebildet worden sind.
Der Carboxamidogruppenteil eines niedrigen Alkylcarboxamidorestes, wie z.B. der oben angeführten, hat die Formel CONR&sup5;R&sup6;, worin R&sup5; und R&sup6; gleich oder verschieden sind und aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Niedrigalkyl und C&sub2;-C&sub3;-Alkanol besteht. Alternativ können die Reste NR&sup5;R&sup6; zusammengenommen einen heterocyclischen Ring bilden, der fünf oder sechs Atome im Ring aufweist. Diese 7-Substituenten können somit als Niedrigalkylcarboxamidoreste beschrieben werden, deren Carboxamidogruppenteil die Formel CONR&sup5;R&sup6; hat.
Ein C&sub2;-C&sub6;-Alkylenniedrigalkylcarboxylatrest kann als ein Ester eines Substituenten-Hydroxy-C&sub2;-C&sub6;-Alkyl- oder Polyhydroxy-C&sub3;-C&sub6;-Alkylrestes und einer Niedrigalkylcarbonsäure angesehen werden. Beispielhafte Hydroxy-C&sub2;-C&sub6;-Alkylsubstituenten sind weiter oben erörtert worden. Niedrigalkanoyl-(Niedrigacyl)-Teile von Niedrigalkylcarbonsäuren, welche in solchen Estern vorliegen können, umfassen Formyl, Acetyl, Propionyl, 2- Methylpropionyl, Butyryl, 3-Methylvalerianyl und dgl. Niedrigalkanoyloxygruppen, welche durch die Veresterung einer 2'- und/oder 3'-Hydroxylgruppe und einer Niedrigalkylcarbonsäure, wie z.B. einer der oben angeführten, gebildet worden sind, sind als R² und R³ vorgesehen. Niedrigalkanoylgruppen, die in ähnlicher Weise durch Veresterung einer 5'-Hydroxylgruppe gebildet werden, sind als Reste R&sup4; vorgesehen.
Ein C&sub2;-C&sub6;-Alkylenniedrigalkylcarboxamidrest ist ebenfalls als ein heteroatomsubstituierter 7-Kohlenwasserstoff-Substituent vorgesehen. Ein solcher Rest kann als ein Amid angesehen werden, das aus einem mit einer primären oder sekundären Aminogruppe substituierten C&sub2;-C&sub6;-Alkylrest und einer Niedrigalkylcarbonsäure gebildet worden ist. Durch primäre und sekundäre Aminogruppen substituierte C&sub2;-C&sub6;-Alkylreste (sowie in ähnlicher Weise substituierte tertiäre Amine) sind als solche hierin ebenfalls nicht vorgesehen, weil ihre Aminogruppen bei physiologischen pH-Werten dem Guaninderivat eine Ionenladung verleihen. Brauchbare Niedrigalkylcarbonsäuren, welche in solchen Amiden vorliegen, sind jene, die vorstehend erörtert worden sind. Beispiele von C&sub2;-C&sub6;-Alkylresten, die durch primäre bzw. sekundäre Amine substituiert sind, umfassen 2-Aminoethyl-, 2- Aminopropyl-, 2-(Isopropyl)aminoethyl-(3-aza-4-methylpentyl)reste und dgl.
Bemerkt sei, daß ein Ester oder Amid, wie derselbe bzw. dasselbe in den vorhergehenden Absätzen beschrieben worden ist, theoretisch eine größere Länge als jene einer Decylgruppe haben könnte. Wie vorstehend jedoch schon ausgeführt wurde, hat ein Rest R¹ eine Länge, welche kleiner als jene einer Decylgruppe ist. Somit ist ein Ester ausgeschlossen, der aus einem Alkylcarboxylat mit sechs Kohlenstoffatomen und einem Niedrigalkylalkohol mit sechs Kohlenstoffatomen gebildet worden ist, da derselbe länger als eine Decylgruppe ist. Bemerkt sei auch, daß bevorzugte Reste R¹ eine Länge aufweisen, die kleiner als etwa jene einer Heptylgruppe ist, und daß die oben beschriebenen Ester und Amide bevorzugt sind.
Noch eine andere Gruppe von substituierten 7-Kohlenwasserstoff-Substituenten sind Diniedrigalkyletherreste, welche auch als Niedrigalkoxyniedrigalkylreste bezeichnet werden können. Solche Diniedrigalkylether können als Alkylgruppen betrachtet werden, in denen eine oder mehrere Methylengruppen (-CH&sub2;-) durch ein Sauerstoffatom (-O-) substituiert sind. Beispielhafte, verwendbare Etherreste umfassen Methoxymethyl-, Methoxyethyl-, Ethoxyethyl-, Ethoxy-2-propylreste und dgl.
Die vorstehende Erörterung hat 7-Substituenten gegolten, welche heteroatomsubstituierte, gerad- bzw. verzweigtkettige (aliphatische) Alkylreste sind. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen auch substituierte cycloaliphatische Reste, ethylenisch ungesättigte, aliphatische Reste und Aralkylreste. Jeder dieser Reste kann heteroatomsubstituiert sein, wie dies für die geradkettigen und verzweigtkettigen Alkylreste besprochen worden ist.
Beispielsweise können heteroatomsubstituierte, cyclischaliphatische Reste, wie z.B. Cyclopentancarbonsäure oder Cyclobutancarbonsäure, zur Ausbildung eines Esters oder Amides mit einem weiter oben besprochenen, 7-substituierten Niedrigalkylalkohol bzw. -amin, verwendet werden. Das gleiche gilt für ethylenisch ungesättigte, cyclische Carbonsäuren, wie z.B. 2- Cyclopenten-1-essigsäure. In ähnlicher Weise können ein cyclischer Alkohol, wie z.B. Cyclohexanol oder 2-Cyclohexen-1-ol, Cyclopropylcarbinol, oder ein cyclisches Amin, wie z.B. Cyclobutylamin oder Cyclohexylamin, zur Ausbildung eines Esters bzw. Amides mit einem weiter oben erörterten 7-Alkylcarboxylrest, wie z.B. einem Carboxylmethylrest, verwendet werden. Ethylenisch ungesättigte Alkohole und Carbonsäuren, wie z.B. 3-Butin- 1-ol und 3,3-Dimethylacrylsäure, können ebenfalls zur Herstellung der vorstehend erörterten Ester und Amide verwendet werden.
Speziell vorgesehene Reste R¹ sind substituierte Aralkylreste. Beispielhafte Aralkylreste umfassen Benzyl- und Phenethylreste, und diese Reste sind auf ihren Phenylringen mit einem oder mit zwei, vorzugsweise mit einem, Heteroatom-Substituenten substituiert, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Nitro, Cyano, Carboxamido (-CONR&sup5;R&sup6;, worin R&sup5; und R&sup6; wie oben beschrieben sind), Halogen, Niedrigalkoxy-, Niedrigalkoxycarbonyl-, Hydroxyl- und Niedrigalkanoyloxygruppen besteht. Es sei nochmals betont, daß das Erfordernis hinsichtlich der Gesamtlänge für den Rest R¹ aufrechterhalten bleibt.
Substituenten an einer Benzylgruppe, welche durch Resonanz oder induktive Wirkung in Bezug auf Wasserstoff elektronenabziehende Gruppen sind, wie sie in Hine, "Physical Organic Chemistry", 2. Aufl., McGraw-Hill Book Co., New York, S. 85-93 (1962), erörtert sind, wie z.B. Cyano, Nitro und Halogen, werden bevorzugt. Ein 4-Nitrobenzylrest ist ein besonders bevorzugter Rest, ebenso wie das 7-(4-Nitrobenzyl)-8-oxoguanosin ein besonders bevorzugtes Guaninderivat der Erfindung ist.
Von den obigen heteroatomsubstituierten Kohlenwasserstoffresten sind substituierte, geradkettige Alkyl- und Benzylkohlenwasserstoffreste mit einer Länge, die größer als Ethyl und kleiner als etwa Heptyl ist, bevorzugt. Aus dieser bevorzugten Gruppe sind halogensubstituiertes Alkyl, Niedrigalkoxyniedrigalkylcarbonyl, Niedrigalkylcarboxamido, in welchem der Carboxamidoteil die Formel CONR&sup5;R&sup6; hat, Niedrigalkoxyniedrigalkyl und Benzyl, dessen Phenylring durch eine in Bezug auf Wasserstoff elektronenabziehende Gruppe substituiert ist, besonders bevorzugte Reste.
Die Reste R² und R³ können gleich oder verschieden sein, und sie werden aus einer Gruppe ausgewählt, die aus Wasserstoff, Hydroxy, Niedrigalkoxy, Niedrigalkanoyloxy und Benzoxy besteht. R² und R³ zusammengenommen können auch einen cyclischen 2',3'-Niedrigalkylidendioxyrest bilden. Beispielhafte Reste R² und R³ werden nachstehend erörtert.
Niedrigalkoxyreste sind Niedrigalkylreste, die an den Guanin-Zucker-(Ribose)-Ring durch ein Sauerstoffatom des Zuckers gebunden sind. Beispielhafte Niedrigalkoxyreste umfassen Methoxy, Ethoxy, Isopropoxy, Butoxy, Hexyloxy und dgl. Niedrigalkanoyloxyreste sind Ester, die zwischen einer Hydroxylgruppe des Guanin-Zuckerringes und einer Niedrigalkylcarbonsäure gebildet worden sind. Beispiele für Niedrigalkanoyloxyreste umfassen Formoxy, Acetoxy, Propionoxy, Hexanoyloxy und dgl.
Die Niedrigalkylacetal- und -ketalderivate der 2'- und 3'- Hydroxylgruppen werden als cyclische 2',3'-Niedrigalkylidendioxy- oder einfacher als Niedrigalkylidendioxyreste bezeichnet. Diese Reste werden durch die Reaktion eines Aldehydes, wie z.B. Formaldehyd, Acetaldehyd oder dgl., oder eines Ketons, wie z.B. Aceton oder Methylethylketon, mit den 2'- und 3'-Hydroxylgruppen einer substituierten Guanosinribosylgruppe gebildet.
Es wird bevorzugt, daß R² und R³ Hydroxyl, Niedrigalkanoyloxy oder Benzoxy, und in höherem Maße bevorzugt Hydroxyl oder Acetoxy sind. Sind R² und R³ Niedrigalkanoyloxy oder Benzoxy, dann können diese Reste während oder bald nach der Stufe des Inberührungbringens mit den Leukozyten eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung verlorengehen, und sie können somit eine "Prae-Arzneimittel"-Form des Guanosinderivates ergeben. In höchstem Maße bevorzugt sind R² und R³ Hydroxyl.
R&sup4; ist ein Rest, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, Niedrigalkanoyl und Benzoyl besteht. R&sup4; ist in höchstem Maße bevorzugt Wasserstoff. Ist R&sup4; Niedrigalkanoyl oder Benzoyl, dann wird auch angenommen, daß der carboxylgruppenhältige Rest wie oben beschrieben abgespalten werden kann, wobei wiederum eine "Prae-Arzneimittel"-Form zur Verfügung gestellt wird.
Ein nützliches Guanosin ist bei physiologischen pH-Werten im wesentlichen frei von Ionenladungen; nämlich bei einem pH- Wert von etwa 7,0 bis etwa 7,5; ausgenommen diejenigen Ionenladungen, welche durch das relativ saure Ring-Stickstoffatom in der Position 1 geliefert werden könnten. Ein nützliches Molekül ist somit frei von säure- und basenhältigen Resten, welche in dem Guanosin nicht vorhanden sind. Dieses Freisein von sauren und basischen Gruppen erstreckt sich von dem Rest R¹ und durch das gesamte Guanosinmolekül.
Die Guanine sind Säuren, und als solche können sie Basenadditionssalze bilden. Solche Salze sind nützlich zum Schaffen einer Lagerungsstabilität und fügen dem in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Guaninderivat, wegen der durch das Blut und die Lymphsysteme des Wirtes oder den Puffer eines Kulturmediums bereitgestellten puffernden Wirkungen, keine zusätzlichen Ionenladungen hinzu.
Pharmazeutisch annehmbare, nichttoxische Basenadditionssalze von Guaninderivaten sind hierin nützlich und können durch Behandlung des die Immunantwort verstärkenden Mittels mit einer geeigneten Base in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. Wasser oder einem Niedrigalkylalkohol, wie z.B. Methanol oder Ethanol, gebildet werden. Beispielhafte anorganische Basen umfassen Natrium-, Kalium- und Ammoniumhydroxid und ähnliche Basen. Beispielhafte organische Basen umfassen Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS), 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) und ähnliche Basen. Umgekehrt kann die Basenadditionssalzform durch Behandlung mit Säure in die freie Guanosinform übergeführt werden.
Die hierin nützlichen, substituierten Guaninnukleosidderivate sind leicht durch in der chemischen Literatur publizierte Verfahren oder durch dazu analoge Verfahren herstellbar. Verschiedene beispielhafte Synthesen werden nachstehend in dem Abschnitt "Materialien und Methoden" zur Verfügung gestellt. Die Synthesen von 7,8-disubstituierten Guaninnukleosidderivaten beginnen typischerweise mit der bereits gebildeten 9-1'-beta- Aldoglykosidbindung, obwohl die anfängliche Bildung dieser Bindung nicht erforderlich ist.
Zusätzlich zu den beispielhaften Synthesen, die später beschrieben werden, werden drei allgemeine synthetische Modi hier kurz beschrieben. Diese Modi sind beispielhaft für die durch die Literatur zur Verfügung gestellten, synthetischen Modi und werden unter Verwendung eines 7-heteroatomsubstituierten Kohlenwasserstoff-8-Thioxoguanosins der Erfindung als herzustellender Verbindung beschrieben.
Gemäß einem ersten Modus wird ein 7-heteroatomsubstituiertes Kohlenwasserstoff-8-Thioxoguanin mit einem mit einer geeigneten alpha-1-Leaving-Gruppe substituierten Ribosederivat, beispielsweise alpha-1-Chlor(oder -Brom oder -Acetoxy)-2,3,5-tribenzoyl-D-ribose, in einem geeigneten Lösungsmittel zur Bildung des beta-Ribosylderivates umgesetzt. Die Reaktionsprodukte werden gesammelt und mittels HPLC abgetrennt, um das gewünschte Guanosinderivat zu erhalten.
Gemäß einem zweiten Modus wird 7-Allyl-8-thioxoguanosin (22444; Beispiel 20) oxidiert, um den entsprechenden Aldehyd zu bilden. Das so erhaltene 7-(2-Ethanal)-8-thioxoguanosin wird anschließend über eine Wittig-, Claisen-, Reformatsky- oder dgl. Reaktion unter Bildung eines ungesättigten 7-heteroatomsubstituierten Guanosins kondensiert, das für die Verwendung von den anderen vorhandenen Produkten abgetrennt wird, oder vor der Verwendung reduziert oder halogeniert werden kann.
Das 7-(2-Ethanal)-Derivat kann auch zur Bildung eines Niedrigalkylamin-Substituenten, aus welchem ein C&sub2;-C&sub6;-Alkylenniedrigalkylcarboxamidrest gebildet werden kann, reduzierend alkyliert werden. Noch weiterhin kann das 7-(2-Ethanal)-Derivat zu dem entsprechenden 7-(2-Ethanol)-Derivat reduziert werden, welches als solches verwendbar ist, und welches auch zur Bildung eines C&sub2;-C&sub6;-Alkylenniedrigalkylcarboxylates verestert werden kann.
Gemäß einem dritten Modus wird der Ringschluß durch eine Reaktion von Thiophosgen mit einem entsprechend substituierten 2,5,6-Triamino-4-hydroxypyrimidin verwendet. Genauer gesagt, wird ein 2-Amino-4-hydroxy-5-heteroatomsubstituiertes-Kohlenwasserstoff-6-beta-D-ribosylpyrimidin mit Thiophosgen in Gegenwart einer Säure abfangenden Base umgesetzt, um ein 7-heteroatomsubstituiertes-Kohlenwasserstoff-8-thioxoguanosinderivat bereitzustellen, das von den anderen Reaktionsprodukten für die Verwendung abgetrennt werden kann.

III. Die Zusammensetzungen

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfaßt eine Verdünnungsmittelmenge eines physiologisch tolerierbaren Trägers (der hierin auch als Vehikel oder Verdünnungsmittel bezeichnet wird) im Gemisch mit einer immunpotenzierenden (Immunantwort-verstärkenden oder immunstimulierenden) wirksamen Menge eines substituierten Guaninnukleosidderivates oder Salzes gemäß dieser Erfindung wie zuvor beschrieben.
Eine Zusammensetzung für die in-vivo-Verabreichung wird typischerweise für die orale oder parenterale Verabreichung in üblichen Dosierungseinheitszusammensetzungen zur Verfügung gestellt. Der Ausdruck "Dosierungseinheit" und seine grammatikalischen Äquivalente, so wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einzeldosis für menschliche Patienten und andere Säuger geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte wirksame Menge des aktiven Guanosinbestandteils enthält, die so berechnet ist, daß sie die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen physiologisch tolerierbaren Träger, z.B. einem Verdünnungsmittel oder einem Vehikel, ergibt. Die Spezifikationen für die neuen Dosierungseinheitsformen dieser Erfindung werden diktiert durch und sind direkt abhängig von (a) den einzigartigen Merkmalen des aktiven Guanosinderivatbestandteils und dem besonderen therapeutischen Effekt, der erreicht werden soll, und (b) den in der Natur der Sache liegenden Einschränkungen bei der Formulierung eines solchen aktiven Bestandteils für die therapeutische Verwendung in vitro sowie in vivo in Menschen und anderen Tieren.
Beispiele für geeignete Dosierungseinheitsformen im Einklang mit dieser Erfindung sind Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulverpäckchen, Granula, Oblaten und ähnliches, getrennte Vielfache der vorstehend genannten, sowie flüssige Lösungen, Emulsionen und Suspensionen. Flüssige Zusammensetzungen können auf übliche Weise verabreicht werden, beispielsweise subkutan, intraperitoneal, intramuskulär, peroral oder ähnlich.
Die Menge des Wirkstoffes, die in vivo als wirksame immunstimulierende Menge verabreicht wird, hängt vom Alter und Gewicht des Patienten, dem besonderen zu behandelnden Zustand, der Häufigkeit der Verabreichung und der Verabreichungsart ab. Der Bereich der gesamten Tagesdosis kann sich von etwa 0,01 bis etwa 200 mg pro kg Körpergewicht, in höherem Maße bevorzugt von etwa 0,1 bis etwa 25 mg pro kg Körpergewicht, und in höchstem Maße bevorzugt von etwa 1 bis etwa 15 mg pro kg Körpergewicht erstrecken. Die Dosis für menschliche Erwachsene liegt im Bereich von etwa 5 bis etwa 1400 mg täglich, die entweder als Einzeldosis oder in 3 oder 4 Teildosen gegeben werden. Veterinärmedizinische Dosen entsprechen den menschlichen Dosierungen, wobei die verabreichten Mengen im Verhältnis zum Gewicht und der Stoffwechselrate des Tieres im Vergleich zu menschlichen Erwachsenen stehen.
Der Fachmann wird anerkennen, daß nützliche in-vivo-Konzentrationen von Tierart zu Tierart variieren können. Der Fachmann weiß auch, daß geeignete Konzentrationen leicht bestimmt werden können.
Die Konzentrationen für das In-Kontakt-Bringen von Tierzellen in vitro betragen etwa 1x10&supmin;&sup6; M bis etwa 3x10&supmin;&sup4; M für Zellkonzentrationen von etwa 10&sup6;-10&sup7; Zellen pro ml. In höherem Maße bevorzugt beträgt die Konzentration etwa 1x10&supmin;&sup5; M bis etwa 1x10&supmin;&sup4; M. Wie aus dem Abschnitt "Ergebnisse" im folgenden entnommen werden kann, kann die Spitzenkonzentration, nämlich die Konzentration, die die größte Adjuvanswirkung ergibt, für ein gegebenes Guanosin um das 10-fache oder um ein noch höheres Vielfaches variieren, wenn sie in Maus- bzw. Mensch-Lymphozytensystemen untersucht wird.
Eine Zusammensetzung kann ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein. Physiologisch verträgliche Träger sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispiele für flüssige Träger sind sterile wäßrige Lösungen, die keine Materialien zusätzlich zu dem Wirkstoff Guanosinderivat und Wasser enthalten, oder die einen Puffer, wie z.B. Natriumphosphat bei physiologischem pH-Wert, physiologische Kochsalzlösung oder beides, z.B. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, enthalten. Wäßrige Träger können darüber hinaus mehr als ein Puffersalz sowie Salze, wie z.B. Natrium- und Kaliumchloride, Dextrose und andere gelöste Stoffe, enthalten. Beispiele für die letztgenannten Träger sind z.B. Ringer-Injektionslösung, Dextroseinjektionslösung, Dextrose- und Natriumchloridinjektionslösung und Ringer-Laktat-Injektionslösung.
Flüssige Zusammensetzungen können außerdem flüssige Phasen zusätzlich zu und unter Ausschluß von Wasser enthalten. Beispiele solcher zusätzlichen Phasen sind Glyzerin, pflanzliche Öle, wie z.B. Baumwollsamenöl, Sesamöl und Wasser-Öl-Emulsionen.
Beispielhafte feste Träger umfassen solche Materialien, die üblicherweise für die Herstellung von Pillen oder Tabletten verwendet werden, und schließen Maisstärke, Lactose, Dicalciumphosphat, Verdickungsmittel, wie z.B. Tragantgummi und Methylcellulose U.S.P., fein verteiltes SiO&sub2;, Polyvinylpyrrolidon, Magnesiumstearat und ähnliches ein. Zusätzlich kann der feste Träger biologisch abbaubare und biologisch nicht abbaubare Polymere, Polypeptidträger, Affinitätsträger, wie z.B. AFFI-GEL 601 (Phenylboronatharz, verfügbar von BIO-RAD Laboratories, Richmond, Kalifornien), Liposomen und synthetische Polymere, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, enthalten. Antioxidanzien, wie z.B. Methylparaben und Propylparaben, können sowohl in festen als auch in flüssigen Zusammensetzungen vorhanden sein, sowie auch Süßungsmittel, z.B. Zuckerrohr oder Rübenzukker, Natriumsaccharin, Natriumcyclamat und das Dipeptid Asparaginsäure-Phenylalaninmethylester-Süßungsmittel, das unter dem Warennamen NUTRASWEET (Aspartame) von G.D. Searle Co. verkauft wird.

IV. Verfahren zur Immunstimulierung

Ein Verfahren zum Verstärken der Immunantwort von Leukozyten ist ebenfalls umfaßt. Bevorzugt ist die Immunantwort eine Antigen-spezifische Antwort. Gemäß diesem Verfahren werden Leukozyten, wie z.B. Lymphozyten-Präparate , B-Zellen, T-Zellen, Neutrophile und Makrophagen, getrennt oder in Kombination in einem wäßrigen Medium mit einer zuvor beschriebenen Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die eine immunstimulierende wirksame Menge eines zuvor beschriebenen Guaninnukleosidderivates enthält.
Das Verfahren kann in vivo in Menschen, in Laborsäugetieren, wie z.B. Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, oder in domestizierten Tieren und Haustieren, wie z.B. Schweinen, Pferden, Rindern, Hunden und Katzen, angewendet werden. Das Verfahren kann auch in vitro in Zellkulturen, wie z.B. Hybridomenkulturen zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, praktiziert werden.
Die Leukozyten werden in einem wäßrigen Medium in Kontakt gebracht, ungeachtet der Frage, ob die Zusammensetzung des Guanosinderivates selbst ein Feststoff oder eine Flüssigkeit ist, oder ob die Flüssigkeit der Zusammensetzung wäßrig ist oder nicht. Bei dem in-vivo-Verfahren wird das wäßrige Medium wenigstens zum Teil durch das Wasser des Blutes oder der Lymphe zur Verfügung gestellt. Für in-vitro-Verfahren wird das wäßrige Medium wenigstens zum Teil durch das verwendete Kulturmedium zur Verfügung gestellt.
Der Kontakt zwischen der Zusammensetzung und den Leukozyten wird für einen Zeitraum aufrechterhalten, der für die in Kontakt gebrachten Zellen ausreichend ist, um die Steigerung ihrer Immunantwort zu manifestieren. Diese Immunstimulation kann sich in zellulärer Proliferation, verstärkter Antikörpersekretion, verstärkter T-Helferzellenaktivität, verstärkter Zytokinerzeugung von T-Zellen und Makrophagen, Enzymausekretion aus Neutrophilen und ähnlichem manifestieren.
Die im folgenden erörterten, spezifischen Ergebnisse veranschaulichen nichtspezifische, mitogene Antworten von Mäuse- Milz-Zellen, sowie die bevorzugten Antigen-spezifischen Antworten von Mäuse-B-Zellen und menschlichen peripheren Blutlymphozyten, die frei von T-Suppressorzellen sind. Zusätzliche, veranschaulichende, antigenspezifische Immunverstärkungen, die unter Anwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens erzielt werden können, umfassen eine Proliferation von T-Zellen, die in-vitro- Rekonstitution der primären Immunantwort in immundefekten Mäuse-B-Zellen, die T-Zell-ersetzende Aktivität in Mäuse-B-Zellen, und eine in-vivo-Verstärkung der Mäuse-Antikörpererzeugung.
Für die Verwendung in vivo wird der Kontakt zwischen den Leukozyten und einer Zusammensetzung typischerweise für einen Zeitraum aufrecht erhalten, der für das Tier ausreichend ist, um das Guanosinderivat aus seinem Körper zu entfernen, z.B. durch Stoffwechsel, Ausscheidung oder beide Prozesse. Dieser Zeitraum kann länger als der für eine Manifestierung der Immunstimulation erforderliche sein. Der Kontakt mit einer einzelnen Dosiseinheit wird - für eine gegebene Verbindung - in Abhängigkeit von dem verwendeten Träger oder Vehikel - typischerweise über einen Zeitraum von Stunden bis ungefähr eine Woche oder mehr aufrechterhalten. Ein kontinuierlicher Kontakt kann für einen immundefekten tierischen Wirt vorteilhaft sein.
Der Kontakt in vitro kann über einen Zeitraum aufrechterhalten werden, der dafür ausreicht, daß sich eine der zuvor beschriebenen Immunstimulationen manifestiert, was durch Standardtestverfahren bestimmt wird. Solche Aufrechterhaltungszeiten brauchen typischerweise etwa einen bis sieben Tage Zeit, und gewöhnlicher etwa zwei bis etwa 6 Tage.

V. Ergebnisse

Unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren sind spezielle Ergebnisse erhalten worden, und diese Ergebnisse sind oft mit ähnlichen Ergebnissen verglichen worden, die unter Verwendung der in der US-PS 4 643 992 offenbarten Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren erhalten worden sind. Einige der in der US-PS 4 643 992 verwendeten Verbindungen wurden hierin für Vergleichszwecke benützt. Diese Verbindungen sind 8-Mercaptoguanosin, 7-Methyl-8- oxoguanosin und 8-Bromguanosin, und sie werden hierin als 8MGuo, 7m8oGuo bzw. 8BrGuo abgekürzt.
Die im folgenden erörterten Ergebnisse wurden unter Verwendung einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Verbindungen erhalten, und zwar wenn nicht anders angegeben, in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird. Im Sinne der Kürze und leichten Verständlichkeit der Beschreibung wird im folgenden nur auf die Verbindungen Bezug genommen, wobei das so zu verstehen ist, daß diese Verbindungen in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren verwendet werden.
Jede der neuen Verbindungen, deren Aktivität hierin erörtert oder verglichen worden ist, hat außerdem eine identifizierende fünfstellige Zahl erhalten. Diese Zahlen sind im Titel des Beispiels aufgeführt, das die Herstellung der Verbindung beschreibt. Die fünfstellige Zahl und/oder die Nummer des Beispiels wird in den folgenden Tabellen und der nachstehenden Erörterung verwendet, um diese Verbindungen zu identifizieren.

A. Aktivitäten 8-substituierter Guanosine

Wie zuvor erwähnt, wurde die Adjuvanswirkung und Mitogenität einer Reihe nicht-erfindungsgemäßer 8-substituierter Guanosine mit Thioethern unterschiedlicher Länge untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Tabellen 1 und 2, unten, gezeigt, wobei horizontale Linien über die ganze Tabelle zur Unterscheidung verschiedener Untersuchungen voneinander verwendet werden. Tabelle 1 Antigenspezifische Adjuvanswirkung von 8-Thioetherguanosinen 1) Direkt Anti-SRBC-PFC/Kultur4) Verbindung2) Konzentration3) Kontrolle Kein Nukleosid Antigen voranden Kein Antigen
1) Adjuvanswirkung gegen rote Blutzellen aus Schafen (SRBC), gemessen in direkt plaquebildenden Kulturen pro Lymphozytenzellkultur aus den gezeigten Mäusestämmen. Einzelheiten des Verfahrens sind in dem Abschnitt "Materialien und Methoden" erklärt. Standardabweichungen von den angegebenen Mittelwerten sind durch "± Zahl" angezeigt.
2) Die Nukleoside sind durch ihre fünfstelligen Zahlen identifiziert, und die Nummer des Beispiels, in der ihre Herstellung gezeigt ist, ist in Klammern angegeben.
3) Konzentration des Nukleosids in Mol pro Liter in dem wäßrigen Medium, in dem die Lymphozyten in Kontakt gebracht wurden.
4) Es wurden Lymphozyten aus den Inzucht-Mäuselinien CBA/CaJ oder C57BL6/J verwendet. Tabelle 2 Mitogenität von 8-Thioetherguanosinen1) Verbindung2) Konzentration3) [³H] TdR-Aufnahme (cpm/Kultur) Kontrolle Kein Nukleosid
1) Mitogenität, gemessen durch Aufnahme von [³H]TdR (Tritium-markiertem Thymidindesoxyribonukleosid), bestimmt durch Messen der Zählimpulse pro Minute (cpm) pro Zellkultur unter Anwendung der im Abschnitt "Materialien und Methoden" erörterten Bedingungen. Die Standardabweichungen sind wie in Tabelle 1 gezeigt.
2),3) Siehe die Anmerkungen 2 und 3 bei Tabelle 1.
Die oben angegebenen Ergebnisse veranschaulichen, daß mit zunehmender Länge des Substituenten die Aktivität des 8-substituierten Guanosinderivates im Verhältnis zu 8MGuo, dessen 8- Schwefelatom nur an ein Wasserstoffatom gebunden war, abnahm. Die Antigen-spezifische Adjuvanswirkung des 8-(2-Butenyl)derivates (22435) war daher größer als die des längeren 8-Cinnamylderivates (22359), aber geringer als die der 8-Mercaptoverbindung (8MGuo). Das 8-Allylderivat (22300) hatte bei den gezeigten Konzentrationen eine ungefähr gleiche Adjuvanswirkung wie 8MGuo. Die Ergebnisse für die Mitogenität der gleichen Verbindungen zeigten einen sogar noch ausgeprägteren Trend bei den Aktivitäten, wobei zunehmend längere 8-Substituenten zunehmend schlechtere Ergebnisse brachten.

B. Adjuvanswirkung und Mitogenität müssen nicht miteinander in Beziehung stehen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren sind für die Verstärkung mitogener und polyklonaler Antworten und für die Adjuvanswirkung nützlich, so wie es die Verbindungen sind, deren Aktivitäten in den Tabellen 1 und 2 gezeigt werden. Es wird angenommen, daß die mitogene Wirkung und die Adjuvanseigenschaften der vorliegenden Verbindungen sich aus wenigstens zwei verschiedenen Wegen ergeben, wobei Mitogenese und eine polyklonale Antwort oft gleichzeitig auftretende Ergebnisse sind, während die Ergebnisse für die Adjuvanswirkung sich häufig unterscheiden. Siehe beispielsweise Goodman et al., J. Exp. Med., 147:800 (1978), und McIntire et al., J. Immunol., 117:674 (1976). Einige ähnliche Unterschiede sind in der US-PS 4 643 992 erörtert.
Diese Entkopplung der Aktivitäten zeigt sich ebenso für einige der hier erörterten Verbindungen, wie aus den Ergebnissen der Tabellen 3 und 4, unten, ersehen werden kann. Tabelle 3 Antigen-spezifische Adjuvanswirkung einiger 7-heteroatomsubstituierter Kohlenwasserstoff-8-Oxoguanosine im Humansystem1) Verbindung2) Konzentration3) PFC/Kultur Kontrolle Kein Nukleosid Kein Antigen Antigen vorhanden
1) Die Untersuchungen wurden auf ähnliche Weise wie die von Tabelle 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß ein Human- Lymphozytenpräparat verwendet wurde.
2),3) Siehe die Anmerkungen 2 und 3 zu Tabelle 1. Tabelle 4 Mitogenität einiger 7-heteroatomsubstituierter 8-Oxoguanosine im Humansystem1) Verbindung2) Konzentration3) [³H] TdR-Aufnahme (cpm/Kultur) Kontrolle Kein Nukleosid[3H] TdR-Aufnahme
1),2),3) Siehe die Anmerkungen 1, 2 und 3 von Tabelle 2.
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß 7-(3-Dimethylamino)propyl-B-oxoguanosin (22943) im Vergleich zu 7-Carbethoxymethyl-8-oxoguanosin (22935) in einem Mäusesystem (Tabelle 4) mitogen war. Die aminhältige Verbindung (22943) zeigte jedoch eine Aktivität, die etwa gleich groß wie jene war, die von einer der Kontrollen (kein Nukleosid + Antigen) gezeigt wurde, wenn die gleichen Verbindungen unter Verwendung von Human-Lymphozyten auf ihre Adjuvanswirkung geprüft wurden (Tabelle 3).
Die obigen Ergebnisse bestätigen weiterhin, daß die Mitogenität und die Adjuvanswirkung nicht notwendigerweise miteinander verbunden sind und auf verschiedenen Wegen fortschreiten können. Diese Ergebnisse veranschaulichen auch das Fehlen einer Adjuvanswirkung bei Verbindungen, welche ansonsten nützliche Strukturelemente enthalten, z.B. den Guanosinring, eine 8-Oxogruppe und einen 7-heteroatomsubstituierten Kohlenwasserstoffrest, der länger als Ethyl aber kürzer als Decyl ist, der aber bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung trägt, welche Ionenladung hier auf die Dimethylaminogruppe zurückzuführen ist.
Bemerkt sei weiterhin, daß zwar die Mitogenität und die Adjuvanswirkung in vitro in dem Mäusesystem nachgewiesen werden können, daß aber in vitro, in dem Humansystem, unter Verwendung irgendeiner der hierin erörterten Verbindungen, nur die Adjuvanswirkung beobachtet worden ist.

C. Adjuvanswirkungsuntersuchungen

Eine Anzahl von Vergleichen der Adjuvanswirkung gegenüber den SRBC unter Verwendung humaner und Mäuse-Lymphozyten als Leukozytenquelle sind unter Verwendung erfindungsgemäßer Verbindungen sowie mit neuen Verbindungen, die von der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen sind, durchgeführt worden. Wegen der Unterschiede bei den Lymphozytenantworten sogar von Inzuchtmäusen, ganz abgesehen von denen der nicht inzüchtigen Humanpopulation, können diese Ergebnisse leider nur sehr schwer genau miteinander verglichen werden. Sie können vielmehr am besten innerhalb einer gegebenen Untersuchung mit solchen Verbindungen verglichen werden, die in der gleichen Untersuchung verwendet werden, und mit den Kontrollen jeder Untersuchung. In den nachstehenden Tabellen 5 und 6 werden beispielhafte Daten von solchen Untersuchungen zur Verfügung gestellt, in denen nur die Aktivität bei der Spitzenkonzentration für jede Verbindung gezeigt wird. Die Ergebnisse jeder Untersuchung werden von denen anderer durch eine horizontale Linie quer über die Tabelle unterschieden. Tabelle 5 Adjuvanswirkungsuntersuchungen im Mäusesystem1) Verbindung2) Spitzenkonzentration3) Direkt Anti-SRBC-PFC/Kultur Kontrolle Kein Nukleosid Kein Antigen Antigen vorhanden Kontrolle Kein Nukleosid Kein Antigen Antigen vorhanden 1),2) Siehe die Anmerkungen 1 und 2 von Tabelle 1.
3) Der angegebene Wert ist die Konzentration, die die größte Anzahl von Plaques pro Kultur in einer gegebenen Untersuchung ergibt.
a,b) Es wurden zwei Untersuchungen ("a" und "b") durchgeführt, wobei die Ergebnisse dieser Untersuchungen "a" und "b" ebenso bezeichnet wurden.
Die Ergebnisse in der obigen Tabelle veranschaulichen verschiedene Punkte. Erstens sind die erfindungsgemäßen Verbindungen generell aktiver als die in der US-PS 4 643 992 offenbarten Verbindungen. Diese Verbesserung bei der Aktivität manifestierte sich entweder in der Konzentration, bei der die Spitzenadjuvanswirkung beobachtet wurde (Spitzenkonzentration), die um etwa 0,5 bis 1 Logeinheiten (Zehnerpotenzen) niedriger war, oder in einer Adjuvanswirkung bei einer gegebenen Spitzenkonzentration, die signifikant höher, gewöhnlich um mindestens etwa 100 Prozent höher, als diejenige war, die von einer Verbindung jenes Patentes aufgewiesen wird. Die verbesserte Adjuvanswirkung kann z.B. dort ersehen werden, wo 8BrGuo mit 7-(2- Chlorethyl)-8-oxoguanosin (24599) verglichen wurde, wo beide Verbindungen eine ähnliche Anzahl von Plaques pro Kultur hatten, das 2-Chlorethylderivat diesen Wert jedoch bei einer um 1,5 Logeinheiten (etwa 30-mal) niedrigeren Konzentration aufwies.
Die obigen Daten für das 7m8oGuo und das 7-(2-Hydroxy-3- azido)propylderivat (24670) scheinen wenigstens zwei Anomalien zu enthalten. Der Peak für das 7m8oGuo trat bei einer ungewöhnlich niedrigen Konzentration in Erscheinung, und der Wert für die PFC/Kultur scheint gegenüber den gewöhnlich beobachteten Werten etwas erhöht zu sein. Der Wert für die PFC/Kultur für die Verbindung 24670 scheint auch etwas niedrig zu sein.
Die Ergebnisse in der Tabelle 5 veranschaulichen auch die nicht annehmbaren Ergebnisse, die mit den ansonsten neuen und nicht-naheliegenden Verbindungen erhalten wurden, die aus dieser Erfindung ausgeschlossen sind. Beispielhafte, ausgeschlossene Verbindungen umfassen 7-[2-(1-Piperidino)ethyl]-8-oxoguanosin (23090), 7-[3-(3,4-Dimethoxyphenylamino)-2-hydroxy]propyl-8-oxoguanosin (24364), 7-[3-(Dimethylamino)propyl]-8-oxoguanosin (22943) und 7-Carboxymethyl-8-oxoguanosin (23642), welche dem Molekül bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung verschaffen.
Bemerkt sei, daß die beiden letztgenannten Verbindungen (22943 und 23642) in dem Mäusesystem offensichtlich eine hohe Anzahl von Plaques ergaben. Diese relativ hohen Zahlen von Plaques wurden jedoch bei Konzentrationen (3x10&supmin;&sup4;M) geschaffen, welche relativ zu hoch waren, um nützlich zu sein, und sie sind vermutlich auf die nichtionisierten Teile jener Moleküle zurückzuführen, welche im Gleichgewicht ebenfalls vorhanden sind. Außerdem ist aus den Daten der Tabelle 6 zu ersehen, daß die Verbindung 22943 bei der gleichen, relativ hohen Konzentration im Humansystem im wesentlichen inaktiv war.
Es sei auch auf die Ergebnisse für das 7-[3-(4-Fluorphenyl)piperazinyl-2-hydroxypropyl]-8-oxoguanosin (24455) sowie für die oben erörterte Verbindung 24364 aufmerksam gemacht. Es wurde gefunden, daß jede dieser zwei Verbindungen bei den in den Untersuchungen angewendeten Konzentrationen im wesentlichen unwirksam war. Jede enthält auch einen 7-heteroatomsubstituierten-Kohlenwasserstoff-Substituenten-Rest, der länger als eine Decylgruppe ist. Diese zwei Verbindungen enthalten auch Aminogruppen, welche bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung aufweisen würden. Das 7-[2-Hydroxy-3-(phenylthio)propyl]-8-oxoguanosin (24331), dessen 7-Heteroatom-Substituent ein wenig länger als Octyl ist, zeigte ein relativ niedriges Ausmaß von Aktivität.
Die in der nachstehenden Tabelle 6 angeführten Ergebnisse wurden in ähnlicher Weise wie jene der Tabelle 5 unter Verwendung von Human-Lymphozyten statt Leukozyten aus Mäusen erhalten. Tabelle 6 Untersuchungen der Adjuvanswirkung im Humansystem1) Verbindung2) Spitzenkonzentration3) Direkt Anti-SRBC-PFC/Kultur Kontrolle Kein Nukleosid Kein Antigen Antigen vorhanden
1),2),3) Siehe die Anmerkungen 1, 2 und 3 zu Tabelle 5.
a,b,c) Beispielhafte Ergebnisse aus drei Untersuchungen unter Verwendung von 7m8oGuo mit Lymphozytenpräparaten aus drei mit a, b und c bezeichneten Personen. Die Vergleiche zwischen den Verbindungen werden daher innerhalb eines gegebenen Lymphozytenpräparates angestellt. Die mit "a" bezeichneten Ergebnisse sind mit sich selbst zu vergleichen, ebenso die mit "b" und die mit "c" bezeichneten.
Die Ergebnisse in Tabelle 6 zeigen wiederum die gesteigerte Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen im indirekten Vergleich zu 7-Methyl-8-oxoguanosin im Humansystem. Diese Ergebnisse zeigen wiederum, daß eine Verbindung, welche bei physiologischen pH-Werten eine Ionenladung ergibt, wie z.B. 7-(3-Dimethylamino)propyl-8-oxoguanosin (22943), im Vergleich zu den anderen Verbindungen der Erfindung im wesentlichen wirkungslos ist.
Die indirekte, aber große Verstärkung der Adjuvanswirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen [22935, 23756 und 23890] gegenüber dem 7m8oGuo in dem Humansystem, und zwar sowohl hinsichtlich der Größe der Antwort als auch der kleineren Dosierung, die zur Erzeugung dieser Antwort erforderlich ist, veranschaulicht weiterhin die Wirksamkeit der Verwendung von 7- heteroatomsubstituierten-Kohlenwasserstoff-Substituenten, deren Substituentenlänge größer als Ethyl, aber kleiner als Decyl ist.
Noch eine andere unerwartete Eigenschaft der in höherem Maße bevorzugten Verbindungen, nämlich jener Verbindungen, worin R¹ länger als Ethyl und kürzer als Decyl ist, und worin die Ribosylgruppe unsubstituiert ist, besteht darin, daß die Dosis-Antwortkurve nahe der Spitzenkonzentration breiter als eine ähnliche für 7m8oGuo erhaltene Kurve ist. Diese breitere Antwort kann aus den Einzelwerttabellen, oben, nicht ersehen werden.
Ein Maß für die relative Breite kann durch Summieren der durchschnittlichen Anzahl von Plaques (PFC/Kultur), die bei einer Konzentration vorgefunden werden, die sich in einem Abstand von einer halben Log-Einheit von jener Konzentration betindet, welche den Spitzenwert erzeugte, und jener der PFC/Kultur bei der Spitzenkonzentration, erhalten werden. Die so erhaltene Summe wird dann durch zwei (die Zahl der summierten Werte) geteilt, um den durchschnittlichen 1/2-log-Plaquewert zu ergeben.
Insbesondere werden einzelne, mittlere Plaquewerte ausgewählt, und der Hintergrundswert, bei dem SRBC allein anwesend waren, wird von jedem Wert, bevor er summiert wird, abgezogen, um "Netto"-Werte zu erzielen. Jeder Nettowert wird durch die Anzahl der in 1 ml Kultur vorhandenen Mikromole Nukleosid (Molkonzentration/10&supmin;³) dividiert, um die PFC/Kultur/Mikromol zu erhalten. Die zwei größten, so erhaltenen Werte, welche den Spitzenkonzentrationswert und einen Wert umfassen, der um eine halbe log-Einheit daneben liegt, werden ausgewählt, summiert und durch zwei dividiert, um den durchschnittlichen 1/2-log- Wert pro Mikromol zu erhalten.
Werden Berechnungen wie die obigen für die ansonsten unzusammenhängenden Untersuchungen der Tabelle 6 angestellt, dann bindet man, daß die durchschnittlichen 1/2-log-Plaquewerte pro Mikromol für die erfindungsgemäßen Verbindungen viel größer als der Wert für 7m8oGuo sind. Die so berechneten Werte sind in der nachstehenden Tabelle 7 angeführt. Ähnliche Ergebnisse erhält man für das Mäusesystem. Tabelle 7 Durchschnitts-1/2-log-Plaquewerte1) in den Humansystemen Verbindung2) Wert
1) Die Werte wurden wie oben beschrieben unter Verwendung der Daten erhalten, welche den in der Tabelle 6 dargestellten Ergebnissen zugrundeliegen.
2) Siehe die Anmerkung 2 von Tabelle 1.
a,b,c) Siehe die Tabelle 6.
Obwohl die in der Tabelle 7 dargestellten Ergebnisse nicht direkt vergleichbar sind, weil sie aus getrennten Untersuchungen erhalten worden sind, so sind die Unterschiede in den berechneten Werten doch so groß, daß angenommen wird, daß dieselben signifikant sind.
Eine Dosis-Antwortkurve kann zu eng sein und daher keine geeignete Dosierung für einen besonderen Empfänger erlauben. Beispielsweise zeigen die Daten für das Humansystem in Tabelle 6 so große Unterschiede wie solche um Faktoren von drei bis zehn (eine halbe bis eine Logeinheit) bei der Spitzenkonzentration der untersuchten Verbindungen, wenn Lymphozytenpräparate aus verschiedenen Individuen verglichen wurden. Wären die Dosis-Antwortkurven zu eng, dann könnte eine ausgewählte, für Empfänger übliche Dosierung im allgemeinen zu hoch oder zu niedrig für einen speziellen Empfänger sein. Die verbreiterten Dosis-Antwortkurven für die bevorzugten Verbindungen bieten daher einen weiteren Vorteil im Vergleich zu 7m8oGuo.

D. T-Zellen-ersetzende Aktivität

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann dazu verwendet werden, T-Zellen in der Antikörperantwort auf ein T-abhängiges Antigen zu ersetzen. Hierzu wurden Mäuse-B-Zellen, die in vitro durch Behandlung mit monoklonalem Anti-thy-1,2 plus Komplement erzeugt worden waren, mit oder ohne SRBC als Antigen in Gegenwart von Zusammensetzungen, die zunehmende Konzentrationen eines 7-heteroatomsubstituierten-Kohlenwasserstoff-Substituenten-Guanosinderivates enthielten, kultiviert.
Unter diesen Bedingungen reagieren isolierte B-Zellkulturen schlecht auf Antigen, sofern sie nicht mit einem erfindungsgemäßen Guanosinderivat ergänzt worden sind. Die Guanosinmodulierte Antwort ist sowohl dosisabhängig als auch antigenabhängig. Somit verschafft das Inberührungbringen von B-Zellen in vitro mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung diesen in Kontakt gebrachten Zellen ein T-Zellen-ähnliches Signal.

E. In vitro-Rekonstitution der primären humoralen Immunantwort

CBA/N-Mäuse haben einen X-Chromosomen-gebundenen (X-gebundenen) primären B-Zellen-Immundefekt und können daher ein Mäuse-Modell für geschlechtsgebundene Immundefekte bereitstellen. Vom CBA/N-Stamm wird angenommen, daß er hinsichtlich der funktionalen Aktivität einer Subpopulation der reifen B-Lymphozyten, die die Lyb 3/5/7-Antigene tragen, defekt ist. Siehe Huber et al., J. Exp. Med., 145:1 (1977); Ahmed et al., J. Exp. Med., 145:101 (1977); und Subbaro, J. Immunol., 122:2279 (1979).
Kulturen von Milzzellen aus männlichen und weiblichen homozygoten CBA/N-Mäusen und männlichen Mäusen, die für das CBA/N-Gen, das das xid-Gen genannt wird, heterozygot waren (männliche Mäuse tragen das X-Chromosom), werden wie im Abschnitt "Materialien und Methoden" beschrieben hergestellt. 0,1 ml einer 0,1%igen (Vol./Vol.) SRBC-Suspension allein oder der SRBC-Suspension plus zunehmender Mengen eines erfindungsgemäßen Guanosins werden den Kulturen zugegeben, wobei 5x10&sup6; Zellen/ml verwendet werden. Die direkt Anti-SRBC-Plaque-bildenden Kulturen pro Kultur werden nach 4 Tagen des Kultivierens beurteilt.
Bei Verwendung eines ähnlichen Präparates von Milzzellen aus immunkompetenten CBA/CAJ-Mäusen zeigt es sich, daß bei der Konzentrationshöhe des Guanosinderivates von Null im wesentlichen keine Antwort für die CBA/N-Zellen vorhanden war, verglichen mit einer positiven PFC/Kultur-Antwort für die immunkompetenten CBA/CaJ-Zellen.
Bei Konzentrationen von etwa 10&supmin;&sup4; - 10&supmin;&sup5; M für das Guanosinderivat werden sowohl die immunkompetenten CBA/CaJ-Zellen als auch die ursprünglich immuninkompetenten CBA/N-Zellen in die Lage versetzt, signifikante Zahlen von PFC/Kultur zu erzeugen. Somit kann durch das Inberührungbringen der X-gebundenen, immundefekten Milzzellen mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung die primäre humorale Immunantwort auf SRBC für diese ansonsten immundefekten Zellen wiederhergestellt werden.
Immundefekte sowohl bei Mäusen als auch bei anderen Säugetieren können sowohl eine Folge des Alters oder des Alterns sein als auch, wie oben erörtert, durch genetische Defekte hervorgerufen werden. Daher können Tiere, die als Jugendliche oder Erwachsene immunkompetent waren, mit Erreichen eines hohen Alters immundefekt werden. Dies ist der Fall für den Inzuchtmäusestamm CBA/CaJ.
Eine weitere Untersuchung der Rekonstitution einer primären humoralen Antikörperantwort gegen SRBC wird unter Verwendung von Milzzellen aus alternden, 156 Wochen alten CBA/CaJ- Mäusen, die durch das Alter immundefekt geworden sind, durchgeführt. Die in vitro-Antworten dieser Milzzellen auf SRBC in einem Plaque-Bildungstest werden mit ähnlichen Antworten von Zellen aus einer anderen Gruppe gesunder, erwachsener 8 Wochen alter CBA/CaJ-Mäuse verglichen. Dieser Vergleich wird, wie oben beschrieben, durchgeführt, wobei wiederum eine ein erfindungsgemäßes Guanosin enthaltende Zusammensetzung zum In-Kontakt- Bringen mit den Milzzellen verwendet wird.
Die PFC/Kultur für die gesunden, adulten Mäusekontrollen, die SRBC, jedoch kein Guanosinderivat enthielten, betragen ein Mehrfaches der in Abwesenheit von sowohl SRBC als auch Guanosin gebildeten Zahl. Die PFC/Kultur der Kontrollen für die alternden Mäuse sind ungefähr gleich für beide Kontrollen, und erhöht im Vergleich zu jenen von gesunden Erwachsenen. Es wird angenommen, daß diese relativ erhöhten und ähnlichen Antworten auf die Bildung von Autoantikörper-erzeugenden Klonen zurückzuführen sind.
Es wird eine von der Dosis des Guanosinderivates abhängige Antwort auf SRBC beobachtet. Diese Antwort wird sowohl für die immunkompetenten, gesunden erwachsenen Milzzellen als auch für die zuvor immundefekten, aber nunmehr im Sinne einer primären humoralen Antwort rekonstituierten, alternden Milzzellen beobachtet. Solche Ergebnisse zeigen somit an, daß das In-Kontakt- Bringen immundefekter, alternder Milzzellen mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung diese defekte Immunantwort rekonstituieren kann.

F. In vivo-Antikörperantworten

CBA/CaJ-Mäuse werden intraperitoneal (i.p.) unter Verwendung eines Konjugates (TNP-BSA), das durch Reaktion von 2,4,6- Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) und Rinderserumalbumin (BSA) in 0,28 M Cacodylatpuffer bei pH 6,9 hergestellt worden ist, immunisiert. Jedes Tier erhält eine intraperitoneale (i.p.) Injektion, die 50 ug des immunisierenden Konjugates enthält. Eine Gruppe von Mäusen erhält danach (innerhalb von etwa 30 Minuten) eine weitere i.p. Injektion, welche ein Guanosinderivat der Erfindung in entweder 100%igem Sesamsamenöl oder einer wäßrigen Zusammensetzung enthält, die ihrerseits 2 Vol.-% Sesamsamenöl, schallbehandelt mit Kochsalzlösung, enthält. Jedes Tier erhält 0,2 ml des Guanosinderivates aus den Zusammensetzungen, deren Konzentration an dem Guanosinderivat jeweils 5 mg/ml beträgt. Eine dritte Gruppe von Mäusen erhält die Immunisierung, aber keine erfindungsgemäße Zusammensetzung, und dient als Kontrolle. Die Anti-TNP-BSA-Antikörperabsonderung jeder Gruppe wird anschließend über einen Zeitraum von etwa 30 Tagen unter Anwendung von Enzym-gebundenen Standard-Immunadsorptionstestverfahren (ELISA) unter Verwendung von TNP-BSA als Antigen überwacht.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen an, daß jene Tiere, welche ein Guanosinderivat der Erfindung erhielten, erhöhte Anti-TNP-BSA-Antikörper-Titer im Vergleich zu den Titern aus Tieren zeigten, welche kein Guanosinderivat erhielten.
Nachdem diese Erfindung im allgemeinen beschrieben worden ist, kann ein weiteres Verständnis unter Bezugnahme auf die Synthesen und Verfahren, die nachstehend zum Zwecke der Veranschaulichung angeführt werden, erzielt werden.

VIII. Materialien und Methoden

A. Synthesen

Beispiel 1: Allgemeines Verfahren zur Herstellung von 7-heteroatomsubstituierten Kohlenwasserstoff-8-oxoguanosinen

1-Amino-8-oxoguanosin (im folgenden als Verbindung A bezeichnet) diente als Ausgangsmaterial für verschiedene Synthesen, bei denen ein zweistufiges Verfahren angewendet wurde. Dieses Material wurde im wesentlichen nach dem von Rizkalla et al., Biochim. Biophys. Acta., 195:285-293 (1969), beschriebenen Verfahren hergestellt.

Stufe 1:

Zu einer Lösung der Verbindung A [9,5 g, 30 mM] in Dimethylformamid (DMF) wurde Natriummethoxid (33 mM) in 250 ml DMF zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur (etwa 18-22ºC) während 30 min gerührt. Eine DMF-Lösung (10 ml), welche das Alkylierungsmittel, das zur Bildung des 7-Substituenten verwendet wurde, in einem leichten molaren Überschuß über die Verbindung A (z.B. 33 mM vs. 30 mM) enthielt, wurde hinzugefügt, und das so entstandene Alkylierungsreaktionsgemisch wurde während eines Zeitraumes von etwa 16 Stunden bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40ºC gerührt.
Das Lösungsmittel wurde anschließend im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit destilliertem oder entionisiertem Wasser (150 ml) und Methylenchlorid (150 ml) behandelt. Der erhaltene Feststoff wurde filtriert und aus einem geeigneten Lösungsmittel umkristallisiert, um ein 1-Amino-7-substituiertes 8-Oxoguanosin zu erhalten und die "Stufe 1" des gewöhnlich angewendeten, zweistufigen Syntheseverfahrens zu vervollständigen.

Stufe 2:

Das Produkt der Stufe 1 wurde anschließend in konzentrierter HCl (z.B. 4,65 mM in 15 ml HCl), zu der wäßriges Natriumnitrit hinzugefügt worden war (z.B. 4,19 mM in 5 ml Wasser), bei Null ºC gelöst, wonach während etwa 1 h gerührt wurde. Das so entstandene, entaminierte Produkt wurde anschließend nach Standard-Kristallisationsverfahren erhalten, sofern nichts anderes angegeben ist.
Die Herstellung von spezifischen, beispielhaften Verbindungen unter Anwendung des obigen zweistufigen Verfahrens und anderer Verfahren sowie weitere Synthesen sind nachstehend beschrieben.

Beispiel 2: 7-Carbethoxymethyl-8-oxoguanosin (22935)

Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde nach dem zweistufigen Verfahren des Beispiels 1 hergestellt, in welchem Ethylbromacetat als Alkylierungsmittel der Stufe 1 verwendet wurde, und sie wurde aus der entsprechenden 1-Aminoverbindung in einer Ausbeute von 10% als weißes Pulver erhalten; F. 167-172ºC. NMR (DMSO-d) 10,9 (bs, 1H); 6,5 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H). IR (KBr): 1680, 1620 und 1420 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub9;N&sub5;O&sub8;-1/2 H&sub2;O:
C 42,64; H 5,11; N 17,76
Gefunden: C 42,44; H 4,71; N 17,73.
Durch Ersatz des Ethylbromacetates durch 2-Chloracetamid oder ein N-Kohlenwasserstoff- oder N-Alkanol-substituiertes 2- Chloracetamid in der obigen Umsetzung erhält man das entsprechende 7-Carboxamidomethyl-8-oxoguanosin (oder das entsprechende, substituierte Amid, dessen Carboxamido-Gruppe die Formel CONR&sup5;R&sup6; hat, worin R&sup5; und R&sup6; wie oben beschrieben sind). In ähnlicher Weise führt der Ersatz des Ethylbromacetates durch einen geeigneten Halogenether, wie z.B. 2-Bromethylmethylether oder 2-Bromethylphenylether (beta-Bromphenetol), zu den entsprechenden 7-Methoxyethyl- bzw. -phenoxyethylderivaten.

Beispiel 3: 7-Carboxymethyl-8-oxoguanosin (23642)

Ein Gemisch aus 7-Carbethoxymethyl-8-oxoguanosin (1 g, 2,6 mM; Beispiel 2), Methanol (5 ml) und 1N NaOH (5 ml) wurde bei Raumtemperatur unter N&sub2; während 4 h gerührt. Das meiste Methanol wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Wasser (50 ml) erhitzt. Die Lösung wurde mit 1N HCl bei 0ºC auf einen pH-Wert von 5 angesäuert. Das Reaktionsprodukt wurde durch präparative Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie an einer C-18-Säule (HPLC) gereinigt, wobei die in der Überschrift angegebene Verbindung als weißes Pulver in einer Ausbeute von 31% erhalten wurde; F. über 230ºC. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 10,9 (bs, 1H); 6,5 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H); 4,4 (bs, 2H). IR (KBr): 1640, 1600 und 1460 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub5;N&sub5;O&sub8;:
C 40,34; H 4,23; N 19,60
Gefunden: C 35,71; H 3,52; N 17,37.

Beispiel 4: 7-[3-(Dimethylamino)propyl]-8-oxoguanosin-Monohydrochloriddihydrat (22943)

Man verfährt nach dem Zweistufenverfahren des Beispiels 1, wobei 3-N,N-Dimethylaminopropylchlorid-Hydrochlorid als Alkylierungsmittel verwendet wurde, Kaliumcarbonat als Base verwendet wurde, und das entaminierte Produkt mit 1 Äquivalent HCl in 2-Propanol behandelt wurde. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde aus der 1-Aminoverbindung in einer Ausbeute von 40% als weißes Pulver vom F. 180ºC (Zers.) rückgewonnen. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 2,7 (s, 6H); 5,57 (d, J=5Hz, 1H); 6,91 (bs, 2H); 10,70 (bs, 1H); 11,31 (bs, 1H). IR (KBr): 1670, 1625 und 1590 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub4;N&sub6;O&sub6;-HCl-2H&sub2;O:
C 39,43; H 6,40; N 18,40
Gefunden: C 39,31; H 6,15; N 18,07.

Beispiel 5: 7-[2-(Piperidino)ethyl]-8-oxoguanosin-Monohydrochloridmonohydrat (23090)

Man verfährt nach der Verfahrensweise des Beispiels 4, wobei aber 2-Piperidinoethylchlorid als Alkylierungsmittel verwendet wurde, und wobei die in der Überschrift angegebene Verbindung aus der 1-Aminoverbindung als blaß-gelbes Pulver in einer Ausbeute von 34% erhalten wurde; F. 157ºC (Zers.). NMR (DMSO-d&sub6;): δ 6,65 (bs, 2H); 9,97 (br, 1H); 11,22 (bs, 1H). IR (KBr): 1700, 1670, 1620 und 1590 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub6;N&sub6;O&sub6;-HCl-H&sub2;O:
C 43,92; H 6,29; N 18,08
Gefunden: C 43,99; H 6,39; N 17,93.

Beispiel 6: 8-(2-Propenylmercapto)guanosin (22300)

Allylbromid (8g, 63,5 mM) wurde zu einem Gemisch aus 8- Thioxoguanosin (8MGuo; 20 g, 63,5 mM) und Kaliumcarbonat (10 g, 72 mM) in Dimethylformamid (DMF) (300 ml) zugegeben, und das so erhaltene Gemisch wurde unter Rühren während 90 min auf eine Temperatur von 45ºC erhitzt.
Anschließend wurde das Gemisch auf Umgebungsraumtemperatur abgekühlt und in eine Lösung von Diethylether (1,4 l) und Essigsäure (5 ml) gegossen. Der so entstandene Feststoff wurde filtriert, mit Wasser (250 ml), Aceton (200 ml) und dann mit Diethylether gewaschen und anschließend in einem Ofen bei 60ºC getrocknet, um den in der Überschrift angegebenen Thioether (14,7 g, Ausbeute von 67%) als weißes Pulver vom F. 225ºC (Zers.) zu erhalten. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 5,70-5,91 (m, 2H); 6,38 (bs, 2H). IR (KBr): 1700, 1640 und 1610 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub7;N&sub5;O&sub5;S:
C 43,93; H 4,82; N 19,71
Gefunden: C 44,10; H 4,82; N 19,69.

Beispiel 7: 8-(2-Butenylmercapto)guanosin (22435)

Man verfährt nach der obigen Verfahrensweise zur Herstellung des 8-(2-Propenylmercapto)guanosins (Beispiel 6), wobei man aber das Allylbromid durch 2-Butenylchlorid ersetzt, und wobei die in der Überschrift angegebene Verbindung in einer Ausbeute von 48% als weißes Pulver vom F. 210ºC (Zers.) erhalten wurde NMR (DMSO-d&sub6;): δ 6,3 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H); 1,6 (d, J=6Hz, 3H). IR (KBr): 1690, 1630, 1600, 1510 und 1365 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub9;N&sub5;O&sub5;S:
C 45,52; H 5,18; N 18,96
Gefunden: C 45,38; H 5,32; N 18,79.

Beispiel 8: 8-(Cinnamylmercapto)guanosin (22359)

Man verfährt nach der Verfahrensweise zur Herstellung des 8-(2-Propenylmercapto)guanosins (Beispiel 6), wobei aber das Allylbromid durch Cinnamylbromid ersetzt wurde, und wobei die in der Überschrift angegebene Verbindung in einer Ausbeute von 33% als gebrochen weißes Pulver vom F. 172ºC (Zers.) erhalten wurde. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 7,25 (br, 5H); 6,7-6,2 (m, 4H); 5,7 (d, J=5Hz, 1H). IR (KBr): 1690, 1640 und 1600 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub9;H&sub2;&sub1;N&sub5;O&sub5;S:
C 52,89; H 2,91; N 16,23
Gefunden: C 53,26; H 4,90; N 16,08.

Beispiel 9: 1-Amino-7-(2,3-epoxypropyl)-8-oxoguanosin

Man verfährt nach der allgemeinen Verfahrensweise der Stufe 1 des Beispiels 1, wobei Epibromhydrin als Alkylierungsmittel verwendet wurde, und wobei die in der Überschrift angegebene Verbindung als Rohprodukt erhalten wurde. Es wurde keine Reinigung versucht.

Beispiel 10: 7-[2-Hydroxy-3-(phenylthio)propyl]-8-oxoguanosinhemihydrat (24331)

Ein Gemisch aus dem Rohprodukt des Beispiels 9 (3 g, 5,4 mM) und Thiophenol (5 g, 45,4 mM) in DMF (150 ml) wurde während einer Zeitspanne von 4 h bei einer Badtemperatur von 80ºC erhitzt. Nach einem Abkühlen, Entfernen des meisten Lösungsmittels unter Vakuum, Auflösen des Rückstandes in Wasser und nach einer Reinigung durch präparative Umkehrphasen-HPLC (C-18) wurde das 1-Aminoderivat der in der Überschrift angegebenen Verbindung als ein gebrochen weißes Pulver in einer Ausbeute von 52% erhalten; F. = 135-137ºC. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 7,3 (m, 5H); 7,15 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H); 5,35 (s, 2H). IR (KBr): 1700 und 1580 cm&supmin;¹.
Nach der Entaminierungsverfahrensweise der Stufe 2 des Beispiels 1 und unter Verwendung des oben hergestellten 1-Aminoderivates wurde die in der Überschrift angegebene Verbindung in einer Ausbeute von 45% als brauner Feststoff vom F. 180- 182ºC hergestellt. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 7,3 (bs, 5H); 5,6 (bs, 2H); 5,7 (d, J=5Hz, 1H). IR (KBr): 1690, 1635, 1600 und 1100 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub9;H&sub2;&sub3;N&sub5;O&sub7;S-1/2 H&sub2;O:
C 48,09; H 5,10; N 14,76
Gefunden: C 48,16; H 5,11; N 15,04.

Beispiel 11: 7-[3-(3,4-Dimethoxyphenethylamino)-2-hydroxy]proyl-8-oxoguanosin-Monohydrochloridmonohydrat (24364)

1-Amino-7-[3-(3,4-dimethoxyphenethylamino)-2-hydroxypropyl]-8-oxoguanosin (24330) wurde analog zu dem 1-Aminoderivat des Beispiels 10 hergestellt, wobei das Thiophenol durch 3,4- Dimethoxyphenethylamin ersetzt wurde. Dieses 1-Aminoderivat wurde in einer Ausbeute von 40% als gebrochen weißes Pulver vom F. 156-158ºC hergestellt. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 7,0 (bs, 3H); 6,9- 6,4 (m, 3H); 5,3 (s, 2H); 3,7 (s, 6H). IR (KBr): 1670, 1615 und 1580 cm&supmin;¹.
Man verfährt gemäß der Entaminierungsverfahrensweise der Stufe 2 des Beispiels 1 (und des Beispiels 10), wobei das oben hergestellte l1Aminoderivat eingesetzt wurde, und wobei die in der Überschrift angegebene Verbindung in einer Ausbeute von 55% als hellbraunes Pulver vom F. 163-170ºC (Zers.) hergestellt wurde. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 8,9 (br, 1H); 6,8 (m, 5H); 5,6 (d, J=5Hz 1H); 5,59 und 5,62 (beide s, jeweils 3H). IR (KBr): 1680, 1640, 1600 und 1030 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub2;N&sub6;O&sub9;-HCl-H&sub2;O:
C 46,74; H 5,97; N 14,22
Gefunden: C 46,85; H 6,01; N 14,25.

Beispiel 12: 7-(3-Azido-2-hydroxypropyl)-8-oxoguanosinmonohydrat (24670)

Man verfährt gemäß der Verfahrensweise der Beispiele 10 und 11, wobei das 1-Amino-7-(3-azido-2-hydroxypropyl)-8-oxoguanosin (24332) durch Umsetzen des Rohepoxides des Beispiels 9 mit Natriumazid hergestellt wurde. Dieses 1-Aminoderivat wurde in einer Ausbeute von 35% als weiße Kristalle vom F. 180-182ºC (Zers.) hergestellt. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 7,1 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H). IR (KBr): 2140, 1690 und 1550 cm&supmin;¹.
Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde nach den Verfahrensweisen der Entaminierungsreaktion der Stufe 2 des Beispiels 1 (und der Beispiele 10 und 11) unter Einsatz des unmittelbar vorstehend beschriebenen 1-Aminoderivates (24332) erhalten. Die in der Überschrift angegebene Verbindung war ein gebrochen weißes Pulver vom F. 138-141ºC (Zers.), das in einer Ausbeute von 30% erhalten wurde. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 6,4 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H). IR (KBr): 3600-3000, 2110, 1690 und 1660 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub8;N&sub8;O&sub7;-H&sub2;O:
C 37,50; H 4,84; N 26,91
Gefunden: C 38,06, H 4,79; N 26,67.

Beispiel 13: 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-8-oxoguanosinmonohydrat (24292)

Nach den Verfahrensweisen der Beispiele 10-12 wurde das 1- Amino-7-(2,3-dihydroxypropyl)-8-oxoguanosin (24457) durch Umsetzen des Rohepoxides des Beispiels 9 mit Wasser hergestellt. Dieses 1-Aminoderivat wurde in einer Ausbeute von 55% als ein gebrochen weißes Pulver vom F. 210-212ºC (Zers.) erhalten. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 6,9 (bs, 2H); 5,55 (d, J=4,5Hz, 1H); 5,3 (bs, 2H). IR (KBr): 1700, 1670 und 1600 cm&supmin;¹.
Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde gemäß den Verfahrensweisen der Entaminierungsreaktion der Stufe 2 des Beispiels 1 (und der Beispiele 10-12) unter Einsatz des unmittelbar vorstehend beschriebenen 1-Aminoderivates (24457) erhalten. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde als ein weißes Pulver vom F. 195-196ºC mit einer Gesamtausbeute von 35% erhalten. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 10,7 (bs, 1H); 6,5 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H). IR (KBr): 1680, 1640 und 1660 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub9;N&sub5;O&sub8;-H&sub2;O:
C 39,90; H 5,41; N 17,90
Gefunden: C 39,67; H 5,32; N 17,52.

Beispiel 14: 7-[3-[4-(4-Fluorphenyl)piperazinyl]-2-hydroxypropyl]-8-oxoguanosinhemihydrat (24455)

Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde nach den Verfahrensweisen der Beispiele 10-13 durch Umsetzen von 4- (4-Fluorphenyl)piperazin mit dem Rohepoxid des Beispiels 9 und eine anschließende Entaminierung des so entstandenen, 7-heteroatomsubstituierten-Kohlenwasserstoff-1-Aminoderivates hergestellt, wie dies in den Beispielen 10-13 erörtert ist. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde als ein weißes Pulver in einer Gesamtausbeute von 25% erhalten; F. 178-181ºC. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 6,8-7,1 (m, 4H); 6,3 (bs, 2H); 5,2 (d, J=5Hz, 1H). IR (KBr): 1690, 1600 und 1390 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub0;FN&sub7;O&sub7;-1/2 H&sub2;O:
C 50,73; H 5,74; N 18,00
Gefunden: C 50,94; H 5,76; N 17,74.

Beispiel 15: 7-[2-(4-Chlorphenyl)-2-oxoethyl]-8-oxoguanosin (23880)

Man verfährt gemäß der zweistufigen Verfahrensweise des Beispiels 1, wobei das 2-Brom-4'-chloracetophenon als Alkylierungsmittel verwendet wurde, und wobei die in der Überschrift angegebene Verbindung als ein hellbraunes Pulver, mit einem F. über 230ºC, in einer Gesamtausbeute von 35% erhalten wurde. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 10,7 (bs, 1H), 8,1 (d, J=10Hz, 2H), 7,7 (d, J=10Hz, 2H), 6,5 (bs, 2H), 5,6 (d, J=5Hz, 1H), 5,3 (s, 2H). IR (KBr): 1700, 1680 und 1630 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub8;ClN&sub5;O&sub7;:
C 47,85; H 4,02; N 15,50
Gefunden: C 47,32; H 3,98; N 15,40.

Beispiel 16: 7-(4-Nitrobenzyl)-8-oxoguanosin (23756)

Man verfährt gemäß der zweistufigen Verfahrensweise des Beispiels 1, wobei 4-Nitrobenzylbromid als Alkylierungsmittel verwendet wurde, und wobei die in der Überschrift angegebene Verbindung als gelbes Pulver mit einem F. über 230ºC in einer Gesamtausbeute von 10% erhalten wurde. NMR (DMSO-d&sub2;): δ 10,8 (bs, 1H), 8,3 (d, J=10Hz, 2H), 7,6 (d, J=10Hz, 2H), 6,5 (bs, 2H), 5,6 (d, J=5Hz, 1H). IR (KBr): 1680, 1640, 1600 und 1520 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub8;N&sub6;O&sub8;-1/2 H&sub2;O:
C 46,11; H 4,32; N 18,98
Gefunden: C 46,48; H 4,04; N 18,72.

Beispiel 17: 7-(4-Methoxybenzyl)-8-oxoguanosin (23890)

Man verfährt gemäß der zweistufigen Verfahrensweise des Beispiels 1, wobei 4-Methoxybenzylchlorid als Alkylierungsverbindung verwendet wurde, und wobei die in der Überschrift angegebene Verbindung als ein sandfarbenes Pulver mit einem F. über 230ºC in einer Gesamtausbeute von 7% erhalten wurde. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 10,8 (bs, 1H), 7,2 (d, J=10Hz, 2H), 6,8 (d, J=10Hz, 2H), 6,4 (bs, 2H), 5,5 (d, J=5Hz, 1H), 3,7 (s, 3H). IR (KBr): 1670, 1600, 1510, 1450 und 1250 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub7;N&sub3;O&sub7;-1/2 H&sub2;O:
C 50,47; H 5,18; N 16,35
Gefunden: C 50,85; H 5,12; N 16,20.

Beispiel 18: 7-(2-Chlorethyl)-8-oxoguanosin (24599)

Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde nach der allgemeinen, zweistufigen Synthese des Beispiels 1, wobei Chlorethylbromid als Alkylierungsmittel verwendet wurde, als gebrochen weißes Pulver vom F. 192ºC (Zers.) in einer Ausbeute von 27% erhalten. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 9,8 (br, 1H); 6,9 (bs, 2H); 5,8 (d, J=5Hz, 1H). IR (KBr): 1680 und 1640.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub6;ClN&sub5;O&sub6;-3/2 H&sub2;O:
C 37,07; H 4,93; N 18,02
Gefunden: C 36,65; H 4,67; N 18,18.

Beispiel 19: 7-Heteroatomsubstituierte-Kohlenwasserstoff-8- selenoxoguanosin-Derivate

7-Heteroatom-substituierte Kohlenwasserstoff-8-selenoxoguanosinderivate werden aus den entsprechenden, in geeigneter Weise geschützten 7-heteroatomsubstituierten-Kohlenwasserstoff- 8-thioxoderivaten hergestellt, deren Herstellung weiter oben beschrieben worden ist. So wird das 7-heteroatomsubstituierte- Kohlenwasserstoff-8-thioxoguanosin mit einem S-Alkylierungsmittel, wie z.B. Methyliodid, in einem Lösungsmittel, wie z.B. DMSO, umgesetzt. Das so erhaltene, S-alkylierte Produkt wird anschließend zur Bildung des 7-heteroatomsubstituierten-Kohlenwasserstoff-8-selenoxoderivates mit Natriumselenid umgesetzt. Das gewünschte Produkt kann anschließend aus dem Reaktionsgemisch durch Umkehrphasen-HPLC gewonnen werden.

Beispiel 20: 7-(2-Allyl)-8-thioxoguanosin (22444)

Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde unter Anwendung einer Umlagerungsverfahrensweise aus dem 8-(2-Propenylmercapto)guanosin (22300; Beispiel 6) hergestellt.
Bistrimethylsilylacetamid (72 g, 354,7 mM) wurde zu einer Suspension von 8-(2-Propenylmercapto)-guanosin (20 g, 56,3 mM) als Ausgangsmaterial in Chloroform (500 ml) zugegeben, und das so entstandene Gemisch wurde während einer Zeitspanne von 16 h unter N&sub2; unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das meiste Lösungsmittel im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde bei 40ºC unter Vakuum während einer Zeitspanne von 6 h erhitzt.
Der ölige Rückstand wurde mit Tetrahydrofuran (500 ml), PdCl&sub2; (10,3 g, 58,3 mM) und Benzonitril (12,1 g, 117 mM) vermischt, und das so entstandene Gemisch wurde unter Rückfluß und unter N&sub2; während 3 h erhitzt. Dieses Gemisch wurde anschließend auf die Umgebungsraumtemperatur abgekühlt, weiterhin mit Pyridin (25 ml) vermischt und über Nacht (während etwa 16 h) umgerührt. Das Gemisch wurde durch Silikagel filtriert und mit Methylenchlorid (2x300 ml) gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden unter Vakuum konzentriert, und der Rückstand wurde mit einem Gemisch aus Wasser, Methanol und Essigsäure (500 ml; 10:10:1) vermischt und während einer zusätzlichen Zeitspanne von etwa 16 h umgerührt.
Der Großteil der zugesetzten Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in DMF (1 Liter) aufgelöst und dann mit Aktivkohle behandelt. Die so erhaltene Suspension wurde durch ein Celite-Bett filtriert, und das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mit Methanol behandelt, und der so entstandene Feststoff wurde filtriert, mit Aceton gewaschen und in einem Ofen bei 60ºC getrocknet, wobei 7-Allyl-8-thioxoguanosin (8,5 g, 42,5% Ausbeute) als gebrochen weißes Pulver, mit einem F. über 230ºC, erhalten wurde. NMR (DMSO-d&sub6;): δ 5,90 (m, 1H); 6,32 (d, J=5Hz, 1H); 6,56 (bs, 2H); 10,60 (bs, 1H). IR (KBr): 1700, 1635, 1605 und 1450 cm&supmin;¹.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub7;N&sub5;O&sub5;S:
C 43,93; H 4,82; N 19,71
Gefunden: C 43,96; H 4,87; N 19,62.

Beispiel 21: 7-Heteroatomsubstituierte-Kohlenwasserstoff-8- cyanimino-guanosin-Derivate

Für diese Derivate werden die entsprechenden 7-heteroatomsubstituierten-Kohlenwasserstoff-8-thioxoguanosinderivate als Ausgangsmaterialien verwendet. Bei einem typischen Herstellungsverfahren wird Methyliodid (42 mM) zu 28 mM des in Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelösten Thioxoguanosin-Ausgangsmaterials zugegeben. Die Zugabe findet bei Raumtemperatur und unter Stickstoff statt. Das so entstandene Gemisch wird während etwa 3 h umgerührt und wird dann auf etwa 0ºC abgekühlt. Es werden Cyanamid (etwa 57 mM) und im Anschluß daran Natriumhydrid (60%ige Öldispersion; 5 mM) zugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wird auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und wird während etwa 1 h umgerührt.
Das Reaktionsgemisch wird dann in etwa 1,5 l Diethylether gegossen und während etwa 10 min umgerührt. Die Etherschicht wird dekantiert, und der Rückstand wird mit weiteren 1,5 Litern Diethylether, welche zusätzlich etwa 50 ml Essigsäure enthalten, extrahiert. Die Etherschicht wird wieder dekantiert, und der Rückstand wird in Wasser (etwa 500 ml) aufgelöst. Die gewünschte Verbindung wird aus der Wasserschicht durch Umkehrphasen-HPLC (C-18) isoliert und gereinigt.

Beispiel 22: Niedrigalkylidendioxyderivate

Ein Niedrigalkylidendioxyderivat von einer der oben beschriebenen Verbindungen wird durch die nachstehende Synthese eines Isopropylidenderivates beispielsweise veranschaulicht.
Ein Gemisch aus 7-heteroatomsubstituiertem Kohlenwasserstoff-8-oxoguanosin (17 mM), 2,2-Dimethoxypropan (41 mM), Aceton (200 ml) und konzentrierter Schwefelsäure (10 Tropfen) wird unter Stickstoff bei Umgebungsraumtemperatur während einer Zeitspanne von 52 h umgerührt. Das Gemisch wird auf 0ºC abgekühlt und mit konzentriertem Ammoniumhydroxid (5 ml) behandelt. Der Großteil der Flüssigkeit wird unter Vakuum entfernt, und der so entstandene Feststoff wird abfiltriert. Der abfiltrierte Feststoff wird mit Wasser, Aceton und dann mit Diethylether gewaschen, wonach zur Gewinnung des gewünschten Derivates ein Trocknen in einem Vakuumofen bei 60ºC vorgenommen wird. Ähnliche Verfahrensweisen werden zur Gewinnung der 8-Thioxo-, 8-Selenoxo- und 8-Cyaniminoderivate angewendet.

Beispiel 23: 7-Heteroatomsubstituiertes-Kohlenwasserstoff-8- oxo-2',3'-O-isopropyliden-5'-benzoylguanosin

Ein Gemisch, welches ein Isopropylidenderivat von der in Beispiel 22 beschriebenen Art (3 mM), Triethylamin (3 ml), Benzoylchlorid (3 mM) und Methylenchlorid (100 ml) enthält, wird bei Umgebungsraumtemperatur während einer Zeitspanne von 16 h umgerührt. Das Gemisch wird anschließend in Wasser gegossen, die Methylenchloridschicht wird abgetrennt, und die Wasserschicht wird mit Methylenchlorid (2x150 ml) weiter extrahiert.
Die Methylenchloridschichten werden vereinigt, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, und das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie auf Silikagel gereinigt.
Die 5'-Acetylderivate werden dadurch hergestellt, daß man das Benzoylchlorid durch Essigsäureanhydrid ersetzt. Die 8-Thioxo-, 8-Selenoxo- und 8-Cyaniminoderivate werden in ähnlicher Weise hergestellt.

Beispiel 24: 7-Heteroatomsubstituiertes-Kohlenwasserstoff-8- thioxo-2',3',5'-triacetylguanosin

Diese Verfahrensweise ist beispielhaft für Acylierungsverfahren für den Ribosylring.
4-N,N-Dimethylaminopyridin (10 mg) wird zu einem Gemisch aus dem 7-heteroatomsubstituierten Kohlenwasserstoff-8-thioxoguanosin (3 mM), Triethylamin (2 ml), Essigsäureanhydrid (15 mM; wobei als Alternativen Niedrigacylchloride oder Benzoylchlorid verwendet werden können) und Methylenchlorid (50 ml) zugegeben. Das so entstandene Reaktionsgemisch wird unter N&sub2; während 16 h bei Raumtemperatur umgerührt.
Anschließend wird weiteres Methylenchlorid (50 ml) zugegeben, und die Lösung wird mit 1N HCl, Sole und dann mit Wasser gewaschen. Die Lösung wird anschließend über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wird durch Säulenchromatographie auf Silikagel gereinigt.
Ähnliche Verfahrensweisen werden für die 8-Oxo-, 8-Selenoxo- und 8-Cyaniminoderivate angewendet.

B. Beispielhafte Zusammensetzungen für die Verabreichung

Beispielhafte feste und flüssige Zusammensetzungen, die für die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen geeignet sind, werden nachstehend beschrieben, wobei fünf der in höherem Maße bevorzugten Guaninnukleosidderivate als beispielhafte Wirkstoffe verwendet werden.

Tabletten

Tabletten werden aus den folgenden Bestandteilen formuliert: Gew.-Teile 7-(2-Chlorethyl)-8-oxoguanosin Lactose, gepulvert Maisstärke, trocken feinverteiltes SiO&sub2; Polyvinylpyrrolidon Magnesiumstearat
Das Guanosinderivat wird gründlich mit der Lactose, 25,0 Gew.-Teilen der Maisstärke und 4,0 Gew.-Teilen des SiO&sub2; gemischt. Das so entstandene Gemisch wird dann gleichmäßig mit einer 5%igen ethanolischen Lösung von Polyvinylpyrrolidon befeuchtet. Die feuchte Masse wird dann durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 1 mm geführt, um ein Granulat zu erzeugen. Das so entstandene Granulat wird während etwa 24 Stunden bei 60ºC in einer Trockenkammer getrocknet. Das getrocknete Granulat wird wiederum durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 1 mm geführt. 70,0 Teile des so erhaltenen Granulates werden in einem geeigneten Mischer mit einer Mischung, die aus dem Rest des SiO&sub2;, dem Rest der Maisstärke und dem gesamten Magnesiumstearat besteht, vermischt, wobei die Mischung zuvor durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 1 mm geführt worden ist. Das so erhaltene Gemisch wird dann zu Tabletten verpreßt, die jeweils 800 mg wiegen und 25 mg des Guanosins enthalten.

Stärkekapseln

Der Kapselinhalt wird aus den folgenden Bestandteilen formuliert: Gew.-Teile 7-(Carbethoxymethyl)-8-oxoguanosin Lactose Maisstärke
Das Guanosinderivat wird schrittweise mit der Lactose vermischt. Wenn die gesamte Lactose zugemischt worden ist, wird das so erhaltene Gemisch mit der Maisstärke vermengt. Das so entstandene Gemisch wird dann in Kapseln gefüllt, die jeweils 10 g des Gemisches aufnehmen können. Jede Kapsel enthält 1,0 mg des Guanosinderivates.

Tabletten

Ein 10.000 Tabletten enthaltender Ansatz, deren jede 50 mg 7-(4-Nitrobenzyl)-8-oxoguanosin enthält, wird aus den folgenden Typen und Mengen von Bestandteilen hergestellt: 7-(4-Nitrobenzyl)-8-oxoguanosin 500 g Dicalciumphosphat Methylzellulose, U.S.P. (15 cps) Talkum Maisstärke Magnesiumstearat
Das Guanosinderivat und das Dicalciumphosphat werden gut vermischt, mit einer 7,5%igen Lösung von Methylzellulose in Wasser granuliert, durch ein Sieb Nr. 8 (U.S. Standardsiebreihe) geführt und sorgfältig getrocknet. Die getrockneten Granula werden durch ein Sieb Nr. 12 (U.S. Standardsiebreihe) geführt, gründlich mit dem Talkum, der Stärke und dem Magnesiumstearat vermischt und zu Tabletten verpreßt.

Injizierbare Zubereitung

Eine sterile Zubereitung, die für die subkutane oder intrakavitäre Injektion geeignet ist und 50 mg 7-Carboxamidomethyl-8-oxoguanosin pro ml Bestandteile enthält, wird aus den folgenden Typen und Mengen von Bestandteilen hergestellt:
7-Carboxamidomethyl-8-oxoguanosin 5 g
physiologische Kochsalzlösung 98 ml
Sesamöl 2 ml
Das Guanosinderivat und die Kochsalzlösung werden vermischt und über einen Zeitraum beschallt, der ausreichend ist, um eine im wesentlichen homogene Dispersion zu ergeben. Das Sesamöl wird anschließend zugemischt, und die neue Mischung wird ähnlich homogenisiert, um eine Emulsion zu ergeben. Nach der Emulgierung werden 5 bis 15% des Endvolumens dieser sterilen Zubereitung subkutan oder intraperitoneal einmal pro Woche injiziert, um die humorale Immunität zu verstärken.

Wäßrige Zubereitung für die orale Verwendung

Eine wäßrige Zubereitung für die orale Verwendung, die in jeweils 5 ml (1 Teelöffel) 25 mg 7-(4-Methoxybenzyl)-8-oxoguanosin enthält, wird aus den folgenden Bestandteilen hergestellt:
7-(4-Methoxybenzyl)-8-oxoguanosin 5,0 g
Methylparaben, U.S.P. 0,75 g
Propylparaben, U.S.P. 0,25 g
Natriumsaccharin 1,25 g
Natriumcyclamat 0,25 g
Glycerin 300 ml
Traganthpulver 1,0 g
Orangenölgeschmacksstoff 1,0 g
F.D. und C. orangenfarbiger Farbstoff 0,75 g
Entionisiertes Wasser, q.s. ad 1000 ml

C. Methoden

Lymphozytenkulturen

Ein Serum-haltiges Kulturmedium wird so hergestellt, daß es in 100 ml folgendes enthält: 91,9 ml RPMI 1640 (Flow Laboratories, Inc., Rockville, MD), 0,1 ml 100x Glutamin, 1,0 ml 100x Natriumpyruvat, 1,0 ml 50x nicht-essentielle Aminosäuren, 1,0 ml Wasser, enthaltend 10&sup4; Einheiten Penicillin G und 10&sup4; ug Streptomycin, und 5,0 ml eines unterstützenden Ansatzes von fetalem Kälberserum (FCS). Diese Bestandteile werden bis zu offensichtlicher Homogenität vermischt. Milzzellsuspensionen und Populationen, die an Milz-B-Zellen angereichert sind, werden, wie von Goodman et al., J. Immunol., 121:1905 (1978), beschrieben, hergestellt.
Für die Bewertung der primären humoralen Immunantwort auf Schaferythrozyten (SRBC) werden 5x10&sup6; bis 10&sup7; Mäuse-Milzzellen in 1,0 ml eines 5% FCS enthaltenden Mediums während 4 oder 5 Tagen in Gegenwart von Immunogen kultiviert. Die Zellen werden in Kulturschalen (Costar, Cambridge, MA) bei 37ºC, in einer angefeuchteten Atmosphäre von 10% CO&sub2; in Luft, unter Verwendung von Gewebekulturkästen (CBS Scientific, Del Mar, CA), die mit einer Frequenz von 7 Cyclen pro Minute bewegt werden, inkubiert. Gesammelte SRBC sind von der Colorado Serum Co., Denver, CO, erhältlich.
Humane periphere Blutlymphozyten (PBL) werden aus normalem, heparinisiertem, venösem Blut mittels Ficoll-Diatrizoat- Dichtegradientenzentrifugation hergestellt. Die PBL werden von Suppressor-T-Zellen, die den Histamin-Typ-2-Rezeptor tragen, befreit, indem dieselben an die Oberflächen von Histamin-Kaninchen-Serumalbumin-beschichteten Plastik-Petrischalen (Cell-ect Nr. 2 Kit; Seragen, Boston, MA) angeheftet werden und indem die nichtanhaftenden Zellen durch Auswaschen rückgewonnen werden, wie dies von Wysocki und Sato, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75:2844 (1978), beschrieben und von Cavagnaro und Osband, Biotechniques, Januar/Februar:30 (1983), modifiziert wurde.
Das in diesen Untersuchungen verwendete Gewebekulturmedium wird wie folgt hergestellt: 100 ml enthielten 87,9 ml RPMI 1640 (Flow Laboratories, Rockville, MD), 0,1 ml 100x Glutamin, 1,0 ml 1,0M HEPES-Puffer (Microbiological Associates, Bethesda, MD), 1,0 ml Wasser, enthaltend 10&sup4;E Penicillin G und 10&sup4; ug Streptomycin, und 10 ml frisches, autologes Hitze-inaktiviertes Plasma. Für die Bewertung der primären humoralen Immunantwort auf SRBC werden Lymphoidzellen mit einer Dichte von 2x10&sup6;/ml in einem Volumen von 1,0 ml, enthaltend 5x10&sup6; SRBC als Antigen (Colorado Serum Co., Denver, CO), zusammen mit IL-2 (einem teilweise gereinigten Präparat von Human-IL-2, das frei von Interferon-gamma-Aktivität ist, und das von Electro-Nucleonics, Inc., Silver Spring, MD erhalten wurde) und dem Guaninnukleosidderivat kultiviert.

Test auf plaquebildende Zellen (PFC)

PFC, welche Antikörper gegen SRBC sezernieren, werden nach 4 oder 5 Tagen des Kultivierens unter Anwendung einer Modifikation des hämolytischen Plaquetests von Jerne und Nordin, Science, 140:405 (1963), bewertet. Die Zellen werden vor dem Plaquetest in Vollmedium gezogen; sie werden in einer Standard- Agarose mit niedrigem Mr (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) plaquiert, und sie werden in SRBC-absorbiertem Meerschweinchen- Komplement 1 Stunde lang nach 1,5 Stunden Inkubation ohne Komplement inkubiert.

T-Zell-ersetzende Aktivität

5x10&sup6; lebensfähige CBA/CaJ-Mäuse-B-Zellen werden kultiviert. Diese Zellen werden durch aufeinanderfolgende Behandlung der Milzzellen zunächst mit Komplement-fixierenden monoklonalen Antikörpern, die gegen die Thy-1,2-Antigene der T-Zellen gerichtet sind, und zweitens mit Komplement zur Lyse etwa vorhandener T-Zellen (New England Nuclear, Boston, MA) erzeugt. Die so behandelten Zellen werden anschließend mit oder ohne 0,1 ml von 0,1%igen (Vol./Vol.) SRBC als Immunogen in einem Serum-haltigen Medium, das weiterhin steigende Mengen eines Guanosinderivates im Bereich von Null bis 10&supmin;&sup4; M enthält, wachsen gelassen. Die direkten PFC gegen SRBC werden 4 Tage später bestimmt.

Mäuse

CBA/CaJ-Mäuse, 8-16 Wochen alt, werden von Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, erworben. Ein zuchtkern von CBA/N- Mäusen wird von der Animal Production Section, National Institutes of Health, Bethesda, MD, zur Verfügung gestellt. Alle Mäuse werden mit Wayne Lab Blox F6-Pellets (Allied Mills, Inc., Chicago IL) und gechlortem Wasser, das mit HCl auf einen pH-Wert von 3,0 angesäuert worden ist, gehalten.

Zellpräparate

Milz- und Thymus-Zellsuspensionen werden, wie von Goodman et al., J. Immunol., 121:1905 (1978), beschrieben, hergestellt. B-Zell-angereicherte Populationen werden durch 30-minütiges Behandeln von 10&sup8; Milzzellen mit einer 1:1000-Verdünnung eines monoklonalen Anti-Thy-1,2-Antikörpers (New England Nuclear, Boston, MA) bei 4ºC hergestellt. Die behandelten Zellen werden bei 280xg während 10 min zentrifugiert, die Antikörper werden entfernt,und die Zellen werden in einer 1:6-Verdünnung von CBA- RBC-absorbiertem Meerschweinchen-Komplement während 45 min bei 37ºC resuspendiert. Die Zellen werden dann gewaschen und wie oben beschrieben kultiviert.

Injektionen

Die Mäuse erhalten i.p.-Injektionen einer Lösung, die 50 ug TNP-BSA enthält. Innerhalb von etwa 30 min nach der immunisierenden Injektion erhalten zwei Gruppen von je 6 Mäusen auch 0,2 ml i.p.-Injektionen von einem erfindungsgemäßen Guanosin in 100% Sesamöl oder 2% (Vol./Vol.) Sesamöl, beschallt in normaler Kochsalzlösung, wobei das Guanosin in einer Konzentration von 5 mg/ml vorhanden ist. Eine dritte Gruppe von 6 Mäusen erhält die Immunisierung, aber kein Guanosinderivat. Die Anti-TNP-BSA-Antikörpertiter werden anschließend unter Anwendung von Standardverfahren bestimmt.
Die vorliegende Erfindung ist im Hinblick auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden. Dem Fachmann ist dabei klar, daß Modifikationen und/oder Variationen des offenbarten Gegenstandes vorgenommen werden können, ohne den Schutzbereich der hier erläuterten Erfindung zu verlassen.

Claims

1. Substituiertes Guaninnukleosidderivat, welches der Formel

entspricht,

worin X für O, S, Se oder NCN steht;

R¹ ein heteroatomsubstituierter Kohlenwasserstoffrest ist, der länger als eine Ethylgruppe und kürzer als eine Decylgruppe ist und bei physiologischen pH-Werten frei von Ionenladungen ist;

R² und R³ die gleichen oder verschiedene Reste darstellen, welche aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Hydroxyl, Niedrigalkoxy, Niedrigalkanoyloxy und Benzoxy besteht, oder R² und R³ zusammengenommen einen Niedrigalkylidendioxyrest darstellen; und

R&sup4; ein Rest ist, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, Niedrigalkanoyl und Benzoyl besteht;

und die pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Basenadditionssalze hievon.

2. Substituiertes Guaninnukleosidderivat nach Anspruch 1, worin der Rest R¹ eine geringere Länge als etwa Heptyl aufweist.

3. Substituiertes Guaninnukleosidderivat nach Anspruch 2, worin der Rest R¹ aus einer Gruppe ausgewählt ist, welche aus halogensubstituiertem Alkyl, Niedrigalkoxyniedrigalkylcarbonyl, Niedrigalkylcarboxamido, wobei der Carboxamidoteil die Formel CONR&sup5;R&sup6; aufweist, worin R&sup5; und R&sup6; gleich oder verschieden sind und aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Niedrigalkyl und C&sub2;-C&sub3;-Alkanol besteht, oder NR&sup5;R&sup6; zusammengenommen einen heterocyclischen Ring mit 5 oder 6 Atomen im Ring bilden; Niedrigalkoxyniedrigalkyl und Benzyl, dessen Phenylring mit einer Gruppe substituiert ist, welche in bezug auf Wasserstoff elektronenabziehend ist, besteht.

4. Substituiertes Guaninnukleosidderivat nach Anspruch 1, worin R¹ aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus 2-Chlorethyl, 4-Nitrobenzyl, 4-Methoxybenzyl, Methoxyethyl, Carbethoxymethyl und Carboxamidomethyl besteht, und X für 0 steht.

5. Substituiertes Guaninnukleosidderivat nach Anspruch 4, worin R² und R³ Hydroxyl darstellen und R&sup4; für Wasserstoff steht.

6. Substituiertes Guaninnukleosidderivat nach Anspruch 1, wobei das Guanosinnukleosidderivat aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus 7-Carbethoxymethyl-8-oxoguanosin; 7-(4- Nitrobenzyl)-8-oxoguanosin; 7-(4-Methoxybenzyl)-8-oxoguanosin; 7-(2-Chlorethyl)-8-oxoguanosin; 7-Carbamoylmethyl- 8-oxoguanosin; 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-8-oxoguanosin und 7-Methoxyethyl-8-oxoguanosin besteht.

7. Zusammensetzung, welche eine verdünnende Menge eines physiologisch verträglichen Trägers im Gemisch mit einer immunpotenzierend wirksamen Menge eines die Immunantwort verstärkenden, substituierten Guaninnukleosidderivates nach Anspruch 1 enthält.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin X für 0 oder S steht.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, worin R² und R³ für Hydroxyl stehen und R&sup4; Wasserstoff ist.

10. Verfahren zur Verstärken einer Immunantwort, welches das Inberührungbringen von Leukozyten in vitro in einem wässerigen Medium mit einer Zusammensetzung umfaßt, welche eine verdünnende Menge eines physiologisch verträglichen Trägers im Gemisch mit einer immunpotenzierend wirksamen Menge eines substituierten Guanninnukleosidderivates enthält, wobei dieses substituierte Guaninnukleasidderivat eine Struktur aufweist, welche der Formel

entspricht,

worin X für O, S, Se oder NCN steht;

R&sup4; ein Rest ist, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, Niedrigalkanoyl und Benzoyl besteht; oder von pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Basenadditionssalzen hievon enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die kontaktierten Leukozyten B-Zellen (B-Lymphozyten) umfassen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Immunantwort eine antigen-spezifische Antwort ist.

13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Leukozyten aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus Human-B-Zellen, -T-Zellen (T-Lymphozyten) und neutrophilen Human-Granulozyten besteht.

14. Substituiertes Guaninnukleosidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, oder eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, zur Verwendung in der Therapie.

15. Verwendung eines substituierten Guanninnukleosidderivates nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Erzeugung eines Medikamentes zum Verstärken einer Immunantwort.