PT90464B - Processo de preparacao de derivados da guanina imuno-estimulantes e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

REQUERENTE:

EPÍGRAFE:

SCRIPPS CLINIC AND RESERARCH FOUNDATION , norte-americana (Estado de Califórnia) , com sede em 10666 North Torrey Pines Road, La Jolla Califórnia 92037, Estados Unidos da América.

PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DA GUANINA IMUNO-ESTIMULANTES E DE COMPOSI ÇOES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM

INVENTORES: Michael Goodman e Robert Chen.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América, com o n²190.694 em 05 de Maio de 1988.

INPI MOO. 113 RF

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E FG: 11

SCRF 124.03

PATSΝΤΕ N-. 9Ό 464

Processo de preparação de derivados de guanina imuno-estimulantes e de composi çces farmacêuticas que os contêm para que

SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION, pretende obter privilégio de invenção em Portuga 1.

RESUMO

O presente invento refere-se a um processo de preparação de derivados de nucleósido-guanosina 7,8-di-substituído com a f órmu la onde

Xe 0, S, Se ou NCN; 1

R é um radical hidrocarbilo substituído oor heteroátomo, possuindo um comprimento superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo, e que esta livre de carga iónica aos valores de dH fisiológicos;

* 2 3

R e R são radicais iguais ou diferentes seleccronados do grupo consistindo em hidrogénio, hidroxilo, alcanoiloxilo infe2 3 rior e benzoxilo, ou R e R constituem juntos um radical alquili.

denodioxilo inferior;

R é um radical seleccionado do grupo consistindo em hidro génio, alcanoílo inferior e benzoilo; e dos seus sais de adição de base, não tóxico, farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por compreender os passos de

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-2a) se reagir l-amino-8-oxoguanosina com um agente de a Iqui. lação que é um composto hidrocarbilo substituído por heteroátomo possuindo um comprimento superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo e que está livre de carga iónica a valores de pH fisiológicos para formar um produto l-amino-7-substituído8-oxoguanosina;

b) isolar o produto do passo a)

c) dissolver o referido produto isolado do passo b) em HC1 concentrado para formar uma solução;

d) misturar a referida solução do passo c) com nitrito de sódio aquoso e mantendo a mistura resultante durante um período de tempo suficiente para desaminar o grupo 1-amino da referida 1-amino-7-substituída—8-oxoguanosina; e

e) isolar o produto 7-substituído-8-oxoguanosina resultante ;

ou a') reagir 8-tioxoguanosina com um agente de alquilação que é um composto hidrocarbilo substituído por um heteroátomo pos suindo um comprimento superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo e que está livre de carga iónica a valores de pH fisiológicos para formar uma hidrocarbi1-8-ticxoguanosina subs tituida em 7 por heteroátomo; e b' ) tituída em se isolar o produto hidrocarbi1-3-tioxoguanosina subs7 por heteroátomo, resultante;

ou a'') se reagir o produto isolado do passo b') com um agente de S-alquilação para formar um produto S-alguilado;

b'') isolar o referido produto S-alquilado;

c*') reagir o referido produto S-alguilado com seleneto de sódio para formar um produto hidrocarbil-3-selenoxoguanosina subs tituído em 7 por heteroátomo; e d'') se isolar o referido produto do passo c'');

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-3ou a’’’) ss reagir o produto isolado do passo b*') com cian mida e com hidreto de sódio para formar um produto hidrocarbil-cianirainoguanosina substituída em 7 por heteroátomo;

rol ooi b‘'') se isolar o referido produto do passo a* ' ' ) ;

ou a’'·*) se reagir qualquer dos produtos isolados nos passos

e), b'), d'’) oub') com um composto aIquilidenodioxilo inferior,., com um composto acilo inferior ou benzoílo para formar um

3 4 produto no qual R , R e R sao como acima definidos; e b' '' ') se isolar o produto do passo a' ¹ ’ ') .

Estes derivados de nucleósido guanosina 7,8-di-substituído são agentes melhoradores da resposta imunitária muito potente, em células humanas e animais.

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-4 _

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo da invenção

O presente invento refere-se ao processo de preparação de comoostos melhoradores da imuno-resposta {imuno-estimulantes) e, mais particularmente, ao processo de preparação de de. rivados de guanina-nucleósido que estão substituídos nas posi^ ções 7 e 8 do anel de guanina, bem como ao processo de preparação de composições contendo esses derivados e a métodos que os utilizam.

Antecedentes da Invenção

Um imuno-sistema animal compreende numerosos elementos que actuam separadamente e/ou em conjunto para contractuar, para eliminar ou para neutralizar, substâncias que são reconhecidas por esse sistema como estranhas ao animal hospedeiro. Geralmente, mas não necessáriamente, a substância reconhecida como estranha pelo imuno-sistema tem uma origem que á exógena em relação ao animal hospedeiro. Exemplos destas substâncias exógenas são as bactérias infecciosas e os sub-produtos da sua actividade celular, partículas de vírus e as suas proteínas, proteínas injectadas por picadas de insectos e similares. Em doenças auto-imunes, tais como a artrite reumatóide, o irnuno-sistema do hospedeiro reconhece como estranhas as proteínas produzidas no hospedeiro, ou proteínas auto—produz idas.

Os principais intervenientes do imuno-sistema são os leucócitos, que incluem linfócitos de origem tímica (células T), linfócitos produzidos na medula óssea (células B), neutro filos que, inter alia produzem enzimas que fabricam agentes oxidantes, tais como peróxido de hidrogénio que têm efeitos c totóxicos nas bactérias, a macrofagos que apresentam a substâ cia estranha ou antigénio às células T, bem como produzem uma proteína designada por interleucina-1 que auxilia a transforma ção das células T em células T auxiliares. O complemento, que é uma mistura complexa de proteínas que actua duma forma orde•h| c|

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EPGzll - SCRF 124.CE nada em cascata na substância estranha, desempenha também um papel importante nas imuno-respostas.

As células B podem distinguir-se das células T, inter alia, pela presença de imunoglobulinas nas suas superfícies de membrana. As imunoglobulinas funcionam como anticorpos.

Existem cinco classes conhecidas de imunoglobulinas, ide tifiçadas por IgA, igD, IgE, IgG e IgM com base em cinco proteí nas de cadeia pesada, antigenicamente diferentes que, em parte, constituem a molécula de imunoglobulina. As células B compreendem também marcadores de célula que nSo são imunoglobulinas, que incluem, um receptor de complemento (CR), um receptor para a porção Fc da imunoglobulina (FCR), antigénios associados à região I (la), e um conjunto de antigénios- de diferenciação (Lyb 1—7) que são identificados por todos os anti-soros e que estão correlacionados com vários aspectos de maturação e activação das células B. Estes marcadores são úteis na identificação fenotipica das células B.

Enquanto que as imunoglobulinas das células B actuam na substância estranha, ou antigénio, crê-se que as células T, e particularmente as células T auxiliares são necessárias para estimular as células B a dividirem-se e a diferenciarem-se em células segregadoras de anticorpos para a imunidade humoral.

As células T supressoras contribuem para a regulação da imunida_ de humoral, enquanto que as células T citotóxicas e os mediadores de células T de hiper-sensibilidade do tipo retardado são os principais intervenientes de imunidade?por células.

As células T incluem antigénios designados por Lyt 1, 2 e 3, bem como por L3T4, que estão relacionados com as funções das células T. Cs precursores de células T auxiliares são do fe notipo Lyt 1,2,3, L3T4T. São estas células que participam normalmente na activação e na regulação das células B.

E conhecido que as células T auxiliares auxiliam a activação e a diferenciação das células B segregando imunoglobulina após as células B receberem uma primeira mensagem do agente antigénico activante. Contudo, o modo pelo qual as células T for69 197

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-6necem a segunda mensagem para a proliferação, activação e dife renciaçao às células B, é uma matéria controversa.

O monofosfato de guanosina-35 *-cíclico (cGMP) tem sido implicado com um agente natural que fornece a segunda mensagem requerida para a proliferação de células B. Tem-se verificado que o monofosfato de 8-bromoguanosina-3',5 *-cíclico (8-BrcGMP) é um mitogeno de linfocito intracelular sintético fraco.

A imuno-resposta pode ser modificada por supressão arti ficial (imuno-supressão) ou por melhoria artificial (imuno-potenciação ou imuno-estimulação). A imuno—supressão i.e., uma menor resposta induzida artificialmente, pode ser conseguida por seis métodos gerais:

Cl) administração de antigénio, (2) administração de anti-soros ou anticorpos específicos, (3) uso de outros reagentes biológicos tais como anti-soros anti—linfócitos, f4) uso de drogas ou hormonas, (5) radiação e (6) remoção cirúrgica do tecido linfói. de. A imuno-potenciação pode incluir a administração de um agen te que efectua um aumento na velocidade à qual a imuno-resposta se desenvolve um aumento na intensidade ou no nível da resposta, um prolongamento da resposta, ou o desenvolvimento de uma resposta a uma substância que, de outro modo, seria não-imunogénica .

Cs agentes conhecidos que aumentam as imuno-respostas são geralmente designados por adjuvantes e podem ser incluídos em duas categorias gerais: (1) os que conferem uma potenciação geral; i.e., substâncias que aumentam as imuno-respostas tanto celulares como humorais para uma grande variedade de antigénios, e (2) os que conferem uma potenciação específica; i.e., substân cias que aumentam respostas específicas apenas a certos antigénios .

As substâncias que podem actuar como adjuvantes podem ser agrupadas nas categorias seguintes: (1) emulsões de água-er-óleo, p.e., o adjuvante de Freund, (2) polinucleótidos sintéti. cos, C3) hormonas, drogas e nucleótidos cíclicos, (4) endotoxi nas, f5) linfoquinas e monoquinas proteináceas tais como interleuouinas.

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-7 O factor de transferência, um extracto de leucócitos dia. lisavel (DLE) obtido a partir de leucócitos periféricos humanos é uma substância, capaz de potenciar especificamente a imuno-resposta. Tem sido publicado que o factor de transferência exi. be alguma eficácia em pacientes com imunodeficiências e uma pos. sível eficácia em pacientes cancerosos e em pacientes com imuno deficiências limitadas. Contudo, ainda é preciso aprender muito acerca desta substância particular.

Em algumas doenças e condições fisiológicas tais como a SIDA, agamaglobulinemias X-ligadas, senescência e imuno-supressao induzida por drogas, a activaçâo e a diferenciação de células B estão ausentes e/ou existem apenas a um nível reduzido, di. minuindo deste modo a imuno-resposta do hospedeiro. Estas doenças e condições são representativas de estados imuno—suprimidos. Aqui, a activaçâo e diferenciação melhoradas, se se puderem efe. ctuar tendem a minorar beneficamente a manifestação da doença e/ou a melhorar a condição do paciente.

Um estado imuno-potenc iado pode ser ilustrado Tela condi, ção do organismo após a vacinação. Aqui, a imuno-resposta está já aumentada devido a uma resposta antigénica, mas pode ser beneficamente melhorada ainda mais para se obter um maior grau e/ /ou uma maior duração da imunidade.

A Patente dos E.U.A. n?. 4 539 205 transmitida, de Goodman e Weigle descreve a modulação de respostas celulares animais com derivados de guanina 8—substituídos ligados 9-1' a uma aldose com 5 ou 6 átomos de carbono na cadeia de aldose (anel). As modulações celulares que se descrevem nessa patente referem— -se, na sua maior parte, a imuno-modulação, tal como adjuvanticidade na produção de imuno—respostas primárias e secundárias. Descreve-se também a actividade contra certas condições neoplás. ticas, bem como, a actividade de substituição de células T, uma actividade do tipo IL-1 em timocitos, e a indução da libertação de enzimas lipossómicas de neutrófilos. Nessas moléculas, os su bstituintes na posição 8 têm efeitos indutores de atracção de electões em relação ao hidrogénio. Assim, descreveram-se como

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-8úteis substituintes tais como halogéneo, mercapto e o seu tan tómero tioxo, acilmercapto, aIquilsulfureto, nitro, ciano, ce to, halometilo e metilenoxialquilo e similares enquanto se ve rificou que substituintes doadores de electrões, tais como um grupo amino, eram inactivos.

Adicionalmente, a patente dos E.U.A. n⁹ 4 643 992, transmitida, e o seu pedido de patente Europeia n⁹. 83306791.1, publicado, correspondente, descrevem ainda o uso de derivados de 8-hidroxiguanina (8-oxoguanina), 7-metil-8-oxoguanina e 7-me til-8-tioxoguanina na modulação de respostas celulares animais. Na Patente dos E.U.A. n⁹ 4 643 992 descrevem-se também outros resultados usando os derivados de guanina que se descrevem na Patente dos E.U.A. n⁹. 4 539 205, bem como resultados similares usando derivados de guanina que se descrevem pela primeira vez nessa patente.

Têm também sido publicados vários artigos e capítulos de livros por alguns dos presentes inventores e pelos seus colaboradores, relativos ainda a outros aspectos dos compostos que se descrevem e reivindicam na Patente dos E.U.A. n⁹. 4 643 992. Exemplos desses artigos publicados são Goodman, Proc. Soc. Exp. B i o1« Me d., 17 9:4 7 9 (1985); Goodman, J. Immunol., 13 6 :3335 (1986); Goodman e Weigle em Purine Metabolism In Man, Part B, Nyhan e Thompson, eds., Plenum Press, New York, pág. 451 e 443 (1986); Goodman e Weigle, J. Immunol», 13 5 :3 2 84 ( 1985); Goodman e Wolfert, Immunol. Res., 5.:71 ( 1986); Goodman, J. Immunol.,

137:3753 (1986); e Goodman e Hennen, Ce 11. Immunol., 102:3 95 (1986).

Breve Sumário da Invenção

Os derivados de guanina—nucleósido 7,8-dissubstituídos (derivados de guanina) são utilizados para melhorar uma imuno-resposta em células humanas e animais. Os derivados de guanina -nucleósido substituídos têm uma estrutura que corresponde à f órmula

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onde X é 0, S, Se ou NCN; R^ é um radical hidrocarbilo substituído com heteroátomos, que tem um comprimento superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo, e que está isen ,23 to de carga iónica aos valores de pH fisiológicos; R e R são radicais Iguais ou diferentes seleccionadas entre o grupo consis tindo de hidrogénio, hidroxilo, alcoxilo de cadeia curta, alca2 3 noiloxilo de cadeia curta e benzoxilo, ou R e R constituem juntos um radical alquilidenodioxilo de cadeia curta; e R é se leccionado entre o grupo consistindo de hidrogénio, alcanoilo de cadeia curta e benzoilo. Os derivados de guanosina preferidos do presente invento são aqueles onde X é 0 ou S e R^ tem um com primento total (incluindo o heteroátomo substituinte suDerior ao do etilo e inferior aproximadamente ao do heptilo. Derivados de guanosina particularmente preferidos são a 7-f 2-c loroetil''-8-oxoguanosina, a 7-carbetoximetil-8-oxoguanocina, a 7-carbamoilmetil-8-oxoguanosina, a 7-metoxieti1-8-oxoguanosina, a Ί—(4-nitrobenzil)-8-oxoguanosina, a 7-(4-metoxibenzil)-8-oxogua nosina e a 7—(2,3-di-hidroxipropil)-8-oxoguanosina. São também contemplados os sais de adição de base, não tóxicos e farmaceu ticamente aceitáveis, destes compostos.

presente invento contempla também uma composição me lhjo radora de imuno—resposta que conuem uma quantidade diluente de um transportador fisiologicamente tolerável conjuntamente, com uma quantidade eficaz potenciante (ou imuno-estimulante) de um derivado de guanina—nucleósido, substituído com heteroátomos, anteriormente referido como ingrediente activo_c

E também contemplado um método de melhorar uma imuno—res

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-IO posta e particularmente uma imuno-resposta específica de antigénio. Aqui, pôem-se os leucócitos em contacto num meio aquoso

i.e., em cultura ( in vitro) ou in vivo, com uma composição con tendo uma quantidade imuno-estimulante de um derivado de guani. na-nucleos ido anteriormente descrito. Mantém-se o contacto entre a composição e os leucócitos por um período de tempo suficiente para que as células postas em contacto manifestem a melhoria da sua imuno-resposta. Os leucócitos postos em contacto são preferivelmente linfócitos B.

O presente invento tem vários benefícios e vantagens.

Um benefício saliente do presente invento reside no facto de os seus compostos serem geralmente mais eficazes; i.e., conferem uma resposta similar para uma dose menor ou conferem uma resposta melhorada para uma dada dose, do que os imuno-estimulantes de guanosina anteriormente conhecidos.

Uma vantagem do presente invento consiste no facto de o uso de uma das suas composições poder fornecer a segunda mensa gem requerida para a activação e diferenciação dos linfocitos B, em resposta a uma primeira mensagem (antigénica).

Outra vantagem do presente invento consiste no facto de se poder conseguir a imuno-resposta melhorada tanto na presença como na ausência de actividade de células T auxiliares. Assim, nota-se uma imuno-resposta melhorada em sistemas dependen tes de células T e em sistemas independentes de células T.

Outra vantagem do presente invento reside no facto de se poderem melhorar e/ou minorar condições, imuno-suprimidas ou imuno-deficientes, e manifestações de doença particulares pelo uso da invenção.

Ainda outros benefícios e vantagens da invenção serão evidentes para os peritos na arte a partir da descrição que se segue.

Usam-se aqui descrições antropomórficas tais como o envio e a recepção de mensagens por e para produtos químicos e células, para propósitos descritivos como auxílios para a com69 197

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-11preenção dos fenómenos observados.

Descrição Detalhada da Invençgp

I . Introdução

O presente invento contempla um agente melhoradorda imu no-resposta. (imuno-estimulante) que estimula o imuno-sistema do mamífero hospedeiro ao qual é administrado, bem como leucò'citos numa cultura de células. A imuno-estimulação particularmente contemplada é predominantemente específica do antigénio para o antigénio imunizante.

Ao estudar os efeitos de alguns derivados de guanosina nitogénicos conhecidos, p.e„, o monofosfato de guanosina-3‘,5 * -cíclica e o seu derivado de 8-bromo, verificou-se que uma nova classe de derivados de guanina-nucleósido de baixo peso mole cular, quando presentes numa quantidade eficaz como ingrediente activo de uma composição contendo uma quantidade diluente de um transportador fisiologicamente tolerável, tinha efeitos notáveis na modulação de respostas de células de mamíferos. A melhoria das imuno-respostas humorais específicas de antigénio, que resul tou numa adjuvanticidade potente, a actividade do tipo factor de substituição de células T e a actividade de imuno-reconstituição são exemplos particulares de respostas celulares que se verificou serem moduladas. As Patentes dos Ξ .U .A. n? 4 539 205 e n?

643 992 descrevem esses compostos e os seus métodos de utilização.

Tem-se verificado que os compostos do presente invento são surpreendentemente mais activos do que os compostos das duas patentes anteriores. As constatações de uma actividade me lho rada foram surpreendentes por um certo número de razões.

O composto mais activo que se descreveu nas patentes dos

G.U.A. anteriores foi a 7-metil-8-oxo-guanosina (7m80Guo), tancorro to como mitogeno de leucócitos como/adjuvante específico de antigénio. Tal como aqui a seguir se descreve, a mitogenicidade e a adjuvanticidade são fenómenos que não estão necessáriamente relac ionados.

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-12Em face dos resultados subsequentemente obtidos foi surpre endente que a 7m8oGuc exibisse uma actividade melhorada em relação a compostos tais como a 3—hidroxiguanosina (designada como o seu tautómero, 8-oxoguanosina; 8oGuo), ou a 8-mercaptoguanosina (designada por 8MGuo ou como o seu tautómero 8-tioxoguancsina). Mais especificamente, resultados subsequentes, alguns dos quais são aqui depois apresentados, revelaram que a actividade (tanto a mitogenic idade como a adjuvant icidade) de uma série de guanosi. nas 8-substituídas diminui com o aumento do tamanho do grupo substituintes na posição 8.

Assim, uma vez que o grupo metilo da 7m8oGuo está ligado ao anel de guanosina na posição adjacente à posição 8 onde se ve rificou a existência de um efeito da dimensão do substituinte, se ria de esperar que a adição desse grupo ou de qualquer grupo na posição 7, onde anteriormente não havia qualquer substituinte, pr vocasse também uma diminuição na actividade, meramente em virtude da molécula em questão ser maior numa posição adjacente à posição do anel sensível à dimensão do substituinte. A adjuvanticidade me lhorada de compostos do presente invento com substituintes ainda maiores na posição 7 do anel de guanosina em relação a 7mBoGuo foi ainda mais surpreendente.

II . Os Compostos

Os compostos imuno-estimulantes aqui contemplados são der vados de guanina-nucleósido 7,8-di-substituídos (também aqui des gnados por guanosinas ou por derivados de guanosina). Estes compostos tem estruturas que correspondem à fórmula I que a seguir se apresenta •a| *h |

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-13onde X é O, S, Se ou NCM;

r1 é um radical hidrocarbilo substituído com heteroátomos, com um comprimento total superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo, e isento de uma carga iónica aos valores de pH fisiológico;

3

R e R são radicais iguais diferentes seleccionados entre o grupo consistindo de hidrogénio, hidroxilo, alcoxilo de cadeia 2 3 curta, alcanoiloxilo de cadeia curta e benzoxilo, ou R e R formam juntos um radical alquilidenodioxilo de cadeia curta; e

R⁴ é um radical seleccionado entre o grupo consistindo de hidrogénio, alcanoilo de cadeia curta e benzoilo.

E de notar que o grupo ribosilo na fórmula anterior preten de ser mostrado ligado na posição 1, desse anel estando a ligação na configuração beta. Adicionalmente deve entender-se que está pressuposta a forma D do grupo ribosilo.

Os derivados de guanosina preferidos são aqueles onde X é

O ou S, R^ tem um comprimento superior ao de um grupo-etilo e 2 3 aproximadamente inferior ao de um grupo heptilo, e R e R são d_i ferentes de alquilidenodioxilo de cadeia curta. Na prática particularmente preferida, X é O, R⁴ é seleccionado entre o grupo consistindo de 2-cloroetilo ( -CH ₂<7Η C 1) , carbetoximet ilo (-Ch^CO^C^H^), carbamoilmetilo C-CH₂CONH ), metoxietilo (-CH-CH OCH^), 4-nitrobenzilo, 4-metoxibenzilo, e 2,3-di-hidroxiz z ₂ ^J 3 . 4 propilo, R e R são hidroxilo, e R é hidrogénio. Muito preferi— ^z 1 no velmente, X é 0, R é 4-nitrobenzilo ou 2-cloroetilo, R^z e R^J são 4 hidroxilo e R é hidrogénio.

Tal como anteriormente se referiu, um radical R⁴ tem um comprimento superior ao de um grupo etilo, e assim, inclui grupos etilo substituídos com heteroátomos onde é substituinte tem um ta manho superior ao de um átomo de hidrogénio. Um radical R⁴ tem também um comprimento que é inferior ao de um grupo decilo. Isto equivale a dizer que R é um radical hidrocarbilo, substituido com heteroátomos com um comprimento da cadeia mais comprida, incluindo o substituinte, que é superior ao de uma cadeia saturada de dois átomos de carbono e inferior ao de uma cadeia saturada de dez átouAD ORIGINAL I

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-14mos de carbono. Cada comprimento incluindo os átomos de hidrogé nio apropriados. Um grupo hidrocarbilo substituído com heteroátomos, designado simplesmente por propilo, butilo, hexilo ou de cilo, ou similar, substituído com heteroátomos, deve ser entendido como sendo um radical hidrocarbilo de cadeia linear normal. Os radicais de cadeia ramificada substituídos com heteroátomos são indicados usualmente pelos prefixos numéricos ou abreviados tais como 2-propilo ou isopropilo, respectivamente.

Os comprimentos da cadeia do radical hidrocarbilo substituído com heteroátomos são medidos ao longo da cadeia mais comprida no substituinte. Essa cadeia mais comprida pode ou não incluiu o grupo de heteroátomos substituintes. Estes comprimentos podem ser facilmente calculados usando ângulos de ligação, comprimentos de ligação e raios atómicos publicados, como f ôr neces sário para desenhar e medir comprimentos de formas de cadeias alternadas dos radicais, ou construindo modelos usando conjuntos de construção comercialmente disponíveis cujos ângulos de ligação, comprimentos e raios atómicos estão de acordo com os valores publicados normalmente aceites. Adicionalmente, podem estimar-se comprimentos aproximados do substituinte assumindo que os compri mentos de ligação não saturadas, ângulos de ligação e raios atómicos, bem como os dos heteroátomos substituintes, são idênticos aos dos átomos de carbono saturados, ainda que se prefiram os mo dos de medição anteriormente referidos.

R1 é um radical hidrocarb. com um comprimento particular, e confere carga iónica aos valores cal substituído com heteroátomos amina ou de uma base carboxílica acéticos cujos valores de pKa sãc cuia possuisse carga iónica aos \ ilo substituído com heteroátomos que está isento de um grupo que de pH fisiológicos. Assim o radi. na posição 7 está isento de uma ou de outros grupos básicos ou 3 tais que fariam com que a mole ralores de pK fisiológicos.

Os hidrocarbonetos e os radicais hidrocarb próprios, ser divididos genericamente em radicais aromáticos. Radicais alifáticos úteis incluem (i) (radicais alquilo)e (ii) alcenos mono-insaturados ilo podem, eles alifáticos e alcano saturado e alcinos (radi

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SCR? 124.CL

-15cais alcenilo e alcinilo, respectivamente). Para cada tipo de ra dical alifático existem radicais cíclicos de cadeia linear e de cadeia ramificada. Radicais aromáticos úteis incluem radicais aralcano que contêm um anel aromático ligado a um grupo alifático. Num radical R¹ contemplado, cada um desses radicais hidrocar bilo está adicionalmente substituído com um heteroátomo (um átomo sem ser de carbono ou um átomo de hidrogénio).

Os radicais R^ têm um comprimento superior ao de um grupo etilo e um comprimento inferior ao de um grupo decilo. Quando o radical é um radical alquilo substituído com heteroátomos esses radicais alquilo podem ser designados por radicais alquilo de cadeia curta substituídos com heteroátomos. Os radicais alquilo

C„-C substituídos ccm heteroátomos incluem vários membros da cias 2 o — se aqui designada por radicais alquilo de cadeia curta que são úteis como radicais alquilo substituídos com heteroátomos tal como aqui depois se discute. Assim, é apropriado discutir nesta altura os radicais alquilo de cadeia curta.

Os grupos e radicais aqui designados por de cadeia curta contêm de 1 a cerca de 6 átomos de carbono, e preferivelmente, contêm de 1 a cerca de 3 átomos de carbono. Rsta definição a plica-se ao uso da designação de cadeia curta tal como é aqui 12^4 utilizado em todos os grupos R , R , R e R .

Radicais alquilo de cadeia curta incluem, por exemplo, me tilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, t-butilo, n-pentilo, 3-meti1-2-butilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, ne o-pentilo, n-hexilo, 1-metilpentilo, 3-metilpentilo, 1-etilbutilo,

2-etilbutilo, 2-hexilo, 3-hexilo e similares. 0 grupo de radicais

R alquilo C_ substituídos com heteroátomos inclui radicais me2 — o tilo apropriadamente substituídos com heteroátomos do grupo dos radicais alquilo de cadeia curta, e inclui também radicais heptilo, octilo e nonilo substituídos com heteroátomos bem como outros radicais, tais como o radical 2-metil-heptilo substituído com heteroátoraos, que são radicais alquilo de cadeia curta substituídos com alquilo substituído com heteroátomos. No entanto, como os ra1 dicais R mais preferidos têm um comprimento superior ao do etilo e a próximadamente inferior ao do heptilo, os radicais alquilo de

RA D O oiti

GIN Aí

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-16cadeia curta mais preferidos para R^ incluem metilo, apropriadamente substituído com heteroátomos bem como propilo, butilo, pen tilo, 1-metilbutil, 2-metilbutilo, e similares, substituídos com heteroátomos.

Radicais alquilo substituídos, R^ incluem alquilo C₂-Cθ substituído com halogéneo, hidroxi- e poli-hidroxi- alquilo C2“Cg, carboxilato de alquileno-C₂-Cg-alquilo de cadeia curta, éter de di-alquilo de cadeia curta (alcoxilo de cadeia curta alquilo de cadeia curta), e radicais alcoxilo de cadeia curta-alquilC^_^carbonilo não substituídos, bem como outros radicais monoe di—alquilo de cadeia curta (alquilo de cadeia curta) carboxamido nó qual a oorção do grupo carboxamido do radical tem a fórmula

6 1

CONR R . Estes radicais R sao aqui depois discutidos.

Os radicais hidroxi-aIquiloC^-Cg incluem 2-hidroxietilo,

2-hidroxipropilo, 3-h idr oxipropilo, 3-hidroxi-2-butilo, 3-hidroxi_ -2,2-dimetilpropilo, 6-hidroxi-hexilo e similares.

Outro grupo de radicais R^ alquilo substituído_é um subgru po de radicais hidroxi-alquilcC_-C que são radicais C_-C^ que contêm um grupo hidroxilo, espaçado dois átomos de carbono de um outro substituinte que é seleccionado entre o grupo consistindo de substituintes azido,éter e tioéter onde os grupos éter e tioéter contêm até cerca de três átomos de carbono. Este subgrupo pode ser encarado como o produto da reacção de um epóxido e de um nucleófilo. 0 grupo hidroxilo que se forma a partir do epóxido e do nucleófilo está muito preferivelmente ligado a uma cadeia de três átomos de carbono tal como a que é fornecida pela reacção da epicloro—hidrina ou da epibromo-hidrina com uma guanosina apro priada seguida da reacção do epóxido resultante com o nucleófilo.

Gs radicais poli-hidroxialquilo C-Cincluem 2,3-di-nidro xipropilo, 3,4-di-hidroxibutilo, sorbitilo e similares. Os peritos na arte entenderão que os polióis contemplados contêm não mais do que um grupo hidroxilo em cada átomo de carbono do grupo alquilo de cadeia curta.

Os radicais alquiloC₂-C_g substituídos com halogéneo incluem, DreferiveImente, um ou mais átomos de cloro, bromo, fluor ou

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-17iodo ligados a um radical alquilo C_-C_o. Exemplos de radicais su z o ~~ bstituídos com halogéneo incluem, 2-cloroetilo, 2,2,2-trifluoroe tilo, 2-bromobutilo, 2-cloro-hexilo, 2,3-dicloro-octilo, hidrocar bilo per-halo-substituído e similares.

Os radicais carboxialquilo de cadeia curta incluem os radicais alquilo de cadeia curta anteriormente descritos, que incluem adicionalmente como substituinte um grupo carboxilo (-CC2H). Assim um radical 7-CK₂CC>2H é considerado um radical metilo substituído com um carboxilo. Os radicais carboxialquilo de cadeia curta não estão eles próprios contemplados como substituintes r\ na medida que conferem carga iónica ao derivado de guanina aos va lores de pH fisiológico. Contudo, os derivados éster e amida de radicais carboxialquilo de cadeia curta estão contemplados.

Os radicais alcoxilo de cadeia curta-alquilo de cadeia cur ta-carbonilo podem ser encarados como ésteres de radicais carboxi alquilo de cadeia curta com a'lcoois de alquilo de cadeia curta, tais como os álcoois de metilo, etilo, isopropilo, ter-butilo e neo-pentilo. Exemplos de radicais carboxialquilo de cadeia curta incluem carboximetilo, 2-carboxietilo, 2-carboxi-hexilo e similares. Exemplos de radicais alcoxilo de cadeia curta-alquilo de cadeia curta-carbonilo incluem, carbetoximetilo (também conhecido por carboetoximetilo), 3-isopropoxicarbonilpropilo, 4-hexiloxicarbonilpentilo e similares.

Os radicais alquilo de cadeia curta-carbonilamino substituí do com mono- e di-alquilo de cadeia curta (alquil de cadeia curta -carboxamido onde a porção do grupo carboxamido do radical tem uma fórmula CCMR^R^)podem ser encarados como sendo formados a par tir de um grupo carboxialquilo de cadeia curta substituinte, na posição 7 e amónio, bem como uma mono-alquil de cadeia curta— ou alcanolC^-C^-amina ou di-alquil de cadeia curta- ou di-alcanol C₂-C’₃-amina, respectivamente, onde os radicais alquilo de cadeia curta são como anteriormente se descreveu, e onde as porções alca ^nolc2““3 ^s^° ²-hidroxietilo, 3-hidroxipropilo de 2-h idr ox ipropi lo. Exemplos, destas aminas incluem, metilamina, propilamina, secbutilamina, hexilamina, dimetilamina, metiletilamina, butil-hexilamina, 2-hidroxietilamina (etanolamina), 2-hidroxipropilamina,

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In o — (isopropanolamina), dietanolamino, di-isopropanolamina, metiletanolamina, 3-propanolamina e similares. As amidas de aminas se cundárias cíclicas com cinco ou seis átomos no anel podem ser en caradas como sendo formadas a partir de um grupo carboxiaIquilo de cadeia curta e de uma amina ciclíca secundária tal como pirrolidina, morfolina, piperidina, pirrolo ou 4-metilpiperazina.

A porção do grupo carboxamido de um radical carboxamidoal quilo de cadeia curta tal como os anteriores, tem a fórmula CONR R onde Pd e R° são iguais ou diferentes e são seleccionados entre o grupo consistindo de hidrogénio, alquilo de cadeia curta e alcanol Alternativamente, NR^R^ podem formar juntos utn anel heterocíc1ico com cinco ou seis átomos no anel. Assim podem descrever-se estes 7-substituintes como sendo radicais carboxamidoaIquilo de cadeia curta cuja porção do grupo carboxamido tem a fórmula CONR R°.

Um radical de carboxilato de alquilenoC₂-Cgalguilo de cadeia curta pode ser encarado como um éster de um radical substituinte hidroxialqui1oC -C, ou poli-hidroxiaIquiloC_-C ' e de um ácido alquil de cadeia curta-carboxílico. Discutiram-se anterior mente exemolos de substituintes h idr ox ia Icui loC _-C _ . As nornões 2 6 ^y alcanoilo de cadeia curta (acilo de cadeia curta) de ácidos aloui de cadeia curta-carboxílicos que podem estar presentes nestes ésteres incluem formilo, acetilo, propionilo, 2-metilpropionilo, butirilo, 3-metilvalerilc e similares. Como grupos R e R são contemplados grupos alcanoiloxilo de cadeia curta, formados pela esterificação de um grupo 2'- e/ou 3'-hidroxilo, e de um ácido al quilo de cadeia curta-carboxi1ico, tais como os anteriores. Como 4 radicais R sao contemplados grupos alcanoilo de cadeia curta rrue se formam similarmente pela esterificação de um grupo 5-hidroxi — lo.

Um radical alauilenoC„-C,-alauilo de cadeia curta-carboxa 2 o — mida é também contemplado como sendo um substituinte 7-hidrocarbilo substituído com um heteroátomo. Zste radical pode ser encarado como uma amida formada entre um radical a lerui loC „ -C substi 2 O — tuído, com um grupo amino primário ou secundário, e um ácido albad oaioina:

-----------—

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124.03 to I -Hl

-19- ~ ouil de cadeia curta-carboxílico. Os radicais alguiloC„-C^ su2 o bstituídos com um araino primário ou secundário (bem como atninas terciárias similarmente substituídas) nao são também eles próprios aqui contemplados na medida em que os seus grupos amino conferem uma carga iónica ao derivado de guanina aos valores de pH fisiológicos. Ácidos alquil de cadeia curta-carboxílicos úteis, presentes nestas amidas, são os que anteriormente se di cutiram. Exemplos de radicais alouiloC_n-C- substituídos com am * Z Ό na primária e secundária incluem radicais 2-aminoetilo, 2—amino propilo, 2-(isopropil)aminoetilo (3-aza-4-metilpentilo) e similares.

Ê de notar que um éster ou uma amida, tal como anteriormente se descreveram nos parágrafos anteriores, pode ter, teori camente um comprimento superior ao de um grupo decilo. Porém, tal como anteriormente se referiu, um radical R¹ tem um comprimento que é inferior ao de um grupo decilo. Assim, um éster formado a partir de um alquilcarboxilato com seis carbonos e de um álcool de alquilo de cadeia curta com seis carbonos, é excluído pois é mais comprido do que um grupo decilo. â também de notar que os radicais R^ preferidos têm um comprimento que é inferior, aproximadamente, ao de um grupo heptilo, e essa preferência mantém— -se para os ésteres e amidas anteriormente descritas .

Ainda outro grupo de substituintes hidrocarbilo 7-substituídos é constituído pelos radicais éter di-alquilo de cadeia curta, que podem também ser designados por radicais alcoxilo de cadeia curta-aIquilo de cadeia curta. Estes éteres de di-alquilo de cadeia curta podem ser considerados como grupos alquilo,nos quais um ou mais grupos metilenoí-CH^-) estão substituídos com um átomo de oxigénio (-C-). Exemplos de radicais éter úteis inclu em radicais me t ox ime t i lo, metoxietilo, etoxietilo, etoxi-2-propilo e similares .

A discussão anterior referiu-se a 7-substituintes que são radicais alquilo de cadeia linear ou ramificada (alifáticos) substituídos com heteroátomos. Os compostos do presente invento in cluem também radicais ciclo-alifáticos substituídos, alifáticos bad ORIGINAL

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SC:

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-20etilenicamente não saturados e aralquilo. Cada um desses radicais pode estar substituído com heteroátomos, como anteriormente se discutiu para os radicais alquilo de cadeia linear ou ramificada .

Por exemplo, podem utilizar-se radicais cíclicos alifáticos substituídos com heteroátomos, tais como o ácido ciclopenta nocarboxílico ou o ácido ciclobutanocarboxílico, para formar um éster ou uma amida com um álcool de alquilo de cadeia curta ou uma amina 7-substituídos , resnectivamente , anteriormente refer_i dos, 0 mesmo se passa no caso dos ácidos carboxílicos cíclicos etilenicamente não saturados tais como o ácido 2-ciclopenteno-1-acético. Similarmente, podem utilizar um álcool cíclico tal como o ciclo-hexanol ou o 2-c ic lo-hexeno-l-ol, o ciclopropilcarbinol ou uma amina cíclica tal como o cic1obutilamina ou a ciclo-hexilamina, para formar um éster ou uma amida, respectivamen te, com um radical 7-alquilcarboxilo anteriormente discutido tal como um radical carboximetilo. podem também usar-se álcoois e áci dos carboxílicos etilenicamente não saturados tal como o 3-butino —l-ol, e o ácido 3,3-dimetilacrílico na preparação de ésteres e de amidas tal como anteriormente se discutiu.

Os radicais aralquilo substituídos são radicais R particu larmente contemplados. Sxemplos de radicais aralquilo incluem os radicais benzilo e feniletilo, e esses radicais estão substituídos nos seus aneis fenilo com um on dois, preferivelmente, um substituinte com heteroátomos seleccionados entre o grupo consistin 5 6 5 do de nitro, ciano,carboxamido (-GCYR R onde R e R~ são definidos como anteriormente), haiogéneo, alcoxilo de cadeia curta, car bonilalcoxi1o de cadeia curta, hidroxilo e aIcanoiloxilo de caia curta .

iterado que o requisito do comorimento total R se mantém,

Preferem-se os substituintí num gruoo benzilo

7UC grupos atractores electroes em relação ao hidrogénio ;or efei to Oí ressonância ou indutivo, tal como os ouc screvem em

o., bine, Phys ic a 1 Organic Chemistry, 2 a ed., ycGraw-Hil1 Book C

Xew York, pág, 85-93 (1962) tais como o ciano, nitro e haiogéneo.

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-2 1Um radical 4-nitrobenzilo é um radical particularmente preferido, tal como o é a 7-(4-nitrobenzil)-B-oxoguanosina, um derivado de guanina particularmente preferido da invenção.

Dos radicais hidrocarbilo substituídos com heteroátomos anteriores, preferem-se os radicais alquilo de cadeia linear substituídos e os radicais benzil-hidrocarbilo com um comprimento superior ao do etilo e um comprimento inferior, aproximadamente, ao de um grupo heptilo. Desse grupo preferido, os radicais alqui lo substituídos com halogéneo,alcoxi de cadeia curta-alquil de cadeia curta-carbonilo, alquil de cadeia curta-carboxamido 5 6 onde o gruno carboxamido tem a fórmula CONR R , alcoxi de cadeia curta-aIquilo de cadeia curta, e benzilo cujo anel fenilo está su bstituído com um grupo atractor de elect^rões em relação ao hidrogénio, são radicais particularmente preferidos.

3

Os radicais R e R podem ser iguais ou diferentes e são seleccionados entre o grupo consistindo de hidrogénio, hidroxilo, alcoxilo de cadeia curta, alcanoiloxilo de cadeia curta e benzilo. 2 3,

R e R podem também formar juntos um radical alquilidenodioxilo de cadeia curta 2¹,3'-cíc1ico. Discutem-se seguidamente exemplos 2 3 de radicais R e R .

Cs radicais alcoxilo de cadeia curta são radicais alquilo de cadeia curta ligados ao anel açúcar (ribose) da guanina através de um átomo de oxigénio do açúcar. Exemplos de radicais alco xilo de cadeia curta incluem metoxilo, etoxilo, iso-propilo, butoxilo, hexiloxilo e similares. Os radicais alcanoiloxilo são és teres que se formam entre um grupo hidroxilo do anel de açúcar da guanina e um ácido alquil de cad.eia curt a-carbox í 1 ic o . Exemplos de radicais alcanoiloxilo de cadeia curta incluem, formoxilo, ace toxilo, propionoxilo, nexanoiloxilo e similares. Os derivados ace tal e cetal de alquilo de cadeia curta dos grupos 2'- e 3'-hidroxilo, são designados por aIquilidenodioxilo de cadeia cur -cíclicos ou mais simplesmente, por radicais aIquilidenodioxilo de cadeia curta. Estes radicais formam-se pela reacção de um aldeído, tal como formaldeído, acetaldeído ou similares, ou de uma cetona, tal como acetona ou metiletilcstona, com os grupos 2'- e o » Dl tl iÍÓMAU

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-2 23'—hidroxilo de um grupo ribosilo da guanosina substituído.

Pref ere-sí

3 que R e R sejam hidroxilo, aIcanoiloxιlo de cadeia curta ou benzoxilo, e mais preferivelmente, hidroxilo ou 2 3 acetoxilo. Quando os radicais R e R são aIcanoiloxilo de cadeia curta ou benzoxilo, esses radicais podem perder-se durante, ou logo após o passo de contacto com leucócitos de um método da invenção e,deste modo, podem constituir uma forma pró-droga do 2 3 derivado de guanosina. Muito preferivelmente, R e R são hidro xilo.

R é um radical seleccionado entre o grupo consistindo de hidrogénio, alcanoilo de cadeia curta e benzoilo. í-Iuito preferivelmente, R⁴ é hidrogénio. Quando R⁴ é alcanoilo de cadeia curta ou benzoilo crê-se também que o radical contendo o grupo carboxi lo possa ser clivado tal como anteriormente se descreveu, consti tuindo de novo uma pró-droga.

Uma guanosina útil está substancialmente isenta de carga iónica aos valores de pE fisiológico; i.e. cerca de pE 7,C a cer ca de pH 7,5 excepto para as carças iónicas que possam ser forne azoto do anel na posição 1,relativamente áci ác ioe lo á tomo cl do. Assim, uma molécula útil está isenta dí grunos c ontenoo do e base nu·.? não estão presentes na guanosina. Essa ausência d^; grupos ácidos e básicos estende-se do radical R⁴ e ao longo de toda a molécula de guanosina.

As guancsinas são ácidos, · adição de base. Estes sais/uteis nara se :oro tal, podem formar sais de ter estabilidade no arm. zenamento e não conferem uma carga iónica adicionada a um deriva do de guanina,usado num método da invenção,em virtude dc efeito tampão produzido pelos sistemas sanguíneo ro ou pelo tamoão de um meio de cultura.

o hospede

Cs sais oe adição de base, dos derivados de guanina não tóxicos e farmacéutica mente aceitáveis, são úteis no oresente vento a

o od e m preparados oor tratamento do aaení me lhorac or ’a imuno-rosposta com uma base apropriada, num solvente adequado tal como água ou um álcool de alquilo de cadeia curta, tal como metanol ou etanol. Exemplos de bases inorgânicas incluem, hidreBAD ORIGINAL

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Ξ ?G : 11

SCRF 124.08 xido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amónio e s imi. lares. Exemplos de bases orgânicas incluem tris-(hidroximeti1)aminometano (TRIS), ácido 4-( 2-hidroxiet i 1)-1-piperaz inaetanossuj. fónico (HEPES) e bases similares. Inversamente, a forma de sal de adição de base pode ser convertida na forma de guanosina livre por tratamento com ácido.

Os derivados substituídos de guanina-nucleósido úteis no presente invento sao facilmente preparados por procedimentos publicados na literatura química, ou por procedimentos análogos.

Na Secção de Materiais e Métodos descrevem-se vários exemplos de s ínteses .

A síntese dos derivados 7,8-dissubstituídos de guanina-nucleósido começa tipicamente com a ligação 9-1’-beta-aIdoglicó sido já formada, ainda que a formação inicial dessa ligação não seja requerida.

Em adição aos exemplos de sínteses que aqui depois se des crevem, apresentam-se aqui resumidamente três processos sintéticos gerais. Estes processos são exemplares dos métodos de síntese que se descrevem na literatura e são descritos usando uma 8-tioxoguanosina, substituída na posição 7 com um hidrocarbilo su bstituído com heteroátomcs, da invenção como o composto a ser preparado.

Num primeiro processo faz-se reagir uma 8-tioxoguanosina, substituída na posição 7 com um radical hidrocarbilo substituído com heteroátomos, com derivado de ribcse, substituído na posição alfa-1 com um grupo rejeitado, adequado, tal como alfa-l-cloro (ou bromo ou acetoxi)-2,3,5-tribenzoil-E-ribose, num solvente ade guado para formar o derivado de beta-ribosilo. Cs produtos da reacção são separados por -PLC para se obter o derivado de guanosina desejado.

Num segunde processo, exida-se a 7-a1i1-8-tioxoguanosina (22 444; Exemplo 2C) para formar o aldeído correspondente. Conden sa-se depois a ?-(2-etanol)-8-tioxoguanosina correspondente, por uma reacção de Wittig, Claisen, Reformatsky ou similar, oara formar uma guanosina não saturada substituída na posição 7 com um

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-24grupo substituído com heteroátomos que é separada dos outros produtos para uso, ou que pode ser reduzida ou halogenada antes de utilizar.

^pode também alquilar-se redutivamente o derivado de 7-Q-etanol) para formar um substituinte alquil de cadeia curta-amino a partir do qual se pode formar um radical alnuilencC„-C_r-alz o quil de cadeia curta-carboxamida. 0 derivado de 7-(2-etanol) po de ainda ser reduzido no derivado de 7-(2-etanol) correspondente, que é,ele próprio, útil e pode também ser esterifiçado para formar alquileno C₂-Cg-alquil de cadeia curta-carboxilato.

Num terceiro processo, utiliza-se o fecho do anel por uma reacçao de tiofosgénio com uma 2,5,6-triamino-4-hidroxipirimidina apropriadamente substituída. Mais especificamente, faz reagir uma 2-amino-4-hidroxi-6-beta-D-ribosilpirimidina, substituída na posição 5 com um hidrocarbilo substituído com heteroátomos, com tiofosgénio na presença de uma base extractora de ácido por forma a obter-se um derivado de 8-tioxoguanosina substituído na posição 7 com um hidrocarbilo substituído com heteroátomos, que po de ser separado dos outros produtos da reacção para uso.

III. As Composições

Uma composição do presente invento compreende uma quantidade diluente de um transportador fisiologicamente tolerável (também aqui designado por veículo ou diluente) misturada com uma quantidade eficaz imuno-potenciante (melhoradora da imuno-res posta ou imuno-estimulante) de um derivado substituído de guanina -nucleósido, ou de um seu sal, do presente invento anteriormente descrito.

am

Uma composição para ad entada, para administraç al de uma unidade de dosagem, seus equivalentes gramaticais rem-se a unidades fisicamente tárias para pacientes humanos de contendo uma quantidade ef de guanosina activo calculada ministração in vivo é tipicamente ão oral ou parenteral, na forma usuC termo unidade de dosagem e os , tal como são aqui utilizados, refe discretas adequadas como doses uni e para outros mamíferos, cada unida, icaz predeterminada do ingrediente para produzir o efeito terapêutico

Al

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SC?.? 124.C8 ,-x .<

íi»

-2 5desejado em associação com o transportador fisiologicamente tolerável requerido, tal como um diluente ou um veículo. As espsci ficaçSes para as novas formas de unidades de dosagem sao ditadas por e estão directamente dependentes (a) das características únicas do ingrediente activo de derivado de guanosina e do efeito terapêutico particular que se pretende obter, e (b) das limitações inerentes à arte de preparação de composições de um tal ingrediente activo para uso terapêutico in vitro, bem como in vi vo em humanos e em outros animais.

Exemplos de formas de unidades de dosagem adequadas de acordo com o presente invento incluem comprimidos, cápsulas, p_í lulas, pacotes de pó, grânulos, wafers e similares, múltiplos individuais de qualquer das formas anteriores, bem como soluções, emulsões e suspensões líquidas. As composições líquidas podem ser administradas pelas formas usuais, por exemplo subcutaneamen te, intraperitonealmente, intramuscularmente, per-ora Imente ou si milares .

A quantidade de ingrediente activo que é administrada in vivo como uma quantidade imuno-estimulante eficaz depende da idade e do peso do paciente, da condição particular a ser tratada, da frequência de administração e da via de administração. A gama de dose diária total pode ser de cerca de C,01 a cerca de 200 miligramas por cuilograma de peso de corpo, ma is preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 25 miligramas por quilograma de peso de corpo e muito preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 15 miligramas por quilograma de peso de corpo. A dose para um humano adulto está na gama de cerca de 5 a cerca de 1400 miligrama por dia, que administradas como uma dose simples quer divididas em 3 ou 4 doses. As dosagens veterinárias correspondem às dosagens humanas, estando em proporção com o peso e a velocidade meta bólica do animal em comnaração com humanos adultos.

Será de notar pelos peritos na arte gue as concentrações in vivo úteis podem variar de espécie animal para espécie animal Os peritos na arte sabem também gue as concentrações apropriadas podem ser facilmente determinadas.

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-26As concentrações para o contacto in vitro da células animais estão compreendidas entre cerca de 1x10 molar a cerca de 3x10 molar para concentrações de células de cerca de ΙΟθ-lC^ células por mililitro. Mais preferivelmente a concentração é de

-5 -4 cerca de 1x10 molar a cerca de 1x10 molar. Tal como se poderá observar aqui depois na secção dos Resultados a concentração de pico; i.e., a concentração com a qual se obtém a maior adjuvan ticidade, para uma dada guanosina, pode variar tanto quanto dez ou raais vezes, quando estudadas em sistemas de linfócitos murinos e huma nos .

Uma composição pode ser um sólido ou um líquido. Cs trans portadores fisiologicamente toleráveis são bem conhecidos na arte. Exemplos de transportadores líquidos incluem soluções aquosas estéreis que não contêm quaisquer materiais além do ingrediente activo de derivado de guanosina, ou que contêm um tampão tal como fosfato de sódio ao valor de pH fisiológico, solução salina fisio lógica ou ambos, por exemplo, solução salina tamponsda com fosfato. Cs transportadores aquosos podem conter também mais do que um sal tampão, bem como sais tais como cloretos de sódio e potássio, dextrose e outros solutos. Os últimos transportadores são exemplificados pela Injecção de Ringer, a Injecção de Dextrose e a Injecção de Dextrose e Cloreto de sódio e a Injecção de Ringer lactada .

As composições líquidas podem também conter fases líquidas além de, e com a exclusão de água. Exemplos destas fases adi, cionais incluem glicerina, óleos vegetais, tais como óleo de semente de algodão, óleo de sésamo ou emulsões de água em óleo.

Exemolos dc ansportadores sólidos incluem os material;

normalmente usados no fabrico de pílulas, ou comprimidos e ir.clu em amido de milho, lactose, fosfato de di-cálcio, espessantes tai como goma de tragacanto e metiIcelulese U.5.P., SiC^ finamente di vidida, polivinilpirrolidona, estearato de magnésio e similares. Adicionalmente, o transportador sólido pode incluir polímeros bio degradáveis e não biodegradáveis, transportadores de polipéotido, transportaiores de afinidade tais como o AFFI-GEL 6Cl 'resina de

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-27boronato de fenilo disponível nos 3io-RAD Laboratories, Richmond, Califórnia, S.U.A.), lipossomas e polímeros sintéticos tal como á conhecido na arte. Nas composições sólidas e líquidas podem es tar também presentes antioxidantes tais como metilparabeno e pro pilparabeno, bem como adocicantes tais como açúcar de cana de be terraba, sacarina de sódio, ciclamato de sódio e o adocicante de éster de metilo do dipéptido ácido aspártico-fenila lamina vendido com o nome comercial NUTRASWSST (aspartam ) por G.D. Searle C o.

IV. Método de Imuno-estimulação

É também contemplado um método para melhorar a imuno-resposta de leucócitos. Preferivelmente, a imuno-resposta é uma res posta específica de antigénio. De acordo com este método poém-se em contacto leucócitos, tais como, preparações de linfócitos, ce lulas S, células T, neutrófilos e macrofagos, separadamente ou em combinação, num meio aquoso, com uma composição,qu? anteriormente se descreveu,contendo uma quantidade eficaz imuno-estimulante de um derivado de guanina-nucleósido anteriormente descrito.

O método pode ser praticado in vivo em humanos, anima is de laboratório, tais como ratinhos, ratazanas e cobaias, ou em animais domésticos tais como porcos, cavalos, bovinos, cães e ga. tos. 0 método pode também ser praticado in v11ro em culturas de células tais como uma cultura de hibridoma para a produção de an ticcrpcs monoclonais.

C contacto com os leucócitos realiza-se num meio aquoso, incependentemente do facto de a composição ie derivado d e o ua η o sina ser ela própria um sólido ou um líquido ou de o líquido da composição ser ou não aquoso. Para o método in vivo, o meio aquo so é fornecido, pelo menos, em parte pela água do sangue ou da í mr a . Para os t ca os v11ro o meio aaucs o t or nec id o, mo:

'm pelo meio de cultura usado.

C contacto entre a composição e os leucócitos é mantido por um período de tempo suficiente para que as células postas em contacto manifestem a melhoria da sua imuno-resposta. A imuno-es· liAd UiíU-Liv

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-2 8timulação pode ela própria manifestar-se na proliferação celular, na secreção aumentada de anticorpos, na actividade aumentada de células T auxiliares, na produção aumentada de citocina de células T e de macrofagos, na secreção de enzima de neutrófilo, etc.

Os resultados específicos que aqui depois se discutem ilus tram respostas mitogénicas não específicas de células de baço murinas, bem como as respostas específicas de antigénio preferidas de células B murinas e de linfócitos de sangue periférico desprovidas de células T supressoras.

Outras imuno-melhorias, específicas de antigénio, ilustrativas que podem ser conseguidas usando um método da invenção incluem, a proliferação de células T, a reconstituição in vitro da imuno—resposta primária em células B murinas imunodeficientes, a actividade de substituição de células T em células B murinas, e o aumento in vivo da produção de anticorpos murinos.

Para utilização in vivo o contacto entre os leucócitos e uma composição é mantido tipicamente por um período de tempo suficiente para que o animal elimine o derivado de guanosina do seu organismo, pelo metabolismo, por secreção ou por ambos os processos. Esse período de tempo pode ser mais prolongado do que o requ rido para que a imuno-estimulação se manifeste. 0 contacto com uma dose unitária individual é mantido tipicamente por um período de tempo de horas até cerca de uma semana ou mais, dependendo, pa ra um dado composto, do transportador ou veículo utilizado. 0 con tacto contínuo pode ser vantajoso para um animal hospedeiro imune -defic iente .

C contacto in vitro pode ser mantido por um período de tem po suficiente para que uma das imuno-estimulaçSes anteriormente descritas se manifeste tal como pode ser determinado por técnicas de ensaio convencionais. Estes tempos de contacto têm tipicamente uma duração de um a cerca de sete dias, e ma is usualmente de cerca de 2 a cerca de 6 dias.

V. Resultados

Cbtiveram-se resultados específicos utilizando os composORIGINAL

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-29tos, as composições e os métodos do presente invento e compararam-se muitas vezes esses resultados com resultados similares obtidos usando os compostos, as composiçoes e os métodos que se descrevem na Patente dos E.U.A. n². 4 643 992. Utilizaram-se aqui alguns dos compostos usados na patente dos E.U.A. n².

643 992 com propósitos comparativos. Esses compostos são a 8-mercaptoguanosina, a 7-metil-8-oxoguanosina e a 8-bromoguanosi na, e são aqui designados abreviadamente por 8MGuo, 7m8oGuo e 8BrGuo, respectivamente.

Os resultados que aqui depois se discutem foram obtidos usando um ou mais compostos da invenção, a não ser onde indicado de outro modo, na forma de uma composição da invenção que é usada num método da invenção. Para resumir e para facilidade de de£ crição, apenas os compostos serão aqui depois referidos,estando pressuposto que esses compostos são utilizados em composições e em métodos da invenção.

A cada um dos novos compostos, cuja actividade é aqui disc tida ou comparada, foi também atribuído um número de -identificação de cinco digitos. Esses números são indicados no título do exemplo que descreve a preparação do composto. 0 número de cinco digitos e/ou o número do Exemplo são utilizados nas tabelas e na discussão que se segue para identificar esses compostos.

A. Actividades de guanosinas 8-substituídas

Tal como anteriormente se referiu examinou-se a adjuvant' cidade e a mitogenicidade de uma série de guanosinas 8-substitu das, que não são compostos da invenção, com tioéteres de vários comprimentos. Os resultados desses estudos são apresentados nas tabelas 1 e 2 seguintes onde as linhas horizontais ao longo de toda a tabela servem para separar os estudos uns dos outros.

•H| ΜI

BAD ORIGINAL

------··*—*

197

EPGcll - SCRF 124.C8

-30Tabela 1

Ad -juvantic idade	específica de antigénio de 8-tioéter-guanosinas
2 Composto	Concentração3	PFC directo	4 a nt i-SR BC/C uItura
		CBA/CaJ	C57BL/6J
22359	lo”4	123^21	-
(8)	—4 3x10	157-7	2620-100
	lo-3	653—52	3110-350
22435	lo”4	247—3 8	—
(7)	_4 3x10	582—52	913 imo
	lo3	6O7±57	12,080^470
8MGuo	lo”4	813—129	**
	-4 3x10	527—25	11,000^140
C ontrolo	Sem nucleósido	75±1O	486^70

Antigénio presente

22300 (6)	io4 3xl0“4 lo'3	420^105 870^70 4 9Ο.Ϊ13 3	-
8MGuo	io”4 -4	813^129	-
3x10	782-123	—
C ontrolo	Sem nucleósido Sem antigénio	8Ϊ4	-
C ontrolo	Sem nucleósido Antigénio presente	307Ϊ61	-

Mediram-se as adjuvanticidades contra glóbulos vermelhos de ovelha (SRBC) em culturas de formação de placas directa por

197

EPG:11

SCRF 124.08

-31cultura de células de linfócitos das estirpes de ratinhos apresentadas. Na secção Materiais e Métodos apresentam-se pormenores do procedimento. Os erros padrão dos valores médios indicados são apresentados pelo - número.

O

Os nucleósidos são identificados pelos seus números de cinco digitos e o número do Exemplo no qual se apresenta a sua preparação está entre parêntesis.

Concentracção do nucleósido em moles por litro no meio

X aquoso onde se realizou o contacto com os leucócitos.

^Usaram-se linfócitos de linhagens de ratinhos consaguineos CBA/CaJ ou C57BL6/'J.

Tabela 2

Mitogenicidade de 8-tioeterguanosinas

3 3

Composto Concentração Incorporação de H_7TdR (cpm/cultura)

22359	IO4	1600-90
(8)	-4 3x10	1300-80
	, -3
	10	1700-280
22435	lo4	4500—120
(7)	—4 3x10	8800-200
	io3	11,.200-202
8MGuo	10-3	41,100—390
C ontrolo	Sem nucleósido	2100^60

22300	10 4	2700-130
(6)	-4 3x10	4100^70
	, -3	-f-
	10	16,400-1130
8MGuo	IO3	25200-950

197

SPG:11

-32SCRF 124.08 í'/' tf tf

Composto

Tabela 2 (Cont.)

3

Incorporação de f~ Hj7^TdR (cpm/cultura)

C oncentração'

Controlo

Sem nucleósido

2400-90 ^A mitogenicidade foi medida pela incorporação de Ζ7³Η_27TdR fdesoxirribonucleótido de timidina marcado com trítio), usan do as condições que se discutem na secção Materiais e Métodos, tal como é determinado pela medição das contagens por minuto (cpm) por cultura de células. Os desvios padrão são apresentados como na Tabela 1.

²'³Vêr notas 2 e 3 da Tabela 1.

Os resultados anteriores ilustram que,à medida que o comprimento do substituinte aumenta, a actividade do derivado de guanosina 8-substituido diminui em relação á 8MGuo cujo átomo de enxofre na posição 8 está ligado a um átomo de hidrogénio. Assim, a adjuvanticidade especifica de antigénio do derivado de 8—(2-bu tenil) (22435) era maior do que a do derivado de 8-cinamilo (22359) mais comprido, mas inferior à do composto de 8-mercapto (8MGuo). O derivado de 8-alilo (22300) tinha uma adjuvanticidade apr oximadamente igual à da 8MGuo para as concentrações apresenta das. Os resultados de mitogenicidade para os mesmos compostos mostraram uma tendência ainda mais pronunciada nas actividades obtendo-se com 8-substituintes cada vez mais compridos resultados cada vez mais pobres.

B. A adjuvanticidade e a mitogenicidade não estão necessariamente relacionadas

Os compostos, as composições e os métodos do presente invento são úteis na melhoria das respostas mitogénicas e policlonais, e da adjuvanticidade, tal como os compostos cujas activida des se ilustram nas Tabelas I e 2. Pensa-se que as propriedades mitogénicas e de adjuvante dos presentes compostos resulta pelo menos de dois percursos diferentes nos quais a mitogenese e uma

9 197 ·

EPG:11 - SCRF 124.08

-3 3resposta policlonal são muitas vezes resultados coincidentes, enquanto que os resultados de adjuvanticidade diferem frequente mente. Vêr por exemplo, Goodman et al., J, Exp. Med«, 147:800 (1978) e Mclntire et al., J. ImBiunol., 117:674 (1976). Na Paten te dos E.U.A. n® 4 643 992 discutem-se algumas diferenças simila res .

Este não acoplamento de actividades é também exibido por alguns dos compostos do presente invento tal como se pode obser var dos resultados das Tabelas 3 e 4 seguintes.

TabeIa 3

Adjuvanticidade específica de antigénio de algumas 8-oxoguanosinas, substituídas na posição 7 com hidrocarbilo substituído com heteroátomos no sistema humano¹

C omposto	Concentração	PFC/Cultura
22935	3xlO-5	175-33
C2)	lo-4	3613^717
	—Δ 3x10	13,013^2613
22943	3xlO-5	83±12
(4)	IO-4	5 8-4
	-4
	3x10	222-54
C ontrolo	Sem nucleósido Sem antigénio	0±l
Controlo	Sem nucleósido	150-15

Antigénio presente ^Os estudos foram realizados de sentados na Tabela 1 com a excepção de ção de linfócitos humanos.

um modo similar aos apre se ter usado uma prepara

2,3

Vêr notas 2 e 3 da Tabela 1

9 197

EPGill - SCRF 124.08

-34Tabela 4

Mitogenicidade de algumas 8-oxoguanosinas substituídas na posição 7 cora hidrocarbilo substituído com heteroátomos, no sistema h u ma η o!

Composto^ Concentração Incorporação de / ^{1 * 3}H_~7TdR (cpm/cultura)

22935	3x10 5	5,975^449
(2)	io4	38,505^655
	-4 3x10	60,217^272
	-3
	10	70,944-453
22943	3xlO~3	1,077^40
(4)	io4	1,814±71
	, -4	-f-
	3x10	15,714-856
	io3	77,100—799

Controlo Sem nucleósido 1508^125 ¹*^2/3Vêr notas 1, 2 e 3 da Tabela 2.

Os resultados anteriores mostram que a 7-(3 -dimet i lam ino_)_ propil—8-oxoguanosina (22943) foi mitogénica num sistema murino (Tabela 4) quando comparada com a 7-carbetoximetil—8-oxoguanosina (22935). Contudo, o composto contendo amina (22943) exibiu uma actividade aproximadamente igual à exibida por um dos controlos (sem nucleósido + antigénio) quando se examinaram esses mesmos compostos para determinar a adjuvanticidade usando linfócitos hu manos (Tabela 3).

Os resultados anteriores confirmam também que a mitogenicidade e a adjuvanticidade não estão necessariamente ligadas e podem ocorrer por percursos diferentes. Esses resultados mostram também que a ausência de adjuvanticidade exibida por compostos contendo elementos estruturais úteis noutras funções, p.e., o anel de guanosina, um grupo 8-oxo e um radical hidrocarbilo subs

9 197

EPG:11

SCRF 124.08

-3 5tituído com heteroátomos na posição 7, mais comprido do que o etilo mas mais curta do que o decilo mas que comporta uma carga iónica aos valores de pH fisiológico, aqui devida ao grupo dime tilamino.

É de notar ainda que, se bem que a mitogenicidade e a adjuvanticidade possam ser observadas in vitro no sistema murino, apenas a adjuvanticidade foi observada in vitro no sistema humano usando qualquer dos compostos aqui discutido.

C. Estudos de adjuvanticidade

Realizou-se um certo número de estudos comparativos de adjuvanticidade em relação ao SRBC usando linfócitos humanos e mu rinos como fonte de leucócitos, usando compostos do presente invento, bem como novos compostos não incluídos no presente invento. InfeIizmente, devido a diferenças nas respostas de linfócitos mesmo de ratinhos consaguíneos, deixando de parte a população hu mana não consaguínea, estes resultados são muito difíceis de com parar, com exactidão, uns com os outros. Preferivelmente podem ser melhor comparados, dentro de um dado estudo, os obtidos com os compostos usados no estudo e os dos controlos para um dado e£ tudo. Nas Tabelas 5 e 6 seguintes apresentam-se resultados destes estudos, os quais se referem apenas à actividade para a concentração de pico, de cada composto. Cada estudo está separado dos outros por uma linha horizontal na tabela.

9 197

EPG:11

-36SCRF 124.08

Estudos

Compostos

2 935 (2)

22943 (4)

23090 (5) ,

Controlo

C ontrolo

Tabela 5 de adjuvanticidade

4. ~ 3

C oncentraçao

3xlO^-4 no sistema murino

PFC anti-SRBC directo/cultur

2371^179

2283-104 ⁵ 40-3

Sem nucleósido 33^9

Sem antigénio

Sem nucleósido 20^3

Antigénio presente

24599 (18)

8BrGuo

C ontrolo

C ontrolo

3x10

2521^191 lo ³ 245ΟΪ325

Sem nucleósido 12^2

Sem antigénio

Sem nucleósido 45^10

Antigénio presente

7m8oGuo

24670 (12)

C ontrolo

3xlO^-5 1809-39

1O“⁴ 1945-191

Sem nucleósido 53-3

Sem antigénio

197

EPGíll - SCRF 124.08

Controlo	-37- Sem nucleósido Antigénio presente	282±46
24455	io4	230-76
C14)
Controlo	Sem nucleósido Sem antigénio	20—5
C ontrolo	Sem nucleósido	203—25
	Antigénio presente
24331	-4 3x10	215—5
(10)
24364	3xlO-5	50-13
fll)		-
C ontrolo	Sem nucleósido Sem antigénio	8±3
Controlo	Sem nucleósido Antigénio presente	55^8
24292	lo-4	2491
C13)
Controlo	Sem nucleósido Sem antigénio	50
C ontrolo	Sem nucleósido Antigénio presente	161

197

EPGill - SCRF 124.08 ff

-3 8-

2 3 880	-4 10	735^561 * 3
Γ15)	—4 10	6408Í464b
C ontrolo	Sem nucleósido	17-73
	Sem antigénio	458±13b
Controlo	Sem nucleósido	357-12θ
	t Antigénio presente 1	1960—120b
23756	lo”4	2376—212
C16)
Controlo	Sem nucleósido	165-40
	Sem antigénio
Controlo	Sem nucleósido	305-65
	Antigénio presente
23642	3xlo”4	1103^123
(3)
Controlo	Sem nucleósido Sem antigénio	72^12
Controlo	Sem nucleósido	293-22

Antigénio presente

2 ' Ver notas 1 e 2 da tabela 1.

O valor apresentado é o da concentração com a qual se obtém o maior número de placas por cultura num dado estudo.

b * Realizaram-se dois estudos (a e *'b) sendo os resultados dos estudos a e b assim marcados,

Os resultados da Tabela anterior ilustram vários pontos. Em primeiro lugar, os compostos do presente invento são geralmen

197

EPGíll - SCRF 124 .08

-3 9 — te mais activos do que os compostos que se descrevem na Patente dos E.U.A. n2, 4 643 992. Essa melhoria na actividade manifestou -se, quer numa concentração para a qual a adjuvanticidade de pico foi observada (concentração de pico) que foi de cerca de 0,5 a I unidade log (potência de dez) mais baixa, quer numa adjuvanticidade para uma dada concentração de pico que foi significativamente superior, usualmente pelo menos aproximadamente 100 por cento superior, do que a exibida por um composto dessa patente. Pode observar-se uma adjuvanticidade melhorada, por exemplo, quando se comparou a 8BrGuo com a 7-(2-cloroetil)-8-oxoguanosina (24599) tendo-se observado que ambos os compostos tinham números de placas^por cultura, similares embora o derivado de 2-cloroetilo exibisse esse valor para uma concentração 1,5 unidades log (cer ca de 30 vezes) inferior em concentração.

Os resultados anteriores para a 7m8oGuo e para o derivado de 7 —(2—hidroxi—3—az ido)propilo f2467o) parecem conter pelo menos duas anomalias. A concentração de pico para a 7m8oGuo apareceu pa_ ra uma concentração invulgarmente baixa e o valor de PFC/cultura parece algo elevado em relação aos valores usualmente observados.

valor de PFC/cultura para o composto 24670 parece também um pouco baixo .

Os resultados na Tabela 5 ilustram também os resultados inaceitáveis obtidos com compostos de outro modo novos e não óbvi. os que não se incluem no presente invento. Exemplos de compostos excluídos incluem a 7-//2-(1—piperidino)etil~7-8-oxoquanosina (230 90),a 7 -//3-( 3 ,4-dimetoxifenilamino) -2 -hidroxiJ/propil-8-oxoguanosina (24364), a 7-//3-(dimetilamino)propi1/7-8-oxoguanosina (22943) e a 7-carboximetil-8-oxoguanosina (23642) que conferem uma carga iónica à molécula aos valores de pH fisiológico.

E de notar que com os dois últimos compostos (22943 e

23642) obtiveram-se números de placas aparentemente elevados no sistema murino. Contudo esses números relativamente elevados de -4 placas foram obtidas para concentrações (3x10 molar) que são relativamente muito elevadas para serem úteis,, e são presumivelmen te devidos a porções não ionizadas dessas moléculas também presen

9 197

EPG:11 - SCRF 124.08

-40tes no equilíbrio. Adicionalmente, tal ccmo se pode observar dos resultados da Tabela 6, o composto 22943 era substanciaImente inactivo à mesma concentração relativamente elevada no sistema humano.

Deve também prestar-se atenção aos resultados obtidos para a 7-/~3-(4-fInorofenil)piperazinil-2-hidroxipropil/y-e-oxogua nosina (24455) bem como para o composto 24364 anteriormente discutido. Verificou-se que cada um desses dois compostos era substancialmente inactivo nas concentrações usadas nos estudos. Cada um contém também um radical substituinte, na posição 7, hidrocar bilo substituído com heteroátomos, que é mais comprido do que um grupo decilo. Esses dois compostos contêm também-grupos amino que lhes conferem uma carga iónica aos valores de pH fisiológico. A 7-//2-hidroxi-3 — (feniltio)propil ~7~-8-oxoguanosina (24331), cujo substituinte na posição 7, hidrocarbilo substituído com heteroátomos é ligeiramente mais comprido do que o octilo exibiu uma quantidade de actividade relativamente pequena.

Os resultados que se apresentam na Tabela 6 seguinte foram obtidos de um modo similar aos da Tabela 5 usando linfócitos humanos em vez de leucócitos de ratinho.

Tabela 6

Estudos de adjuvanticidade no sistema humano'

C omposto

Concentração de pico

2 935 (2)

2 943 (4)

C ontrolo

3x10

3x10

C ontrolo

PFC anti-SRBC directo/ /cultura

13,013^2613

222-54

Sem nucleósido 0^0

Sem antigénio

Sem nucleósido Antigénio presente

150-15

197

BPG:11

- SCRF 124.08

23756	10 4	25,083
(16)
23 890	io-4	15,583
(17)
Controlo	Sem nucleósido Sem antigénio	2-2
Controlo	Sem nucleósido Antigénio presente	398-52
7m8oGuo	-4 3x10	5775—214
	10-* 3	830Í67b
	103	1225^175
Controlo	Sem nucleósido	12-43
	Sem antigénio	b
		c
Controlo	Sem nucleósido	652Ϊ863
	Antigénio presente	82-gb 143-175*

^1,2/3Vêr notas 1, 2 e 3 da Tabela 5.

b c ' ^f Exemplos de resultados de três estudos usando 7m8oGuo com preparações de linfócitos de três pessoas designada por a, b e c. As comparações entre os compostos são,deste modo, feitas dentro de uma dada preparação de linfócitos. Os resultados marcados com a devem ser comparados com eles próprios, o mesmo acontecendo com os resultados marcados com b e com c.

Os resultados da Tabela 6 mostram de novo a eficácia melhorada dos compostos do presente invento quando comparados ind rectamente com a 7-meti1-8-oxoguanosina no sistema humano. Esse resultados mostram de novo que um composto com uma carga iónica

SCRF 124.08

197 EPG:11

-4 2aos valores de pH fisiológico, p.e., a 7-(3-dimetilamino)propil-8-oxoguanosina (22943), é substancialmente inactivo quando comparado com outros compostos da invenção.

aumento indirecto,mas grande, da adjuvanticidade dos com postos da invenção /~22 93 5, 23756 e 23 890~7 em relação à 7m8oGuo no sistema humano, tanto na magnitude da resposta, como na menor dose requerida para produzir essa resposta, ilustra também a efi cácia de utilizar substituintes hidrocarbilo, substituídos com heteroátomos, na posição 7, cujo comprimento é superior ao do etilo mas inferior ao do decilo.

Ainda uma outra propriedade inesperada dos compostos mais preferidos; i.e., onde R^3, é mais comprido do que o etilo e mais curto do que o decilo e onde o grupo ribosilo não está substitu_í do, reside no facto de a curva dose—resposta seja mais larga pró xirao da concentração do pico do que uma curva similar obtida para a 7m8oGuo. Esta resposta alargada não é observada nas Tabelas de valores discritos anteriores.

Pode obter-se uma medida de largura relativa somando o nú mero médio de placas (PFC/cultura) encontrado para uma concentra ção a meia unidade log da concentração que produziu o valor de pico, com o PFC/cultura à concentração de pico. A soma assim obt da é depois dividida por dois (o número de valores somados) por forma a obter-se o valor de placa de 1/2 log médio.

Mais especificamente, seleccionam-se valores de placa médios individuais e subtrai-se a cada valor, o valor residual quando o SRBC sózinho estava presente, antes deste ser somado, por forma a obterem-se valores líquidos. Cada valor líquido é dividido pelo número de micromoles de nucleósido presente em 1 m _3 de cultura (concentração molar/10 ) por forma a obter-se o PFC/ /cultura/micromole. Seleccionam-se os dois maiores valores assim obtidos que incluem o valor à concentração de pico e um valor adjacente de 1/2 unidade log, somam-se e divide-se por dois por forma a obter-se o valor médio de 1/2 log por micromole.

Quando se realizam cálculos como os anteriores para estudos não seleccionados da Tabela 6, verifica-se que os valores mé

197

EPGzll - SCRF 124.C8

-4 3dios de placa de 1/2 log por micromole para os compostos da invenção são muito superiores ao valor para a 7m8oGuo. Na Tabela 7 seguinte mostram-se os valores assim calculados. No sistema murino obtêm-se resultados similares.

Tabela 7

Valores de placa médios de 1/2 log no sistema humano

Composto Valor

7m8oGuo 21,604³

87^b

00^C

23756 153,108

C16)

23890 85,818

C17)

22935 38,753 (2) ^{* 2} ^Os valores foram obtidos tal como anteriormente se descr veu usando valores que traduzem os resultados apresentados na Ta bela 6.

Vêr nota 2 da Tabela 1. ^a'k*^cyêr Tabela 6.

Ainda que os resultados apresentados na Tabela 7 não possam ser directamente comparados, uma vez que foram obtidos em es tudos separados, as diferenças nos valores calculados são tão grandes que se crê serem estes valores significativos.

Uma curva de dose-resposta pode ser estreita demais,não permitindo,assim,a dosagem apropriada de um recipiente particuBAD Cri

9 197

EPG;11 - SCRF 124.08

-44lar. Por exemplo, os resultados para o sistema humano apresenta dos na Tabela 6 ilustram diferenças tão grandes quanto um factor de três a dez (meia unidade log a uma unidade log) na concentração de pico dos compostos estudados, quando se compararam preparações de linfócitos de indivíduos diferentes. Se as curvas de dose resposta fossem muito estreitas, uma dosagem seleccionada usual para recipientes poderia geralmente ser muito elevada ou muito baixa, para um recipiente particular. Assim, as curvas dose—resposta alargadas para os compostos preferidos oferecem uma vantagem adicional,em comparação com a 7m8oGuo.

D. Actividade de substituição de células T

Pode usar-se uma composição do presente invento para subs tituir as células T na resposta de anticorpos a um antigénio T-de pendente. Aqui, cultivam-se células B murinas, geradas in vitro por tratamento com anti—thy 1.2 monoclonal mais complemento, com ou sem SRBC como antigénio, na presença de composições contendo concentrações incrementais de um derivado de guanosina substituí do na posição 7 com um hidrocarbilo substituído com hèteroátomos.

Sob estas condições, as culturas de células B isoladas respondem fracamente ao antigénio a não ser que suplementadas com um derivado de guanosina da invenção. A resposta modulada pela guanosina ê dependente da dose, bem como do antigénio. Assim, o contacto de células B in vitro com uma composição do presente invento fornece a essas células um sinal do tipo/da célula T.

E. Reconstituição in vitro da imuno-resposta humoral primária

Os ratinhos CBA/N possuem uma imuno-deficiência de células B primárias ligada ao cromossoma X (X-ligada) e deste modo podem constituir um modelo murino da imuno-deficiene ia ligada ao sexo. Pensa-se que a estirpe CBA/N é deficiente na actividade funcional de uma subpopulação de linfócitos B maduros compreendendo an tigénios Lyb 3/5/7. Vêr Huber et al., J, Exp» Med., 14 5: 1 ( 1977); Ahmed et al., J, Exp. Med», 14 5:101 (1977); e Subbaro, J. Immunol., 122:2279 (1979).

Preparam-se culturas de células de baço de ratinhos CBA/N

197

EPG:11 - SCRF 124.08

-45machos e fêmeas homozigóticos e de ratinhos machos heteroz igot_i cos em relação ao gene CBA/N, designado por gene xid (os ratinhos macho contêm o cromossoma X) tal como se descreve na secção Materiais e Métodos. Adicionam-se às culturas 0,1 mililitro de uma suspensão de 0,1 por cento (v/v) de SRBC sózinho ou de uma suspensão de SRBC com quantidades incrementais de uma guanosina da invenção, usando 5x10^ células/ml. Determinaram—se o numero de culturas formando placas anti-SRBC directas por cultura, após 4 dias de cultura.

Usando uma preparação similar de células de baço de ratinhos CBA/Caj imuno-competentes verifica-se que para o nível zero de concentração de derivado de guanosina, não existe substancia_l mente qualquer resposta para as células CBA/N, quando comparada com uma resposta positiva de PFC/cultura para as células CBA/Caj imuno-competentes,

Para concentrações de derivado de guanosina de cerca de -4 -5

- 10 molar, ambas a células CBA/Caj imuno-competentes e

CBA/N, originalmente imuno—incompetentes, foram capazes de produzir números significativos de PFC/cultura. Assim, o contacto de células de baço,com uma imuno-deficiéncia X-ligada,com uma compo sição do presente invento, pode reconstituir a imuno-resposta hu moral, primária ao SRBC dessas células que, de outro modo, seria imuno-def ic ientes.

A imuno-deficiência em ratinhos bem como em outros mamífe ros pode ser devida à idade avançada ou senescência, bem como a um defeito genético tal como anteriormente se discutiu. Assim, animais que eram imuno-competentes quando jovens ou adultos podem tornar-se imuno-deficientes à medida que atingem uma idade avançada. Este é o caso da estirpe de ratinhos CBA/CaJ consanguíneos.

Realiza-se um outro estudo da reconstituição de uma respos ta de anticorpos humoral primária ao SRBC,usando células de baço de ratinhos CBA/Caj senescentes, com 156 semanas de idade, que se tornam imuno-deficientes com a idade. Comparam-se as respostas in vitro dessas células de baço ao SRBC, num ensaio de formação de placas, com as respostas similares de outro grupo de ratinhos

197

EPGzll - SCRF 124.C8

-46CBA/CaJ adultos, com 8 semanas de idade, saudáveis. Esta compara ção realiza-se como anteriormente se descreveu, usando de novo uma composição contendo uma guanosina da invenção para pór em contacto com as células,de baço.

PFG/cultura para os controlos de ratinhos adultos saudá veis_?contendo SRBC, mas não contendo derivado de guanosina é várias vezes o número formado na ausência tanto do SRBC como da gua nosina. 0 valor de PFC/cultura,para os controlos de ratinhos senescentes, é aproximadamente igual para ambos os controlos, e elevado, quando comparado com o de adultos saudáveis. Pensa-se que es sas respostas relativamente elevadas e similares sejam devidas à formação de clones auto-produtores de anticorpos.

Observa-se uma resposta ao SRBC relacionada com a dose de derivado de guanosina. Essa resposta é observada tanto para as cé lulas de baço de adultos saudáveis imuno-competentes, como para as células de baço de senescentes, anteriormente imuno-deficientes, mas agora com a resposta humoral primária reconstituída. Estes re sultados ilustram, pois, que o contacto de células de baço senescen tes imuno-deficientes com uma composição do presente invento,pode reconstituir esta imuno-resposta deficiente.

F. Respostas de anticorpos in vivo

Imunizaram-se ratinhos CBA/Caj intraperitonealmente (i.p.) usando um conjugado (TNP-BSA)? preparado por reacção de ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBS) com albumina de soro bovino (BSA), num tampão de cacodilato 0,28 molar, a pH 6,9o Cada animal recebe uma injecção intraperitonea1 (i.p.) contendo 50 micrograma (/ig) do conjugado imunizante. Um grupo de ratinhos recebe depois (cerca de 30 minutos depois) outra injecção i.p.,que contém um derivado de guanosina da invenção,quer em óleo de semente de sésamo a 100%, quer numa composição aquosa contendo 2 por cento em volume de óleo de sésamo sonicado com solução salina. Cada animal recebe 0,2 ml do derivado de guanosina a partir das composições cuja concentração em derivado de guanosina é de 5 mg/ml.

Um terceiro grupo de ratinhos recebe a imunização,mas não recebe

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-47 — composição do presente invento e serve como controlo. Determina-se depois a secreção de anticorpos anti-TNP-BSA durante um período de cerca de 30 dias usando técnicas convencionais de ensaio de imuno-sorvante ligado a enzima (ELISA) usando o TNP-BSA como antigénio.

Os resultados de um tal estudo indicam que os animais que receberam um derivado de guanosina da invenção exibiram títulos melhorados de anticorpos anti-TNP-BSA quando comparados com os títulos dos animais que não receberam o derivado de guanosina.

Tendo descrito genericamente a invenção pode ter-se uma compteenção adicional da mesma por referência às sínteses e aos procedimentos que aqui a seguir se apresentam com a função de ilustrar o presente invento.

VIII. Materiais e Métodos

A. Sínteses

Exemplo 1; Procedimento geral para a preparação de 8-oxoguanosinas substituídas na posição 7 com um hidrocarbilo substituído com heteroátomos.

Utilizou-se a l-amino-8-oxoguanosina (aqui depois Composto A) como material de partida para várias sínteses usando um procedimento a dois passos. Esse material foi preparado essencial mente pelo método descrito em Rizkalla et al., Biochim, Biophys. Acta . , 195;285-293 (1969).

Passo 1:

A uma solução do composto A /2”9,5 gramas (g), 30 milimole (mmole)^7 em dimetilformamida (DMF) adicionou-se metóxido de sódio (33 mmole) em 250 mililitros (ml) de DMF. Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente (cerca de 18-22^0) durante 30 minutos. Adicionou-se uma solução de DMF (10 ml), contendo o agente alquilante, usado para formar o substituinte na posição 7, num ligeiro excesso molar em relação ao Composto A (p.e., 33 mmole vs. 30 mmole), e agitou-se a mistura reaccional alquilante, resultante, durante cerca de 16 horas a uma temperatura de cerca

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-4 8de 20 a cerca de 40 graus C.

Removeu-se depois o solvente in vácuo e tratou-se o resí duo com água destilada,, ou desionizada, (150 ml) e com diclorometano (150 ml). Filtrou-se o sólido obtido e recristalizou-se a partir de um solvente apropriado obtendo—se uma l-amino-8-oxogua. nosina 7-substituída, completando-se o passo 1 do procedimento de síntese a dois passos normalmente usado.

Passo 2:

Dissolveu-se depois o produto do passo 1 em HC1 concentra do (p.e., 4,65 mmole em 15 ml de HC1) ao qual se adicionou nitri to de sódio aquoso (p.e. 4,19 mmole em 5 ml de água) a zero graus C seguindo-se agitação durante cerca de uma hora. 0 produto desaminado resultante foi depois obtido por técnicas de cristali. zaçSo convencionais, a não ser onde se indique ter sido de outro modo.

Descreve - se,seguidamente, a preparação de exemplos de com postos específicos usando o método a dois passos anterior e outros métodos, bem como outras sínteses.

Exemplo 2: 7-carbetoximet il-8-oxoguanos ina (22935 )

Preparou-se o composto do título seguindo o procedimento a dois passos do Exemplo 1, usando bromoacetato de etilo como agente alquilante do passo 1, e foi obtido com um rendimento de 10 por cento, a partir do composto de 1-amino correspondente, na forma de um pó branco, ponto de fusão 167-172²C. RNN (DMSO-d):

10,9 (bs, 1H); 6,5 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H). IV (KBr): 1680, 1620, e 1420 cm .

Análise calculada para o ^c14^HΣg^N5°₈_₁/₂H₂0:

C, 42,64; H, 5,11; M, 17,76.

Encontrado: C, 42,44 ; li, 4,71; N, 17,73.

Substituindo o bromoacetato de etilo por 2-cloroacetamida ou por 2-cloroacetamida substituída por um N-hidrocarbilo ou por um N-alcanol, na reacção anterior obtém-se a 7-carboxamidometil—

BAD ORIGINAL

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-4 9-8-oxoguanosina correspondente (ou a amida substituída correspon dente^cujo grupo carboxamido tem a fórmula CONR^R^, onde R^ e R^ são definidos como anteriormente).

Similarmente, substituindo o bromoacetato de etilo por um halo-éter adequado, tal como 2-bromoetilmetiléter ou 2-bromoetilfeniléter (beta-bromofenetole) obtêm-se, respectivamente, os derivados de 7-metoximetilo e de fenoxietilo correspondentes.

Exemplo 3: 7-carboximetil—8-oxoguanosina (23642)

Agitou-se uma mistura de 7-carbetoximetil-8-oxoguanosina (1 g, 2,3 mmole; Exemplo 2), metanol (5 ml) e NaOH Lí (5 ml), à temperatura ambiente sob durante 4 horas. Removeu-se a maior parte do metanol in vacuo, e aqueceu-se o resíduo com água (50 ml). Acidificou-se a solução com HC1 IN, a zero graus C, até pH 5. Purificou-se o produto da reacção por cromatografia líquida de alta eficiência preparativa de fase inversa, numa coluna C-18 (HPLC) obtendo-se o composto do titulo na forma de um pó branco, com um rendimento de 31 por cento; ponto de fusão superior a 23C^

C. RMN (DMSO-dg):10,9 (bs, 1H); 6,5 (bs, 2H) 5,6 (d, J=5Hz, 1H) 4,4 (bs, 2H). IV (KBr): 1640, 1600 e 1460 cm^-1.

Análise encontrada para o C„H_1cNr0_o:

z _L b b o

C, 40,34; H, 4,23; N, 19,60

Encontrado: C, 35,71; H, 3,52; N, 17,37.

Exemplo 4 : Di-hidrato do mono-hidr oc loret o de 7-22~3-(dime ti lamino) propil_Z7-8-oxo-guanosina (22 94 3 )

Seguindo o procedimento a dois passos do Exemplo 1, usando hidrocloreto de cloreto de 3-Ν,Ν-dimetilaminopropilq, como agente alquilante_>e carbonato de potássio^como base, tratou-se o produto desaminado com um equivalente de HC1 em 2-propanol. Recu perou-se o composto do título com um rendimento de 40 por cento, a partir do composto de 1-amino na forma de um pó branco; ponto de fusão 180⁹C (decompõe-se). RMN (DMSO-dg) :_rV2,7 (s, 6H) ; 5,57 (d, J=5Hz, 1H) ; 6,91 (bs, 2H); 10,70 (bs, 1H) ; 11,31 (bs, 1H) .

IV (KBr): 1670, 1625 e 1590 cm^-1.

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-50Análise calculada para o C^gH^^NgOg-HCΙ-ΣΗ^Οz C, 39,43; H, 6,40; N, 18,40

Encontrado: C, 39,31; H, 6,15; N, 18,07.

Exemplo 5: Mono-hidrato de mono-hidrocloreto de 7-/Z~2-(piperidino)eti1/7—8-oxoguanos ina (23090)

Seguindo o procedimento do Exemplo 4 mas usando cloreto de 2-piperidinoetilo como agente alquilante, obteve-se o composto do título, com um rendimento de 34 por cento,a partir do composto de 1-amino na forma de um pó amarelo claro; ponto de fusão

1579C (decompõe—se). RMN (DMSO11,22 (bs, 1H) . IV (KBr)z 1700,

Análise calculada para o C, 43,92; H,

Encontrado: C, 43,99; H,

L)zÒ6,65 (bs, 2H); 9,97 (br, 1H);

⁶ -1 1670 e 1590 cm ,

8t^H26^N6^O6-^HC1-^H2^O:

6,29; N, 18,08

6,39; N, 17,93.

Exemplo 6 z 8-(2-propenilmercapro)guanos ina (22300)

Adicionou-se brometo de alilo (8 g, 63,5 mmole) a uma mis tura de 8-tioxoguanosina (8MGuo; 20 g, 63,5 mmole) e de carbonato de potássio (10 g, 72 mmole) em dimetilformamida (DMF) (300 ml), e aqueceu-se a mistura resultante com agitação, a uma tempe ratura de 45^C, durante 90 minutos.

Arrefeceu-se depois a mistura, até à temperatura ambiente, e adicionou-se a uma solução de éter etílico (1,4 1) e ácido acé tico (5 ml). Filtrou-se o sólido resultante e lavou-se, com água (250 ml), acetona (200 ml) e depois com éter etílico, e secou-se depois numa estufa a 60ec,obtendo-se o tioéter do título (14,7 g, 67 por cento de rendimento) na forma de um pó branco; ponto de fusão 2255C (decompoe-se) . RMN (DMS0-d_g) z 5,70-5,91 (m, 2H) ; 6,38 (bs, 2H). IV (KBr)z 1700, 1640 e 1610 cm^-1.

Análise calculada para o C , _H, _N_r0.-S z 13 1Z 5 5

C, 43,93; H, 4,82; N, 19,71

Encontrada: C, 44,10; H, 4,82; N, 19,69.

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-51Exemplo 7: 8-(2-butenilmercapto)guanos ina (2243 5)

Seguindo o procedimento anterior para a preparação da 8_(2-propenilmercapto)guanosina (Exemplo 6), mas substituindo o brometo de alilo por cloreto de 2-butenilo, obteve-se o composto do título, com um rendimento de 48 por cento, na forma de um pó branco; ponto de fusão 2l0²C (decompõe-se). RMN (DMSO-dg): cT 6,3 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H); 1,6 (d, J=6Hz, 3H); IV (KBr): 1690, 1630, 1600, 1510 e 1365 cm .

Análise calculada para o ^C24^Hi9^N5°5^S:

C, 45,52; H, 5,18; N, 18,96

Encontrado: C, 45,38; H, 5,32; N, 18,79.

Exemplo 8: 8-(Cinamilmercapto)guanosina (22359)

Seguindo o procedimento para a preparação da 8-( 2-pr openil. mercapto)guanosina (Exemplo 6)^mas substituindo o brometo de alilo por brometo de cinamilo, obteve-se o composto do título, com um rendimento de 33 por cento, na forma de um pó esbranquiçado; ponto de fusão 172²C (decompôe-se) . RMN (DMSO-d^) : J'* 7,2 5 (br,

5H); 6,7-6,2 (m, 4H); 5,7 (d, J=5Hz, 1H). IV (KBr): 1690, 1640 e 1600 cm \

Análise calculada para o ^c1^N5°5^S:

C, 52,89; H, 2,91; N, 16,23

Encontrado: C, 53,26; H, 4,90; N, 16,08.

Exemplo 9: 1—Amino—7-(2,3-epoxipropil)-8-oxoguanosina

Seguindo o procedimento geral do passo 1 do Exemplo 1, usando epibromo-hidrina como agente alquilante, obteve-se o composto do título na forma de um produto em bruto. Não se tentou qualquer purificação.

Exemplo 10: Hemi-hidrato de 7-/2~2-hidroxi-3-(feniltio)propilZ7-8-oxoguanosina (24331)

Aqueceu-se uma mistura do produto em bruto do Exemplo 9 (3 g, 5,4 mmole) e de tiofenol (5 g, 45,4 mmole) em DMF (150 ml) a uma temperatura de banho de 80²C durante 4 horas. Após arrefeci

9 197

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-52mento, remoção in vácuo da maior parte do solvente, dissolução do resíduo em água e purificação por HPLC preparativa de fase inversa (C-18), obteve-se o derivado de 1-amino do composto do título na forma de um pó esbranquiçado, com um rendimento de 52 por cento; ponto de fusão 135-1372C. RMN (DMSO-dg);£ 7,3 (m,

5H); 7,15 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H); 5,35 (s, 2H). IV (KBr) 1700 e 1580 cm .

Seguindo o procedimento de desaminação do passo 2 do Exem pio 1, usando o derivado de 1-amino anteriormente preparado, obteve-se o composto do título, com um rendimento de 45 por cento, na forma de um sólido castanho, ponto de fusão 180-182⁵C.

RMN (DMS0-d₆); 7,3 (bs, 5H) ; 5,6 (bs_r 2H); 5,7 (d, J=5Hz, 1H) .

IV (KBr): 1690, 1635, 1600 e 1100 cm^-1.

Análise calculada para o CO^S-l/QH^O:

C, 4 8,09; H, 5,10; N, 14,76

Encontrado: C, 48,16; H, 5,11; N, 15,04.

Ξxemplo 11: Mono-hldrato do mono-hidroc loreto de 7-Z7~3-(3,4-dimetoxifenetilamino)-2-h idrox iJ7propil-8-oxoguanosina (24364)

A l-amino-7-/ 3-(3,4-dimetoxifenetilamino)-2-hidrox ipropil_y-8-oxoguanosina (24330) foi preparada de um modo análogo ao derivado de 1-amino do Exemplo IO,substituindo o tiofenol por 3,4 -dimetoxifenetilamina. Este derivado de 1—amino foi preparado com um rendimento de 40 por cento na forma de ura pó esbranquiçado; ponto de fusão 156-158⁹C. RMN (DMSO-d^): 7,0 (bs, 3H); 6,9-6,4 (m, 3H); 5,3 (s, 2H); 3,7 (s, 6H). IV (KBr): 1670, 1615 e 1580 cm

Seguindo o procedimento de desaminação do passo 2 do Exem pio 1 (e do Exemplo 10), usando o derivado de 1-amino anteriormen te preparado, obteve-se o composto do título na forma de um pó castanho claro com um rendimento de 55 por cento, ponto de fusão 163-170⁹C (decompõe-se). RMN (DMSO-dg):£ 8,9 (br, 1H); 6,8 (M,

5H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H); 5,59 e 5,62 (ambos s, 3H cada). IV (KBr) 1680, 1640, 1600 e 1030 cm

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-53 Análise calculada para o C„_QH_O „N,-O -HC1-H_0:

3 3 2 6 9 2

C, 46,74; H, 5,97; N, 14,22

Encontrado: C, 46,85; H, 6,01; N, 14,25.

Exemplo 12: Mono-hidrato de 7-(3-azido-2-hidroxipropil)-8-oxoguanosina (24670)

Seguindo o procedimento dos Exemplos 10 e 11, preparou-se a 1-amino—7—(3-azido-2-hidroxipropil)-8-oxoguanosina (24332) fazendo reagir o epóxido em bruto do Exemplo 9 com azida de sódio. Esse derivado de 1-amino foi preparado, com um ren dimento de 35 por cento, na forma de cristais brancos; ponto de fusão 180-182²C (decompõe-se). RMN (DMSO-d^) : 7,1 (bs, 2H);

5,6 (d_r J=5Hz, 1H). IV (KBr): 2140, 1690 e 1550 cm^-1.

Obteve-se o composto do título, após os procedimentos da reacção de desaminação do passo 2 do Exemplo 1 (e dos Exemplos 10 e 11), usando o derivado de 1-amino que se descreveu imediatamente antes (24332) . O composto do título era um pó esbranquiçado, obtido com um rendimento de 30%, ponto de fusão 138-14l^c (decom pie-se), (DMSO-dg) : 6,4 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H) . IV (KBr):

3600-3000, 2110, 1690 e 1660 cm^-1.

Análise calculada para o C, 37,50; H,

Encontrado: C, 38,06; H,

Exemplo 13: Mono-hidrato -oxoguanos ina ^C13^H18^N8°7 ^H2^0;

4,84; N, 26,91 4,79; N, 26,67.

de 7—(2,3-di—hidroxipropil)-8(24292)

Seguindo os procedimentos dos Exemplos 10-12, preparou-se a l-amino-7-(2,3-di—hidroxipropi1)-8-oxoguanosina (24457), fazendo reagir o epóxido em bruto do Exemplo 9 com água. Esse derivado de 1-amino foi obtido na forma de um pó esbranquiçado com um rendimento de 55 por cento, ponto de fusão 210-212°C (decompÓe-se) . RMN (DMSO-dg) : 6,9 (bs, 2H); 5,55 (d, J=4,5Hz, 1H) . 5,3 (bs, 2H). IV (KBr): 1700, 1670 e 1600 cm¹.

O composto do título foi obtido, após os procedimentos da reacção de desaminação do passo 2 do Exemplo 1 (e dos Exemplo 10—

197

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-54-12), usando o derivado de 1-amino que se descreveu imediatamente antes (24457). O composto do título foi obtido na forma de um pó branco com um rendimento global de 35 por cento, ponto de fusão 195-1962C. RMN (DMSO-d,.) : £ 10,7 (bs, 1H); 6,5 (bs, 2H) ;

° -1

5,6 (d, J=5Hz, 1H). IV (KBr): 1680, 1640 e 1660 cm .

Análise calculada para o C^H^gNc-Og-í^O:

C, 39,90; H, 5,41; N, 17,90

Encontrado: C, 39,67; H, 5,32; N, 17,52.

Exemplo 14 : Hemi-hidrato de 7-zC~3—/2~4-(4-fluorofenil)piperazinilZ/-2-hidroxipropil_Z7-8-oxoguanosina (24455) composto do título foi preparado seguindo os procedimen tos dos Exemplos 10-13 fazendo reagir a 4-(4-fluorofenil)pipera— zina com o epóxido em bruto do Exemplo 9, seguido de desaminação do derivado de 1-amino substituído na posição 7 com hidrocarbilo substituido com heteroátorno, resultante, ta 1 como se discute nos Exemplos 10-13. O composto do título foi obtido na forma de um pó branco com um rendimento global de 25 por cento, ponto de fusão 178-181SC. RMN (DMS0-d_g):£ 6,8-7,1 (m, 4H); 6,3 (bs, 2H);

5,2 (d, J=5Hz, 1H). IV (KBr): 1690, 1600 e 1390 cm^-1.

Análise calculada para o ^C23^H30^FN7⁰7”^4//^^2^{0 :}

C, 50,73; H, 5,74; N, 18,00

Encontrada: C, 50,94; H, 5,76; N, 17,74.

Exemplo 15: 7-/272 -(4 -clorof enil) —2 —oxoe ti 13^-8-oxoguanosina (23880)

Seguindo o procedimento a dois passos do Exemplo 1, usando 2-bromo-4‘-cloroacetofenona, como agente alquilante, obteve-se o composto do título, com um rendimento global de 35 por cento, na forma de um pó castanho claro, ponto de fusão superior a 230? C. RMN (DMSO-dg) : <5^10,7 (bs, 1H) , 8,1 (d, J=lOHz, 2H), 7,7 (d,

J=10Hz, 2H), 6,5 (bs, 2H), 5,6 (d, J=5Hz, 1H), 5,3 (S, 2H). IV (KBr): 1700, 1680 e 1630 cm”⁴.

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Analise calculada para o C

17**!

8^N6

-55Análise calculada para o ^cj8^H18^Cl ^N5°7^:

C, 47,85; H, 4,02; N, 15,50

Encontrada: C, 47,32; H, 3,98; N, 15,40.

Exemplo 16: 7-(4-nitrobenz il)-8-oxoguanosina (23756)

Seguindo o procedimento a dois passos do Exemplo 1, usan do brometo de 4-nitrobenzilo,corno agente alquilante, obteve-se o composto do titulo, com um rendimento global de 10%, na forma de um pó amarelo, ponto de fusão superior a 23O⁹C. RMN (DMSO-d^) : çT 10,8 (bs, 1H)r θ,3 (d, J=l0Hz, 2H), 7,6 (d, J=lOHz, 2H), 6,5 (bs, 2H), 5,6 (d, J=5Hz, 1H). IV (KBr): 1680, 1640, 1600 e 1520 cm

0θ-1/2Η₂0:

C, 46,11; H, 4,32; N, 18,98

Encontrado: C, 46,48; H, 4,04; N, 18,72.

Exemplo 17: 7 —(4-Metoxibenz í1)-8-oxoguanos ina (23756)

Seguindo o procedimento a dois passos do Exemplo 1 usando cloreto de 4-metoxibenzilo, como agente alquilante, obteve-se o composto do título, com um rendimento global de 7%, na forma de um pó castanho claro, ponto de fusão superior a 23O⁹C. RMN (DMSO—dg) : 10,8 (bs, 1H) , 7,2 (d, J= 10Hz) , 2H), 6,8 (d. J=lOHz,

2H), 6,4 (bs, 2H), 5,5 (d, J=5Hz, 1H), 3,7 (S, 3H). IV (KBr): 1670, 1600, 1510, 1450 e 1250 cm^-1.

Análise calculada para o C_1oH„_N,0_n-l/2 H„C:

lo z f J r 2.

C, 50,47; H, 5,18; N, 16,35

Encontrado: C, 50,85; H, 5,12; N, 16,20.

Exemplo 18: 7-(2-Cloroetil)-8-oxoguanosina (24599) composto do título foi obtido seguindo o procedimento geral a dois passos do Exemplo 1, usando brometo de cloroetilo, como agente alquilante, com um rendimento de 27 por cento, na for de um pó esbranquiçado, ponto de fusão 192⁹C (decompfife-se).

RMN (DMSO-dg) : (V 9,8 (br, 1H); 6,9 (bs, 2H); 5,8 (d, J=5Hz, 1H) .

197

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-56TV (KBr): 1680 e 1640.

Análise calculada para o ^cj2^H16^CbN5^O6^-^'^/,2H2^O:

C, 37,07; H, 4,93; N, 18,02

Encontrado: C, 36,65; H, 4,67; N, 18,18.

Exemplo 19: Derivados de 8—selenoxoguanosina substituídos na posição 7 com hidrocarbilo substituído com heteroátomos

Os derivados de 8-selenoguanosina, substituídos na posição 7 com hidrocarbilo substituído com heteroátomos, são prepara dos a partir dos derivados de 8-tioxo, substituídos na posição 7 com hidrocarbilo substituído com heteroátomos, correspondentes, adequadamente protegidos, cujas preparações se descreveram anteriormente. Assim, faz-se reagir a 8—tioxoguanosina, substituída na posição 7 com hidrocarbilo substituído com heteroátomos, com um agente S-alquilante, tal como iodeto de metilo, num solvente, tal como DMSO. Faz—se depois reagir o produto S-alquilado, assim obtido, com seleneto de sódio para formar o derivado de 8-selenoxo substituído na posição 7 com hidrocarbilo substituído com heteroá tomos. 0 produto desejado pode depois ser obtido a partir da mis tura reaccional por HPLC de fase inversa.

Exemplo 20: 7-(2-xlil)-8-tioxoguanos ina (22444 )

O composto do título foi preparado a partir da 8-(2-propenilmercapto)guanosina (22300; Exemplo 6) usando um procedimen to de rearranjo.

Adicionou-se bistrimetilsililacetamida (72 g, 354,7 mM) a uma suspensão de 8-(2-propeniImercapto)guanosina (20 g, 56,3 mM), como material de partida, em clorofórmio (500 ml) e aqueceu -se a mistura resultante ao refluxo durante 16 horas sob N.

Após arrefecimento, a maior parte do solvente foi removido in ✓ z ✓ vacuo, e aqueceu-se o resíduo a 40^0 sob vacuo durante 6 noras.

Misturou-se o resíduo oleoso com tetra-hidrofurano (500 ml), PdCl₂ (10,3g, 58,3 mM) e benzonitrilo (12,1 g, 117 mM) e aqueceu-se a mistura resultante ao refluxo sob durante 3 horas.

197

EPG:11 - SCRF 124.08

-57Arrefeceu-se depois essa mistura até à temperatura ambiente, misturou-se também com piridina (25 ml) e agitou-se de um dia para o outro (cerca de 16 horas). Filtrou-se a mistura através de sílica gel e lavou-se com diclorometano (2x300 ml). Concentrou -se o filtrado combinado in vacuo, e misturou-se o resíduo com uma mistura de água, metanol e ácido acético (500 ml; 10:10:1) e agitou-se durante um período adicional de cerca de 16 horas.

Removeu-se, in vácuo,a maior parte dos solventes adiciona dos, dissolveu-se.o resíduo em DMF (1 litro), e depois tratou-se com carvão activado. Filtrou-se a suspensão obtida, através de um leito de celite, e concentrou-se o filtrado in vácuo. Tratou-se o resíduo com metanol e filtrou-se 0 sólido resultante, lavou-se com acetona, e secou-se numa estufa a 60⁹C obtendo-se a 7-alil-8—tioxoguanosina (8,5 g, 42,5 por cento de rendimento) na forma de um pó esbranquiçado, ponto de fusão superior a 23O²C. RMN (DMSO-dg) 5,90 (m, 1H); 6,32 (d, J=5Hz, 1H) 6,56 (bs, 2H) ;

10,60 (bs, 1H). IV (KBr): 1700, 1635, 1605 e 1450 cm^-1.

Análise calculada oara o C.,H,^N_rO_rS:

1J 1/55

C, 43,93; H, 4,82; N, 19,71

Encontrado: C, 43,96; H, 4,87; N, 19,62.

Exemplo 21: Derivados de 8-ciano-imino-guanosina substituídos na posição 7 com hidrocarbilo substituído com heteroátomos

Para estes derivados usam-se, como materiais de partidq os derivados de 8-tioxoguanosina, substituídos na posição 7 com hidrocarbilo substituído com heteroátomos, correspondentes. Numa preparação típica, adiciona-se iodeto de metilo (42 mmole) a 28 mmole da tioxoguanosina de partida, dissolvida em dimetilsulfóxi. do (DMSO) . A adição realiza-se à temperatura ambiente, sob azoto. Agita-se a mistura resultante, durante cerca de três horas, e depois arrefece-se até cerca de zero graus C. Adiciona-se cianamida (cerca de 57 mmole), e depois hidreto de sódio (dispersão de óleo a 60%; 5 mmole). Deixa-se a mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente e agita-se durante cerca de uma hora. Adi. ciona-se depois a mistura reaccional a cerca de 1,5 litros de

9 197 /j”

EPO:11 - SCRF 124.08 //.. /'-·

-58éter etílico e agita-se durante cerca de 10 minutos. Decanta-se a fase de éter, extracta-se o resíduo com mais 1,5 litros de éter etílico contendo adicionalmente cerca de 50 ml de ácido acético. Decanta-se de novo a fase de éter e dissolve-se o res_í duo em água (cerca de 500 ml) . A partir da fase aquosa, purifica, -se o resíduo por HPLC de fase inversa (C-18).

Exemplo 22: Derivados de aIquilidenodioxilo de cadeia curta

Como exemplo da síntese de um derivado de a lqui lide nodiox_i lo de cadeia curta de um dos compostos anteriormente descritos, usa-se a síntese seguinte de um derivado de isopropilideno.

Agita-se uma mistura de 8-oxoguanosina, substituída na po sição 7 com hidrocarbilo substituído com heteroátomos '(17 mmole), 2,2-dimetoxipropano (41 mmole), acetona (200 ml) e ácido sulfúri co concentrado (10 gotas), sob N₂,à temperatura ambiente, durante um período de 52 horas. Arrefece-se a mistura até zero graus C e trata-se com hidróxido de amónio concentrado (5 ml). Remove-se a maior parte do líquidq in vacuo, e filtra-se o sólido resul tante. Lava-se o sólido filtrado com água, acetona e depois com éter etílico, seguindo-se uma secagem numa estufa de vácuo a 60 graus C por forma a obter-se o derivado desejado. Para os deriva dcs 8-tioxo, 8-selenoxo e 8-ciano-imino, seguem-se procedimentos similares.

Exemplo 2 3: 8—oxo-2' ,3'—0-isopropilideno-5¹-benz oiIguanosina substituída na posição 7 com hidrocarbilo substituído com heteroátomos

Agita-se uma mistura contendo um derivado de isopropilide no, como se descreveu no Exemplo 22 (3 mmole), trietilamina (3 ml), cloreto de benzoilo (3 mmole) e diclorometano (100 ml), à temperatura ambiente durante um período de 16 horas. Adiciona-se depois a mistura a água, separa-se a fase de diclorometano, e ex tracta-se a fase aquosa com mais diclorometano (2x150 ml).

Combinam-se as fases de diclorometano, secam-se com NaSO,, 4 e remove-se o solvente in vácuo. Purifica-se o resíduo por croma

197

EPG:11 - SCRF 124.08

-59tografia em coluna de sílica gel.

Os derivados de 5'-acetilo são preparados substituindo o cloreto de benzoilo por anidrido acético. Os derivados de 8-tio

I xo, 8-selenoxo e 8-cianimino são preparados de um modo similar.

Exemplo 24:

8-tioxo—2 ¹,3',5¹-triacetiIguanos ina substituída na posição 7 com hidrocarbilo substituído com heteroátomos

Esta preparação é um exemplo dos procedimentos de acilação para o anel de ribosilo.

Adiciona-se 4-N,N-dimetilaminopiridina (10 mg) a uma mistura de 8-tioxoguanosina,substituída na posição 7 com hidrocarbi lo substituído com heteroátomos, (3 mmole), trietilamina (2 ml), anidrido acético (15 mmole; alternativamente podem usar-se clore tos de acilo de cadeia curta ou cloreto de benzoilo) e diclorome tano (50 ml). Agita-se a mistura reaccional resultante sob N du rante 16 horas à temperatura ambiente.

Adiciona-se depois mais diclorometano (50 ml)-e lava-se a solução com HC1 IN, com salmoura e, depois, com água. Depois seca-se a soluçã© com Na^SO^ . Remove-se o solvente in vácuo e pu rifica-se o resíduo,por cromatografia. em coluna de sílica gel.

Para preparar os derivados de 8-oxo, 8-selenoxo e 8-ciani mino utilizam-se procedimentos similares.

E. Exemplos de Composições para administração

Descrevem-se seguidamente exemplos de composições sólidas e líquidas, adequadas para administrar os compostos do presente invento, usando, como exemplos de ingredientes activos, cinco dos derivados de guanina-nucleósido mais preferidos.

C omprimidos

Os comprimidos são preparados a partir dos ingredientes seguintes:

197 Ξ PG : 11

SCRF 124.08

-60Partes em peso

7—(2-cloroetil)-8-oxoguanosina 2,5

Lactose em ρδ 36,4

Amido de milho, anidro 34,5

SiO₂ finamente dividida 5,6

Polivinilpirrolidona 0,6

Estearato de magnésio 0,4

80,0

Mistura-se exaustivamente o derivado de guanosina com a lactose, 25,0 partes em peso do amido de milho e 4,0 partes de SiO₂. A mistura resultante é depois humidificada uniformemente com uma solução etanólica a 5% de polivinilpirrolidona. Faz-se de pois passar a mistura molhada através de um peneiro com malha de um milímetro, para produzir um granulado. Seca-se o granulado, du rante cerca de 24 horas, a 60^eÇ, numa câmara de secagem. Faz-se pa£ sar o granulado seco de novo através de um peneiro.com malha de 1 milímetro. Misturam-se 700 partes do granulado assim obtido, num misturador adequado, com uma mistura consistindo na restante SÍO2* ^no restante amido de milho e no total de estearato de magné sio, mistura esta que tinha sido passada, previamente, através de um peneiro com malha de um milímetro. Prensa-se então a mistu ra assim obtida, na forma de comprimidos pesando, cada urr^ 800 milj. gramas e contendo 25 miligramas da guanosina.

Cápsulas de amido

C conteúdo das cápsulas é preparado a partir dos ingredien tes seguintes:

Partes em peso

7-(carbetoximetil)-8-oxoguanosina 10,0

Lactose 450,0

Amido de milho 540,0

1000,0

197

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-61Mistura-se, gradua lmente, o derivado de guanosina com a la_ ctose. Quando já se misturou toda a lactose mistura-se a mistura obtida com amido de milho. Usa-se depois a mistura resultante pa ra encher cápsulas contendo 10 gramas da mistura. Cada cápsula contem 1,0 miligrama do derivado de guanosina.

Comprimidos

Prepara-se um lote de 10.000 comprimidos, contendo, cada um_z50 miligramas de 7-(4-nitrobenz i 1)-8-oxoguanos ina, a partir dos tipos e quantidades de ingredientes seguintes:

7-(4 —nitrobenz il)-8-oxoguanos ina	500	gramas
Fosfato de dicálcio	1000	gramas
Metilcelulose, U.S.P. (15 cps)	75	gramas
Ta lc o	150	gramas
Amido de milho	250	gramas
Estearato de magnésio	25	gramas

2000 gramas

Misturam-se bem o derivado de guanosina e o fosfato de dicálcio, granulam-se com uma solução a 7,5 de metilcelulose em água, faz-se passar através de um peneiro n⁹ 8 (U.S. Standard Sieve Series) e seca-se cuidadosamente. Fazem-se passar os grânu los secos através de um peneiro n⁹. 12 (U.S. Std. Sieve Series), misturam-se com o talco, o amido e o estearato de magnésio e pen sa-se em comprimidos.

Composição injectável

Prepara-se uma composição estéril, adequada para injecção subcutânea ou intracavitária e contendo 50 miligramas de 7-carbo xamidometil-8-oxoguanosina em cada mililitro de ingredientes, a partir dos tipos e quantidades de ingredientes seguintes:

7-Carboxamidometil-8-oxoguanosina 5 gramas

Solução salina fisiológica 98 mililitros

Óleo de sésamo 2 mililitros

BAD ORIGINAL

SCRF 124.08

197 EPG:11

-62Misturam-se o derivado de guanosina e a solução salina e sonica-se a mistura durante um período de tempo suficiente para se obter uma suspensão substancialmente homogénea. Mistura-se depois o óleo de sésamo e homogeneiza-se similarmente a nova mis tura por forma a obter-se uma emulsão. Após a emuls ionação, injectam-se cinco a quinze por cento do volume final desta preparação estéril, subcutânea ou intraperitonealmente, uma vez por semana, para melhorar a imunidade humoral.

Composição aquosa para uso oral

Prepara-se uma composição aquosa para uso oral contendo cada 5 mililitros (1 colher de chá), 25 miligramas de 7-(4-metox_i benzil)-8-oxoguanosina, a partir dos ingredientes seguintes:

7—(4-metoxibenzil)-8-oxoguanosina 5,0 gramas

Metilparabeno, U.S.P.	0,75 gramas
Propilparabeno, U.S.P.	0,25 gramas
Sacarina de sódio	1,25 gramas
Ciclamato de sódio	0,25 gramas
Glicerina	300 mililitros
PÓ de tragacanto	1,0 gramas
Sabor de óleo de laranja	1,0 gramas
Corante de laranja F.P. e C.	0,75 gramas

Agua desionizada, q.s. para 1000 mililitros

C. Métodos

Culturas de linfócitos

Prepara—se o meio de cultura contendo soro, para conter em 100 mililitros o seguinte: 91,9 mililitros de RPMI164C (Flow

Laboratories, Inc . , Rockville, MD, E.U.A.), 0,1 mililitros de lOOxglutamina, 1,0 mililitro de lOOxpiruvato de sódio, 1,0 milil tro de SOxaminoácidos não essenciais, 1,0 mililitro de água con4 4 tendo 10 unidades de penicilina G e 10 microgramas de estrepto micina e 5,0 mililitros de um lote suportante ou de soro fetal ^G'^V1AL J .k.JW'

197

EPG;11 - SCRF 124.08

-63de vitelo (FCS). Misturam-se estes ingredientes até se ter uma homogeneicidade aparente. Preparam-se suspensões de células de baço e populações enriquecidas com células B esplénicas tal como se descreve em Goodman et al., J. Immunol., 121:1905 (1978).

para avaliar a imuno-resposta humoral primária aos eritro 6 7 eitos de ovino (SRBC), cultivam-se 5x10 a lo células de baço murinos em 1/0 mililitro de meio contendo 5% de FCS durante 4 ou 5 dias na presença do imunogénio. Incubam-se as células em placas de cultura (Costar, Cambridge, MA, E.U.A.) a 37RC, numa atmosfera humidificada de 10% de CO2 em ar, usando caixas de cultura de tecidos (CBS Scientific, Del Mar, CA) que são agitadas a uma frequência de 7 ciclos por minuto. Os SRBC em fase líquida estEo di£ poníveis na Colorado Serum Co., Denver Co., E.U.A.

Preparam-se linfócitos de sangue humano periférico (PBL) a partir de sangue venoso heparinizado, por centrifugação em gra diente de densidade de Ficoll-diatrizoato. CsPBL são desprovidos de células T supressoras contendo o receptor de histamina do tipo 2, fazendo-os aderir às superfícies de caixas de pètri,de piás tico,revestidas com albumina de soro de coelho-histamina (Cell ect n^2 Kit; Seragen, Boston, MA, E.U.A.) e recuperando as células não aderentes por lavagem tal como se descreve em Wysocki e Sato, Proc, Natl. Acad, Sei. USA 75 : 2 844 (1978) e tal como foi modificado por Cavagnaro e Osband, Bioteohniques, Janeiro/Feverei r o : 3 0 (1983).

meio de cultura de tecidos utilizado nestes estudos é pre parado como se segue: cem mililitros (ml) contêm 87,9 ml de RPMI

1640 (Elow Laboratories, Rockville, MD, E.U.A.), 0,1 ml de 100 x x glutamina, 1,0 ml de Tampão HEPES 1,0 M (Microbiologica1 Asso, 4 ciates, Betheseda, MD, E.U.A.), 1,0 ml de agua contendo 10 U de penicilina G e 10 microgramas de estreptomicina, e 10 ml de plasma desactivado por calor autólogo, fresco. Para avaliação da imuno-resposta humoral primária ao SRBC, cultivam-se células linfóides com uma densidade de 2xl0^/ml num volume de 1,0 ml conteng do 5x10 SRBC como antigénio (Colorado Serum Co., Denver, Co., E.U.A.) conjuntamente com IL-2 (uma preparação parcialmente puribAú ΟΗΙθ'ΝΑΙ69 197

EPG:11 - SCRF 124.08

-64fiçada de IL-2 humana, que está isenta de actividade de interfe rSo-gama, que foi obtida na Electro-Nucleonics, Inc ., Silver Spring, MD, E.U.A.) e com o derivado de guanina-nucleósido.

Teste de células formando placas (PFC)

Determinaram-se as PFC segregando anticorpos contra o SRBC, após 4 ou 5 dias de cultura, usando uma modificação do ensaio de placa hemolítica de Jerne e Nordin, Science 140:405 (1963). Cultivam-se as células em meio completo antes da formação das placas; estas são colocadas em placas de agarose padrão de baixo Mr (Bio-Rad Laboratories, Richmond CA, E.U.A.), incubatwe em complemento de cobaia absorvido - SRBC durante uma ho ra, após 1,5 horas de incubação sem complemento.

Actividade de substituição de células T

Cultivam-se 5χ1θθ células B viáveis de ratinho CBA/CaJ.

Estas células são geradas tratando sequencialmente células de baçe^ primeiro, com complemento que fixa os anticorpos monoclonais dirigidos contra os antigénios thy 1.2 das células T.e,em segundo lugar, com complemento para lisar quaisquer células T presentes (New England Nuclear, Boston, MA, E.U.A.). Cultivam-se depois as células assim tratadas, com ou sem 0,1 ml de SRBC a 0,1 por cento (v/v) como imunogénio, em meio contendo soro e contendo também quantidades incrementais de um derivado de guanosina numa -4 quantidade compreendida entre O e IO molar. Os PFC directos con tra o SRBC são determinados 4 dias depois.

Ratinhos Os ratinhos CBA/Caj, 8-16 semanas de idade, são adquiridos no Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, E.U.A. Um núcleo de criação de ratinhos CBA/N é fornecido pela Animal Production Sec tion, National Institutes of Healter, Bethesda, MD, E.U.A. Todos os ratinhos são mantidos com pelotas Wayne Lab Blox F6 (Allied Mills, Inc., Chicago, IL, E.U.A.) e com água clorada, acidifiçada com HC1 a um valor de pH de 3,0.

Preparações de células As suspensões de células de baço e do timos são preparadas como se descreve em Goodman et al., J. Immunol♦, 121:1905 (1978). As populações, enriquecidas com células

197

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-658 z

B, são preparadas tratando 10 células de baço com uma diluição 1:1000 dé anticorpo monoclonal anti-thy 1.2 (New England Nuclear, Boston, MA, E.U.A.) durante 3o minutos a 4 . Centrifugam-se as células tratadas a 280 xg,durante 10 minutos, removem-se os anti corpos e ressuspendem-se as células numa diluição 1:6 de complemento de cobaia absorvido - RBC de CBA, a 37^c durante 45 minutos. Lavam-se então as células e cultivam-se como anteriormente se descreveu.

Lnjecçoes Os ratinhos são injectados i.p.^com uma solução contendo 50 g de TNP-BSA. Nos cerca de 30 minutos seguintes à injecção de imunização, dois grupos de seis ratinhos ,cada um recebem também injecções de 0,2 ml i.p. de uma guanosina da invenção em óleo de sésamo a 100 por cento, ou em 2 por cento (v/v) de óleo de sésamo sonicado em solução salina normal, estando a guanosina presente numa concentração de 5 mg/ml. Um terceiro grupo de seis ratinhos recebeu a imunização mas não recebeu derivado de guanosina. 0s títulos de anticorpos anti—TNP—BSA são depois deter minados usando técnicas padrao.

presente invento foi descrito em relação às suas concre tizações preferidas. Será evidente para os peritos na arte que se podem fazer modificações e/ou variações da matéria que se des creveu sem se alterar o espírito da invenção aqui definido.

9 197

EPG:11 - SCRF 124.C8 .

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de preparação de um derivado de guanina-nucleósido substituído que corresponde ã fórmula:

   onde

   X é O, S, Se ou NCN;

   r! é um radical hidrocarbilo substituído por heteroátomo, possuindo um comprimento superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo, e que está livre de carga iónica aos valo res de pH fisiológicos;
2. 2 3

   R e R são radicais iguais ou diferentes seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio, hidroxilo, aIcanoiloxilo inf 2 3 rior e benzoxilo, ou R e R constituem juntos um radical alquil deno-dioxilo inferior;

   4 ,

   R e um radical seleccionado do grupo consistindo em hidro génio, alcanoílo inferior e benzoílo; e dos seus sais de adição de base, não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por compreender os passos de

   a) se reagir l-amino-8-oxoguanosina com um agente de alqui lação que é um composto hidrocarbilo substituído por heteroátomo possuindo um comprimento superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo e que está livre de carga iónica a valores de pH fisiológicos para formar um produto 1-amino—7-substituído-8-oxoguanosina;

   b) isolar o produto do passo a)

   c) dissolver o referido produto isolado do passo b) em HC 1

   69 197 EPG:11

   SCRF 124.08

   -67concentrado para formar uma solução;

   d) misturar a referida solução do passo c) com nitrito de sódio aquoso e mantendo a mistura resultante durante um perío do de tempo suficiente para desaminar o grupo 1-amino da referida l-amino-7-substituída-8-oxoguanosina; e

   e) isolar o produto 7-substituído-8-oxoguanosina resultan te;

   ou a’) reagir 8-tioxoguanosina com um agente de alquilação que é um composto hidrocarbilo substituído por um heteroátomo pos suindo um comprimento superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo e que está livre de carga iónica a valores de pH fisiológicos para formar uma hidrocarbil-8-tioxoguanosina subs tituída em 7 por heteroátomo; e b') se isolar o produto hidrocarbil-8-tioxoguanosina substituída em 7 por heteroátomo, resultante;

   ou a'¹) se reagir o produto isolado do passo b') com um agente de S-alquilaç3o para formar um produto S-alquilado;

   b'') isolar o referido produto S-alquilado;

   c¹¹) reagir o referido produto S-alquilado com seleneto de sódio para formar um produto hidrocarbi1-8-selenoxoguanosina substituído em 7 por heteroátomo; e d' ¹ ) se isolar o referido produto do passo c' ’ ) ;

   ou a''*) se reagir o produto isolado do passo b'¹) com ciana mida e com hidreto de sódio para formar um produto hidrocarbil-8-cianiminoguanosina substituída em 7 por heteroátomo;

   e b‘ ^{1 1} ) se isolar o referido produto do passo a' ^{1 1} ) ;

   ou

   SCRF 124.08

   69 197 SPG:11 a' ‘ ¹ ’ ) se reagir qualquer dos produtos isolados nos passos e), b’), d'') ou b‘'¹) com um composto alquilidenodioxilo inferior, com um composto acilo inferior ou benzoílo para formar 2 3 4 ~ um produto no qual R , R e R sao como acima definidos; e b' ' ' ' ) se isolar o produto do passo a* ' ' ' ).

   2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o agente de alquilação do passo a) ser epibromo-hidrina, o referido produto, isolado no passo b) ser 1-amino—7-( 2,3-epoxi. propil)-8—oxoguanosina e antes do passo c), o referido produto isolado ser:

   i) reagido com um reagente seleccionado do grupo consistiri do em tiofenol, 3,4-dimetoxifenetilamina, azida de sódio, água e 4-(4-fluorofenil)piperazina para formar um produto;

   ii) isolar o referido produto do passo i); e iii) e por o produto isolado do passo ii) ser o produto isolado utilizado no passo c).
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o agente de alquilação do passo a) ser seleccionado do grupo consistindo em bromoacetato de etilo, 2-cloroacetamida, uma 2 —cloroacetamida substituída por N-hidrocarbilo ou N-alcanol, cujo grupo carboxamido tem a fórmula CONR^R^ onde R^ e R^ são iguais ou diferentes e são seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio, alquilo inferior ou alcanol C₂~C₃, ou NR R⁶ em conjun to formam um anel heterocíclico com cinco ou seis átomos no anel, um haloéter, cloreto de 3-Ν,Ν-dimetilaminopropil, cloreto de 2-piperidinoetilo, 2—bromo-4-cloroacetofenona, brometo de 4-ni — trobenzilo, cloreto de 4-metoxibenzilo e brometo de 2-cloroetil.
4. 4 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por compreender a mistura de uma quantidade diluen te de um transportador fisiologicamente tolerável e de uma quantidade imunopotenciante eficaz de um derivado de guanina-nucleósido substituído, melhorador da resposta imunitária preparado de acordo com a reivindicação 1.
5. 5 — Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteri_Bí\D ORIGINAL
6. 6 9 197

   EPG:11 - SCRF 124.08

   -69zado por no composto de fórmula I X ser 0 ou S.

   6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteri2 3 zado por no composto de fórmula IR e R serem hidroxilo e por 4

   R ser hidrogénio.
7. 7 - Processo para melhorar uma resposta imunitária, cara cterizado por compreender o contacto de leucóc it os, num meio aquoso, com uma composição contendo uma quantidade diluente de um transportador fisiologicamente tolerável com uma quantidade imunopotenciante eficaz de um derivado de guanina-nucleósido su bstituído, tendo o referido derivado de guanina-nucleósido subs tituído uma estrutura que corresponde à fórmula onde

   X é 0, S, Se ou NCN;

   r! é um radical hidrocarbilo substituído no heteroátomo, com um comprimento superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo e que está isento de carga iónica aos valores fisiológicos de pH ;

   2 3

   R e R sao radicais iguais ou diferentes seleccionados entre os do grupo consistindo de hidrogénio, hidroxilo, alcoxilo 2 3 inferior, alcanoiloxilo inferior, e benzoxilo, ou R e R consti tuem juntos um radical alquilidenodioxilo inferior;

   R é um radical seleccionado entre os do grupo consistindo de hidrogénio, alcanoilo inferior e benzoílo;

   e os seus sais de adição de base, não tóxicos, farmacêuticamente ace itáve is .
8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteriza

   69 197

   EPG:11 - SCRF 124.OB

   -70do por os referidos leucócitos serem postos em contacto in vitro, num meio de cultura.
9. 9 — Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteri zado por os referidos leucócitos incluírem células B.
10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a referida resposta imunitária ser uma resposta especifica para antigénio.
11. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteri zado por os referidos leucócitos serem seleccionados entre os do grupo consistindo de células B, células T e neutrófilos, humanos .

    -4. til '539

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