DK170780B1 - Substituerede guaninnucleosidderivater, immunreaktionsforstærkende præparater deraf, og fremgangsmåde til at forøge en immunreaktion - Google Patents

Description

DK 170780 B1

Den foreliggende opfindelse angår substituerede guaninnucleosidderivater, immunreaktionsforstærkende præparater deraf og en fremgangsmåde til at forøge en immunreaktion.

5 Et dyrs immunsystem omfatter adskillige elementer, som virker hver for sig og/eller sammen for at modvirke, eliminere eller neutralisere stoffer, som genkendes af dette system som værende fremmede for værtsdyret. Muligvis, men ikke nødvendigvis har det stof, der genkendes som værende 10 fremmed af immunsystemet, dets oprindelse uden for værten.

Som typiske eksempler på sådanne exogene stoffer tjener infektiøse bakterier og biprodukterne af deres cellulære aktivitet, viruspartikler og deres proteiner, proteiner injicerede med insektstik, og lignende. Ved autoimmune syg-15 domme, såsom rheumatoid arthritis, genkender værtens immunsystem proteiner, produceret af værten, som fremmede.

De vigtigste af immunsystemets effektorer er leukocy-terne, som omfatter lymphocyter, der stammer fra thymus (T-celler), lymphocyter produceret i knoglemarven (B-celler), 20 neutrophiler, der blandt andet producerer enzymer, som fremstiller oxiderende stoffer, såsom hydrogenperoxid, der har cytotoxiske virkninger på bakterier, og macrophager, som præsenterer det fremmede stof eller antigenet for T-cel-lerne, samt producerer et protein med betegnelsen inter-25 leukin-1, som hjælper ved at transformere T-celler til T-hjælper-celler. Komplement, der er en kompleks blanding af proteiner, som virker på en ordnet, kaskadelignende måde på det fremmede stof, spiller ligeledes en hovedrolle ved immunreaktioner.

30 B-celler kan skelnes fra T-celler blandt andet ved tilstedeværelsen af immunoglobuliner på deres membranoverflade. Immunoglobulinerne virker som antistoffer.

Der er fem kendte immunoglobulinklasser, der identificeres IgA, IgD, IgE, IgG og IgM på basis på fem antigenisk 35 forskellige kædeproteiner, som tildels udgør immunoglobulinmolekylet. B-celler har ligeledes ikke-imraunoglobulin celle- DK 170780 B1 2 markører, men herunder en komplementreceptor (CR), en receptor for Fc-delen af immunoglobulin (FCR), i-region-associe-rende antigener (la), og et sæt af differentiationsantigener (Lyb 1-7), som identificeres af alle antisera og er korrele-5 ret med de forskellige aspekter af B-cellemodning og aktivering. Disse markører er anvendelige til phenotypisk identifikation af B-celler.

Medens B-celle-immunoglobuliner virker på det fremmede stof, eller antigen, mener man, at T-celler, og især hjælper-10 T-celler, er nødvendige til stimulering af B-celler til at dele sig og til at differentiere til antistof-udsondrende celler til humoral immunitet. Suppressor-T-celler bidrager til reguleringen af humoral immunitet, medens cytotoxiske T-celler og T-cellemediatorer af typen med forsinket hyper-15 sensitivitet er de vigtigste effektorer af celle-formidlet immunitet.

T-celler omfatter antigener med betegnelse Lyt l, 2 og 3 samt L3T4, som er relaterede til T-cellefunktioner. Hjælper-T-celleforstadier er af Lyt 1+, 2”, 3”, L3T4T-pheno-20 typen. Det er disse celler, som normalt deltager i aktiveringen og reguleringen af B-celler.

Det er kendt, at hjælper-T-celler hjælper til ved aktivering og differentiation af immunoglobulin-udsondrende B-celler efter, at et første budskab er modtaget af B-celler-25 ne fra det aktiverende antigene stof. Man er imidlertid uenig om den måde, ved hvilken T-cellerne tilvejebringer det andet budskab til B-celle-deling eller aktivering og differentiation til B-cellerne.

Guanosin-3',5'-cyclisk monophosphat (cGMP) er blevet 30 impliceret som et naturligt forekommende middel til tilvejebringelse af det krævede andet budskab til B-celle-deling.

Det havde vist sig, at 8-bromguanosin-3',5'-cyclisk monophosphat (8-BrcGMP) er et svagt syntetisk intracellulært lymphocytmitogen.

35 Immunreaktionen kan modificeres ved artificiel under trykkelse (immunosuppression) eller forøgelse (immunopotenti- DK 170780 B1 3 ering eller immunostimulation). Immunosuppresion, dvs. artificiel induceret nedsat reaktion, kan opnås ved hjælp af 6 generelle fremgangsmåder: (1) indgift af antigen, (2) indgift af specifik antisera eller antistof, (3) anvendelse af andre 5 biologiske reagenser, såsom antilymphocytantisera, (4) anvendelse af lægemidler eller hormoner, (5) bestråling og (6) kirugisk fjernelse af lymfevæv. Immunopotentiering kan omfatte indgiften af et middel, der bevirker en forøgelse af den hastighed, med hvilken immunreaktionen udvikles, en 10 forøgelse i intensiteten eller niveauet af reaktionen, en forlængelse af reaktionen eller fremkaldelsen af en reaktion til et ellers ikke-immunogent stof.

De midler, der er kendte for at forbedre immunreaktioner, kaldes almindeligvis adjuvanter, og kan anbringes i 15 2 generelle kategorier: (1) de stoffer, der tilvejebringer en generel potentiering, dvs. stoffer, som forøger både cellulære og humorale immunreaktioner for mange forskellige antigener, (2) de stoffer, der tilvejebringer specifik potentiering, dvs. stoffer, som kun forøger specifikke reaktioner 20 mod visse antigener.

Stoffer, der kan virke som adjuvanter kan grupperes i de følgende kategorier: (1) vand- og olieemulsioner, eksempelvis Freund's adjuvant, (2) syntetiske polynucleotider, (3) hormoner, lægemidler og cycliske nucleosider, (4) endo-25 toxiner, (5) protein-lymphokiner og -monokiner, såsom inter-leukinerne.

Et stof, der kan forstærke immunreaktionen specifikt, er overføringsfaktoren, et dialyserbart leukocytekstrakt (DLE), der fås fra humane periphere leukocyter. Det er rap-30 porteret, at overføringsfaktoren har nogen virkning i patienter med immunsvækkelse og mulig virkning i cancerpatienter og i patienter med begrænset immunsvækkelse. Imidlertid er der stadig meget at lære omkring dette bestemte stof.

Med nogle sygdomme og fysiologiske tilstande, såsom 35 AIDS, X-bundet agammaglobulinæmier, alderssvækkelse og lægemiddel-induceret immunosuppression, mangler B-celle-aktive- DK 170780 B1 4 ring og -differentiation, og/eller den eksisterer kun på et nedsat niveau og nedsætter dermed værtens immunreaktion. Disse sygdomme og tilstande er typiske eksempler på immun-undertrykte tilstande. Hvis forøget aktivering og differen-5 tiation kan bevirkes, har det tilbøjelighed til på gunstig måde at mindske sygdomsmanifestationen og/eller forbedre patientens tilstand.

En immunforstærket tilstand kan illustreres ved legemets tilstand efter vaccinering. Her er immunreaktionen alle-10 rede forstærket på grund af en antigenreaktion, men den kunne på gunstig måde forstærkes yderligere til tilvejebringelse af en forbedret grad og/eller varighed af immuniteten.

Fra U.S.patentskrift 4.539.205 er kendt modulering af animalske cellulære reaktioner med 8-substituerede guanin-15 derivater, bundet i stillingen 9-1' til en aldose med 5 eller 6 C-atomer i aldosekæden (ringen). De cellulære modulationer, der er beskrevet i dette patentskrift, angår for det meste immunmodulation, såsom adjuvansvirkning ved fremkaldelse af primære og sekundære immunreaktioner. Aktivitet 20 mod visse neoplastiske tilstande er ligeledes kendt, ligesom T-celleerstattende aktivitet, en IL-l-lignende aktivitet på thymocyter, og induktion af frigivelsen af lysosomale enzymer fra neutrophiler. 8-Substituenterne i disse molekyler har elektrontiltrækkende induktive virkninger i forhold til 25 hydrogen. Således er det beskrevet, at halogen, mercapto eller dets thioxotautomer, acylmercapto, alkylsulfido, nitro, cyano, keto, halogenmethyl og methylenoxyalkyl og lignende er anvendelige, medens elektrondonorsubstituenter, såsom en aminogruppe, viser sig at være inaktive.

30 Desuden er der fra U.S. patentskrift 4.643.992 og den tilsvarende offentliggjorte europæiske patentansøgning 83306791.1 yderligere kendt anvendelsen af derivater af 8-hydroxyguanin (8-oxoguanin), 7-methyl-8-oxoguanin og 7-me-thyl-8-thioxoguanin til modulering af animalske cellulære 35 reaktioner. Yderligere resultater ved anvendelsen af guanin-derivater, kendte fra U.S. patentskrift 4.539.205, er ligele- DK 170780 B1 5 des kendte fra U.S.patent 4.643.992, og lignende resulater med anvendelse af guaninderivater er ligeledes beskrevet for første gang i dette patentskrift.

Der er endvidere offentliggjort adskillige artikler 5 og bogkapitler, som angår yderligere virkninger af forbindelser, der er kendt fra U.S. patent 4.643.992. Som typiske eksempler på disse offentliggjorte artikler tjener Goodman, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 179:479 (1985)? Goodman, J.

Immunol., 136:3335 (1986); Goodman og Wiegle i Purine 10 Metabilism In Man, Del B, Nyhan og Thompson, eds., Plenum Press, New York, 451 og 443 (1986) ? Goodman og Weigle, J. Immunol., 135:3284 (1985); Goodman og Wolfert, Immunol.

Res., 5:71 (1986)? Goodman, J.Immunol., 136:3335 (1986);

Goodman, J.Immunol., 137:3753 (1986); og Goodman og Hennen, 15 Cell. Immunol., 102:395 (1986).

Den foreliggende opfindelse angår substituerede guaninnucleosiderivater, som er ejendommelige ved, at de har formlen Ί&·

NH, K I

H'TJTh R^R2

25 R R

hvori R1 er en heteroatom-substitueret carbonhydridgruppe, som har en længde, der er større end længden af en ethyl-gruppe og mindre end længden af en decylgruppe, og som ikke 30 har ionisk ladning ved physiologiske pH-værdier, R2 og R3 er ens eller forskellige grupper, valgt blandt hydroxyl, lavere alkoxy, lavere alkanoyloxy og benzoxygrupper, eller R2 og R3 udgør tilsammen en lavere alkylidendioxygruppe, og R4 er valgt blandt hydrogen, lavere alkanoyl- og benzoyl-35 grupper, og de farmaceutisk acceptable, ugiftige baseadditionssalte deraf. Foretrukne guanosinderivater ifølge opfin- DK 170780 B1 6 delsen er den, hvori R1 har en samlet længde (herunder dets heteroatom-substituent), der er større end længden af ethyl og mindre end ca. længden af heptyl. Især foretrukne guano-sinderivater er 7-(2-chlorethyl)-8-oxoguanosin, 7-carbethoxy-5 methyl-8-oxoguanosin, 7-carbamoylmethyl-8-oxoguanosin, 7-methoxyethyl-8-oxoguanosin, 7-(4-nitrobenzyl)-8-oxoguanosin, 7- (4-methoxybenzyl) -8-oxoguanosin og 7- (2,3-dihydroxypropyl) - 8- oxoguanos in.

Opfindelsen angår desuden immunreakt i ons-forstærkende 10 præparater, som er ejendommelige ved, at de indeholder en fortyndende mængde af en fysiologisk acceptabel bærer, blandet med en immunforstærkende virkende mængde af et immun-reaktionsforøgende substitueret guaninnucleosidderivat ifølge opfindelsen.

15 Opfindelsen angår ligeledes en fremgangsmåde til at forøge en immunreaktion, nærmere bestemt en antigen-specifik immunreaktion, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at leukocyter i et vandigt dyrkningsmedium bringes i kontakt in vitro med et præparat indeholdende en fortyn-20 dende mængde af en fysiologisk acceptabel bærer blandet med en immunforstærkende mængde af et substitueret guaninnucleosidderivat ifølge opfindelsen. Kontakten mellem præparatet og leukocyterne opretholdes i en tidsperiode, der er tilstrækkelig til, at de celler, der er blevet kontaktede, 25 manifesterer forstærkning af deres immunreaktion. De leukocyter, der kontaktes, er fortrinsvis B-lymphocyter.

Den foreliggende opfindelse har adskillige fordele og gunstige virkninger.

En iøjnefaldende fordel ved opfindelsen er, at for-30 bindeiserne ifølge opfindelsen generelt er mere effektive, dvs. giver en lignende reaktion ved en lavere dosis eller giver en forøget reaktion ved en given dosis i forhold til kendte guanosinimmunostimulerende stoffer.

En fordel ved opfindelsen er, at anvendelsen af et 35 af præparaterne deraf kan tilvejebringe det andet budskab, der kræves til B-lymphocytaktivering og differentiering som DK 170780 B1 7 reaktion på et første (antigent) budskab.

En anden fordel ved opfindelsen er, at man kan udvirke en forøget immunreaktion i både nærvær og fravær af T-hjæl-per-celleaktivitet. Således bemærkes en forøget immunreaktion 5 i både T-celle-afhængige og T-celle-uafhængige systemer.

Den anden fordel ved opfindelsen er, at man kan forbedre og/eller forringe bestemte immun-undertrykte eller immun-svækkede tilstande og sygdomsmanifestationer ved anvendelse af opfindelsen.

10 Endnu yderligere goder og fordele ved opfindelsen vil være åbenbare for fagfolk ud fra den nedenfor angivne diskussion.

Anthropomorfe beskrivelser, såsom afsendelse og modtagelse af budskaber fra og til kemikalier og celler, anven-15 des til beskrivelse som hjælpemidler til forståelse af iagttagne fænomener.

Detaljeret beskrivelse af opfindelsen.

20 I. Introduktion.

Den foreliggende opfindelse angår et immunreaktions- forbedrende middel (immunstimulator), som stimulerer immunsystemet i værtsdyret, hvortil det indgives, samt stimulerer leukocyter i cellekultur. Den her især omhandlede immun-25 stimulation er i overvejende grad antigen-specifik for det immuniserende antigen.

Ved undersøgelse af virkningerne af nogle angiveligt mitogene guanosinderivater, såsom guanosin-3',51-cyclisk monophosphat og dets 8-bromderivat, viser det sig, at en ny 30 klasse af guaninnucleosidderivater med lav molekylvægt giver bemærkelsesværdige virkninger, når de er til stede i en virksom mængde som den aktive ingrediens i et præparat indeholdende en fortyndende mængde af et fysiologisk acceptabelt bærestof, med modulering af reaktioner i pattedyrceller. Forøg-35 else af antigen-specifikke humorale immunreaktioner, som resulterer i potent adjuvansvirkning, T-celle-erstattende DK 170780 B1 8 faktor-lignende aktivitet og immunrekonstitutionsaktivitet er særlige eksempler på de cellulære reaktioner, der viser sig at blive modulerede. Disse forbindelser og fremgangsmåder til anvendelse deraf er kendt fra U.S. patentskrifterne 5 4.539.205 og 4.643.992.

Forbindelserne ifølge opfindelsen viser sig at være overraskende mere aktive end forbindelserne fra de ovennævnte 2 patentskrifter. Resultaterne med hensyn til forøget aktivitet er overraskende af mange årsager.

10 Den mest aktive forbindelse, kendt fra de ovennævnte patentskrifter, er 7-methyl-8-oxoguanosin (7m8oGuo), både som leukocy tmi togen og et antigen-specifikt adjuvant. Mitoge-nitet og adjuvansvirkning er fænomener, som det omtales nedenfor, som ikke nødvendigvis har en sammenhæng.

15 I betragtning af senere opnåede data er det overras kende, at 7m8oGuo har forøget aktivitet i forhold til forbindelser, såsom 8-hydroxyguanosin (omtalt som den tautomere, 8-oxoguanosin, 8oGuo), eller 8-mercaptoguanosin (omtalt som 8-MGou, eller som dets tautomere 8-thioxoguanosin). Nærmere 20 bestemt afslører senere data, hvoraf nogle er angivet nedenfor, at aktiviteten (både mitogenitet og adjuvansvirkning) af en række 8-substituerede guanosiner falder med voksende størrelse af 8-substituentgruppen.

Eftersom methylgruppen i 7m8oGuo er bundet til guano-25 sinringen, i nabostilling til 8-stillinger, hvor der findes en substituentstørrelseseffekt, ville man således have forventet, at additionen af denne gruppe eller hvilken som helst gruppe i 7-stillingen, hvor der tidligere ikke var nogen substituent, ligeledes ville forårsage en nedsættelse 30 af aktiviteten, blot fordi det omhandlede molekyle er større i en stilling, nabostillet til den størrelses-følsomme ringstilling. Den forbedrede adjuvansvirkning af forbindelsen ifølge opfindelsen med stadig større substituenter i 7-stillingen på guanosinringen i forhold til 7m8oGuo er endnu 35 mere overraskende.

DK 170780 B1 9 II. Forbindelserne

De her omhandlede immunstimulerende forbindelser er 7,8-disubstituerede guaninnucleosidderivater (heri ligeledes omtalt som guanosiner eller guanosinderivater). Disse for-5 bindeiser har formlen O R1 Χλ>" R3 R2 15 hvori R1 er en heteroatom-substitueret carbonhydridgruppe, som har en længde, der er større end længden af en ethyl-gruppe og mindre end længden af en decylgruppe, og som ikke har ionisk ladning ved physiologiske pH-værdier, R2 og R3 er ens eller forskellige grupper, valgt blandt hydroxyl, 20 lavere alkoxy, lavere alkanoyloxy og benzoxygrupper, eller R2 og R3 udgør tilsammen en lavere alkylidendioxygruppe, og R4 er valgt blandt hydrogen, lavere alkanoyl- og benzoyl-grupper.

Det bemærkes, at det er meningen, at ribosylgruppen 25 i formlen ovenfor skal være vist bundet i 1-stillingen i den ring med bindingen i beta-konfiguration. Desuden skal D-formen af ribosylgruppen forstås på samme måde.

Foretrukne guanosinderivater er de derivater, hvori R1 har en længde, der større end længden af ethyl og mindre 30 end længden af heptyl, og R2 og R3 er forskellig fra lavere alkylidendioxy. Især foretrækkes udførelsesformer, hvori R1 er valgt blandt 2-chlorethyl (-CH2CH2CI) , carbethoxymethyl (-CH2CO2C2H5), carbamoylmethyl (-CH2CONH2), methoxyethyl (-CH2CH2OCH3), 4-nitrobenzyl, 4-methoxybenzyl og 2,3-dihydro-35 xypropyl, R2 og R3 er hydroxyl, og R4 er hydrogen. Især foretrækkes det, at R1 er 4-nitrobenzyl eller 2-chlorethyl, DK 170780 B1 10 R2 og R3 er hydroxyl, og R4 er hydrogen.

Som ovenfor bemærket har en R3—gruppe en længde, som er større end længden af ethyl, og omfatter således hetero-atomsubstituerede ethylgrupper, hvor substituenten har en 5 størrelse, som er større end hydrogenatomer. En R3--gruppe har ligeledes en længde, som er mindre end længden af en decylgruppe. R1 er altså en heteroatom-substitueret carbon-hydridgruppe med en længde af den længste kæde, herunder substituenten, som er større end længden af en mættet kæde 10 med 2 carbonatomer og mindre end længden af en mættet kæde med 10 carbonatomer, idet hver længde omfatter passende hydrogenatomer. En heteroatom-substitueret carbonhydridgrup-pe, der simpelthen omtales som heteroatom-substitueret propyl, butyl, hexyl eller decyl eller lignende, skal forstås 15 således, at de har en normal ligekædet carbonhydridgruppe. Forgrenede heteroatom-substituerede kæder angives ved sædvanligvis anvendte numeriske eller forkortede præfixer, såsom henholdsvis 2-propyl eller isopropyl.

Kædelængden af heteroatom-substituerede carbonhydrid-20 grupper måles langs den længste kæde i substituenten. Denne længste kæde kan eventuelt omfatte den heteroatom-substituerede hydridgruppe. Disse længder kan let beregnes ved anvendelse af offentliggjorte bindingsvinkler, bindingslængder og atomradier efter behov for at tegne og måle længder af 25 gruppernes siksakkædeformer, eller ved at bygge modeller ved anvendelse af kommercielt tilgængelige sæt, hvis bindingsvinkler, længder, og atomradier er i overensstemmelse med accepterede, offentliggjorte værdier. Desuden kan man anslå tilnærmede substituentlængder ved at antage, at længderne 30 af umættede bindinger, bindingsvinkler og atomradier samt disse parametre i atomerne i en heteroatom-substituent har samme værdi som mættede carbonatomer, skønt man foretrækker de ovennævnte målemetoder.

R1 er en heteroatom-substitueret carbonhydridgruppe 35 med en bestemt længde, som er fri for en gruppe, som giver en ionladning ved fysiologiske pH-værdier. Således er den DK 170780 B1 11 7-heteroatom-substituerede gruppe fri for amin, carboxylbase eller andre basiske eller eddikesyregrupper, hvis pKa-værdi-er er således, at molekylet har en ionladning ved fysiologiske pH-værdier.

5 Carbonhydrider og carbonhydridgrupper kan bredt stil les op i aliphatiske og aromatiske grupper. Anvendelige aliphatiske grupper omfatter henholdsvis (i) mættet alkan (alkylgrupper) og (ii) mono-umættede alkener og alkyner (alkenyl- og alkynylgrupper). Cycliske ligekædede og forgrenede 10 grupper foreligger for hver enkelt type aliphatisk gruppe. Anvendelige aromatiske grupper er aralkan-grupper, som indeholder en aromatisk ring bundet til en aliphatisk gruppe. Hver af disse carbonhydridgrupper er endvidere substituerede med et heteroatom (ikke-carbon eller hydrogenatom) i de her 15 omhandlede R1-grupper.

R^—grupper har en længde, som er længere end ethyl-gruppen og kortere end decylgruppen. Når R^—gruppen er en heteroatom-substitueret alkylgruppe, kan som før omtalt disse alkylgrupper betegnes som heteroatom-substituerede lavere 20 alkylgrupper. De heteroatom-substituerede C2-Cg-alkylgrupper omfatter adskillige elementer fra den klasse, som heri omtales som "lavere alkyl"-grupper, der er anvendelige i heteroatom-substituerede alkylgrupper, som det omtales nedenfor.

Det er således passende på dette sted at omtale lavere alkyl-25 grupper.

Grupper og radikaler, der omtales heri som "lavere", betegner, at de indeholder fra 1 til ca. 6 carbonatomer og fortrinsvis fra 1 til ca. 3 carbonatomer. Denne definition gælder for anvendelsen af ordet "lavere", som det anvendes 30 i alle R1-, R2-, R3- og R4-grupperne.

Lavere alkylgrupper omfatter eksempelvis methyl, ethyl, propyl, iso-propyl, n-butyl, sec-butyl, t-butyl, n-pentyl, 3-methyl-2-butyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, neo-pentyl, n-hexyl, 1-methylpentyl, 3-methylpentyl, 1-ethyl-35 butyl, 2-ethylbutyl, 2-hexyl og 3-hexyl. Gruppen af heteroatom-substituerede C2-C8-alkylgrupper i R1 omfatter passende DK 170780 B1 12 heteroatom-substituerede methylgrupper fra gruppen lavere alkylgrupper og omfatter endvidere heteroatom-substituerede heptyl-, octyl- og nonylgrupper samt yderligere grupper såsom en heteroatom-substitueret 2-methylheptylgruppe, som 5 er heteroatom-substituerede alkyl-substituerede lavere alkylgrupper. Eftersom de især foretrukne R^-grupper har en længde, der er længere end ethyl og kortere end ca. heptyl, omfatter mange foretrukne lavere alkylgrupper for R1 passende heteroatom-substitueret methyl, samt substitueret propyl, 10 butyl, pentyl, 1-methylbutyl og 2-methylbutyl.

Substituerede alkyl-R^—grupper omfatter halogen-substitueret C2-Cg-alkyl, hydroxy- og polyhydroxy-C2-C6-alkyl, C2-Cg-alkylen-lavere alkylcarboxylat, di-lavere alkylethere (lavere alkoxy-lavere alkyl) og lavere alkoxy-C1-C7-alkylcar-15 bonylgrupper, usubstituerede samt mono- og di-lavere alkyl-lavere alkoxycarbaxomidogrupper, hvori carboxamidgruppedelen af gruppen har formlen CONR5R6. Disse R^-grupper omtales nedenfor.

Hydroxy-C2-Cg-alkylgrupper omfatter eksempelvis 2-20 hydroxyethyl, 2-hydroxypropyl, 3-hydroxypropyl, 3-hydroxy- 2-butyl, 3-hydroxy-2,2-dimethylpropyl og 6-hydroxyhexyl.

En anden gruppe substituerede alkyl-R1-grupper er undergrupper af hydroxy-C2-Cg-alkylgrupper, dvs. fra C3-C6-grupper, som indeholder en hydroxygruppe med en afstand på 25 2 carbonatomer fra en yderligere substituent, som er valgt blandt azido-, ether- og thioethergrupper, hvori ether- og thioethergrupper indeholder op til ca. 3 carbonatomer. Denne undergruppe kan betragtes som reaktionsproduktet mellem et epoxid og et nucleophil. Hydroxygruppen, dannet udfra epoxi-30 det og nucleophilet, er især fortrinsvis bundet til en kæde med 3 carbonatomer, såsom den, der fås ved reaktionen mellem epichlorhydrin eller epibromhydrin med en passende guanosin, efterfulgt af omsætningen af det fremkomne epoxid med nucleo-philen.

35 Polyhydroxy-C3~Cg_alkylgrupper omfatter f.eks. 2,3-di- hydroxypropyl, 3,4-dihydroxybutyl og sorbityl. Fagfolk for- DK 170780 B1 13 står, at de omfattede polyoler højst indeholder en hydroxyl-gruppe på hvert af de lavere alkylgruppers carbonatomer.

Ha logen-substituerede C2-Cg-alkylgrupper omfatter fortrinsvis et eller flere chlor-, brom-, fluor- eller ioda-5 tomer, bundet til en C2-C8-alkylgruppe. Som typiske eksempler på halogensubstituerede grupper tjener eksempelvis 2-chlorethyl, 2,2,2-trifluorethyl, 2-brombutyl, 2-chlorhexyl, 2,3-dichloroctyl, perhalogensubstitueret carbonhydrid.

Lavere alkylcarboxygrupper omfatter de ovennævnte 10 lavere alkylgrupper, som endvidere omfatter en carboxygruppe (-CO2H) som en substituent. Således opfattes en 7-CH2CO2H-gruppe som en carboxy-substitueret methy1gruppe. Lavere alkylcarboxygrupper anses ikke selv for at være R^-substitu-enter, idet de giver en ionladning til guaninderivatet ved 15 fystiologiske pH-værdier. Imidlertid omfattes ester- og amidderivater af lavere alkylcarboxygrupper af opfindelsen.

Lavere alkoxy-lavere alkylcarbonylgrupper kan betragtes som estere af lavere alkylcarboxygrupper med lavere alkylalkoholer såsom methyl-, ethyl-, iso-propyl- og t-butyl-20 og neo-pentylalkoholer. Som typiske eksempler på lavere alkylcarboxygrupper tjener eksempelvis carboxymethyl, 2- carboxyethyl, 2-carboxyhexyl. Som typiske eksempler på lavere alkoxy-lavere alkylcarbonylgrupper tjener eksempelvis carbe-thoxymethyl (ligeledes kendt som carboethoxymethyl), 3-iso-25 propoxycarbonylpropyl, 4-hexyloxycarbonylpentyl.

Usubstituerede, mono- og di-lavere alkyl-substitueret amino-lavere alkylcarbonylgrupper (lavere alkylcarboxamid, hvori carboxamidgruppedelen af gruppen har formlen CONR5R6) kan betragtes som værende dannet ud fra en 7-substituent 30 lavere alkylcarboxygruppe og ammoniak, samt henholdsvis monolavere alkyl eller C2-C3-alkanolamin eller di-lavere alkyl eller di-C2-C3-alkanolamin, idet de lavere alkylgrupper er som ovenfor beskrevet, og C2-C3-alkanoldelene er 2-hydroxy-ethyl, 3-hydroxypropyl eller 2-hydroxypropyl. Som typiske 35 eksempler på sådanne aminer tjener eksempelvis methylamin, propylamin, sec-butylamin, hexylamin, dimethylamin, methy le- DK 170780 B1 14 thylamin, butylhexylamin, 2-hydroxyethylamin (ethanolaxnin) , 2-hydroxypropylamin (isopropanolamin), diethyanolamin, diis-propanolamin, methylethanolamin og 3-propanolamin. Amider af cycliske sekundære aminer med 5 eller 6 atomer i ringen 5 kan betragtes som værende dannet ud fra en lavere alkylcar-boxygruppe og en cyclisk sekundær amin, såsom pyrrolidin, roorpholin, piperidin, pyrrol eller 4-methylpiperazin.

Carboxamidgruppedelen af en lavere carboxamidgruppe, såsom de, der er omtalt ovenfor, har formlen C0NR5R6, idet 10 r5 og R6 er ens eller forskellige og er valgt blandt hydrogen, lavere hydrogen og C2“C3-alkanol. Alternativt kan NR5R6 sammen danne en heterocyclisk ring med 5 eller 6 atomer i ringen. Således kan disse 7-substituenter beskrives som lavere alkylcarboxamidgrupper, hvis carboxamidgruppedel 15 har formlen CONR5R6.

En C2_Cg-alkylen lavere alkylcarboxylatgruppe kan betragtes som en ester af en substituent hydroxy-C2-C6-alkyl-eller polyhydroxy-C3-C6-alkylgruppe og en lavere alkylcarbo-xylsyre. Typiske eksempler på hydroxy-C2“C6-substituenter 20 er omtalt ovenfor. Lavere alkanoyl (lavere acyl)-dele af lavere alkylcarboxylsyrer, der kan være til stede i sådanne estere, omfatter eksempelvis formyl, acetyl, propionyl, 2-methylpropionyl, butyryl og 3-methylvaleryl. R2 og R3 omfatter lavere alkanoyloxygrupper, dannet ved forestring af en 25 2'- og/eller 31-hydroxylgruppe og en lavere alkylcarboxylsy re, såsom de ovenfor nævnte. De her omhandlede R4-grupper omfatter lavere alkanoylgrupper, der på lignende måde dannet ved forestring af en 5'-hydroxylgruppe.

Som en heteroatom-substitueret 7-carbonhydridsubsti-30 tuent omfattes også en C2“Cg-alkylen lavere alkylcarboxamid-gruppe. En sådan gruppe kan betragtes som et amid, dannet ud fra en primær eller sekundær aminosubstitueret C2-C6-alkyl-gruppe og en lavere alkylcarboxylsyre. Opfindelsen angår ikke primære og sekundære aminosubstituerede C2~C6-alkylgrup-35 per (samt på lignende måde substituerede tertiære aminer) i sig selv, idet deres aminogrupper giver guaninderivatet en DK 170780 B1 15 ionladning ved fysiologiske pH-værdier. Anvendelige lavere alkylcarboxylsyrer til stede i sådanne amider er dem der er omtalt ovenfor. Som typiske eksempler på primære og sekundære aminsubstituerede C2“C6-alkylgrupper tjener 2-aminoethyl-, 5 2-aminopropyl-, 2-(isopropyl)-aminoethyl-(3-aza-4-methylpen-tyl)-grupper.

Det er bemærket, at en ester eller et amid som beskrevet i de ovennævnte afsnit teoretisk kan have en længde, der er større end decylgruppen. Som tidligere bemærket har 10 en R1 -gruppe imidlertid en længde, som er kortere end decyl-gruppens. Således er en ester dannet ud fra et alkylcarboxy-lat med 6 carbonatomer og en lavere alkylalkohol med 6 C-atomer imidlertid udelukket, idet den er længere end en decylgruppe. Det bemærkes ligeledes, at foretrukne R^—grupper 15 har en længde, som er kortere end heptylgruppens, og at man foretrækker de ovennævnte estere og amider.

Endnu en anden gruppe substituerede 7-carbonhydridsub-stituenter er di-lavere alkylethergrupper, som kan betegnes som lavere alkoxy-lavere alkylgrupper. Sådanne di-lavere 20 alkylethere kan betragtes som værende alkylgrupper, hvori en eller flere methylengrupper (-CH2-) er substitueret med et oxygenatom (-0-) . Som typiske eksempler på anvendelige ether-grupper tjener eksempelvis methoxymethyl, methoxyethyl, ethoxyethyl og ethoxy-2-propylgrupper.

25 Den ovennævnte omtale omhandler 7-substituenter, som er heteroatom-substituerede ligekædede og forgrenede alkyl (aliphatiske)-grupper. Forbindelserne ifølge opfindelsen omfatter ligeledes substituerede cycloaliphatiske forbindelser, ethylenisk umættede aliphatiske og aralkylgrupper.

30 Hver af disse grupper kan være heteroatom-substituerede, som det er omtalt for de ligekædede og forgrenede alkylgrupper.

Eksempelvis kan man anvende heteroatom-substituerede cycliske aliphatiske grupper, såsom cyclopentancarboxylsyre 35 eller cyclobutancarboxylsyre, til dannelse af en ester eller amid henholdsvis med en tidligere nævnt 7-substitueret lavere DK 170780 B1 16 alkylalkohol eller amin. Det samme er tilfældet for ethyle-nisk umættede cycliske carboxylsyrer, såsom 2-cyclopenten- 1-eddikesyre. På lignende måde kan man anvende en cyclisk alkohol, såsom cyclohexanol eller 2-cyclohexen-l-ol, cyclo-5 propylcarbinol, eller en cyclisk amin, såsom cyclobutylamin eller cyclohexylamin, til dannelse af henholdsvis en ester eller amid med en ovenfor omtalt 7-alkylcarboxygruppe, såsom en carboxymethylgruppe. Ethylenisk umættede alkoholer og carboxylsyrer, såsom 3-butyn-l-ol, og 3,3-dimethylacryl-10 syrer kan ligeledes anvendes til fremstilling af estere og amider som ovenfor omtalt.

Især omhandlede R^grupper er substituerede aralkyl-grupper. Typiske eksempler på aralkylgrupper omfatter benzyl-og phenethylgrupper, og disse grupper er substituerede på 15 deres phenylringe med en eller to, fortrinsvis en, hetero-atom-substituent, valgt blandt nitro, cyano, carboxamid (-CONR5R6, idet R5 og R6 er som ovenfor beskrevet), halogen, lavere alkoxy, lavere alkoxycarbonyl, hydroxyl og lavere alkanoyloxy grupper. Det skal gentages, at kravet for den 20 samlede længde af R1-gruppen opretholdes.

Substituenter på en benzylgruppe, som er elektrontiltrækkende grupper i forhold til hydrogen ved hjælp af resonans eller induktiv virkning, som omtalt i Hine, Physical Organic Chemistry, 2. udg., McGraw-Hill Book Co., New York, 25 s. 85-93 (1962), såsom cyano, nitro og halogen, foretrækkes.

En 4-nitrobenzylgruppe er en især foretrukken gruppe, ligesom 7-(nitrobenzyl)-8-oxoguanosin er et især foretrukket guaninderivat ifølge opfindelsen.

Blandt de ovennævnte heteroatom-substituerede carbon-30 hydridgrupper foretrækkes substituerede ligekædede alkyl-og benzyl-carbonhydridgrupper med en længde, der er længere end ethyl og kortere end heptyl. Blandt den foretrukne gruppe halogen-substitueret alkyl, lavere alkoxy-lavere alkylcarbo-nyl, lavere alkylcarboxamid, hvori carboxamiddelen har form-35 len CONR5R6, lavere alkoxy-lavere alkyl og benzyl, hvis phenylring er substitueret med en elektrontiltrækkende gruppe DK 170780 B1 17 i forhold til hydrogen, især foretrukne grupper.

R2- og R3-grupper kan være ens eller forskellige og er valgt blandt hydrogen, hydroxyl, lavere alkoxy, lavere alkanoloxy og benzoxy. R2 og R3 kan sammen ligeledes danne 5 en 2 ',3'-cyclisk lavere alkylidendioxygruppe. Typiske eksempler på R2- og R3-grupper er omtalt nedenfor.

Lavere alkoxygrupper er lavere alkylgrupper, bundet til guaninsukker-(ribose)-ringen gennem et oxygenatom i sukkeret. Som typiske eksempler på lavere alkoxygrupper 10 tjener eksempelvis methoxy, ethoxy, isopropoxy, butoxy og hexyloxy. Lavere alkanoyloxygrupper er ethere, dannet mellem en guaninsukkerringhydroxylgruppe og en lavere alkylcarbo-xylsyre. Eksempler på a lkanoyloxy grupper omfatter eksempelvis formoxy, acetoxy, propionoxy og hexanoyloxy.

15 Lavere alkylacetat- og ketalderivater af 2'- og 3'- hydroxylgrupperne omtales som 2',3'-cycliske lavere alkyli-dendioxy- eller mere forenklet som lavere alkylidendioxy-grupper. Disse grupper dannes ved omsætning mellem et aldehyd, såsom formaldehyd, acetaldehyd eller lignende, eller 20 en keton, såsom acetone eller methylethylketon, med 2'- og 3'-hydroxygrupper af en substitueret guanosinribosylgruppe.

Man foretrækker, at R2 og R3 er hydroxyl, lavere alkanoyloxy eller benzoxy, især hydroxyl eller acetoxy. Når R2 og R3 er lavere alkanoyloxy eller benzoxy, kan disse grup-25 per tabes under eller snart efter leukocyt-kontakttrinnet i en fremgangsmåde ifølge opfindelsen, og der kan således tilvejebringes en "pro drug"-form af guanosinderivatet.

Især er R2 og R3 hydroxyl.

R4 er en gruppe valgt blandt hydrogen, lavere alka-30 noyl og benzoyl. R4 er især hydrogen. Når R4 er lavere alka-noyl eller benzoyl, menes det ligeledes, at den carboxylhol-dige gruppe kan spaltes som ovenfor beskrevet, hvorved man atter får et "pro drug".

En anvendelig guanosin er i det væsentlige fri for 35 ionladning ved fysiologiske pH-værdier, dvs. ved pH-værdier fra 7,0 til ca. 7,5, med undtagelse af de ionladninger, der DK 170780 B1 18 kan fås ved det relativt sure nitrogenatom i 1-stillingen i ringen. Således er et anvendeligt molekyle frit for syre-og baseholdige grupper, som ikke er til stede i guanosin. Dette fravær af sure og basiske grupper strækker sig fra R1-5 gruppen og gennem hele guanosinmolekylet.

Guaninerne er syrer og kan som sådanne danne baseadditionssalte. Sådanne salte er anvendelige til tilvejebringelse af opbevaringsstabilitet og giver ikke en yderligere ionladning til et guaninderivat, anvendt ved en fremgangsmåde 10 ifølge opfindelsen, på grund af den puffervirkning, der fås ved værtens blod og lymfesystemer eller pufferen i et dyrkningsmedium.

Farmaceutisk acceptable, ugiftige baseadditionssalte af guaninderivater er anvendelige heri og kan dannes ved 15 behandling af det immunreaktions-forøgende middel med en passende base i et egnet opløsningsmiddel, såsom vand eller en lavere alkylalkohol, såsom methanol eller ethanol. Som typiske eksempler på uorganiske baser tjener natriumhydroxid, kaliumhydroxid og ammoniumhydroxid. Som typiske eksempler 20 på organiske baser tjener tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-(TRIS) og 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsyre (HEPES). Omvendt kan baseadditionssaltformen omdannes til den fri guanosinform ved behandling med syre.

De substituerede guaninnucleosidderivater, der er 25 anvendelige ved opfindelsen, fremstilles let ved fremgangsmåder, der er offentliggjorte i den kemiske litteratur, eller ved fremgangsmåder analoge dertil. Der er angivet adskillige typiske eksempler på synteser nedenfor i afsnittet materialer og fremgangsmåder. Synteser af 7,8-disubstitue-30 rede guaninnucleosidderivater begynder typisk med den 9-1'-/3-aldoglycosidbinding, der er allerede er dannet, skønt den indledningsvise dannelse af denne binding ikke er påkrævet.

III. Præparaterne 35 Et præparat ifølge opfindelsen omfatter en fortynd ende mængde af en fysiologisk acceptabel bærer (ligeledes DK 170780 B1 19 omtalt heri som en vehikel eller fortyndingsmiddel), blandet med en immunforstærkende (immunreaktionsfremmende eller immunstimulerende) virkningsfuld mængde af et substitueret guaninnucleosidderivat eller salt ifølge opfindelsen be-5 skrevet ovenfor.

Et præparat til in vivo indgift er typisk til oral eller parenteral indgift i gængse enhedsdosispræparater. Udtrykket "enhedsdosis" og de grammatiske ækvivalenter heraf, som disse er anvendt, henviser til fysisk adskilte enheder, 10 egnede som enhedsdoser til humane patienter og andre pattedyr, idet hver enhed indeholder en på forhånd bestemt virkningsfuld mængde af den aktive guanosiningrediens, beregnet til at fremkalde den ønskede terapeutiske virkning sammen med den krævede fysiologisk acceptable bærer, eksempel et 15 fortyndingsmiddel eller en vehikel. Specifikationer for de særlige enhedsdosisformer ifølge opfindelsen er dikterede af og er direkte afhængige af (a) de enestående egenskaber af den aktive guanos inder ivat ingrediens og den særlige terapeutiske virkning, der skal opnås, og (b) de begrænsning-20 er, der naturligt følger af formuleringen af sådan en aktiv ingrediens til terapeutisk anvendelse in vitro samt in vivo i mennesker og andre dyr.

Eksempler på egnede enhedsdosisformer i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse er tabletter, kapsler, 25 piller, pakker med pulver, granulater, oblater og lignende, adskilte mangefold af hvilke som helst af de ovennævnte, samt flydende opløsninger, emulsioner og suspensioner. Flydende præparater kan indgives på sædvanlig måde, såsom sub-cutant, intraperitonealt, intramuskulært og peroralt.

30 Mængden af aktiv ingrediens, der skal indgives in vivo som en virkningsfuld immunostimulerende mængde, afhænger af patientens alder og vægt, den bestemte tilstand, der skal behandles, hyppigheden af indgiften og indgiftsvejen. Den samlede daglige dosis kan variere fra ca. 0,01 til 35 ca. 200 mg pr. kg legemsvægt, fortrinsvis fra ca. 0,1 til ca.

25 mg pr. kg legemsvægt og især fra ca. 1 til ca. 15 mg pr.

DK 170780 B1 20 1 g legemsvægt. Voksendosis for mennesker ligger i et interval fra ca. 5 til ca. 1400 mg pr. dag, indgivet enten som en enkeltdosis eller i 3 eller 4 opdelte doser. Veterinærdoser svarer til doser for mennesker, idet de indgivne mængder 5 står i forhold til dyrets vægt og metaboliske hastighed sammenlignet med voksne mennesker.

Det forstås af fagfolk, at anvendelige in vivo koncentrationer kan variere fra dyreart til dyreart. Fagfolk ved ligeledes, hvordan passende koncentrationer let kan bestem-10 mes.

Koncentrationer for in vitro kontakt af dyreceller ligger fra ca. 1x10“® molær til ca. 3x10“* molær for cellekoncentrationer på ca. 106-107 celle pr. ml. Fortrinsvis er koncentrationen fra ca. lxlO"5 molær til ca. lxlO-4 molær.

15 Som det fremgår nedenfor kan top ("peak”)-koncentrationen, dvs. den koncentration, der giver den største adjuvansvirk-ning, for en given guanosin variere 10 eller flere gange, når den undersøges i muse- og humane lymphocytiske systemer.

Et præparat kan være fast eller i væskeform. Fysiolo-20 giske acceptable bærere er velkendte. Som typiske eksempler på flydende bærere tjener sterile vandige opløsninger, der ikke indeholder nogle materialer ud over det aktive guanosin-derivat og vand, eller indeholder en puffer, såsom natrium-phosphat, ved fysiologiske pH-værdier, fysiologisk saltvand 25 eller begge dele, såsom phosphatpufferetsaltvand. Endvidere kan vandige bærere indeholde mere end et puffersalt, samt salte, såsom natrium- og kaliumchlorider, dextrose og andre opløsningsstoffer. Eksempler på de sidstnævnte bærere er f.eks. Ringer's Injection, Dextrose Injection, Dextrose and 30 Sodium Chloride Injection og Lactated Ringer's Injection.

Flydende præparater kan ligeledes indeholde flydende faser foruden og til udelukkelse af vand. Som typiske eksempler på sådanne yderligere faser tjener glycerol, vegetabilske olier, såsom bomuldsfrøolie, sesamolie og vand-olieemul-35 sioner.

Typiske eksempler på faste bærere omfatter de materia- DK 170780 B1 21 ler, der sædvandligvis kan anvendes til fremstilling af piller eller tabletter, og omfatter eksempelvis majsstivelse, lactose, dicalciumphosphat, fortykkelsmidler, såsom tragant-gummi og methylcellulose USP, findelt Si02, polyvinylpyrro-5 lidon, magnesiumstearat. Desuden kan de faste bærere omfatte bionedbrydelige og ikke-bionedbrydelige polymere, polypeptid-bærere, affinitetsbærere, såsom AFFI-GEL 601 (phenylboronat-harpiks, tilgængelig fra BIO-RAD laboratories, Richmond, Califonia, USA), liposomer og syntetiske polymere, som det 10 er kendt. Antioxidanter, såsom methylparaben og propylparaben, kan være til stede i både faste og flydende præparater, og det samme kan sødestoffer, såsom rørsukker eller roesukker, natriumsaccharin, natriumcyclamat og det dipeptidiske asparagin-phenylalaninmethylestersødestof, som sælges under 15 varemærket "NUTRASWEET" (aspartam) af G.D. Searie Co.

IV Metoder til immunostimulation.

Opfindelsen angår ligeledes en fremgangsmåde til forøgelse af immunreaktionen af leukocyter. Fortrinsvis er 20 immunresponen en antigen-specifik reaktion. Ifølge denne fremgangsmåde bringes leukocyter, såsom lymphocytpræparater, B-celler, T-celler, neutrofiler og macrophager hver for sig eller i forening i et vandigt medium i kontakt in vitro med et ovenfor beskrevet præparat indeholdende en immunostimule-25 rende virkningsfuld mængde af et ovenfor beskrevet guaninnu-cleos idderivat.

Fremgangsmåden udøves in vitro i cellekulturer, såsom i hybridoma-kultur til produktion af monoclonale antistoffer.

Leukocyterne kontaktes i et vandigt medium uden hensyn 30 til, om guanos inder ivatpræparat et selv er et fast stof eller en væske, eller om væsken i præparatet er vandig. Ved fremgangsmåden suppleres det vandige medium i det mindste delvis med det anvendte dyrkningsmedium.

Kontakten mellem præparatet og leukocyterne oprethol-35 des i en tidsperiode, der er tilstrækkelig til, at de kontaktede celler kan vise forøgelsen af immunreaktionen deraf.

DK 170780 B1 22

Denne immunostimulation kan i sig selv udtrykkes ved celledeling, forøget antistofudskillelse, forøget T-hjælpeaktivi-tet, forøget cytokinproduktion fra T-celler og macrophager, enzymudskillelse fra neutrofiler og lignende.

5 De specifikke resultater, der er omtalt nedenfor, belyser en ikke-specifik mitogen reaktion af muse-milt-celler samt de foretrukne antigen-specifikke reaktioner af muse-B-celler og humane perifere blodlymphocyter, fattige på T-sup-pressorceller. Yderligere belysende antigen-specifikke immu-10 noforøgelser, der kan opnåes, omfatter deling af T-celler, in vitro rekonstitutionen af den primære immunreaktion i museimmunsvækkede B-celler og T-celle-erstattende aktivitet i muse-B-celler.

Kontakt in vitro kan opretholdes i en tidsperiode, 15 der er tilstrækkelig til, at en af de ovenfor beskrevne immunostimulationer kan ytre sig, som bestemt ved standarda-nalysefremgangsmåder. Sådanne henstandstider varer typisk fra ca. 1 til ca. 7 dage og sædvanligvis fra ca. 2 til ca.

6 dage.

20 V. Resultater.

Der er opnået specifikke resultater ved anvendelse af forbindelserne, præparaterne og fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og man har ofte sammenlignet disse resultater 25 med lignende resultater, der fås ved anvendelse af forbindelser, præparater og fremgangsmåder kendt fra US patentskrift 4.643.992. Nogle af de forbindelser, der anvendes i US patentskrift 4.643.992, anvendes til sammenligningsformål heri. Disse forbindelser er 8-mercaptoguanosin, 7-methyl-8-oxogua-30 nosin og 8-bromguanosin, og de forkortes heri til henholdsvis 8MGuo, 7m8oGuo og 8BrGuo.

Det nedenfor omtalte resultater fås ved anvendelse af en eller flere forbindelser ifølge opfindelsen, medmindre andet er angivet, i et præparat ifølge opfindelsen, der 35 anvendes ved en fremgangsmåde ifølge opfindelsen. For kortheds skyld og for at forenkle beskrivelsen omtales kun for- DK 170780 B1 23 bindeiserne nedenfor, idet det forstås, at sådanne forbindelser anvendes i præparater og ved fremgangsmåder ifølge opfindelsen.

Hver af de hidtil ukendte forbindelser, hvis aktivitet 5 omtales eller sammenlignes heri, har ligeledes fået et 5-cifret nummer til identifikation. Disse tal er angivet i titlen på det eksempel, som beskriver fremstilling af forbindelsen. Det 5-cifrede tal og/eller eksempelnummeret anvendes i tabellerne og diskussionen, der følger efter, til 10 identifikation af disse forbindelser.

A. Aktivitet af 8-substituerede guanosiner.

Som ovenfor bemærket undersøges adjuvansvirkningen og mitogeniteten af en række 8-substituerede guanosiner, som 15 ikke er ifølge opfindelsen, med thioethere af forskellige længder. Resultaterne af disse undersøgelser er vist i tabel I og II, idet vandrette linier henover hele tabellen adskiller undersøgelserne fra hinanden.

DK 170780 B1 24

Tabel I

Antigen-specifik adjuvansvirkning af 8-thioetherquanosiner1_ 5

Koncen- Direkte anti-SRBC PFC/kultur4

Forbindelse2 tration3 CBA/CaJ C5BL/6J

22359 10"4 123±21 10 (8) 3xl0“4 157±7 2620±100 10“3 653±52 3110±350 22435 10"4 247±38 (7) 3xl0”4 582±52 913±1110 15 10-3 607±57 12.0801470 8MGUO 10“4 8131129 3X10-4 527125 11.0001140 20 Kontrol Intet nucleosid 75110 486170

Antigen til stede 22300 10-4 4201105 (6) 3xl0”4 870170 25 10-3 4901133 8MGUO 10"4 8131129 3xl0-4 7821123 30 Kontrol Intet nucleosid 814

Intet antigen

Kontrol Intet nucleosid 307161

Antigen til stede DK 170780 B1 25 1 Adjuvansvirkninger mod røde blodlegemer fra får (SRBC), målt i direkte plague-dannede kulturer pr. cellekultur af lymphocyter fra musestammen er vist. Detaljer ved fremgangsmåden er angivet nedenfor. Standardafvigelser fra 5 de angivne middelværdier er angivet ved "± tal".

2 Nucleosideme er identificerede ved deres 5-cifrede tal, og nummeret på det eksempel, hvori deres fremstilling er vist, er angivet i parentes.

3 Koncentration af nucleosideme, udtrykt i mol pr.

10 liter i det vandige medium, hvori lymphocyterne kontaktes.

4 Der anvendes lymphocyter fra de indavlede muselinier CBA/CaJ eller C57BL6/J.

Tabel II Mitogenitet af 15 8-thioetherquanosiner1 [3H]TdR-optagel-

Forbindelse2 Koncentration3 se (cpm/kultur) 20 22359 10“4 1600±90 (8) 3xl0"4 1300±80 10“3 17001280 22435 10-4 45001120 25 (7) 3xl0-4 88001200 10”3 11.2001202 8MGUO 10“3 41.1001390 30 Kontrol Intet nucleosid 2100160 22300 10"4 27001130 (6) 3X10“4 4100170 10”3 16.40011130 35 8MGUO 10“3 25200+950

Kontrol Intet nucleosid 2400190 DK 170780 B1 26 1 Mitogenitet målt ved optagelse af [3H]TdR (tritium-mærket thymidin-deoxyribonucleosid) under anvendelse af de betingelser, der er omtalt nedenfor, bestemt ved måling af antal signaler pr. minut (cpm) pr. cellekultur. Standardaf-5 vigeiserne er vist som i tabel I.

2,3 jVf. noterne 2 og 3 i tabel I.

De ovennævnte resultater belyser, at aktiviteten af det 8-substituerede guanosin derivat øger i forhold til 10 8MGuo, hvis 8-svovlatom er bundet til et hydrogenatom, med stigende substituentlængde. Således er den antigenspecifikke adjuvansvirkning af 8-(2-butenyl)-derivatet (22435) større end adjuvansvirkningen af det længere 8-cinnamylderivat (22359), men mindre end adjuvansvirkningen for 8-mercaptofor-15 bindeisen (8MGuo). 8-Allylderivatet (22300) har ca. sammen adjuvansvirkning som 8-MGuo for de viste koncentrationer. Resultaterne for mitogenicitet for de samme forbindelser viser en enog mere udtalt tendens i aktiviteterne med voksende 8-substituenter, hvilket giver stadigt dårligere resulta-20 ter.

B. Adjuvansvirkning og mitogenicitet behøver ikke at være forbundne.

Forbindelserne, præparaterne og fremgangsmåden ifølge 25 opfindelsen er anvendelige ved en forøgelse af mitogene og polyclonale reaktioner og adjuvansvirkningen, ligesom forbindelserne, hvis aktiviteter er belyst i tabellerne I og II. De mitogene og adjuvante egenskaber af de foreliggende forbindelser menes at fremkomme fra mindst 2 forskellige 30 baner, hvorved mitogenese og en polyclonal reaktion ofte falder sammen, med adjuvansvirkning ofte adskiller sig derfra, jvf. eksempelvis Goodman et al., J.Exp.Med., 147:800 (1978) og Mclntire et al., J.Immunol., 117:674 (1976). Nogle lignende forskele omtales i US patentskrift 4.643.992.

35 Denne afkobling af aktiviteterne er ligeledes vist for nogle af de heri omtalte forbindelser, hvilket fremgår DK 170780 B1 27 af resultaterne i tabellerne III og IV.

Tabel III

Antigen-specifik adjuvansvirkning af nogle 5 7-heteroatom-substituerede carbonhydrid-8- oxoguanosiner i det humane system1_

Forbindelse2 Koncentration3 PFC/kultur 10 22935 3x10“® 175133 (2) 10“4 36131717 3xl0”4 13.01312613 22943 3x10”® 83112 15 (4) 10“4 5814 3xl0“4 222154

Kontrol Intet nucleosid 011

Intet antigen 20

Kontrol Intet nucleosid 150115

Antigen til stede 3 Undersøgelserne udføres på en måde, der ligner 25 den, der anvendes i tabel I med den undtagelse, at der anvendes en human lymphocyt præparation.

2·3 Jvf. noterne 2 og 3 i tabel I.

Tabel IV

30 Mitogenitet af nogle 7-heteroatom-substituerede 8-oxoquanosiner i det humane system1_ [3H]TdR cptagel- 35 Forbindelse2 Koncentration3 se fcmp/kultur) 22935 3x10“® 5.9751449 (2) 10”4 38.5051655 3xl0”4 60.2171272 10”3 70.9441453 DK 170780 B1 28

Tabel IV - fortsat [3H]TdR optagel-

Forbindelse2 Koncentration3 se (cmp/kultur) 5 22943 3xl0"5 1.077+40 (4) 10"4 1.814±71 3xl0”4 15.714±856 10“3 77.100±799 10

Kontrol Intet nucleosid 1508±125 1» 2, 3 jVf. noterne 1, 2 og 3 i tabel II.

15 De ovennævnte resultater belyser, at 7-(3-dimethylami- no)propyl-8-oxoguanosin (22943) er mitogent i et murint system (tabel IV) , sammenlignet med 7-carbethoxymethyl-8-oxoguanosin (22935). Imidlertid viser den aminholdige forbindelse (22943) en aktivitet, der er omtrent den samme som 20 den, den vises af en af kontrolforbindelserne (intet nucleosid + antigen), når disse samme forbindelser undersøges for adjuvansvirkning ved anvendelse af humane lymphocyter (tabel III) .

De ovennævnte resultater bekræfter yderligere, at 25 mitogenitet og adjuvansvirkning ikke nødvendigvis er forblindet og kan forløbe ad forskellige baner. Disse resultater viser ligeledes manglen på adjuvansvirkning, der viser sig hos forbindelser indeholdende ellers nyttige funktiorelle elementer, eksempelvis guanosinringen, en 8-oxogruppe og en 30 7-heteroatom-substitueret carbonhydridgruppe, som er længere end ethyl, men kortere end decyl, men som har en ionladning ved fysiologisk pH-værdier, hvilket her skyldes dimethylami-nogruppen.

Det bemærkes endvidere, at skønt man in vitro i muse-35 systemet kan påvise mitogenitet og adjuvansvirkning, har man kun iagtaget adjuvansvirkning in vitro i det humane system ved anvendelse af en hvilken som helst af de her omtalte DK 170780 B1 29 forbindelser.

C. Adjuvansvirkningsundersøgelserne.

Man har udført et antal sammenligninger af adjuvansvirkning til SRBC ved anvendelse af humane og murine lympho-5 cyter som leukocytkilden ved anvendelse af forbindelser ifølge opfindelsen samt hidtil ukendte forbindelser, der er udelukket fra den foreliggende opfindelse. Uheldigvis er disse resultater, pga. forskellene i lymphocytreaktioner selv fra indavlede mus, for ikke at tale om den udavlede 10 humane population, særdeles vanskelige at sammenligne nøjagtigt med hindanden. Snarere kan de indenfor en given undersøgelse bedst sammenlignes med de forbindelser, der anvendes i undersøgelsen, og med de kontrolforbindelser, der foreligger for hver enkelt undersøgelse. I tabellerne V og VI er 15 der tilvejebragt typiske data fra sådanne undersøgelser, hvori man kun viser aktiviteten ved "top"-koncentrationen for hver enkelt forbindelse. Hver undersøgelse er adskilt fra de andre ved en vandret linie henover tabellen.

20 Tabel V

Adjuvansvirkningsundersøg-elser i det murine system1 "Top"-koncen- Direkte anti- 25 Forbindelse2 tration3_ SRBC PFC/kultur 22935 10“4 23711179 (2) 30 22943 3xl0“4 22831104 (4) 23090 10-5 40+3 (5) 35

Kontrol Intet nucleosid 3319

Intet antigen DK 170780 B1 30

Tabel V - fortsat MTop"-koncen- Direkte anti-

Forbindelse2 tration3_ SRBC PFC/kultur 5 Kontrol Intet nucleosid 20±3

Antigen tilstede 24599 3xl0-5 2521±191 (18) 10 8BrGUO 10“3 2450+325

Kontrol Intet nucleosid 12±2

Intet antigen 15

Kontrol Intet nucleosid 45±10

Antigen til stede 7m8oGuo 3xl0“5 1809139 20 24670 10“4 19451191 (12)

Kontrol Intet nucleosid 5313 25 Intet antigen

Kontrol Intet nucleosid 282146

Antigen til stede 30 24455 10”4 230176 (I4)

Kontrol Intet nucleosid 2015

Intet antigen 35

Kontrol Intet nucleosid 203125

Antigen til stede DK 170780 B1 31

Tabel V - fortsat "Top"-koncen- Direkte anti-

Forbindelse2 tration3_ SRBC PFC/kultur 5 - 24331 3xl0"4 215±5 (10) 24364 3xl0“5 50±13 10 (11)

Kontrol Intet nucleosid 8±3

Intet antigen 15 Kontrol Intet nucleosid 55±8

Antigen til stede 24292 10“4 2491 (13) 20

Kontrol Intet nucleosid 50

Intet antigen

Kontrol Intet nucleosid 161 25 Antigen til stede 23880 10”4 735±56a (15) 10“4 6408±464b 30 Kontrol Intet nucleosid 17±7a

Intet antigen 458±13b

Kontrol Intet nucleosid 357±12a

Antigen til stede 1960±120b 35 - 23756 10"4 2376±212 (16) DK 170780 B1 32

Tabel V - fortsat •'Top"-koncen- Direkte anti-

Forbindelse2 tration3_ SRBC PFC/kultur 5

Kontrol Intet nucleosid 165±40

Intet antigen

Kontrol Intet nucleosid 305±65 10 Antigen til stede 23642 3xl0"4 1103±123 (3) 15 Kontrol Intet nucleosid 72±12

Intet antigen

Kontrol Intet nucleosid 293±22

Antigen til stede 20 - 2 Jvf. noterne 1 og 2 i tabel I.

3 Den koncentration, der giver det største antal plaque'er pr. kultur i en given undersøgelse, er den værdi, der er angivet.

25 a' b Der udføres 2 undersøgelser ("a" og "b"), idet resultaterne for undersøgelserne "a" og "b" er mærket således.

Resultaterne i den ovennævnte tabel illustrerer ad-30 skillelige punkter. For det første er forbindelserne ifølge opfindelsen generelt mere aktive end de forbindelser, der er kendte fra US patentskrift 4.643.992. Denne forøgelse af aktiviteten viser sig enten i en koncentration, ved hvilken "top"-adjuvansvirkningen iagttages ("top"-koncentration) som 35 værende fra ca. 0,5 til 1 log enheder (titalslogaritmen) lavere, eller en adjuvansvirkning i en given "top"-koncentration, som er signifikant højere, sædvanligvis ca. 100 % DK 170780 B1 33 højere, end den, der vises for en forbindelse ifølge ovennævnte patentskrift. Den forøgede adjuvansvirkning kan eksempelvis ses, når man sammenligner 8BrGuo med 7-(2-chl orethyl) -8-oxoguanosin (24599), hvori begge forbindelser har samme 5 antal plague'er pr. kultur, men 2-chlorethylderivatet har denne værdi ved en koncentration, der er 1,5 log-enheder (ca. 30 gange) lavere.

De ovennævnte data for 7m8oGuo og 7-(2-hydroxy-3-azido)propylderivatet (24670) synes at indeholde mindst 2 10 unormale ting. "Toppen" for 7m8oGuo fremkommer ved en usædvanlig lav koncentration, og PFC/kultur-værdien synes at være noget forøget i forhold til sædvanligvis observerende værdier. PFC/kultur-værdien for forbindelsen 24670 synes også at være noget lav.

15 Resultaterne i tabel V belyser ligeledes de uacceptab le resultater, der fås med ellers hidtil ukendte og ikke indlysende forbindelser, der udelukket fra denne opfindelse.

Som typiske eksempler på forbindelser, der er udelukket, findes 7-[2-(1-piperidino)ethyl]-8-oxoguanosin (23090), 7-20 [3-(3,4-dimethoxyphenylamino)2-hydroxy]propyl-8-oxoguanosin (24364), 7-[3-(dimethylamino)propyl]-8-guanosin (22943) og 7- carboxymethyl-8-guanosin (23642), som giver en ionladning til molekylet ved fysiologiske pH-værdier.

Det bemærkes, at de sidstnævnte 2 forbindelser (22943 25 og 23642) giver tilsyneladende høje antal plaque'er i det murine system. Imidlertid fås disse relativt høje antal plaque'er ved koncentrationer (3xl0-4 molær), som er relativt for høje til at være anvendelige, og det skyldes sandsynligvis ikke-ioniserede dele af disse molekyler, som ligeledes 30 er til stede ved ligevægt. Desuden ses det ud fra data i tabel VI, at forbindelse 22943 er i det væsentlige inaktiv ved den samme relativt høje koncentration i det humane system.

Opmærksomheden skal ligeledes henledes til resulta-35 terne for 7-[3-(4-fluorphenyl)piperazinyl-2-hydroxypropyl]- 8- oxoguanosin (24455) samt for forbindelse 24364, der er DK 170780 B1 34 omtalt ovenfor. Hver af disse 2 forbindelser viser sig at være i det væsentlige inaktiv ved de koncentrationer, der anvendes i undersøgelsen. Hver forbindelse indeholder ligeledes en 7-heteroatom-substitueret-carbonhydrid substituent 5 gruppe, som er længere end en decylgruppe. Disse 2 forbindelser indeholder ligeledes amingrupper, som ville give ionladning ved fysiologiske pH-værdier. 7-[2-Hydroxy-3-(phenyl-thio)propyl]-8-oxoguanosin (24331), hvis 7-heteroatom-substi-tuent er lidt længere end octyl, har en relativt ringe akti-10 vitet.

Resultaterne vist i tabel VI fås på lignende måde som resultaterne i tabel V ved anvendelse af humane lymphocy-ter snarere end leukocyter fra mus.

15 Tabel VI

Adj uvansvirkningsundersøg-elser i det humane system1

Direkte anti- 20 Forbindelse2 Topkoncentration3 SRBC PFC/kultur 22935 3xl0“4 13.013+2613 (2) 25 22943 3xl0“4 222±54 (4)

Kontrol Intet nucleosid 0±0

Intet antigen 30

Kontrol Intet nucleosid 150±15

Antigen til stede 23756 10"4 25.083+546 35 (16) 23890 10~4 15.583±435 (17) DK 170780 B1 35

Kontrol Intet nucleosid 2+2

Intet antigen 5 Kontrol Intet nucleosid 398±52

Antigen til stede 7m8oGUO 3xl0”4 5775±214a 10“3 830±67b 10 10"3 12251175°

Kontrol Intet nucleosid 12±4a

Intet antigen - b _ c 15

Kontrol Intet nucleosid 652±86a

Antigen til stede 82±9b 1431175° 20 1; 2, 3 jvf. noterne 1, 2 og 3 i tabel V.

a/ b/ c Eksempelvis resultater de 3 undersøgelser under anvendelse af 7m8oGuo med lymphocyt præparationer fra 3 forsøgspersoner med betegnelsen a, b og c. Sammenligninger af forbindelserne foretages derfor indefor en given 25 lymphocytpræparationen. De resultater, der er mærket "a", skal sammenlignes med sig selv, og det samme gælder for de resultater, der er mærket "b" og "c".

Resultaterne i tabel VI viser atter den forøgede 30 effektivitet af forbindelser ifølge opfindelsen, sammenlignet indirekte med 7-methyl-8-oxoguanosin i humansystemet. Disse resultater viser atter, at en forbindelse, der giver en ionladning ved fysiologiske pH-værdier, eksempelvis 7— (3— dimethylamino)propyl-8-oxoguanosin (22943), er i det væsent-35 lige inaktiv, sammenlignet med de andre forbindelser ifølge opfindelsen.

DK 170780 B1 36

Den indirekte, men store forøgelse af adjuvansvirk-ningen af forbindelser ifølge opfindelsen [22935, 23756 og 23890] i forhold til 7m8oGuo i det humane system, både med hensyn til størrelsen af reaktionen og den mindskede dosis, 5 der kræves til at fremkalde denne reaktion, belyser yderligere effektiviteten ved anvendelse af 7-heteroatom-sub-stituerede carbonhydridsubstituenter, hvis substituentlængde er længere end ethyl, men kortere end decyl.

Endnu en anden uventet egenskab ved de mere foretruk-10 ne forbindelser, dvs., hvor R1 er længere end ethyl og kortere end decyl, og hvor ribosylgruppen er usubstituerede, er, at dosis-reaktionkurven er bredere nærved "top"-koncentra-tionen end en lignende kurve, der fås fra 7m8oGuo. Denne udvidede reaktion ses ikke fra enkelt-værditabellerne oven-15 for.

Et mål for den relative bredde kan fås ved at opsummere det gennemsnitlige antal plaque'er (PFC/kultur), der findes ved en koncentration, der ligger en halv logaritmisk enhed fra den koncentration, der fremkalder "top"-værdien, 20 og ved en PFC/kultur ved denne "top"-koncentration. Den således opnåede sum deles derefter med 2 (antalet af opsumme-rede værdier), hvorved man får den gennemsnitlige ΐ: log plaque-værdi.

Nærmere bestemt udvælges individuelle gennemsnitlige 25 plaque-værdier, og baggrundsværdien, hvor SRBC alene er til stede, trækkes fra hver værdi forud for, dens opsummering, hvorved man får "netto"-værdier. Hver nettoværdi deles med antallet af mikromol nucleosid, til stede i 1 ml kultur (molær koncentration divideret med 10"3), hvorved man får 30 PFC/kultur/mikromol. De 2 højeste således tilvejebragte værdier, som omfatter "peak"-koncentrationværdien og en tilskødende ½ log enhedsværdi, udvælges, opsummeres og deles med 2, hvorved man får den gennemsnitlige ½ log værdi pr. mikromol.

35 Når beregninger, såsom de ovenstående, udføres for de ellers ikke sammenhørende undersøgelser i tabel VI, viser DK 170780 B1 37 det sig, at de gennemsnitlige h log-værdier pr. mikromol for forbindelserne ifølge opfindelsen er meget højere end værdien for 7m8oGuo. Således beregnede værdier er vist i tabel VII. Man får lignende resultater i det murine system.

5

Tabel VII

Gennemsnitlig ½ log plaque-10 værdier1 i det humane system

Forbindelse2 Værdi 7m8oGuo 21.604a 787b 15 1.300c 23756 158.108 (16) 20 23890 85.818 (17) 22935 38.753 (2) 25 - 1 Værdierne er opnået som beskrevet ovenfor ved anvendelse af data, som ligger til grund for de resultater, der er vist i tabel VI.

2 Jvf. note 2 i tabel I.

30 a» b/ c Jvf. tabel VI.

Skønt resultaterne, vist i tabel VII, ikke er direkte anvendelige, eftersom de fås ud fra særskilte undersøgelser, er forskellene i beregnede værdien så store, at de menes at 35 være signifikante.

En dosisreaktionskurve kan være for smal og tillader derved ikke en passende dosering af en bestemt recipient. Eksempelvis illustrerer data for det humansystem, vist i DK 170780 B1 38 tabel VI, forskelle på så meget som en faktor fra 3 til 10 (½ til 1 logaritmisk enhed) i "top"-koncentrationen af de forbindelser, der undersøges, når man sammenligner lymphocyt-præparationer fra forskellige forsøgspersoner. Hvis dosis-5 reaktionskurven er for smal, kunne en svag dosis, sædvanlig for recipienter, almindeligvis være for høj eller for lav for en bestemt recipient. Således får derved de udvidede dosisreakt ionkurver for de foretrukne forbindelser en yderligere fordel, sammenlignet med 7m8oGuo.

10 D. T-celle-erstattende aktivitet.

En forbindelse ifølge opfindelsen kan anvendes til at erstatte T-celler i antistofreaktionen til et T-afhængigt antigen. Her dyrkes murine B-celler, dannet in vitro ved 15 behandling med monoclonal anti-thy 1.2 plus komplement, med eller uden SRBC som antigen i nærvær af forbindelser indeholdende stigende koncentrationer er et 7-heteroatom-substitue-ret carbonhydridsubstituent-guanosin-derivat.

Under disse betingelser reagerer isolerede B-cellekul-20 turer dårligt på antigen, medmindre de suppleres med et guanosinderivat ifølge opfindelsen. Den guanosin-modulerede reaktion er dosisafhængig samt antigen-afhængig. Således fås der ved kontakt af B-celler in vitro med et præparat ifølge opfindelsen et T-celle-lignende signal til disse 25 kontaktede celler.

E. In vitro rekonstitution af den primære humorale immun-respon.

CBA/N-mus har en x-chromosom bundet (x-bundet) primært 30 B-cel le immundefekt, og der fås derfor en murinmodel for kønsbundet immundefekt. CBA/N-stammen menes at være svækket i den funktionelle aktivitet af en subpopulation af modne B-lymphocyter med Lyb 3/5/7 antigenerne, Jvf. Huber et al., J.

Exp. Hed., 145:1 (1977); Ahmed et al., J. Exp. Med., 145:101 35 (1977); og Subbaro, J. Immunol., 122:2279 (1979).

Kulture af miltceller fra homozygotiske CBA/N-han- DK 170780 B1 39 og hunmus og hanmus, der er heterozygotiske i CBA/N-genet, der benævnes som xid-genet, (hanmus har x-chromosomet) fremstilles som beskrevet nedenfor. 0,1 ml af en 0,1 volumenprocent SRBC-suspension alene eller SRBC-suspensionen plus 5 trinvis stigende mængder af en guanosin ifølge opfindelsen sættes til kulturerne ved anvendelse af 5xl06 celler/ml. Direkte anti-SRBC-plaque-dannende kulturer pr. kultur vurderes efter 4 dages dyrkning.

Ved anvendelse af en lignende præparation af miltcel-10 ler fra immunokompetente CBA/CaJ-mus viser, at der ved et guanosinderivatkoncentrationsniveau på 0 i det væsentlige ikke er nogen reaktion for CBA/N-cellerne, sammenlignet med en positiv PFC/kultur-reaktion for de immunokompetente CBA/CaJ-celler.

15 Ved koncentrationer fra ca. 10“4 til ca. 10”5 molær guanosinderivat gøres både de immunokompetente CBA/CaJ-celler og oprindeligt immunoinkompetente CBA/N-celler i stand til at producere et signifikant antal PFC/kultur. Således kan man ved at bringe x-bundne immunosvækkede splenocyter i 20 kontakt med et præparat ifølge opfindelsen rekonstituere den primære humorale immunreaktion på SRBC af disse ellers immunsvækkede celler.

Immunsvækkelse hos mus samt andre pattedyr kan fremkomme i alderdommen samt ved genetisk defekt som ovenfor 25 omtalt. Således kan dyr, der var immunokompetente som unge eller voksne, blive immunsvækkede, når de kommer ind i alderdommen. Dette er tilfældet for den indavlede CBA/CaJ-muse-stamme.

En yderligere undersøgelse af rekonstitutionen af en 30 primær humoral antistof reaktion på SRBC udføres ved anvendelse af miltceller fra alderdomssvækkede, 156 uger gamle CBA/CaJ-mus, der er blevet immunsvækkede pga. alderen. In vitro reaktionerne fra disse miltceller på SRBC ved en pla-que-dannelsesanalyse sammenlignes med lignende reaktioner fra 35 celler fra en anden gruppe sunde, voksne 8 uger gamle CBA/CaJ-mus. Denne sammenligning udføres som beskrevet oven- DK 170780 B1 40 for, idet man atter anvender et præparat indeholdende en guanosin ifølge opfindelsen til splenocytkontakt.

PFC-kulturen for de sunde, voksne musekontroldyr indeholdende SRBC, men intet guanosinderivat, er adskillelige 5 gange det antal, der dannes i fravær af både SRBC og guanosin. PFC/kulturen for kontroldyrene for de alderdomssvækkede mus er omtrent den samme for begge kontroldyr og forhøjet i forhold til værdierne for sunde voksne dyr. Disse relativt forhøjede og ens reaktioner menes at skyldes dannelsen af 10 autoantistofproducerende kloner.

Der iagtages en guanosinderivat-dosis-relateret reaktion på SRBC. Denne reaktion iagtages for både de immuno-kompetente sunde splenocyter fra voksne dyr og de tidligere immunosvækkede, men nu primært humoralt reaktions-rekonsti-15 tuerede alderdomssvækkede splenocyter. Sådanne resultater illustrere derved, at man ved at bringe immunosvækkede splenocyter fra aIderdomssvækkede dyr i kontakt med et præparat ifølge opfindelsen kan rekonstituere denne svækkede immunreaktion.

20 F. In vivo antistofreaktioner.

CBA/CaJ-mus immuniseres intraperitonealt (i.p.) ved anvendelse af et konjugat (TNP-BSA), fremstillet ved omsætning af 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre (TNBS) og bovinserum-25 albumin (BSA) i en 0,28 molær cacodylat puffer ved pH-værdi 6,9. Hvert dyr får en intraperitoneal injektion indeholdende 50 Mg immuniserende konjugat. En gruppe mus får derefter (indenfor forløbet af ca. 30 minutter) yderligere en i.p. injektion, der indeholder et guanos inder ivat ifølge opfindel-30 sen i enten 100% sesamfrøolie eller en vandig sammensætning indeholdende 2 volumenprocent sesamolie lydbehandlet med saltvand. Ethvert dyr får 0,2 ml af guanos inder ivatet fra præparaterne, idet koncentrationen af guanosinderivat i hver enkelt er 5 mg/ml. En tredje gruppe mus får immunise-35 ringen, men ikke noget præparat ifølge opfindelsen, og tjener som kontrol her. Anti-TNP-BSA-antistof-udskillelse fra hver DK 170780 B1 41 enkelt gruppe overvåges derefter i en periode på ca. 30 efter anvendelse af den enzymbundne immunosorbentafprøvningsstandardteknik (ELISA) ved anvendelse af TNP-BSA som antigen.

5 Resultaterne af en sådan undersøgelse tyder på, at dyr, der får et guanosinderivat ifølge opfindelsen, viser forøgede anti-TNP-BSA-antistof-titere, sammenlignet med titere fra dyr, som ikke får guanosinderivatet.

Af de følgende eksempler vedrører eksempel 3-9, 11, 10 14 og 20 sammenligningsforbindelser, medens de øvrige eksemp ler vedrører forbindelser ifølge opfindelsen.

VIII. Materialer og fremgangsmåder.

A. Synteser.

15

Eksempel 1: Generel fremgangsmåde til fremstilling af 7- heteroatom-substituerede carbonhydrid-8-oxoguanosiner.

l-amino-8-oxoguanosin (herefter betegnet som forbindelsen A) tjener som udgangsmateriale til adskillige synte-20 ser ved anvendelse af en 2-trinsfremgangsmåde. Dette materiale fremstilles i det væsentlige ved den fremgangsmåde, der er beskrevet i Rizkalla et al., Biochem. Biophys. Acta., 195: 285-293 (1969).

Trin 1: 25 Til en opløsning af 9,5 g (30 mmol) af forbindelsen A i dimethylformamid (DMF) sættes der 33 mmol natriummetho-xid i 250 ml DMF. Reaktionsblandingen omrøres ved omgivelsernes temperatur (fra ca. 18 til ca. 22*C) i ca. 30 minutter.

Der tilsættes 10 ml af en DMF-opløsning indeholdende det 30 alkylerende middel, anvendt til dannelse af 7-substituenten, i et lille overskud i forhold til forbindelsen A (33 mmol vs. 30 mmol), og den fremkomne alkylerende reaktionsblanding omrøres i en tidsperiode på ca. 16 timer ved en temperatur på fra ca. 20 til ca. 40*C.

35 Opløsningsmiddel fjernes herefter i vakuum, og rema nensen behandles med 150 ml destilleret eller afioniseret DK 170780 B1 42 vand og 150 ml methylenchlorid. Det faste stof, der således fås, filtreres og omkrystalliseres fra et passende opløsningsmiddel, hvorved man får l-amino-7-substitueret-8-oxogua-nosin, og derved afsluttes "trin 1" af den sædvanligvis an-5 vendte 2-trinssyntese.

Trin 2:

Produktet fra trin 1 opløses derefter i koncentreret saltsyre (eksempelvis 4,65 mmol i 15 ml saltsyre), hvortil der sættes vandigt natriumnitrit fra opløsning (eksempelvis 10 4,19 mmol i 5 ml vand) ved en temperatur på 0*C, fulgt af omrøring af ca. 1 time. Det fremkomne deaminerede produkt fås derefter ved standardkrystallisation, medmindre andet er angivet.

Fremstillingen af specifikke, typiske eksempler på 15 forbindelser ved anvendelse af den ovennævnte 2-trinsfrem-gangsmåde og andre fremgangsmåder er omtalt nedenfor, hvor det samme gælder andre synteser.

Eksempel 2: 7-Carbethoxymethyl-8-oxoguanosin (22935).

20 Den ovennævnte forbindelse fremstilles ved at følge 2-trinssfremgangsmåden ifølge eksempel 1, hvori man anvender bromacetat som alkyleringsmidlet i trin 1, og forbindelsen fås i et udbytte på 10% udfra den tilsvarende 1-aminofor-bindelse som et hvidt pulver, smp. 167-172“C. NMR (DMSO-d): 25 10,9 (bs, IH); 6,5 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, IH). IR (KBr): 1680, 1620, og 1420 cm"1.

Analyse for C14H19N5O3-I/2 H20:

Beregnet: C: 42,64; H: 5,11; N: 17,76 30 Fundet: C: 42,44; H: 4,71; N: 17,73.

Ved at bytte ethylbromacetat ud med 2-chlorbromacet-amid eller et N-carbonhydrid- eller N-alkanol-substitueret 2-chloracetamid i den ovennævnte omsætning fås den tilsvaren-35 de 7-carboxamidmethyl-8-oxoguanosin (eller tilsvarende substituerede amid, hvis carboxamidgruppe har formlen CONR5R6, DK 170780 B1 43 idet R5 og R6 er som ovenfor beskrevet) . På lignende måde fås der ved ombytning af ethylbromacetat med en egnet haloge-nether såsom 2-bromethylmethylether eller 2-bromethylphenylether (beta-bromphenetol) de tilsvarende henholdsvis 7-metho-5 xyethyl- og -phenoxyethyl-derivater.

Eksempel 3: 7-Carboxymethyl-8-oxoguanosin (23642).

En blanding af 1 g (2,6 mmol, jvf. eksempel 2) 7-carboxymethyl-8-oxoguanosin, 5 ml methanol og 5 ml IN NaOH 10 omrøres ved stuetemperatur under N2 i 4 timer. Det meste af methanolen fjernes i vakuum, og remanensen opvarmes med 50 ml vand. Opløsningen gøres sur med 1 N saltsyre ved 0*C til en pH-værdi på 5. Reaktionsproduktet renses ved præparativ revers fase væskechromotografi med høj ydeevne på en C18 15 kolonne (HPLC), hvorved man får ovennævnte forbindelse som et hvidt pulver i et udbytte på 31%, smp. over 230*C. (DMSO-d6): i 10,9 (bs, IH); 6,5 (bs, 2H) 5,6 (d, J=5Hz, IH); 4,4 (bs, 2H). IR (KBr): 1640, 1600 og 1460 cm-1.

20 Analyse for C^HisNsOe:

Beregnet: C: 40,34; H: 4,23; N: 19,60 Fundet: C: 35,71; H: 3,52; N: 17,37.

Eksempel 4: 7-[3-(Dimethylamino)propyl]-8-oxoguanosin · 25 monohydrochlorid · dihydrat (22943).

Idet man følger 2-trins-proceduren i eksempel 1, hvori der anvendes 3-N,N-dimethylaminopropylchlorid-hydro-chlorid som alkyleringsmidlet, kaliumcarbonat som basen, og det deaminerende produkt behandles med et ækvivalent 30 saltsyre i 2-propanol. Den ovennævnte forbindelse fås i et udbytte på 40% udfra 1-aminoforbindelsen som et hvidt pulver, smp. 180’C (nedbrydes). NMR (DMSO-dg): 6 2,7 (s,6H); 5,57 (d, J=5Hz, IH); 6,91 (bs, 2H); 10,70 (bs, IH); 11,31 (bs, IH). IR (KBr): 1670, 1625 og 1590 cm-1.

Analyse for (^5^4^05-^1-2^0: 35 DK 170780 B1 44

Beregnet: C: 39,43; H: 6,40; N: 18,40

Fundet: C: 39,31; H: 6,15; N: 18,07.

Eksempel 5: 7-[2-(Piperidino)ethyl]-8-oxoguanosin · monohy- drochlorid-monohydrat (23090).

5 Idet man følger fremgangsmåden 1 eksempel 4, men anvender 2-piperedinoethylchlorid som alkyleringsmidlet, fås ovennævnte forbindelse i et udbytte på 34% udfra 1-aminofor-bindelsen som et bleggult pulver, smp. 157eC (nedbrydes).

NMR (DMSO-d6) : δ 6,65 (bs, 2H); 9,97 (br, IH); 11,22 (bs, 10 IH). IR (KBr): 1700, 1670, 1620 og 1590 cm"1.

Analyse for Ο^^β^Οβ-ΗΟΙ-^Ο:

Beregnet: C: 43,92; H: 6,29; N: 18,08

Fundet: C: 43,99; H: 6,39; N: 17,93.

15

Eksempel 6: 8-(2-Propenylmercapto)guanosin (22300).

8 g (63,5 mmol) allylbromid sættes til en blanding af 20 g (63,5 mmol) 8-thioxoguanosin (8MGuo) og 10 g (72 mmol) i kaliumcabornat i 300 ml dimethyl formamid, og den 20 fremkomne blanding opvarmes under oprøring ved en temperatur på 45°C i 90 minutter.

Blandingen afkøles herefter til stuetemperatur og hældes i en opløsning af 1,4 1 diethylether og 5 ml eddikesyre. Det fremkomne faste stof filtreres og vaskes med 250 25 ml vand, 200 ml acetone og derefter diethylether og tørres derefter i en ovn ved 60*C, hvorved man får 14,7 g (udbytte 67%) af den ovennævnte thioether som et hvidt pulver, smp.

225°C (nedbrydes). NMR (DMS0-d6): δ 5,70-5,91 (m, 2H); 6,38 (bs, 2H). IR (KBr): 1700, 1640 og 1610 cm"1.

30

Analyse for C^H^NsOsS:

Beregnet: C: 43,93; H: 4,82; N: 19,71 Fundet: C: 44,10; H: 4,82; N: 19,69.

35 Eksempel 7: 8-(2-Butennylmercapto)guanosin (22435)

Idet man følger den ovennævnte fremgangsmåde til DK 170780 B1 45 fremstilling af 8-(2-propenylmercapto)guanosin (eksempel 6), men erstatter allylbromid med 2-butenylchlorid, fås den ovennævnte forbindelse med et udbytte på 48% som et hvidt pulver, smp. 210*C (nedbrydes). NMR (DMSO-dg): δ 6,3 (bs, 5 2H); 5,6 (d, J=5Hz, IH); 1,6 (d, J=6Hz, 3H). IR (KBr): 1690, 1630, 1600, 1510 og 1365 cm”1.

Analyse for C14H19N5O5S:

Beregnet: C: 45,52; H: 5,18; N: 18,96

Fundet: C: 45,38; H: 5,32; N: 18,79.

10

Eksempel 8: 8-(Cinnamylmercapto)guanosin (22359)

Idet man følger fremgangsmåden til fremstilling af 8-(2-propenylmercapto)guanosin (eksempel 6), men erstatter allylbromid med cinnamylbromid, fås den ovennævnte forbindel-15 se i et udbytte på 33% som et off-white pulver, smp. 172“C (nedbrydes). NMR (DMS0-d6) : 5 7,25 (br, 5H) ; 6,7-6,2 (m, 4H); 5,7 (d, J=5HZ, IH). IR (KBr): 1690, 1640 og 1600 cm”1.

Analyse for C19H21N5O5S: 20 Beregnet: C: 52,89; H: 2,91; N: 16,23

Fundet: C: 43,26; H: 4,90; N: 16,08.

Eksempel 9: l-Amino-7-(2,3-epoxypropyl)-8-oxoguanosin.

Idet man følger den almene fremgangsmåde i trin 1 i 25 eksempel 1 og anvender epibromhydrin som alkyleringsmidlet fås den ovennævnte forbindelse som et råprodukt. Der forsøges ingen rensning.

Eksempel 10: 7-[2-Hydroxy-3-(phenylthio)propyl]-8-oxoguano-30 sin-semihydrat (24331).

En blanding af 3 g (5,4 mmol) råprodukt fra eksempel 9 og 5 g (45,4 mmol) thiophenol i 150 ml DMF opvarmes ved en badtemperatur på 80*C i 4 timer. Efter afkøling, fjernelse af det meste af opløsningsmidlet i vakuum, opløsning af 35 remanensen i vand og rensning ved præparativ revers fase HPLC (C-18) fås 1-aminoderivatet af den ovennævnte forbind- DK 170780 B1 46 else som et off-white pulver med et udbytte på 52%, smp. 135-137‘C. NMR (DMS0-d6): δ 7,3 (m, 5H); 7,15 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, IH); 5,35 (s, 2H). IR (KBr): 1700 og 1580 cm-1.

Efter deaminerlngsfremgangsmåden 1 trin 2 i eksempel 5 1 ved anvendelse af det ovenfor fremstillede 1-aminoderivat fremstilles den ovennævnte forbindelse med et udbytte på 45% som et fast brunt stof, smp. 180-182*0. NMR (DMSO-dg): δ 7,3 (bs, 5H); 5,6 (bs, 2H); 5,7 (d, J=5Hz, IH). IR (KBr): 1690, 1635, 1600 og 1100 cm”1.

10

Analyse for C19H23N5O7S-I/2H2O:

Beregnet: C: 48,09; H: 5,10; N: 14,76 Fundet: C: 48,16; H: 5,11; N: 15,04.

15 Eksempel li: 7-[3- (3,4-Dimethyoxyphenethylamino) -2-hydro- xy ] propyl -8 -oxoguanos in · mondhydrochlorid · monohydrat (24364).

l-Amino-7-[3-(3,4-dimethyoxyphenethylamino)-2-hydro-xy]propyl-8-oxoguanosin (29330) fremstilles på en måde, til 20 fremgangsmåde til fremstilling af 1-aminoderivatet i eksempel 10 ved at udskifte thiophenol med 3,4-dimethoxyphenethylamin. Dette 1-aminoderivat fremstilles med et udbytte på 40% som et off-white pulver, smp. 156-158*C. NMR (DMSO-dg): δ 7,0 (bs, 3H) ; 6,9-6,4 (m, 3H) ; 5,3 (s, 2H) ; 3,7 (s, 6H). IR

25 (KBr): 1670, 1615 og 1580 cm-1.

Efter deaminerlngsfremgangsmåden i trin 2 i eksempel 1 (og eksempel 10) under anvendelse af det ovenfor fremstillede 1-aminoderivat fås titelforbindelsen som et lysebrunt pulver med et udbytte på 55%, smp. 163-170*c (nedbrydes).

30 NMR (DMSO-dg): 6 8,9 (br, IH); 6,8 (Μ, 5H); 5,6 (d, J=5Hz, IH); 5,59 og 5,62 (begge s, 3H hver). IR (KBr): 1680, 1640, 1600 og 1030 cm”1.

Analyse for C23H32Ng09-HCl-H20: 35 Beregnet: C: 46,74; H: 5,97; N: 14,22

Fundet: C: 46,85; H: 6,01; N: 14,25.

DK 170780 B1 47

Eksempel 12: 7-(3-Azido-2-hydroxypropyl)-8-oxoguanosin*mono-hydrat (24670).

Idet man følger fremgangsmåden i eksemplerne 10 og 5 11, fremstilles l-amino-7-(3-azido-2-hydroxypropyl)-8-oxogua- nosin (24332) ved at omsætte det rå epoxid fra eksempel 9 med natriumazid. Dette 1-aminoderivat fremstilles med et udbytte på 35% som hvide krystlier, smp. 180-182°C (nedbrydes). NMR (DMSO-d6): δ 7,1 (bs, 2H)7 5,6 (d, J=5Hz, IH). IR 10 (KBr): 2140, 1690 og 1550 cm"1.

Den ovennævnte forbindelse fås efter deaminering fra reaktionsprocedurerne i trin 2 i eksempel 1 (og eksemplerne 10 og 11) ved anvendelse af det 1-aminoderivat, der er beskrevet umiddelbart ovenfor (24332). Den ovennævnte forbind-15 else er et off-white pulver, der fås i et udbytte på 30%, smp. 138-141 ’ C (nedbrydes). NMR (DMSO-dg): δ 6,4 (bs, 2H) ? 5,6 (d, J=5HZ, IH). IR (KBr): 3600-3000, 2110, 1690 og 1660 cm-1.

20 Analyse for C^HigNgC^-^O:

Beregnet: C: 37,50; H: 4,84? N: 26,91 Fundet: C: 38,06? H: 4,79? N: 26,67.

Eksempel 13: 7-(2,3-Dihydroxypropyl) -8-oxoguanosin·monohydrat 25 (24292).

Idet man følger fremgangsmåderne i eksemplerne 10-12, fremstilles l-amino-7- (2,3-Dihydroxypropyl)-8-oxoguanosin (24457) ved at omsætte det rå epoxid i eksempel 9 med vand. Dette 1-aminoderivat fås som et off-white pulver i et udbytte 30 på 55%, smp. 210-212 °C (nedbrydes). NMR (DMSO-d6) : δ 6,9 (bs, 2H) ? 5,55 (d, J=4,5Hz, IH); 5,3 (bs, 2H). IR (KBr): 1700, 1670 og 1600 cm"1.

Titelforbindelsen fås efter deamineringsreaktionspro-cedurerne i trin 2 i eksempel 1 (og eksemplerne 10-12), idet 35 man anvender 1-aminoderivatet beskrevet umiddelbart ovenfor (24457). Den ovennævnte forbindelse fås som et hvidt pulver DK 170780 B1 48 i et samlet udbytte på 35%, smp. 195-196'C. NMR (DMSO-d6): δ 10,7 (bs, IH)7 6,5 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, IH). IR (KBr): 1680, 1640 og 1660 cm"1.

5 Analyse for C13H19N5OQ-H2O:

Beregnet: C: 39,90; H: 5,41; N: 17,90 Fundet: C: 39,67; H: 5,32; N: 17,52.

Eksempel 14: 7-[3-[4-(4-Fluourphenyl)piperazinyl]-2-hydroxy-propyl]-8-oxoguanosin»semihydrat (24455).

10 Titelforbindelsen fremstilles ifølge fremgangsmåderne i eksempel 10-13 ved at omsætte 4-(4-fluourphenyl)piperazin med det rå epoxid i eksempel 9, fulgt af deaminering af det fremkomne 7-heteroatom-substituerede rå carbonhydrid-l-amino-derivat som omtalt i eksempler 10-13. Den ovennævnte forbind-15 else fås som et hvidt pulver i et samlet udbytte på 25%, smp. 178-181’C. NMR (DMSO-d6) : δ 6,8-7,1 (m, 4H); 6,3 (bs, 2H) ; 5,2 (d, J=5Hz, IH). IR (KBr): 1690, 1600 og 1390 cm"1.

Analyse for C23H30FN7O7-I/2H2O: 20 Beregnet: C: 50,73; H: 5,74; N: 18,00 Fundet: C: 50,94; H: 5,76; N: 17,74.

Eksempel 15: 7-[2-(4-Chlorphenyl)-2-oxoethyl]-8-oxoguanosin (23880).

25 Idet man følger 2-trinsfremgangsmåden i eksempel 1, hvori 2-brom-4 1-chloracetophenon anvendes som alkyleringsmid-let, fås den ovennævnte forbindelse i et samlet udbytte på 35% som et lysebrunt pulver, smp. over 230eC. NMR (DMSO-dg): δ 10,7 (bs, IH); 8,1 (d, J=10Hz, IH); 7,7 (d, J=10Hz, 2H); 30 6,5 (bs, 2H) ; 5,6 (d, J=5HZ, IH); 5,3 (S, 2H) . IR (KBr): 1700, 1680 og 1630 cm"1.

Analyse for Ci8H18clN5°7:

Beregnet: C: 47,85; H: 4,02; N: 15,50 35 Fundet: C: 47,32; H: 3,98; N: 15,40.

DK 170780 B1 49

Eksempel 16: 7-(4-Nitrobenzyl)-8-oxoguanosin (23756).

Idet man følger 2-trins-fremgangsmåden i eksempel l og anvender 4-nitrobenzylbromid som alkyleringsmidlet, fås ovennævnte forbindelse i et samlet udbytte på 10% som et 5 gult pulver, smp. over 230eC. NMR (DMS0-d2): δ 10,8 (bs, IH); 8,3 (d, J=10Hz, 2H); 7,5 (d, J=10Hz, 2H)? 6,5 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, IH). IR (KBr): 1680, 1640, 1600 og 1520 cm”1. Analyse for C^HigNgOg-l^^O:

Beregnet: C: 46,11; H: 4,32; N: 18,98 10 Fundet: C: 46,48; H: 4,04; N: 18,72.

Eksempel 17: 7-(4-Methoxybenzyl)-8-oxoguanosin (23890).

Idet man følger 2-trins-fremgangsmåden i eksempel 1 og anvender 4-methoxybenzylchlorid som alkyleringsmidlet, 15 fås ovennævnte forbindelse i et samlet udbytte på 7% som et beige pulver, smp. over 230*0. NMR (DMSO-dg): δ 10,8 (bs, IH); 7,2 (d, J=10Hz, 2H); 6,8 (d, J=10Hz, 2H); 6,4 (bs, 2H); 5,5 (d, J*=5Hz, IH); 3,7 (S, 3H) . IR (KBr): 1670, 1600, 1510, 1450 og 1250 cm"1.

20

Analyse for 0^^27^07-1/2 H20:

Beregnet: C: 50,47; H: 5,18; N: 16,35

Fundet: C: 50,85; H: 5,12; N: 16,20.

25 Eksempel 18: 7-(2-Chlorethyl)-8-oxoguanosin (24599).

Den ovennævnte forbindelse fås ved at følge den generelle 2-trins-fremgangsmåde i eksempel 1, hvori der anvendes chlorethylbromid som alkyleringsmidlet, i et udbytte på 27% som et off-white pulver, smp. 192*C (nedbrydes). NMR (DMSO-30 dg) : δ 9,8 (br, IH); 6,9 (bs, 2H); 5,8 (d, J=5Hz, IH). IR (KBr): 1680 og 1640 cm"1.

Analyse for C12HigClN50g-3/2H20:

Beregnet: C: 37,07; H: 4,93; N: 18,02 35 Fundet: C: 36,65; H: 4,67; N: 18,18.

50 DK 170780 B1

Eksempel 20: 7-(2-Allyl)-8-thioxoguanosin (22444).

Den ovennævnte forbindelse fremstilles ud fra 8-(2-propenylmercapto)guanosin (22300, eksempel 6), idet man anvender en omlejningsprocedure.

5 72 g (354,7 mmol) bistrimethylsilylacetamid sættes til en suspension af 20 g (56,3 mmol) 8-(2-propenylmercapto)-guanos in som udgangsmateriale i 500 ml chloroform, og den fremkomne blanding opvarmes ved tilbagesvaling i 16 timer under N2. Efter afkøling fjernes det meste af opløsningsmid-10 let i vakuum, hvor remansen opvarmes til 40eC under vakuum i 6 timer.

Den olieagtige remanens blandes med 500 ml tetrahydro-furan, 10,3 g (58,3 mmol) palladiumchlorid og 12,1 g (117 mmol) benzonitril, og den fremkomne blanding opvarmes ved 15 tilbagesvaling under N2 i 3 timer. Denne blanding afkøles derefter til stuetemperatur, blandes yderligere med 25 ml pyridin og omrøres natten over (ca. 16 timer). Blandingen filtreres gennem silicagel og vaskes med 2 gange 300 ml methylenchlorid. Det forende filtrat inddampes i vakuum, og 20 remanensen blandes med 500 ml af en blanding af vand, methanol og eddikesyre i forholdet 10:10:1 og omrøres i yderligere en tidsperiode på ca. 16 timer.

Størstedelen af de tilsatte opløsningsmidler fjernes i vakuum, remanensen opløses i dimethylsulfoxid (1 liter) 25 og behandles derefter med trækul. Den således tilvejebragte suspension filtreres gennem et lag celite, og filtratet inddampes i vakuum. Remanensen behandles med methanol, og det fremkomne faste stof filtreres, vaskes med acetone og tørres i en ovn ved 60*C, hvorved man får 8,5 g 7-allyl-8-30 thioxoguanosin (udbytte 42,5 %) som et off-white pulver, smp. over 230°C. NMR (DMSO-d6) : S 5,90 (m IH); 6,32 (d, J=5Hz, IH); 6,56 (bs, 2H); 10,60 (bs, 2H). IR (KBr): 1700, 1635, 1605 og 1450 cm-1.

35 Analyse for C13H17N5O5S:

Beregnet: C: 43,93; H: 4,82; N: 19,71

Fundet: C: 43,96; H: 4,87; N: 19,62.

DK 170780 B1 51

Eksempel 22: Lavere alkylidendioxy-derivater.

Et lavere alkylidendioxy-derivat af en af de ovennævnte forbindelser eksemplificeres ved den følgende syntese af et isopropylidenderivat.

5 En blanding af 17 mmol 7-heteroatom-substitueret- carbonhydrid-8-oxoguanosin, 41 mmol 2,2-dimethoxypropan, 200 ml acetone og 10 dråber koncentreret svovlsyre omrøres under N2 ved stuetemperatur i 52 timer. Blandingen afkøles til 0°C og behandles med 5 ml koncentreret ammoniumhydroxid.

10 Størstedelen af væsken fjernes i vakuum, og det fremkomne faste stof filtreres. Det filtrerede faste stof vaskes med vand, acetone og derefter diethylether, fulgt af tørring i en vakuumovn ved 60*C, hvorved man får det ønskede derivat.

15 Eksempel 23: 7-Heteroatom-substitueret-carbonhydrid-8-oxo- 21,3·-O-isopropyliden-5·-benzoylguanosin.

En blanding indeholdende et isopropylidenderivat som beskrevet i eksempel 22 (3 mmol), 3 ml triethylamin, 3 mmol benzoylchlorid og 100 methylenchlorid omrøres ved stue-20 temperatur i 16 timer. Blandingen hældes derefter i vand, methylenchloridlaget skilles fra, og vandlaget ekstraheres yderligere med 2 gange 150 ml methylenchlorid.

Methylenchloridlagene forenes, tørres over natriumsulfat, og opløsningsmidlet fjernes i vakuum. Remanensen renses 25 ved søjlechromotografi på silicagel.

5'-Acetylderivaterne fremstilles ved at bytte benzoylchlorid ud med eddikesyreanhydrid.

Eksempel 24: 7-Heteroatom-substitueret-carbonhydrid-8-oxo-30 2',3',5'-triacetylguanosin.

Denne fremstilling tjener som eksempel på acylerings-fremgangsmåder for ribosylringen. 10 mg 4-N,N-dimethylamino-pyridin sættes til en blanding af 3 mmol af det 7-heteroatom-substitueret-carbonhydrid-8-oxo-guanosin, 2 ml triethyl-35 amin, 15 mmol eddikesyreanhydrid (man kan anvende lavere acylchlorider eller benzoylchlorid som alternativ) og 50 ml DK 170780 B1 52 methylenchlorid. Den fremkomne reaktionsblanding omrores under N2 i 16 timer ved stuetemperatur.

Der tilsættes herefter yderligere 50 ml methylenchlorid, og opløsningen vaskes med IN saltsyre, saltvand og 5 derefter vand. Opløsningen tørres derefter over natriumsulfid. Opløsningsmidlet fjernes i vakuum, og remanensen renses ved søjlechromotografi på silicagel.

B. Eksempler på præparater til indgift.

10 Eksempler på faste og flydende præparater, egnet til indgift af forbindelserne ifølge opfindelsen, er beskrevet nedenfor, idet 5 af de mere foretrukne guaninnucleosidderiva-ter tjener som eksempler på aktive ingredienser.

15 Tabletter

Tabletter blandes udfra de følgende ingredienser: Væqtdele 7-(2-Chlorethyl)-8-oxoguanosin 2,5 20 Lactose, pulveriseret 36,4

Majsstivelse, tør 34,5

Findelt Si02 5,6

Polyvinylpyrrolidon 0,6 25 Magnesiumstearat 0,4 80,0

Guanosinderivatet blandes omhyggeligt med lactosen, 25 vægtdele af majsstivelsen og 4,0 vægtdele af Si02. Den 30 fremkomne blanding fugtes derefter ensartet med en 5% ethano-lisk opløsning af polyvinylpyrrolidon. Den fugtige masse passeres derefter gennem en sigte med maskeåbning 1 mm, hvorved man får et granulat. Det fremkomne granulat tørres i ca. 24 timer ved 60*C i et tørreskab. Det tørrede granulat 35 passeres atter gennem en 1 mm mesh sigte. 70,0 dele af det tilvejebragte granulat blandes i et passende blandeapparat med en blanding bestående af resten af Si02, resten af majsstivelsen og alt magnesiumstearatet, idet denne blanding på DK 170780 B1 53 på forhånd er ledet gennem 1 mm sigte. Den således tilvejebragte blanding komprimeres derefter til tabletter med en vægt på 800 mg hver og indeholdende 25 mg guanosin. Stivelseskapsler 5 Kapselindhold blandes udfra de følgende bestanddele: Vægtdele 7-(Carbethoxymethyl)-8-oxoguanosin 10,0

Lactose 450,0 10 Majsstivelse 540,0 1000,0

Guanosinderivatet blandes gradvis med lactosen. Når 15 al lactosen er blevet iblandet, blandes den tilvejebragte blanding med majsstivelsen. Det fremkomne blandede materialet fyldes derefter i kapsler, der indeholder 10 g af det blandede materiale. Hver kapsel indeholder 1,0 mg guanosinderivat.

Et parti bestående af 10,000 tabletter, der hver 20 indeholder 50 mg 7-(4-nitrobenzyl)-8-oxoguanosin, fremstilles ud fra de følgende typer og mængder af ingredienser: 7-(4-Nitrobenzyl)-8-oxoguanosin 500 g

Dicalciumphosphat 1000 g 25 Methylcellulose, U.S.P. (15 cps) 75 g

Talkum 150 g

Majsstivelse 250 g

Magnesiumstearat 25 g 30 2000 g

Guanos inder ivatet og dicalciumphosphatet blandes godt, granuleres med 7,5% opløsning af methylcellulose i vand, passeres gennem en sigte med en maskevidde på 2,38 mm (U.S.

35 Standard Sieve Series) og tørres omhyggeligt. Det tørrede granulat passeres gennem en sigte med en maskevide på 1,69 mm, blandes omhyggeligt med talkum, stivelse og magnesiumstearat og slås til tabletter.

DK 170780 B1 54

Ini icerbart præparat

Et sterilt præparat, egnet til subcutan eller intra-cavitær injektion og indeholdende 50 mg 7-carboxamidamethyl-8-oxoguanosin i hver ml af bestanddele fremstilles ud fra de 5 følgende typer og mængder af ingredienser: 7-Carboxamidomethyl-8-oxoguanosin 5 g

Fysiologisk saltvand 98 ml

Sesamolie 2 ml 10

Guanosinderivatet og saltvandet blandes og lydbehandles i en tidsperiode, der er tilstrækkelig lang, til at der fås i det væsentlige homogen dispersion. Sesamolien tilblades derefter, og den fremkomne blanding homogeniseres på lignende 15 måde, hvorved man får en emulsion. Efter emulgering injiceres 5-15% af slutrumfanget af dette sterile præparat subcu-tant eller intraperitonealt en gang om ugen til forøgelse af humoral immunitet.

20 Vandigt præparat til oral anvendelse.

Et vandigt præparat til oral anvendelse indeholdende for hver 5 ml (1 teske) 25 mg 7-(4-methoxybenzyl)-8-oxoguano-sin fremstilles udfra de følgende ingredienser: 25 7-(4-Methoxybenzyl)-8-oxoguanosin 5,0 g

Methylparaben, U.S.P. 0,75 g

Propylparaben, U.S.P. 0,25 g

Natriumsaccarin 1,25 g

Natriumcyclamat 0,25 g 30 Glycerol 300 ml

Tragantpulver 1,0 g

Orangeoliearoma 1,0 g R.D. og C. orange farve 0,75 g

Deioniseret vand, q.s. ad 1000 ml 35 DK 170780 B1 55 C. Metoder.

Lyxnphocytkulturer. Det serumholdige dyrkningsmedium fremstilles til at indeholde det følgende pr. 100 ml: 91,9 ml RPMI 1640 (Flow Laboratories, Inc., Rockville, MD, USA, 5 0,1 ml 100 x glutamin, 1,0 ml 100 x natriumpyruvat, 1,0 ml 50 x nonessentielle aminosyrer, 1,0 ml vand indeholdende 104 penicillin G-enheder og 104 mikrogram streptomycin, og 5,0 ml af en understøttende portion af kalvefosterserum (FCS). Disse ingredienser blandes til tilsyneladende homo-10 genitet. Miltcellesuspensioner og -populationer, berigede på milt-B-celler, fremstilles som beskrevet i Goodmann et al., J. Immunol., 121:1905 (1978).

Til evaluering af den primære humorale reaktion på fåreerythrocyter (SRBC) dyrkes 5xl06 til 107 murine miltcel-15 ler i en 1,0 ml 5% FCS-holdigt medium i 4-5 dage i nærvær af immunogen. Cellerne inkuberes i dyrkningsbakker (Costar, Cambridge, MA, USA), ved 37eC i en fugtig atmosfære med 10% CC>2 i luft under anvendelse af vævskulturæsker (CBS Scientific, Del Mar, CA, USA) , som vippes ved en frekvens på 7 20 cycluser pr. minut. "Pooled" SRBC fås fra Colorado Serum Co., Denver CO, USA.

Humane periphere blodlymphocyter (PBL) fremstilles udfra normalt hepariniseret venøst blod ved Ficoll-diatrizo-at-densitetsgradientcentrifugering. PBL befries for supres-25 sor-T-celler med histamid type 2 receptor ved at klæbe dem til overfladen af histaminkaninserumalbumin-belagte plastpetriskåle (Cell-eet. nr. 2 sæt, Seragen, Boston, MA, USA) og ved at udvinde de celler, der ikke hænger fast, ved udvaskning som beskrevet af Wysocki og Sato, Proc. Natl. Acad.

30 Sci. USA, 75:2844 (1978) og modificeret af Cavagnaro og

Osband, Biotechniques, Januar/Februar:30 (1983).

Vævsdyrkningsmediet, der anvendes i disse undersøgelser, fremstilles som følger: 100 ml indeholder 87,9 ml RPMI 1640 (Flow Laboratories, Rockville, MD), 0,1 ml 100 x gluta-35 min, 1,0 ml 1,0 M HEPES puffer (Microbiological Associates, Bethesada, MD, USA), 1,0 ml vand indeholdende 104 penicillin DK 170780 B1 56 G-enheder og 104 mikrogram streptomycin og 10 ml frisk autolog varmeinaktiveret plasma. Til bedømmelse af den primære humorale immunreaktion på SRBC dyrkes lymphoide celler i en koncentration på 2xl0®/ml i et rumfang på 1 ml indeholdende 5 5x10® SRBC som antigen (Colorado Serum Co., Denver, CO, USA) sammen med IL-2 (et særligt renset præparat af humant IL-2, som ikke har interferon-gamma-aktivitet, fås fra Electro-Nucleonics, Inc., Silver Spring, MD, USA) og guaninnu-cleosidderivatet.

10 Bestemmelse af plaquedannende celler (PFC). PFC, der udskiller antistoffer mod SRBC, bedømmes efter 4 eller 5 dages dyrkning ved anvendelse af en modifikation af den hæmolytiske plaquebestemmelse ifølge Jerne og Nordin, Science, 140:405 (1963). Cellerne dyrkes i fuldstændigt 15 medium før plaquedannelse. De danner plaque'er i standard lav Mr agarose (Bio-Rad Laboratories, Richmond CA, USA) og inkuberes i SRBC-absorberet marsvinekomplement i en time efter 1,5 times inkubering uden komplement.

T-celle-erstattende aktivitet.

20 5x10® levedygtige CBA/CaJ-muse-B-celler dyrkes. Disse celler genereres ved i rækkefølge at behandle miltceller, først med komplement-fikserende monoclonale antistoffer, rettet mod thy 1,2 antigener af T-celler, og derefter med komplement til lyse af hvilke som helst tilstedeværende T-25 celler (New England Nuclear, Boston, MA, USA). De således behandlede celler dyrkes derefter med eller uden 0,1 ml af en 0,1 volumenprocent SRBC som immunogen i serum-holdige medier, der endvidere indeholder trinvis stigende mængder af et guanosinderivat, der i mængde varierer fra 0 til 10“4 30 molær. Direkte PFC i forhold til SRBC bestemmes 4 dage deref ter.

Mus. CAB/CaJ-mus med en alder på 8-16 uger leveres fra Jackson Laboratory, Bar Habor, ME, USA. En avisgruppe af CBA/N-mus fås hos the Animal Production Section, National 35 Institute of Healht, Bethesda, MD, USA. Alle mus fodres med "Wayne Lab Blox F6" pellets (Allied Mills, Inc., Chicago, DK 170780 B1 57 IL, USA) og får chloreret vand, der er gjort surt med HC1 til en pH-værdi på 3,0.

Cellepræparater. Milt- og thymuscellesuspensioner fremstilles som beskrevet i Goodman et al., J. Immunol., 5 121:1905 (1978). B-celleberigede populationer fremstilles ved at behandle 108 miltceller med en fortynding i forholdet 1:1000 af monoelonalt antithy 1,2 antistof (New England Nuclear, Boston, MA, USA) i 30 minutter ved 4°C. Behandlede celler centrifugeres ved 280 g i 10 minutter, antistofferne 10 fjernes, og cellerne suspenderes i en fortynding i forholdet 1:6 af C BA RBC-absorberet marsvinekomplement ved 37'C i 45 minutter. Cellerne vaskes derefter og dyrkes som ovenfor beskrevet.

Injektioner. Musene injiceres i.p. med en opløsning 15 indeholdende 50 mg TNP-BSA. Indenfor forløbet af ca. 30 minutter fra den immuniserende injektion får 2 grupper på hver 6 mus ligeledes 0,2 ml i.p. injektioner af et guanosin ifølge opfindelsen i 100% sesamolie eller 2 volumenprocent sesamolie, lydbehandlet i normalt saltvand, idet guanosinet 20 er til stede i en koncentration på 5 mg/ml. En tredje gruppe på 6 mus får immunisering, men ikke noget guanosinderivat. Anti-TNP-BSA-antistoftitere bestemmes derefter ved anvendelse af standardfremgangsmåder.

Claims (12)

1. Substituerede guaninnucleosidderivater, kendetegnet ved, at de har formlen , OR1 5 li I “χχ>· HH, N I r'cCHjV'O^ HTfn

2. Substituerede guaninnucleosidderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R^-gruppen har en længde, som er mindre end ca. længden af en heptylgruppe.

3. Substituerede guaninnucleosidderivater ifølge krav 2, kendetegnet ved, at R^—gruppen er valgt blandt halogensubstitueret alkyl, lavere alkoxy-lavere alkylcarbo-nyl, lavere alkylcarboxamid, hvori carboxamiddelen har formlen CONR5R6, idet R5 og R6 er ens eller forskellige og er 30 valgt blandt hydrogen, lavere alkyl og C2-C3-alkanol, eller NR5R6 sammen danner en heterocyclisk ring roed 5 eller 6 atomer i ringen, lavere alkoxy-lavere alkyl og benzyl, hvis phenylring er substitueret med en gruppe, som er elektrontiltrækkende i forhold til hydrogen.

4. Substituerede guaninnucleosidderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R1 er valgt blandt 2-chlor- DK 170780 B1 ethyl, 4-nitrobenzyl, 4-methoxybenzyl, methoxyethyl, carbe-thoxymethyl og carboxamidomethyl.

5 R4 er hydrogen.

5. Substituerede guaninnucleosidderivater ifølge krav 4, kendetegnet ved, at R2 og R3 er hydroxyl, og

6. Substitueret guanosinnucleosidderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er valgt blandt 7-carbethoxymethyl-8-oxoguanosin; 7-(4-nitrobenzyl) -8-oxo-guanosin? 7-(4-methoxybenzyl)-8-oxoguanosin; 7-(2-chlor- 10 ethyl)-8-oxoguanosin; 7-carbamoylmethyl-8-oxoguanosin; 7-(2,3 - d i hydroxypropy1)-8-oxoguanos in og 7-methoxyethy1 - 8 -oxoguanosin.

7. Immunreaktionsforstærkende præparater, kendetegnet ved, at de omfatter en fortyndende mængde af 15 en fysiologisk acceptabel bærer, blandet med en immunfor-stærkende virkende mængde af et immunreaktions-forøgende substitueret guaninnucleosidderivat ifølge krav 1.

8. Præparater ifølge krav 7, kendetegnet ved, at R2 og R3 er hydroxyl, og R4 er hydrogen.

9. Fremgangsmåde til at forøge en immunreaktion, kendetegnet ved, at leukocyter i et vandigt dyrkningsmedium bringes i kontakt in vitro med et præparat indeholdende en fortyndende mængde af en fysiologisk acceptabel bærer blandet med en immunforstærkende mængde af et substi- 25 tueret guaninnucleosidderivat ifølge krav 1.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at de leukocyter, der kontaktes, omfatter B-cel- ler.

10 R»l2 hvori R1 er en heteroatom-substitueret carbonhydridgruppe, som har en længde, der er større end længden af en ethyl-gruppe og mindre end længden af en decylgruppe, og som ikke 15 har ionisk ladning ved physiologiske pH-værdier, R2 og R3 er ens eller forskellige grupper, valgt blandt hydroxyl, lavere alkoxy, lavere alkanoyloxy og benzoxygrupper, eller R2 og R3 udgør tilsammen en lavere alkylidendioxygruppe, og R4 er valgt blandt hydrogen, lavere alkanoyl- og benzoyl-20 grupper, og de farmaceutisk acceptable, ugiftige baseadditionssalte deraf.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendete g- 30 net ved, at immunreaktionen er en antigen-specifik reaktion.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at leukocyterne er valgt blandt humane B-celler, T-celler og neutrofiler. 35