DK170779B1 - Substituerede guaninnucleosidderivater, immunreaktionsforstærkende præparater deraf, fremgangsmåde til forstærkning af en immunreaktion, anvendelse af derivaterne til fremstilling af et farmaceutisk præparat og fremgangsmåde til fremstilling af substituerede guaninnucleosidderivater - Google Patents

Description

i DK 170779 B1

Den foreliggende opfindelse angår substituerede guaninnucleosidderivater, immunreaktionsforstærkende præparater deraf, fremgangsmåde til forstærkning af en immunreaktion, anvendelse af derivaterne til fremstilling af et farma-5 ceutisk præparat og fremgangsmåde til fremstilling af substituerede guaninnucleosidderivater.

Et dyrs immunsystem omfatter talrige elementer, der virker hver for sig og/eller sammen for at modvirke, eliminere eller neutralisere stoffer, der genkendes af dette 10 system som fremmed for værtsdyret. Generelt men ikke nødvendigvis er det stof, der genkendes som fremmed af immunsystemet, af exogen oprindelse i forhold til værten. Eksempler på sådanne exogene stoffer er infektiøse bakterier og biprodukterne fra deres celleaktivitet, viruspartikler og deres 15 proteiner, proteiner injiceret med insektbrodde og lignende.

Ved autoimmunsygdomme, såsom rheumatoid arthritis, genkender værtens immunsystem værtsproducerede proteiner eller selvproducerede proteiner som fremmede.

De væsentligste effektorer i immunsystemet er leuko-20 cyterne, som omfatter lymphocyter hidrørende fra thymus (T-celler), lymphocyter produceret i knoglemarv (B-celler), neutrophiler, der bl.a. producerer enzymer, som igen producerer oxidationsmidler, såsom hydrogenperoxid, der har cytotoksiske virkninger på bakterier, og makrophager, der præsen-25 terer det fremmede stof eller antigen for T-cellerne, samt producerer et protein betegnet interleukin-1, der medvirker ved T-celletransformation til T-hjælperceller. Komplement, som er en kompleks blanding af proteiner, der virker på en fastlagt, kaskadeagtig måde på det fremmede stof, spiller 30 også en vigtig rolle i immunreaktioner.

B-celler kan skelnes fra T-celler bl.a. ved tilstedeværelsen af immungiobuliner på deres membranoverflader. De membranbundne immungi obul iner fungerer som antigenreceptorer, medens afsondrede immungiobuliner fungerer som antistoffer.

35 Der foreligger fem kendte klasser af immunglobuliner, identificeret som IgA, IgD, IgE, IgG og IgM på basis af fem DK 170779 B1 2 antigent forskellige tunge proteinkæder, som delvis udgør immunglobulinmolekylet. B-celler bærer desuden ikke-immunglo-bulin-cellemarkører, inklusive en komplement-receptor (CR), en receptor for immungiobulinets Fc-del (FcR), antigener 5 (la) knyttet til I-området samt et sæt differentieringsantigener (Lyb 1-7), som identificeres af alle antisera og er korreleret med forskellige sider af G-celleudvikling og -aktivering. Disse markører er anvendelige ved den phenotypiske identificering af B-celler.

10 Medens B-celleimmunglobulinerne vekselvirker med det fremmede stof eller antigen, antages det, at T-cellerne, og især hjælper-T-cellerne, er nødvendige for at stimulere B-celler, således at der sker en deling og differentiering til antistof-afsondrende celler til humoral immunitet. Sup-15 pressor-T-celler bidrager til reguleringen af humoral immunitet, medens cytotoksiske T-celler og T-cellemediatorer med forsinket hypersensitivitet er de vigtigste effektorer ved cellemedieret immunitet.

T-celler bærer antigener betegnet Lyt 1, 2 og 3 samt 20 L3T4, der har relation til T-cellefunktioner. Hjælper-T-celleprecursorer er af Lyt 1+, 2", 3" og L3T4+ phenotypen.

Det er disse celler, der normalt deltager i aktiveringen og reguleringen af B-celler.

Det er kendt, at hjælper-T-celler assisterer ved 25 aktivering og differentiering af immunglobulinafsondrende B-celler, når disse celler har modtaget en første meddelelse fra det aktiverende antigene stof. Den måde, på hvilken T-cellerne giver B-cellerne den anden aktiverings- og differentieringsmeddelelse, er imidlertid endnu ikke helt klarlagt.

30 Guanosin-3',5'-cyclisk monophosphat (cGMP) har været inddraget som et naturligt forekommende stof til tilvejebringelse af den nødvendige anden meddelelse for B-celleprolife-ration. 8-Bromguanosin-3',5'-cyclisk monophosphat (8-BroGMP) har vist sig at være et svagt syntetisk intracellulært lym-35 phocyt-mitogen.

Immunreaktionen kan modificeres ved kunstig suppres- DK 170779 B1 3 sion (immunsuppression) eller forstærkning (immunpotentiering eller immunstimulering). Isununsuppression, dvs. kunstigt fremkaldt nedsat reaktionsevne, kan opnås på seks generelle måder: (1) blokade med antigen, (2) indgift af specifikke 5 antisera eller antistof, (3) anvendelse af andre biologiske reagenser, såsom antilymphocyt-antisera, (4) anvendelse af medikamenter eller hormoner, (5) bestråling og (6) kirurgisk fjernelse af lymphoidt væv. Immunpotentiering kan omfatte indgift af et stof, som bevirker, at der sker en forøgelse 10 i den hastighed, med hvilken immunreaktionen udvikles, en forøgelse i reaktionens intensitet eller niveau, en forlængelse af reaktionen eller udvikling af en reaktion mod et i øvrigt ikke-immunogent stof.

De stoffer, der er kendt for at forstærke immunreak-15 tioner, betegnes almindeligvis adjuvanser og kan placeres i to generelle klasser: (1) de stoffer, med hvilke der opnås en generel potentiering, dvs. stoffer, der forstærker de cellulære og/eller humorale immunreaktioner for en lang række forskellige antigener og (2) de stoffer, med hvilke 20 der opnås en specifik potentiering, dvs. stoffer, der forstærker specifikke reaktioner udelukkende mod visse antige ner.

Stoffer, der kan virke som klasse 1 adjuvanser, kan grupperes i følgende kategorier: (1) vand-og-olieemulsioner, 25 f.eks. Freund's adjuvans, (2) syntetiske polynucleotider, (3) hormoner, medikamenter og cycliske nucleotider, (4) endotoxiner, (5) proteinholdige lymphokiner og monokiner, f.eks. interleukiner.

En immunpotentieret tilstand kan illustreres ved 30 kroppens tilstand efter vaccination. I dette tilfælde er immunreaktionen allerede forstærket på grund af en antigen reaktion men kunne med fordel forstærkes yderligere, således at der opnås en forbedret immunitetsgrad og/eller -varighed.

Immunpotentiering kan forekomme i dyr, der udviser 35 en normal immunreaktion, såvel som i dyr, der udviser en defekt immunreaktion. I sidstnævnte situation står immun- DK 170779 B1 4 potentier ingen i forhold til værtsdyrets immundefekte status, og frem for at forstærke reaktionen til supernormale niveauer, soger man at opnå en beskyttende grad af immunitet (f.eks. næsten normale niveauer), og dette benævnes en immun-5 rekonstitution. Henvisninger til immunforstærkninger i det følgende omfatter også immunrekonstitution.

Ved nogle sygdomme og fysiologiske tilstande, såsom AIDS, X-forbundne agammaglobulinemier, senescentia og medikamentfremkaldt immunsuppression, mangler der en antigenafhæn-10 gig B-celleaktivering og -differentiering og/eller denne eksisterer kun i reduceret omfang, hvorved værtens humorale immunreaktion mindskes. Disse sygdomme og tilstande er repræsentative for immunsupprimerede tilstande. I dette tilfælde er en forstærket aktivering og differentiering, såfremt en 15 sådan kan gennemføres, tilbøjelig til at give en gavnlig formindskelse af sygdommens udslag og/eller at forbedre patientens tilstand.

I ansøgerens US-patentskrift 4.539.205 er beskrevet modulation af dyrs cellereaktioner med 8-substituerede gua-20 ninderivater bundet 9-1' til en aldose med 5 eller 6 carbon-atomer i aldosekæden (ringen). De i det nævnte patentskrift beskrevne cellulære modulationer angår overvejende immunmodulation, såsom adj uvanticitet, ved forstærkning af primære og sekundære immunreaktioner. Aktivitet mod visse neoplasti-25 ske tilstande er ligeledes beskrevet, hvilket også er tilfældet for T-celleerstattende aktivitet, en IL-l-lignende aktivitet (afprøvet på thymocyter), og inducering af frigørelsen af lysosomale enzymer fra neutrophiler. 8-Substituen-terne i disse molekyler har elektrontiltrækkende induktive 30 virkninger i forhold til hydrogen. Således er halogen, mer-capto eller dets thioxotautomer, acylmercapto, alkylsulfido, nitro, cyano, keto, halogenmethyl og methylenoxyalkyl og lignende beskrevet som værende anvendelige, medens elektronafgivende substituenter, såsom en aminogruppe, har vist sig 35 at være inaktive.

Desuden er der i ansøgerens US patentskrift 4.643.992 DK 170779 B1 5 og den tilsvarende europæiske patentansøgning 83306791.1 yderligere beskrevet en anvendelse af derivater af 8-hydroxy-guanosin (8-oxoguanosin), 7-methyl-8-oxoguanosin og 7-me thyl- 8-thioxoguanosin til modulering af dyrs cellereaktioner.

5 Yderligere resultater under anvendelse af guaninderivater beskrevet i US-patentskrift 4.539.205 er også beskrevet i US-patentskrift 4.643.992 sammen med lignende resultater ved anvendelse af guaninderivater beskrevet for første gang i dette patentskrift.

10 Nogle af ansøgerne og deres medarbejdere har desuden offentliggjort en række artikler vedrørende yderligere virkninger af forbindelser beskrevet i US-patentskrift 4.643.992. Eksempler på sådanne offentliggjorte artikler er Goodman, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 179, 479 (1985), Goodman, J.

15 Immunol., 136, 3335 (1986), Goodman og Weigle i Purine Metabolism In Man, del B, Nyhan og Thompson, udg., Plenum Press,

New York, side 451 og 443 (1986), Goodman og Weigle, J.

Immunol., 135, 3284 (1985), Goodman og Wolfert, Immunol.

Res., 5, 7 (1986), Goodman, J. Immunol., 137, 3753 (1986) 20 og Goodman og Hennen, Cell. Immunol., 102, 395 (1986).

Den foreliggende opfindelse angår substituerede guaninnucleosidderivater, som er ejendommelige ved, at de har formlen 25 * H'CP"‘ NH, N \ •3* 2

30 R3 R

hvor X betyder 0, S eller Se, R1 betyder en ligekædet, cyc-lisk eller forgrenet carbonhydridgruppe med en længde, der er større end længden af en ethylgruppe og mindre end længden af en decylgruppe, R2 og R3 er ens eller forskellige og 35 betyder hydroxyl, lavere alkoxy, lavere alkanoyloxy eller benzoxy, eller R2 og R3 tilsammen betyder en lavere alkyl- DK 170779 B1 6 idendioxygruppe, og R4 betyder hydrogen, lavere alkanoyl eller benzoyl. Foretrukne guanosinderivater ifølge opfindelsen er sådanne, hvor X betyder O eller S, og R1 har en længde, der er større end en ethylgruppe og mindre end en hexyl-5 gruppe. Særligt foretrukne guanosinderivater er 7-ally1-8-thioxoguanosin, 7-allyl-8-oxoguanosin, 7-butyl-8-oxoguanosin, 7-(2-butenyl)-8-oxoguanosin, 7-benzyl-8-oxoguanosin og 7-propyl-8-oxoguanosin. Der foretrækkes især 7-allyl-8-oxo-guanosin. Den foreliggende opfindelse angår desuden farma-10 ceutisk acceptable, ikke-toksiske baseadditionssalte af forbindelserne med formlen (I).

Opfindelsen angår også immunreaktionsforstærkende præparater, der indeholder en fortyndende mængde af en fysiologisk acceptabel bærer blandet med en immunpotentierende 15 effektiv mængde af et immunreaktionsforstærkende substitueret guaninnucleosidderivat ifølge opfindelsen, hvor R^ og X har de i krav 7 angivne betydninger.

Den foreliggende opfindelse angår desuden anvendelsen af guaninnucleosidderivater ifølge opfindelsen til fremstil-20 ling af et farmaceutisk præparat til forstærkning af en immunreaktion, samt en fremgangsmåde til forstærkning af en immunreaktion, især en antigenspecifik immunreaktion, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at leukocyter i et vandigt dyrkningsmedium kontakteres in vitro med et præparat indehol-25 dende en fortyndende mængde fysiologisk acceptabel bærer blandet med en immunpotentierende effektiv mængde af et substitueret guaninnucleosidderivat ifølge opfindelsen. Kontakten mellem præparatet og leukocyter opretholdes i tilstrækkelig lang tid til, at de kontakterede celler udviser 30 en forstærkning af deres immunreaktion. Denne fremgangsmåde udøves in vitro for cellekulturer. De kontakterede leukocyter er fortrinsvis B-lymphocyter.

Den foreliggende opfindelse angår desuden en fremgangsmåde til fremstilling af substituerede guanosinnucleo-35 sidderivater ifølge opfindelsen, hvor X betyder O, S eller Se, og R1 betyder -CH2-CR=CH2, hvor R betyder hydrogen, DK 170779 B1 7 lavere alkyl eller benzyl, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at (a) den tilsvarende forbindelse, som er usub-stitueret i 7-stillingen, og som er substitueret i 8-stillin-gen med -X-CH2-CR=CH2, hvor X og R har ovenstående betydnin-5 ger, opvarmes i et flydende opløsningsmiddel til ca. 50*C til ca. 200*C i tilstrækkelig lang tid til, at der dannes det ønskede omlejrede produkt, som eventuelt isoleres. Reaktionen kan også katalyseres ved at medtage en katalytisk mængde PdCl2 i det flydende medium. Produktet isoleres for-10 trinsvis.

På vedlagte tegning er fig. 1 en graf, der illustrerer den T-celleerstattende aktivitet af et vandigt præparat, der indeholder 7-allyl-8-oxoguanosin (7a8oGuo), der anvendes til kontaktering af 15 CBA/CaJ muse-B-cellekulturer fri for T-celler men indeholdende røde blodlegemer fra får (SRBC) som et specifikt antigen. Punkterne på den fuldt optrukne linie illustrerer pla-quedannelse i nærværelse af trinvis stigende mængder 7a8oGuo med en konstant mængde SRBC i kulturen. Den stiplede linie 20 repræsenterer resultater i fravær af SRBC. Enhederne på ordinaten er det direkte antal anti-SRBC-plaquedannende celler (PFC) gange 10"^ pr. kultur. Abscissen angiver koncentrationen (molaritet, M) af 7a8oGuo i kontaktpræparatet. Yderligere detaljer fremgår af det følgende.

25 Fig. 2 er en graf, der illustrerer in vitro rekonsti- tutionen af den primære humorale immunreaktion mod et specifikt antigen, SRBC, i dyrkede immundefekte CBA/N-musemiltceller (punkterede linie) opnået ved kontaktering af disse celler med et vandigt præparat indeholdende 7a8oGuo yder-30 ligere i nærværelse af SRBC. En lignende undersøgelse under anvendelse af miltceller fra immunkompetente CBA/CaJ-mus (fuldt optrukken linie) er også vist på grafen til sammenligning. Punkterne på begge linier repræsenterer PFC-værdien opnået i nærværelse af den anførte mængde 7a8oGuo plus SRBC.

35 Ordinat og abscisse er som i fig. l. Yderligere detaljer vedrørende denne undersøgelse fremgår af det følgende.

DK 170779 Bl 8

Fig. 3 er bjælkediagram, der illustrerer in vitro rekonstitutionen af den primære humorale immunreaktion mod SRBC i immundefekte alderdomssvækkede (156 uger gamle) CBA/-CaJ-musesplenocyter sammenlignet med splenocyter fra im-5 munkompetente (8 uger gamle) CBA/CaJ-mus opnået ved kontak-tering af disse celler med et vandigt præparat indeholdende 7a8oGuo. Til venstre på figuren er anført alderen i uger på musene, fra hvilke cellerne hidrører, nærvær (+) eller fravær (-) af SRBC og fravær (-) eller Mmolær (μΜ) koncentration 10 af 7a8oGuo. Bjælkelængderne er i samme enheder som ordinaterne på fig. 1 og 2. Yderligere detaljer vedrørende denne undersøgelse fremgår af det følgende.

Fig. 4 viser nogle grafer, der illustrerer in vivo kinetikken ved forstærkede anti-trinitrophenyl-kvægserumalbu-15 min (TNP-BSA) antistofreaktioner fremkaldt ved kontaktering af leukocyter in vivo med et præparat indeholdende 7-allyl- 8-mercaptoguanosin (7a8MGuo). I dette tilfælde foreligger guanosinderivatet (0,2 ml 7a8MGuo i en koncentration på 5 mg/ml) i et bæremedium på 100% sesamolie (fuldt optrukken 20 linie) eller 2% sesamolie i saltvand (punkteret linie), når det indføres i dyret.

Tre grupper CBA/CaJ-mus anvendes ved forsøget. Hver gruppe immuniseres med TNP-BSA-konjugatet. En gruppe modtager 100%'s sesamolie-guanosinderivatet, en anden gruppe 25 modtager 2%'s sesamolie-guanosinderivatet, og den tredie gruppe (stiplet linie) modtager intet guanosinderivat og tjener som kontrol.

Antistoftitere over for TNP-BSA bestemmes over et tidsrum på 37 dage ved anvendelse af gængse enzymimmunanalyse 30 (ELISA) metoder med TNP-BSA som antigen. Dataene er vist som forholdet mellem den titer, der opnås ved anvendelse af et af de guanosinholdige præparater, og kontroltiteren. 37 dage efter immuniseringen udviser dyr, der har modtaget 7a8MGuo fra det bæremedium, der indeholder 100% sesamolie, 35 en titer, der er ca. 5 gange større end titeren for kontroldyrene, medens dyr, der har modtaget 7a8MGuo fra bæremediet, DK 170779 B1 9 der indeholder 2% sesamolie, udviser en titer, der er ca. 4 gange større end titeren for kontroldyrene. Yderligere detaljer vedrørende disse undersøgelser fremgår af det følgende.

Fig. 5 er en graf, der viser struktur/funktionsrela-5 tionen mellem længden af en 7-substituent i en 7-carbon-hydrid-substitueret 8-oxoguanosin og den antigenspecifikke PFC-reaktion af murine lymphocyter mod SRBC in vitro. PFC-værdierne er fra tabel VIII med et lxlO”5 molært guanosinde-rivat. Datapunkterne er for 7m8oGuo, 7-ethylderivatet 10 (23643), 7-allylderivatet (21757), 7-propylderivatet (24069), 7-butylderivatet (23644), 7-(2-butenyl)-derivatet (23679) og 7-hexylderivatet (23924). Hver værdi for direkte anti-SRBC PFC/kultur minus kontrolværdien divideres med μιηοΐ guanosinderivat i 1 ml kulturvæske [(lxlO"5 M)/(10"3 liter)] 15 for at få ordinatværdierne. Abscissekoordinaterne svarer til antal carbonatomer i den længste lineære carbonatomkæde i 7-substituenten. Allylkæden antages at være lidt længere end propylkæden, og 2-butenylkæden antages at være lidt længere end butylkæden. Yderligere detaljer vedrørende denne 20 graf fremgår af det følgende.

Fig. 6 er en anden graf svarende til grafen i fig.

5. Datapunkterne for denne graf er fremkommet over et tidsrum fra flere undersøgelser under anvendelse af murine lymphocyter fra flere dyr. De gennemsnitlige spidsværdier for direkte 25 anti-SRBC PFC minus kontrol PFC er sammenstillet med antallet af carbonatomer i den længste lineære carbonkæde, som 7-substituenten repræsenterer. Spidsværdierne fås ved først at subtrahere kontrol-PFC/kultur fra hver værdi, der fås ved forskellige guanosinderivatkoncentrationer, således at 30 der fås en "netto" PFC-værdi. Hver netto-PFC-værdi, der således fås på denne måde, divideres derpå med μχηοΐ guanos in til stede ved det forsøg, der giver denne nettoværdi, således at der fås en PFC-spidsværdi pr. μιηοΐ. Derefter tages gennemsnittet af PFC-spidsværdierae pr. μιηοΐ opnået for hvert 35 guanosinderivat fra undersøgelser under anvendelse af det specielle derivat. Disse gennemsnitsværdier er vist på gra- DK 170779 B1 10 fen.

De femcifrede tal i parentes anvendt i beskrivelsen til identificering af guanosinderivaterne er også anvendt i denne figur og er de samme som de anført i fig. 5. Desuden 5 er der i fig. 6 vist data for 7-benzyl- (24234), 7-cinnamyl-(22827) og 7-decyl- (23894) 8-oxoguanosinerne.

Abscissekoordinaterne for guanosinderivaterne, der også fremgår af fig. 5, er gentaget i denne figur. Desuden er 7-benzylderivatet tildelt et abscissekoordinat, der er 10 lidt mindre end pentyl, og 7-cinnamylderivatet er tildelt et abscissekoordinat, der er lidt mindre end heptyl. Yderligere detaljer vedrørende denne figur fremgår af det følgende.

Der er mange fordele ved den foreliggende opfindelse.

15 En iøjnefaldende fordel ved den foreliggende opfin delse er, at de her omhandlede forbindelser er generelt mere effektive, dvs. giver en tilsvarende reaktion ved en lavere dosis eller giver en stærkere reaktion ved en given dosis end tidligere kendte guanosinimmunstimulanter.

20 En anden fordel ved opfindelsen er, at anvendelse af et af de her omhandlede præparater kan tilvejebringe den anden meddelelse, der er nødvendig for B-lymphocytaktivering og -differentiering som reaktion på en første (antigen) meddelelse.

25 En yderligere fordel ved opfindelsen er, at der kan gennemføres en forstærket immunreaktion både i nærvær og fravær af T-hjælpercelleaktivitet. Der iagttages således en forstærket immunreaktion både i T-celleafhængige og i T-celleuafhængige systemer.

30 Det er desuden en fordel ved opfindelsen, at specielle immunsupprimerede og immundefekte tilstande og sygdomsmanifestationer kan forbedres og mindskes ved anvendelse af opfindelsen.

Yderligere fordele ved opfindelsen vil være nærlig- 35 gende for enhver fagmand ud fra den følgende beskrivelse.

Anthropomorphe beskrivelser, såsom afsendelse og DK 170779 B1 11 modtagelse af meddelelser af og til kemikalier og celler, anvendes her udelukkende med det formål at beskrive disse forhold som en hjælp til at forstå iagttagne fænomener.

Den foreliggende opfindelse angår et immunreaktions* 5 forstærkende stof (immunstimulator), der stimulerer immunsystemet hos det værtspattedyr, der modtager det, foruden at det stimulerer leukocyter i cellekultur. Immunstimuleringen, som opfindelsen især angår, er overvejende antigen-specifik for det immuniserende antigen.

10 Ved undersøgelser af virkningerne af visse guanosin- derivater, rapporteret som værende mitogene, f.eks. guanosin-3',5'-cyclisk monophosphat og dets 8-bromderivat, viste det sig, at en hidtil ukendt klasse af guaninnucleosidderi-vater med lav molekylvægt gav bemærkelsesværdige virkninger 15 ved at modulere pattedyrcellers reaktioner, når disse forbindelser var til stede i en effektiv mængde som den aktive bestanddel af et præparat indeholdende en fortyndende mængde fysiologisk acceptabel bærer. Forstærkning af antigenspecifikke humorale immunreaktioner, som resulterede i potent 20 adjuvanticitet, T-celleerstatningsfaktor-lignende aktivitet, T-hjælperaktivitet, T-celleafledt lymphokinsekretion, cyto-toksisk T-celleaktivitet og immunrekonstitutionsaktivitet, er specielle eksempler på de cellereaktioner, der vist sig at blive moduleret. Disse forbindelser og deres anvendelser 25 er beskrevet i US-patentskrifterne 4.539.205 og 4.643.992.

De her omhandlede forbindelser har vist sig at være overraskende mere aktive end forbindelserne beskrevet i de oven for anførte to patentskrifter. Denne forstærkede aktivitet er overraskende af flere grunde.

30 Den mest aktive forbindelse beskrevet i de oven for anførte US-patentskrifter er 7-methyl-8-oxoguanosin (7m8oGuo), både som leukocytmitogen og en antigenspecifik adjuvans. Som det vil blive diskuteret i det følgende er mitogenicitet og adjuvanticitet fænomener, der ikke nødven-35 digvis er beslægtede.

I betragtning af senere fremkomne data er det overras- DK 170779 B1 12 kende, at 7m8oGuo udviser forstærket aktivitet i forhold til forbindelser, såsom 8-hydroxyguanosin (omtalt som dens tautomer 8-oxoguanosin, 8oGuo) eller 8-mercaptoguanosin (omtalt som 8MGuo eller som dens tautomer 8-thioxoguanosin).

5 Mere specifikt har senere data, hvoraf nogle eksempelvis er anført i det følgende, afsløret, at aktiviteten (både roito-genicitet og adjuvanticitet) af en række 8-substituerede guanosiner aftager med stigende størrelse på 8-substituenten.

Eftersom methylgruppen i 7m8oGuo er bundet på guano-10 sinringen i umiddelbar nærhed af 8-stillingen, hvor der har vist sig en substituentstørrelseseffekt, ville man således have forventet, at addition af denne gruppe eller en hvilken som helst gruppe i 7-stillingen, hvor der tidligere ikke var nogen substituent, også ville forårsage en sænkning af 15 aktiviteten, alene fordi det pågældende molekyle var større på et sted i umiddelbar nærhed af det størrelsesfølsomme ringsted. Den forstærkede adjuvanticitet af de her omhandlede forbindelser roed endnu større substituenter i 7-stillingen på guanosinringen i forhold til 7m8oGuo er endnu mere uventet 20 og overraskende.

De her omhandlede immunstimulerende forbindelser er 7,8-disubstituerede guaninnucleosidderivater (også omtalt som guanosiner eller guanosinderivater). Disse forbindelser har formlen 25 ° *?1 γγ> «V·- R4OCHwOsJ (I) 30 h'YJJNh • 3 I 2 h R2 hvor X betyder 0, S eller Se, R1 betyder en ligeksdet, cyc-lisk eller forgrenet carbonhydridgruppe med en længde, der 35 er større end længden af en ethylgruppe og mindre end længden af en decylgruppe, R2 og R3 er ens eller forskellige og DK 170779 B1 13 betyder hydroxyl, lavere alkoxy, lavere alkanoyloxy eller benzoxy, eller R2 og R3 tilsammen betyder lavere alkyliden-dioxy, og R4 betyder hydrogen, lavere alkanoyl eller benzoyl.

Det skal bemærkes, at det er hensigten, at ribosyl-5 gruppen i den ovenfor anførte formel skal være vist bundet i denne rings 1-stilling med bindingen i beta-konfiguration. Det er desuden hensigten at vise D-formen af ribosyl-gruppen.

Foretrukne guanos inder ivater er sådanne, hvor X bety-10 der O eller S, R1 har en længde, der er større end ethyl og mindre end hexyl, og R2 og R3 betyder hydroxy eller acetoxy.

I praksis foretrækkes især forbindelser, hvor X betyder 0, R1 betyder propyl, allyl, butyl, 2-butenyl eller benzyl, R2 og R3 betyder hydroxyl, og R4 betyder hydrogen. Specielt 15 foretrukket er forbindelser, hvor X betyder O, R1 betyder allyl, R2 og R3 betyder hydroxyl, og R4 betyder hydrogen.

Som anført tidligere har en R^-gruppe en længde, der er større end en ethylgruppe. R1-gruppen har desuden en længde, der er mindre end en decylgruppe. Dette betyder, at 20 R1 er en carbonhydridgruppe med en længde, der er større end en mættet 2-carbonkæde og kortere end en mættet 10-car-bonkæde, idet hver længde omfatter et passende antal hydrogenatomer. Ved en carbonhydridgruppe omtalt blot som propyl, butyl, hexyl, decyl eller lignende skal forstås en normal, 25 ligekædet gruppe. Forgrenede grupper er vist ved sædvanligt anvendte numeriske eller forkortede prefixer såsom hhv. 2-propyl eller iso-propyl.

Carbonhydridgruppens kædelængde måles langs den længste lineære carbonkæde i molekylet. Sådanne længder kan let 30 bestemmes ved anvendelse af publicerede bindingsvinkler, bindingslængder og atomradier efter behov for at tegne og måle en forskudt kæde eller ved at bygge modeller ved anvendelse af kommercielt tilgængeligt udstyr, hvis bindingsvinkler, længder og atomradier er i overensstemmelse med accep-35 terede, offentliggjorte værdier. Gruppelængder kan også bestemmes noget mindre nøjagtigt ved at antage, at umættede DK 170779 B1 14 bindinger har samme længde som mættede bindinger, og at bindingsvinkler for umættede bindinger er den samme som for mættede bindinger, selv om ovenfor anførte målemetoder fore-trækkes. Længderne bestemmes som den længste længde for 5 gruppen.

R1 er en carbonhydridgruppe med en speciel længde.

Da R1 er en carbonhydridgruppe, indeholder den kun carbonato-mer og hydrogenatomer.

Carbonhydrider og carbonhydridgrupper kan bredt op-10 deles i aliphatiske og aromatiske grupper. Aliphatiske grupper omfatter (i) mættede alkaner (alkylgrupper) og (ii) mono- og polyumættede alkener og alkyner (alkenyl- og alky-nylgrupper). Cycliske, ligekædede og forgrenede grupper eksisterer for hver type aliphatisk gruppe. Aromatiske R1-15 grupper omfatter en aromatisk benzen- eller naphthalenring. Aralkan-, aralken- og aralkyngrupper, der indeholder en aromatisk ring bundet til en aliphatisk gruppe, er også omfattet af opfindelsen, hvilket også er tilfældet for alkyl-substituerede benzen- og naphthalenderivater. Eksempler på 20 R1-grupper er beskrevet i det følgende.

Som allerede bemærket har R1-grupper en længde, der er større end en ethylgruppe og en længde, der er kortere end en decylgruppe. Alkylgrupper inden for denne gruppe kan derfor benævnes C3_g-alkylgrupper. C3_g-alkyl grupperne omfat-25 ter flere medlemmer af klassen omtalt her som "lavere alkyl"-grupper, der også er anvendelige som dele af R2-, R3- og R4-grupper som anført i det følgende. Det er således passende på dette sted at diskutere lavere alkylgrupper.

Grupper omtalt her som "lavere" betyder, at de inde-30 holder 1 til ca. 6 carbonatomer. Denne definition gælder ved anvendelse af ordet "lavere" som det anvendes i alle substituenterae R1, R2, R3 og R4. For R2, R3 og R4 foretrækkes det at anvende en "lavere" gruppe, der indeholder 1 til 3 carbonatomer.

35 Lavere alkylgrupper omfatter både ligekædede og for grenede grupper, såsom methyl, ethyl, propyl, isopropyl, η- DK 170779 B1 15 butyl, sek.butyl, tert.butyl, n-pentyl, 3-methyl-2-butyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, neopentyl, n-hexyl, 1-methyl-pentyl, 3-methylpentyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, 2-hexyl, 3-hexyl og lignende. Gruppen af C3_9-alkylradikaler svarende 5 til R1 udelukker methyl og ethyl fra gruppen af lavere alkyl-grupper og inkluderer heptyl, octyl og nonyl såvel som yderligere forgrenede grupper, såsom 2-methylheptyl, der er alkylsubstituerede alkylgrupper. Det foretrækkes, at R1-grupperne har en længde, der er større end ethyl og mindre 10 end hexyl og er ligekædede. Særligt foretrukne lavere alkylgrupper svarende til R1 er propyl, butyl og pentyl.

Cycliske aliphatiske grupper er også omfattet af den foreliggende opfindelse og kan være inkluderet i gruppen af alkylgrupper såvel som i gruppen af umættede alkenyl- og 15 alkynylgrupper. Sådanne grupper omfatter cyclopentyl, cyclo-hexyl, cycloheptyl og cyclooctyl. I denne gruppe er også inkluderet umættede grupper, såsom 2-cyclopentenyl, 2-cyclo-hexenyl, 3-cycloheptenyl og lignende.

Cycliske aliphatiske grupper ifølge opfindelsen omfat-20 ter desuden grupper med én eller flere lavere alkylsubstitu-enter bundet til en ring, hvor ringen er bundet direkte til 7-stillingen i en guaninring, såvel som grupper med en alky-len-, alkenylen- eller alkynylengruppe bundet mellem 7-stil-1ingens nitrogenatom og den cycliske ringstruktur. Eksempler 25 på grupper fra førstnævnte gruppe af cycliske grupper er 2-methylcyclopentyl, 3-ethylcyclohexyl og 4-isopropylcyclohep-tyl. Eksempler på grupper fra sidstnævnte gruppe af cycliske grupper er 2-(cyclopentyl)ethyl, 3-(cyclohexyl)butyl og lignende.

30 Umættede grupper udgør en yderligere gruppe af alipha tiske grupper. Eksempler på monoumættede forbindelser er 3-butenyl, 2-methyl-3-pentenyl, 3-hexynyl og lignende. Cycliske grupper, der desuden indeholder én eller flere umættede bindinger men er aromatiske, betragtes som cycliske grupper 35 som ovenfor. Polyumættede grupper omfatter butadienyl, 2-methyl-2,4-pentedienyl og lignende.

DK 170779 B1 16 C3_6-Beta-alkenylgrupper er en særligt foretrukken gruppe af umættede carbonhydridgrupper. C3_6“Beta-alkenyl-grupper indeholder en ethylenisk dobbeltbinding beta til 7-nitrogenatomet i guanosinen. Eksempler på grupper er allyl 5 (2-propenyl), 2-butenyl, 2-pentenyl, 3-methyl-2-pentenyl og lignende.

Aromatiske grupper udgør en yderligere gruppe af R1-carbonhydridgrupper. Eksempler på aromatiske grupper er phenyl og naphthyl. Alkylsubstituerede aromatiske grupper, 10 såsom 3- eller 4-methylphenyl, 3- eller 4-isopropylphenyl, 3-ethylnaphthyl, 5-methylnaphthyl og lignende, er også omfattet af den foreliggende opfindelse.

Eksempler på R-'—grupper er desuden aralkylgrupper. Eksempelvis skal nævnes benzyl, phenethyl og 3-phenylbutyl.

15 Benzyl er en særligt foretrukken R1-gruppe.

Cinnamyl (3-phenyl-2-propenyl) er en nært beslægtet gruppe, idet det er en aralkenylgruppe. Cinnamylgruppen kan også betragtes som en substitueret beta-alkenylgruppe, der er længere end en C3_6-beta-alkenylgruppe men er overraskende 20 aktiv som adjuvans i betragtning af dens længde.

R2 og R3 kan være ens eller forskellige og betyder hydroxyl, lavere alkoxy, lavere alkanoyloxy eller benzoxy.

R2 og R3 kan tilsammen også danne en 21,3'-cyclisk lavere alkylidendioxygruppe. Eksempler på R2 og R3 er anført i det 25 følgende.

Lavere alkoxygrupper er lavere alkylgrupper bundet til guaninsukkerringen gennem et oxygenatom. Eksempler på lavere alkoxygrupper er methoxy, ethoxy, isopropoxy, butoxy, hexyloxy og lignende. Lavere alkanoyloxygrupper er estere 30 dannet mellem en guaninsukkerrings hydroxylgruppe og en lavere alkylcarboxylsyre. Eksempler på lavere alkanoyloxygrupper er formoxy, acetoxy, propionoxy, hexanoyloxy og lignende.

Lavere alkylacetal- og -ketalderivater af 2'- og 3'-35 hydroxylgrupperne er omtalt som 2',3'-cyclisk lavere alkyl-idendioxy eller blot som lavere alkylidendioxygrupper. Disse DK 170779 B1 17 grupper dannes ved omsætning af et aldehyd, såsom formaldehyd, acetaldehyd eller lignende, eller en keton, såsom acetone eller methylethylketon, med 2'- og 3'-hydroxylgrupper i en substitueret guanosinribosylgruppe.

5 Det foretrækkes, at R2 og R3 betyder hydroxyl, lavere alkanoyloxy eller benzoxy, især hydroxyl eller acetoxy. Når R2 og R3 betyder lavere alkanoyloxy eller benzoxy, kan disse grupper mistes under eller lige efter leukocyt-kontakterings-trinnet ved en fremgangsmåde ifølge opfindelsen og kan såle-10 des give en "pro-medikament" form af guanos inder ivatet. R2 og R3 betyder især hydroxyl.

R4 betyder hydrogen, lavere alkanoyl eller benzoyl.

R4 betyder især hydrogen. Når R4 betyder lavere alkanoyl eller benzoyl, antages det, at carboxylgruppen kan spaltes 15 som beskrevet ovenfor, hvorved der igen fås et "pro-medika-ment".

En anvendelig guanosin er i alt væsentligt uden ionladning ved fysiologiske pH-værdier, dvs. ved en pH-værdi på ca. 7,0 til ca. 7,5 bortset fra de ionladninger, der 20 måtte forekomme på grund af de relativt sure ringn it rogenatomer i 1-stillingen. Et anvendeligt molekyle er således fri for syre- og baseholdige dele, der ikke forekommer i guano-sinen. Denne frihed for sure og basiske grupper strækker sig fra R1-gruppen, som defineret, og gennem hele guanosin-25 molekylet.

Guaninerne er syrer, og kan som sådanne danne baseadditionssalte. Sådanne salte er anvendelige til opnåelse af lagringsstabilitet og er ikke ensbetydende med en ekstra ionladning på et guaninderivat anvendt ved en fremgangsmåde 30 ifølge opfindelsen på grund af pufringseffekten, der tilvejebringes af værtens blod- og lymphesystemer eller et dyrkningsmediums puffer.

Farmaceutisk acceptedsle, ikke-toksiske baseadditionssalte af guaninderivater er anvendelige ifølge opfindelsen 35 og kan dannes ved behandling af det immunreaktionsforstærken-de stof med en passende base i et egnet opløsningsmiddel, DK 170779 B1 18 såsom vand eller en lavere alkylalkohol, såsom methanol eller ethanol. Eksempler på uorganiske baser er natrium-, kalium- og ammoniumhydroxid og lignende baser. Eksempler på organiske baser er tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), 5 4-(2-hydroxy ethyl) -1-piperazinethansul fonsyre (HEPES) og lignende baser. Omvendt kan baseadditionssaltformen omdannes til den frie guanosinform ved behandling med syre.

De substituerede guaninnucleosidderivater anvendelige ifølge opfindelsen fremstilles let ved fremgangsmåder of-10 fentliggjort i den kemiske litteratur eller ved fremgangsmåder analoge hermed. Flere eksempler på synteser er anført i det følgende. Synteser af 7,8-disubstituerede guaninnucleo-sidderivater begynder typisk med, at 9-l'-beta-aldoglycosid-bindingen allerede er dannet, selv om den initielle dannelse 15 af denne binding ikke er nødvendig. En særlig og uventet fremgangsmåde til fremstilling af nogle af de her omhandlede forbindelser er diskuteret i det følgende.

Foruden de eksempler på synteser, der er beskrevet i det følgende, skal der her kort beskrives tre generelle 20 syntesemetoder. Disse er eksempler på syntesemetoder, som fremgår af litteraturen, og er beskrevet ved anvendelse af en 7-carbonhydridsubstitueret 8-thioxoguanosin ifølge opfindelsen som den forbindelse, der skal fremstilles.

Ved den første fremgangsmåde omsættes en 7-carbon-25 hydridsubstitueret 8-thioxoguanin med et passende ribosede-rivat substitueret med en alpha-l-afgangsgruppe, såsom alpha- 1-chlor (eller brom eller acetoxy) 2,3,5-tribenzoyl-D-ribose i et egnet opløsningsmiddel til dannelse af beta-ribosylde-rivatet. Reaktionsprodukterne isoleres og adskilles ved 30 HPLC, således at der fås det ønskede guanosinderivat.

Ved en anden fremgangsmåde oxideres 7-allyl-8-thioxo-guanosin (22444, eksempel 9) til dannelse af det tilsvarende aldehyd. Den dannede 7-(2-ethanal)-8-thioxoguanosin kondenseres derefter via en Wittig-reaktion til dannelse af en 35 7-beta-C3.g-alkenyl (eller anden) substitueret guanosin, der til videre forarbejdning skilles fra andre produkter.

DK 170779 B1 19

Denne umættede guanosin kan derpå reduceres, således at der fås en mættet substituent.

Ved en tredie fremgangsmåde gennemføres der en ringlukning ved omsætning af thiophosgen med en passende sub-5 stitueret 2,5,6-triamino-4-hydroxypyrimidin. Mere specifikt omsættes en 2-amino-4-hydroxy-5-carbonhydridsubstitueret amino-6-beta-D-ribosylpyrimidin med thiophosgen i nærværelse af en syreuddrivende base, således at der fås et 7-carbon-hydrid-8-thioxoguanosinderivat, der inden dets anvendelse 10 kan skilles fra andre reaktionsprodukter.

De her omhandlede præparater indeholder en fortyndende mængde af en fysiologisk acceptabel bærer blandet med en immunpotentierende (immunreaktionsforstærkende eller im-munstimulerende) effektiv mængde af et substitueret guaninnu-15 cleosidderivat ifølge opfindelsen beskrevet ovenfor.

Et præparat til in vivo indgift fremstilles således, at det kan anvendes til peroral eller parenteral indgift i gængse enhedsdosisformer. Udtrykket "enhedsdosis" og dets grammatiske ækvivalenter som anvendt her refererer til fysisk 20 adskilte enheder egnet som enhedsdoser til mennesker og andre pattedyr, idet hver enhed indeholder en på forhånd fastlagt effektiv mængde guanosin som aktiv bestanddel beregnet til at give den ønskede terapeutiske virkning sammen med den nødvendige fysiologisk acceptable bærer, f.eks. et 25 fortyndingsmiddel eller et bæremedium. Specifikationerne for de her omhandlede enhedsdosisformer dikteres af og er direkte afhængige af (a) det aktive guanosinderivats unikke egenskaber og den særlige terapeutiske virkning, der skal opnås samt (b) de naturlige begrænsninger, der forekommer 30 ved blanding af en sådan aktiv bestanddel til terapeutisk anvendelse in vitro såvel som in vivo i mennesker og dyr.

Eksempler på egnede enhedsdosisformer i overensstemmelse med opfindelsen er tabletter, kapsler, piller, pulverpakker, granuler, oblater og lignende, adskilte multipla af 35 de ovenfor anførte former, såvel som flydende opløsninger, emulsioner og suspensioner. Flydende præparater kan indgives DK 170779 B1 20 på sædvanlig måde, såsom subcutant, intraperitonealt, in-tramuskulært, peroralt eller lignende.

Mængden af aktiv bestanddel, der indgives in vivo som en effektiv immunstimulerende mængde, afhænger af patien-5 tens alder og vægt, den særlige tilstand, der skal behandles, indgiftshyppigheden og indgiftsvejen. Den samlede daglige dosis kan være ca. 0,01 til ca. 200 mg pr. kg legemsvægt, fortrinsvis ca. 0,1 til ca. 25 mg pr. kg legemsvægt, især ca. 1 til ca. 15 mg pr. kg legemsvægt. Til et voksent men-10 neske anvendes en dosis på ca. 5 til ca. 1400 mg daglig, indgivet enten som en enkelt dosis eller i 3- eller 4-delte doser. Doser til dyr svarer til doser til mennesker, hvor den indgivne mængde er i forhold til dyrets vægt og stofskiftehastighed sammenlignet med voskne mennesker.

15 Det vil være klart for enhver fagmand, at anvendelige in vivo koncentrationer kan variere fra dyreart til dyreart. Enhver fagmand ved desuden, at passende koncentrationer let kan bestemmes.

Koncentrationer til in vitro kontaktering af dyrecel-20 ler er ca. 1 x 10“® mol til ca. 3 x 10”4 mol/1 ved cellekoncentrationer på ca. 106 til 107 celler pr. ml. Der anvendes fortrinsvis en koncentration på ca. 1 x 10“5 mol til ca. 1 x 10”4 mol/1. Som det fremgår af det følgende kan spidskoncentrationen, dvs. den koncentration, der giver den største 25 adjuvanticitet, for en given guanosin variere så meget som 10 til 100 gange ved undersøgelser af lymphocytsystemer hos mus eller mennesker.

Præparatet kan være fast eller flydende. Fysiologisk acceptable bærere er kendte. Eksempler på flydende bærere 30 er sterile vandige opløsninger, som kun indeholder det aktive guanosinderivat og vand eller indeholder en puffer, såsom natriumphosphat ved den fysiologiske pH-værdi, fysiologisk saltvand eller begge dele, såsom phosphatpufret saltvand. Desuden kan vandige bærere indeholde mere end ét puffersalt, 35 såvel som salte, såsom natrium- og kaliumchlorider, dextrose og andre opløste stoffer. Sidstnævnte bærere er eksempelvis DK 170779 B1 21

Ringer's injektion, dextroseinjektion, dextrose- og natrium-chloridinjektion og Ringer's lactatiserede injektion.

Flydende præparater kan også indeholde flydende faser foruden og ned udelukkelse af vand. Eksempler på sådanne 5 yderligere faser er glycerol, vegetabilske olier, såsom bomuldsfrøolie og sesamolie, samt vand-olie-emulsioner.

Eksempler på faste bærere er sådanne materialer, der sædvanligvis anvendes til fremstilling af piller eller tabletter, og omfatter majsstivelse, lactose, dicalciumphos-10 phat, fortykningsmidler, såsom traganth gummi og methylcellu-lose U.S.P., findelt Si02, polyvinylpyrrolidon, magnesiumste-arat og lignende. Desuden kan den faste bærer indeholde bionedbrydelige og ikke-bionedbrydelige polymerer, polypep-tidbærere, affinitetsbærere, såsom "AFFI-GEL" 601 (phenyl-15 boronatharpiks, der kan fås fra BIO-RAD Laboratories, Richmond, Californien), liposomer og syntetiske polymerer som kendt af enhver fagmand. Antioxidanter, såsom methylparaben og propylparaben, kan forekomme både i faste og flydende præparater, ligesom sødemidler, såsom sukker fra sukkerrør 20 eller sukkerroer, natriumsaccharin, natriumcyclamat og dipep-tidet asparagin-phenylalanin-methylester solgt under varebetegnelsen "NUTRASWEET" (aspartam) af G.D. Searie Co.

Den foreliggende opfindelse angår desuden en fremgangsmåde til forstærkning af leukocyters immunreaktion.

25 Immunreaktionen er fortrinsvis en antigenspecifik reaktion.

I overensstemmelse med denne fremgangsmåde kontakteres leu-kocyter, såsom B-celler, T-celler, neutrophiler og makropha-ger, separat eller sammen i et vandigt medium in vitro med ét af de ovenfor beskrevne præparater indeholdende en immun-30 stimulerende effektiv mængde af ét af de ovenfor beskrevne guaninnucleosidderivater.

Fremgangsmåden gennemføres in vitro i cellekulturer, såsom i hybridomkulturer ved produktion af monoklonale antistoffer.

35 Leukocyterne bringes i kontakt med præparatet i et vandigt medium, uanset om guanosin-præparatet selv er fast DK 170779 B1 22 eller flydende, eller uanset om væsken i præparatet er vandig. Det vandige medium er i det mindste delvis det anvendte dyrkningsmedium.

Kontakt mellem præparatet og leukocytteme opretholdes 5 i tilstrækkelig lang tid til, at de kontakterede celler udviser en forstærket immunreaktion. Denne immunstimulering kan i sig selv være tydelig ved celleproliferation, forstærket antistofsekretion, forstærket T-hjælperaktivitet, forstærket cytokinproduktion fra T-celler og makrophager, enzym-10 sekretion fra neutrophiler og lignende. De i det følgende diskuterede resultater illustrerer murine miltcellers ikke-specifikke mitogene reaktioner, antigenspecifikke reaktioner fra murine B-celler og humane perifere blodlymphocyter fri for T-supressorceller, antigenspecifik proliferation af T-15 celler, in vitro rekonstitution af den primære immunreaktion i murine immundefekte B-celler, T-supressorcelleerstattende aktivitet for en antigenspecifik reaktion i murine B-celler og en in vivo antigenspecifik forstærkning af murin antistofproduktion .

20 Kontakt in vitro kan opretholdes i tilstrækkelig lang tid til, at én af de ovenfor beskrevne immunstimuleringer bliver tydelig som bestemt ved gængse analyseteknikker. Sådanne kontakttider er typisk ca. 1 til ca. 7 dage, eller mere almindeligt ca. 2 til ca. 6 dage.

25 Den foreliggende opfindelse angår desuden en frem gangsmåde til fremstilling af substituerede guaninnucleosid-derivater som ovenfor defineret.

I overensstemmelse med denne fremgangsmåde gås der ud fra en tilsvarende forbindelse, der er substitueret i 8-30 stillingen med en gruppe -X-CH2CR=CH2, hvor X betyder 0, S eller Se, og R betyder hydrogen, lavere alkyl eller benzyl. Udgangsforbindelsen opvarmes til den forhøjede temperatur på ca. 50*C til ca. 200*C. Den forhøjede temperatur opretholdes i tilstrækkelig lang tid (ca. 1 time til ca. 2 uger) 35 til, at der sker en omlejring af udgangsforbindelsen, og der dannes et produkt substitueret (i) i 8-stillingen med gruppen DK 170779 B1 23 =X, hvor X i produktet har samme betydning som X i udgangsforbindelsen, og (ii) i 7-stillingen med en gruppe -CH2-CR=CH2, hvor R har den samme betydning som i udgangsforbindelsen. Det dannede produkt isoleres fortrinsvis, hvilket 5 kan ske på kendt måde.

Den ovenfor anførte reaktion gennemføres fortrinsvis med udgangsforbindelsen opløst eller dispergeret i et flydende opløsningsmiddel, der er indifferent over for reaktionsbetingelserne. Eksempler på indifferente flydende opløs-10 ningsmidler til sådanne formål er vand, dimethylformamid og dimethylsulfoxid som beskrevet i det følgende.

Det skal bemærkes, at udgangsforbindelsen ikke behøver at være et isoleret, renset materiale.

De temperaturer, der kan anvendes ved den ovenfor 15 anførte reaktion, og den tid, hvori disse temperaturer opretholdes, kan variere i vid udstrækning. De optimale temperaturer viser sig at være ca. 100°C, når X betyder O, og ca.

135'C, når X betyder S eller X betyder Se. Svovl-analogen kræver en længere reaktionstid end både oxygen- og selen-20 analogerne.

Uden ønske om at være bundet af teori antages det, at den beskrevne reaktion er en omlejring, der forløber via et 6-leddet ringmellemprodukt eller overgangstilstand. Den 6-leddede ring antages at blive dannet af 7-nitrogenatomet 25 og 8-carbonatomet, X-atomet og de første tre (viste) carbon-atomer i X-CH2-CR=CH2-gruppen, idet *CH2-carbonatomet i udgangsforbindelsen lukker ringen ved at danne en binding med 7-nitrogenatornet.

Ifølge en udførelsesform for fremgangsmåden kataly-30 seres omlejringen ved anvendelse af palladiumdichlorid (PdCl2), fortrinsvis i et relativt lavtkogende opløsningsmiddel, såsom tetrahydrofuran (kogepunkt: 65*C). Som ved den ikke-katalyserede omlejring blokeres typisk de forskellige reaktive dele på guanosinen, foruden nitrogenatomet i 35 9-stillingen, såsom hver enkelt hydroxylgruppe i sukkerringen, 6-oxo (hydroxy) gruppen og 2-aminogruppen under den DK 170779 B1 24 katalyserede omlejring med egnede blokeringsgrupper, der kan fjernes, såsom trimethylsilylgrupper. En sådan blokering er ikke nødvendig ved den ikke-katalyserede reaktion.

Ved en katalyseret omlejring, der skal tjene som 5 eksempel, blandes det som udgangsforbindelse anvendte, i 9-stillingen blokerede 8-X-CH2“CR=CH2-guanosinderivat med en katalytisk mængde PdCl2, idet molforholdet mellem katalysator og guanosin er ca. 1:1 til ca. 1:10, og den resulterende blanding tilbagesvales i et opløsningsmiddel, såsom tetrahy-10 drofuran, i en passende tid, såsom ca. 10 til ca. 20 timer, for at gennemføre omlejringen. Reaktionsprodukteme adskilles derefter typisk, hvorpå de isoleres.

I de tilfælde, hvor der under syntesen anvendes blokeringsgrupper, der kan fjernes, fjernes disse også typisk 15 inden isoleringen af det ønskede 7-CH2-CR=CH2-8-X-guanosinde-rivat. I de tilfælde hvor der anvendes trimethylsilylgrupper som blokeringsgrupper, der kan fjernes, kan disse grupper fjernes ved behandling af det blokerede produkt med en syre, såsom eddikesyre.

20 Som det fremgår af eksempel 9 i det følgende, giver den katalyserede reaktion et højere udbytte af 7a8MGuo (42,5%) end den ikke-katalyserede reaktion (36%), og reaktionstiden er desuden kortere, dvs. 16 timer mod 9 dage, og reaktionen sker ved en lavere temperatur, dvs. 65*C mod 25 130*C. For den katalyserede reaktion udføres omlejringen typisk ved en temperatur på ca. 50 til ca. 100*c, medens den ikke-katalyserede omlejring typisk sker ved en temperatur på ca. 100 til 200*C.

Der er opnået specifikke resultater ved anvendelse 30 af de her omhandlede forbindelser, præparater og fremgangsmåder, og disse resultater er i en række tilfælde sammenlignet med lignende resultater opnået ved anvendelse af forbindelser, præparater og fremgangsmåder beskrevet i US-patent-skrift 4.643.992. Størsteparten af disse resultater er opnået 35 ved at anvende 7-(2-propenyl)-8-oxoguanosin (her også benævnt 7-allyl-8-oxoguanosin) og 7-(2-propenyl)-8-thioxoguanosin DK 170779 B1 25 (her også benævnt 7-allyl-8-thioxoguanosin og 7-allyl-8-mercaptoguanosin). Disse to forbindelser omtales for nemheds skyld som hhv. 7a8oGuo og 7a8MGuo, idet der anvendes den samme forkortede skrivemåde som anført tidligere for 7-me-5 thyl-8-oxoguanosin (7m8oGuo), 8-mercaptoguanosin (8MGuo) og 8-oxoguanosin (8oGuo). En anden forkortet skrivemåde, der anvendes for en forbindelse til sammenligning, er 8-BrGuo for 8-bromguanosin.

Resultaterne diskuteret i det følgende er opnået ved 10 anvendelse af én eller flere af de her omhandlede forbindelser, med mindre andet er angivet, i et præparat ifølge opfindelsen, der anvendes ved en fremgangsmåde ifølge opfindelsen.

For at gøre beskrivelsen kortere og lettere vil der i det følgende kun blive henvist til forbindelserne, idet det er 15 underforstået, at disse forbindelser anvendes i præparater og ved fremgangsmåder ifølge opfindelsen.

De her omhandlede forbindelser, hvis aktivitet diskuteres eller sammenlignes i det følgende, er også tildelt et 5-cifret tal til identificering af disse. Disse tal er 20 anført i overskriften i forbindelsen med eksemplet, der beskriver fremstillingen af forbindelserne. Det 5-cifrede tal og/eller nummeret på eksemplet anvendes i tabellerne og den følgende diskussion som en hjælp til identificering af forbindelserne.

25 A. Aktiviteter af 8-substituerede quanosiner.

Som bemærket tidligere er adjuvanticiteten og mitoge-niciteten af en række 8-substituerede guanosiner, der ikke falder ind under den foreliggende opfindelse, med thioethere 30 med varierende længder undersøgt. Resultaterne af disse undersøgelser fremgår af tabellerne I og II, hvor vandrette linier hen over hele tabellen anvendes for at adskille separate undersøgelser fra hinanden.

DK 170779 B1 26

Tabel I

Antigen-specifik adiuvanticitet af 8-thioetherguanosiner1

Direkte 5 Koncen- anti-SRBC PFC/kultur4

Forbindelse 2 tration3 CBA/CaJ C57BL/6J

22359 10”4 123121 10 (cinnamyl; 14) 3xl0"4 15717 2620 1100 10"3 653152 3110 1350 15 22435 10”4 247138 (2-butenyl; 13) 3xl0"4 582152 9120 11110 20 10“3 607157 12.0801470 8MGUO 3xl0“4 527125 11.0001140 25

Kontrol (uden nu- 75 110 486 170 cleosid) (med antigen) 30 DK 170779 B1 27

Tabel I (fortsat)

Antigen-specifik adiuvanticitet af 8-thioetherauanosiner1

Direkte 5 Koncen- anti-SRBC PFC/kultur4

Forbindelse 2 tration3 CBA/CaJ C57BL/6J

22300 10“4 420±105 10 Λ (allyl» 9) 3xl0“4 870±70 10”3 490±133 15 8MGUO 10“4 8131129 3xl0“4 7821123 20 Kontrol (uden nu- 8 14 cleosid) (uden antigen) 25

Kontrol (uden nu- 307161 cleosid) (med antigen) 30 - 1 Adjuvanticiteter mod røde fåreblodlegemer (SRBC) målt i direkte plaguedannende celler pr. kultur med lynphocy-ter fra de viste musestammer. Detaljer vedrørende fremgangsmåden er omtalt i det følgende. Standardafvigelser fra de 35 specificerede gennemsnitsværdier er angivet med "1 tal".

2 Nucleosiderne er identificeret ved hjælp af deres 5-cifrede tal. Gruppen bundet til 8-thiogruppen og nummeret på eksemplet, hvori forbindelsen er fremstillet, er angivet i parentes.

40 3 Koncentrationen af nucleosidet i mol pr. liter i det vandige medium, hvori lymphocyterne bringes i kontakt med præparatet.

4 Der anvendes lymphocyter fra indavlede muselinier CBA/CaJ eller C57BL/6J.

DK 170779 B1 28 latel.. il

Mitogenicitet af S-thioethercruanosiner1 [3H]TdR optagelse 5 Forbindelse2 Koncentration3 (cpm/kultur)_ 22359 10“4 1600 ±90 (cinnamyl; 14) 3xl0”4 1300 ±80 10 10”3 1700 ±280 22435 10"4 4500 ±120 15 (2-butenyl; 13) 3xl0-4 8800 ±200 10“3 11.200±202 20 8MGUO 10"3 41.100±390

Kontrol (uden nucleo- 2100 ±60 sid) 25 22300 10-4 2700 ±130 30 (allyl; 9) 3xl0“4 4100 ±70 10“3 16.400±1130 35 8MGUO 10“3 25200 ±950

Kontrol (uden nucleo- 2400 ±90 sid) 40 1 Mitogenicitet målt ved optagelsen af [3H]TdR (tri-tiuxnmærket thymidindeoxyribonucleosid) som bestemt ved måling af tælletal pr. minut (cpm) pr. cellekultur ved anvendelse 45 af betingelserne anført senere i beskrivelsen. Standardafvigelser er anført som i tabel I.

2,3 jævnfør noterne 2 og 3 til tabel I.

De ovenfor anførte resultater illustrerer, at med DK 170779 B1 29 stigende længde af substituenten aftager aktiviteten af det 8-substituerede guanosinderivat i forhold til 8MGuo, hvis 8-svovlatom er bundet udelukkende til et hydrogenatom. Således er den antigen-specifikke adjuvanticitet af 8-(2-buten-5 yl)-derivatet (22435) større end adjuvanticiteten af det længere 8-cinnamylderivat (22359) men mindre end adjuvanti-citeten af 8-mercaptoforbindelsen (8MGuo). 8-Allylderivatet (22300) har ca. samme adjuvanticitet som 8MGuo i de viste koncentrationer. Resultaterne for mitogenicitet for de samme 10 forbindelser viser en endnu mere udtalt tendens i aktiviteter# hvor længere og længere 8-substituenter giver dårligere og dårligere resultater.

B. Adjuvanticitet oa mitoaenicitet.

15 De her omhandlede forbindelser, præparater og frem gangsmåder er anvendelige til at fremkalde og forstærke mitogene og polyklonale reaktioner samt adjuvanticitet, som det er tilfældet for forbindelserne, hvis aktiviteter er vist i tabellerne I og II. De her omhandlede forbindelsers 20 mi togen- og ad j uvansegenskaber antages at fremkomme ad mindst to forskellige veje, hvor mitogenese og en polyklonal reaktion ofte er overensstemmende resultater, medens adjuvan-ticitetsresultaterne hyppigt er forskellige, jvf. f.eks. Goodman et al., J. Exp. Med., 147, 800 (1978) og Mclntire 25 et al., J. Immunol., 117, 674 (1976). Nogle tilsvarende forskelle er anført i US-patentskrift 4.643.992.

Denne mangel på sammenkobling af aktiviteter er også vist for nogle af de her diskuterede forbindelser, som det fremgår af resultaterne i tabellerne III og IV.

30 DK 170779 B1 30

Tabel III

Antigen-specifik adluvanticitet af nogle 7-substituerede 8-oxo- quanosiner i det humane system1 5 7m8oGUO 10"2 2613 ±192 3xl0“2 5775 ±214 10"1 1517 ±205 10 23643 10"2 5492 ±137 (ethylf 6) 3xl0“2 9059 ±310 15 10"1 1950 ±189 7a8oGuo 10-4 10.075±628 20 3xl0“2 11.938±762 10“1 2.807 ±381 25 23644 10”2 11.838±1337 (butyl; 2) 3xl0”2 12.238±150 30 10"1 7.363 ±325

Kontrol (uden nucleosid) 12 ±4 35 (uden antigen)

Kontrol (uden nucleosid) 652 ±86 40 (med antigen)

Undersøgelserne udføres på samme måde som i forbindelse med tabel I, idet der dog anvendes et præparat med 45 humane lymphocyter.

2 2»1 Jævnfør noterne 2 og 3 i tabel I.

DK 170779 B1 31

Tabel IV

Mitogenicitet af nogle 7-substituerede 8-oxoguanosiner i det murine system1 5 [3H]TdR optagelse

Forbindelse2 Koncentration3 (cpm/kultur)_ 7m8oGuo 10“4 23.6401770 10 3xl0“4 39.620+1160 10“3 35.070±1830 15 23643 10”4 37.490±540 (ethyl; 6) 3xl0"4 48.690±1120 20 10"3 34.1601780 7a8oGuo 10“4 39.8301780 25 3xl0-4 59.1501420 10“3 51.34011050 30 23644 10"4 30.72011030 (butyl; 2) 3xl0-4 41.1801410 10~3 33.22011330 35

Kontrol (uden nucleosid) 1640 150 40 1# 2» 3 Jævnfer noter 1, 2 og 3 i tabel II.

Resultaterne vist i tabel IV illustrerer, at 7-methyl-, 7-ethyl-, 7-allyl- og 7-butyl-8-oxoguanosinerne alle udviser omtrent de samme mitogeniciteter i det murine system 45 over det samme koncentrationsområde. Når adjuvanticiteten i det humane system undersøges (tabel III), er spidsværdierne imidlertid ca. 100% større for de her omhandlede forbindelser (7-allyl- og 7-butyl-8-oxoguanosin) sammenlignet med 7-me- DK 170779 B1 32 thyl-8-oxoguanosin (7m8oGuo). Det er interessant, at humane perifere B-celler, den samme type celler anvendt i tabel III, som udviser forstærket adjuvanticitet i nærværelse af et guanosinderivat ifølge opfindelsen, ikke udviser nogen 5 mitogen reaktion i nærværelse af noget guanosinderivat. De ovenfor anførte resultater og den mangel på mitogenicitet, som humane celler, der viser en adjuvans reaktion, udviser, bekræfter yderligere, at mitogenicitet og adjuvanticitet ikke nødvendigvis hænger sammen og kan forløbe ad forskellige 10 veje.

C. Ad~iuvanticitetsundersøgelser

Et stort antal sammenligninger af adjuvanticitet ved anvendelse af humane og murine lymphocyter som leukocytkilde 15 er gennemført ved anvendelse af forbindelser ifølge opfindelsen såvel som med hidtil ukendte forbindelser ikke omfattet af den foreliggende opfindelse. På grund af forskellene i lymphocytreaktioner selv fra indavlede mus, for slet ikke at tale om den udavlede humane population, sammenlignes disse 20 resultater bedst inden for en given undersøgelse med de forbindelser, der anvendes i den samme undersøgelse og med kontrollerne for hver undersøgelse. Sammenligning mellem de enkelte forbindelser er imidlertid nyttig for at vise tendenser og store forskelle. Tabellerne V, VI og VII giver 25 eksempler på data fra sådanne undersøgelser, hvor kun aktiviteten ved spidskoncentrationen er vist for hver forbindelse, og resultaterne for kontrollerne er udeladt. Resultaterne fra hver undersøgelse er adskilt fra de andre ved en vandret linie hen over tabellen.

/ DK 170779 B1 33

Tabel V

Adiuvanticitetsundersgqelser i det murine system1

Spidsværdier for

5 Spidskoncen- direkte anti-SRBC

Forbindelse2 tration3 PFC/kultur_ 7a8MGuo 3x10”® 1850170 10 22827 3xl0“4 12571226 (cinnamyl; 11) 15 7m8oGuo 3xl0'4 723 1143 20 24234 3xl0“5 2004 (benzyl; 23) 25 7a8oGuo 10”5 1827 23643 3x10“® 1009197 30 (ethyl; 6) 23644 3x10“® 10581154 35 (butyl; 2) 23894 3x10“® 90 115# 40 (decyl; 7) 45 23643 3xl0“5 20671230 (ethyl; 6) 50 8BrGuo 10“3 24501325

Tabel V

Adiuvanticitetsundersøgelser i det murine system1 DK 170779 B1 34

Spidsværdier for

5 Spidskoncen- direkte anti-SRBC

Forbindelse2 tration3 PFC/kultur_ 23369 3xl0~5 2425±229 10 (7-allyl-8- -selenoxo; 10) 7a8MGuo 3xl0“4* 925 ±80 15 1» 2 Jævnfør noterne 1 og 2 i tabel I.

3 Den koncentration, der giver det største antal plaquer pr. kultur ved en given undersøgelse, er den værdi, 20 der er rapporteret, bortset fra det tilfælde, hvor symbolet (*) er anvendt for at vise, at der er anvendt en overoptimal koncentration.

# Den viste spidsværdi for PFC/kultur er mindre end værdien for kontrollen, hvilket er ensbetydende med, at 25 forstærkningen af PFC/kultur er effektivt nul.

Resultaterne i den ovenfor anførte tabel illustrerer flere ting. For det første er de her omhandlede forbindelser mere aktive end forbindelser beskrevet i US-patentskrift 4.643.992, hvormed de er sammenlignet. Denne forbedrede 30 aktivitet er tydelig enten ved en koncentration, ved hvilken der observeres spidsadjuvanticitet, hvor spidskoncentrationen er ca. 0,5 til 1 logenheder (potenser af 10) lavere, eller en adjuvanticitet ved en given spidskoncentration, der er betydeligt højere, sædvanligvis mindst ca. 100% højere, end 35 den adjuvanticitet, der udvises af en forbindelse ifølge det nævnte patentskrift.

Den forbedrede adjuvanticitet kan ses i den første gruppe af forbindelser i tabel V, hvor 7a8MGuo, 7m8oGuo og 7-cinnamyl-8-oxoguanosin (22827) sammenlignes. Således er 40 7a8MGuo mere end 100% mere aktiv end 7m8oGuo ved en koncentration, der er to logenheder lavere. 7-Cinnamyl-8-oxoguano- DK 170779 B1 35 sin er mere end ca. 100% mere aktiv end 7m8oGuo ved den samme spidskoncentration. Tilsvarende resultater er vist i den nedre del af tabel V, hvor 8-BrGuo sammenlignes med 7-ethyl-8-oxoguanosin (23643), hvor begge forbindelser har 5 det samme antal plaquer pr. kultur men sidstnævnte forbindelse udviser disse værdier ved en koncentration, der er 1,5 logenheder lavere. (Fra andre undersøgelser, der vil blive omtalt i det følgende, viser resultatet for 7-ethy 1-8-oxogua-nosin sig at være unormalt højt).

10 Forøgelsen af PFC/kultur, der er praktisk talt nul ved anvendelse af 7-decyl-8-oxoguanosin (23894), giver basis for en R^—gruppe, der har en kædelængde, der er mindre end længden af en decylgruppe.

Resultaterne i tabel VI er opnået på samme måde som 15 resultaterne i tabel V, idet dog immunstimulanterne ifølge tabel VI bærer forskellige andre substituenter på ribosyl-delens hydroxylgrupper og nogle ringstillinger.

Tabel VI

Adiuvanticitetsundersøaelser med yderligere ribosvl-substitution 20 i det murine system1

Spidsværdier for Spidskoncen- direkte anti-SRBC 25 Forbindelse2 tration3 PFC/kultur_ 23083 10"4 21501250 (15) 30 7a8MGuo 3XlO“5 18671150

Tabel VI

Adiuvanticitetsundersøqelser med yderligere ribosvl-substitution i det murine system1 DK 170779 B1 36 5

Spidsværdier for Spidskoncen- direkte anti-SRBC Forbindelse2 tration3 PFC/kultur_ 10 23287 10“4 16501634 (18) 16751298 15 8BrGuo 3xl0“4 1167168 633 196 20 23351a 10“4 14311134 (21) 25 23314b 10“5 243 119 (19) 30 23350° 10“5 45 18 (20) 35 7a8MGuo 3xl0“5 1850150a 3xl0“4* 925 180b 3xl0“5 19751109° 40 22360 10“5 743 1485 45 (22) 8MGUO 3X10"4 527 125 50 -—- 21 3 jævnfør noterne 1, 2 og 3 i tabel V, idet det dog skal bemærkes, at 7-substituentnavnet er udeladt på grund af tilstedeværelsen af andre substituenter på forbin- DK 170779 B1 37 delserne, således at en mulig forveksling med tilsyneladende tilsvarende angivelser i andre tabeller undgås.

4 Der gennemføres to undersøgelser, idet det første tal af hvert par har relation til en første undersøgelse, 5 og det andet tal i hvert par har relation til en undersøgelse nr. 2.

5 Den viste værdi viser sig at være unormalt lav i betragtning af andre data opnået her, f.eks. jvf. tabel VIII.

a,b,c Hver af forbindelserne 23351, 23314 og 25350 10 sammenlignes med 7a8MGuo i separate undersøgelser. Resultaterne fra hver undersøgelse er mærket med "a", "b" eller "c" efter den anvendte forbindelse.

* Ved undersøgelsen "b" er der anvendt en overoptimal mængde 7a8MGuo.

15

Resultaterne i tabel VI illustrerer, at en guanosin substitueret i 7- og 8-stillingerne som beskrevet tidligere også kan være virkningsfuld, såfremt dens ribosyl-hydroxyl-grupper bærer substituenter. Således udviser en 7-allyl-8-20 thioxoguanosin, hvis 2'- og 3'-hydroxylgrupper er bundet i en isopropylidenring (23083), en aktivitet, der i alt væsentligt er identisk med aktiviteten for 7a8oGuo, omend ved en koncentration, der er ca. ½ logenhed højere. Tilsvarende udviser også 5' -acetylesteren af det ovenfor anførte isopro-25 pylidenderivat (23287) en største adjuvanticitet, der er ca. to gange adjuvanticiteten udvist af 8-bromguanosin (8BrGuo), hvis største aktivitet er ved en koncentration, der er ca. ½ logenhed højere.

Et lignende resultat fås, når 5'-acetyl (acetoxy) 30 gruppen erstattes af en benzoyl (benzoxy) gruppe (23351).

Det er interessant, at når der adderes en yderligere benzo-ylgruppe til forbindelsen 23351 ved aminogruppen i 2-stillingen, er den resulterende forbindelse (23350) i alt væsentligt inaktiv ved de ved undersøgelserne anvendte koncentrationer.

35 Når alle tre 2'-, 3'- og 5'-hydroxylgrupper på ribo- syldelen acetyleres (forbindelse 22360), opretholder forbin- DK 170779 B1 38 delsen sin høje aktivitet. Resultaterne vist i tabel VIII viser, at denne tri-O-acetyl-forbindelse er blandt de mest aktive af alle de undersøgte forbindelser, især ved lave koncentrationer.

5 Resultaterne vist i tabel VII er opnået på samme måde som ovenfor men ved anvendelse af humane lymphocyter.

Ved nogle af disse undersøgelser er der anvendt lymphocyter fra mere end ét individ, og disse er derfor rapporteret med flere angivelser.

DK 170778 B ,

1 -3ET-· VII

Ad~avanticitetsunderza&l ser i det huiaane sys-ce::.1

Spidsværdi for

5 Spids- rirekrt: anti-SRBC

Forbindelse2 koncentrat;.cn3 PFC/kir" tur 7a£c.'3uo 10"4 3 038±2S8a 3X10”4 9250±lC10b 20 IC-4 4£31±270c 7bSo£ r c 1C":; 1250112 19“ 3 83010" 10~3 122511 .

15 ---- 22312 3>:10“4 &25a (22, 2::3.0-5 6008b i'"4 5050° 2 3 7a8K: 3x10”4 ό 7 3a 10“4 . *Ί5: :0“4 3 05c 7a8o3rc 2x10"" 4 7 7r 25 3x10" 10.3 10”4 4413c 7nEctuo 10“3 528a 10"3 2 97b 3C 10“: 263° 7m8oSuo 3x10 5 L· 7 7 5114 23643 3xl0“4 904ir310 (ethyl; 6) 35 7a8oGuo 3xl0”4 11.9381762 22644 3XlO“4 12.2381150 'butyl; 2^ TABEL VII (fortsat)

Adiuvanticitetsundersoaelser i det humane system1 DK 170779 B1 40

Spidsværdi for

5 Spids- direkte anti-SRBC

Forbindelse2 koncentration3 PFC/kultur 23369 3xl0"4 2204+370 (7-allyl-S-10 selenoxo; 10) 23644 3xl0~4 33711120 (butyl? 2) 23679 3xl0“4 31291252 (butenyl? 3) 15 7a8oGUO 3xlO”4 40791102 22827 3Xl0”4 25771300 (cinnamyl? 11) 20 7a8oGuo 3xl0“4 7075+260 7m8oGuo 10“3 780+142 25 1/2,3 jfr# noterne 1, 2 og 3 i tabel V, bortset fra at navnet på 7-substituenten er udeladt, hvor der også forekommer substituenter på sukkerringen. a,b,c Forbindelser er sammenlignet, idet der er anvendt lymphocytpræparater fra tre personer betegnet 30 a, b og c. Sammenligningerne mellem forbindelserne er derfor sket indenfor et bestemt lymphocytpræparat. Resultaterne mærket "a" er sammenlignet indbyrdes, ligesom resultaterne mærket "b" og "c".

DK 170779 B1 41

Resultaterne i tabel VII viser igen en forøget virk-ningsfuldhed af forbindelser ifølge opfindelsen sammenlignet med 7-methyl-8-oxoguanosin i det humane system. Resultaterne illustrerer også en preference for 7-stillingssubstituenter, 5 der har en kædelængde, der er kortere end en hexylgruppe. Selvom 7-cinnamyl-8-oxoguanosin (22827), som er længere end en hexylgruppe, er forholdsvis aktiv i forhold til 7m8oGuo, er den således væsentligt mindre aktiv end 7a8oGuo.

Ligheden i adjuvanticitet af 7a8oGuo, 7-butyl-8-oxo-10 guanosin (23644) og 7-(2-butenyl)-8-oxoguanosin (23679), hvor alle 7-substituenterne er kortere end en hexylgruppe og længere end en ethylgruppe, er også vist i tabellen. Tilsvarende ses en forstærket adjuvanticitet af forbindelser med en 7-substituent, der er længere end en ethylgruppe, 15 ved sammenligning af adjuvanticiteten af 7-ethyl-8-oxoguano-sin (23643) med adjuvanticiteten af både 7a8oGuo og 7-butyl--8-oxoguanosin (23644).

Adjuvanticitetsforskellene mellem særligt foretrukne forbindelser ifølge opfindelsen, hvis R^-grupper er længere 20 end ethyl og kortere end hexyl, og hvis ribosylgrupper er usubstituerede, og 7m8oGuo og 7-ethyl-8-oxoguanosin fremgår af resultaterne i tabel VIII. Disse resultater er fremkommet ved en større, enkel undersøgelse udført ved anvendelse af murine lymphocyter og ni guanosinderivater, hvor guanosin-25 derivatet bringes i kontakt med lymphocyterne ved de relativt lave koncentrationer, der er ønskelige ved deres anvendelse. Resultaterne er vist i tabel VIII.

DK 170779 B1 42

TABEL VIII

Undersøgelser af adiuvanticitet ved lave koncentrationer i det murine svstem1 5 Direkte anti-SRBC PFC/kultur ved 3;

Forbindelse2 7,5xlO"6M 1x10"5M

23924 (hexyl; 4) 103 243 7m8oGuo 128 145 10 23644 (butyl; 2) 292 900 23643 (ethyl; 6) 313 270 23679 (2-butenyl; 3) 383 612 24069 (propyl; 5) 793 1306 7a8oGuo 1028 1387 15 7a8MGuo 1130 1049 22360 (22) 1391 1176

Kontrol (antigen men uden nucleosid) 57 20 l'2 Jfr. noterne 1 og 2 i tabel V dog ikke med hensyn til forbindelsen 23360 (7-allyl-8-thioxo-2',3',5'--triacetoxyguanosin).

3 Koncentrationer af forbindelser i mol pr. liter (M) .

25

En gennemgang af tabel VIII viser, at 7-hexyl-8-oxo-guanosin (23924) er ca. lige så aktiv som 7m8oGuo ved den lavere koncentration og ca. 2 gange så aktiv ved den højere koncentration. 7-butyl- (23644), 7-ethyl- (23643) og 7-(2-30 -butenyl)-8-oxoguanosinerne er alle mindst ca. dobbelt så aktive som 7m8oGuo ved den lavere koncentration, idet 7--butyl- og 7-(2-butenyl)-8-oxoguanosinerne udviser ca. 100 til ca. 200%'s større adjuvanticitet i forhold til 7-ethyl--8-oxoguanosin ved den højere koncentration.

35 7-propyl-8-oxoguanosin (24069) og 7a8oGuo såvel som 7a8MGuo og dens 2',3',5·-triacetylderivat (22360) er alle flere gange mere aktive som adjuvanser end 7-ethyl-8-oxo- DK 170779 B1 43 guanosin og endnu mere aktive, når de sammenlignes med 7m8oGuo.

En afbildning af værdien (PFC-kontrol PFC) pr. μιηοΐ fra tabel VIII for de 7-substituerede 8-oxoguanosiner ved 5 den højere koncentration i tabellen mod længden af den længste carbonatomkæde i substituenten, idet det antages, at allyl er lidt længere end propyl, og af 2-butenyl er lidt længere end butyl, er vist i fig. 5, og denne illustrerer relationen mellem adjuvanticitet og kædelængde. Som det 10 ses, topper adjuvanticiteten ved en kædelængde på mellem ca. 3 og ca. 4 carbonatomer, idet der udvises en væsentligt lavere aktivitet af substituenter, der er kortere end 3 carbonatomer, dvs. methyl og ethyl. Hexylsubstituenten udviser en aktivitet, der svarer til aktiviteten for methyl-15 og ethylgrupperne.

Disse resultater, der viser, at der er en tilsyneladende relation mellem struktur og aktivitet baseret på den omtrentlige kædelængde af 7-substituenten, er ganske overraskende. R. Gallo i Progress in Physical Organic 20 Chemistry, bind 14, R. Taft (udg.), John Wiley & Sons, New York (1983) side 115-163 diskuterer kvantitative struktur/-aktivitetsrelationer og rapporterer om flere fri energi--relationer i biologiske systemer, der er lineære under anvendelse af Taft-Es-parameteren. Es-parameteren siges at 25 give steriske effekter en relativ fri energi.

F.eks. er det anført af Gallo, at andre har beskrevet en lineær Es-korrelation for acylering og deacylering af a--chymotrypsin, metabolismen af primære alkoholer til glu-curonider i kaniner, amphetaminers lokomotoraktivitet i 30 mus, ved hæmning af cholinesterase med diethylsubstituerede phenylphosphater, ved phenoxyethylcyclopropylaminmonoamin-oxidasehæmmere og ved diphenylhydraminantihistaminer såvel som ved virkningen af tuberkulostatiske medikamenter af isonikotinsyrehydrazidtypen (jfr. Gallo side 125).

35 Det kunne således forventes, at der ville være en lignende korrelation for 7-substituenterne i en guanosin i DK 170779 B1 44 den foreliggende situation ved anvendelse enten af Es eller dens korrelative steriske parameter v, der sige at være baseret på Van der Waals radier og er udviklet af Charton, J. Am. Chem. Soc., 97, 1552-1556 (1975). Men en undersøgelse 5 af υ- og Es-værdier for ligekædede 7-carbonhydridsubstituen-ter, såsom propyl, butyl, pentyl og octyl, viser at υ-værdierne alle er 0,68 for disse substituenter, medens Es-vær-dierne er -0,36, -0,39, -0,40 og -0,33. Det er klart, at PFC/kulturresultaterne fra tabel VIII ved sammenstilling 10 med enten v eller Es ikke ville være lineære, og at der ikke ville forekomme nogen korrelation mellem resultaterne og disse steriske parametre.

Det bemærkes yderligere, at Charton (J. Org. Chem., 41, 2217-2220 (1976)) også har rapporteret en u-værdi på 15 0,68 for de ligekædede Cg-, C^-, ci3"/ c15" °9 C^-alkyl- grupper, hvilket ville medføre, at en 7-butylgruppe og en 7-decylgruppe skulle give samme PFC/kultur, såfremt den her undersøgte adjuvanticitet kunne korreleres, som det er tilfældet med andre tidligere omtalte biologiske processer.

20 Men selvom der foretages en sammenligning af 7-decyl-8- -oxoguanosin (23894), som ikke i væsentligt omfang udviser adjuvanticitet, med de moderat aktive 7-ethyl- og 7-hexyl--8-oxoguanosinderivater (23643 og 23644) i tabel V, hvis i>--parametre er hhv. 0,56 og 0,73, er det igen meget klart, 25 at adjuvanticiteten, der forstærkes med en forbindelse ifølge opfindelsen, ikke korrelerer med v eller dens korrelative Es-parameter, og at adjuvanticiteten heller ikke kan forudsiges af nogen af disse parametre.

En anden uventet egenskab ved de foretrukne forbin-30 delser, dvs. hvor R1 er længere end ethyl og kortere end hexyl, og hvor ribosylgruppen er usubstitueret, er, at dosis--reaktionskurven er bredere nær ved spidskoncentrationen, end det er tilfældet for en lignende kurve fremkommet på basis af 7m8o6uo. Denne udvidede reaktion ses ikke af de 35 ovenfor anførte tabeller med enkelte værdier.

I nogle tilfælde forekommer denne udvidelse mod kon- DK 170779 B1 45 centrationer, der er lavere end spidskoncentrationen, og i andre tilfælde forekommer den ved koncentrationer, der er højere end spidskoncentrationen. Denne tilsyneladende skævhed i dosis-reaktionskurverne er højst sandsynlig en funktion 5 af forskellige koncentrationer af nucleosid anvendt i undersøgelserne i 0,5 logenheder.

Uanset grunden til denne tilsyneladende skævhed i dosis-reaktionskurverne kan der fås et mål for den relative bredde ved at summere det gennemsnitlige antal plaquer (PFC/-10 kultur), der findes med 0,5 logintervaller indenfor én logkoncentrationsenhed af spidskoncentrationen inkl. PFC/kultur--værdien ved spidskoncentrationen. Den fremkomne sum divideres derpå med 3 (antallet af opsummerede værdier), således at der fås en gennemsnitlig 1 log plaqueværdi. Denne gen-15 nemsnitlige 1 log plaqueværdi kan således fås ud fra den gennemsnitlige spidsværdi plus gennemsnitlige værdier 0,5 logenheder på begge sider af spidskoncentrationen eller ud fra den gennemsnitlige spidsværdi plus de gennemsnitlige værdier, der fås fra koncentrationen 0,5 logenheder over og 20 1 logenhed over (eller 0,5 logenheder under og 1 logenhed under) spidskoncentrationen. Gennemsnitlige plaqueværdier udvælges, således at de giver den største sum, og baggrundsværdien, hvor SRBC alene er til stede, trækkes fra hver værdi, inden den summeres. Hver værdi divideres med antal 25 μιηοΐ nucleosid i kulturen, og de tre største værdier, der fås i 1 log området, summeres og divideres roed 3, hvilket giver den gennemsnitlige 1 log værdi pr. μπιοΐ.

Når beregninger som de ovenfor anførte udføres, og gennemsnittet af disse beregnet, for forskellige iøvrigt 30 ikke-beslægtede undersøgelser under anvendelse af et specielt guanosinderivat, viser det sig, at de gennemsnitlige 1 log plaqueværdier pr. μιηοΐ for de foretrukne forbindelser ifølge opfindelsen er meget større end værdien for 7m8oGuo. Disse forskelle i værdier findes, når data både fra humane og 35 murine lymphocytsystemer undersøges. Repræsentative værdier er illustreret i tabel IX.

DK 170779 B1 46

TABEL IX

Gennemsnitlige 1 log placrueværdier1

Forbindelse2 Murint3 Humant3 5 7a8oGuo 98.237142.041 22.64014187 24234 110.777142.823 (benzyl; 23) 10 7a8MGU0 326.8401170.907 45.630128.808 7m8oGuo 22.35915154 8671217 23644 118.886+80.092 52.397* 15 (butyl? 2) 23679 52.332* (2-butenyl; 3) 20 22360 53.695128.444 38.508126.802 (22) 1 Værdier fås som beskrevet ovenfor.

2 Jfr. note 2 i tabel I.

25 3 Murint = murint lymphocytsystem som beskrevet for tabellerne I, IV, V, VI og VIII. Humant = humant lymphocytsystem som beskrevet for tabellerne III og VII.

* Værdi fremkommet ved en enkelt undersøgelse.

30

En dosis-reaktionskurve kan være for smal og derved ikke give mulighed for passende dosering af en speciel modtager. F.eks. dataene for det humane system vist i tabel VII illustrerer forskelle på så meget som en faktor 3-10 35 (0,5 til 1 logenhed) i spidskoncentrationen af de forbin delser, der blev undersøgt, når lymphocytpræparater fra 3 forskellige individer blev sammenlignet. Såfremt dosis-reak-tionskurven er for smal, kunne en valgt dosis, som er sædvanlig for modtagere, generelt være for høj eller for lav 40 for en speciel modtager. Således giver de udvidede dosisreaktionskurver for de foretrukne forbindelser ifølge opfindelsen en yderligere fordel sammenlignet med 7m8oGuo. Dataene DK 170779 B1 47 anført i tabel IX viser, at de gennemsnitlige 1 log pla-queværdier i det humane system er ca. 25 til ca. 60 gange større for de foretrukne forbindelser end for 7m8oGuo.

En yderligere struktur/aktivitetsprofil i lighed med 5 formen på den profil, der er vist i fig. 5, kan fås ved anvendelse af spidsværdier for PFC/kultur for samme guano-sinderivat og yderligere derivater fra forskellige undersøgelser. I dette tilfælde anvendes der en enkelt spidsværdi for PFC for hver undersøgelse. Denne værdi fås ved at divi-10 dere de opnåede PFC/kulturværdier med antallet af μπιοί guano-sin, der er til stede ved undersøgelsen, som giver PFC-vær-dien, efter subtraktion af baggrundsværdien for plaquer fra en kontrol fra undersøgelsen. Derpå beregnes gennemsnittet af de således fremkomne spidsværdier for hver undersøgelse 15 under anvendelse af en given forbindelse for at formindske udsving i reaktion fra undersøgelse til undersøgelse, der som bekendt er forekommet tidligere.

En sammenstilling af sådanne gennemsnitlige spidsværdier for det murine system er vist i fig. 6, hvis abscis-20 seværdier bestemmes på samme måde som ved fig. 5. De i fig.

6 viste gennemsnitlige spidsværdier er ikke så præcise som værdierne vist i fig. 5 på grund af reaktionsudsving iagttaget mellem de forskellige undersøgelser, der er anvendt for at få disse data. Desuden er flere punkter på grafen et 25 resultat af enkelte undersøgelser eller to undersøgelser, der giver vidt forskellige resultater. F.eks. viser den gennemsnitlige spidsværdi for 7-butyl-8-oxoguanosin (23644) fremkommet ud fra to meget forskellige spidsværdier sig at være unormalt høj i betragtning af dataene i tabel VIII for 30 det murine system og tabel VII for det humane system. Således viser det sig, at den carbonhydridsubstituent, der giver den største spidsværdi for PFC/kultur, er en substituent med 1-2 carbonatomer mere i fig. 6 end i fig. 5. Alligevel er tendensen i struktur/aktivitetsrelationen vist i grafen 35 på fig. 6 i alt væsentligt lig med graden vist i fig. 5, hvis data antages at være præcise og direkte sammenlignelige, DK 170779 B1 48 hvorved man kan fæste lid til resultaterne vist i fig. 6.

De i alt væsentligt ens resultater viser, at R*-grupper, der er længere end ethyl men kortere end ca. hexyl, giver en væsentligt, og uforudsigeligt, forøget adjuvanticitet 5 sammenlignet med 7m8oGuo.

Ikke blot udviser 7a8oGuo en uventet høj adjuvan-ticitet ved en lavere spidskoncentration end 7m8oGuo, foruden at den udviser en udvidet dosis-reaktionskurve, men 7a8oGuo er også uventet mere opløselig i humant urin end 7m8oGuo.

10 Denne uventede høje opløselighed i urin er i strid med den forudsagte opløselighed i vand baseret på beregnede π-kon-stantværdier. Urin anvendes ved opløselighedsundersøgelser, idet forbindelser ifølge opfindelsen overvejende udskilles via urinen fra de dyr, som indgives disse forbindelser.

15 Uopløselighed i urin kan føre til udfældelse af forbindelsen i nyren med derpå følgende beskadigelse af dette organ.

jr-konstantværdier er et mål for relativ opløselighed i 1-octanol og i vand bestemt ved fordelingskoefficienter mellem de to opløsningsmidler, jr-konstantværdien siges at 20 være den valgfrie parameter ved korrelering både af binding til biologiske makromolekyler og transport gennem et biologisk system, jfr. Norrington et al., J. Med. Chem., 18, 604 (1975).

ff-konstantparametrene er udviklet af Leo og Hansch 25 og deres medarbejdere, jfr. f.eks. Leo et al., Chem. Rev., 71, 525 (1971) og C. Hansch og A. Leo, Substituent Constants for Correlation Constants in Chemistry, Wiley Interscience,

New York, 1979.

En r-konstantværdi, sædvanligvis vist ved anvendelse 30 af det græske bogstav (ir), beregnes ud fra ligningen:

w « log Px - log PH

hvor Px er fordelingskoefficienten for den pågældende for-35 bindelse, og Pjj er fordelingskoefficienten for den tilsvarende usubstituerede forbindelse. Når man har fået en række DK 170779 B1 49 π-konstantværdier fra en gruppe substituenter for iøvrigt beslægtede forbindelser, kan de anvendes på andre, ikke--beslægtede forbindelser med de samme substituenter, uden at det er nødvendigt at udføre fordelingsundersøgelser for 5 disse ikke-beslægtede forbindelser. Hydrogen som substituent tildeles en værdi på nul.

Som det kan bestemmes ved undersøgelse af den ovenfor anførte ligning, fører substituenter, der giver større opløselighed i vand, til π-konstantværdier, der er relativt 10 mere negative. Omvendt fører substituenter, der giver større 1-octanol-opløselighed, til π-konstantværdier, der er relativt mere positive.

π-konstantværdier fundet i den ovenfor anførte litteratur af Hansch og Leo er 0,56 for en methylgruppe og 15 1,10 for en allylgruppe. Således kan det forudsiges, at en forbindelse med en allylgruppe er mere opløselig i 1-octanol end en tilsvarende forbindelse, der bærer en methylgruppe. Omvendt ville man forvente, at tilstedeværelsen af en methylgruppe på en given forbindelse ville føre til større vand-20 opløselighed for denne forbindelse sammenlignet med en tilsvarende forbindelse med en allylgruppe i stedet for methyl-gruppen.

Ved at anvende LSE-optionen i ChemLab computerprogrammet til beregning af log P-værdier ud fra de ovenfor anførte 25 π-konstantværdier og derpå beregne π-konstantværdierne for 7m8oGuo og 7a8oGuo, viser det sig, at værdierne for log Px er hhv. -8,43 og -7,46, hvor x er hhv. methyl eller allyl. Computerprogrammet anvender formalismen ifølge R. F. Rekker,

The Hydrophobic Fragment Constant, Elsevier, New York (1977).

30 Igen forudsiger anvendelse af π-konstanten således en større vandopløselighed for 7m8oGuo end for 7a8oGuo.

Når der udføres opløselighedsundersøgelser i human urin for 7m8oGuo og 7a8oGuo, fås der opløseligheder på hhv.

4,88 mg/ml og 16,3 mg/ml. Således har 7a8oGuo en opløselig-35 hed, der er 3 gange større end opløseligheden af 7m8oGuo, men ud fra en π-konstantanalyse var det forudsagt, at den DK 170779 B1 50 skulle være mindre opløselig. Opløseligheder i urin kunne forventes at være lavere end opløseligheder for vand på grund af det relativt højere saltindehold i urin end i vand.

Der er ikke gennemført en π-konstantanalyse for 5 7a8MGuo eller andre forbindelser ifølge opfindelsen. Den ovenfor anførte opløselighedsundersøgelse under anvendelse af human urin omfattede 7a8MGuo, og denne forbindelse viser sig at være relativt uopløselig (0,30 mg/ml), som det kunne forventes ud fra tilstedeværelsen af dens svovlatom.

10 De ovenfor anførte opløselighedsundersøgelser blev gennemført ved at omryste overskud af hver forbindelse i human urin ved 37*C i et tidsrum på ca. 18 timer. Prøvebeholderne blev gennemluftet med argongas inden sammenblandingen. Hver prøve filtreres gennem et filter med en porestør-15 relse på 5 μιη, fortyndes efter behov med den mobile fase anvendt ved HPLC, hvorpå der kvantificeres ved hjælp af HPLC.

D. T-Celleerstattende aktivitet

De her omhandlede præparaters evne til at erstatte 20 T-celler i antistofreaktionen mod et T-afhængigt antigen er illustreret i fig. 1. I dette tilfælde dyrkes B-celler frembragt in vitro ved behandling med monoklonalt anti-thy 1,2 plus komplement, med eller uden SRBC som antigen, i nærværelse af præparater indeholdende trinvis stigende kon-25 centrationer af 7a8oGuo.

Dataene i fig. 1 illustrerer, at under disse betingelser reagerer isolerede B-cellekulturer dårligt på antigen, medmindre de er suppleret med 7a8oGuo. Den 7a8oGuo modulerede reaktion er dosisafhængig såvel som antigenafhængig. Desuden 30 kan denne reaktion ikke tilskrives ikke-specifik polyklonal aktivering af B-celler, fordi udeladelse af antigen formindsker reaktionen mærkbart (stiplet linie). Reaktionen for normale miltceller på SRBC ligger i området fra ca. 200 til ca. 600 PFC pr. kultur.

35 Dataene i fig. 1 illustrerer, at kontaktering af B- -celler in vitro med et præparat ifølge opfindelsen giver DK 170779 B1 51 et T-cellelignende signal til de kontakterede celler. Disse resultater viser også, at resultatet er antigen-specifikt og dos isafhængigt med hensyn til guanosinnucleos idderivatet.

5 E. In vitro rekonstitution af den primære humorale immun- peaKtion B-cellerne, der ligger til grund for dataene i fig.

1, er immunkompetente og fås fra CBA/CaJ mus. CBA/N mus har en primær B-celleimmundefekt knyttet til x-chromosomet (x-10 -bundet) og kan derved tjene som murin model for immundefekter knyttet til kønnet.

CBA/N stammen antages at være utilstrækkelig med hensyn til den funktionelle aktivitet af en subpopulation af fuldt udviklede B-lymphocyter, der bærer Lyb 3/5/7 anti-15 generne. Der henvises til Huber et al., J. Exp. Med., 145, 1 (1977), Ahmed et al., J. Exp. Med., 145, 101 (1977) og

Subbaro, J. Immunol., 122, 2279 (1979).

Kulturer af miltceller fra homozygotiske CBA/N han-og hunmus samt hanmus, der er heterozygotiske med hensyn 20 til CBA/N genet, kaldet xid-genet (hanmus bærer x-chromosomet) , fremstilles som beskrevet senere i beskrivelsen. 0,1 ml 0,1% (v/v) SRBC suspension alene eller SRBC suspension plus trinvis stigende mængder 7a8oGuo sættes til kulturerne, idet der anvendes 5 x 106 celler/ml. Direkte anti-SRBC pla-25 guedannende kulturer pr. kultur bestemmes efter 4 dages dyrkning.

Resultaterne af denne undersøgelse, hvor celler fra CBA/N mus sammenlignes med et præparat af miltceller fra CBA/CaJ mus, er vist i fig. 2. Det fremgår af fig. 2, at 30 ved en koncentration af guanosinderivat på nul, forekommer der praktisk talt ingen reaktion sammenlignet med ca. 250 PFC/kultur for de immunkompetente CBA/CaJ celler.

Det fremgår yderligere af figuren, at både de immunkompetente CBA/CaJ celler og de oprindeligt immuninkom-35 petente CBA/N celler bliver gjort i stand til at producere ca. det samme antal PFC/kultur i nærværelse af 7a8oGuo. Det DK 170779 B1 52 er overraskende, at der fås tilsvarende værdier ved at bringe cellerne i kontakt med præparater med en forskel i koncentration på kun 0,5 logenheder af 7a8oGuo, 10"5M mod 3 x 10"5M for hhv. CBA/CaJ og CBA/N celler.

5 Dataene i fig. 2 illustrerer derved, at ved at bringe til x knyttet immundefekte splenocyter i kontakt med et præparat ifølge opfindelsen kan disse iøvrigt immundefekte cellers primære humorale immunreaktion mod SRBC rekonstitueres.

10 Immundefekter i mus såvel som andre pattedyr kan skyldes alder eller alderdomssvækkelse såvel som genetiske defekter som anført ovenfor i forbindelse med fig. 2. Således kan dyr, der har været immunkompetente som unger eller som fuldt udvoksede dyr, kan blive immundefekte, når de bliver 15 gamle. Dette er tilfældet for den indavlede CBA/CaJ musestamme .

En yderligere undersøgelse af rekonstitutionen af en primær humoral antistofreaktion mod SRBC gennemføres ved at anvende miltceller fra alderdomssvækkede, 156 uger gamle, 20 CBA/CaJ mus, der er blevet immundefekte på grund af alder.

In vitro reaktionerne fra disse miltceller mod SRBC ved en plaquedannelsesanalyse sammenlignes med lignende reaktioner fra en anden gruppe af sunde udvoksede, 8 uger gamle CBA/CaJ mus. Denne sammenligning gennemføres som beskrevet tidligere 25 i forbindelse med fig. 2, igen ved anvendelse af et præparat indeholdende 7a8oGuo til kontaktering af splenocyterne. Resultaterne fremgår af fig. 3.

Som det ses af fig. 3, er PFC/kultur for kontroller med sunde udvoksede mus med SRBC men uden guanos inder ivat 30 flere gange større end antallet dannet i fravær af både SRBC og guanosin. PFC/kultur for kontroller for alderdomssvækkede mus er som forventet for sådanne mus, idet antallet er ca. det samme i begge tilfælde og større sammenlignet med antallet for sunde udvoksede mus. Disse relativt høje og 35 ens reaktioner antages at skyldes dannelsen af autoantistof producerende kloner.

DK 170779 B1 53

En yderligere undersøgelse af figuren viser en guano-sinderivat-dosis-relateret reaktion mod SRBC i nærværelse af både 3 og 10 μιηοΐ (μΜ) koncentrationer af 7a8oGuo. Denne reaktion iagttages både for immunkompetente sunde fuldt 5 udviklede splenocyter og de tidligere immundefekte, men nu med hensyn til primær humoral reaktion rekonstituerede alderdomssvækkede splenocyter.

Resultaterne i fig. 3 illustrerer derved, at kontakte-ring af immundefekte alderdomssvækkede splenocyter med et 10 præparat ifølge opfindelsen kan rekonstituere denne defekte immunreaktion. Dataene i figurerne 2 og 3 illustrerer denne rekonstitution både i immundefekter, der har relation til x-chromosomet og til alderdom.

15 F. In vivo antistofreaktioner CBA/CaJ mus immuniseres intraperitonealt (i.p.) ved anvendelse af et konjugat (TNP-BSA) fremstillet ved omsætning af 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre (TNBS) og kvægserumalbumin (BSA) i en 0,28 molær cacodylat puffer ved en pH-værdi på 20 6,9. Hvert dyr modtager en intraperitoneal (i.p.) injektion indeholdende 50 μg af det immuniserende konjugat. Derpå modtager den ene gruppe af mus (indenfor ca. 30 minutter) en anden i.p. injektion, der indeholder 7a8MGuo enten i 100% sesamfrøolie eller et vandigt præparat indeholdende 2 25 rumfangsprocent sesamolie sonisk behandlet med saltvand. Hvert dyr modtager 0,2 ml af præparaterne, hvis koncentrationer hver især er 5 mg/ml 7a8MGuo. En tredie gruppe af mus modtager immuniseringen men intet præparat ifølge opfindelsen og tjener som kontrol. Anti-TNP-BSA antistofsekre-30 tionen fra hver gruppe overvåges derefter i et tidsrum på 37 dage ved enzymanalyse (ELISA) teknikker under anvendelse af TNP-BSA som antigen.

Resultaterne af denne undersøgelse fremgår af fig. 4 og er vist som et forhold mellem ELISA antistoftitrene opnået 35 ved anvendelse af et af de 7a8MGuo-holdige præparater og kontroltiteren. Som det fremgår af fig. 4 bevirker anvendelse DK 170779 B1 54 af et præparat indeholdende 7a8MGuo, at anti-TNP-BSA antistof titerne bliver større end kontrollerne fra den første dag, hvor titerne måles (dag 9 efter indgift) og til afslutningen af undersøgelsen (37 dage efter indgift).

5 En ting, der ikke fremgår af fig. 4, er, at kontrol antistof niveauet topper ca. 2 uger efter indgift og begynder derpå at aftage. I modsætning hertil stiger antistoftiterne for dyr, der har modtaget 7a8MGuo, over ca. 2 uger efter indgift og forbliver derpå på ca. samme forhøjede niveau 10 under resten af undersøgelsen. Efter datapunkterne taget 2 uger hen i undersøgelsen illustrerer dataene i fig. 4 således den relative konstans af antistoftiterne efter indgift af 7a8MGuo og de faldende titere for kontrollerne.

15 G. T-hi ælnercelleaktiverinq T-lymphocyter aktiveret med fremmede eller modificerede egne hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) determinanter antages at repræsentere afgørende effektorceller involveret i reguleringen af egen integritet. Allotransplan-20 tationsafstødning og udskillelse af viralt eller kemisk ændrede egne strukturer repræsenterer kliniske eksempler på denne forsvarsmekanisme. T-celleproliferation i nærværelse af et alloantigen kan give en korrelation til T-hjælper-aktivitet og dens forstærkning, jfr. Pobor et al., Scan. J.

25 Immunol. 18, 207-215 (1983). Der udføres derfor T-cellepro-liferationsundersøgelser i nærværelse af et alloantigen og desuden i nærværelse eller fravær af et guanosinderivat ifølge opfindelsen, og resultaterne diskuteres i det følgende .

30 Ved bedømmelsen af virkningen af et guanosinderivat på allogenantigen- fremkaldt proliferation, er det meget nødvendigt at formindske B-cellers samtidige mitogene reaktion på kontakt med et guanosinderivat. Miltceller fra SJL mus (hvis B celler er hyporeaktive overfor den mitogene 35 virkning af et guanos inder i vat men ikke overfor dets ad-juvansaktivitet) anvendes som reaktionsceller ved to under- DK 170779 B1 55 søgelser. Disse reaktionsceller stimuleres med bestrålede allogene celler (fra CBA/CaJ mus) uden tilsat nucleosid og med trinvis stigende mængder guanosinderivat ifølge opfindelsen, 7M8oGuo, eller et andet guanosinderivat, 8MGuo, 5 anvendt som positiv kontrol.

Ved en tredie og fjerde undersøgelse anvendes der thymocyter fra CBA/CaJ mus som de stimulerede celler (reaktionsceller) og bestrålede BDF^ musemiltceller som stimulatorceller. Til disse undersøgelser anvendes der to guanosin-10 derivater ifølge opfindelsen, 7a8MGuo og 7a8oGuo, idet 8MGuo tjener som positiv kontrol ved den ene af undersøgelserne.

Thymocyter er i vid udstrækning ikke færdigudviklede T-celler, der ikke reagerer kraftigt på allogene celler.

Men i nærværelse af interleukin-2 (IL-2) udvikler disse 15 celler en reaktivitet overfor allogenstimulering. Ved disse undersøgelser anvendes der derfor thymocyter i nærværelse af en costimulerende mængde IL-2.

Resultaterne af de fire T-celleproliferationsunder-søgelser fremgår af tabel X. Hver enkel af disse undersøgel-20 ser anvender separate cellepopulationer, således at resultaterne bedst sammenlignes indenfor hver enkel undersøgelse.

DK 170779 B1 56

TABEL X

T-Celleproliteration i blandede leukocvtkulturer1 Bestrålede 5 Reaktions- stimulator- [3H]TdR- celler2 celler3 Nucleosid4 optagelse5

Undersøgelse 1 SJL CBA/CaJ

10 splenocvter splenocvter + - - 21.6001900 + - 10“5(7a8MGuo) 36.70012400 + 1300150 10”5(7a8MGUo) 3001110 15 + + - 40.10012300 + + 10"5(7a8MGuo) 67.50012900 + + 10”3(8MGuo) 28.10012700

Undersøgelse 2 SJL CBA/CaJ

20 splenocvter splenocvter + - - 16.60011100 + - 10"5(7a8MGuo) 19.10011100 + 500130 10“5(7a8MGuo) 23001200 25 + + - 16.50011300 + + 10"5(7a8MGuo) 36.40013800 + + 10“3(8MGuo) 30.80011300

Undersøgelse 3 CBA/CaJ BDFi 30 thvmocvter sp3,.enpgyter + 3.100+300 + 300170 + + - 12.500190 + + 10”6(7a8MGuo) 11.8001400 35 + + 10“5(7a8MGuo) 15.3001600 + + 10“4(7a8MGuo) 21.40011200 + + 10“5(8MGUO) 15.60011000 + + 10“4(8MGUO) 13.80011000 DK 170779 B1 57 TABEL X (fortsat) T-Celleproliteration i blandede leukocvtkulturer1 Bestrålede 5 Reaktions- stimulator- [3H]TdR- celler2 celler3 Nucleosid4 optagelse5

Undersøgelse 4 CBA/CaJ BDFX

10 thvmocvter splenocvter + - - 780±70 + 300±60 + + - 5400±200 + + 10”6(7a8oGuo) 83001300 15 + + 10“5(7a8oGuo) 80001300 + + 10"4(7a8oGuo) 10.0001800 3 Plus-tegn (+) anvendes for at angive tilstedeværelsen af materialet anført i søjlehovedet i dyrknings-20 mediet, medens minus-tegn (-) anvendes for at vise, at et sådant materiale ikke forekommer i dyrkningsmediet. Detaljer vedrørende fremgangsmåderne og dyrkningsmedierne anvendt ved undersøgelserne fremgår af det følgende.

25 2 Celler, hvis proliferation er analyseret.

3 Allogene celler anvendt til costimulering af proliferation, efter at de har været bestrålet med 2500 rad.

4 Nucleosidkoncentrationerne er i molaritet ganget med 30 tallet i søjlen. Forkortelserne i parentes 7a8MGuo, 7a8oGuo og 8MGuo er som beskrevet tidligere.

5 [3H]TdR-optagelse i tælletal pr. minut.

De i tabellen viste resultater illustrerer, at kon-35 taktering af T-celleholdige reaktionspopulationer med et præparat ifølge opfindelsen i nærværelse af allogene stimulatorceller bevirker en forstærket proliferation af disse reaktionsceller. Denne fremkaldte T-celleproliferation er DK 170779 B1 58 større end den proliferative virkning, der er forårsaget af de allogene celler selv, når guanosinnucleosidderivatet ikke er til stede. Yderligere viser indbyrdes sammenligninger af de fundne virkninger ved anvendelse af en forbindelse 5 ifølge opfindelsen sammenlignet med en tidligere kendt forbindelse, 8MGuo, generelt en uventet forstærkning, når der anvendes en forbindelse ifølge opfindelsen.

Af de følgende eksempler vedrører eksempel 6, 7, 13, 14, 19 og 20 sammenligningsforbindelser, medens de øvrige 10 eksempler vedrører forbindelser ifølge opfindelsen.

A. Synteser

Eternal lm-

Generel fremgangsmåde til fremstilling af 7-carbonhydrid-15 substituerede 8-oxoguanosiner l-Amino-8-oxoguanosin (i det følgende forbindelse A) tjener som udgangsforbindelse for flere synteser under anvendelse af en totrinsmetode. Denne forbindelse fremstilles 20 i alt væsentligt ved fremgangsmåden beskrevet i Rizkalla et al., Biochim. Biophys. Acta., 195, 285-293 (1969).

Trin li

Til en opløsning af 9,5 g (30 mmol) af forbindelsen A i dimethylformamid (DMF) sættes der 33 mmol natriummethoxid 25 i 250 ml DMF. Reaktionsblandingen omrøres ved omgivelsestemperatur (ca. 18-22*C) i 30 minutter. 10 ml DMF-opløsning, som indeholder alkyleringsmidlet anvendt til dannelse af 7--substituenten i et lille molært overskud i forhold til forbindelsen A (f.eks. 33 mmol mod 30 mmol), tilsættes, og 30 den resulterende alkyleringsreaktionsblanding omrøres i ca.

16 timer ved en temperatur på ca. 20 til ca. 40*C.

Derpå fjernes opløsningsmidlet under formindsket tryk, og remanensen behandles med 150 ml destilleret eller afioniseret vand og 150 ml methylenchlorid. Det dannede 35 faste stof filtreres og omkrystalliseres fra et passende opløsningsmiddel, hvilket giver en l-amino-7-substitueret 8-oxoguanosin, som er slutproduktet i trin 1 af den sædvan- DK 170779 B1 59 ligvis anvendte totrinsmetode.

Trin 2;

Produktet fra trin 1 opløses derpå i koncentreret HC1 (f.eks. 4,65 mmol i 15 ml HC1), hvortil der sættes van-5 digt natriumnitrit (f.eks. 4,19 mmol i 5 ml vand) ved 0eC, hvorefter der omrøres i ca. 1 time. Det resulterende deamine-rede produkt udvindes derpå ved gængse krystallisationsteknikker, medmindre andet er angivet.

Fremstillingen af specifikke eksempler på forbindelser 10 under anvendelse af den ovenfor anførte totrinsmetode og andre metoder er beskrevet i det følgende ligesom andre synteser.

Eksempel 2: 15 7-Butyl-8-oxoguanosin (23644)

Idet totrinsmetoden ifølge eksempel 1 følges, og der som alkyleringsmiddel anvendes butyliodid, fås den ovenfor anførte forbindelse i et samlet udbytte på 15% som et hvidt 20 pulver med et smeltepunkt over 230°C.

NMR (DMS0-d6): S 10,8 (bs, IH), 6,4 (bs, 2H), 5,6 (d, J=5Hz, IH) .

IR (KBr): 1680, 1610 og 1510 cm-1.

Analyse beregnet for C14H2N5O5:

25 C Η N

47,32, 5,96, 19,71

Fundet: 47,03, 5,86, 19,56.

Eksempel 3: 30 7-(2-Butenyl)-8-oxoguanosin (23679)

Totrinsmetoden ifølge eksempel 1 følges, og som alky-leringsmiddel anvendes der 2-butenylbromid, hvorved den ovenfor anførte forbindelse fås i et samlet udbytte på 10% 35 som et hvidt pulver, smeltepunkt 167-170’C.

NMR (DMSO-d6) : S 10,7 (bs, IH), 6,4 (bs, 2H) , 5,4-5,6 (bs, 3H), 3,3 (bs, 3H).

DK 170779 B1 60 IR (KBr): 1690, 1650 og 1600 cm"1.

Analyse beregnet for C^HigNsOs-i^O:

C Η N

45,28, 5,70, 18,86 5 Fundet: 45,16, 5,61, 18,82.

Eksempel 4: 7-Hexyl-8-oxoguanosin (23924) 10 Totrinsmetoden ifølge eksempel 1 følges, og som alky ler ingsmiddel anvendes der hexyliodid, hvorved ovennævnte forbindelse fås i et samlet udbytte på 8% som et beigefarvet pulver, smeltepunkt 196-199°C.

NMR (DMSO-d6): S 10,8 (bs, IH), 6,5 (bs, 2H).

15 IR (KBr): 1680, 1640 og 1600 cm"1.

Analyse beregnet for C15H25N5O5:

C Η N

50,12, 6,57, 18,27

Fundet: 49,93, 6,52, 18,24.

20

Eksempel 5: 7-Propyl-8-oxoguanosin (24069)

En blanding af 1,0 g (2,9 mmol, eksempel 8), 7-allyl-25 -8-oxoguanosin, 100 mg 10% Pd/C og 100 ml ethanol omrøres ved stuetemperatur under en hydrogenatmosfære i 3 timer. Katalysatoren filtreres gennem en masse af "Celit" og vaskes med 100 ml ethanol. Det forenede filtrat koncentreres under formindsket tryk. Remanensen opløses i 20 ml methanol og 30 behandles med 200 ml ether. Det resulterende faste stof filtreres og tørres ved 60°C, hvilket giver den ovenfor anførte forbindelse i et udbytte på 55% som et hvidt pulver, smeltepunkt 151-153°C.

NMR (DMS0-d6): 6 10,8 (bs, IH), 6,5 (bs, 2H) , 5,5 (d, 35 J«5,5Hz, IH), 0,8 (d, J-7HZ, 3H).

IR (KBr): 1680 og 1640 cm"1.

DK 170779 B1 61

Analyse beregnet for C^H^NgOg:

C Η N

45,75, 5,61, 20,56

Fundet: 45,41, 5,56, 20,09.

5

Eksempel 6: 7-Ethyl-8-oxoguanosin (23643)

Totrinsmetoden ifølge eksempel 1 følges, og som alky-10 leringsmiddel anvendes der ethyliodid, hvorved ovennævnte forbindelse fås i et samlet udbytte på 15% som et hvidt pulver, smeltepunkt 185-187*0.

NMR (DMSO-d6): δ 6,7 (bs, 2H) , 5,7 (d, J=5Hz, IH), 1,2 (t, J=6Hz, 3H).

15 IR (KBr): 1680, 1640, 1610 og 1460 cm"1.

Analyse beregnet for C^H^NgOg'l^^O:

C Η N

42,86, 5,39, 20,82

Fundet: 43,17, 5,24, 20,45.

20

Eksempel 7: 7-Decyl-8-oxoguanosin (23894)

Totrinsmetoden ifølge eksempel 1 følges, og som alky-25 leringsmiddel anvendes der decyliodid, hvilket giver den ovenfor anførte forbindelse i et samlet udbytte på 10% som et hvidt pulver, smeltepunkt 174-176*0.

NMR (DMS0-d6): δ 10,8 (bs, IH), 6,4 (bs, 2H), 5,6 (d, J=5Hz, IH).

30 IR (KBr): 1690, 1590 og 1450 cm"1.

Analyse beregnet for C2oH33N5°6:

C Η N

54,66, 7,57, 15,93

Fundet: 54,17, 7,44, 15,90.

35 DK 170779 B1 62

Eksempel 8; 7-(2-Propenyl)-8-oxoguanosin (21757) (også 7-allyl-8-oxo--guanosin) 5 Der anvendes to fremgangsmåder til fremstilling af den ovenfor anførte forbindelse, der også her er betegnet 7-a1ly1-8-oxoguanos in.

Fremgangsmåde 1

Totrinsmetoden ifølge eksempel 1 følges, og som alky-10 leringsmiddel anvendes der allylbromid (3-brompropen), hvilket giver den ovenfor anførte forbindelse i et udbytte på 40% fra den tilsvarende 1-aminoforbindelse som et hvidt pulver, smeltepunkt 230-231°C.

NMR (DMSO-d6) : δ 5,6 (d, J=5Hz, IH), 6,5 (bs, 2H) , 10,8 15 (bs, IH).

IR (KBr): 1660, 1590 og 1560 cm-1.

Analyse beregnet for C13H17N3O6:

C Η N

46,02, 5,05, 20,64 20 Fundet: 45,63, 5,10, 20,56.

Fremgangsmåde 2 A. Trin 1: 8-(2-propenyl)oxyguanosin

En blanding af 10 g (29,5 mmol) 8-bromguanosin (f.eks.

25 fra Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo), 5 g (125 mmol, 60% i olie) natriumhydrid, 20 ml allylalkohol og 200 ml dimethyl-sulfoxid (DMSO) opvarmes ved 60°C under N2 i 3 timer. Blandingen får lov at afkøle til ca. omgivelsestemperatur, hvorpå den hældes i 1 liter diethylether, hvilket giver et gråt 30 bundfald.

Det etheriske lag dekanteres fra og kasseres. Den faste remanens behandles med 50 ml vand og 10 ml eddikesyre.

Det faste stof filtreres og renses ved omvendt fase HPLC (C-18), hvilket giver 2-propenyletheren som et hvidt pulver 35 i en udbytte på 20% (1,8 g).

NMR (DMSO-d6) : S 6,3 (bs, 2H) , 6,2-5,8 (m, IH), 5,6 (d, J-5HZ, IH).

DK 170779 B1 63 B. Trin 2: 7-allyl-8-oxoguanosin

En blanding af 40 mg (0,12 mmol) 8-(2-propenyl)oxy-guanosin i 50 ml vand opvarmes ved tilbagesvaling i 3 timer. Reaktionsblandingen afkøles til omgivelsestemperatur, og 5 den ovenfor anførte forbindelse fås ved omvendt fase HPLC (C-18) i 85% udbytte.

Eksempel 9: 7-(2-Propenyl)-8-thioxoguanosin (også benævnt 7-allyl-8-10 -thioxoguanosin) (22444)

Den ovenfor anførte forbindelse, også omtalt her som 7-allyl-8-thioxoguanosin og 7-allyl-8-mercaptoguanosin (7a8MGuo), fremstilles ved anvendelse af to forskellige 15 omlejringsmetoder ud fra 8-(2-propenylmercapto)guanosin.

A. Trin 1: 8-(2-propenylmercapto)guanosin (22300) 8 g (63,5 mmol) allylbromid sættes til en blanding af 20 g (63,5 mmol) 8-thioxoguanosin og 10 g (72 mmol) ka-liumcarbonat i 300 ml DMF, og den resulterende blanding 20 opvarmes under omrøring ved en temperatur på 45'C i 90 minut ter.

Derpå afkøles blandingen til omgivelsestemperatur og hældes i en opløsning af 1,4 liter diethylether og 5 ml eddikesyre. Det resulterende faste stof filtreres og vaskes 25 med 250 ml vand, 200 ml acetone og derpå med diethylether, hvorpå det tørres i en ovn ved 60°C, hvilket giver den ovenfor anførte thioether i et udbytte på 67% (14,7 g) som et hvidt pulver, smeltepunkt 225*C (sønderdeling).

NMR (DMSO-d6): S 5,70-5,91 (m, 2H), 6,38 (bs, 2H).

30 IR (KBr)J 1700, 1640 og 1610 cm-1.

Analyse beregnet for C13H17N5O5S:

C H N

43,93, 4,82, 19,71

Fundet: 44,10, 4,82, 19,69.

35 DK 170779 B1 64 B. Omleiring

Trin 2: Fremgangsmåde 1: 7-allyl-8-thioxoguanosin 72 g (354,7 mmol) bis-trimethylsilylacetamid sættes til en suspension af 20 g (56,3 mmol) 8-(2-propenylmercapto)-5 guanosin som udgangsmateriale i 500 ml chloroform, og den resulterende blanding opvarmes ved tilbagesvaling i 16 timer under N2. Efter afkøling fjernes størstedelen af opløsningsmidlet under formindsket tryk, og remanensen opvarmes ved 40*C under vakuum i 6 timer.

10 Remanensolien blandes med 500 ml tetrahydrofuran, 10,3 g (58,3 mmol) PdCl2 og 12,1 g (117 mmol) benzonitril, og den resulterende blanding opvarmes ved tilbagesvaling under N2 i 3 timer. Blandingen afkøles derpå til omgivelsestemperatur, hvorefter den yderligere blandes med 25 ml pyri-15 din og omrøres natten over (ca. 16 timer). Blandingen filtreres gennem silicagel og vaskes med 2 x 300 ml methylen-chlorid. Det forenede filtrat koncentreres under formindsket tryk, og remanensen blandes med 500 ml af en blanding af vand, methanol og eddikesyre (10:10:1) og omrøres i yder-20 ligere ca. 16 timer.

Størstedelen af de tilsatte opløsningsmidler fjernes under formindsket tryk, og remanensen opløses i 1 liter DMF, hvorpå den behandles med trækul. Den således fremkomne suspension filtreres gennem en masse af "Celit", og filtratet 25 koncentreres under formindsket tryk. Remanensen behandles med methanol, og det resulterende faste stof filtreres, vaskes med acetone og tørres i en ovn ved 60*c, hvilket giver 7-allyl-8-thioxoguanosin i et udbytte på 42,5% (8,5 g) som et off-white pulver, smeltepunkt over 230*c.

30 NMR (DMSO-d6): δ 5,90 (m, IH), 6,32 (d, J=5Hz, IH), 6,56 (bs, 2H), 10,60 (bs, IH).

IR (KBr): 1700, 1635, 1605 og 1450 cm"1.

Analyse beregnet for C13H17N5O5S:

C Η N

35 43,93, 4,82, 19,71

Fundet: 43,96, 4,87, 19,62.

DK 170779 B1 65

Trin 2: Fremgangsmåde 2: 7-allyl-8-thioxoguanosin En opløsning indeholdende 60 g 8- (2-propenylmercapto) -guanosin som udgangsmateriale i 60 g DHF opvarmes ved en badtemperatur på 130*C under N2 i 9 dage. Den resulterende 5 reaktionsblanding afkøles til omgivelsestemperatur, og opløsningsmidlet fjernes under formindsket tryk. Remanensen behandles med methanol. Det resulterende faste stof filtreres og vaskes med acetone, hvoxrpå det tørres i en ovn ved 60*C, hvilket giver den ovenfor anførte forbindelse i et udbytte 10 på 36% (21 g) som et off-white pulver.

Eksempel 10: 7-(2-Propenyl)-8-selenoxoguanosin (23369) 15 Den ovenfor anførte forbindelse, også benævnt 7-allyl- -8-selenoxoguanosin, fremstilles ved omsætning af 8-selenoxoguanosin (Chu et al., J. Med. Chem., 18, 559-564 (1975)) og allylbromid som beskrevet i eksempel 9 efterfulgt af termisk omlejring. Produktet omkrystalliseres fra vand og 20 tørres, smeltepunkt 227-230*C.

Analyse beregnet for C13H17N505Se:

C Η N

38,28, 4,26, 17,41

Fundet: 38,77, 4,25, 16,92.

25

Eksempel 11: 7-[(3-Phenyl)-2-propenyl]-8-oxoguanosin (også benævnt 7--cinnamyl-8-oxoguanosin) (22827) 30 Den ovenfor anførte forbindelse fremstilles ud fra det tilsvarende 1-aminoderivat efterfulgt af den generelle totrinsmetode ifølge eksempel 1. I trin 2 sættes der til en opløsning af 2 g (4,65 mmol) af den dannede l-amino-7-[(3--phenyl)-2-propenyl]-8-oxoguanosin i 15 ml koncentreret HC1 35 0,29 g (4,19 mmol) natriumnitrit i 5 ml vand ved 0*C. Den resulterende blanding omrøres i 1 time. Størsteparten af opløsningsmidlet fjernes under formindsket tryk, hvilket DK 170779 B1 66 giver et bleggult fast stof. Det faste stof tritureres med methanol, hvilket giver den ovenfor anførte forbindelse som et hvidt pulver i et udbytte på 65%, smeltepunkt 240*C.

NMR (DMSO-d6): δ 10,8 (bs, IH), 5,6 (d, J=5Hz, IH).

5 IR (KBr): 1680, 1610 og 1530 cm-1.

Analyse beregnet for Cjg^iNsOg:

C Η N

54,94, 5,10, 16,86

Pundet: 54,70, 5,10, 16,90.

10

Eksempel 13: 8-(2-Butenylmercapto) guanos in (22435)

Den første fremgangsmåde til fremstilling af 8-(2-15 -propenylmercapto)guanosin (eksempel 9) følges, men i stedet for allylbromid anvendes der 2-butenylchlorid, hvorved ovennævnte forbindelse fås i et udbytte på 48% som et hvidt pulver, smeltepunkt 210*C (sønderdeling).

NMR (DMSO-d6) : δ 6,3 (bs, 2H) , 5,6 (d, J=5Hz, IH), 1,6 (d, 20 J=6Hz, 3H).

IR (KBr): 1690, 1630, 1600, 1510 og 1365 cm-1.

Analyse beregnet for C14H19N5O5S:

C Η N

45,52, 5,18, 18,96 25 Fundet: 45,38, 5,32, 18,79.

Eksempel 14: 8-(Cinnamylmercapto)guanosin (22359) 30 Fremgangsmåden til fremstilling af 8-(2-propenylmer capto) guanosin (eksempel 9A) følges, men i stedet for allylbromid anvendes der cinnamylbromid, hvorved ovennævnte forbindelse fås i et udbytte på 33% som et off-white pulver, smeltepunkt 172*C (sønderdeling).

35 NMR (DMSO-d6) : δ 7,25 (br, 5H) , 6,7-6,2 (m, 4H) , 5,7 (d, J«5Hz, IH).

IR (KBr): 1690, 1640 og 1600 cm"1.

DK 170779 B1 67

Analyse beregnet for C^^iNgC^S:

C Η N

52,89, 2,91, 16,23

Fundet: 53,26, 4,90, 16,08.

5

Eksempel 15: 7-(2-Propenyl)-8-thioxo-2',3'-O-isopropylidenguanosin-hemi-hydrat (23083) 10 En blanding af 6 g (16,9 mmol, eksempel 9) 7-(2-pro- penyl)-8-thioxoguanosin, 5 ml (40,7 mmol) 2,2-dimethoxypro-pan, 200 ml acetone og 10 dråber koncentreret svovlsyre omrores under N2 ved omgivelsestemperatur i 52 timer. Blandingen afkøles til 0*C og behandles med 5 ml koncentreret 15 ammoniumhydroxid. Størsteparten af opløsningsmidlet fjernes under formindsket tryk, og det hvide faste stof filtreres.

Det faste stof vaskes med vand, derpå med acetone, og derefter med diethylether, hvorpå det tørres i en ovn ved 60* C, hvilket giver den ovenfor anførte forbindelse som et bleggult 2 0 pulver i et udbytte på 75%, smeltepunkt 237*C (sønderdeling).

NMR (DMSO-d6): 6 1,32 (s, 3H), 1,52 (s, 3H), 5,92 (m, IH), 6,58 (bs, IH), 6,95 (bs, 2H).

IR (KBr): 1695, 1630, 1600 og 1450 cm"1.

Analyse beregnet for C16H21N3O3S-I/2 H20:

25 C Η N

47,51, 5,48, 17,32

Fundet: 47,08, 5,12, 17,30.

Eksempel 16: 30 7-Cinnamyl-2',3'-isopropyliden-8-oxoguanosin-hemihydrat (23803)

Fremgangsmåden ifølge eksempel 15 følges, men i stedet for 7-(2-propenyl)-8-thioxoguanosin anvendes der 7-cinnamyl-35 -8-oxoguanosin (eksempel 11), hvilket giver den ovenfor anførte forbindelse i et udbytte på 35% som et off-white pulver, smeltepunkt 230*C.

DK 170779 B1 68 NMR (DMSO-d6): δ 10,9 (bs, IH), 7,3-7,6 (m, 5H) , 6,6 (bs, 2H), 6,4 (m, 2H).

IR (KBr): 1680, 1630, 1590, 1450, 1420 og 1380 cm”1.

Analyse beregnet for C22H25N506-l/2H20:

5 C Η N

56,89, 5,64, 15,07

Fundet: 57,08, 5,53, 15,12.

Eksempel 18: 10 5 1 -Acetyl-7- (2-propenyl) -2^31 -O-isopropyliden-8-thioxo- guanosin (23287)

En blanding af 1,2 g (3 mmol, eksempel 15) 7-(2-propenyl) -2 1,3' —O-isopropyliden-8-thioxoguanosin, 3 ml triethyl-15 amin, 0,3 g (2,9 mmol) eddikesyreanhydrid og 100 ml methylen-chlorid omrøres ved omgivelsestemperatur i 16 timer. Blandingen hældes i 100 ml vand, det organiske lag skilles fra, og det vandige lag ekstraheres med 2 x 50 ml methylenchlorid.

Det forenede organiske lag tørres over Na2S04, og 20 opløsningsmidlet fjernes under formindsket tryk. Remanensen renses ved søjlechromatografi på silicagel (100 g, ethyl-acetat/hexan (9:1 v/v)), hvilket giver den ovenfor anførte forbindelse som et off-white pulver i et udbytte på 70% (950 mg), smeltepunkt 179*C (sønderdeling).

25 NMR (DMSO-d6): δ 11,1 (bs, IH), 6,85 (bs, 2H), 6,6 (s, IH), 2,01 (s, 3H) , 1,45 og 1,32 (begge s, 3H hver).

IR (KBr): 1730, 1710, 1680 og 1630 cm-1.

Analyse beregnet for C18H23N506S:

C Η N

30 49,42, 5,30, 16,01

Fundet: 49,33, 5,36, 15,50.

35 DK 170779 B1 69

Eksempel 19: 7- (2-Propenyl) -6,5' -dibenzoyl-2 ', 3' -o-isopropyliden-8-thioxo-guanosin (23314) 5 Den generelle fremgangsmåde ifølge eksempel 18 følges, men i stedet for eddikesyreanhydrid anvendes der benzoyl-chlorid, hvilket giver den ovenfor anførte forbindelse som et gult pulver i et udbytte på 12%, smeltepunkt 99-101*C.

NMR (CDC13): S 8,3-7,4 (m, 10H) , 6,85 (d, J=lHz, IH), 10 1,61 og 1,38 (begge s, 3H hver).

IR (KBr)i 1760, 1720, 1640, 1600 og 1450 cm"1.

Analyse beregnet for C30H29N5O7S:

C Η N

59,69, 4,84, 11,60 15 Fundet: 59,73, 4,88, 11,49.

Eksempel 20: 7-(2-Propenyl)-2-N,5'-O-dibenzoyl-2',3'-O-isopropyliden-8- -thioxoguanosin-hemihydrat (23350) 20 -

Fortsat eluering af silicagelsøjlen anvendt til rensning i eksempel 19 med ethylacetat/hexan (3:7 v/v) giver den ovenfor anførte forbindelse som et bleggult pulver i et udbytte på 20%, smeltepunkt 134-136*C.

25 NMR (CDCI3) : δ 10,1 (bs, IH), 8,2-7,3 (m, 10H) , 1,65 og 1,34 (begge s, 3H hver).

IR (KBr): 1710, 1680, 1610 og 1588 cm"1.

Analyse beregnet for C30H29N5O7S-I/2 H20:

C Η N

30 58,81, 4,94, 11,43

Fundet: 58,77, 4,82, 11,50.

35 DK 170779 B1 70

Eksempel 21: 7-(2-Propenyl)-5'-benzoyl-2·,3'-O-isopropylidenguanosin-8--th ioxoguanos in-kvarthydrat (23351) 5 Yderligere eluering af silicagelsøjlen anvendt i eksempel 19 og 20 med ethylacetat/hexan (4:1 v/v) giver den ovenfor anførte forbindelse som et bleggult pulver i et udbytte på 21%, smeltepunkt 214*C (sønderdeling).

NMR (DMS0-d6): δ 11,1 (bs, IH), 7,9-7,3 (m, 5H) , 6,7 (bs,

10 2H), 6,6 (s, IH), 1,6 og 1,4 (begge s, 3H

hver).

IR (KBr): 1700, 1630, 1590 og 1450 cm"1.

Analyse beregnet for C23H25N506-1/4H20:

C Η N

15 54,80, 5,10, 13,90

Fundet: 54,77, 4,99, 13,85.

Eksempel 22: 7-(2-Propenyl)-8-thioxo-2',3',5'-triacetylguanosin (22360) 20 -

Til en blanding af 1 g (2,8 mmol) 7-(2-propenyl)-8- -thioxoguanosin (7a8MGuo), 2 ml triethylamin, 1,2 ml (13 mmol) eddikesyreanhydrid og 50 ml methylenchlorid sættes der 10 mg 4-N,N-dimethylaminopyridin. Den resulterende reak- 25 tionsblanding omrøres under N2 i 16 timer ved stuetemperatur.

Der tilsættes yderligere 50 ml methylenchlorid, og opløsningen vaskes med 1 N HC1, saltvand og derpå vand, hvorpå den tørres over Na2S04. Opløsningsmidlet fjernes under formindsket tryk, og remanensen renses ved søjlechroma- 30 tografi på silicagel (200 g) under anvendelse af ethylacetat som opløsningsmiddel. Den ovenfor anførte forbindelse fås som et bleggult pulver i et udbytte på 54%, smeltepunkt 100-102 *C.

NMR (CDCI3): δ 2,01 (s, 3H), 2,10 (s, 6H), 6,79 (d, J=3Hz, 35 IH).

IR (KBr): 1740, 1690, 1630, 1450 og 1230 cm"1.

DK 170779 B1 71

Analyse beregnet for C19H23N5O8S:

C Η N

47,39, 4,82, 14,55

Fundet: 47,29, 4,84, 14,19.

5

En anden fremstilling i større målestok af den ovenfor anførte forbindelse giver denne forbindelse i et udbytte på 26% og desuden 7-(2-propenyl)-8-thioxo-2',3',5'-2-N-tetra-acetylguanosin (25177) i et udbytte på 40%, smeltepunkt 90-10 -92 *C.

NMR (DMSO-d6): S 12,1 (bs, IH), 11,4 (s, IH), 6,4 (d, J=5Hz,

IH), 2,15, 2,00, 1,94 og 1,90 (alle s, 3H

hver).

IR (KBr): 1750 og 1690 cm”1.

15 Analyse beregnet for C21H25N5O9S:

C Η N

48,18, 4,81, 13,38

Fundet: 48,20, 4,69, 13,32.

20 Eksempel 23: 7-Benzyl-8-oxoguanosin (24234)

Totrinsmetoden ifølge eksempel 1 følges, og som alkyler ingsmiddel anvendes der benzylbromid, hvilket giver den 25 ovenfor anførte forbindelse i et samlet udbytte på 20% som et off-white pulver, smeltepunkt 175*C.

NMR (DMSO-d6): S 10,7 (bs, IH), 7,3 (s, 5H) , 6,4 (bs, 2H) , 5,6 (d, J=5Hz, IH).

IR (KBr): 1680, 1600 og 1450 cm”1.

30 Analyse beregnet for C17H19N506:

C H N

52,44, 4,92, 17,99

Fundet: 52,47, 5,03, 17,10.

35 B. Eksempler på præparater til indgift

Eksempler på faste og flydende præparater egnet til indgift af forbindelserne ifølge opfindelsen er beskrevet i DK 170779 Bl 72 det følgende, hvor der er anvendt fem af de mest foretrukne guaninnucleosidderivater som eksempler på aktive bestanddele.

Tabletter 5 Tabletterne blandes ud fra følgende bestanddele: Væatdele 7-Allyl-8-oxoguanosin 2,5

Lactose, pulveriseret 36,4

Majsstivelse, tørt 34,5 10 Findelt Si02 5,6

Polyvinylpyrrolidon 0,6

Magnesiumstearat 0.4 80,0 15 Guanosinderivatet blandes grundigt med lactosen, 25,0 vægtdele majsstivelse og 4,0 vægtdele Si02. Den resulterende blanding fugtes derefter jævnt med en 5% ethanolisk opløsning af polyvinylpyrrolidon. Den fugtige masse passeres derefter gennem en 1 mm mesh sigte, hvorved der fås et granu-20 lat. Det resulterende granulat tørres i ca. 24 timer ved 60*C i et tørreskab. Det tørrede granulat passeres igen gennem en 1 mm mesh sigte. 70,0 dele af det således dannede granulat blandes i en egnet mixer med en blanding bestående af resten af Si02, resten af majsstivelsen og al magnesium-25 stearat, hvilken blanding forud har passeret gennem en 1 mm mesh sigte. Den således fremkomne blanding presses til tabletter, der vejer 800 mg hver og indeholder 25 mg guanosin.

Stivelseskapsler 30 Kapselindholdet blandes ud fra følgende bestanddele: Væotdele 7-Butyl-8-oxoguanosin 10,0

Lactose 450,0

Majsstivelse 540.0 35 1000,0

Guanosinderivatet blandes gradvis med lactosen. Når DK 170779 B1 73 al lactose er iblandet, blandes den dannede blanding med majsstivelsen. Den resulterende blanding fyldes derpå i kapsler, der indeholder 1,0 g af blandingen. Hver kapsel indeholder 10 mg guanosinderivat.

5

Tabletter

Et parti bestående af 10.000 tabletter, der hver indeholder 50 mg 7-(2-butenyl)-8-oxoguanosin, fremstilles ud fra følgende typer og mængder af bestanddele: 10 7-(2-Butenyl)-8-oxoguanosin 500 g

Dicalciumphosphat 1000 g

Methylcellulose, U.S.P (15 cps) 75 g

Talkum 150 g 15 Hajsstivelse 250 g

Magnesiumstearat 25 g 2000 g

Guanosinderivatet og dicalciumphosphatet blandes 20 godt, granuleres med 7,5%’s opløsning af methylcellulose i vand, passeres gennem en nr. 8 sigte (US standardsigteserie) og tørres omhyggeligt. Det tørrede granulat passeres gennem en nr. 12 sigte (US standardsigteserie), blandes grundigt med talkum, stivelse og magnesiumstearat og presses til 25 tabletter.

Iiriiserbfrrt præparat

Der fremstilles et sterilt præparat egnet til in-tramuskulær, subkutan eller intracavitær injektion og inde-30 holdende 50 mg 7-benzyl-8-oxoguanosin i hvert ml af bestanddelene ud fra følgende typer og mængder af bestanddele: 7-Benzyl-8-oxoguanosin 5 g

Fysiologisk saltvand 98 ml

Sesamolie 2 ml 35 Guanosinderivatet og saltvandet blandes og behandles sonisk i så lang tid, at der fås en i alt væsentligt homogen DK 170779 B1 74 dispersion. Derpå iblandes sesamolien, og den herved dannede blanding homogeniseres tilsvarende, således at der fås en emulsion. Efter emulsionsdannelsen injiceres 5 til 15% af slutrumfanget af det sterile præparat subkutant eller in-5 traperitonealt en eller to gange ugentlig for at forstærke immuniteten.

Vandicrt præparat til oral anvendelse

Der fremstilles et vandigt præparat til oral anven-10 delse indeholdende i hver 5 ml (1 teskefuld) 25 mg 7-propyl--8-oxoguanosin ud fra de følgende bestanddele: 7-Propyl-8-oxoguanosin 5,0 g

Methylparaben, U.S.P. 0,75 g 15 Propylparaben, U.S.P. 0,25 g

Saccharin-Na 1,25 g

Cyclamat-Na 0,25 g

Glycerol 300 ml

Tragantpulver 1,0 g 20 Orangeolie som smagsstof 1,0 g F.D. og C. orangefarvestof 0,75 g

Afioniseret vand g.s. til 1000 ml C. MgWer 25 Lvmphocvtkulturer. Det serumholdige dyrkningsmedium fremstilles således, at det indeholder følgende bestanddele pr. 100 ml: 91,9 ml RPMI 1640 (Flow Laboratories, Inc. Rockville, MD) , 0,1 ml 100 x glutamin, 1,0 ml 100 x natrium- pyruvat, 1,0 ml 50 x ikke-essentielle aminosyrer, 1,0 ml 30 vand indeholdende 104 enheder af penicillin G og ΙΟ4 μg streptomycin og 5,0 ml af en næringsbouillon af fetalt kalveserum (FCS). Disse bestanddele blandes til der opnås en tilsyneladende homogenitet. Miltcellesuspensioner og populationer beriget med milt-B-celler fremstilles som beskrevet 35 i Goodman et al., J. Immunol., 121, 1905 (1978).

Til bedømmelse af den primære humorale immunreaktion DK 170779 B1 75 mod fåreerythrocyter (SRBC) dyrkes 5 x 106 til 107 murine miltceller i 1,0 ml 5% FCS-holdigt medium i 4 eller 5 dage i nærvær og fravær af immunogen. Cellerne inkuberes i dyrkningsbakker (Costar, Cambridge, MA) ved 37*C i en fugtig 5 atmosfære med 10% C02 i luft under anvendelse af vævsdyrkningskasser (CBS Scientific, Del Mar, CA), der omrystes med en frekvens på 7 cycler pr. minut. Forenede SRBC kan fås fra the Colorado Serum Co., Denver CO.

Humane perifere blodlymphocyter (PBL) fremstilles ud 10 fra normalt hepariniseret venøst blod ved Ficoll-diatrizoat--densitetsgradient-centrifugering. PBL befries for suppres-sor-T-celler, der bærer histamin type 2 receptor, ved at klæbe dem til overfladen af histamin-kaninserumalbumin-over-trukne plastpetriskåle (Cell-ect nr. 2 kit, Seragen, Boston, 15 MA) og ved at udvinde de ikke-klæbende celler ved vaskning som beskrevet af Wysocki og Sato, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 75, 284 (1978) og modificeret af Cavagnaro og Osband, Biotechniques, januar/februar: 30 (1983).

Det ved disse undersøgelser for humane lymphocyter 20 anvendte vævsdyrkningsmedium fremstilles som følger: 100 ml indeholder 87,9 ml RPMI 1640 (Flow Laboratories, Rockville, MD) , 0,1 ml 100 x glutamin, 1,0 ml 1,0 M HEPES-puffer (Microbiological Associates, Betheseda, MD), 1,0 ml vand indeholdende 104 enheder af penicillin G og 104 /xg streptomycin og 25 10 ml frisk, autologt, varmeinaktiveret plasma. Til bedøm melse af den primære humorale immunreaktion mod SRBC dyrkes lymphoide celler fremstillet soro ovenfor i en densitet på 2 x 106/ml i et rumfang på 1,0 ml indeholdende 5 x 106 SRBC som antigen (Colorado Serum Co., Denver, CO) sammen med IL-30 -2 (et delvis renset præparat af human IL-2, der er fri for interferon-Tf-aktivitet, fås fra Electro-Nucleonics, Inc., Silver Spring, MD) og guaninnucleosidderivatet.

Analyse for plaouedannende celler fPFC). PFC. der afsondrer antistoffer mod SRBC, bedømmes efter 4 eller 5 35 dages dyrkning under anvendelse af en modifikation af den hæmolytiske plaqueanalyse ifølge Jerne og Nordin, Science, DK 170779 B1 76 140, 405 (1963). Cellerne dyrkes i komplet medium inden plaquedannelsen. Derefter overføres de til standardagarose med lav Mr (Bio-Rad Laboratories, Richmond CA) og inkuberes i SRBC-absorberet marsvinekomplement i 1 time efter inkube-5 ring uden komplement i 1,5 timer.

T-Celleerstattende aktivitet. Der dyrkes 5 x 106 levedygtige CBA/CaJ muse-B-celler. Som anført mere detaljeret i det følgende frembringes disse celler ved sekventielt at behandle miltceller først med komplementfikserende mono-10 klonale antistoffer rettet mod thy 1,2 antigener i T-celler og derpå med komplement for at opløse eventuelt forekommende T-celler (New England Nuclear, Boston, MA) . Cellerne behandlet på denne måde dyrkes derefter med eller uden 0,1 ml 0,1% (v/v) SRBC som immunogen i serumholdige medier, der 15 yderligere indeholder trinvis stigende mængder guanosinderi-vat i en mængde fra 0 til 10”4 mol. Direkte PFC mod SRBC bestemmes 4 dage senere.

Mus. CBA/CaJ mus, 8-16 uger gamle, indkøbes fra Jack-son Laboratory, Bar Harbor, ME. En stamkerne af CBA/N mus 20 leveres fra Animal Production Section, National Institutes of Health, Bethesda, MD. SJL, BDF^ og C57BL/6J mus, 8-16 uger gamle, fås fra museavlingscenteret hos Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA. Alle musene fodres med Wayne Lab Blox F6 pellets (Allied Mills, Inc., Chicago, 25 IL) og chloreret vand syrnet med HC1 til en pH-værdi på 3,0.

Cellepræparater. Milt- og thymuscellesuspensioner fremstilles som beskrevet i Goodman et al., J. Immunol., 121, 1905 (1978). B-celleberigede populationer fremstilles 30 ved at behandle 108 miltceller med en 1:1000 fortynding af monoklonalt anti-thy 1,2 antistof (New England Nuclear, Boston, MA) i 30 minutter ved 4*C. De behandlede celler centrifugeres ved 280 x i 10 minutter, antistofferne fjernes, og cellerne suspenderes igen i en 1:6 fortynding af CBA-35 -RBC-absorberet marsvinekomplement ved 37*C i 45 minutter. Cellerne vaskes derefter, hvorpå de dyrkes som beskrevet DK 170779 B1 77 tidligere.

Injektioner. Musene injiceres i.p. ned en opløsning indeholdende 50 μg TNP-BSA. I løbet af ca. 30 minutter efter immuniseringsinjektionen modtager to grupper på 6 mus også 5 0,2 ml i.p. injektioner af 7a8MGuo i 100% sesamolie eller 2% (v/v) sesamolie sonisk behandlet i normalt saltvand, hvor 7a8MGuo forekommer i en mængde på 5 mg/ml. En tredie gruppe på 6 mus modtager immuniseringen men ikke guanosin-derivat. Anti-TNP-BSA antistoftiterne bestemmes ved anven-10 delse af gængse teknikker.

T-Hiælpercelleaktivering♦ 1,5 x 105 levedygtige miltceller fra SJL mus eller CBA/CaJ musethymocyter dyrkes med eller uden samme antal bestrålede (2500 rad) miltceller fra hhv. CBA/CaJ eller BDF^ mus i 0,2 ml dyrkningsmedium i nær-15 værelse af trinvis stigende koncentrationer af forskellige 7,8-disubstituerede guaninderivater. Det anvendte lymphocyt-dyrkningsmedium er det tidligere beskrevne, som yderligere er suppleret med 2-mercaptoethanol til en slutkoncentration på 50 μιηοΐ. Thymocy tkul turerne indeholder også 10% (v/v) con-20 canavalin A-konditioneret rottemiltcellemedium solgt under navnet Rat T Cell Monoclone af Collaborative Research. Efter 90 timers dyrkning iblandes der 1 /zCurie [3H]TdR pr. kultur, og den resulterende kultur henstilles i yderligere 6 timer.

Kulturerne høstes med en Brandel cellehøster (M24V, 25 Biological Research and Development Laboratories, Rockville, MD) på glasfiberfilterskiver. Filterskiverne overføres til plastscintillationshætteglas, dækkes med flydende scintil-lationsblanding og tælles i en Beckman LS5700 væskescintil-lationstæller.

30 35

Claims (13)

1. Substituerede guaninnucleosidderivater, kendetegnet ved, at de har formlen _ OR1 5. i NH, N R4OCH?wOJ io pi* hvor X betyder o, S eller Se, R1 betyder en ligekædet, cyclisk eller forgrenet carbonhydridgruppe med en længde, der er større end længden af en ethylgruppe og mindre end længden 15 af en decylgruppe, R2 og R3 er ens eller forskellige og betyder hydroxyl, lavere alkoxy, lavere alkanoyloxy eller benzoxy, eller R2 og R3 tilsammen danner en lavere alkyliden-dioxygruppe, R4 betyder hydrogen, lavere alkanoyl eller benzoyl, samt farmaceutisk acceptable, ikke-toksiske base-20 additionssalte deraf.

2. Substituerede guaninnucleosidderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R1 betyder ligekædet c3--Cg-alkyl, ligekædet C3-Cg-0-alkenyl eller benzyl.

3. Substituerede guaninnucleosidderivater ifølge krav 25 1, kendetegnet ved, at R1 betyder propyl, butyl, allyl, 2-butenyl eller benzyl, og X betyder O.

4. Substituerede guaninnucleosidderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R2 og R3 betyder hydroxyl, og R4 betyder hydrogen.

5. Substituerede guaninnucleosidderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R1 betyder allyl, R2 og R3 hver især betyder acetoxy, og X betyder O eller S.

6. Substitueret guaninnucleosidderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er 7-allyl-8-thioxo-35 -2',3',5·-triacetylguanosin, 7-allyl-8-oxoguanosin, 7-butyl- -8-oxoguanosin, 7-(2-butenyl)-8-oxoguanosin, 7-allyl-8-thi- DK 170779 B1 oxoguanosin, 7-benzyl-8-oxoguanosin eller 7-propyl-8-oxo-guanosin.

7. Ininu nreakt i ons for s tær kende præparater, kendetegnet ved, at de indeholder en fortyndende mængde 5 af en fysiologisk acceptabel bærer blandet med en immunpoten-tierende effektiv mængde af et immunreaktionsforstærkende, substitueret guaninnucleosidderivat ifølge krav 1, hvor R1 betyder ligekædet C3-C6-alkyl, ligekædet C3-C6-£-alkenyl eller benzyl, fortrinsvis propyl, butyl, allyl, 2-butenyl 10 eller benzyl, og X betyder O eller S, fortrinsvis O.

8. Fremgangsmåde til forstærkning af en immunreaktion, kendetegnet ved, at leukocyter i et vandigt dyrkningsmedium kontakteres in vitro med et præparat indeholdende en fortyndende mængde fysiologisk acceptabel bærer blandet 15 med en immunpotentierende effektiv mængde af et substitueret guaninnucleosidderivat ifølge krav 1.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at leukocyterne er B-celler, T-celler eller neutrophiler.

10. Anvendelse af substituerede guaninnucleosidderi- vater ifølge ethvert af kravene 1-6 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til forstærkning af en immunreaktion.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af substituerede guanosinnucleosidderivater ifølge krav 1, hvor X betyder 0, 25. eller Se, og R1 betyder -CH2-CR=CH2, hvor R betyder hydrogen, lavere alkyl eller benzyl, kendetegnet ved, at (a) den tilsvarende forbindelse, som er usubstitueret i 7-stillingen, og som er substitueret i 8-stillingen med -X-CH2“CR=CH2, hvor X og R har ovenstående betydninger, 30 opvarmes i et flydende opløsningsmiddel til ca. 50°C til ca. 200*C i tilstrækkelig lang tid til, at der dannes det ønskede omlejrede produkt, som eventuelt isoleres.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det flydende opløsningsmiddel yderligere 35 indeholder en katalytisk mængde PdCl2; og udgangsforbindelsen opvarmes til en temperatur på ca. 50*C til ca. 100*C. DK 170779 B1

13. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at udgangsforbindelsen er 8-(2-propenyl)oxy-guanosin. 5 10 15 20 25 30 35