JP6770169B2

JP6770169B2 - 軟骨細胞の細胞外基質由来ペプチド

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Publication number: JP6770169B2
Application number: JP2019503878A
Authority: JP
Inventors: ウクヤンジェー
Original assignee: Eyebio Korea
Current assignee: Eyebio Korea
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2017-02-09
Publication date: 2020-10-14
Anticipated expiration: 2037-02-09
Also published as: EP3539559B1; WO2017175963A1; US10532084B2; US20190111112A1; EP3441081B1; CN110025765A; CN109310731A; AU2017247626B2; AU2019200063B2; ES2819030T3; CN109310731B; EP3539559A1; CN110025765B; ES2822289T3; AU2019200063A1; JP2019519597A; US20190100572A1; US10709768B2; AU2017247626A1; JP2019065013A

Description

本発明は、新規なペプチド及びその用途に関する。

細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）は、組織で細胞を除いた残りの成分であって、細胞が分泌した多様な構造的・機能的分子の３次元的な組合わせからなっており、いまだにその特性及び機能が完全には判明しておらず、人工的な製作は不可能である。細胞外基質は、組織の形状を成しながら、組織の物理的性質、すなわち、伸延力、圧縮強度と弾力性とを決定し、浸透圧、イオンの透過などを調節しながら、細胞の環境を保持する重要な役割を果たす。

また、多い成長因子とサイトカインとを保有しており、細胞の機能を決定する役割を行うが、特に、胎児、成長期には、細胞の分化を調節するか、細胞の接着、代謝活動を増減させながら、組織成長の方向を提示する。

細胞外基質は、膠原質（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、エラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）のようなタンパク質で組織の物理的性質を決定し、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）のような糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）が、細胞と細胞外基質とを貼り付ける接着剤のような役割を行い、コンドロイチン硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｓｕｌｆａｔｅ）のような多くのタンパク糖（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）があって、組織の形状と体積とを保持し、組織内で細胞と活発な相互作用を行って、組織や臓器固有の機能を保持し、行うように体積を保持する支持体の役割を果たしているが、細胞外基質の成分と構造は、いまだに完全に究明されていない。

本発明は、角膜の血管新生、混濁化、纎維化及び炎症による病理学的変化を抑制または改善して、眼球表面疾患を予防または治療することができる新規なペプチドを提供することである。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または改善用健康食品を提供する。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する黄斑変性の予防または治療用薬学組成物を提供する。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する黄斑変性の予防または改善用健康食品を提供する。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分を含む乾性眼の予防または治療用薬学組成物を提供する。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分を含む乾性眼の予防または改善用健康食品を提供する。

本発明の新規なペプチドは、アルカリ火傷で眼球表面の病理学的変化が誘導された動物モデルで、角膜混濁、血管新生及び纎維化を減少させ、炎症誘発因子の発現を抑制する効果を示し、組織変化が誘導された網膜及び脈絡膜で血管新生を効果的に抑制して、黄斑変性を予防及び改善し、眼球の涙量の減少、角膜表面の不規則性及び結膜杯状細胞の損失のような角膜上皮細胞の病理学的変化を抑制または改善すると確認されることによって、それを有効成分として含有する組成物を眼球疾患の予防または治療用薬学組成物及び健康食品として提供することができる。

合成されたヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの結果報告書である。ＨＰＬＣを用いてヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの純度を分析した結果である。Ｉｏｎ−Ｍａｓｓを通じてヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの分子量を確認した結果である。アルカリ火傷のウサギの角膜でＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認した結果であって、図４の（Ａ）は、アルカリ火傷後、０、７及び１７日目のウサギの角膜を顕微鏡（ＳＺＸ７、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で撮影した写真であり（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１０ｍｍ）、図４の（Ｂ）は、角膜血管新生の程度を示すグラフであり、図４の（Ｃ）は、角膜混濁化の程度を示すグラフであって、グラフ値は、各実験群（ｎ＝５）の平均±標準偏差を示したものであり、ｔ−テストを通じて^＊Ｐ＜０．０５ｖｓアルカリ火傷群値を有意な値として見た。アルカリ火傷のウサギの角膜の厚さ変化に対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認した結果であって、図５の（Ａ）は、仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ２．０ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した組織切片写真であり（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１ｍｍ）、図５の（Ｂ）は、角膜の厚さを示すグラフである。アルカリ火傷のウサギで纎維化の変化に対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認するために、眼球線維芽細胞をＭａｓｓｏｎ´ｓｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色法で免疫染色し、仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ２．０ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した写真（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）であって、褐色で表われた部分が線維芽細胞である。アルカリ火傷のウサギで血管新生マーカーに対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認した結果であって、特異的抗体であるＣＤ３１、ＦＧＦ及びＶＥＧＦで免疫染色された組織切片を仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ２．０ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝３００μｍ）。アルカリ火傷のウサギで炎症マーカーに対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認した結果であって、組織切片を大食細胞、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＭＭＰ−９のような特異的抗体で免疫染色した後、仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ２．０ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝３００μｍ）。コラーゲン、ＧＤＲＧＤ（ＣＰＩ）及びヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）が処理されたＨＵＶＥＣ細胞で血管形成の抑制効果を確認した結果である。レーザ照射１４日後、レーザ照射による組織崩壊及び新生血管の形成の程度を確認した結果である。動物モデルにレーザ照射後、２、１０及び２０μｇ濃度のコラーゲンまたは２〜２０μｇ濃度のＧＤＲＧＤ（ＣＰＩ）及びヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）をそれぞれ処理して、脈絡膜新生血管の抑制効果を確認した結果である。動物モデルにレーザ照射後、５μｇ濃度のアバスチンまたはヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）をそれぞれ処理して、脈絡膜新生血管の抑制効果を確認した結果である。動物モデルにレーザ照射後、５μｇ濃度のアバスチンまたはヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）をそれぞれ処理し、レーザ照射１４日後、網膜及び脈絡膜からＲＮＡを抽出して、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ及びＭＣＰ−１遺伝子発現レベルを確認したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果である。動物モデルにレーザ照射後、５μｇ濃度のアバスチンまたはヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）をそれぞれ処理し、レーザ照射１４日後、網膜及び脈絡膜抽出物でＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＲ−２（Ｆｌｋ−１）及びＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ２タンパク質の発現レベルを確認したウェスタンブロット結果である。乾燥ストレスが除去されたＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスに、それぞれ生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処理による各マウスの涙量の変化を確認した結果であって、ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスに３、５、７及び１０日間生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡを眼球に投与した後、マウスの涙量を測定し、平均±標準偏差で定量的結果を示した。^＊Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＳ１０Ｄ群、^＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．生理食塩水群、^§Ｐ＜０．０５ｖｓ．Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群、^¶Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＣｓＡ処理群、^†Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＱＳ処理群、^＆Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＣｓＡ処理群。Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの角膜表面屈曲性に及ぼす影響を確認した結果であって、図１６の（Ａ）は、乾燥ストレスが除去されたＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウス（ＤＳ）に３、５、７及び１０日間生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡが処理された各グループの眼球イメージ結果（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１ｍｍ）であり、図１６の（Ｂ）は、生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡが処理されたマウスの角膜表面滑らかさ点数の変化を確認した結果であって、平均±標準偏差で定量的結果を示した。^＊Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＳ１０Ｄ群、^＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．生理食塩水群、^§Ｐ＜０．０５ｖｓ．Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群、^¶Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＣｓＡ処理群、^＆Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＣｓＡ処理群。角膜上皮細胞の剥離に及ぼすＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの影響を確認した結果であって、図１７の（Ａ）は、ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの角膜に生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ投与し、１０日後、角膜上皮細胞の剥離程度を確認したヘマトキシリン＆エオシン染色結果（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）であり、図１７の（Ｂ）は、角膜上皮細胞の剥離程度を平均±標準偏差で表わした定量的結果である（^＊Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＳ１０Ｄグループ）。結膜杯状細胞の分布に及ぼすＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチド影響を確認した結果であって、図１８の（Ａ）は、生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡが投与されたＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの結膜をＰＡＳ染色した結果（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝２００μｍ）であり、図１８の（Ｂ）は、結膜杯状細胞の分布程度を平均±標準偏差で表わした定量的結果である（^＊Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＳ１０Ｄグループ）。ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの涙腺でＴＮＦ−α、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９発現程度を確認した免疫組織化学の分析結果であって、乾燥ストレスを除去させたマウスに生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡを投与し、１０日後、マウスの涙腺で前記炎症性因子の発現程度を確認した結果である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。

前記ペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ；Ｈｙｄ）であり、より望ましくは、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ）であり得る。

前記ペプチドは、コラーゲンタイプII α１由来であり、前記コラーゲンタイプII α１は、動物軟骨細胞由来の細胞外基質から分離される。

前記軟骨細胞由来の細胞外基質は、動物の軟骨組織及び／または軟骨由来軟骨細胞から分泌されて形成された軟骨細胞由来の細胞外基質から分離されたものであり、前記動物は、豚、馬、牛、羊、山羊、及び猿からなる群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。

本発明の「ペプチド」は、一般的に２個以上のα−アミノ酸がペプチド結合で連結された形態の化合物であって、構成アミノ酸の数によってジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドなどと言い、約１０個以下のペプチド結合があるものをオリゴペプチド、多数のペプチド結合からなるものをポリペプチドと言う。

本発明のペプチドは、化学方法（ＰｅｐｔｉｄｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＡｐｒａｃｔｉｃａｌＴｅｘｔｂｏｏｋ．ＭｉｋｏｓＢｏｄａｎｓｋｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ．）を用いて製造される。例えば、ペプチドは、固相技術（ＲｏｂｅｒｇｅＪＹｅｔａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：２０２−２０４）によって合成され、樹脂から切断され、高性能液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３）ＰｒｏｔｅｉｎｓＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ，ＮｅｗＹｏｒｋＮＹ）によって精製されうる。

また、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

前記眼球表面疾患は、角膜混濁、角膜血管新生、角膜炎症及び角膜纎維化からなる群から選択される何れか１つであり得る。

本発明の一実施例によれば、アルカリ火傷が誘導された動物モデルは、図４の（Ａ）のように、アルカリ火傷後、即時角膜混濁が表われ、アルカリ火傷７日後、角膜血管新生及び混濁が増加したが、角膜血管新生及び混濁が確認された動物モデルに生理食塩水またはＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドをそれぞれ１０日間処理した結果（アルカリ火傷１７日後）、図４の（Ｂ）及び図４の（Ｃ）のように、対照群の角膜混濁点数が３．０±０．０に相当増加した一方、図４の（Ｂ）のように、ペプチドが処理された実験群で混濁化の減少が表われることを確認することができた。

本発明の他の一実施例によれば、アルカリ火傷によって誘導された角膜の纎維化に及ぼすＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの影響を確認するために、Ｍａｓｓｏｎ´ｓｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を行った結果、図６のように、アルカリ火傷対照群の場合、アルカリ火傷によってストロマ部分に褐色線維芽細胞の形成が増加したことを確認することができたが、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理された実験群では、線維芽細胞の増加が抑制されたことを確認することができた。また、Ｈ＆Ｅ染色を行って、アルカリ火傷による角膜の組織学的変化を確認した結果、図７の上部を参考すれば、アルカリ火傷によって角膜に上皮増殖、炎症性細胞侵入、癲癇浮腫及び新生血管の形成が誘導されたことが確認された。

しかし、前記組織学的変化に対して、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理実験群では、向上した改善効果が表われ、図５の（Ａ）のように、Ｈ＆Ｅ染色結果でも、ペプチドが処理された組織で新生血管の形成が有意に改善されたことを確認することができた。

本発明のさらに他の一実施例によれば、炎症マーカー発現に対する各ペプチドの効果を確認するために、角膜切片に大食細胞、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＭＭＰ−９のような炎症特異的マーカーで免疫染色を行った結果、図８のように、アルカリ火傷は、上皮と上皮下及び増殖性基質で大食細胞の発現を増加させた一方、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理された実験群では、大食細胞の発現が効果的に抑制されたことを確認することができた。また、アルカリ火傷群では、ＴＮＦα、ＩＬ−１β及びＩＬ−６を含む炎症性サイトカインとＩＣＡＭ−１付着分子の発現増加が確認されたが、ペプチドが処理された実験群では、前記炎症性因子の発現が減少したことを確認することができた。追加的に、アルカリ火傷群の角膜では、ＭＭＰ−９の発現が強く表われた一方、ペプチドが処理された実験群で、ＭＭＰ−９の発現が抑制されたことを確認することができた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドは、眼球表面疾患は、角膜混濁、角膜血管新生、角膜炎症及び角膜纎維化の予防または治療に効果的であることが確認された。

前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、軟骨細胞由来の細胞外基質（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ；ＣＤＥＭ）から分離されたコラーゲンタイプII α１（ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅ II α１）由来であり得る。

より詳細には、前記軟骨細胞由来の細胞外基質は、動物の軟骨組織及び／または軟骨由来軟骨細胞から分泌されて形成された軟骨細胞由来の細胞外基質から分離されたものであり、前記動物は、豚、馬、牛、羊、山羊、及び猿からなる群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。

前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロキシプロリンであるペプチドであり、より望ましくは、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫであり得る。

前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されうる。

前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロップ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であり得る。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または改善用健康食品を提供することができる。

また、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する黄斑変性の予防または治療用薬学組成物を提供することができる。

前記ペプチドは、コラーゲンタイプII α１由来であり得る。

前記ペプチドは、眼球の新生血管の形成を抑制して黄斑変性を予防または治療し、前記黄斑変性は、老人性黄斑変性であり得るが、これに限定されるものではない。

本発明の一実施例によれば、マウスの眼球内にレーザを照射して損傷を被らせ、１４日後、眼球を摘出して、Ｈ＆Ｅ染色を行った。

その結果、図１０のように、レーザ照射部位の組織が崩壊されながら、新生血管が形成されたことを確認することができた。一方、図１１のように、レーザ照射後、コラーゲン、ＣＰＩ及びＣＰIIをそれぞれ処理した実験群では、いずれも２μｇに処理された時、ＣＮＶ病変が減少したことを確認することができた。

また、ＩｎｖｉｔｒｏＴｕｂｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ実験で最も優れた抗血管形成能を示したヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）の脈絡膜新生血管の抑制効果を陽性対照群であるアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）と比較した結果、図１１のように、ＣＰII処理群の病変サイズが対照群の病変サイズよりも有意に減少し、同じ濃度のアバスチンが処理された陽性対照群の病変サイズと類似したレベルであると確認された。

前記結果から、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドは、血管新生によって発病される老人性黄斑変性に優れた治療効果を示すことができる。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する黄斑変性の予防または改善用健康食品を提供することができる。

また、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する乾性眼の予防または治療用薬学組成物を提供する。

前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、コラーゲンタイプII α１由来であるものである。

より詳細には、前記ペプチドは、軟骨細胞由来の細胞外基質（ＣＤＥＭ）から分離されたペプチドであり、前記軟骨細胞由来の細胞外基質は、動物の軟骨組織及び／または軟骨由来軟骨細胞から分泌されて形成された軟骨細胞由来の細胞外基質から分離されたものであり、前記動物は、豚、馬、牛、羊、山羊、及び猿からなる群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。

前記ペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロキシプロリンであるペプチドであり、より望ましくは、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫであり得る。

前記ペプチドは、乾燥ストレスによる涙の生成の減少及び角膜表面の不均衡を回復させ、角膜上皮細胞の剥離及び炎症性因子の生成を抑制することができる。

本発明の一実施例によれば、図１５のように、乾燥ストレスに露出させたマウスの涙量が正常群（０．２２±０．０１μＬ）よりも約８５．５％減少（ＤＳ１０Ｄｇｒｏｕｐ、０．０３±０．０１μＬ、ｐ＜０．０５）したが、乾燥ストレス除去後、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫが処理されたマウス群（０．２３±０．０２μＬ）で処理後、１０日目で涙量が７．９倍（ｐ＜０．０５）増加し、陰性対照群である生理食塩水処理群（０．０８±０．０１μＬ）よりも約２．８倍（ｐ＜０．０５）、陽性対照群であるコラーゲン処理群（０．１３±０．０２μＬ）よりも涙量が約１．７倍（ｐ＜０．０５）増加したと確認された。

また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処置群（０．１３±０．０２μＬ；０．１６±０．０２μＬ；０．１４±０．０１μＬ）と比較して、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群の涙量は、それぞれ１．７倍（ｐ＜０．０５）、１．４倍（ｐ＜０．０５）及び１．６倍（ｐ＜０．０５）増加したと確認されることによって、涙量の改善に対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果は、現在販売される乾性眼治療剤よりも効果的であることを確認することができた。

前記ペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されうる。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する乾性眼の予防または改善用健康食品を提供することができる。

本発明の他の具体例で、前記ペプチドを有効成分として含む眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常使う適切な担体、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤、香味剤、抗酸化剤、緩衝液、靜菌剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤からなる群から選択される１つ以上の添加剤をさらに含みうる。

具体的に、担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を使用し、経口投与のための固型製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固型製剤は、前記組成物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例を挙げれば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤の以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあり、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィンの以外に、さまざまな賦形剤、例を挙げれば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。座剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。

本発明の一実施例によれば、前記薬学組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、腹腔内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式で対象体に投与することができる。

前記ペプチドの望ましい投与量は、対象体の状態及び体重、疾患の種類及び程度、薬物形態、投与経路及び期間によって変わり、当業者によって適切に選択されうる。本発明の一実施例によれば、これに制限されるものではないが、１日投与量が０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ、具体的には、０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇであり得る。投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもでき、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない。

本発明において、前記‘対象体ん’は、ヒトを含む哺乳動物であり得るが、これら例に限定されるものではない。

また、本発明において、前記健康食品は、本発明のペプチドの以外に、他の食品または食品添加物と共に使われ、通常の方法によって適切に使われる。有効成分の混合量は、その使用目的、例えば、予防、健康または治療的処置によって適するように決定されうる。

前記健康食品に含有された化合物の有効容量は、前記治療剤の有効容量に準して使用することができるが、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記範囲以下であり、有効成分は、安全性面で何の問題がないために、前記範囲以上の量でも使われうるということは確実である。

前記健康食品の種類には、特別な制限がなく、例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含んだ酪農製品、各種スープ、飲み物、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などが挙げられる。

以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。

＜実験例１＞眼球表面疾患の動物モデルの製作
目と視力研究のための動物実験は、大韓民国の仁済医科大学及びＡＲＶＯＳｔａｔｅｍｅｎｔから承認された動物実験指針書によって行われた（Ｎｏ．；２０１４−０２８）。

２．０〜２．５ｋｇのニュージーランドの白ウサギ２６匹をＳａｍｔａｋｏ（Ｏｓａｎ，Ｋｏｒｅａ）から購入し、ケタミン塩酸塩（３０ｍｇ／ｋｇｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ、Ｈｕｏｎｓ，Ｊｅｃｈｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）及びキシラジン塩酸塩（２．５ｍｇ／ｋｇ、ＢａｙｅｒＫｏｒｅａＬｔｄ．，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）混合物を筋肉に注射して、全身麻酔し、アルカリプロパラカイン（Ａｌｃａｉｎｅｐｒｏｐｒａｃａｉｎｅ）点眼液（ＡｌｃｏｎＩｎｃ．，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）を用いて局所麻酔した。

次いで、１ＮＮａＯＨを濡らした８ｍｍフィルター紙をウサギの右側の角膜中心に１分間露出させて、アルカリ火傷モデルを製作し、火傷７日後、アルカリ火傷による角膜血管新生及び角膜混濁の増加を確認した。

前記ウサギをランダムにアルカリ火傷群（ｎ＝５）及びペプチド処理群（ｎ＝５）に分けた。アルカリ火傷群は、生理食塩水を毎日４回投与し、ペプチド処理群には、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチド１０ｍｇ／ｍＬを毎日４回投与し、左目を対照群として使用した。

前記方法で、それぞれの処理物質を１０日間投与した後、Ｈ＆Ｅ染色、Ｍａｓｓｏｎ´ｓｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色及び免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を行って、纎維化、血管新生、炎症及び角膜構造の変化などを確認した。

＜実験例2＞角膜血管新生及び混濁化の確認

角膜血管新生及び混濁化に対する臨床評価を行った。

角膜血管新生の程度を０点から３点まで評価した。血管新生が表われていない場合、０点、角膜周辺部の血管新生が確認される場合、１点、瞳の縁部まで血管新生が拡張された場合、２点、及び瞳の縁部を越えて角膜中心まで血管新生が拡張された場合、３点と評価し、角膜血管新生の評価時に、相当な混濁及び幅広い瞼球癒着が形成されて、角膜血管新生の程度を評価しにくい場合、３点と評価した。

また、角膜混濁の程度を０点から３点まで評価した。虹彩部分が鮮かに見える透明な角膜の場合、０点、虹彩部分に部分的な混濁が確認される場合、１点、瞳の縁部と虹彩部分とが弱く見える時、２点、虹彩及び瞳の部分が完全に混濁化された場合、３点と評価した。

＜実験例3＞Ｍａｓｓｏｎ´ｓｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色

眼球を３．５％パラホルムアルデヒドで固定させた後、洗浄し、パラフィンが打ち込まれた組織切片（６μｍ）で製作する時まで７０％アルコールに貯蔵した。コラーゲン纎維化及び纎維化の等級程度を視覚化するために、切片にＭａｓｓｏｎｓｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を行い、仮想顕微鏡（ｖｉｒｔｕａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ２．０ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で切片のイメージを撮影した。

＜実験例4＞組織学的分析のための化学染色

組織学的分析のために、眼球を３．５％パラホルムアルデヒドで固定させた後、ｏｐｔｉｍａｌｃｕｔｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＯＣＴ；Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、ＳａｋｕｒａＦｉｎｅＴｅｃｈｎｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に打ち込み、液体窒素に冷凍させた。

試料を４％ホルムアルデヒドに２４時間固定させ、乾燥させた後、パラフィンワックスに打ち込んだ。次いで、８μｍ厚さの組織切片で準備した後、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行い、切片のイメージを仮想顕微鏡（ｖｉｒｔｕａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ２．０ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した。

＜実験例5＞免疫組織化学的分析

組織切片を６μｍ厚さに切断して免疫組織化学分析に使用した。

まず、組織切片を３．５％パラホルムアルデヒドで固定させ、０．１％トリトンＸ−１００、不活性化された２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ；ａｌｌｆｒｏｍＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を透過させ、抗ＣＤ３１（１：１，０００；ＡｂｃａｍＩｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、抗ｂＦＧＦ（１：１，０００；ＢｉｏｓｓＩｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、抗ＩＬ−１β、抗ＩＬ−６（１：１，０００；Ｃｌｏｕｄ−ＣｌｏｎｅＣｏｒｐ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）、抗ＭＭＰ−９、抗ＩＣＭＡ−１、抗ＴＮＦα、抗大食細胞／単核（１：１，０００；ＡｂｎｏｖａＣｒｏｐ．，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）及び抗ＶＥＧＦ−Ａ（Ａｂｂｉｏｔｅｃ、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）１次抗体で４℃で一晩インキュベーションした。

次いで、切片に２次抗体を４５分間インキュベーションし、ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）ｃｈｒｏｍｏｇｅｎで免疫学的反応を視覚化し、切片を室温で３０秒間Ｍａｙｅｒ´ｓｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）で対比染色した。

前記方法で染色された切片を仮想顕微鏡（ｖｉｒｔｕａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ２．０ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した。

＜実験例6＞Ｔｕｂｉｎｇａｓｓａｙ

ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの抗血管形成の効果をヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を利用したＴｕｂｉｎｇａｓｓａｙを行って、確認した。

ＨＵＶＥＣ細胞をｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色した後、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）がコーティングされた４８ウェルプレートに分周し、５０ｎｇ／ｍｌ濃度の組換えヒトＶＥＧＦと共にコラーゲン、ＣＰＩ及びＣＰIIを濃度別に処理し、３７℃インキュベーターで４時間放置した後、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で管（Ｔｕｂｅ）形成を観察し、管長さは、Ｉｍａｇｅｌａｂｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で分析した。

＜実験例7＞実験動物及び脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）モデルの製作

Ｃ５７ＢＬ／６マウスをオリエントバイオから購入し、本動物実験は、目と視力研究のための動物使用に対して大韓民国の仁済医科大学（Ｎｏ，２０１３−０５３）とＡＲＶＯに承認された指針によって行われた。６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスにダイオードグリーンレーザ（ｄｉｏｄｅｇｒｅｅｎｌａｓｅｒ；５３２ｎｍ、１５０ｍＷ、０．１ｓｅｃ、５０μｍ、ｐｈｏｔｏｃｏａｇｕｌａｔｏｒ）を用いて網膜視神経部位に損傷を与えた。レーザ（Ｌａｓｅｒ）照射直後、ＣＰI、ＣＰII及び陽性対照群アバスチンをＰＢＳに溶解して、一日に５ｍｇずつ５日間眼球内に投与した。各実験群は、それぞれ５匹ずつマウスの両目を用いて、前記実験を進行した。

＜実験例8＞組織学的分析

レーザによる組織変化を観察するために、マウス眼球を摘出して、１０％ホルマリンで固定させ、ＯＣＴ混合物に深く打ち込んだ。

前記方法で処理された８μｍ組織試料をヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ２．０ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いて撮影及び分析した。

＜実験例9＞網膜−脈絡膜フラットマウント（Ｆｌａｔ−ｍｏｕｎｔ）

レーザ照射１４日後、網膜−脈絡膜フラットマウンドを行って、ＣＰIIのＣＮＶ病変サイズの抑制効果を確認した。マウスを麻酔させ、２５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）をｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌで１００ｍｌ注射した。３０分後、マウスを安楽死し、眼球を摘出して、１０％ホルマリンで固定した後、角膜と水晶体とを除去し、カバーガラスにフラットマウントした。ＦＩＴＣ−デキストランによって染色された新生血管は、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を通じて観察し、その病変サイズをＩｍａｇｅＪｐｒｏｇｒａｍを通じて測定した。

＜実験例１0＞定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析

ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの新生血管関連遺伝子発現の抑制効果を確認するために、摘出されたマウス眼球の網膜と脈絡膜混合物とからＲＮｅａｓｙＭｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素とを用いて、ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ産物は、表１の特異的プライマーセット（コスモジンテック，Ｋｏｒｅａ）及びＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲ２ＸＰｒｅＭｉｘ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を用いて増幅させ、行われたＰＣＲ条件としては、試料を９５℃で１０分間培養した後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒及び７２℃で１５秒間進行して、４０ＰＣＲサイクルを行った。相対定量化を２−（ＤＤＣＴ）方法（ＬｉｖａｋａｎｄＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１；ＤＤＣＴ＝（ＣＴ，ｔａｒｇｅｔ−ＣＴ，ａｃｔｉｎ）処理区（ＣＴ，ｔａｒｇｅｔ−ＣＴ，ａｃｔｉｎ）対照区）で計算した。

＜実験例１1＞ウェスタンブロット

マウスの網膜と脈絡膜混合物とをプロテアーゼ抑制カクテル及びホスファターゼ抑制カクテルが含まれたＰｒｏ−ＰＲＥＰｂｕｆｆｅｒ（ｉＮｔＲＯＮ）で溶解した後、タンパク質を抽出した。

抽出されたタンパク質は、ＢＣＡａｓｓａｙｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて定量した後、ＳＤＳｇｅｌｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒと混合して、１００℃で５分間沸かして変性させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動されたタンパク質は、ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移され、次いで、非特異的タンパク質結合を遮断するために、膜を５％脱脂乳で１時間放置した後、１次抗体でＶＥＧＦ、Ｆｌｋ−１、Ｆｌｔ−１、Ａｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ−２及びβ−ａｃｔｉｎ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を処理して、一般的な免疫ブロットを行った。次いで、ＥＣＬｋｉｔ（Ａｄｖａｎｓｔａ）及びｍｕｌｔｉｐｌｅＧｅｌＤＯＣｓｙｓｔｅｍで免疫反応性タンパク質を検出した。

＜実験例１2＞実験動物及び乾性眼モデルの製作

ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２^ｂマウスをＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ、ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。動物実験は、目と視力研究のための動物使用に対して大韓民国の仁済医科大学（Ｎｏ．；２０１４−０２９）とＡＲＶＯに承認された指針によって行われた。１２〜１６週齢のＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２^ｂマウスに乾燥ストレスで一日１８時間４０〜５０％の周囲湿度とファンとを利用した通風に露出させ、皮下に０．５ｍｇ／０．２ｍＬムスカリン受容体遮断剤を注射した。また、１０日間、午前９時、午後１２時、午後３時及び午後６時の一日４回スコポラミン臭化水素酸（ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をマウスの尻側に交互に注射した。前記方法で処理されたマウスを１０日後、安楽死させ、実験期間の間の動物の行動と食べ物及び水の摂取とを制限しなかった。

眼球乾燥ストレス１０日後、スコポラミン注射を中断し、一般湿度と温度環境に転換し、乾燥ストレス除去した後、１０ｍｇ／ｍｌＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫとコラーゲンは、生理食塩水（ｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ）に溶解して、５μＬずつ一日に５回１０日間眼球に投与し、生理食塩水及び０．１％ＨＡは、一日に５回１０日間眼球に投与した。６つの実験群は、それぞれ３匹ずつマウスの両目を用いて、前記実験を進行し、あらゆる実験は、繰り返して進められた。

＜実験例１3＞涙量の確認

涙の生成をフェノールレッド−浸潤綿スレッド（ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ−ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅｄｃｏｔｔｏｎｔｈｒｅａｄｓ；Ｚｏｎｅ−Ｑｕｉｃｋ；Ｏａｓｉｓ、Ｇｌｅｎｄｏｒａ、ＣＡ）を用いて報告された方法（ＶｉｌｌａｒｅａｌＡＬ，ＦａｒｌｅｙＷ，ＰｆｌｕｇｆｅｌｄｅｒＳＣ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｏｐｉｃａｌｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｅｐｉｎａｓｔｉｎｅａｎｄｏｌｏｐａｔａｄｉｎｅｏｎｔｅａｒｖｏｌｕｍｅｉｎｍｉｃｅ．ＥｙｅＣｏｎｔａｃｔＬｅｎｓ．２００６；３２（６）：２７２−２７６．）で測定した。涙量は、医療用ピンセットを用いてスレッドを２０秒間側面眼角に位置させ、涙に濡れて赤色に変わったスレッドを顕微鏡（ＳＺＸ７；Ｏｌｙｍｐｕｓｃｏｒｐ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察して、ｍｍで表示した。前記測定されたｍｍ内の涙液を２０秒間マウスの涙量と予想される容量の塩基性溶液（０．９％塩分１５００ｍＬと５ｍＬの５ＮＮａＯＨ）を濡らした綿スレッドで表わした標準曲線と比較した。

＜実験例１4＞角膜表面の屈曲性の評価

角膜表面の屈曲性は、動物を麻酔後、実体顕微鏡（ＳＺＸ７；Ｏｌｙｍｐｕｓ）の光繊維リング照明から白リングの反射イメージを得た。角膜の滑らかさをデジタルイメージの白リングに反射された角膜上皮細胞の不規則性を等級化して評価した。角膜不規則性の深刻度点数は、反射リングを４等分に分けて不規則性程度によって５等級で計算した。不規則性ないは０等級、１／４等分の不規則性を１等級；２／４等分の不規則性は２等級；３／４等分の不規則性を３等級；いずれも不規則な程度を４等級；深刻な程度を５等級にしてあらゆるリングを確認した。

＜実施例１＞タンパク質分析及びペプチド合成

Ｂａｅｋ´ｓｇｒｏｕｐｏｆＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＭａｓｓＳｅｐｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＤｉａｔｅｃｈＫｏｒｅａＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）で動物軟骨細胞由来の細胞外基質のタンパク質分析を行った。

前記タンパク質分析を通じてコラーゲンタイプII α１タンパク質のアミノ酸配列の一部に該当するヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ；配列番号１）を得て、前記ペプチドを、図１のように（株）バイオセルトラン（ＢＩＯＣＥＬＴＲＡＮ；Ｃｈｕｎｃｈｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）で合成した。

ＨＰＬＣを行って、前記合成されたヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの純度を確認した結果、図２のように、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが純度９９．３％に合成されたことを確認することができた。

また、Ｉｏｎ−Ｍａｓｓを通じてヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの分子量を確認した結果であって、図３のように、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの分子量が６５４．９９であると確認された。

＜実施例２＞ペプチドによる角膜血管新生及び混濁化の変化確認

角膜アルカリ火傷７日後、角膜血管新生及び混濁化に対する臨床評価を行った。

その結果、図４の（Ａ）のように、アルカリ火傷後、即時角膜混濁が表われ、アルカリ火傷７日後、角膜血管新生及び混濁が増加したことを確認することができた。

角膜血管新生及び混濁が確認された後、生理食塩水またはＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドをそれぞれ１０日間処理した結果（アルカリ火傷１７日後）、図４の（Ｂ）及び図４の（Ｃ）のように、対照群の角膜混濁点数が３．０であって、相当増加し、血管新生点数は２．８であって、新生血管が瞳の縁部を越えて角膜中心まで拡張されたことを確認することができた。

一方、図４の（Ｂ）のように、ペプチドが処理された実験群で混濁化の減少効果が表われることを確認することができた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが、角膜混濁化の阻害に効果的であることが確認された。

＜実施例３＞ペプチドによる角膜の厚さの変化確認

仮想顕微鏡（ｖｉｒｔｕａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ２．０ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影したＨ＆Ｅ染色切片の角膜の厚さをＮＤＰｖｉｅｗプログラム（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，ＵＳＡ）を用いて分析した。

その結果、図５の（Ｂ）のように、アルカリ火傷後、角膜の厚さが正常範囲である５２６．６μｍから９６０．６μｍに増加したことを確認することができた。

しかし、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチド処理１０日後、ペプチドが処理された実験群では、角膜の厚さが５５０．０μｍ（ｐ＜０．０５）であって、アルカリ火傷群よりも減少したことを確認することができた。

＜実施例４＞ペプチドの角膜纎維化の抑制効果確認

アルカリ火傷によって誘導された角膜の纎維化に及ぼすＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの影響を確認するために、Ｍａｓｓｏｎ´ｓｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を行った。

その結果、図６のように、アルカリ火傷対照群の場合、アルカリ火傷によってストロマ部分に褐色線維芽細胞の形成が増加したことが確認されたが、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理された実験群では、線維芽細胞の増加が抑制されたことを確認することができた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが線維芽細胞の増加を阻害することにより、角膜纎維化の抑制に効果的であることが確認された。

＜実施例５＞ペプチドの角膜血管新生の抑制効果確認

Ｈ＆Ｅ染色を行って、アルカリ火傷による角膜の組織学的変化を確認した。

その結果、図７の上部を参考すれば、アルカリ火傷によって角膜に上皮増殖、炎症性細胞侵入、癲癇浮腫及び新生血管の形成が誘導されたことが確認された。

しかし、前記組織学的変化に対して、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが、処理実験群では向上した改善効果が表われ、図５の（Ａ）のように、Ｈ＆Ｅ染色結果でも、ペプチドが処理された組織で新生血管の形成が有意に改善されたことを確認することができた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが、新生血管の形成に影響を及ぼすと確認されることによって、アルカリ火傷を負わせた角膜でＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチド処理し、角膜血管新生の特異的マーカーであるＣＤ３１、ＦＧＦ及びＶＥＧＦを用いて、角膜切片に免疫染色を行った。

その結果、図７のように、ＣＤ３１、ＦＧＦ及びＶＥＧＦ血管新生マーカーが、アルカリ火傷による纎維化基質細胞で強く発現されることを確認することができた。

しかし、ペプチドが処理された実験群では、上皮、上皮下及び基質でＣＤ３１、ＦＧＦ及びＶＥＧＦの有意な減少を確認することができた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが、角膜血管新生の阻害に効果的であることが確認された。

＜実施例６＞ペプチドの抗炎症の効果確認

前記Ｈ＆Ｅ染色遂行結果、アルカリ火傷によって炎症細胞が角膜に侵透したことを確認することができた。したがって、炎症マーカー発現に対する各ペプチドの効果を確認するために、角膜切片に大食細胞、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＭＭＰ−９のような炎症特異的マーカーで免疫染色を行った。

その結果、図８のように、アルカリ火傷は、上皮と上皮下及び増殖性基質で大食細胞の発現を増加させた一方、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理された実験群では、大食細胞の発現が効果的に抑制されたことを確認することができた。また、アルカリ火傷群では、ＴＮＦα、ＩＬ−１β及びＩＬ−６を含む炎症性サイトカインとＩＣＡＭ−１付着分子の発現増加が確認されたが、ペプチドが処理された実験群では、前記炎症性因子の発現が減少したことを確認することができた。追加的に、アルカリ火傷群の角膜では、ＭＭＰ−９の発現が強く表われた一方、ペプチドが処理された実験群で、ＭＭＰ−９の発現が抑制されたことを確認することができた。

＜実施例７＞ペプチドの血管形成の抑制効果確認

ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を利用したＴｕｂｉｎｇａｓｓａｙを行って、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの抗血管形成の効果を確認した。

その結果、図９のように、ＶＥＧＦ処理群では、ＶＥＧＦ非処理群よりも管形成（Ｔｕｂｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が約１．５倍以上増加した一方、コラーゲン、ＣＰＩ及びＣＰIIが処理された実験群では、いずれも有意的に血管形成が抑制された。特に、ＣＰIIは、濃度依存的に管形成を抑制し、ＶＥＧＦ非処理群の血管形成の程度とほぼ同様に減少したと表われた。また、年齢関連黄斑変性治療剤であるアバスチン処理群とも、類似したレベルに確認された。

＜実施例８＞ペプチドの脈絡膜新生血管の抑制効果確認

実験例7のような方法でマウス眼球にレーザを照射し、レーザ照射１４日後、眼球を摘出して、Ｈ＆Ｅ染色を行った。

その結果、図１０のように、レーザ照射部位の組織が崩壊されながら、新生血管が形成されたことを確認することができた。一方、図３のように、コラーゲン、ＣＰＩ及びＣＰIIをそれぞれ眼球内注射で５日間処理した実験群では、いずれも２μｇに処理された時、ＣＮＶ病変が減少したことを確認することができた。

また、前記実験で確認したように、ＩｎｖｉｔｒｏＴｕｂｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ実験で最も優れた抗血管形成能を示したヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）の脈絡膜新生血管の抑制効果を陽性対照群であるアバスチンと比較するために、レーザ照射直後からＣＰII及びアバスチンをそれぞれ５μｇずつ５日間連続して眼球内注射し、レーザ照射１４日後、眼球を摘出した後、血管をＦＩＴＣ−デキストランで染色した後、フラットマウンド実験を行って、ＣＮＶ病変サイズを測定した。

その結果、図１１のように、ＣＰII処理群の病変サイズが対照群の病変サイズよりも有意に減少し、同じ濃度のアバスチンが処理された陽性対照群の病変サイズと類似したレベルであると確認された。

＜実施例９＞ペプチドの新生血管関連遺伝子及びタンパク質の抑制効果確認

マウスにレーザ照射１４日後、網膜と脈絡膜とからＲＮＡを抽出して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで遺伝子発現を分析した。

その結果、図１２のように、代表的な新生血管関連遺伝子であるＶＥＧＦが、レーザ処理群では５５倍程度発現が増加したが、アバスチン処理群及びＣＰII処理群では、レーザ非処理群と類似しているレベルに減少したことを確認することができた。

一方、ＩＣＡＭ及びＭＣＰ−１遺伝子は、レーザ処理群でそれぞれ約３００倍及び１０倍の発現増加が確認されたが、これも、ＣＰII処理群では、有意的に減少したことを確認することができた。

また、新生血管関連タンパク質マーカーの発現において、ＣＰIIの効果を評価するために、レーザ照射１４日後、網膜と脈絡膜とからタンパク質を抽出して、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＲ−２（Ｆｌｋ−１）及びＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ２の免疫ブロッティングを行った。

その結果、図１３のように、レーザ照射によって新生血管形成促進因子であるＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ２とＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２との発現が著しく増加したことを確認することができ、特に、新生血管の形成に最も重要な役割を果たすと知られたＶＥＧＦの発現が著しく増加した。しかし、ＣＰIIが処理された実験群では、前記タンパク質の発現が著しく減少し、年齢関連黄斑変性治療剤アバスチンとほぼ類似したレベルを示した。

＜実施例１０＞涙の生成の効果確認

涙の生成程度をフェノールレッド−浸潤綿スレッドで測定した。

その結果、図１５のように、乾燥ストレスは、ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２^ｂマウスの涙量を正常群（０．２２±０．０１μＬ）と比較して、約８５．５％有意なレベルに減少したことを確認することができた（ＤＳ１０Ｄｇｒｏｕｐ、０．０３±０．０１μＬ、ｐ＜０．０５）。一方、乾燥ストレス除去後、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群（０．２３±０．０２μＬ）は、処理１０日目で涙量が７．９倍（ｐ＜０．０５）増加し、陰性対照群であるｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ処理群（０．０８±０．０１μＬ）と比較して、約２．８倍（ｐ＜０．０５）、陽性対照群であるコラーゲン処理群（０．１３±０．０２μＬ）と比較して、涙量が約１．７倍（ｐ＜０．０５）増加したことを確認することができた。

また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ（ＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅＡ；０．１３±０．０２μＬ）、ＤＱＳ（Ｄｉｑｕａｓ；０．１６±０．０２μＬ）及びＨＡ（Ｈｙａｌｕｎｉ；０．１４±０．０１μＬ）と比較して、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群の涙量は、それぞれ１．７倍（ｐ＜０．０５）、１．４倍（ｐ＜０．０５）及び１．６倍（Ｐ＜０．０５）増加したと表われた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫは、現在販売される乾性眼治療剤よりも高いレベルに減少した涙量を回復させると確認された。

＜実施例１１＞角膜表面の屈曲性確認

各実験群の角膜表面の屈曲程度を数値化して、角膜表面の屈曲性を確認した。

その結果、図１６のように、正常角膜（０．３３±０．５８点）と比較して、１０日間乾燥ストレスに露出されたマウスの角膜表面の屈曲程度は、約１３倍（４．３３±０．５８点；ｐ＜０．０５）増加したことを確認することができた。一方、乾燥ストレス除去後、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群（２．０±０点）１０日目で角膜表面の屈曲性が５３．８％（ｐ＜０．０５）有意的に減少し、陰性対照群であるｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ処理群（３．３３±１．５３点）よりは４０％（ｐ＜０．０５）、陽性対照群であるコラーゲン処理群（３．６７±１．１６点）よりは４５．５％（ｐ＜０．０５）が減少したことを確認することができた。

また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処理群（３．３３±０．５８点；３．０±１．０点；３．０±０点）と比較して、それぞれ４０％（ｐ＜０．０５）、３３．３％（ｐ＜０．０５）及び３３．３％（ｐ＜０．０５）に角膜表面の屈曲程度が減少したことを確認することができた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫは、乾性眼治療剤よりも角膜表面の屈曲性の改善に効果的であると確認された。

＜実施例１２＞角膜上皮細胞の剥離抑制効果確認

角膜上皮細胞の剥離に及ぼすペプチドの影響を確認するために、各実験群マウスの角膜をＨ＆Ｅ染色した。

その結果、図１７のように、乾燥ストレスによって角膜の上皮細胞の剥離が２４倍増加した（２．２９±０．５７／０．１ｍｍ^２、ｐ＜０．０５）。一方、乾燥ストレス除去後、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群（０．３８±０．１７／０．１ｍｍ^２）で角膜の上皮細胞の剥離が８３．３％（ｐ＜０．０５）減少した。また、陰性対照群であるｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ処理群（１．３３±０．１７／０．１ｍｍ^２）と比較して、７１．４％（ｐ＜０．０５）角膜上皮細胞の剥離が減少し、陽性対照群であるコラーゲン処理群（０．８６±０．２９／０．１ｍｍ^２）よりは、５５．６％（ｐ＜０．０５）角膜上皮細胞の剥離が減少した。

また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処理群（１．５２±０．３３／０．１ｍｍ^２；０．０９５±０．１７／０．１ｍｍ^２；１．７１±０／０．１ｍｍ^２）と比較して、それぞれ７５％（ｐ＜０．０５）、６０％（ｐ＜０．０５）及び７７．８％（ｐ＜０．０５）有意的に減少したことを確認することができた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫが、乾性眼治療剤よりも角膜上皮細胞の剥離の減少に効果的であると確認された。

＜実施例１３＞結膜杯状細胞の分布に及ぼす影響確認

乾性眼マウスモデルを対象にして点眼による結膜杯状細胞の分布を観察した。

その結果、図１８のように、乾燥ストレスは、正常結膜（１４．３８±０．４４／０．１ｍｍ^２）と比較して、５８．２％（６．０２±０．２９／０．１ｍｍ^２、ｐ＜０．０５）杯状細胞を減少させた。一方、乾燥ストレス除去後、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群（１３．９±０．８３／０．１ｍｍ^２）では、減少した杯状細胞が２．３倍（ｐ＜０．０５）回復され、陰性対照群であるｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ処理群（５．４３±０．２９／０．１ｍｍ^２）と比較して、２．６倍（ｐ＜０．０５）増加し、陽性対照群であるｃｏｌｌａｇｅｎ処理群（１１．０５±０．３３／０．１ｍｍ^２）と比較して、１．３倍（ｐ＜０．０５）増加したことを確認することができた。

また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処理群（１１．１４±０．７６／０．１ｍｍ^２；８．８６±０．２９／０．１ｍｍ^２；８．６７±０．１７／０．１ｍｍ^２）と比較して、それぞれ１．２倍（ｐ＜０．０５）、１．５倍（ｐ＜０．０５）及び１．６倍（ｐ＜０．０５）有意に杯状細胞が回復されたことを確認することができた。

前記結果から、結膜の杯状細胞の分布は、ｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ処理を除いた残りの処理群でも結膜の杯状細胞の分布が改善されると表われたが、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫが処理された動物の角膜で著しく増加したことを確認することができた。

＜実施例１４＞乾性眼マウスモデルで抗炎症の効果確認

乾性眼マウスモデルを対象にして炎症反応因子の発現において、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を評価するために、涙腺でＴＮＦ−α、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の免疫染色を行った。

その結果、図１９のように、乾燥ストレスによって涙腺で炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αと付着分子であるＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１の発現が著しく増加したことを確認することができ、乾燥ストレスによって涙腺のＭＭＰ−２とＭＭＰ−９も、顕著に増加した。しかし、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫが処理されたマウスモデルの涙腺では、炎症関連因子の発現が著しく減少したことを確認することができ、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡが処理されたマウスモデルよりも、顕著に抑制されたことを確認することができた。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な記述は、単に望ましい実施態様であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、下記の特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。

Claims

配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
前記ペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロキシプロリン（Ｈｙｄ）であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、コラーゲンタイプII α１由来であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
前記コラーゲンタイプII α１は、動物軟骨細胞由来の細胞外基質から分離されたことを特徴とする請求項３に記載のペプチド。
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
前記眼球表面疾患は、角膜混濁、角膜血管新生、角膜炎症及び角膜纎維化からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする請求項５に記載の眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
前記ペプチドは、軟骨細胞由来の細胞外基質（ＣＤＥＭ）から分離されたコラーゲンタイプII α１由来であることを特徴とする請求項５に記載の眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
前記ペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されることを特徴とする請求項５に記載の眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロップ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であることを特徴とする請求項５に記載の眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または改善用健康食品。
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有する乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
前記ペプチドは、コラーゲンタイプII α１由来であることを特徴とする請求項１１に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
前記ペプチドは、乾燥ストレスによる涙の生成の減少及び角膜表面の不均衡を回復させ、角膜上皮細胞の剥離及び炎症性因子の生成を抑制することを特徴とする請求項１１に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
前記ペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されることを特徴とする請求項１１に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロップ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であることを特徴とする請求項１１に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有する乾性眼の予防または改善用健康食品。