JP2017524340A - 多能性幹細胞由来の機能性オリゴデンドロサイト、ならびにその作製方法及び使用方法 - Google Patents
多能性幹細胞由来の機能性オリゴデンドロサイト、ならびにその作製方法及び使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2014年5月22日付米国特許仮出願第62/002,048号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に援用される。
添付の配列表中の物質は、本明細書では参照により本出願中に取り込まれる。添付の配列を収載しているテキストファイル、ファイル名NYSC1250_1WO_Sequence_Listing_ST25は、2015年5月22日に作成され、2kbである。当該ファイルはWindowsのOSを使用したコンピューター上でMicrosoft Wordを使用して評価することができる。
オリゴデンドロサイトは、脊椎動物に存在する中枢神経系細胞である。オリゴデンドロサイトは、積層された脂質に富むミエリン鞘を生成し、当該ミエリン鞘は、ニューロンの軸索を包んで電気絶縁用の規定のセグメントを形成し、活動電位の伝導速度を最大化する。ミエリンは軸索の完全性及び生存にも重要であり、オリゴデンドロサイトの代謝に影響を与える小さな変化でさえも神経変性を招くことが分かっている。Kassmann,C.M.ら、Nature Genet.39:969〜976(2007年)(非特許文献1)。ヒトの脳はミエリン化したニューロン(白質)の含有量が高く、また出生後から生涯を通じてミエリン化が継続することから、ミエリン形成プロセスはヒトにおいて特に重要である。Bartzokis,G.,Adolescent Psychiat.29:55〜96(2005年)(非特許文献2)。このことは、オリゴデンドロサイトは単に不活性な絶縁体を提供している訳ではなく、むしろミエリン化は認知機能や行動にさえ影響を与える動的なプロセスであることを示唆している。
本発明者らは、増殖因子に富む化学的組成が明らかな培地を用いる、PSCからヒトオリゴデンドロサイトを生成する安定的で迅速かつ再現可能な分化プロトコルを開発した。本発明者らのプロトコルは発生中のオリゴデンドロサイト分化を模倣している。PSCは8日以内にPAX6+神経幹細胞に分化し、該細胞から12日目までにOLIG2+前駆細胞が発生する。OLIG2+細胞は、18日目前後に共発現NKX2.2によってオリゴデンドロサイト系列にコミットされ、その後、40日目前後にSOX10及びPDGFRαの上方制御により初期OPCに分化する。O4抗体(O4+)に認識される硫酸化糖脂質抗原を発現する後期OPCが50日目前後に出現し、それは分化の75日目までに細胞集団の40〜70%に達する。O4+オリゴデンドロサイト前駆細胞は、ミエリン化の研究のために細胞選別により単離することができ、または最終的にMBP+の成熟オリゴデンドロサイトに分化することができる。本発明者らのオリゴデンドロサイト分化プロトコルのタイムラインを図1に示す。
OLIG2‐GFPノックインhESCレポーター株(Liuら、2011年)を使用し、ライブ蛍光イメージングによりOLIG2+前駆細胞を追跡した。初めに、接着培養においてSMADシグナル伝達の二重阻害を利用してPAX6+細胞を誘導した。Chambers,S.M.ら、Nat Biotechnol.27:275〜80(2009年)。次に、胚脊髄環境を模倣するために、様々な時間で様々な濃度のRA及び/またはSHHを使用し、フローサイトメトリーによりOLIG2‐GFP発現を定量した(図2A)。誘導開始時から100nMのRAを使用したところ、40.6%のOLIG2+前駆細胞が生成されたが、8日目からSHHを100ng/ml添加したところ、その収率は57.7%に増加した(図2B)。興味深いことに、外因性SHHを含まない細胞は初めの12日間でSHHのmRNAの上方制御を示し(図3A)、また、SHHで処置した細胞と比較して低い効率ではあったが、O4+細胞に分化した(図3B)。
本発明者らのプロトコルがiPSC株に適用できることを示すため、4人のPPMS患者から皮膚生検を取得した。生検から繊維芽細胞の培養物を樹立し、最も不応性の株のリプログラミング効率を改善するためにmiRNAのクラスターと共に修飾mRNAカクテル(Warrenら、Cell Stem Cell.7:618〜30(2010年))を毎日トランスフェクションしてiPSCを生成した(Stemgent社)。リプログラミングの12日目〜15日目に、TRA‐1‐60+コロニー(図8A)をライブ染色で同定し、選択し、増殖させ、多能性マーカーの免疫蛍光法により特徴付けした(図8B)。
本発明者らのプロトコルにより得たOPCが機能的にミエリンを形成し得ることを検証するため、75日目のFACS精製O4+細胞(105細胞/匹)を免疫無防備状態のシバラーマウス新生仔の前脳に注射した(図11A)。フローサイトメトリーによる多能性マーカーSSEA4及びTRA‐1‐60の分析により示されるとおり、注入した細胞にはiPSCの混入はなかった(図11B)。しかし、臨床試験に移行できる可能性を維持するため、インビボでの移植前に該培養物を精製した。細胞を凍結し、解凍し、移植の24〜48時間前に元の状態にした(図11C)。ヒトhNA+細胞が検体脳梁及び前脳白質全体に分布した時点の12〜16週目に動物を屠殺した。12週目の検体脳梁内のhNA+細胞の密度は34,400±3,090細胞/mm3であり、ヒト細胞数は16週目までに12週目のおよそ2倍になった。細胞クラスターの存在または明確な腫瘍形成は観察されず、生着したhNA+細胞の増殖画分は12週目で17%であり、16週目にはKi67+はわずか8%まで減少し、このとき細胞の5%だけがPCNA+であった。重要なのは、検体脳梁中80%を超えるhNA+細胞がOLIG2タンパク質を共発現したことであり、このことは生着細胞がオリゴデンドロサイト系列に限定されることを示唆していた(図12E)。更に、12及び16週目に、ヒトMBP+オリゴデンドロサイトは生着した検体脳梁全体に散見された(図12A)。16週目に、生着したマウス検体脳梁内で31±3%の宿主マウス軸索が被鞘されていた(図12B)。
細胞株
3種のhESC株及び4種のhiPSC株を使用した。RUES1及びHUES45は両方ともNIHで承認されたhESC株であり;OLIG2‐GFPレポーター株はBG01のhESC株(University of Texas Health Science Center、ヒューストン)に由来する。4種のiPSC株は、本発明者らの研究所において、mRNA/miRNA法(Stemgent社)によりPPMS患者の皮膚生検から誘導された。
HUESM(HUman Embryonic Stem Medium)培地及び10ng/mlのbFGF(Stemcell Technologies社)を使用してマウス胚線維芽細胞(MEF)層上でhESC及びhiPSC株を培養し増殖させた。オリゴデンドロサイト分化の場合は、細胞を、MATRIGEL(登録商標)でコーティングしたディッシュ上でのmTeSR1培地(Stemcell Technologies社)での培養に移した。HUESMは、ノックアウト‐DMEM、20%ノックアウト血清、2mMのglutamax、0.1mMのNEAA、0.1mMの1XP/S及びβ‐メルカプトエタノールから構成され、これらは全てLife Technologies社(グランドアイランド、ニューヨーク州)から購入した。全段階で分化細胞は5%CO2インキュベーター中で培養する。
10μMのROCK阻害剤Y‐27632(Stemgent社;ケンブリッジ、マサチューセッツ州)を含むmTeSR1培地(Stemcell Technologies社;バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ)中、10×103細胞/cm2の密度でPSCをMATRIGEL(登録商標)(BD Biosciences社;サンノゼ、カリフォルニア州)上に播種し、24時間、平板培養した。播種したhPSCのこの密度は、分化の8日目までに十分にコンフルエントになるように、また分化の12日目に多層構造になるように最適化したものである。この構成には、6ウェルプレートのうち1ウェル(80%コンフルエント)だけで、少なくとも2×106個のオリゴデンドロサイトを分化及び単離するのに十分な細胞を含んでいるため、大幅なPSC増殖は必要ない。hPSCコロニーが直径100〜250μmに達するまで細胞を1〜2日間インキュベートした。
30日目に、スフィアを上述のようにPDGF培地中、pO/Lプレートに播種し、分化の75日目まで1日おきにPDGF培地の2/3を交換した。55日目以降に、ライブO4染色によりO4+細胞の出現を評価した(図6)。75日目に、FACSによってO4+OPCを単離することができた(図7I)。あるいは、最終オリゴデンドロサイト分化(図7G、7H)では、75日目から細胞をグリア培地中で培養し、3日おきに2週間、培地の2/3を交換した。
30日目に、スフィアを上述のようにグリア培地中、pO/Lプレートに播種し、分化の55日目まで1日おきにグリア培地の2/3を交換した。55日目に、ライブO4染色によりO4+細胞が視認可能になり(図6A〜F、図7F)、またはFACSにより該細胞を単離した(図6G)。75日目に、FACSによりO4+OPCを単離することができた。あるいは、75日目までグリア培地中で培養物を維持し、O4+細胞の収率を高めた(図6)。約60日目にMBP+細胞が出現し始めたことが観察された。
皮膚生検をMS患者及び健常者から得た(図13)。Tisch Multiple Sclerosis Research Center of New Yorkの4人の匿名患者が、標準的な診断基準に従ってPPMSと診断された。施設内倫理委員会の承認(BRANY)及びインフォームドコンセントの下に当該患者らの生検を得た。患者は全て白人である。患者102及び107は男性で、それぞれ56歳及び61歳であり;患者104及び109は女性で、それぞれ62歳及び50歳である。
継代3〜5代目の皮膚繊維芽細胞をStemgent社のmRNA/miRNAキットを使用してリプログラミングし、これによりOCT4、SOX2、KLF4、cMYC及びLIN28の修飾RNAを介して、遺伝子挿入がないウイルスフリーのヒトiPSCが生成された(図14)。特定のmiRNAクラスターの添加によってリプログラミング効率が高まることが分かっている(Stemgent社)。すなわち、線維芽細胞を、培養培地中5.5×103細胞/cm2の密度で、Matrigelでコーティングした6ウェルまたは12ウェルプレート上に播種した。翌日、培地を、B18Rを含有するNuFF−conditioned Pluriton reprogramming mediumと交換した。細胞は、STEMFECT(商標)を用いて、0日目はmiRNAのみ、1日目〜3日目はmRNAカクテルのみ、4日目はmRNAを加えたmiRNAカクテル、5日目〜11日目はmRNAカクテルのみを用いて連続11日間トランスフェクションされた。11日目の後、ライブTRA‐1‐60のために陽性染色された視認可能コロニーを選択し、HUESM培地を用いてMEF上に再播種した。
実験はColumbia Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)に承認されたプロトコルに従って行った。
iPSCをACCUTASE(登録商標)(Life Technologies社)で37℃、5分間かけて分離し、bFGFを含まないHUESM中、超低接着6ウェルプレートに播種し、一日おきに培地を交換した。培養から3週間後、胚様体(EB)を1%ゼラチンでコーティングしたTC処理ディッシュ上で更に2週間平板培養した。EB及びそれらの派生物を4%PFA中、RTで8分間固定し、適当なマーカーで免疫染色した。
QIAshredder(Qiagen社; ヒルデン、ドイツ)を含むRNeasy Plus Mini Kitを使用してRNA単離を行った。すなわち、細胞をペレット化し、PBSで洗浄し、溶解緩衝液に再懸濁した。その後、メーカーの使用説明書に従って更に処理するまで、試料を−80℃で保存した。RNAを30μlのRNA分解酵素フリーddH2O中に溶出し、NanoDrop8000分光光度計(Thermo Scientific社;サマセット、ニュージャージー州)で定量した。
上述したように、未分化iPSC及びhESC HUES45からRNAを単離した。メーカーの使用説明書に従って、特定のReporter Code Set及びCapture Probe Set(NanoString Technologies社;シアトル、ワシントン州)を用いてハイブリダイゼーション用のRNA(100ng/試料)をロードした。データは、以下のハウスキーピング遺伝子:ACTB、POLR2A、ALAS1に対して正規化した。データは、hESC株(HUES45=1)の発現に対する変化倍率として表した。図15を参照されたい。
正常な核型を確認するため、全iPSC株をCell Line Geneticsによる細胞遺伝学的分析に供した。
細胞を、PBS‐T(0.1%Triton‐X100を含むPBS)中で10分間かけて3回洗浄し、ブロッキング血清(5%ヤギまたはロバ血清を含むPBS‐T)中で2時間インキュベートし、一次抗体を添加して4℃で一晩置いた(表4)。翌日、細胞をPBS‐T中で15分間かけて3回洗浄し、室温(RT)で二次抗体と共に2時間インキュベートし、PBS‐T中で10分間かけて3回洗浄し、室温で15分間DAPIにより対比染色し、PBSで2回洗浄した。Invitrogen(商標)のAlexa Fluor二次抗体、ヤギまたはロバの抗マウス、ラット、ウサギ、ヤギ及びニワトリ488、555、568及び647を1:500希釈して使用した(Life Technologies社)。
37℃、25分間のACCUTASE(登録商標)処理により細胞を酵素的に回収し、単一細胞懸濁液を得た。次いで、適当な量の一次抗体または蛍光結合抗体のいずれかを含有する培地それぞれ100μlに細胞を再懸濁し、遮光して氷上で30分間インキュベートした。二次抗体を使用する場合、一次抗体はPBSで洗浄し、二次抗体は氷上に30分間置いた。染色された細胞、またはGFPを発現する細胞をPBSで洗浄し、20psiの100μmのセラミックノズルを使用した5レーザーのBD Biosciences社製ARIA‐IIu(商標)Cell Sorterで即時に選別した。死細胞を排除するためにDAPIを使用した。BD FACSDiva(商標)ソフトウェアを用いてフローサイトメトリーデータを分析した。
シバラー/rag2マウス(University of Rochester;Windrem,M.S.ら、Cell Stem Cell.2:553〜565(2008年))を用いた全実験は、University at Buffalo Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)に承認されたプロトコルに従って行った。事前に凍結保存されていたFACS選別O4+OPCを解凍し、PDGF培地中、pO/Lディッシュ上で平板培養することにより手術前の1〜2日間で回復させた。1μl当り1×105個で細胞を再懸濁することにより、細胞を注射用に調製した。
本開示の他の項で引用された文献に加えて、以下の参考文献により更なる状況が提供され得る。本開示に引用された参考文献は全て、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。更に、本明細書に引用または言及されているあらゆる製品のメーカーの使用説明書またはカタログが、参照により取り込まれる。参照により本文書に取り込まれた文献またはその中のあらゆる教示を、本発明の実施において使用することができる。参照により本文書に取り込まれた文献は、先行技術であると認めたものではない。
Claims (86)
- OLIG2+オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の生成方法であって、
a.以下によって多能性幹細胞(PSC)コロニーを調製する段階:
i.PSCを低密度で表面上に播種すること;及び
ii.前記PSCを1〜2日間、接着培養することであって、それによりPSCコロニーが調製される、こと;
b.前記PSCコロニーを、低濃度レチノイン酸(RA)と、形質転換増殖因子ベータ(TGFβ)シグナル伝達の少なくとも1種の阻害剤と、骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の少なくとも1種の阻害剤とを含む培地中でコンフルエントになるまで培養する段階であって、前記培養の初日を0日目とする、段階;ならびに
c.コンフルエントな前記細胞を、スムーズンドアゴニスト(SAG)及び低濃度RAを含む培地中でオーバーコンフルエントになるまで培養する段階であって、前記細胞がOLIG2を発現する、段階;
を含み、それによりOLIG2+OPCが生成される、前記方法。 - O4+オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の生成方法であって、
a.OLIG2+OPCの三次元細胞凝集体を、SAG及び低濃度RAを含む培地中で約8日間、懸濁培養する段階;
b.前記細胞凝集体を、血小板由来増殖因子(PDGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、インスリン様増殖因子1(IGF−1)及びニューロトロフィン3(NT3)を含む培地中で約10日間、懸濁培養する段階;
c.前記細胞凝集体を、スフィア2個/cm2の密度でプレートに再播種する段階;ならびに
d.前記細胞凝集体を、(i)アスコルビン酸(AA)または(ii)PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む培地中で、細胞がO4+になるまで接着培養する段階;
を含み、それによりO4+OPCが生成される、前記方法。 - オリゴデンドロサイトの生成方法であって、請求項2に記載の方法に従ってO4+OPCを生成する段階;ならびに前記O4+OPCをPDGF、HGF、IGF‐1及びNT3の非存在下で約3週間培養する段階;を含み、それによりオリゴデンドロサイトが生成され、前記オリゴデンドロサイトがミエリン塩基性タンパク質(MBP)+である、前記方法。
- オリゴデンドロサイトの生成方法であって、
a.以下によってPSCコロニーを調製する段階:
i.PSCを低密度で表面上に播種すること;及び
ii.前記PSCを1〜2日間、接着培養することであって、それによりPSCコロニーが調製される、こと;
b.前記PSCコロニーを、低濃度RAと、TGFβシグナル伝達の少なくとも1種の阻害剤と、BMPシグナル伝達の少なくとも1種の阻害剤とを含む培地中でコンフルエントになるまで培養する段階であって、前記培養の初日を0日目とする、段階;
c.コンフルエントな前記細胞を、SAG及び低濃度RAを含む培地中でオーバーコンフルエントになるまで培養する段階であって、前記細胞がOLIG2+OPCである、段階;
d.前記細胞を前記表面から剥離する段階であって、それにより三次元細胞凝集体が形成される、段階;
e.前記細胞凝集体を、SAG及び低濃度RAを含む培地中で約8日間、懸濁培養する段階;
f.前記細胞凝集体を、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む培地中で約10日間、懸濁培養する段階;
g.前記細胞凝集体を、スフィア2個/cm2の密度でプレートに再播種する段階;
h.前記細胞凝集体を、(i)AAまたは(ii)PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む培地中で、細胞がO4+になるまで接着培養する段階であって、それによりO4+OPCが生成される、段階;ならびに
i.前記O4+OPCを、AAを含むがPDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含まない培地中で、細胞がMBP+になるまで培養する段階;
を含み、それによりオリゴデンドロサイトが生成される、前記方法。 - オリゴデンドロサイトの生成方法であって、
a.PSCを、(i)0日目〜8日目は二重SMAD阻害下で、(ii)8日目〜12日目はソニックヘッジホッグ(SHH)またはスムーズンドアゴニストの存在下で、低濃度RAを含む培地中で単層接着培養する段階であって、それによりOLIG2+細胞が生成される、段階;
b.段階(a)の細胞を、(i)12日目〜20日目はSHHまたはスムーズンドアゴニスト及び低濃度RAを含む培地中で、(ii)20日目〜30日目はPDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む培地中で懸濁培養することにより、OLIG2+細胞を濃縮する段階;
c.段階(b)の細胞を、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む培地中で30日目〜75日目まで接着培養する段階であって、それによりO4+OPCが生成される、段階;ならびに
d.前記O4+OPCを、AAを含むがPDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含まない培地中で75日目〜95日目まで接着培養する段階;
を含み、それによりオリゴデンドロサイトが生成される、前記方法。 - オリゴデンドロサイトの生成方法であって、:
a.PSCを、(i)0日目〜8日目は二重SMAD阻害下で、(ii)8日目〜12日目はSHHまたはスムーズンドアゴニストの存在下で、低濃度RAを含む培地中で単層接着培養する段階であって、それによりOLIG2+細胞が生成される、段階;
b.段階(a)の細胞を、(i)12日目〜20日目はSHHまたはスムーズンドアゴニスト及び低濃度RAを含む培地中で、(ii)20日目〜30日目はPDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む培地中で懸濁培養することにより、OLIG2+細胞を濃縮する段階;ならびに
c.段階(b)の細胞を、AAを含むがPDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含まない培地中で30日目〜60日目まで接着培養する段階;
を含み、それによりオリゴデンドロサイトが生成される、前記方法。 - 前記PSCが胚性幹細胞である、請求項1、4、5または6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PSCが誘導多能性幹細胞(iPSC)である、請求項1、4、5または6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記iPSCが多発性硬化症患者由来である、請求項8に記載の方法。
- 前記PSCがヒト細胞である、請求項1、4、5または6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記表面が基底膜マトリックスを含む、請求項1、4、5または6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PSCが、約10,000細胞/cm2で前記表面上に播種される、請求項1、4、5または6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PSCコロニーの直径が約100μm〜約250μmである、請求項1または4に記載の方法。
- 前記PSCが、rho関連タンパク質キナーゼ(ROCK)の阻害剤を含む培地中で培養される、請求項1、4、5または6のいずれか一項に記載の方法。
- RAの前記濃度が100nMである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- TGFβシグナル伝達の前記阻害剤がSB431542である、請求項1または4に記載の方法。
- BMPシグナル伝達の前記阻害剤がLDN193189である、請求項1または4に記載の方法。
- 二重SMAD阻害がSB431542及びLDN193189による、請求項5または6に記載の方法
- コンフルエントな前記細胞がPAX6+である、請求項1または4に記載の方法。
- 前記細胞が8日目までにPAX6+になる、請求項5または6に記載の方法。
- SAG及びRAを含む前記培地がSHHを含まない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 低濃度RAを含む前記培地がスムーズンドのアゴニストを含む、請求項5または6に記載の方法。
- 前記スムーズンドのアゴニストがSAGである、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞が機械的に前記表面から剥離される、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞が酵素的に前記表面から剥離される、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞凝集体をプレートに再播種する段階が、細胞外マトリックスタンパク質及び正荷電ポリアミノ酸を含む表面上で行われる、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックスタンパク質がラミニンである、請求項26に記載の方法。
- 前記ポリアミノ酸がポリオルニチンである、請求項26に記載の方法。
- 段階(c)の前記細胞が、細胞外マトリックスタンパク質及び正荷電ポリアミノ酸を含む表面上で培養される、請求項5または6に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックスタンパク質がラミニンである、請求項29に記載の方法。
- 前記ポリアミノ酸がポリオルニチンである、請求項29に記載の方法。
- PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地が更にインスリンを含む、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地が更にトリヨード‐L‐サイロニン(T3)を含む、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地が更にビオチンを含む、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地が更にcAMPを含む、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地が塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)を含まない、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地が上皮増殖因子(EGF)を含まない、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- AAを含む前記培地が更にインスリンを含む、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- AAを含む前記培地が更にT3を含む、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- AAを含む前記培地が更にビオチンを含む、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- AAを含む前記培地が更にcAMPを含む、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- SAG及びRAを含む前記培地中で培養する前記段階が8日目に開始される、請求項1または4に記載の方法。
- 前記細胞が12日目までにオーバーコンフルエントになる、請求項1または4に記載の方法。
- 前記懸濁培養する段階が12日目に開始される、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞の少なくとも50%が12日目までにOLIG2+になる、請求項1、5または6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の少なくとも60%が12日目までにOLIG2+になる、請求項1、5または6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の少なくとも70%が12日目までにOLIG2+になる、請求項1、5または6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が、20日目から、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地中で培養される、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が30日目にプレートに播種される、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が、AAを含むがPDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含まない前記培地中で30日目から培養され、前記細胞の少なくとも25%が55日目までにO4+になる、請求項4または6に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が、AAを含むがPDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含まない前記培地中で30日目から培養され、前記細胞の少なくとも30%が55日目までにO4+になる、請求項4または6に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が、AAを含むがPDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含まない前記培地中で30日目から培養され、前記細胞の少なくとも45%が63日目までにO4+になる、請求項4または6に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が、AAを含むがPDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含まない前記培地中で30日目から培養され、前記細胞の少なくとも60%が75日目までにO4+になる、請求項4または6に記載の方法。
- 前記細胞凝集体がAAを含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも25%がAAを含む前記培地中での25日間の培養後にO4+になる、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞凝集体がAAを含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも30%がAAを含む前記培地中での25日間の培養後にO4+になる、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞凝集体がAAを含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも40%がAAを含む前記培地中での45日間の培養後にO4+になる、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞凝集体がAAを含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも50%がAAを含む前記培地中での45日間の培養後にO4+になる、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞凝集体がAAを含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも60%がAAを含む前記培地中での45日間の培養後にO4+になる、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地中で30日目から培養され、前記細胞の少なくとも40%が75日目までにO4+になる、請求項4または5に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地中で30日目から培養され、前記細胞の少なくとも50%が75日目までにO4+になる、請求項4または5に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地中で30日目から培養され、前記細胞の少なくとも60%が75日目までにO4+になる、請求項4または5に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地中で30日目から培養され、前記細胞の少なくとも70%が75日目までにO4+になる、請求項4または5に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも40%が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地中での45日間の培養後にO4+になる、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも50%が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地中での45日間の培養後にO4+になる、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも60%が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地中での45日間の培養後にO4+になる、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞凝集体が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも70%が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含む前記培地中での45日間の培養後にO4+になる、請求項2に記載の方法。
- 前記O4+OPCの少なくとも20%が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含まない前記培地中での20日間の培養後にMBP+になる、請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記O4+OPCの少なくとも25%が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含まない前記培地中での20日間の培養後にMBP+になる、請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記O4+OPCの少なくとも30%が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含まない前記培地中での20日間の培養後にMBP+になる、請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記O4+OPCの少なくとも35%が、PDGF、HGF、IGF‐1及びNT3を含まない前記培地中での20日間の培養後にMBP+になる、請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の少なくとも20%が60日目にMBP+になる、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞の少なくとも25%が60日目にMBP+になる、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞の少なくとも30%が60日目にMBP+になる、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞の少なくとも25%が60日目にMBP+になる、請求項6に記載の方法。
- ミエリン化を促進する化合物の同定方法であって、
a.請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法によりオリゴデンドロサイトを生成する段階;
b.前記オリゴデンドロサイトを候補化合物と接触させる段階;及び
c.前記候補化合物がニューロンのミエリン化を促進するかどうかを判定する段階
を含む、前記方法。 - ハイスループット法である、請求項75に記載の方法。
- 対象における神経疾患または障害の治療方法であって、
a.請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法によりオリゴデンドロサイトを生成する段階;及び
b.有効量の前記オリゴデンドロサイトを前記対象に投与する段階であって、前記オリゴデンドロサイトが前記対象の神経系においてミエリン形成を促進する、段階
を含み、それにより前記対象における前記神経疾患が治療される、前記方法。 - 前記神経疾患または障害が脱髄疾患またはミエリン形成不全疾患である、請求項77に記載の方法。
- 前記脱髄疾患が多発性硬化症である、請求項78に記載の方法。
- 前記脱髄疾患が一次進行型多発性硬化症である、請求項78に記載の方法。
- 前記神経疾患または障害が神経変性疾患である、請求項77に記載の方法。
- 前記PSCが前記対象の体細胞から生成された誘導多能性幹細胞(iPSC)である、請求項77に記載の方法。
- 請求項1または2に記載の方法により生成された、オリゴデンドロサイト前駆細胞。
- 請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法により生成された、オリゴデンドロサイト。
- 請求項1または2に記載の方法により生成されたオリゴデンドロサイト前駆細胞を含む、非ヒト哺乳動物。
- 請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法により生成されたオリゴデンドロサイトを含む、非ヒト哺乳動物。
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