CN112469818A - 人皮层球体中髓鞘少突胶质细胞的诱导 - Google Patents
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Abstract
本文描述的本发明提供了用于从(人)多能干细胞产生寡皮层球体的方法。如此产生的皮层球体产生成熟的少突胶质细胞,其能够例如使轴突髓鞘化,并为髓鞘疾病和药物作用建模。
Description
对相关申请的引用
本国际专利申请要求于2018年4月17日提交的美国临时专利申请62/658,901和2018年7月19日提交的美国临时专利申请62/700,472的申请日的权益,上述每个申请的全部内容包括任何附图和序列表通过引用并入本文。
政府支持
本发明是在美国国立卫生研究院授予的NS093357,NS095280,GM007250,HD084167和CA043703的政府资助下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
人类皮层发生是一个复杂的过程,需要不同细胞群体的协调产生,迁移和成熟。尽管许多小组通过体外2D培养和分化神经细胞的强制聚集产生了少突胶质细胞,但是hPSC衍生的皮层球体利用内在的分化程序来重现人类大脑发育中的区域组织和皮层分层。
体外3维(3D)组织产生的进展正在提高研究人类神经发育和疾病的能力。人类多能干细胞(hPSC)衍生的3D培养物(称为“有机体”或“球体”)重现了复杂的发育过程,细胞-细胞相互作用,微环境,组织结构以及传统体外培养中无法获得的扩展时空动态。
多个小组已经开发出方案,以对模拟人类大脑皮层所需的细胞增殖,迁移,组织和成熟的协调轮进行建模。这些多能干细胞来源的“皮层球体”已显示可产生多种皮层细胞类型,包括神经祖细胞,成熟的神经元亚型和星形胶质细胞,它们会自组织成不同的皮层层,并建立功能性神经网络。然而,尽管对皮层类球体的单细胞分析已鉴定出转录谱,提示存在少突胶质细胞祖细胞(OPC),并且已在分离物中鉴定了稀少的少突胶质细胞,但尚无任何方案可证明少突胶质细胞(中枢神经系统的髓鞘神经胶质(CNS)和神经起源的第三种主要细胞类型)的可再生产生和成熟。
发明概述
在一个方面,本发明提供了从多能干细胞(PSC)产生寡皮层球体(OCS)的方法,该方法包括:a)通过所述多能干细胞的神经皮层模式形成(patterning)产生神经皮层球体(NCS);b)使所述神经皮层球体定时暴露于确定的少突胶质细胞谱系生长因子和/或激素,以促进所述神经皮层球体内的天然少突胶质细胞祖细胞(OPC)群体的增殖,存活和/或扩增,从而产生所述寡皮层球体;其中所述寡皮层球体包含少突胶质细胞祖细胞(OPC),其能够分化为能够使轴突髓鞘化的髓鞘少突胶质细胞(ODC)。
在某些实施方案中,确定的少突胶质细胞谱系生长因子和激素包括血小板衍生的生长因子(PDGF)例如PDGF-AA(PDGF-AA)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。
在某些实施方案中,确定的少突胶质细胞谱系生长因子和激素包括PDGF-AA,PDGF-AB,FGF-2,VEGF或其组合;和胰岛素或IGF-1或其组合。
在某些实施方案中,该方法进一步包括定时暴露于另外的生长因子和/或激素以诱导少突胶质细胞分化。
在某些实施方案中,另外的生长因子和/或激素包括甲状腺激素(T3),氯马斯汀(clemastine)和/或酮康唑。
在某些实施方案中,步骤b)在等同于受孕后约10周或在步骤a)开始后约50-60天的时间进行。
在某些实施方案中,定时暴露于另外的生长因子和/或激素以诱导少突胶质细胞分化在等同于受孕后约14周或在步骤a)开始后约60-70天的时间进行。
在某些实施方案中,多能干细胞来自人胚胎干细胞系,或来自诱导多能干细胞(iPSC)系。
在某些实施方案中,步骤b)在约6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天的时间段内进行。
在某些实施方案中,在步骤a)结束时的神经皮层球体基本上不包含少突胶质细胞谱系细胞。少突胶质细胞谱系细胞的缺乏可通过少突胶质细胞谱系细胞的任何标志物来证实,例如一种或多种典型的OPC标志物,例如转录因子OLIG2和SOX10。
在某些实施方案中,与未经步骤b)处理的年龄匹配的神经皮层球体相比,在步骤b)结束时的皮层球体包含实质上增加的OPC。例如,增加的OPC可通过一种或多种典型的OPC标志物的免疫染色增加来被检测和/或定量。合适的OPC标志物可以包括:OPC特异性转录因子例如OLIG2和SOX10,少突胶质细胞膜蛋白标志物例如蛋白脂蛋白1(PLP1)和在CNS中的少突胶质细胞中特异性表达的转录因子例如MYRF
在某些实施方案中,多能干细胞是从患有疾病的受试者中分离的iPSC。根据该实施方案,从分离自患病个体的iPSC产生的OCS可以是用于治疗疾病的有价值的模型。
在某些实施方案中,该疾病的特征在于髓鞘产生缺陷,或由髓鞘丧失或髓鞘功能丧失引起的/与之相关的缺陷。
在某些实施方案中,该疾病是Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)。例如,PMD的特征可以是整个PLP1基因座缺失,整个PLP1基因座重复或PLP1中的点突变(例如c.254T>G)。
本发明的另一方面提供了使用本发明的任何方法产生的寡皮层球体。
本发明的另一方面提供了从多能干细胞形成的寡皮层球体,其中所述寡皮层球体包含少突胶质细胞祖细胞(OPC),其能够分化为能够使轴突髓鞘化的髓鞘少突胶质细胞。
在某些实施方案中,寡皮层球体还包含能够使轴突髓鞘化的髓鞘少突胶质细胞。
本发明的另一方面提供了用于筛选有效治疗疾病的药物的方法,所述疾病的特征在于髓鞘产生缺陷或由髓鞘丧失或髓鞘功能丧失引起的/与之相关的缺陷,该方法包括使来自候选药物文库的多种候选药物每种单独与从多能干细胞形成的寡皮层球体接触,所述多能干细胞来自于患有所述疾病的个体,和鉴定一种或多种有效治疗所述疾病的候选药物,所述候选药物减轻髓鞘产生缺陷/恢复髓鞘量或功能/防止髓鞘丧失。
在某些实施方案中,该方法进一步包括对患有该疾病的动物施用鉴定为有效的候选药物。例如,患有疾病的个体可以是人类,和动物可以是作为所述疾病的模型的小鼠。
应当理解,除非明确声明或不适当,本文描述的任何一个实施方案可以与一个或多个其他实施方案组合,包括仅在实施例或权利要求中描述的那些实施例。
附图说明
图1A-1F显示了在人类皮层球体中少突胶质细胞的产生。图1A是球体产生的示意图。直到第8周,产生神经皮层球体(NCS)和寡皮层球体(OCS)的方案是相同的,此后,在基础培养基中培养神经皮层球体,而从50-60天用PDGF-AA/IGF-1处理寡皮层球体和从60-70天用T3处理寡皮层球体。在第14周评估少突胶质细胞的分化。颜色描绘神经元(品红色),星形胶质细胞(红色)和OPC/少突胶质细胞(绿色)。图1B和1C是用(a)神经皮层方案或(b)寡皮层方案产生的H7球体第14周的代表性荧光图像。对于每一种,从4种不同细胞系中产生的3个独立批次的球体都获得了相似的结果。比例尺,50μm。图1B显示神经皮层方案球体产生神经元(神经丝:品红色)和星形胶质细胞(GFAP:红色),但没有少突胶质细胞(PLP1:绿色)。图1C显示寡皮层方案球体产生神经元(神经丝:品红色),星形胶质细胞(GFAP:红色)和少突胶质细胞(PLP1:绿色)。插图,少突胶质细胞在较高放大倍数下的形态。图1D显示了在第14周使用神经皮层或寡皮层方案以及仅使用PDGF-AA和IGF-1或T3产生的球体中,MYRF(少突胶质细胞谱系的核标志物)的定量。在H7,H9和CWRU191细胞系的每种处理条件下,从四个或五个单独的球体(n=4,PDGF/IGF或T3处理,n=5,NCS和OCS)的四个平面计数MYRF阳性细胞,并取平均值(白框)。误差线指示标准差。n=3同一批次的球体用于外部验证的细胞系RUES1。图1E显示了神经皮层和寡皮质球体中的神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞基因的表达。热图由每种细胞类型的100个最具有细胞特异性的转录本组成。与神经皮层球体相比,寡皮层的少突胶质细胞和星形胶质细胞特异性基因上调。图1F显示了神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性基因表达,其来自图1E的数据。方框跨越第一和第三四分位数,以均值划分;短横线延伸到最大值和最小值。图1E和1F显示了每种条件下来自5个球体的RNA-seq。使用配对的非参数Wilcoxon匹配的配对有序秩检验确定显著性。
图2A-2L显示了寡皮层球体中少突胶质细胞的成熟。图2A是寡皮层球体产生的示意图。如图1A中的颜色,图2B-2D中是第20周的H7寡皮层球体的代表性荧光图像。从2个独立批次的球体中获得了相似的结果。比例尺,50μm。图2B显示了少突胶质细胞谱系(MYRF:品红色),CTIP2阳性(黄色)早期神经元和SATB2阳性(青色)后期神经元的稳健产生。图2C显示了少突胶质细胞成熟(PLP1:绿色)中的谱系过程形成。图2D是MBP(红色)(一种成熟髓鞘的标志物)的免疫染色,显示指示成熟的早期阶段的点状MBP表达。图2E-2G是第20周的H7寡皮层球体的代表性EM。EM结果从单批3个球体中获得。比例尺,1μm。图2E显示了由少突胶质细胞进行髓鞘形成的神经元簇。图2F显示了由多层松散压实的髓鞘包围的轴突。图2G显示了围绕轴突的松散压实的髓鞘的更广泛包裹。图2H-2J是第30周的H9寡皮层球体的代表性荧光图像。从单批寡皮层球体中的4个球体获得了相似的结果。比例尺,50μm。图2H显示了CTIP2阳性(黄色)深层从SATB2阳性(青色)浅层的皮层层合和分离。MYRF阳性(品红色)少突胶质细胞散布在皮层层内。图2I示出了少突胶质细胞处理(PLP1:品红色)跟踪(箭头)神经元轴突(神经丝:黄色)。图2J示出了图2I中的方框区域的较高放大。图2K是第30周的H9寡皮层球体的电子显微照片,显示轴突周围有压实的髓鞘。EM结果是从一批球体的3个球体获得的,比例尺,1μm的。图2L是从沿轴突的长度截取的EM面断面进行的3D重建。
图3A-3E显示了寡皮层球体中的皮层模式形成和组织。图3A和3B是第8周,H7球体的代表性荧光图像。图3A显示在最初的神经皮层模式形成结束时,球体会产生不同的神经祖细胞群(SOX2:黄色和Nestin:蓝色),这些祖细胞组织成脑室样区域。这些细胞也是Ki67(品红色)标记的仅有活跃分裂的细胞。图3B显示TBR2阳性(蓝色)外部SVZ样区域出现在Sox2阳性(黄色)脑室样区域附近。图3C是通过PDGF-AA/IGF-1处理的寡皮层方案产生的H7球体,然后在第9周(第58和60天)给予两次剂量的BrdU(品红色)以标记分裂细胞的代表性荧光图像。BrdU阳性细胞位于SOX2阳性脑室区,将其识别为主要生发中心。图3D和3E是用神经皮层(图3D)或寡皮层(图3E)方案产生的H7球状体,在第9周(第58和60天)用BrdU处理,然后保持到第14周的代表性荧光图像。仅寡皮层球体产生少突胶质细胞(MYRF:青色),其中许多对BrdU呈双阳性(图3E中方框区域放大中的箭头,如右侧所示)。比例尺,50μm。
图4A-4G显示促髓鞘形成药物促进寡皮层球体中少突胶质细胞的产生。图4A-4D是用PDGF/IGF-1(从第50-60天)和(图4A)DMSO,(图4B)T3,(图4C)氯马斯汀或(图4D)是酮康唑(从第60-70天)处理的第14周H7球体的代表性荧光图像。DMSO产生很少的MYRF阳性细胞,而T3,氯马斯汀和酮康唑产生强健的MYRF信号。使用同一批中的四个球体进行分析。比例尺,50μm。图4E显示了来自图4A-4D的MYRF的定量。在每个细胞系n=4个单个球体中对MYRF阳性细胞计数(彩色点)并取平均值(白尺)。误差线,s.d。采用Welch校正的双尾非配对t检验确定显著性。图4F-4G是第14周H7球体的代表性EM图像。比例尺,500nm。图4F显示了用标准的寡皮层方案(T3)产生的球体表明不存在髓鞘。图4G显示了用酮康唑替代T3产生的球体证明了围绕多个神经元轴突的非压实髓鞘的强健产生。
图5A-5N显示了寡皮层球体重现了人类髓鞘疾病的表型。图5A-5L是第14周的寡皮层球体的代表性荧光图像。使用同一批中的五个(图5A和5B)或四个(图5C-5L)球体进行分析。比例尺,50μm。图5A和5B显示针对(图5A)PLP1:绿色或(图5B)MYRF:红色进行免疫染色的CWRU198球体,显示丰富的少突胶质细胞和强健的PLP1表达。图5C-5D显示了针对(图5C)PLP1:绿色或(图5D)MYRF:红色进行免疫染色的PLP1缺失球体,表明尽管存在大量MYRF阳性少突胶质细胞,但预期缺乏PLP1。图5E和5F示出了针对(图5E)PLP1:绿色或(图5F)MYRF:红色进行免疫染色的PLP1重复寡皮层球体,尽管MYRF阳性少突胶质细胞的丰度降低,但显示了强健的PLP1表达。图5G和5H显示针对(图5G)PLP1:绿色或(图5H)MYRF:红色进行免疫染色的PLP1 c.254T>G球体,表明PLP1的核周保留和MYRF阳性少突胶质细胞丰度的降低。图5I和5J显示了用GSK2656157处理并针对(图5I)PLP1:绿色或(图5J)MYRF:红色进行免疫染色的PLP1 c.254T>G寡皮层球体,证明了动员PLP1进入少突胶质细胞过程并拯救了MYRF阳性少突胶质细胞的丰度。图5K和5L显示了针对(图5K)PLP1:绿色或(图5L)MYRF:红色进行免疫染色的PLP1 CRISPR校正的c.254TG>T寡皮层球体,表明PLP1核周保留和少突胶质细胞丰度两者都得到了拯救。图5M显示了图5A-5L中每个类器官的MYRF阳性少突胶质细胞的百分比。从对照组细胞系CWRU198的n=5个单个球体和每个细胞系n=4个单个球体(彩色点)计数MYRF阳性细胞,并取平均值(白框)。误差线,s.d。采用Welch校正的两尾不成对t检验确定显著性。图5N是第30周,PLP1 CRISPR校正的c.254G>T寡皮层球体的代表性EM,显示了压实的髓鞘围绕轴突。单个批次中的三个球体用于EM分析。比例尺,1μm。
图6A-6E显示了在人类皮层球体中少突胶质细胞前体细胞的产生。图6A是球体产生的示意图。直到第8周,产生神经皮层球体(NCS)和寡皮层球体(OCS)的方案相同。在基础培养基中培养神经皮层球体,而寡皮层球体从第50天-60天用PDGF-AA/IGF-1处理以产生OPC。在第9周结束时评估OPC数量的增加。示意图中的颜色模拟神经元(品红色),星形胶质细胞(红色)和OPC/少突胶质细胞(绿色)。图6B-6C是用神经皮层方案产生的第8周(图6B)和第9周(图6C)H7球体的代表性荧光图像。这些球体不产生OPC(OLIG2:黄色和SOX10:品红色)。比例尺,对于图6B-6D为50μm。图6D是通过PDGF-AA/IGF-1处理由寡皮层方案产生的第9周的H7球体的代表性荧光图像。这些球体产生OPCs(OLIG2:黄色,SOX10:品红色)。箭头显示OLIG2/SOX10双阳性细胞。图6E显示了在用神经皮层或寡皮层方案产生的第9周球体的OLIG2阳性和SOX10/OLIG2双阳性OPC的定量。从三个平面对细胞进行计数,每个平面都来自H7,H9和CWRU191系的五个单个的球体(彩色点),并取平均值(白框)。误差线是标准偏差,来自每个系同一批次的n=5个球体。
图7A-7C显示了在另外三种人多能细胞系中的寡皮层方案的验证。图7A是从H9,CWRU191和RUES1产生的第14周的寡皮层球状体中PLP1的代表性荧光图像。从H9,CWRU191和CWRU198的3个独立批次的球体和RUES1一个批次中获得了相似的结果。比例尺,50μm。图7B是从H9,CWRU191和RUES1产生的第14周寡皮层球体中MYRF的代表性荧光图像。从H9,CWRU191和CWRU198的3个独立批次的球体和RUES1的一个批次中获得了相似的结果。比例尺,50μm。图7C是图1D中从H7产生的单个第14周寡皮层球体中的MYRF的代表性荧光图像的MYRF定量的示意图。四个小图(1-4)展示了四个均等放大,均等大小且一致分布的区域,这些区域分别按每球体成像和计数。每球体报告的%MYRF阳性细胞是这四个图像的平均值。比例尺,50μm。
图8A-8C显示了来自其他多能细胞系的少突胶质细胞的成熟。图8A显示了在第20周,H9,CWRU191和RUES1寡皮层球体中MYRF和PLP1表达的代表性荧光图像。结果代表了从2个独立批次的H9和CWRU191细胞系和1个批次RUES1细胞系产生的球体。比例尺,50μm。图8B显示了在第20周的H9和CWRU191寡皮层球体中,多个松散压实的髓鞘包裹围绕轴突的代表性EM图像。对于每个细胞系,对来自同一批次的3个球体进行EM分析。未进行RUES1的EM分析。比例尺,1μm。图8C显示了在第14周和第20周的H7寡皮层球体中Sox10和MYRF表达的代表性荧光图像。结果代表了从2个独立批次中产生的球体。比例尺,50μm。
图9是寡皮层球体中少突胶质细胞的基于BrdU的命运图。显示了通过PDGF-AA/IGF-1处理,通过寡皮层方案产生的另外两个H7,两个H9和两个CWRU191球体的代表性荧光图像,所述球体在第9周(第58和60天)施用两次剂量的BrdU以标记分裂细胞。在第二次BrdU脉冲后,大多数BrdU阳性(品红色)细胞定位于SOX2阳性(黄色)和波形蛋白阳性(蓝色)细胞。到第14周时,某些BrdU标记的细胞对少突胶质细胞标志物MYRF(蓝绿色)呈双阳性(高倍放大图中的箭头)。对来自每个细胞系的单批球体进行脉冲追踪实验,并分析每个细胞系的4个球体。比例尺,50μm。
图10是第12周的寡皮层球体的细胞群体的单细胞分析。显示的是来自第12周H7寡皮层球体的单细胞RNA-seq数据的聚类,与Nowakowski et al.2017产生的单细胞人胎儿脑细胞相比。通过祖细胞标志物Vimentin,SOX2,Nestin和Sox6的可视化,在这两个数据集中都有一个祖细胞群体的连续体,而只有寡皮层球体显示出正在出现的少突胶质细胞簇(PLP1/DM20和OMG)的证据。在从单批次中的10个球体中进行单细胞RNA-seq。
图11A-11C显示了PLP1点突变的CRISPR校正。图11A是使用与突变重叠的引导RNA和单链反义寡核苷酸供体来校正患者来源的hiPSC中的PLP1点突变(PLP1c.254T>G)的示意图。图11B是突变体亲本(PLP1c.254G)品系的Sanger测序迹和核型。图11C是校正的(PLP1c.254T)品系的Sanger测序迹和核型。
发明详述
脑类器官提供了可用的系统来检查细胞组成,相互作用和组织,但具有缺乏的少突胶质细胞(中枢神经系统的髓鞘胶质细胞)。本文描述了在人多能干细胞衍生的“寡皮层球体”中可再生地产生少突胶质细胞和髓鞘的方法。与成熟的少突胶质细胞一致的分子特征在培养20周出现,并在30周进一步成熟并产生髓鞘压实。
促髓鞘形成药物提高少突胶质细胞产生和髓鞘形成的速度和程度,而从具有遗传性髓鞘疾病的患者产生的球体重现人类疾病的表型。
因此,本发明的方法和由此产生的寡皮层球体提供了多功能的平台来研究正在发育的中枢神经系统的髓鞘形成,并为疾病建模和治疗开发提供了新的机会。
申请人已经开发了方法以通过将皮层球体暴露于生长因子例如PDGF,IGF-1和T3,可再生地诱导皮层球体中的少突胶质细胞祖细胞和髓鞘少突胶质细胞,同时保留先前神经元模型中证明的总体组织和区域规范。这些寡皮层球体中所有主要中枢神经系统谱系的诱导提供了观察和扰动人类皮层发育和疾病的新机会。
因此,在一个方面,本发明提供了从多能干细胞(PSC)产生寡皮层球体(OCS)的方法,该方法包括:a)通过所述多能干细胞的神经皮层模式形成产生神经皮层球体(NCS);b)使所述神经皮层球体定时暴露于确定的少突胶质细胞谱系生长因子和/或激素,以促进所述神经皮层球体内的天然少突胶质细胞祖细胞(OPC)群体的增殖,存活和/或扩增,从而产生所述寡皮层球体;其中所述寡皮层球体包含少突胶质细胞祖细胞(OPC),其能够分化为能够使轴突髓鞘化的髓鞘少突胶质细胞(ODC)。
在某些实施方案中,优选在步骤a)开始后第9周、14周或20周结束时,寡皮层球体包含至少约5、6、7、8、9、10、15、20、25、30%的少突胶质祖细胞(OPC)和/或分化的少突胶质细胞。OPC和/或ODC的百分比可以基于对表达OPC/ODC标志物的(例如MYRF或PLP1)的细胞进行计数来测量。可以根据用于图1D或图7C的方法对细胞进行计数(例如,从四个或五个独立的球体的四个平面计算)。
在某些实施方案中,确定的少突胶质细胞谱系生长因子和激素包括血小板衍生的生长因子(PDGF),例如PDGF-AA(PDGF-AA)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。
在某些实施方案中,确定的少突胶质细胞谱系生长因子和激素包括PDGF-AA、PDGF-AB、FGF-2、VEGF或其组合;和胰岛素或IGF-1或其组合。
在某些实施方案中,该方法进一步包括定时暴露于另外的生长因子和/或激素以诱导少突胶质细胞分化。
任何已知诱导OPC的少突胶质细胞分化的因子均可用于本发明的该步骤。在某些实施方案中,另外的生长因子和/或激素包括甲状腺激素(T3),氯马斯汀和/或酮康唑。
在某些实施方案中,步骤b)在等同于受孕后约10周或在步骤a)开始后约50-60天的时间进行。
在某些实施方案中,定时暴露于另外的生长因子和/或激素以诱导少突胶质细胞分化在等同于受孕后约14周或在步骤a)开始后约60-70天的时间进行。
在某些实施方案中,多能干细胞来自人胚胎干细胞系,或来自诱导多能干细胞(iPSC)系。
在某些实施方案中,步骤b)在约6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天的时间段内进行。
在某些实施方案中,在步骤a)结束时所述神经皮层球体基本上不包含少突胶质细胞谱系细胞。少突胶质细胞谱系细胞的缺乏可以通过少突胶质细胞谱系细胞的任何标志物来证实。例如,少突胶质细胞系细胞的缺乏可以通过一种或多种典型OPC标志物(例如转录因子OLIG2和SOX10)的缺乏或最小免疫染色来证明。
在某些实施方案中,与未经步骤b)处理的年龄匹配的神经皮层球体相比,在步骤b)结束时寡皮层球体包含实质上增加的OPC。例如可以通过一种或多种典型OPC标志物的免疫染色增加来检测和/或定量增加的OPC。合适的OPC标志物可以包括:OPC特异性的转录因子,例如OLIG2和SOX10,少突胶质细胞膜蛋白标志物,例如蛋白脂蛋白1(PLP1),以及在CNS中的少突胶质细胞中特异性表达的转录因子,例如MYRF。
在某些实施方案中,多能干细胞是从患有疾病的受试者中分离的iPSC。根据该实施方案,从分离自患病个体的iPSC产生的OCS可以是用于治疗疾病的有价值的模型。
在某些实施方案中,该疾病的特征在于髓鞘产生缺陷,或由髓鞘丧失或髓鞘功能丧失引起的/与之相关的缺陷。
在某些实施方案中,该疾病是Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)。例如,PMD的特征可以是整个PLP1基因座的缺失,整个PLP1基因座的重复或PLP1中的点突变(例如c.254T>G)。
本发明的另一方面提供了使用本发明的任何方法产生的寡皮层球体。
本发明的另一方面提供了从多能干细胞形成的寡皮层球体,其中所述寡皮层球体包含少突胶质细胞祖细胞(OPC),其能够分化为能够使轴突髓鞘化的髓鞘少突胶质细胞。
在某些实施方案中,寡皮层球体进一步包括能够使轴突髓鞘化的髓鞘的少突胶质细胞。
本发明的另一方面提供了用于筛选有效治疗疾病的药物的方法,所述疾病的特征在于髓鞘产生缺陷或由髓鞘丧失或髓鞘功能丧失引起的/与之相关的缺陷,该方法包括使来自候选药物文库的多种候选药物每种单独与从多能干细胞形成的寡皮层球体接触,所述多能干细胞来自于患有所述疾病的个体,和鉴定一种或多种有效治疗所述疾病的候选药物,所述候选药物减轻髓鞘产生缺陷/恢复髓鞘量和/或功能,或防止髓鞘丧失。
在某些实施方案中,该方法进一步包括对患有所述疾病的动物施用鉴定为有效的候选药物。例如,患有疾病的个体可以是人类,而动物可以是作为该疾病的模型的小鼠。
以上总体描述了本发明,在下面的部分中更详细地描述了本发明的某些特征。
神经皮层球体(NCS)的产生
根据本发明的方法,通过定时暴露于确定的少突胶质细胞谱系生长因子和激素,可以从(人)多能干细胞(hPSC)产生神经皮层球体。
(Pasca et al.,Functional cortical neurons and astrocytes from humanpluripotent stem cells in 3D culture.Nat Methods 12,671-678(2015),通过引用并入本文)中描述了示例性的50天方案。因此,在一个实施方案中,根据Pasca等人所描述的50天方案,从(人)多能干细胞(hPSC)产生神经皮层球体。
在另一个实施方案中,如本文简要描述的,根据Pasca等人中描述的50天方案的修改形式,从(人类)多能干细胞(hPSC)产生神经皮层球体。
具体而言,在玻连蛋白(例如,Gibco#A14700)上培养多能干细胞集落。使用酶例如分散酶(例如,Gibco#17105-041)在37℃,10分钟收集这些细胞集落。然后将完整的细胞集落在合适体积(例如200μL)的球体起始培养基(Spheroid Starter media)中转移至独立的低粘附力组织培养表面(例如来自S-Bio Prime#MS-9096VZ的V型96孔板),所述培养基包括Rock抑制剂(例如来自Calbiochem#688001的10μM Y-27632),AMP激酶抑制剂(例如来自Sigma#P5499的10μM Dorsopmorphin)和TGF-β抑制剂(例如来自Sigma#S4317的10μM SB-431542)。
球体起始培养基可以在DMEM/F12(Invitrogen#11320-033)中制成,其中包含20%的敲除血清(Invitrogen#12587-010),非必需氨基酸(Invitrogen#11140050),Glutamax(Invitrogen#35050061),β-巯基乙醇和100U/mL青霉素/链霉素。
然后在接下来的五天中使用不含Rock抑制剂的相同培养基,然后将培养基更换为基于Neurobasal-A的球体培养基。基于Neurobasal-A的球体培养基是Neurobasal-A培养基(Invitrogen#10888022),添加了不含维生素A的B-27血清替代品(Invitrogen#12587),Glutamax(Invitrogen#35050061)和100U/mL青霉素/链霉素。
从第7-25天起,将20ng/ml FGF-2(R&D系统#233-FB-25/CF)和10ng/ml EGF(R&D系统#236-EG-200)添加到培养基中。
直到第25天,将球体培养在96孔板中,每天更换一半培养基。在第25天,将球体以每孔8-10个球体的密度转移到超低附着组织培养表面,例如来自Corning#CLS3471的6孔板中,并通过方案的其余部分进行培养。
同样从这一点开始,将1%Geltrex(Invitrogen#A15696-01)添加到Neurobasal-A球体培养基中。
通过在Neurobasal-A球体培养基中添加20ng/ml BDNF(R&D系统#248-BD)和20ng/ml NT-3(R&D系统#267-N),可以在第27天到第41天之间诱导神经分化。在第17到41天之间,每隔一天可以进行一半培养基更换。
寡皮层球体(OCS)的产生
为了产生寡皮层球体,使NCS定时暴露于确定的少突胶质细胞谱系生长因子和/或激素,以促进神经皮层球体内的天然少突胶质细胞祖细胞(OPC)群体的增殖,存活和/或扩增。
在一个实施方案中,从第50天开始,将10ng/mL血小板衍生的生长因子-AA(PDGF-AA,例如来自R&D系统#221-AA-050)和10ng/mL的胰岛素样生长因子-1(IGF-1,例如来自R&D系统#291-G1-200)添加到每隔一天的更换的培养基中持续10天,以产生寡皮层球体。
如此产生的OCS包含少突胶质细胞祖细胞(OPC),其能够分化为能够使轴突髓鞘化的髓鞘少突胶质细胞(ODC)。
如此产生的OCS可以进一步暴露于其他生长因子和/或激素以诱导少突胶质细胞分化。
在一个实施方案中,在第60天,将40ng/mL的3,3′,5-三碘甲状腺胺酸(3,3′,5-triiodothronine)(T3,Sigma#ST2877)添加至每隔一天更换的培养基,持续10天。任选地,在此期间也可以补充小分子。例如,可以添加4μM的酮康唑和2μM的氯马斯汀替代T3。此外,除了T3外还可以添加GSK2656157。
示例性用途
在验证主题系统中,申请人已经证明了在遗传疾病建模和临床前药物筛选中的应用。该主题的寡皮层球体可用于研究许多悬而未决的问题,从了解脑白质营养不良中的脱髓鞘到开发髓鞘再生策略来治疗多发性硬化症。该系统还可以用于探索不同神经元类别中的髓鞘发育,髓鞘压实,节和节间大小调节以及单神经元和整个球体电生理学的基本问题。
少突胶质细胞的区域性群体在胚胎发生过程中的不同时间出现,迁移并成熟。在哺乳动物中,腹侧衍生的少突胶质细胞是最早出现的种群之一,但对于皮层的适当髓鞘化并不需要,并且大部分被后来的皮层衍生的少突胶质细胞替代。即使与非人灵长类动物相比,人类髓鞘形成的时间和持续时间在区域上是不同的。人类的寡皮层球体提供了一种可用的系统,以探索这些和其他独特的人髓鞘形成的方面。
实施例
实施例1寡皮层球体的产生
本文描述了示例性方案,其通过定时暴露于确定的少突胶质细胞谱系生长因子和激素来产生衍生自(人类)多能干细胞(hPSC)的皮层球体,其包含少突胶质细胞祖细胞(OPC)和髓鞘少突胶质细胞。
首先,申请人使用50天方案(Pasca et al.,Functional cortical neurons andastrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.Nat Methods 12,671-678(2015),incorporated herein by reference)的优化版本产生并模式化“神经皮层球体”。参阅实施例7中的变化。
在最初的神经皮层模式形成之后,申请人用血小板衍生的生长因子-AA(PDGF-AA)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)处理以驱动天然OPC群体的扩增(第50-60天=“第9周”),然后是甲状腺激素(T3)诱导少突胶质细胞分化和最终的髓鞘形成(第60-70天=“第10周”)(图1A),产生了“寡皮层球体”。
PDGF-AA和IGF-1是促进OPC增殖和存活的必需发育有丝分裂原,而T3在体内调节并诱导从OPC产生少突胶质细胞。处理时间是根据经验确定的,但分别反映了受孕后10周和14周时人胚胎脑中OPC和少突胶质细胞的最初指标。
为了评估品系间的变化性并证明方案的稳健性,申请人最初使用人类胚胎干细胞系H7(雌性)开发了方案。然后,申请人使用另外两个独立的hPSC系重现了关键实验:胚胎干细胞系H9(雌性)和内部衍生的诱导多能干细胞(iPSC)系CWRU191(雄性)。
实施例2 OPC和少突胶质细胞的诱导
到第8周的神经皮层模式形成结束时,神经皮层球体含有很少少突胶质细胞谱系中的细胞,如通过两种典型OPC转录因子OLIG2和SOX10的最小免疫染色所证实的(图6B-6C)。然而,与年龄匹配的未处理的神经皮层球体相比,随后用PDGF-AA和IGF-1处理模式化的球体10天导致寡皮层球体中的OPC数量实质性增加(图6C-6E)。
到第14周时,神经皮层球体已产生神经元和星形胶质细胞的强健群体,但没有少突胶质细胞(图1B),而寡皮层球体(从50-60天开始用PDGF-AA/IGF-1处理,从60-70天开始用T3处理)在所有三个hPSC系中可重现地产生了强键的少突胶质细胞群体,如通过蛋白脂蛋白1(PLP1),最丰富的少突胶质细胞膜蛋白和MYRF(在CNS少突胶质细胞中特异性表达的转录因子)的免疫荧光所证实的(图1C,7A-7C)。
重要的是,在产生MYRF阳性少突胶质细胞方面,寡皮层球体表现出较低的细胞系间和球间变化性:对于H7、H9和CWRU191衍生的寡皮层球体分别为总细胞的21.59%±4.9%、20.53%±3.9%和18.4%±2.2%(量化示意图参见图7C),每种细胞系n=5个球体(图1D)。
另外,少突胶质细胞谱系的强力诱导依赖PDGF-AA/IGF-1和T3两者的顺序处理,通过单独一种处理产生较少的MYRF阳性少突胶质细胞(图1D)。
因此,虽然神经皮层模式形成建立了少突胶质形成的结构和细胞框架,在本实验中PDGF-AA,IGF-1和T3对于可重复OPC和少突胶质细胞诱导是必需的。
为了进一步验证该方法的可重复性,使用不同的细胞系、人类胚胎干细胞系RUES1(雄性),不同的人员和试剂在独立的实验室中重复了实验方案,其中MYRF阳性细胞占RUES衍生的寡皮层球体中细胞的18.36%±3.37%(图1D,7A-7B)。
最后,大块球体的RNA测序用于整体评估与年龄匹配的神经皮层球体相比PDGF-AA/IGF-1和T3处理如何影响寡皮层球体中神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞基因的转录。分析第14周的球体中每种细胞类型的100种最特异的mRNA转录物(使用Brainrnaseq.org的小鼠转录数据定义)表达表明神经元基因组无明显变化,但神经胶质基因组显著上调,特别是少突胶质细胞系的那些(图1E和1F)。这些数据表明产生寡皮层球体的方法激活整体少突胶质细胞转录程序,但不会明显改变球体中其他细胞类型(包括神经元)的表达程序。
实施例3少突胶质细胞成熟和髓鞘形成
最初的寡皮层模式形成后,球体可以在基础培养基中维持数周至数月。申请人分析了在第20和30周的神经元多样性和少突胶质细胞成熟(图2A)。第20周的球体似乎相对不成熟。除了MYRF阳性少突胶质细胞外,它们还包含大的以CTIP2为标志物的早期深层神经元群体和单独的较小的以SATB2为标志物的晚期浅层神经元群体,其中MYRF阳性少突胶质细胞遍及全部区域(图2B,8A)。但是,神经元群体显示出实质性的重叠,这与较年轻的SATB2细胞正在进行的迁移穿过深层一致。
随着少突胶质细胞的成熟,它们会扩展追踪和髓鞘化邻近的轴突的细胞过程。尽管早在培养的第14周PLP1表达就很稳健,但直到第20周PLP1免疫荧光才解析为不同的过程(图2C,8A)。此外,这些过程的子集开始表达髓鞘碱性蛋白(MBP,图2D),其是早期髓鞘形成的标志,表明少突胶质细胞过程与神经元轴突相关。电子显微镜检查(EM)显示在第20周时,人轴突具有多层未压实的髓鞘的同轴的,但通常是无组织的包裹(图2E-2G,8B),而这种早期的寡皮层球体髓鞘的无组织性质可能是部分由于体外培养环境,它的确与人和鸡体内胎儿髓鞘形成的最早阶段非常相似。重要的是,尽管进行了T3处理和少突胶质细胞的成熟,第20周的寡皮层球体也保持了SOX10阳性,MYRF阴性的OPC池(图8C)。
在第30周,球体包含CTIP2和SATB2标记的神经元群体,这些群体被组织到不同的皮层层中,其中具有大的SATB2群体和较小的CTIP2层。MYRF阳性少突胶质细胞既存在于这些层中又作为与CTIP2相邻的独特层存在(图2H)。另外,少突胶质细胞过程已经进一步分解成与表达神经轴突的神经丝共定位的不同的PLP1阳性束(图2I-2J)。在第30周EM鉴定出压实髓鞘包围的神经元轴突(图2K),并且具有3D重建的系列区块平面成像(serial blockface imaging)显示了髓鞘包裹轴突的纵向包裹(图2L)。但是,在第30周,申请人无法确定进一步结构性组织的明确证据,例如Ranvier结,这可能部分是由于球状神经元的持续不成熟和最小的相干电活动(所有当前的球状和类器官都注意到的技术问题)。
总的来说,这些结果表明,在寡皮层球体的环境下,人少突胶质细胞对人神经元的早期髓鞘形成可以在少至20周,而髓鞘成熟,细化和紧实则在30周。这种体外时机类似于子宫内人胎儿发育晚期的髓鞘的出现,以及移植到啮齿动物中枢神经系统后人OPC成熟和髓鞘化的时机,这表明对于人类少突胶质细胞成熟发育时钟的潜在存在,如在啮齿动物中提出的。
实施例4与体内皮层发育的相关性
申请人接下来评估了受试寡皮层球体内的发育和细胞组织,以证明与体内人类皮层发育的相关性。到第8周时,球体包含分裂的Nestin阳性和SOX2阳性神经祖细胞的强键群体,组织为SOX2阳性脑室样区和TBR2阳性室下外侧样区(图3A和3B)。SOX2阳性生发中心的排列让人想起皮层中的脑室区,尽管并非所有SOX2群体都被脑室样空隙围绕,并且许多都定位在球体的外表面。在第9周,申请人用胸苷类似物5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)标记了这些生发中心的增殖的Sox2阳性细胞(图3C和9A),并追踪了它们的发育轨迹。到第14周时,BrdU标记的细胞已从生发中心迁移出去,形成了与SOX2阳性生发区不同的群体(图3D-3E,9A)。在这个时间点,仅寡皮层球体包含MYRF阳性的OPC,其中一些是MYRF/BrdU双阳性的(图3E和9A)。MYRF与BrdU共定位是这些细胞起源于在寡皮层球体祖细胞区中发现的BrdU标记的SOX2阳性祖细胞的强有力的证据。
BrdU脉冲祖细胞从生发中心的迁移表明,寡皮层球体包含增生性和分化性少突胶质细胞的连续体。为了评估细胞组成的整体多样性和神经胶质细胞成熟谱,申请人在第12周的寡皮层球体(在PDGF-AA/IGF-1和T3处理后的早期时间点,应该代表所有群体)上进行了单细胞RNA测序。细胞簇广义地区分为神经胶质细胞和神经元群体。胶质细胞簇包含早期祖细胞(以波形蛋白(vimentin),SOX2和巢蛋白(nestin)为标志物),OPC(以SOX6为标志物)和成熟少突胶质细胞(以PLP1和少突胶质髓鞘糖蛋白为标志物),在全部簇中均具有增殖的标志物的表达,并且成熟标志物鉴定了逐步更多不同的亚群(图10A)。该单细胞分析表明,处于多个发育阶段的不同少突胶质细胞群体共存于寡皮层球体中,其类似于来自人类胎儿皮层的单细胞转录组数据(图10A)。这表明,寡皮层球体可以提供途径来查询这些人类胶质细胞发育的基本上不可及的阶段。
实施例5球体中的促髓鞘生成药物测试
在体外系统中产生能够使人轴突髓鞘化的人少突胶质细胞的能力为探索人髓鞘的发育,疾病和治疗方法提供了新的机会。申请人首先测试了受试人寡皮质球体是否重现了先前确定的促髓鞘形成药物的已知作用。
已经显示了两种FDA批准的药物,氯马斯汀和酮康唑,是体外和体内啮齿类动物少突胶质细胞产生和髓鞘形成的有效刺激剂。此外,最近报道了氯马斯汀在多发性硬化症患者的2期临床试验中可增强髓鞘再生。为了评估这些促髓鞘形成药物对人类少突胶质细胞产生的影响,从50-60天开始用PDGF-AA/IGF-1处理寡皮层球体,然后从60-70天开始使用DMSO,T3,氯马斯汀或酮康唑处理,然后再回到基础培养基培养4周。在第14周时,对MYRF阳性少突胶质细胞的定量显示,相比于媒介物(DMSO)对照(6.345%±1.46%),氯马斯汀(18.7%±2.94%)和酮康唑(27.61%±5.941%)各自增加了少突胶质细胞的产生,与T3(21.59%±4.9%)增幅相似(图4A-4E)。值得注意的是,当通过EM检查时,酮康唑处理的球体在培养的第14周也显示出髓鞘化,比T3处理的球体早两个月(图4F-4G)。这些结果表明,氯马斯汀和酮康唑增强并加速了人少突胶质细胞生成和成熟,并验证了寡皮层球体提供了生理和物种相关的临床前模型,以在人类临床试验之前评估候选髓鞘疗法。
实施例6球体重现了髓鞘疾病的病理
寡皮层球体提供了前所未有的组织样、最小的操纵系统,可在其中研究人类髓鞘形成的迄今难以接近的阶段以及导致髓鞘疾病的病理过程。申请人研究了单基因脑白质营养不良性Pelizaeus-Merzbacher病(PMD[MIM 312080]),以测试受试系统是否能够重现已知的细胞病理学和功能障碍。
PMD是一种罕见的X连锁疾病,其中髓鞘产生缺陷。已在患者中鉴定了数百个致病基因PLP1中的突变,这些患者的严重程度从轻度的运动延迟和痉挛到严重的伴随有早期幼儿死亡率的肌张力低下。
申请人先前使用二维(2D)培养从一组患病男性患者中产生了PMD iPSC-来源的少突胶质细胞,并且在具有各种突变的个体中证明了不同的和会聚的细胞表型。在这里,申请人从三个具有不同PMD突变的iPSC系产生了寡皮层球体:整个PLP1基因座的缺失,整个PLP1基因座的重复以及PLP1中的点突变(c.254T>G)。从表型上看,这些患者受到轻度(缺失),中度(重复)和严重(点突变)的影响。为了控制来源的性别和细胞类型,申请人同时从内部衍生的健康对照雄性iPSC系CWRU198产生球状体,其表达MYRF(18.4%±2.20%)和PLP1(图5A-5B),与先前描述的对照细胞系H7,H9和CWRU191的表达程度类似。
在寡皮层球体中,MYRF阳性少突胶质细胞的丰度随疾病的严重程度而趋向,而PLP1表达的程度与遗传状态相关(图5C-5H)。尽管预期不存在PLP1,但是PLP1缺失细胞系产生了大量的MYRF阳性少突胶质细胞(15.14%±1.96%)(图5C-5D,5M)。相反,尽管与CWRU198相比,MYRF阳性少突胶质细胞显着减少(11.84%±2.27%),但是重复系却产生了丰富的PLP1信号(图5E)。
在以前的2D培养中,带有c.254T>G点突变的少突胶质细胞表现出明显的PLP1核周保留,其通过内质网应激途径的化学调节解析。寡皮层球体重现了该表型,显示了PLP1的明显的核周保留(图5G)和MYRF阳性少突胶质细胞的最严重减少(9.69%±1.82%)(图5H,5M)。用蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)抑制剂GSK2656157对点突变寡皮层球体的后续处理,改善了PLP1从内质网向少突胶质细胞过程的动员(图5I),并显着增加了MYRF阳性细胞的百分比(15.04%±1.96%)(图5J,5M)。最后,在寡皮层球体产生之前,在iPSC中将点突变CRISPR校正为野生型序列(图11A-11C)不仅将PLP1动员恢复为少突胶质细胞过程(图5K),还增加了MYRF阳性少突胶质细胞的百分比(17.25±3.22%),回到健康对照水平(图5L-5M),并能在培养20周后产生髓鞘(图5N)。
PMD基因型和表型之间的机制关系尚未完全表征。当前数据表明,过量(例如重复)PLP1积累或异常/错误折叠(例如错义突变)的PLP1导致ER应激,细胞死亡和严重的患者表型,而PLP1缺失的耐受性更好,并且受试者寡皮层球体中的细胞丰度和PLP1表达的二分法与该假设一致。hPSC衍生的大脑类器官和皮层球体已经用于解剖涉及神经元疾病的突变特定的病理过程。在验证了该受试系统后,可以将这些努力扩展到各种各样的髓鞘疾病,并开始探索少突胶质细胞出生,成熟,髓鞘的形成和死亡过程中的患者特异性的发病机制。
实施例7各种方法
多能干细胞系
在获得凯斯西储大学(Case Western Reserve University)和大学医院机构审查委员会(University Hospital Institutional Review Board)的知情同意并批准后,之前产生了健康(CWRU191;CWRU198)和PMD iPSC。在这些研究中还使用了来自NIH hESCRegistry批准的两个人类胚胎干细胞(hESC)系(“H7”NIHhESC-10-0061;“H9”NIHhESC-10-0062)。
寡皮层球状体分化
如先前所述并具有以下所述的变化从人多能干细胞产生神经皮层球体(Pasca etal.,Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stemcells in 3D culture.Nat Methods 12,671-678(2015),通过引用并入本文参考)。
为了模式化神经皮层球体,在玻连蛋白(vitronectin)(Gibco#A14700)上培养多能干细胞集落,并使用分散酶(Gibco#17105-041)在37℃孵育10分钟,将多能干细胞集落提起。完整的细胞集落在带有10μM Rock抑制剂Y-27632(Calbiochem#688001),10μMDorsopmorphin(Sigma#P5499),和10μM SB-431542(Sigma#S4317)的球体起始培养基(Spheroid Starter media)中转移至单个低粘附V型底部96孔板(S-Bio Prime#MS-9096VZ)。球体起始培养基是含有20%的敲除血清(Knock out Serum,Invitrogen#12587-010),非必需氨基酸(Invitrogen#11140050),Glutamax(Invitrogen#35050061),β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)和100U/mL青霉素/链霉素的DMEM/F12(Invitrogen#11320-033)。接下来的五天使用相同的不含Rock抑制剂的培养基,此后将培养基改为基于Neurobasal-A的球体培养基。Neurobasal-A球体培养基是Neurobasal-A培养基(Invitrogen#10888022),添加了不含维生素A的B-27血清替代品(Invitrogen#12587),Glutamax(Invitrogen#35050061)和100U/mL青霉素/链霉素。从第7-25天起,将20ng/ml FGF-2(R&D系统#233-FB-25/CF)和10ng/ml EGF(R&D系统#236-EG-200)添加到培养基中。直到第25天,培养在96孔板中球体,每天更换一半培养基。在第25天,将球体以每孔8-10个球体的密度转移到超低附着组织培养表面,例如来自Corning#CLS3471的6孔板中,并通过方案的其余部分进行培养。同样从这一点开始,将1%Geltrex(Invitrogen#A15696-01)添加到Neurobasal-A球体培养基中。通过在Neurobasal-A球体培养基中添加20ng/ml BDNF(R&D系统#248-BD)和20ng/mlNT-3(R&D系统#267-N),可以在第27天到第41天之间诱导神经分化。在第17到41天之间,每隔一天更换一半培养基。
为了产生寡皮层球体,从第50天开始,将10ng/mL的血小板衍生的生长因子-AA(PDGF-AA,R&D Systems#221-AA-050)和10ng/mL的胰岛素样生长因子-1(IGF-1,R&DSystems#291-G1-200)添加到每隔一天更换的培养中,持续10天。接下来,在第60天,将40ng/mL的3,3′,5-三碘甲状腺胺酸(3,3′,5-triiodothronine)(T3,Sigma#ST2877)添加至每隔一天更换的培养基,持续10天。当使用时,在此期间补充小分子。添加4μM的酮康唑和2μM的氯马斯汀替代T3。除T3之外还添加了GSK2656157。
第70天后,球体在Neurobasal-A球体培养基中成熟并保持,每隔一天更换一次培养基,直到实验完成。
独立验证
使用了经NIH hESC Registry(NIHhESC-09-0012)批准的一个hESC细胞系“RUES1”。RUES1在mTeSR1培养基(Stemcell Technologies#85850)中的基质胶上培养,并使用StemPro Accutase(Thermofisher#A1110501)提起。如上文所述进行寡皮层球体分化,除了在分化方案的第1-7天使用N2补充剂(Thermofisher#17502048)和25mg/mL人胰岛素溶液(Sigma#I9278)代替KSR。
小分子
制备4mM的酮康唑(Sigma#K1003)储备液,2mM的富马酸氯马斯汀(Sigma#SML0445)储备液和10mM的GSK2656157(EMD Millipore#5046510001)储备液,分装并保存在-20℃。将小分子加热至37℃ 20分钟,随后加至预热的培养基中。在丢弃前冷冻的等分试样解冻不超过两次。
BrdU标记
为了在球体中标记分裂的细胞,在第58天和第60天将BrdU添加到培养基中,终浓度为3μg/mL。在第60天,BrdU施用后4小时收集第9周样品。对于谱系追踪实验,在第14周收集BrdU标记的球体并进行免疫组织化学处理。
PLP1基因编辑
在圣路易斯华盛顿大学(Washington University in St.Louis)的基因组工程和iPSC中心(Genome Engineering and iPSC Center)使用与该突变重叠的引导RNA(序列:CCAGCAGGCGGGCCCCATCATAAAGG)和具有围绕该突变的25个核苷酸同源臂的寡核苷酸单链对iPSC中的PLP1点突变(c.254T>G)进行CRISPR-Cas9编辑。收到后,对突变和校正位点进行重新测序,并对两个细胞系进行核型分析,以确保在编辑过程(Cell Line Genetics)中不产生大的基因型畸变。
免疫细胞化学
用于免疫组化的球体最初用4%冰冷的多聚甲醛固定45分钟,在PBS中洗涤3次,并用30%蔗糖平衡过夜。将球体嵌入OCT中并以10μm切片。
如先前所述进行免疫组化(Najm et al.,Nat Methods 8,957-962(2011))。简而言之,将切片在PBS中洗涤3次,然后在含有0.1%Triton X-100和0.25%正常驴血清的PBS中封闭30分钟。然后在封闭溶液中使用一抗将切片在4℃下孵育过夜。使用的一抗:大鼠抗-PLP1(1:500,AA3,来自Wendy Macklin的赠予);兔抗-MYRF(1:1000,由Michael Wegner博士提供);山羊抗-SOX10(1:250R&D系统AF 2864);兔抗-OLIG2(1:250,Millipore AB9610;小鼠抗泛轴突神经丝(1:1000,Covance#SMI311);小鼠抗-MBP(1:200,Covance#Smi99),小鼠抗泛神经元神经丝(NF,1:1000,Covance#SMI312);兔抗-GFAP(1:1000,Dako#Z0334);小鼠抗-SATB2(1:250,Abcam,#ab51520);大鼠抗-CTIP2(1:400,Abcam#ab18465);山羊抗-SOX2(1:250R&D Systems,#AF2018);兔抗-TBR2(1:250,Abcam,ab23345);小鼠抗-Ki67(1:250,Millipore MAB4190);小鼠抗-Nestin(1:1000Millipore,MAB5326);小鼠抗-BrdU(1:1000,Millipore,MAB3510);鸡抗-Vimentin(1:1000Abcam,ab24525);DAPI(1μg/ml,Sigma#D8417)。
然后将切片在PBS中洗涤并在二抗中孵育2小时。所有二抗均为LifeTechnologiesAlexaFluor偶联的二抗,稀释度为1:500。
对于PLP1免疫组化,在封闭步骤之前,先在含有10%Triton X-100的PBS中洗涤20分钟。对于MBP免疫组化,使用冰冷丙酮进行20min的后固定步骤。抗原回收后进行BrdU免疫组化,需要将载玻片放入装有沸腾的100mM柠檬酸钠缓冲液的密闭科普林氏缸中,并使其在一个小时的过程中达到室温。
凯斯西储医学医学院成像中心(Case Western Reserve School of MedicineImaging Core)使用Leica DMi8荧光显微镜或Leica Sp8共聚焦显微镜对球体切片进行成像。为了计数MYRF阳性核,每个球体进行了四个20x视野成像。球体的顶部和底部的两个视野和球体的中央区域的边缘的两个视野进行量化(参见图6C示意图)。在Adobe Photoshop或NIH ImageJ中手动计数DAPI阳性细胞的总数和MYRF阳性细胞。每个细胞系和处理条件下分析三到五个球体,使用Graphpad Prism进行t检验来评估细胞系或处理之间的统计学显着性。
电子显微镜检查
如先前所述固定和处理球体(Najm et al.,Nat Methods 8,957-962(2011))。将样品在室温下在含有4%多聚甲醛(EMS),2%戊二醛(EMS)和0.1M甲酸钠(EMS)的固定液中固定1小时。然后将样品锇酸染色,用乙酸铀酰染色并在EMbed 812(EMS)中包埋。使用配备有同心(插入式)高能电子检测器的极高分辨率(XHR)视野发射扫描电子显微镜的FEIHelios NanoLabTM660 FIBSEM观察每个球体样品的超薄切片(120nm),所有图像均在高倍率(15000-35000×)下使用4Kv和0.2当前着陆电压获得。
系列区块平面成像和3D重建
修整环氧树脂嵌入的球体,将其安装在硅片上并用导电银漆覆盖。使用溅射涂层(Cressington Scientific Instruments)沉积形成约1nm厚的附加铱层,并将样品加载到Helios Nanolab 660i双光束显微镜(FEI Company)中进行成像。在将离子柱和离子束重合设置在偏心高度(倾斜角52)之后,使用2kV的电子束和40pA的电流降落,然后离子束(Ga+)辅助的铂作为保护层进行沉积,以用于后续使用0.23nA的低电流铣削横截面,而使用高离子束电流(30kV,6.5nA)去除多余的块状材料。
对于最终的表面抛光/研磨,使用减小的离子电流(30KV,2.8nA)。对于成像,使用Auto Slice and View G3软件(FEI Company),同时电子束电流为400pA,HFW为11.84μm,使用分辨率为6144×4096,停留时间为6μs,工作距离为4.04mm TLD的检测器,来获取154个截面的图像堆(像素大小:1.97,z=50nm)。将原始图像在Fuji成像处理程序包中对齐,并使用Imaris 9.1软件(Bitplane AG)进行图像可视化和髓鞘束的3D重建。
大块RNA测序和分析
在TriReagent(Zymo Research#R2050-1-200)中收集每个细胞系的四个球体,并按照每个制造商的说明提取RNA。使用Qiagen RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen,#73404)进一步纯化RNA。准备了Illumina文库,并在CWRU Genomics Core设施的HiSeq 2500仪器上以50bp的配对末端模式进行测序。使用TopHat v2.0.6将读段与hg19基因组进行比对,但不提供参考转录组。使用Cufflinks v2.0.2测量了来自iGenomes hg19 RefSeq参考的转录本的丰度。FPKM进行了分位数标准化。神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性基因由它们各自细胞中的表达(FPKM>1)而在其他两个谱系中不存在来确定。通过至少在一个球体样品中也检测到的倍数变化,每个列表被减少到对该细胞类型最特异的100个基因。使用Graphpad Prism中的Wilcoxon检验评估基因列表表达的差异。
单细胞RNA测序和分析
如先前所述(Marques et al.,Science 352,1326-1329(2016)),合并十个独立产生的第12周球体并进行解离。简言之,按照制造商的说明,使用Worthington Papain解离系统(Worthington Biochemical Corp.,Lakewood NJ,Cat#:LK003150)解离球体。在解离之前,使用95%O2和5%CO2对木瓜蛋白酶溶液进行氧化。在Countess自动细胞计数器(Countess Automated Cell Counter,Invitrogen)上进行单细胞悬液的细胞计数,并以1,000细胞/μL的最终浓度将细胞上样,以进行单细胞捕获。
使用10x Genomics Chromium Single Cell 3'文库和Bead Kit v2(10xGenomics Inc,Pleasanton CA,Cat#:120237)进行单细胞捕获,cDNA合成,cDNA预扩增和文库制备。回收了3,850个细胞,并以每个细胞38,611个读段的深度进行测序,每细胞具有1,870个中位数基因。Cell Ranger Single-Cell Software Suite v2.1.0用于条形码处理,单细胞3'基因计数和读段均映射到hg19。通过Cell Ranger Single-Cell Software Suitev2.1.0执行PCA降维和tSNE分析,并使用10x Genomics Loupe Cell Browser v2.0.0可视化数据。图2A-2L中的数据是使用10×Genomics Loupe Cell Browser v2.0.0进行聚类获得的,使用目前具有2个集群的K-Means聚类以分离神经元和神经胶质/祖细胞的宽簇。将球体聚类与发育中的人类皮层的公开可获得的单细胞数据进行了比较,该数据可在UCSC集群浏览器(bit.ly/cortexSingleCell)上获得。图2是寡皮层球体基因表达簇热图,其是由10xGenomics Loupe Cell Browser v2.0.0产生的,总体代表与群体中该基因的平均表达相比,每个细胞中基因表达的Log2倍数变化。从UCSC集群浏览器生成发育中的人类大脑皮层的比较基因表达簇热图。
生命科学报告摘要
有关实验设计的更多信息,可在生命科学报告摘要中获取。
数据可用性
所有RNA-seq数据均已以登录号GSE110006(以引用的方式并入本文)存放到GeneExpression Omnibus(GEO)数据库中。
统计
为了定量单个球体中MYRF阳性少突胶质细胞的百分比,对4个区域(如图7所示)进行成像,并对每个球体的MYRF细胞的百分比进行均值处理。对于图1所示的数据,每个处理组都对5个球体(n=5)进行了相似的分析。对于图4所示的数据,每组分析了四个球体(n=4)。图5M所示的数据是来自细胞系CWRU198的五个(n=5)球体和来自每个PMD细胞系的四个(n=4)球体获得的。进行双尾不配对的t检验(Welch校正)一次比较了两组。
使用每种条件下的5个球体进行批量RNA测序。使用配对的非参数Wilcoxon匹配的配对有序秩检验确定显著性。
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本文引用的所有参考文献通过引用并入本文。
Claims (21)
1.从多能干细胞(PSC)产生寡皮层球体(OCS)的方法,该方法包括:
a)通过所述多能干细胞的神经皮层模式形成(patterning)产生神经皮层球体(NCS);
b)使所述神经皮层球体定时暴露于确定的少突胶质细胞谱系生长因子和/或激素,以促进所述神经皮层球体内的天然少突胶质细胞祖细胞(OPC)群体的增殖、存活和/或扩增,从而产生所述寡皮层球体;
其中所述寡皮层球体包含少突胶质细胞祖细胞(OPC),其能够分化为能够使轴突髓鞘化的髓鞘少突胶质细胞(ODC)。
2.权利要求1的方法,其中所述确定的少突胶质细胞谱系生长因子和激素包括血小板衍生的生长因子-AA(PDGF-AA)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。
3.权利要求1或2的方法,其进一步包括定时暴露于另外的生长因子和/或激素以诱导少突胶质细胞分化。
4.权利要求3的方法,其中所述另外的生长因子和/或激素包括甲状腺激素(T3),氯马斯汀(clemastine)和/或酮康唑。
5.权利要求1-4中任一项的方法,其中步骤b)在等同于受孕后约10周或在步骤a)开始后约50-60天的时间进行。
6.权利要求1-5中任一项的方法,其中所述定时暴露于另外的生长因子和/或激素以诱导少突胶质细胞分化在等同于受孕后约14周或在步骤a)开始后的约60-70天的时间进行。
7.权利要求1-6中任一项的方法,其中所述多能干细胞来自人胚胎干细胞系,或来自诱导多能干细胞(iPSC)系。
8.权利要求1-7中任一项的方法,其中步骤b)在约10天的时间段内进行。
9.权利要求1-8中任一项的方法,其中在步骤a)结束时所述神经皮层球体基本上不包含少突胶质细胞谱系细胞(例如,通过一种或多种典型OPC标志物的缺乏或最小免疫染色来证明,所述典型OPC标志物例如转录因子OLIG2和SOX10)。
10.权利要求1-9中任一项的方法,其中与未通过步骤b)处理的年龄匹配的神经皮层球体相比,在步骤b)结束时所述寡皮层球体包含实质上增加的OPC(例如,通过一种或多种典型OPC标志物的免疫染色的增加来证明,所述典型OPC标志物例如转录因子如OLIG2和SOX10,少突胶质细胞膜蛋白如蛋白脂蛋白1(PLP1)和在CNS中的少突胶质细胞中特异性表达的转录因子如MYRF)。
11.权利要求1-9中任一项的方法,其中所述多能干细胞是从患有疾病的受试者中分离的iPSC。
12.权利要求11的方法,其中所述疾病的特征在于髓鞘产生的缺陷,或由髓鞘或其功能的丧失引起/与髓鞘或其功能的丧失相关的缺陷。
13.权利要求12的方法,其中所述疾病是Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)。
14.权利要求12的方法,其中所述PMD的特征在于整个PLP1基因座的缺失,整个PLP1基因座的重复或PLP1中的点突变(c.254T>G)。
15.使用权利要求1-14中任一项的方法产生的寡皮层球体。
16.从多能干细胞形成的寡皮层球体,其中所述寡皮层球体包含少突胶质细胞祖细胞(OPC),其能够分化为能够使轴突髓鞘化的髓鞘少突胶质细胞。
17.权利要求16的寡皮层球体,其进一步包含能够使轴突髓鞘化的髓鞘少突胶质细胞。
18.用于筛选有效治疗疾病的药物的方法,所述疾病的特征在于髓鞘产生的缺陷,该方法包括使来自候选药物文库的多种候选药物每种单独与从多能干细胞形成的寡皮层球体接触,所述多能干细胞来自于患有所述疾病的个体,和鉴定一种或多种有效治疗所述疾病的候选药物,所述候选药物减轻髓鞘产生的缺陷/恢复髓鞘量或功能/防止髓鞘丧失。
19.权利要求18的方法,其进一步包括对患有所述疾病的动物施用鉴定为有效的候选药物。
20.权利要求18的方法,其中所述个体是人类。
21.权利要求19的方法,其中所述动物是作为所述疾病的模型的小鼠。
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