JP2020519237A - ヒトオリゴデンドロサイトを作製しインビトロでの髄鞘形成を研究するための個別化された神経系3d培養系 - Google Patents
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Abstract
ヒト多能性幹細胞を、分析、スクリーニングプログラム等で使用するためのオリゴデンドロサイトを含むオリゴデンドロ−スフェロイドに、インビトロで分化させる。
Description
ヒトの中枢神経系の複雑な発達を理解し、患者の神経障害及び精神障害の機序を解明することにおいて、機能するヒトの脳組織へのアクセスが制限されていることにより、大きな進展は見られていない。げっ歯類及び他の哺乳類での研究では、神経発達の基本原理に関する重要な洞察が与えられたが、霊長類で前脳が大きく発達していることの原因となる細胞及び分子のプロセスも、またヒトに特異的な、前脳の多数の特徴の原因となる細胞及び分子のプロセスも、ほとんど分かっていない。
近年、この分野では、細胞の初期化という、最終分化した体細胞が多能性幹細胞に変換され得る過程を導入してパラダイムシフトが達成され、その多能性幹細胞はヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)と命名された。これらのhiPSCはいかなる個体からも作製することができ、重要なことには、神経系細胞を含め、胚葉性のすべての誘導体への分化をインビトロで誘導することができる。
hiPSCを作製する方法及び効率は大幅に改善され、あちこちの研究機関で標準化されてきているが、特定の神経系細胞種及びグリア細胞種に誘導する方法は引き続き課題となっている。この10年で、単層における多能性幹細胞の神経系への特異化及び分化に関するプロトコルが改善されたことにより、多種多様な細胞が作製されるに至った。それでもなお、2次元(2D)の方法では、発達中の3次元(3D)神経系の細胞構築、または生体内神経系のネットワーク及び回路の複雑性と機能性とを再現しにくい。さらに、これらの方法は骨が折れるうえに費用がかかり、効率が悪く、比較的未成熟なニューロンを生じさせる。
オリゴデンドロサイトは、脳機能で重要な役割を果たす中枢神経系にあるグリア細胞である。オリゴデンドロサイトは、ニューロンの軸索に絶縁層を巻き付ける突起を伸長させ、ニューロン間でシグナルがより急速に伝達されるようにしている。オリゴデンドロサイトはまた、ニューロンへの栄養因子の供給と細胞外環境の緩衝とによって支持的役割も果たす。髄鞘形成の消失は、ニューロンの死及び神経系機能障害をもたらし得る。結果として、多発性硬化症または白質消失病など多くのヒト疾患が髄鞘形成の消失または低下に関連している。
健康及び疾患における髄鞘形成の研究では、利用可能な適切なモデルが少ないことから限界がある。げっ歯類は、ヒト生物学の側面を研究するための代替として一般的に使用されるが、ヒトの脳では髄鞘形成はげっ歯類の脳よりはるかに広範囲にわたる。さらに、ヒト患者から得た利用可能な健常脳試料の数には限界があるため、ヒトの脳で髄鞘形成を広く研究することはできない。近年、インビトロでの髄鞘形成研究用に、ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞(hESC、hiPSC)からオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)及びオリゴデンドロサイトを作製する試みがなされてきた。
hESC由来及びhiPSC由来の髄鞘形成モデルは、正常状態及び疾患状態下のオリゴデンドロサイトの発達及び髄鞘形成という過程を研究するために不可欠であるばかりではなく、調合薬のスクリーニングに応用することもできる。これらのモデルを使用して、特定の疾患状態に関連した特異的異常を修正する化合物をスクリーニングすることも、また新治療用化合物及び化学物質の毒性をヒトへの曝露に先立ち試験することもできる。特に、神経毒性の分野では、神経細胞またはグリア細胞の機能障害を評価することができる試験法は、ヒト細胞ではまだない。
したがって、ニューロンの髄鞘形成など、高度に機能するヒト組織を再現するインビトロのスクリーニングプラットフォームの開発が最も重要である。
刊行物
霊長類の分化した体細胞を多能性状態に初期化させる方法には、分化した体細胞の核移植、分化した体細胞と多能性幹細胞との融合、及び人工多能性幹細胞(iPS細胞)を産生させる直接的初期化が含まれる(Takahashi K,et al.(2007)Cell 131:861−872、Park IH,et al.(2008)Nature 451:141−146、Yu J,et al.(2007)Science 318:1917−1920、Kim D,et al.(2009)Cell Stem Cell 4:472−476、Soldner F,et al.(2009)Cell.136:964−977、Huangfu D,et al.(2008)Nature Biotechnology 26:1269−1275、Li W,et al.(2009)Cell Stem Cell 4:16−19)。
霊長類の分化した体細胞を多能性状態に初期化させる方法には、分化した体細胞の核移植、分化した体細胞と多能性幹細胞との融合、及び人工多能性幹細胞(iPS細胞)を産生させる直接的初期化が含まれる(Takahashi K,et al.(2007)Cell 131:861−872、Park IH,et al.(2008)Nature 451:141−146、Yu J,et al.(2007)Science 318:1917−1920、Kim D,et al.(2009)Cell Stem Cell 4:472−476、Soldner F,et al.(2009)Cell.136:964−977、Huangfu D,et al.(2008)Nature Biotechnology 26:1269−1275、Li W,et al.(2009)Cell Stem Cell 4:16−19)。
中枢神経系ニューロンを用いて3次元系で培養され得る、ヒトのOPC及び髄鞘を形成するオリゴデンドロサイトをインビトロで作製するための組成物及び方法を提供する。本発明の特徴は、治療薬物及び治療レジメン用に細胞を疾患に関連させて作製しスクリーニングすることを可能にする、OPC及びオリゴデンドロサイトを患者試料から作製する能力である。かかる方法はヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を利用するが、これは患者または保因者の細胞試料、例えば、脂肪細胞、角化細胞、線維芽細胞等から得てよい。hiPSCを、インビトロで外胚葉運命が発生するよう誘導し、その後、オリゴデンドロサイトを含有するスフェロイド、すなわちヒトオリゴデンドロ−スフェロイド(hOS)、ならびに神経系前駆細胞、アストロサイト及びニューロンに分化させる。hOSから細胞集団を単離することも、また無傷のhOSを相互作用細胞集団のモデルとして使用することもできる。hOS及びそれに由来する細胞は、移植用、実験評価用、系列及び細胞に特異的な産物の供給源等として使用できる。いくつかの実施形態では、細胞培養は支持細胞を用いず、異種由来成分不含である。
本発明のいくつかの実施形態では、疾患関連オリゴデンドロサイトなど、これに限定されない精製されたヒトのOPCまたはオリゴデンドロサイトの集団を提供し、その場合、かかる細胞は、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)から分化させる。いくつかの実施形態では、そのようなインビトロで作製される細胞のパネルを提供し、その場合、かかるパネルには、遺伝子の異なる2つ以上の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、そのような細胞のパネルを提供し、その場合、かかる細胞は、複数の候補薬剤、またはある候補薬剤の複数用量に供され得る。候補薬剤には、低分子、すなわち、目的RNAの発現、電気的変化を増加または減少させる遺伝子構成体、及び薬物などが含まれる。いくつかの実施形態では、パネルとは、2つ以上の異なる状態から得た患者個別の細胞を用いる系または方法を指し、状態は、遺伝学的に別個の3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上の状態であってよい。
本発明のいくつかの実施形態では、hOSから得たオリゴデンドロサイトに対する候補薬剤の活性を決定する方法を提供し、かかる方法は、候補薬剤を、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)から分化させた、精製されたニューロン、アストロサイト、OPSまたはオリゴデンドロサイトの集団の1種またはパネル1組と接触させることを含む。細胞集団は、任意選択で、髄鞘形成性もしくは脱髄性疾患もしくはオリゴデンドロサイトの発達障害が関連するかまたは生じる変異をコードする少なくとも1つのアレルを含み、その後、遺伝子発現プロファイリングなど、これに限定されない、形態、遺伝子または機能のパラメータに対して薬剤が及ぼす効果を判定する。スクリーニング方法と免疫エフェクター細胞とを併用し、オリゴデンドロサイトのそのような免疫細胞の活性及び髄鞘形成、またはhOSのオリゴデンドロサイト、アストロサイトと、患者から得た自己由来免疫細胞との相互作用を決定してよい。単個細胞レベルでの分析方法は特に関心対象であり、例えば、髄鞘形成試験法、単個細胞遺伝子発現、オリゴデンドロサイトがニューロンまたはアストロサイトに及ぼす作用、及び神経細胞シグナル伝達等である。候補薬剤には、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞、ミクログリア細胞、マクロファージ、NK細胞など、及び免疫エフェクタータンパク質、例えば、IFN−γ、TGF−β、サイトカイン、インターフェロンなどが含まれ、特に、炎症性脱髄性疾患での関与が疑われるような細胞及びタンパク質が含まれる。
本発明の方法は、オリゴデンドロサイトの分化及び髄鞘形成における神経系細胞と前駆細胞との自然の相互作用を利用する。いくつかの実施形態では、hiPSCからオリゴデンドロサイトへの分化は実質的に無血清培地で実施される。
hOSでの分化後、オリゴデンドロサイトなど、これに限定されない、関心対象の個々の細胞種を各種目的用に単離することができる。細胞は、発達の適切な段階で採取されるが、その段階は、所望の細胞種のマーカー発現及び表現型の特性に基づいて決定してよい。培養は、関心対象マーカーの存在についての免疫染色もしくは遺伝子発現、または形態学的決定等、いずれによっても経験的に試験してよい。薬物による選択、パニング、密度勾配遠心等による陽性選択ステップの前または後に任意選択で細胞を濃縮する。別の実施形態では、陰性選択を実施し、その場合、かかる選択は、ヒトのES細胞、線維芽細胞、神経系細胞、上皮細胞等で見られるマーカーの1つ以上の発現に基づいて行われる。選択には、パニング法、磁性粒子による選択、粒子選別装置による選択等を用いてよい。
さまざまな体細胞がhiPSCの供給源として利用されるが、特に関心対象となるのは、脂肪組織由来幹細胞、線維芽細胞、角化細胞、末梢血細胞等である。遺伝子型、特に、神経障害及び精神障害に関連している可能性がある遺伝子型が異なる複数の個人から得たhiPSCを使用することが特に関心対象となる。hiPSCを単個細胞に解離させ、特定細胞数のスフェロイドに集合させてから浮遊状態で増殖させ、その後、BMP経路及びTGFβ経路を阻害することによって神経系の運命に誘導する。その後、スフェロイドをFGF2及びEGFの存在下で培地に移し、Wnt経路阻害剤またはレチノイン酸、ならびにソニック・ヘッジホッグ経路のアクチベーターでパターン形成させる。分化を促進するため、スフェロイドを、PDGF−AA、IGF−1、HGF、インスリン、BDNF、NT3、cAMP、T3、及びビオチンを含む培地に交換する。そのような培養後、スフェロイドは、インスリン、アスコルビン酸、cAMP、T3、及びビオチンを含有している神経系用培地で、増殖因子非存在下、長期間、例えば、1か月、2か月、3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月またはそれ以上の期間、維持が可能である。
本発明のこれら及び他の課題、利点、ならびに特徴は、下記で十分に詳述される、対象とする方法及び組成物の詳細を読むと、当業者には明らかとなる。
本発明は、添付の図面と併せて読むと、以下の詳細な説明から最も良く理解される。通例に従い、図面のさまざまな特徴は、縮尺通りではないことが強調される。むしろ、さまざまな特徴の大きさは、分かりやすくするために任意に拡大または縮小されている。図面には、以下の図が含まれる。
本願組成物及び方法を記載する前に、本発明は、記載されている特定の組成物及び方法に限定されるものではなく、そのような組成物及び方法は当然ながら異なり得ることを理解されるべきである。本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は、あくまで個々の実施形態の記載を目的とするものであり、限定することを意図しないということも理解されるべきである。
値の範囲が提供されている場合、その範囲の上限と下限との間に介在する値のそれぞれ(文脈で特に明確な指示がない限り、下限の10分の1の単位まで)も明確に開示される。記述された範囲内の任意の記述された値または介在している値と、その記述された範囲内で他に記述されているか介在している任意の値とに挟まれる、より小さな範囲の各々は、本発明に包含される。これらの小範囲の上限及び下限は、その記述された範囲内に独立して含まれても除外されてもよく、また、その小範囲内にある、限界値の一方もしくは両方を含むかまたはいずれも含まない範囲の各々も、その記述された範囲で明確に除外された限界値に従って、本発明に包含される。記述されている範囲に限界値のうち一方または両方が含まれる場合、その含まれた限界値のいずれかまたは両方を除外した範囲もまた本発明に含まれる。
特に明記しないかぎり、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はいずれも、本発明が属する分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つ。本発明の実施または試験に際し、本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等の任意の方法及び材料も使用することができるが、有力かつ好ましい方法及び材料のいくつかをここに記載する。本明細書で言及される刊行物はすべて、引用されている刊行物と関連させて方法及び/または材料を開示及び記載するために参照することにより本明細書に組み込まれる。矛盾がある限り、本開示は、組み込まれた刊行物のいかなる開示にも優先すると理解される。
本明細書及び添付の請求の範囲で使用する場合、単数形「a」、「an」、及び「the」には、文脈で特に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「初期化因子ポリペプチド」への言及には、そのようなポリペプチドの複数が含まれ、「人工多能性幹細胞」への言及には、当業者に公知の1つ以上の人工多能性幹細胞及びその同等物への言及が含まれるということになる。
本明細書で論じる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のみを目的として提供されている。本明細書のいかなる記載も、本発明が先行発明を理由としてかかる刊行物に先行する権利がないことを承認するものと解釈すべきではない。さらに、記載の刊行日は実際の刊行日と異なる可能性があり、実際の刊行日を個別に確認する必要がある可能性がある。
「多能性」及び多能性幹細胞により、そのような細胞が、生物内であらゆる種類の細胞に分化する能力を有することを意味する。用語「人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞(ESC)のように、生物内であらゆる種類の細胞に分化する能力を維持したまま長期の培養が可能であるが、ESCとは異なり、分化した体細胞、すなわち、潜在能力がより狭く、より定義されてしまった、実験操作なしでは生物内であらゆる種類の細胞を生じさせるということはできなかった細胞に由来する、多能性細胞を包含する。hiPSCは、ヒトESC様の形態をしており、平坦なコロニーで増殖し、核−細胞質比が大きく、境界は画定され、核が際立っている。さらに、hiPSCは当業者に公知のいくつかの多能性マーカーを発現し、それらには、アルカリホスファターゼ、SSEA3、SSEA4、SOX2、OCT3/4、NANOG、TRA−160、TRA−181、TDGF1、DNMT3B、TERT、及びZFP42が含まれるが、これに限定されるものではない。さらに、hiPSCは奇形腫を形成することができる。hiPSCは、生きている生物内で外胚葉、中胚葉、または内胚葉の組織を形成するかまたはかかる組織に寄与することができる。
本明細書で使用する場合、「初期化因子」とは、細胞に作用して転写を変化させ、それにより細胞を初期化して複能性または多能性にする生物学的に活性な因子の1つ以上、すなわちカクテルを指す。初期化因子は、細胞、例えば、線維芽細胞、脂肪細胞等などの心疾患についての関心対象の家族歴または遺伝子構造を有する個体から得た細胞に対し、個々別々かまたは初期化因子の単一組成物として、すなわち、予混合組成物として提供されてよい。因子は、同一モル比または異なるモル比で提供されてよい。因子は、対象発明の細胞の培養期間中、1回または複数回提供されてよい。いくつかの実施形態では、初期化因子は、Oct3/4、SOX2、KLF3、c−MYC、NANOG、及びLIN−28など、これに限定されない転写因子である。
体細胞を、上記で定義したような初期化因子と、ある組み合わせで、細胞を多能性に初期化するために十分な量で接触させる。初期化因子は、体細胞に対し、個々別々かまたは初期化因子の単一組成物として、すなわち、予混合組成物として提供されてよい。いくつかの実施形態では、初期化因子は、ベクター上の複数のコード配列として提供される。体細胞は、当該技術分野で公知のように線維芽細胞、脂肪細胞、間質細胞等であってよい。体細胞またはhiPSCは、セルバンク、正常ドナー、関心対象の神経性疾患または精神疾患を有する個人等から得ることができる。
多能性の誘導に続き、hiPSCを任意の好都合な方法に従って、例えば、照射支持細胞及び市販培地などで培養する。hiPSCは、プロテアーゼ、例えば、アクターゼなどを用いて支持細胞から解離させることができ、プレートから単個細胞に剥離するために十分な濃度及び期間で消化させることが好ましい。
遺伝子は、多種多様な目的で体細胞またはそれに由来するhiPSCに導入してよく、例えば、機能喪失変異がある遺伝子の交換、マーカー遺伝子の提供等のために導入してよい。別法として、アンチセンスmRNAまたはリボザイムを発現するベクターを導入し、それにより、望ましくない遺伝子の発現を遮断する。遺伝子治療の他の方法は、正常前駆細胞を優位にして選択圧を受けやすくさせる薬物耐性遺伝子の導入であり、例えば、多剤耐性遺伝子(MDR)、またはBCL−2のような抗アポトーシス遺伝子である。上述のように、当該技術分野で公知のさまざまな技術を使用して標的細胞に核酸を導入してよく、例えば、電気穿孔法、カルシウム沈降DNA、融合、トランスフェクション、リポフェクション、感染等がある。DNAを導入する特定の方法が本発明の実施に重要というわけではない。
用語「オリゴデンドロサイト」、「オリゴデンドロサイト前駆細胞」等は、オリゴデンドロサイト系列の細胞、すなわち、最終的にオリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞(oligodendrocyte precursor cell)、及び成熟したミエリン形成性オリゴデンドロサイトを生じさせる神経系前駆細胞を包含し得、それらは、本発明の目的のため、実験操作によってオリゴデンドロサイト以外の細胞から生じる。オリゴデンドロサイトは、以下に考察するようにオリゴデンドロサイト系列細胞に特異的なマーカーによって同定することができる。オリゴデンドロサイトは機能的特性を有してよい、すなわち、ニューロンに髄鞘を形成する能力などを有してよい。「オリゴデンドロサイト前駆細胞(oligodendrocyte precursor)」または「オリゴデンドロサイト前駆細胞(oligodendrocyte progenitor cell)」は、オリゴデンドロサイトを含め、子孫を生じさせる能力がある細胞であると定義される。
オリゴデンドロサイトは、中枢神経系の髄鞘形成細胞である。オリゴデンドロサイトは多くの突起を伸長させ、軸索に接触し、長く伸びていく軸索に被膜を形成していく。こうして巻き付いたオリゴデンドロサイトの膜の層がその後凝縮して髄鞘を形成する。1本の軸索には、多くの異なるオリゴデンドロサイトによる髄鞘節が含有され得る。
髄鞘形成には、オリゴデンドログリア細胞系列の成熟における多数の連続的ステップを要する。これらのステップには、細胞表面抗原の発現の協調的変化を伴う。オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーには、例えば、血小板由来増殖因子α受容体(PDGFR−α)が含まれる。オリゴデンドロサイトの他のマーカーには、ネスチン、プロテオリピドタンパク質、ポリシアリル化形態の神経細胞接着分子(NCAM)、ガングリオシドGD3、及び炭酸脱水酵素II(CA−II)が含まれる。CA−IIなどのいくつかのマーカーは、系列のすべての段階をカバーし、成体オリゴデンドロサイトのマーカーでもある。同様に、ガラクトシルセラミド及び硫酸化ガラクトシルセラミドは、成熟オリゴデンドロサイトの表面に存在したまま残る初期マーカーである。特定のミエリンタンパク質をコードする他の遺伝子は、オリゴデンドロサイトの分化及び成熟が異なる段階で発現される。例えば、2’,3’−環状ヌクレオチド−3’−ホスホヒドラーゼ(CNP)、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、PLP/DM−20、ミエリン関連糖タンパク質(MAG)、及びミエリン/オリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)の各遺伝子、ならびに他の少数のミエリンタンパク質はすべて、成熟オリゴデンドロサイトのマーカーである。
オリゴデンドロサイトの成熟及び生存には数多くの因子を要すると推測されてきた。これらの因子を、本発明のヒトオリゴデンドロサイト培養を用いて試験することができる。関心対象の因子には、PDGF、塩基性FGF、インスリン様増殖因子I(IGF−I)、ニューロトロフィン3(NT−3)、グリア増殖因子(GGF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、IL−6、トランスフォーミング増殖因子(TGF)−β及びIL−2が含まれ得る。
髄鞘は、脊椎動物の神経系に最も大量にある膜構造を構成している。髄鞘に脂質が大量に存在し水含有量が少ないことにより、軸索の電気的絶縁が可能になり、また髄鞘形成された領域の独特な分節構造は神経インパルスの跳躍伝導に関与している。これにより、髄鞘は、脊椎動物中枢神経系の比較的細い軸索で素速い神経伝導を支持することができる。高速伝導、長距離シグナル伝達の忠実性、及び空間経済は、脊椎動物神経系に髄鞘が付与する主要利点である。
髄鞘形成及びこの複雑な過程を調節するシグナルの機序を、本発明の細胞及び培養を用いて試験してよい。連続的ステップがあり、3Dスフェロイド内で髄鞘形成されるべき軸索へとオリゴデンドロサイトが遊走する、かかる軸索にオリゴデンドロサイトの突起が接着する、軸索周囲への突起の巻き付けを、所定数の髄鞘で、髄鞘形成対象外の空間を認識して行う、というステップである。これらのステップの各々を、提案する発明の生きた細胞で試験し、操作することができる。さらに、発達時のオリゴデンドロサイトとアストロサイトとの相互作用を、ここに提示の3Dスフェロイドで試験することができる。また、スフェロイドは培養で長期生存するため、これらの相互作用における経時的な髄鞘の可塑性及び変化を試験することもできる。
脳の領域間のオリゴデンドロサイトの遊走を、提案する発明で試験することもできる。脳の発達の際、外套下部で波のように初期オリゴデンドロサイトが産生され、皮質または外套へ遊走する。オリゴデンドロサイトを含有するスフェロイドを皮質スフェロイドと融合させ、遊走動態、方向性の鍵、及び皮質へのオリゴデンドロサイトの遊走を支配する対立シグナルのモデルを作製することができる。この系は、異常なオリゴデンドロサイトの遊走または分布が役割を果たしている可能性がある疾患の研究に使用することもできる。オリゴデンドロサイトは生体内では組織を通って遊走するので、提案する3Dモデルでは、2Dオリゴデンドロサイトモデルの場合のように平坦な表面に沿う場合とは対照的に、オリゴデンドロサイトの遊走がより良く保持される可能性が高い。
オリゴデンドロサイトは、インビトロでの培養細胞としてのさまざまな使用に加え、適切な動物モデルでの試験も可能である。あるレベルにおいて、細胞を、生体内で生き残り、その表現型を維持する能力について評価する。細胞組成物を免疫不全動物(ヌードマウス、または化学的に、もしくは照射によって免疫不全になっている動物など)に投与する。再増殖期間の後、組織を採取し、投与した細胞またはその子孫がまだ存在しているか否かについて評価するが、その後、関心対象処置に対する応答について表現型を解析してよい。動物モデルで適性を決定することもでき、その際、損傷後に続いて生じる回復の程度、または疾患の場合は、本発明の分化細胞を用いた処置の結果としての回復の程度を評価することを手段とする。
疾患との関連性
多数の病理がオリゴデンドロサイトの機能不全に関連している。ヒトの遺伝性髄鞘疾患である白質ジストロフィーは、髄鞘形成不全、髄鞘低形成、または脱髄により生じる可能性がある。髄鞘形成不全及び髄鞘低形成は、胎生期または乳児期初期に髄鞘形成に障害が生じるもので、ペリツェウス−メルツバッハー病のさまざまな型で観察される。髄鞘の崩壊である脱髄は、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ALD、カナバン病、アレキサンダー病、正染性白質ジストロフィー、またはミトコンドリア病などの代謝性白質ジストロフィーの特徴である。髄鞘形成不全及び脱髄は、白質ジストロフィーの一部の型に統合され得る。
多数の病理がオリゴデンドロサイトの機能不全に関連している。ヒトの遺伝性髄鞘疾患である白質ジストロフィーは、髄鞘形成不全、髄鞘低形成、または脱髄により生じる可能性がある。髄鞘形成不全及び髄鞘低形成は、胎生期または乳児期初期に髄鞘形成に障害が生じるもので、ペリツェウス−メルツバッハー病のさまざまな型で観察される。髄鞘の崩壊である脱髄は、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ALD、カナバン病、アレキサンダー病、正染性白質ジストロフィー、またはミトコンドリア病などの代謝性白質ジストロフィーの特徴である。髄鞘形成不全及び脱髄は、白質ジストロフィーの一部の型に統合され得る。
いくつかの遺伝性疾患は白質脳症を生じさせ得、その場合、脱髄は、血管、ミトコンドリア、もしくは神経細胞の変化に続発しているか、または徴候が広範に分布する代謝性疾患に関連し得る。皮質下梗塞と白質脳症とを伴う常染色体優性脳動脈症(CADASIL)は、常染色体優性脳動脈症である。MRIで多発性の皮質下梗塞が証明され、おおよそ広範になり得る白質の脱髄を伴う。MELAS(ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群)は、血清及びCSF中の乳酸対ピルビン酸比の上昇を伴う乳酸アシドーシスを呈する。MRIでは、白質の変容が皮質萎縮症と共に存在することが示される。
フェニルケトン尿症は脱髄に関連し得る。中間代謝異常も脱髄を生じさせる場合がある。いくつかの遺伝性神経細胞疾患は髄鞘に影響を及ぼし得る(GM2ガングリオシドーシス、ウィルソン病、及びCNS変性疾患)。
血液脳関門の崩壊は、CNSの脱髄性疾患、例えば、多発性硬化症(MS)、EAEの脱髄型、及びウイルス誘導性脱髄などの病理学的徴候における主要事象である。T細胞はこの過程において極めて重要な役割を果たす。活性化T細胞のCNSへの接近は、炎症細胞、マクロファージ、及びミクログリアによる、炎症誘発性サイトカイン、例えば、TNF−α及びインターフェロン−γなどの放出の原因であり得る。
用語「治療」、「治療する(treating)」、「「治療する(treat)」等は本明細書では一般に、所望の薬理学的及び/または生理学的効果を得ることを指すために使用される。かかる効果は、疾患またはその症状を完全もしくは部分的に予防するという点で予防的であり得、及び/または、疾患及び/またはかかる疾患に起因する有害作用に対する部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒という点で治療的であり得る。本明細書で使用する場合、「治療」は、哺乳類、特にヒトの疾患の任意の治療を包含し、それには、(a)疾患または症状にかかりやすい可能性はあるが、まだそのように診断されていない対象において、かかる疾患または症状の発現を予防すること、(b)疾患の症状を阻害すること、すなわち疾患症状の発症を停止させること、または(c)疾患の症状を軽減すること、すなわち疾患もしくは症状を退縮させることが含まれる。
用語「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」は本明細書では同じ意味で使用され、診断、治療、または療法が所望される任意の哺乳類対象、特にヒトを指す。
本発明の方法
ヒトオリゴデンドロ−スフェロイド(hOS)のインビトロ細胞培養及びそこに含まれる細胞、具体的にはオリゴデンドロサイト及びニューロンを獲得及び使用するための方法を提供し、その場合、かかる細胞をヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)から分化させる。いくつかの実施形態では、hiPSCは、神経学的に正常な個体から得られた体細胞に由来する。他の実施形態ではhiPSCは、上記の髄鞘形成関連疾患など、これに限定されない神経疾患に関連した変異をコードする少なくとも1つのアレルを含む個体から得られた体細胞に由来する。いくつかの実施形態では、そのようなオリゴデンドロサイトのパネルを提供し、その場合、かかるパネルには、遺伝子が異なるオリゴデンドロサイトが2つ以上含まれる。いくつかの実施形態では、そのようなオリゴデンドロサイトのパネルを提供し、その場合、かかるオリゴデンドロサイトを、複数の候補薬剤もしくは他の治療介入、または複数の候補薬剤用量または他の治療介入に供する。候補薬剤には、低分子、すなわち、目的RNAの発現、電気的変化を増加または減少させる遺伝子構成体、及び薬物など、これに限定されない。
ヒトオリゴデンドロ−スフェロイド(hOS)のインビトロ細胞培養及びそこに含まれる細胞、具体的にはオリゴデンドロサイト及びニューロンを獲得及び使用するための方法を提供し、その場合、かかる細胞をヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)から分化させる。いくつかの実施形態では、hiPSCは、神経学的に正常な個体から得られた体細胞に由来する。他の実施形態ではhiPSCは、上記の髄鞘形成関連疾患など、これに限定されない神経疾患に関連した変異をコードする少なくとも1つのアレルを含む個体から得られた体細胞に由来する。いくつかの実施形態では、そのようなオリゴデンドロサイトのパネルを提供し、その場合、かかるパネルには、遺伝子が異なるオリゴデンドロサイトが2つ以上含まれる。いくつかの実施形態では、そのようなオリゴデンドロサイトのパネルを提供し、その場合、かかるオリゴデンドロサイトを、複数の候補薬剤もしくは他の治療介入、または複数の候補薬剤用量または他の治療介入に供する。候補薬剤には、低分子、すなわち、目的RNAの発現、電気的変化を増加または減少させる遺伝子構成体、及び薬物など、これに限定されない。
疾患関連細胞での候補薬剤の活性を決定する方法も提供し、かかる方法は、候補薬剤を、神経疾患に関連した変異をコードする少なくとも1つのアレルを任意選択で含むヒト多能性幹細胞から分化させた細胞、例えば、hESCまたはhiPSCから分化させた細胞などの1つまたは1パネルと接触させること、及び遺伝子発現プロファイリングが非限定的に含まれる、形態、遺伝子または機能のパラメータに対し薬剤が及ぼす効果を判定することを含む。これらの方法は、遺伝性疾患モデルの他、オリゴデンドロサイトの成熟及び髄鞘形成に影響を与える環境操作に応用することができ、これには、酸素張カ、温度、及び加える力の変更が含まれるが、これに限定されるものではない。
ヒトオリゴデンドロ−スフェロイド(hOS)及びそこに含まれる細胞、例えば神経系前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)、アストロサイト、髄鞘形成オリゴデンドロサイト及びニューロンなどを体細胞から作製するには多段階過程を用いる。初めに、hiPSCは、任意の好都合な供給源から得ることも、また当該技術分野で認められている方法を使用して体細胞から作製することも可能である。hiPSCを支持細胞から解離させ、FGF2非存在下で、好ましくは単個細胞として解離した際に、浮遊培養で増殖させる。ある実施形態では培養には、例えば、ビトロネクチンでコートした容器で増殖させた場合などに、支持細胞層を用いず、hiPSCを単個細胞浮遊液として解離させ、特定サイズのスフェロイドに集合させる。培養さらに、非ヒト成分不含、すなわち、異種由来成分不含であってよい。浮遊液増殖には、任意選択で、有効用量の選択的Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤が培養初期、最高約6時間、約12時間、約18時間、約24時間、約36時間、約48時間までの期間、培地中に含まれる(例えば、Watanabe et al.(2007)Nature Biotechnology 25:681 686を参照のこと)。そのような目的に有用な阻害剤には、限定することなく、Y−27632;チアゾビビン(Cell Res,2013,23(10):1187−200;ファスジル(HA−1077)HCl(J Clin Invest,2014,124(9):3757−66);GSK429286A(Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(12):E1140−8);RKI−1447;AT13148等が含まれる。
その後、hiPSCの浮遊培養を神経系の運命に誘導する。この培養は、支持細胞なしであってよい。神経系の誘導には、有効用量のBMP阻害剤、及び有効用量のTGFβ経路阻害剤を少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、及び最高約10日、最高約9日、最高約8日、最高約7日、最高約6日、最高約5日の期間培地に加える。例えば、ドルソモルフィン(DM)を、少なくとも約0.1μM、少なくとも約1μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約50μM、最高約100μMの濃度という有効用量で加えることができ、これは、骨形成タンパク質(BMP)I型受容体(ALK2、ALK3及びALK6)を阻害する。他の有用なBMP阻害剤には、限定することなく、A83−01、DMH−1、K02288、ML347、SB505124等が含まれる。SB−431542は、少なくとも約0.1μM、少なくとも約1μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約50μM、最高約100μMの濃度という有効用量で加えることができ、これは、TGFβシグナル伝達を阻害するがBMPシグナル伝達には全く影響を与えない。他の有用なTGFβ阻害剤には、限定することなく、LDN−193189(J Clin Invest,2015,125(2):796−808)、ガルニセルチブ(LY2157299)(Cancer Res,2014,74(21):5963−77)、LY2109761(Toxicology,2014,326C:9−17)、SB525334(Cell Signal,2014,26(12):3027−35)、SD−208、EW−7197、カルトゲニン、DMH1、LDN−212854、ML347、LDN−193189HCl(Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(52):E5039−48)、SB505124、ピルフェニドン(Histochem Cell Biol,2014,10.1007/s00418−014−1223−0)、RepSox、K02288、ヘスペレチン、GW788388、LY364947等が含まれる。
有効用量のWnt阻害剤を培地中に2日目、3日目、4日目、5日目、6日目または7日目から開始して、例えば、約0.1μM〜約100μMなどの濃度で含めてよく、また、選択される阻害剤の活性に応じて約1μM〜約25μMの濃度で含めてよい。例示的な阻害剤として、限定することなく挙げると、XAV−939は、タンキラーゼ1/2の阻害によりWnt/β−カテニン介在性の転写を選択的に阻害し、無細胞アッセイでのIC50は11nM/4nMであり、ICG−001は、Wnt/β−カテニン/TCF介在性の転写に拮抗して配列結合タンパク質(CBP)に特異的に結合し、IC50は3μMであり、IWR−1−endoは、Wnt3A発現L−細胞でIC50が180nMであるWnt経路阻害剤であり、アキシン2タンパク質レベルを誘導し、アキシン−骨格分解複合体の安定化によりβ−カテニンのリン酸化を促進し、Wnt−C59(C59)は、ルシフェラーゼを誘導する多量体化したTCF結合部位のWnt3A介在性活性化に対するPORCN阻害剤であり、HEK293細胞でのIC50は74pMであり、LGK−974は、強力かつ特異的PORCN阻害剤であり、TM3細胞でWntシグナル伝達を0.4nMのIC50で阻害し、KY02111は、Wntシグナル伝達の阻害によりhPSCの心筋細胞への分化を促進し、APC及びGSK3βの下流で作用し得て、IWP−2は、無細胞アッセイでのIC50が27nMである、Wntのプロセッシング及び分泌の阻害剤であり、Porcn介在性のWntパルミトイル化を選択的に遮断し、一般にWnt/β−カテニンには影響を与えず、Wntの刺激を受けての細胞応答に対する影響を全く示さず、IWP−L6は、EC50が0.5nMの極めて強力なPorcn阻害剤であり、WIKI4は、TNKS2に対するIC50が15nMの新規タンキラーゼ阻害剤であり、Wnt/ベータ−カテニンシグナル伝達の阻害をもたらし、FH535はWnt/β−カテニンシグナル伝達阻害剤であり、PPARγ及びPPARδの二重アンタゴニストでもある。Wnt阻害剤の代わりに、培地にレチノイン酸を10nM〜1μMの範囲の濃度で含めてよい。
ソニック・ヘッジホッグ経路のアゴニストを10日目、11日目、12日目、13日目、14日目、または15日目に加え始めてもよい。強力なアゴニストにはSAG及びパルモルファミンが含まれ、100nm〜10μMの範囲の濃度で使用する。
浮遊培養をして約5日後、約6日後、約7日後、約8日後、約9日後、約10日後、浮遊スフェロイドを神経系用培地に移し、神経系前駆細胞に分化させる。培地に有効用量のFGF2及びEGFを添加する。増殖因子はそれぞれについて少なくとも約0.5ng/ml、少なくとも約1ng/ml、少なくとも約5ng/ml、少なくとも約10ng/ml、少なくとも約20ng/ml、最高約500ng/ml、最高約250ng/ml、最高約100ng/mlの濃度で提供され得る。
初期前駆細胞のオリゴデンドロサイトへの分化を促進するため、FGF2/EGFへの曝露から約1週間、約2週間、約3週間、約4週間の後、神経系用培地を交換して、FGF2、EGF、IWP−2、及びSAGを有効用量のPDGF−AA、IGF−1、HGF、BDNF及びNT3に置き換える。増殖因子はそれぞれについて少なくとも約0.5ng/ml、少なくとも約1ng/ml、少なくとも約5ng/ml、少なくとも約10ng/ml、少なくとも約20ng/ml、最高約500ng/ml、最高約250ng/ml、最高約100ng/mlの濃度で提供され得る。培地はさらに、例えば、インスリン、T3、cAMPアナログ、ビオチン等を含んでよく、インスリンについては最高約50μg/ml、最高約25μg/mlの濃度で含んでよい。
分化因子への曝露から約4週間、約5週間、約6週間、約7週間の後、球体は、増殖因子非存在下、神経系用培地中で長期間、例えば、1か月、2か月、3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月またはそれ以上の期間、維持が可能である。神経系用培地は、アスコルビン酸、25μg/mLのインスリン、1μMのcAMPアナログ、60ng/mLのT3、及び100ng/mLのビオチンを含んでよく、4〜5日おきに培地交換を行う。
フローサイトメトリー、磁性免疫選択、イムノパニング等など任意の好都合な方法によって球体から細胞集団を単離することができる。好都合なことに、PDGFR及び/またはMBPはそれぞれ、オリゴデンドロサイト前駆細胞及びオリゴデンドロサイトに対する陽性選択マーカーとして使用する。こうして単離された細胞は、許容される培地での再浮遊及び培養での維持、凍結、関心対象パラメータについての解析、ヒトまたは動物モデルへの移植等をすることができる。オリゴデンドロサイト前駆細胞またはオリゴデンドロサイトの集団が関心対象であり、例えば、CNSニューロンの髄鞘再形成の方法において、例えば、外傷性損傷後のニューロンの再増殖、また多発性硬化症のような脱髄性疾患の治療的処置などにおいての関心対象であり、その場合、有効用量の細胞がそれを必要とする患者に提供される。
スクリーニングアッセイ
低分子のスクリーニングアッセイでは、培養中の細胞に候補薬剤を加えることによる効果を、細胞と細胞環境とからなるパネルを用いて試験するが、その場合、かかる細胞環境には、イオン性変化などの電気刺激、関心対象の候補薬剤での刺激、ニューロン及び神経系前駆細胞、T細胞などの免疫エフェクター細胞、ミクログリア細胞、マクロファージ等などが非限定的に含まれる他の細胞との接触という刺激のうち1つ以上が含まれ、また、オリゴデンドロサイトの各パネルは、遺伝子型、関心対象環境への曝露歴、提供される薬剤の用量等が異なってよい。通常、少なくとも1つの対照、例えば、陰性対照及び陽性対照が含まれる。細胞の培養は典型的に、滅菌環境で実施され、例えば、加湿した92〜95%空気/5〜8%CO2 雰囲気が含有されるインキュベーターで37℃にて実施する。細胞培養は、ウシ胎児血清などの組成が不明確な生体液、または組成が完全に既知かつ無血清の培地を含有している栄養混合物中で行ってよい。形態学的変化、機能的変化及び遺伝子変化など、複数の出力パラメータをモニタリングして環境変化が与える影響を評価する。
低分子のスクリーニングアッセイでは、培養中の細胞に候補薬剤を加えることによる効果を、細胞と細胞環境とからなるパネルを用いて試験するが、その場合、かかる細胞環境には、イオン性変化などの電気刺激、関心対象の候補薬剤での刺激、ニューロン及び神経系前駆細胞、T細胞などの免疫エフェクター細胞、ミクログリア細胞、マクロファージ等などが非限定的に含まれる他の細胞との接触という刺激のうち1つ以上が含まれ、また、オリゴデンドロサイトの各パネルは、遺伝子型、関心対象環境への曝露歴、提供される薬剤の用量等が異なってよい。通常、少なくとも1つの対照、例えば、陰性対照及び陽性対照が含まれる。細胞の培養は典型的に、滅菌環境で実施され、例えば、加湿した92〜95%空気/5〜8%CO2 雰囲気が含有されるインキュベーターで37℃にて実施する。細胞培養は、ウシ胎児血清などの組成が不明確な生体液、または組成が完全に既知かつ無血清の培地を含有している栄養混合物中で行ってよい。形態学的変化、機能的変化及び遺伝子変化など、複数の出力パラメータをモニタリングして環境変化が与える影響を評価する。
遺伝因子のスクリーニングアッセイでは、細胞の遺伝子構成を変化させるためにパネル内の細胞のうち1つ以上にポリヌクレオチドを加えることができる。出力パラメータをモニタリングし、表現型に変化があるか否かを決定する。このような方法で、関心対象経路のタンパク質の発現をコードするかまたは影響を与える遺伝子配列を同定する。結果をデータ処理装置に入力し、スクリーニング結果のデータセットを得る。異なる条件下で得られたスクリーニング結果の比較及び分析にはアルゴリズムを使用する。
単個細胞レベルでの分析方法は特に関心対象であり、例えば、上記のように、原子間力顕微鏡、シングルセル遺伝子発現、シングルセルRNAシークエンシング、カルシウムイメージング、フローサイトメトリー、髄鞘形成、電子顕微鏡、ライブイメージング等は関心対象である。さまざまなパラメータを測定して、薬物または処置がオリゴデンドロサイトに及ぼす効果を判定することができる。
パラメータは、定量化が可能な細胞成分であり、特に、正確に、望ましくはハイスループットシステムで測定することができる成分である。パラメータは任意の細胞成分または細胞産物でもあり得、これには、細胞表面決定因子、受容体、タンパク質またはその立体配座的修飾もしくは翻訳後修飾、脂質、炭水化物、有機分子もしくは無機分子、核酸、例えば、mRNA、DNAなど、またはそのような細胞成分に由来する部分またはその組み合わせが含まれる。ほとんどのパラメータでは定量的な読み出しが得られるが、いくつかの場合には、半定量的または定性的な結果が許容される。読み出しには、単一の決定値が含まれても、または平均、中央値もしくは分散等が含まれてもよい。変動性が予測され、被験パラメータのセットの各々の値の範囲は標準的な統計方法を使用して取得し、共通の統計方法を用いて単一の値を取得する。
関心対象のパラメータには、細胞質の生体分子、細胞表面生体分子または分泌される生体分子の検出、多くの場合は生体高分子、例えば、本明細書に開示するさまざまな髄鞘成分を含め、ポリペプチド、多糖類、ポリヌクレオチド、脂質等の検出が含まれる。細胞表面分子、髄鞘分子、及び分泌される分子は、細胞のコミュニケーション及び細胞エフェクター応答を仲介し、アッセイがより容易にできることから、パラメータの種類として好ましい。一実施形態では、パラメータには特定のエピトープが含まれる。エピトープは、しばしば、特異的モノクローナル抗体または受容体プローブを使用して同定される。場合によっては、エピトープを含む分子種は、2つ以上の物質であり、定義された構造を含む。パラメータは、特異的に修飾されたタンパク質またはオリゴ糖の検出であってよい。パラメータは、特異的モノクローナル抗体または決定基と結合するリガンドもしくは受容体で定義されてよい。
関心対象の候補薬剤は、多数の化学薬品の種類が包含される生物学的に活性な薬剤、有機金属分子が含まれ得る主要有機分子、無機分子、遺伝子配列等である。本発明の重要な態様は、候補薬物を評価し、好ましい生物学的応答機能を有する、治療用抗体及びタンパク質系治療薬を選択することである。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に、水素結合に必要な官能基を含み、典型的には、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、しばしば、官能性化学基の少なくとも2つが含まれる。候補薬剤は、上記官能基の1つ以上で置換された、炭素環式(cyclical carbon)もしくは複素環式の構造及び/または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含むことが多い。候補薬剤はまた、生体分子にも見られ、ペプチド、ポリヌクレオチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、またはその誘導体、構造類似体もしくは組み合わせが含まれる。
薬理学的活性薬物、遺伝学的に活性な分子等が含まれる。関心対象化合物には、化学療法薬、抗炎症剤、ホルモンまたはホルモンアンタゴニスト、イオンチャネル修飾物質、及び神経活性剤が含まれる。本発明に好適な例示的な医薬品は、”The Pharmacological Basis of Therapeutics,” Goodman and Gilman,McGraw−Hill,New York,New York,(1996),Ninth edition、以下の章(section):Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites;Cardiovascular Drugs;Vitamins,Dermatology;and Toxicologyに記載の医薬品であり、いずれも参照により本明細書に組み込まれる。
検体化合物には、上記のすべてのクラスの分子が含まれ、内容物が不明の試料をさらに含んでよい。関心対象となるものは、植物などの天然材料に由来する天然に生じる化合物の複合混合物である。多くの試料は溶液中に化合物を含むが、適切な溶媒に溶解可能な固体試料をアッセイしてもよい。関心対象試料には、環境試料、例えば、地下水、海水、鉱業廃水など、生体試料、例えば、農作物、組織試料等から調製した溶解物など、製造時試料、例えば、医薬品調製の際の経時変化など、ならびに分析用に調製した化合物のライブラリー等が含まれる。関心対象試料には、潜在的治療価について評価する化合物、すなわち、薬物候補が含まれる。
試料という用語には、上記液体にさらなる成分、例えば、イオン強度、pH、総タンパク質濃度等に影響を与える成分などを加えたものも含まれる。さらに、試料を処理して、少なくとも一部の分取または濃縮を達成してよい。生体試料は、例えば、窒素下、凍結、またはその組み合わせなど、化合物の分解を抑制するように注意を払う場合は保存され得る。使用する試料容量は、測定可能な検出ができる量で十分であり、通常、約0.1ml〜1mlの生体試料で十分である。
候補薬剤など化合物は、合成化合物または天然化合物のライブラリーなど、多種多様な材料から得られる。例えば、生体分子など多種多様な有機化合物のランダム及び指向性合成では多数の手段が利用可能であり、無作為化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現が含まれる。別法として、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態の天然化合物ライブラリーは利用可能であるかまたは容易に作製される。さらに、天然または合成によって作製されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段を介して容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーの作製に使用され得る。薬理作用がある既知の物質を指向性またはランダムな化学修飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等などに供して構造類似体を生成してよい。
本明細書で使用する場合、用語「遺伝因子」とは、ポリヌクレオチド及びその類似体を指し、細胞に遺伝因子を付加することにより、かかる因子を本発明のスクリーニングアッセイで試験する。遺伝因子の導入により、細胞の全体的な遺伝子構成が変更される。DNAなどの遺伝因子は、実験的に導入した変化を細胞のゲノムにもたらし得、一般に、染色体内への配列の組み込みを介して行う。遺伝子の変更は一過性でもあり得、その場合、その外来配列は組み込まれないがエピソーム因子として維持される。アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの遺伝因子は、mRNAの転写または翻訳に干渉することによって、細胞の遺伝子型を変えずにタンパク質の発現に影響を与えることもできる。遺伝因子の効果は、細胞内の1つ以上の遺伝子産物の発現を増加または減少させることである。
ポリペプチドをコードする発現ベクターの導入を使用して、かかる配列を欠く細胞でコードされた産物を発現させるかまたは産物を過剰発現させることができる。構成的プロモーターまたは外部制御を受けやすいプロモーターのさまざまなものを使用することができ、その場合、後者の状況では、遺伝子の転写のオン・オフを行うことができる。これらのコード配列には、完全長cDNAまたはゲノムのクローン、それに由来する断片、または天然に生じる配列と、他のコード配列の機能ドメインもしくは構造ドメインとを組み合わせるキメラが含まれ得る。別法として、導入配列は、アンチセンス配列をコードしてよく、アンチセンスオリゴヌクレオチド、天然配列のドミナントネガティブ変異または優勢変異もしくは構成的に活性な変異をコードするRNAi、改変制御配列等であってよい。
アンチセンス及びRNAiオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知の方法によって化学合成することができる。好ましいオリゴヌクレオチドは、その細胞内の安定性及び結合親和性を高めるために、天然のホスホジエステル構造から化学的に修飾されている。そのような修飾の多数が文献に記載されており、それらは骨格、糖または複素環式塩基の化学を改変する。骨格化学における有用な変更は、ホスホロチオエート、非架橋の両酸素がイオウで置換されているホスホロジチオアート、ホスホロアミダイト、アルキルホスホトリエステル及びボラノホスフェートである。アキラルなリン酸誘導体には、3’−O’−5’−S−ホスホロチオアート、3’−S−5’−O−ホスホロチオアート、3’−CH2−5’−O−ホスホナート及び3’−NH−5’−O−ホスホロアミダートが含まれる。ペプチド核酸はリボースのホスホジエステル骨格全体をペプチド結合で置き換える。糖修飾、例えば、モルホリノオリゴヌクレオチド類似体なども、安定性及び親和性を高めるために使用される。デオキシリボースのα−アノマーを使用してよく、その場合、かかる塩基を、天然のβ−アノマーに対して反転させる。リボース糖の2’−OHを変更して2’−O−メチル糖または2’−O−アリル糖を形成してよく、これにより、親和性を含まずに耐分解性が得られる。
薬剤を生物学的活性についてスクリーニングし、その際、薬剤を少なくとも1つの細胞、通常は複数の細胞に、1つまたは複数の環境条件で、例えば、β−アドレナリン作動薬での刺激後、電気的刺激後または機械的刺激後などに加えることによって行う。薬剤に応答した、パラメータ読み出しの変化を測定し、望ましくは正規化を行い、その後、得られるスクリーニング結果を、参照スクリーニングから得た結果、例えば、関心対象の他の変異を有する細胞、正常オリゴデンドロサイト、他のファミリーメンバー由来オリゴデンドロサイト等を用いた結果と比較することにより評価する。参照スクリーニングから得た結果には、異なる環境変化がある場合とない場合との読み出し、既知薬物が含まれているかいないかを問わず他の薬剤を用いて得られたスクリーニング結果などが含まれ得る。
薬剤は、溶液または易溶性形態で、培養中の細胞の培地に好都合に加えられる。薬剤は、間欠流または連続流としてフロースルーシステムで加えても、または別法として、大量化合物を単回もしくは徐々に増量して、他の点では変更がない溶液に加えてもよい。フロースルーシステムでは2種の液体を使用し、その場合、一方は生理学的中性溶液、もう一方は、同一溶液で被験化合物を加えたものである。第1の液体を細胞にかけ、その後、第2の液体をかける。単一溶液法では、大量の被験化合物を細胞を取り囲む培地容積に加える。培地の成分の全体濃度は、大量添加後、またはフロースルー法の2液間のいずれの場合でも、有意に変化させるべきではない。
好ましい薬剤処方物には、全体処方物に有意な影響を及ぼし得る防腐剤などのさらなる成分は含まれない。したがって、好ましい処方物は本質的に、生物学的に活性な化合物及び生理学的に許容される担体、例えば、水、エタノール、DMSO等からなる。ただし、化合物が溶媒不含の液体である場合は、処方物は本質的に化合物それ自体からなってよい。
異なる薬剤濃度で複数の試験法を並行して実施し、さまざまな濃度に対する差次的応答を得てよい。当該技術分野で公知のように、ある薬剤の有効濃度の決定には典型的に、1:10、または他の対数スケール、希釈で得られる濃度範囲を使用する。濃度は、必要に応じて、第2の希釈系列でさらに精製してよい。典型的に、これらの濃度の1つを陰性対照として使用する、すなわち、ゼロ濃度もしくは薬剤の検出レベル以下、または検出可能な変化を表現型に与えない薬剤濃度以下の対照として使用する。
上記の機能性パラメータに加え、選択したパラメータの存在を定量化するためにさまざまな方法を利用することができる。存在する分子の量を測定する場合、好都合な方法は、蛍光性、発光性、放射性、酵素により活性などであり得る検出可能部分を用いて分子、特に、パラメータと高い親和性で特異的に結合する分子を標識することであり、蛍光部分は事実上いかなる生体分子、構造、または細胞種の標識にも容易に利用することができる。免疫蛍光部分は、特定タンパク質だけではなく、特定のコンフォメーション、切断産物、またはリン酸化のような部位修飾にも結合するよう指向させることができる。個々のペプチド及びタンパク質を人工操作して自己蛍光させることができ、例えば、細胞内に緑色蛍光タンパク質キメラを発現させることにより可能である(概説についてはJones et al.(1999)Trends Biotechnol.17(12):477−81を参照のこと)。したがって、抗体を遺伝子組換えし、その構造の一部として蛍光色素を得ることができる。
選択する標識に応じて、蛍光標識以外を使用してパラメータを測定してよく、放射免疫測定法(RIA)または酵素結合免疫吸着法(ELISA)のような免疫測定法、均一系酵素免疫測定法、及び関連する非酵素的技術を使用して測定してよい。これらの技術では特異的抗体をレポーター分子として利用するが、こうした抗体は、単一分子標的への結合が高度に特異的であるため特に有用である。米国特許第4,568,649号には、シンチレーション計測を利用するリガンド検出系が記載されている。これらの技術は、タンパク質もしくは修飾タンパク質のパラメータもしくはエピトープ、または炭水化物決定基に特に有用である。タンパク質及び他の細胞決定基についての細胞読み出しは蛍光タグまたは他のタグが付されたレポーター分子を使用して得ることができる。細胞を用いるELISAまたは関連する非酵素的方法もしくは蛍光による方法により、細胞表面パラメータ及び分泌パラメータの測定が可能になる。捕捉ELISA及び関連する非酵素的方法では通常2つの特異的抗体またはレポーター分子が用いられ、溶液のパラメータの測定に有用である。フローサイトメトリー法は、細胞表面及び細胞内のパラメータならびに形状変化及び粒度を測定するため、ならびに抗体またはプローブが結合した試薬として使用されたビーズを解析するために有用である。そのような試験法から得られる読み出しは、個々の蛍光抗体検出細胞表面の分子もしくはサイトカインに関連した平均蛍光、または平均蛍光強度、蛍光強度中央値、蛍光強度分散値、またはこれら同士の一部の関係であってよい。
単個細胞マルチパラメータ及び複数細胞マルチパラメータマルチプレックス試験法では、投入細胞種を同定し、定量的イメージング及び蛍光によってパラメータが読み取られ、当該技術分野では共焦点顕微鏡が使用される(Confocal Microscopy Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology Vol.122.)Paddock,Ed.,Humana Press,1998を参照のこと)。これらの方法は、1999年11月23日発行の米国特許第5,989,833号に記載されている。
核酸、特に、メッセンジャーRNAの定量もパラメータとして関心対象である。これらは、核酸のヌクレオチドの配列に依存するハイブリダイゼーションにより測定することができる。技術には、ポリメラーゼ連鎖反応法ならびに遺伝子アレイ手法が含まれる。例えば、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,eds,John Wiley & Sons,New York,NY,2000、Freeman et al.(1999)Biotechniques 26(1):112−225、Kawamoto et al.(1999)Genome Res 9(12):1305−12、及びChen et al.(1998)Genomics 51(3):313−24を参照のこと。
被験化合物から得られたスクリーニング結果と、参照スクリーニングから得た結果(複数可)との比較は、適切な演繹による手順、AIシステム、統計比較等の使用により達成される。好ましくは、スクリーニング結果と、参照スクリーニング結果のデータベースとを比較する。参照スクリーニング結果のデータベースは収集可能である。これらのデータベースには、既知の薬剤もしくは薬剤の組み合わせが含まれるパネルから得た参照結果、ならびに単一または複数の環境的な条件もしくはパラメータが除去または特異的に変更されている環境条件下で処理された細胞の分析から得た参照結果が含まれ得る。参照結果は、特定の細胞経路を選択的に標的とするかまたは調節する遺伝子構成体を有する細胞が含有されるパネルから作製してもよい。
読み出しは、中位、平均、中央値または分散、または測定値に関連した他の統計的もしくは数学的に導かれた値であってよい。パラメータ読み出し情報は、対応する参照読み出しと直接比較することによりさらに精緻化されてよい。同一条件下で各パラメータについて得られた絶対値は変動性を示すが、これは生きた生物系では本質的なものであり、個々の細胞の変動性及び個体間に本質的な変動性も反映する。
便宜上、対象発明の系はキットで提供され得る。キットには、使用対象の細胞(凍結、冷蔵または生存率を維持する他の何らかの方法で処理されてよい)、パラメータ測定用試薬、及びスクリーニング結果を準備するソフトウェアが含まれ得る。ソフトウェアは結果を受け取って分析を実施し、参照データを含むことができる。ソフトウェアは結果を、対照培養から得られた結果を用いて正規化することもできる。組成物は、任意選択で、スクリーニング方法等など所望の目的に関する使用説明書と共に適切な容器にパッケージングされてよい。
本発明の実施の際に有用な一般技術のさらなる詳細について、医師は、細胞生物学、組織培養、発生学、及び神経生物学の標準的教科書及び総説を参照することができる。組織培養及び胚性幹細胞に関し、読者は奇形癌腫及び胚性幹細胞の参照を望む場合がある。A practical approach(E.J.Robertson,ed.,IRL Press Ltd.1987);Guide to Techniques in Mouse Development(P.M.Wasserman et al.eds.,Academic Press 1993);Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro(M.V.Wiles,Meth.Enzymol.225:900,1993);Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy(P.D.Rathjen et al.,Reprod.Fertil.Dev.10:31,1998)などである。
分子・細胞生化学における一般的方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd Ed.(Sambrook et al.,Harbor Laboratory Press 2001)、Short Protocols in Molecular Biology,4th Ed.(Ausubel et al.eds.,John Wiley & Sons 1999)、Protein Methods(Bollag et al.,John Wiley & Sons 1996)、Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner et al.eds.,Academic Press 1999)、Viral Vectors(Kaplift & Loewy eds.,Academic Press 1995)、Immunology Methods Manual(I.Lefkovits ed.,Academic Press 1997)、及びCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle & Griffiths,John Wiley & Sons 1998)のような標準的教科書に見出すことができる。本開示で言及された遺伝子操作用の試薬、クローニングベクター、及びキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma−Aldrich、及びClonTechなどの商用販売会社より入手可能である。
本明細書で引用された各刊行物は、あらゆる目的のために参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、記載されている特定の方法、プロトコル、細胞株、動物の種もしくは属、及び試薬に制限されるものではなく、それらは異なり得ることを理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、あくまで個々の実施形態の記載を目的とするものであり、本発明の範囲を限定することは意図しておらず、本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定されるということも理解されるべきである。
本明細書で使用する場合、単数形「a」、「and」、及び「the」には、文脈で特に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「細胞(a cell)」には、複数のそのような細胞が含まれ、「培養(the culture)」には、当業者に公知の1つ以上の培養及びその同等物が含まれるということになる。本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、特に明確な指示がない限り、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つ。
以下の例は、本発明の作製及び使用方法についての完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示するものであり、発明者らが自身の発明であると見なす範囲を限定することも、また、下記実験が実施した全てまたは唯一の実験であると表すことも意図しない。使用する数字(例えば、量、温度など)に関し、正確さを保証するべく試みがなされたが、実験上の一部の誤差及び偏差は考慮されるべきである。特に指定しない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度はセ氏温度、及び圧力は大気圧または大気圧近傍圧である。
実施例1
ヒトオリゴデンドロサイトを作製しインビトロで髄鞘形成の過程をモデル化する先の方法は2次元(2D)培養で実施されてきた。これらのプロトコルでは、髄鞘形成は、合成ナノピラーの周囲へのオリゴデンドロサイト突起の巻き付きとして研究される。これらの方法では、髄鞘形成を、ヒトの脳で生じるような3次元の過程として研究することはできない。別法として、ヒト幹細胞由来オリゴデンドロサイトがげっ歯類に移植されたが、マウスでの環境がヒトのオリゴデンドロサイトの生態学及び髄鞘形成にどの程度まで影響するのかは不明であり、これらの方法は骨が折れる上、ハイスループットのスクリーニングを可能にするものではない。以下に記載する方法は、ヒトのhiPSCまたはhESCのみから誘導されたインビトロでのミエリン形成オリゴデンドロサイトを3次元(3D)培養で作製する初の方法であり、インビトロで健常条件及び疾患条件のヒトの髄鞘形成の研究を可能にするものである。
ヒトオリゴデンドロサイトを作製しインビトロで髄鞘形成の過程をモデル化する先の方法は2次元(2D)培養で実施されてきた。これらのプロトコルでは、髄鞘形成は、合成ナノピラーの周囲へのオリゴデンドロサイト突起の巻き付きとして研究される。これらの方法では、髄鞘形成を、ヒトの脳で生じるような3次元の過程として研究することはできない。別法として、ヒト幹細胞由来オリゴデンドロサイトがげっ歯類に移植されたが、マウスでの環境がヒトのオリゴデンドロサイトの生態学及び髄鞘形成にどの程度まで影響するのかは不明であり、これらの方法は骨が折れる上、ハイスループットのスクリーニングを可能にするものではない。以下に記載する方法は、ヒトのhiPSCまたはhESCのみから誘導されたインビトロでのミエリン形成オリゴデンドロサイトを3次元(3D)培養で作製する初の方法であり、インビトロで健常条件及び疾患条件のヒトの髄鞘形成の研究を可能にするものである。
hiPSCの維持及び集合
ビトロネクチン(0.5μg/cm2 )含有iPSC培地(100U/mLのペニシリン及び100μg/mLのストレプトマイシン含有完全E8培地)でコートした組織培養用処理済プレートでヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)株を培養した。浮遊集合体を形成させるため、最初に、500μLのhiPSC培地にROCK阻害剤Y−27632(10nM)を加えて2,000gで5分間遠心にかけAggrewellプレートを準備した。hiPSCをY−27632で1時間、前処理した後、予熱したアクターゼで5〜7分間処理して解離させた。解離した時点で、hiPSCを採取し、hiPSC培地に希釈してから計数した。300万hiPSCの分注を15mLファルコンチューブに移して2,000gで5分間遠心にかけ、その後、Y−27632を含んだ1.5mLのhiPSC培地に再浮遊させた。その後、3百万細胞の浮遊液を調製済みAggrewellプレートの個々のウェルに加え、プレートを100gで3分間遠心にかけた。その後、Aggrewellプレートを5%CO2 、37℃のインキュベーター内で一晩保存した。
ビトロネクチン(0.5μg/cm2 )含有iPSC培地(100U/mLのペニシリン及び100μg/mLのストレプトマイシン含有完全E8培地)でコートした組織培養用処理済プレートでヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)株を培養した。浮遊集合体を形成させるため、最初に、500μLのhiPSC培地にROCK阻害剤Y−27632(10nM)を加えて2,000gで5分間遠心にかけAggrewellプレートを準備した。hiPSCをY−27632で1時間、前処理した後、予熱したアクターゼで5〜7分間処理して解離させた。解離した時点で、hiPSCを採取し、hiPSC培地に希釈してから計数した。300万hiPSCの分注を15mLファルコンチューブに移して2,000gで5分間遠心にかけ、その後、Y−27632を含んだ1.5mLのhiPSC培地に再浮遊させた。その後、3百万細胞の浮遊液を調製済みAggrewellプレートの個々のウェルに加え、プレートを100gで3分間遠心にかけた。その後、Aggrewellプレートを5%CO2 、37℃のインキュベーター内で一晩保存した。
翌日、hiPSC集合体を、P−1000ピペットでカットチップを使用してピペティングすることによってAggrewellから洗い流した。除去された集合体を、40μmの細胞用フィルターを使用してろ過し、100U/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシン含有E6培地が入った超低接着組織培養用100mmディッシュに移した。
神経系の誘導及びオリゴデンドロサイト発生の促進
神経系の誘導では、最初の6日間、連日ドルソモルフィン(5μM)及びSB−431542(10μM)を加えた。スフェロイドを2種類作製し、一部は、3日目からオールトランスレチノイン酸(RA、100nM)に連日曝露し、残りは4日目からWnt経路阻害剤IWP−2(5μM)に曝露した。浮遊6日目、浮遊スフェロイドを、DMEM/F12、N−2サプリメント、ビタミンA不含B−27血清代替物、GlutaMax(1:100)、MEM非必須アミノ酸溶液(1:100)、0.1nM β−メルカプトエタノール、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシンを含有する神経系用培地(NM)に移した。NMには20ng/mlのFGF2及び20ng/mlのEGFも19日間添加し、最初の10日は培地を毎日交換し、その後の9日間は隔日で交換した。11日目、スムーズンドアゴニストSAG(1μM)も培地に連日加えた。神経系前駆細胞のオリゴデンドロサイトへの分化を促進するため、FGF2、EGF、IWP−2、RA、及びSAGを除去し、10ng/mLのPDGF−AA、10ng/mLのIGF−1、5ng/mLのHGF、25μg/mLのインスリン、1μMのcAMPアナログ、60ng/mLのT3、100ng/mLのビオチン、20ng/mLのBDNF及び20ng/mLのNT3を、25日目からNM培地に加え始めた。25日目から43日目まで培地交換を隔日行った。43日目以降、20μg/mLのアスコルビン酸、25μg/mLのインスリン、1μMのcAMPアナログ、60ng/mLのT3、及び100ng/mLのビオチンを含有するNMでスフェロイドを培養し、4〜5日おきに培地交換をおこなった。
神経系の誘導では、最初の6日間、連日ドルソモルフィン(5μM)及びSB−431542(10μM)を加えた。スフェロイドを2種類作製し、一部は、3日目からオールトランスレチノイン酸(RA、100nM)に連日曝露し、残りは4日目からWnt経路阻害剤IWP−2(5μM)に曝露した。浮遊6日目、浮遊スフェロイドを、DMEM/F12、N−2サプリメント、ビタミンA不含B−27血清代替物、GlutaMax(1:100)、MEM非必須アミノ酸溶液(1:100)、0.1nM β−メルカプトエタノール、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシンを含有する神経系用培地(NM)に移した。NMには20ng/mlのFGF2及び20ng/mlのEGFも19日間添加し、最初の10日は培地を毎日交換し、その後の9日間は隔日で交換した。11日目、スムーズンドアゴニストSAG(1μM)も培地に連日加えた。神経系前駆細胞のオリゴデンドロサイトへの分化を促進するため、FGF2、EGF、IWP−2、RA、及びSAGを除去し、10ng/mLのPDGF−AA、10ng/mLのIGF−1、5ng/mLのHGF、25μg/mLのインスリン、1μMのcAMPアナログ、60ng/mLのT3、100ng/mLのビオチン、20ng/mLのBDNF及び20ng/mLのNT3を、25日目からNM培地に加え始めた。25日目から43日目まで培地交換を隔日行った。43日目以降、20μg/mLのアスコルビン酸、25μg/mLのインスリン、1μMのcAMPアナログ、60ng/mLのT3、及び100ng/mLのビオチンを含有するNMでスフェロイドを培養し、4〜5日おきに培地交換をおこなった。
結果:
図1A、図1B.
三次元培養でのオリゴデンドロサイトの誘導
培養51日後、スフェロイドを4%PFAで一晩固定した。スフェロイドをOCTに包埋して薄片にし、ともにオリゴデンドロサイト前駆細胞を同定するマーカーであるNKX2.2及びOLIG2に対する抗体を使用して免疫蛍光法により標識した。その後、同じ手法を用いて100日目のhOSを固定して切片を調製し、それを、幼若オリゴデンドロサイト及び成熟オリゴデンドロサイトの表面マーカーであるO4、及び成熟オリゴデンドロサイトの表面マーカーであるO1を用いて免疫蛍光法により標識した。NKX2.2/OLIG2+ 細胞ならびに多極性O4+ 細胞及びO1+ 細胞の存在は、記載の方法で誘導されたヒトスフェロイド中にオリゴデンドロサイト前駆細胞及び成熟オリゴデンドロサイトのどちらも存在していることを示唆する。
図1A、図1B.
三次元培養でのオリゴデンドロサイトの誘導
培養51日後、スフェロイドを4%PFAで一晩固定した。スフェロイドをOCTに包埋して薄片にし、ともにオリゴデンドロサイト前駆細胞を同定するマーカーであるNKX2.2及びOLIG2に対する抗体を使用して免疫蛍光法により標識した。その後、同じ手法を用いて100日目のhOSを固定して切片を調製し、それを、幼若オリゴデンドロサイト及び成熟オリゴデンドロサイトの表面マーカーであるO4、及び成熟オリゴデンドロサイトの表面マーカーであるO1を用いて免疫蛍光法により標識した。NKX2.2/OLIG2+ 細胞ならびに多極性O4+ 細胞及びO1+ 細胞の存在は、記載の方法で誘導されたヒトスフェロイド中にオリゴデンドロサイト前駆細胞及び成熟オリゴデンドロサイトのどちらも存在していることを示唆する。
図1C〜図1E.
三次元培養の細胞種間の相互作用
115日目のhOSから切片を調製し、髄鞘の形成に関与するタンパク質であり、成熟オリゴデンドロサイトのマーカーであるMBP、アストロサイトのマーカーであるGFAP、及び軸索のマーカーであるニューロフィラメントに対する抗体で標識した。MBP+ 及びGFAP+ の突起の重なりはオリゴデンドロサイト−アストロサイト相互作用を示す。MBP+ 突起のニューロフィラメント+ 突起周囲への巻き付きは、115日目のhOSにおいてオリゴデンドロサイトが軸索に巻き付いていることを示唆する。
三次元培養の細胞種間の相互作用
115日目のhOSから切片を調製し、髄鞘の形成に関与するタンパク質であり、成熟オリゴデンドロサイトのマーカーであるMBP、アストロサイトのマーカーであるGFAP、及び軸索のマーカーであるニューロフィラメントに対する抗体で標識した。MBP+ 及びGFAP+ の突起の重なりはオリゴデンドロサイト−アストロサイト相互作用を示す。MBP+ 突起のニューロフィラメント+ 突起周囲への巻き付きは、115日目のhOSにおいてオリゴデンドロサイトが軸索に巻き付いていることを示唆する。
図1F.
ヒトhiPSC由来三次元培養(hOS)での髄鞘形成
培養100日後、記載の方法により誘導されたスフェロイドを固定し、透過型電子顕微鏡用に処理した。軸索を取り囲む環状層の存在は髄鞘形成と一致する。
ヒトhiPSC由来三次元培養(hOS)での髄鞘形成
培養100日後、記載の方法により誘導されたスフェロイドを固定し、透過型電子顕微鏡用に処理した。軸索を取り囲む環状層の存在は髄鞘形成と一致する。
有意性及び用途
髄鞘形成は正常な脳機能にとって不可欠であり、髄鞘形成の異常は数多くの神経性障害の基礎となる。本方法に記載のヒト神経系3Dスフェロイドは、髄鞘を形成するオリゴデンドロサイトを含有する初めてのものであり、これを使用して、健康及び疾患における髄鞘形成過程を体系的に研究することができる。この方法は特に、このプロトコルに用いられるhiPSCが脱髄性疾患患者の皮膚細胞から直接初期化され得ることから、疾患モデリングに適用できる。さらに、方法の拡張性のため、これらの培養を薬物スクリーニングに使用して、健常状態及び疾患特異的状態の両方において髄鞘形成に影響を与える化合物を同定することもできる。さらに、これは、ヒトの発達における主要な細胞−細胞相互作用、ニューロンとオリゴデンドロサイトとの間、オリゴデンドロサイトとアストロサイトとの間等の相互作用の研究を可能にする初の系でもある。最終的に、これらの培養で誘導されたオリゴデンドロサイトは、今後の脱髄性疾患治療における移植用の細胞供給源として使用することができる。
髄鞘形成は正常な脳機能にとって不可欠であり、髄鞘形成の異常は数多くの神経性障害の基礎となる。本方法に記載のヒト神経系3Dスフェロイドは、髄鞘を形成するオリゴデンドロサイトを含有する初めてのものであり、これを使用して、健康及び疾患における髄鞘形成過程を体系的に研究することができる。この方法は特に、このプロトコルに用いられるhiPSCが脱髄性疾患患者の皮膚細胞から直接初期化され得ることから、疾患モデリングに適用できる。さらに、方法の拡張性のため、これらの培養を薬物スクリーニングに使用して、健常状態及び疾患特異的状態の両方において髄鞘形成に影響を与える化合物を同定することもできる。さらに、これは、ヒトの発達における主要な細胞−細胞相互作用、ニューロンとオリゴデンドロサイトとの間、オリゴデンドロサイトとアストロサイトとの間等の相互作用の研究を可能にする初の系でもある。最終的に、これらの培養で誘導されたオリゴデンドロサイトは、今後の脱髄性疾患治療における移植用の細胞供給源として使用することができる。
ここまでの記載はあくまで本発明の原則の説明に過ぎない。当業者は、本明細書に明示的に記載または示されてはいなくても、本発明の原則を具体的に実施し、本発明の趣旨及び範囲内に含まれるさまざまな構成を考案することができることは認識される。さらに、本明細書で引用した例及び条件的表現はすべて、本発明の原則、及び技術をさらに前進させる、発明者らにより提供される概念を理解する上で読者の一助となることを主に意図しており、そのように具体的に記述された例及び条件に限定されるわけではないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原則、態様、及び実施形態、ならびにその具体例を記述する本明細書の記述はすべて、それらの構造的及び機能的同等物のいずれも包含することが意図される。さらに、そのような同等物には、現在知られている同等物も、また将来開発される同等物、すなわち、構造を問わず、同じ機能を行ういかなる開発要素も含まれることが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示し、記載する例示的な実施形態に限定されることを意図しない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は添付の請求の範囲によって具体化される。
連邦政府の助成による研究開発
本発明は、政府の支援により、National Institutes of Healthより助成を受けた委託契約MH107800のもと実施された。政府は本発明に特定の権利を有する。
本発明は、政府の支援により、National Institutes of Healthより助成を受けた委託契約MH107800のもと実施された。政府は本発明に特定の権利を有する。
Claims (19)
- インビトロでヒトオリゴデンドロサイトを作製する方法であって、
多能性幹細胞の浮遊培養に神経系の運命を誘導し、神経系前駆細胞のスフェロイドを提供すること、
スフェロイドの前記神経系前駆細胞を、オリゴデンドロサイトを含むヒトオリゴデンドロ−スフェロイド(hOS)に分化するよう分化させること、及び
前記ヒトオリゴデンドロ−スフェロイドを神経系用培地に長期間維持し、髄鞘を形成するオリゴデンドロサイト、ニューロン及びアストロサイトが含まれる培養を導くこと
を含む、方法。 - 前記多能性幹細胞は、髄鞘障害に関連した少なくとも1つのアレルを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞は人工多能性幹細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞の浮遊培養は、前記多能性幹細胞の無傷のコロニーを有効用量のBMP阻害剤及びTGFβ阻害剤を含む培地で培養することによって神経系の運命に誘導される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記神経系用培地は、多能性幹細胞を神経系の運命に誘導するために有効な用量のドルソモルフィン及びSB−431542を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記浮遊培養は支持細胞層を用いない、請求項5に記載の方法。
- 前記神経系用培地はさらに有効用量のwnt阻害剤を含む、請求項6に記載の方法。
- 神経系前駆細胞を維持するために有効な用量のFGF2及びEGFを含む神経系用培地で培養することによって、細胞を神経系前駆細胞に分化させる、請求項7に記載の方法。
- ソニック・ヘッジホッグ経路アゴニスト及びレチノイン酸、またはソニック・ヘッジホッグ経路アゴニスト及びWnt阻害剤を用いて、スフェロイドのパターン形成を行うことをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- FGF2及びEGFを欠き、かつ、有効用量のPDGF−AA、IGF−1、HGF、BDNF、NT3、インスリン、cAMP、T3、及びビオチンを含む神経系用培地で培養することによって、神経系前駆細胞をオリゴデンドロサイトに分化させることをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 作製したオリゴデンドロ−スフェロイドを、増殖因子を欠くがアスコルビン酸、インスリン、cAMP、T3、及びビオチンが含まれる神経系用培地で長期間維持することをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- フローサイトメトリー、磁性免疫選択、またはイムノパニングによって皮質性の球体からオリゴデンドロサイトを単離することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 単離されたオリゴデンドロサイトを候補薬剤または関心対象処置に曝露する、請求項12に記載の方法。
- 前記オリゴデンドロサイトを、ニューロンまたは神経細胞前駆細胞と組み合わせる、請求項13に記載の方法。
- 請求項9または10に記載の方法によって得られるオリゴデンドロサイトの集団。
- ヒトオリゴデンドロサイトに対する候補薬剤の効果を判定する方法であって、
前記オリゴデンドロサイトが任意選択で神経疾患に関連した変異をコードする少なくとも1つのアレルを含み、請求項9または10に記載の方法に従ってヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)から分化させたアストロサイトの1つまたは1パネルと前記候補薬剤とを接触させること、及び
形態、遺伝子または機能のパラメータに対して前記候補薬剤が及ぼす効果を判定すること
を含む、方法。 - 前記候補薬剤は、免疫エフェクター細胞または免疫調節剤である、請求項16に記載の方法。
- オリゴデンドロサイトのパネルは、遺伝子型が異なる少なくとも2つのアストロサイトを含む、請求項16に記載の方法。
- オリゴデンドロサイトのパネルは、異なる環境条件下のオリゴデンドロサイトを含む、請求項18に記載の方法。
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