KR20190140451A - 인간 희소돌기아교세포 생성 및 시험관내 수초화 연구를 위한 개인화된 3d 신경 배양 시스템 - Google Patents

인간 희소돌기아교세포 생성 및 시험관내 수초화 연구를 위한 개인화된 3d 신경 배양 시스템 Download PDF

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Abstract

인간 만능성 줄기 세포는 분석, 스크리닝 프로그램 등에서 사용하기 위한, 희소돌기아교세포를 포함하는 희소돌기-구형체로 시험관내에서 분화된다.

Description

인간 희소돌기아교세포 생성 및 시험관내 수초화 연구를 위한 개인화된 3D 신경 배양 시스템
연방 후원 연구 개발
본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 수여된 계약 MH107800 하에서 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 가진다.
인간 중추 신경계의 복잡한 발달을 이해하고 환자의 신경계 및 정신 장애의 메커니즘을 규명함에 있어서의 진보는 기능적인 인간 뇌 조직에 대한 제한된 접근에 의해 크게 제한되어왔다. 설치류 및 기타 포유류에 대한 연구는 신경 발달의 기본 원리에 대한 중요한 통찰력을 제공했지만 영장류의 대뇌의 대규모 확장을 담당하는 세포 및 분자 과정, 그리고 이의 많은 인간 특이적 특징들에 대해서는 거의 알지 못한다. 최근에, 세포 재프로그래밍의 도입으로 패러다임 전환이 구현되었으며, 이 과정에서 최종적으로 분화된 체세포를 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)라 명명하는 만능성 줄기 세포로 전환시킬 수 있다. 이들 hiPSC는 임의의 개체로부터 생성 될 수 있고, 중요하게는 신경 세포를 포함하여 모든 생식 층 유도체로 시험관 내에서 분화되도록 지시될 수 있다.
hiPSC를 생성하는 방법 및 효율이 실험실 전체에 걸쳐서 크게 개선되고 표준화되었지만, 특정 신경 및 신경아교 세포 유형을 유도하는 방법은 여전히 어려운 과제로 남아있다. 지난 10년 동안, 단층에서 만능성 줄기 세포의 신경 사양 및 분화 프로토콜의 개선으로 다양한 세포 유형이 생성되었다. 그럼에도 불구하고, 2차원 (2D) 방법은 발달중인 3차원 (3D) 신경계의 세포 구조 또는 생체내 신경망과 회로의 복잡성과 기능을 개략하여 설명할 수 없을 것이다. 더욱이, 이러한 방법은 힘들고 비용이 많이 들고, 효율이 제한적이고, 비교적 미성숙한 뉴런을 발생시킨다.
희소돌기아교세포는 뇌 기능에서 결정적인 역할을 하는 중추 신경계의 신경아교 세포이다. 희소돌기아교세포는 절연층으로 뉴런의 축삭을 감싸는 과정을 확장하여 뉴런들 간 신호 전달을 더 빠르게 할 수 있다. 희소돌기아교세포는 또한 영양 인자를 뉴런에 공급하고 세포외 환경을 완충시켜 지원하는 역할을 한다. 수초화 소실은 뉴런의 사멸 및 신경 기능 장애로 이어질 수 있다. 결과적으로, 많은 인간 질병은 다발성 경화증 또는 백색 물질 소실 질환 (white vanishing matter disease)과 같은 수초화의 소실 또는 감소와 관련이 있다.
건강과 질병의 수초화에 대한 연구는 적절한 모델의 이용가능성에 의해 제한된다. 설치류는 일반적으로 인간 생물학 양상들을 연구하는 대용체로 사용되지만; 그러나, 수초화는 설치류 뇌보다 인간에서 훨씬 더 광범위하다. 또한, 인간 환자의 건강한 뇌 샘플들의 제한된 이용가능성은 인간 뇌에서 수초화를 광범위하게 연구할 수 있는 가능성을 배제한다. 최근에, 시험관내에서 수초화 연구를 위해 인간 배아 및 유도된 만능성 줄기 세포 (hESC, hiPSC)로부터 희소돌기아교세포 전구 세포 (OPC) 및 희소돌기아교세포를 생성하려는 시도가 있었다.
hESC 및 hiPSC 유래 수초화 모델들은 정상 및 질병 상태하에서 희소돌기아교세포 개발 및 수초화 과정을 연구하는데 필수적일 뿐만 아니라, 약제학적 약물 스크리닝에도 적용될 수 있다. 이들 모델은 특정 질병 상태와 관련된 특정 이상을 교정하는 화합물을 스크리닝하고 인간 노출 전에 새로운 치료 화합물 및 화학 물질의 독성을 테스트하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 신경독성 분야에서, 뉴런 또는 신경아교 기능의 손상을 평가할 수 있는 분석법은 인간 세포에 대해서는 여전히 부족하다.
따라서, 뉴런의 수초화를 포함하여, 고도로 기능적인 인간 조직을 간략하게 개요하는 시험관내 스크리닝 플랫폼의 개발이 가장 중요하다.
문헌. 영장류 분화된 체세포를 만능 상태로 재프로그래밍하는 방법은 분화된 체세포 핵 전달, 만능 줄기 세포와 분화된 체세포의 융합 및 유도된 만능 줄기 세포 (iPS 세포)를 생성하기 위한 직접 재프로그래밍을 포함한다.(Takahashi K, 외. (2007) Cell 131:861-872; Park IH, 외. (2008) Nature 451:141-146; Yu J, 외. (2007) Science 318:1917-1920; Kim D, 외. (2009) Cell Stem Cell 4:472-476; Soldner F, 외. (2009) Cell. 136:964-977; Huangfu D, 외. (2008) Nature Biotechnology 26:1269-1275; Li W, 외. (2009) Cell Stem Cell 4:16-19).
중추 신경계 뉴런과 함께 3차원 시스템에서 배양될 수 있는, 인간 OPC 및 수초 형성 희소돌기아교세포의 시험관내 생성을 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 특징은 환자 샘플로부터 OPC 및 희소돌기아교세포를 생성하는 능력이며, 치료 약물 및 치료 요법에 대한 질병-관련 세포 생성 및 스크리닝을 가능하게 한다. 상기 방법은 유도된 인간 만능성 줄기 세포 (hiPSC)를 이용하며, 이는, 환자 또는 운반체 세포 샘플, 예컨대, 지방 세포, 각질 세포, 섬유 아세포 등으로부터 수득 될 수 있다. hiPSC는 시험관내에서 외배엽 운명을 발생시키도록 유도되고, 이어서 희소돌기아교세포-인간 희소돌기-구형체 (human oligodendro-spheroids, hOS)뿐만 아니라 신경 전구체, 성상세포 및 뉴런을 함유하는 구형체로 분화된다. 세포 모집단은 hOS로부터 단리될 수 있거나, 무손상 hOS가 세포 모집단들을 상호작용시키기 위한 모델로서 사용될 수 있다. hOS 및 이로부터 유래된 세포는 계통의 공급원 및 세포 특이적 생성물 등으로서 이식, 실험 평가를 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 세포 배양물은 무-지지세포이며 이종이 없다.
본 발명의 일부 구체예들에서, 세포가 유도된 인간 만능성 줄기 세포 (hiPSC)로부터 분화되는, 질병 관련 희소돌기아교세포를 제한없이 포함하는, 정제된 인간 OPC 또는 희소돌기아교세포 모집단들이 제공된다. 일부 구체예들에서, 이러한 시험관내 유래 세포의 패널이 제공되며, 여기서 패널은 둘 이상의 유전적으로 상이한 세포를 포함한다. 일부 구체예들에서, 이러한 세포의 패널이 제공되며, 여기서 세포는 복수의 후보 물질, 또는 복수 용량의 후보 물질 처리될 수 있다. 후보 물질은 소분자, 즉, 약물, 관심대상의 RNA 발현, 전기적 전하 등을 증가 또는 감소시키는 유전자 구조체들을 포함한다. 일부 구체예들에서 패널은 둘 이상의 상이한 조건들로부터의 환자-특이적 세포들을 이용하는 시스템 또는 방법을 지칭하며, 셋 이상, 넷 이상, 다섯 이상, 여섯 이상, 일곱 이상의 유전적으로 상이한 조건들 일 수 있다.
본 발명의 일부 구체예들에서, 유도된 인간 만능성 줄기 세포 (hiPSC)로부터 분화된 정제된 뉴런, 성상세포, OPS 또는 희소돌기아교세포 모집단 중 하나 또는 이의 패널과 후보 물질을 접촉시키는 단계를 포함하는, hOS로부터 희소돌기아교세포 상의 후보 물질의 활성 결정 방법이 제공된다. 세포 모집단은 선택적으로 수초화 또는 탈수초화 질환 또는 희소돌기아교세포 발달 장애와 관련되거나 이를 유발하는 돌연변이를 인코딩하는; 및 제한없이 유전자 발현 프로파일링을 포함하는, 형태학적, 유전적 또는 기능적 파라미터에 대한 상기 물질의 효과를 결정하는 최소한 하나의 대립유전자를 포함한다. 이러한 희소돌기아교세포의 면역 세포의 활성 및 수초화, 또는 희소돌기아교세포, hOS에서의 성상세포와 환자의 자가 면역 세포들 간의 상호작용을 결정하기 위해 스크리닝 방법이 면역 효과기 세포와 조합될 수 있다. 단일 세포 수준에서의 분석 방법, 예컨대, 수초화 분석, 단일 세포 유전자 발현, 뉴런 또는 성상세포에 대한 희소돌기아교세포의 효과 및 뉴런 세포 신호 전달 등이 특히 관심의 대상이다. 후보 물질은 면역 효과기 세포, 예컨대, T 세포, 미세아교 세포, 대식세포, NK 세포 등 및 면역 효과기 단백질, 예컨대, IFN-γ, TGF-β사이토 카인, 인터페론 등, 특히 염증성 탈수초화 질환에 관여하는 것으로 의심되는 세포 및 단백질을 포함한다.
본 발명의 방법은 희소돌기아교세포의 분화 및 수초 (myelin sheath)의 형성에서 신경 세포와 전구체 사이의 자연적 상호 작용을 이용한다. 일부 구체예들에서, hiPSCs 로부터 희소돌기아교세포로의 분화는 실질적으로 무-혈청 배지에서 실시된다.
hOS에서의 분화 후, 제한없이 희소돌기아교세포를 포함한 관심 대상의 개별적인 세포 유형들이 다양한 목적을 위해 분리 될 수 있다. 세포는 마커의 발현 및 원하는 세포 유형의 표현형 특성에 기초하여 결정될 수 있는 적절한 발달 단계에서 수확된다. 배양물은 관심 마커의 존재에 대한 면역염색 또는 유전자 발현, 형태학적 결정 등에 의해 실험적으로 테스트 될 수 있다. 세포는 양성 선택 단계 전 또는 후에 약물 선택, 패닝 (panning), 밀도 구배 원심분리 등에 의해 선택적으로 농축된다. 또 다른 구체예에서, 음성 선택이 실시되는데, 여기서 선택은 인간 ES 세포, 섬유모세포, 신경 세포, 상피 세포 등에서 발견된 하나 이상의 마커의 발현에 기초한다. 선택은 패닝 방법, 자성 입자 선택, 입자 분류기 선택 등을 이용할 수 있다.
다양한 체세포가 hiPSC의 공급원으로 사용되며; 특히 지방-유래 줄기 세포, 섬유모세포, 각질세포, 말초 혈액 세포 등이 중요하다. 다양한 유전자형, 특히 신경 및 정신 장애와 잠재적으로 관련된 유전자형의 개체로부터 얻은 hiPSCs 사용이 특히 중요하다. hiPSCs는 단일 세포로서 분해되고, 특정 세포수의 구형체로 응집된 다음 현탁액에서 성장된 후; BMP 및 TGFβ 경로들의 저해에 의하여 신경 운명으로 유도된다. 이어서, 구형체는 FGF2 및 EGF의 존재하에 배지로 이동하고 Wnt 경로 저해제 또는 레티노산, 뿐만 아니라 소닉 헤지호그 경로의 활성화제로 패턴화된다. 분화를 촉진하기 위해, 구형체는 PDGF-AA, IGF-1, HGF, 인슐린, BDNF, NT3, cAMP, T3, 및 비오틴을 포함하는 배지로 변경된다. 이러한 배양 후, 구형체는 성장 인자들의 부재하에서 인슐린, 아스코르브산, cAMP, T3, 및 비오틴을 내포하는 신경 배지에서 연장된 시기 동안, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 또는 그 이상 동안 유지될 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 목적, 장점 및 특징은 하기에 보다 상세히 기재하는 바와 같이 본 발명의 방법 및 조성물의 세부 내용을 읽으면 해당 분야의 숙련된 기술자에게 명백해질 것이다.
본 발명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 하기 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해된다. 일반적인 관례에 따라, 도면의 다양한 특징들은 축척에 맞지 않음을 강조한다.　 대조적으로, 다양한 특징들의 크기는 명확성을 위해 임의로 확대되거나 축소된다.　 하기 도면들이 도면에 포함되어 있다.
도 1a-1f. 도 1a 희소돌기아교세포 전구 세포 및 성숙 희소돌기아교세포는 3D 인간 iPSC-유래 올리고-구형체 (hOS)를 생성하였다. NKX2.2/OLIG2+ 희소돌기아교세포 전구 세포는 51-일된 hOS의 고정된 섹션들에 존재한다. 도 1b 100-일된 hOS의 고정된 섹션들에서 O4+ 및 O1+ 희소돌기아교세포의 예. 도 1c 115-일된 hOS의 고정된 섹션들에서 MBP+ 성숙 희소돌기아교세포의 분포를 나타내는 면역형광 표지. 도 1d 115-일된 hOS의 고정된 섹션들에서 물리적으로 상호작용하는 MBP+ 희소돌기아교세포 과정 및 GFAP+ 성상세포 과정들의 예. 도 1e 115-일된 hOS의 고정된 섹션들에서 신경필라멘트+축삭을 둘러싸는 MBP+ 희소돌기아교세포 과정의 예. 도 1f 인간 iPSC-유래 hOS에서 수초화의 예. 수초화된 축삭의 투과 전자 현미경 이미지들을 시험관내에서 100일차에 찍었다.
본 발명의 조성물 및 방법을 더욱 상세히 기재하기에 앞서, 본 발명은 상기 기재된 특정 조성물 및 방법들에 제한되지 않으며, 이러한 구체예들은 물론 변화가능함을 이해하여야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 구체예들을 오직 설명하기 위한 것이며, 제한을 하고자 하는 것이 아니므로, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임을 또한 이해하여야 한다.
수치 범위가 제공될 경우, 내용상 명백히 달리 언급이 없는 한 상기 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재된 값은 하한 단위의 10분의 1까지 또한 구체적으로 개시되어 있는 것으로 이해하여야 한다. 언급된 범위 내의 임의의 명시된 값 또는 개재된 값과 상기 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 또는 개재된 값 사이의 각각의 더 작은 범위는 본 발명에 포함된다. 이들 보다 작은 범위들의 상한 및 하한은 독립적으로 해당 범위에 포함되거나 배제될 수 있으며, 한도값 중 어느 하나 또는 둘 모두가 상기 보다 작은 범위에 포함되거나 한도값 모두가 포함되지 않는 각 범위는 또한 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 한도값 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함되는 이들 한도값들 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위 또한 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 균등한 방법들 및 재료들이 본 발명을 실시 또는 테스트함에 사용될 수 있으나, 본 명세서에는 일부 잠재적이고 바람직한 방법들 및 재료들이 기재되어 있다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌들 및 특허들은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되며, 인용되는 문헌들과 관련된 방법들 및/또는 재료들을 개시 및 기재하기 위하여 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다. 본 발명은 모순이 존재하는 한 본 명세서에 포함된 간행물의 개시내용에 우선함을 이해하여야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단수형 "하나" 및 "그것"은 문맥에서 달리 명확히 언급이 없는 한 복수형을 포함함을 유념하여야 한다. 그러므로, 예를 들면, "하나의 재프로그래밍 인자 폴리펩티드"에 대한 지칭은 복수의 이러한 폴리펩티드들을 포함하며 "유도된 만능성 줄기 세포"에 대한 지칭은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 하나 또는 그 이상의 유도된 만능성 줄기 세포들 및 이의 균등물들, 등에 대한 지칭을 포함한다.
본 출원에서 논의되는 간행물들은 본 출원의 출원일 이전에 이들이 공개되었음을 위해서만 제공된다. 본 출원에서 어떤 것도 본 발명이 이러한 개시내용을 선행 발명보다 선행시키는 것에 대한 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공된 문헌의 공개일자는 실제 공개 일자와 상이할 수 있으며 따로 확인할 필요가 있을 수 있다.
정의
“만능성” 및 만능성 줄기 세포는, 이러한 세포들이 유기체내 모든 유형의 세포들로 분화될 수 있는 능력을 가짐을 의미한다. 용어 "유도된 만능성 줄기 세포"는, 배아 줄기 세포 (ESC)와 유사하게, 유기체에서 모든 유형의 세포로 분화하는 능력을 유지하면서 장기간에 걸쳐 배양될 수 있는 만능성 세포를 포함하지만, ESC와 달리, 분화된 체세포, 즉, 더 좁고 더 정의된 잠재력을 가지고 있고 실험 조작이 없는 경우 유기체의 모든 유형의 세포를 생성 할 수 없는 세포에서 유래한다. hiPSC는 큰 핵-세포질 비율, 한정된 경계 및 현저한 핵을 갖는 편평한 콜로니로 성장하는 인간 ESC- 유사 형태를 가진다. 또한, hiPSC는 알칼리성 포스파타제, SSEA3, SSEA4, SOX2, OCT3/4, NANOG, TRA-160, TRA-181, TDGF1, DNMT3B, TERT, 및 ZFP42를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 해당 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 몇 가지 만능성 마커를 발현한다. 또한, hiPSC는 기형종들을 형성할 수 있다. 이들은 살아있는 유기체에서 외배엽, 중배엽, 또는 내배엽 조직들을 형성 또는 이들에 기여할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "재프로그래밍 인자"는 전사를 변경하기 위해 세포에 작용하여 세포를 다능성 또는 만능성으로 재프로그래밍하는 하나 이상의 생물학적 활성 인자, 즉, 칵테일을 지칭한다. 재프로그래밍 인자는, 세포들에, 예컨대, 심장병에 대한 가족력을 가지는 또는 유전적 관심 대상이 되는 개체의 세포, 가령, 섬유모세포, 지방세포 등에; 개별적으로 또는 재프로그래밍 인자들의 단일 조성물로서, 즉, 사전혼합된 조성물로서 개별적으로 또는 단일 조성물로서 제공 될 수 있다. 인자들은 동일한 몰비 또는 다른 몰비로 제공 될 수 있다. 인자들은 본 발명의 세포를 배양하는 과정에서 한 번 또는 여러 번 제공 될 수 있다. 일부 구체예에서, 재프로그래밍 인자는 Oct3/4; SOX2; KLF3; c-MYC; NANOG; 및 LIN-28을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 전사 인자이다.
체세포는 세포를 만능성으로 재프로그래밍하기에 충분한 조합 및 양으로 상기 정의된 재프로그래밍 인자와 접촉된다. 재프로그래밍 인자는 체세포에 개별적으로 또는 재프로그래밍 인자들의 단일 조성물, 즉, 사전혼합된 조성물로서 제공 될 수 있다. 일부 구체예에서, 재프로그래밍 인자는 벡터 상에 복수의 코딩 서열로서 제공된다. 체세포는 해당 분야에 공지된 바와 같이 섬유모세포, 지방세포, 간질 세포 등 일 수 있다. 체세포 또는 hiPSC는 세포 은행, 정상 공여자, 신경계 또는 정신과 질환에 걸린 개인 등으로부터 얻을 수 있다.
만능성 유도 후, hiPSC는 임의의 편리한 방법에 따라, 예컨대, 조사된 지지 세포 및 시판 배지에서 배양된다. hiPSC는 단백분해효소, 예컨대, 아큐타제로, 바람직하게는 단일 세포들을 플레이트로부터 탈착시키기에 충분힌 농도로 그리고 충분한 시기 동안 분해시킴으로써 지지세포들로부터 분리될 수 있다.
유전자는 다양한 목적을 위해, 예컨대, 기능 돌연변이가 없는 유전자들을 대체, 마커 유전자들을 제공, 등을 위해 체세포 또는 그로부터 유래된 hiPSC에 도입 될 수 있다. 대안적으로, 안티센스 mRNA 또는 리보자임을 발현하여 바람직하지 않은 유전자의 발현을 차단하는 벡터가 도입된다. 다른 유전자 치료 방법들은 정상 전구 세포가 이점을 가져서 선택적 압력을 받게 할 수 있는 약물 내성 유전자들, 예를 들면, 다약제 내성 유전자 (MDR), 또는 항-세포자멸 유전자들, 가령, BCL-2의 도입이다. 해당 분야에 공지된 다양한 기술들, 예컨대, 전기천공, 칼슘 침전 DNA, 융합, 형질감염, 지방감염, 감염 등을 사용하여 상기 논의된 바와 같이 핵산을 표적 세포 내로 도입할 수 있다. DNA가 도입되는 특정 방식은 본 발명의 실시에 중요하지 않다.
용어 “희소돌기아교세포,” “희소돌기아교세포 전구체 세포” 등은 희소돌기아교세포 계통의 세포들, 즉, 궁극적으로 희소돌기아교세포를 발생시키는 신경 전구 세포, 희소돌기아교세포 전구 세포, 및 성숙 및 수초화 희소돌기아교세포를 포함할 수 있으며, 이는 본 발명의 목적을 위해 비-희소돌기아교세포로부터 실험 조작에 의해 발생한다. 희소돌기아교세포는 하기 논의된 바와 같은 희소돌기아교세포 계통의 세포들에 특이적인 마커에 의해 식별될 수 있다. 희소돌기아교세포는 기능적 특성을 가질 수 있는데, 즉, 이들은 뉴런의 수초화 능력; 등을 가질 수 있다. "희소돌기아교세포 전구물질" 또는 “희소돌기아교세포 전구체 세포”는 희소돌기아교세포를 포함하는 후대를 생성할 수 있는 세포로 정의된다.
희소돌기아교세포는 중추 신경계의 수초-형성 세포들이다. 희소돌기아교세포는 축삭 스트레치들을 접촉하여 반복적으로 둘러싸는 많은 과정들을 확장시킨다. 이렇게 감싸진 희소돌기아교세포 막의 층들의 후속적 응축은 수초를 형성한다. 하나의 축삭은 많은 상이한 희소돌기아교세포로부터의 수초 분절을 내포할 수 있다.
수초화는 희소돌기아교세포 계통의 성숙에서 많은 순차적인 단계들을 필요로 한다. 이들 단계들은 세포 표면 항원들의 발현에서 조정된 변화를 동반한다. 희소돌기아교세포 전구 세포의 마커는, 예를 들어, 혈소판-유래 성장 인자 α-수용체 (PDGFR-α)를 포함한다. 희소돌기아교세포의 다른 마커들에는 네스틴, 단백지방 단백질; 신경 세포 부착 분자 (NCAM)의 폴리시알릴화 형태, 강글리오사이드 GD3, 및 탄산 무수화효소 II (CA-II)가 포함된다. 일부 마커, 가령, CA-II는, 해당 계통의 모든 단계들을 포함하며 이 또한 성체 희소돌기아교세포의 마커이다. 갈락토실세라마이드 및 설포갈락토실세라마이드는 마찬가지로 성숙 희소돌기아교세포 표면 상에 여전히 존재하는 초기 마커이다. 특정 수초 단백질들을 인코드하는 다른 유전자들은 상이한 희소돌기아교세포 분화 및 성숙 단계들에서 발현된다. 예를 들어, 2′′사이클릭 뉴클레오티드-3′포스포하이드롤라제 (CNP), 수초 염기성 단백질 (MBP), PLP/DM-20, 수초 연관 당단백질 (MAG), 및 수초/희소돌기아교세포 당단백질 (MOG) 유전자, 뿐만 아니라 다른 소수의 수초 단백질들은 성숙 희소돌기아교세포의 모든 마커이다.
희소돌기아교세포 성숙 및 생존에 수많은 인자들이 필요한 것으로 추측되어 왔다. 이들 인자들은 본 발명의 인간 희소돌기아교세포 배양물들을 이용하여 테스트 될 수 있다. 관심 인자들에는 PDGF, 염기성 FGF, 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I), 뉴로트로핀 3 (NT-3), 아교세포 성장 인자 (GGF), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), IL-6, 전환 성장 인자 (TGF)-β및 IL-2가 포함될 수 있다.
수초는 척추동물 신경계에서 가장 풍부한 막 구조를 구성한다. 미엘린에서 풍부한 지질 및 낮은 수분 함량은 축삭의 전기 절연을 가능하게 하고, 수초화된 영역들의 독특한 분절 구조는 신경 자극의 도약 전도를 담당한다. 이것은 수초가 척추동물 중추 신경계의 비교적 얇은 축삭에서 빠른 신경 전도를 지지 할 수 있게 한다. 고속 전도, 장거리 전송 신호 충실도 및 공간 경제는 수초에 의해 척추동물 신경계에 부여되는 주요 이점이다.
이러한 복잡한 과정을 조절하는 수초화 및 신호의 메커니즘은 본 발명의 세포 및 배양물을 사용하여 연구될 수 있다. 3D 구형체 내부에 수초화될 축삭으로의 희소돌기아교세포 이동에 관여하는 다음과 같은 순차적인 단계들이 존재한다; 희소돌기아교세포의 축삭에 대한 부착; 및 예정된 수의 수초로 축삭을 둘러싸는 과정의 나선형화, 및 수초화되지 않을 공간의 인식. 이들 단계 각각은 제시된 본 발명에서 살아있는 세포에서 연구되고 조작될 수 있다. 또한, 발생 중 희소돌기아교세포와 성상세포 사이의 상호작용이 본 발명에 제시된 3D 구형체에서 연구될 수 있다. 구형체의 긴 배양 수명은 또한 시간에 따른 수초 소성 및 이들 상호작용들의 변화를 연구 가능하게 한다.
뇌 영역들 간의 희소돌기아교세포의 이동 또한 본 발명에서 연구될 수 있다. 뇌 발달 동안, 희소돌기아교세포의 초기 웨이브는 아래겉질에서 생성되어 겉질, 또는 대뇌겉질로 이동한다. 희소돌기아교세포-함유 구형체는 겉질로의 희소돌기아교세포 이동을 제어하는 이동 동역학, 방향 신호, 및 반대 신호들을 모델화하기 위해 겉질 구형체 (cortical spheroids)와 융합될 수 있다. 본 시스템은 또한 이상 희소돌기아교세포 이동 또는 분포가 일정 역할을 할 수 있는 질병들을 연구하기 위해 사용될 수도 있다. 희소돌기아교세포 이동은 본원에 제안된 3D 모델에서 보다 잘 보존될 수 있는데, 왜냐하면 2D 희소돌기아교세포 모델들에서와 같이 평평한 표면을 따라가는 것이 아니라 희소돌기아교세포가 생체내에서 조직들을 통해 이동하기 때문이다.
시험관내 배양된 세포로서의 다양한 용도 이외에도, 희소돌기아교세포는 적절한 동물 모델에서 테스트 될 수 있다. 한 수준에서, 세포는 생체내에서 그 표현형을 생존 및 유지하는 능력에 대해 평가된다. 세포 조성물은 면역 결핍 동물 (가령, 누드 마우스 또는 화학적으로 또는 조사에 의해 면역 결핍이 된 동물)에 투여된다. 조직은 재성장 기간 후에 수확되고, 투여된 세포 또는 이의 후대가 여전히 존재하는지 여부에 대해 평가되며, 관심 치료에 대한 반응에 대해 표현형화 될 수 있다. 적합성은 동물 모델에서 본 발명의 분화 세포로 치료한 결과, 부상 후 또는 질병 상황에서 발생하는 회복 정도를 평가함으로써 결정할 수도 있다.
질병 관련성. 많은 병리들이 희소돌기아교세포 기능장애와 관련되어 있다. 인간의 유전성 수초질환인, 백색질장애는 수초형성장애, 저수초화, 또는 탈수초화의 결과 일 수 있다. 수초형성장애 및 저수초화는 태아기 또는 초기 영아기 동안 발생하는 수초화가 되지 않는 것으로서, 펠리제우스-메르츠바하병 (Pelizaeus-Merzbacher disease)의 다른 형태들로 관찰된다. , 수초의 분해인 탈수초화는 크라베병, 이염색백색질장애, ALD, 카나반 질환, 알렉산더 질환, 정염 백색질장애, 또는 미토콘드리아 장애와 같은 대사성 백색질장애의 특징이다. 수초형성장애 및 탈수초화는 일부 형태의 백색질장애에서 조합될 수 있다.
일부 유전자 질환은 탈수초화가 혈관, 미토콘드리아 또는 뉴런 변형에 이차적인 백혈구병증을 유발할 수 있거나 유비쿼터스 징후를 가질 수 있는 대사성 질환과 연관 될 수 있다. 피질하 경색 및 백색질뇌병증 (CADASIL)이 있는 대뇌 상염색체 우성동맥병증은 상염색체 우성 대뇌 동맥병증이다. MRI는 다소 광범위 할 수있는 백색질의 탈수초화로 다수의 피질하 경색을 입증한다. MELAS (미토콘드리아 근병증, 뇌병증, 젖산 산증, 뇌졸중과 같은 에피소드)는 혈청과 CSF에서 젖산-대-피루브산염 비율의 증가와 함께 젖산 산증을 나타낸다. MRI는 백색질 변형이 피질 위축과 함께 나타남을 보여준다.
페닐케톤뇨는 탈수초화와 관련될 수 있다. 중간 대사의 이상 또한 탈수초화를 일으킬 수 있다. 일부 뉴런 유전자 질환은 수초 (GM2 강글리오시드축적증, 윌슨 병 및 CNS의 퇴행성 질환)에 영향을 줄 수 있다.
혈액-뇌 장벽의 붕괴는 다발성 경화증 (MS), 탈수초화 형태의 EAE, 및 바이러스-유도 탈수초화와 같은 CNS의 탈수초화 질환의 병리학적 징후에서 주요 사건이다. T 세포들은 이 과정에서 중추적인 역할을 한다. CNS로의 활성화된 T 세포의 접근은 염증 세포, 대식세포 및 미세아교 세포에 의한 그리고 전염증성 사이토카인, 가령, TNF-α 및 인터페론-γ의 방출을 담당 할 수 있다.
용어 "치료", "치료하는 것", "치료하다" 등은 본 명세서에서 일반적으로 원하는 약동학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 것과 관련하여서는 예방일 수 있으며 및/또는 질환 및/또는 질환에 기여하는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 안정화 또는 치유와 관련하여서는 치료일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 “치료”는, 포유동물, 특히 인간에서 질환의 치료를 포괄하며, 다음을 포함한다: (a) 해당 질환 또는 증상에 취약할 수 있으나 아직 질환 또는 증상에 걸린 것으로 진단받지 않은 대상체에서 질환 또는 증상이 발생하지 않도록 예방하는 것; (b) 질환 또는 증상을 저해하는 것, 즉, 질환 또는 증상의 발달을 정지시키는 것; 또는 (c) 질환 또는 증상을 완화하는 것, 즉, 질환 또는 증상의 퇴행을 유발하는 것.
용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며, 진단, 치료 또는 치료요법을 필요로 하는 임의의 포유동물 대상체, 특히, 인간을 지칭한다.
발명의 방법
세포가 유도된 인간 만능성 줄기 세포 (hiPSC)로부터 분화되는 인간 희소돌기-구형체 (hOS) 및 이에 포함된 세포의 시험관내 세포 배양의 관찰 및 사용을 위한 방법이 제공된다. 일부 구체예들에서, hiPSC는 신경학적으로 정상인 개체로부터 수득된 체세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, hiPSC는 상기 기재된 수초화 관련 질병을 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 신경 질환과 관련된 돌연변이를 인코딩하는 적어도 하나의 대립 유전자를 포함하는 개체로부터 얻은 체세포로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 이러한 희소돌기아교세포의 패널이 제공되며, 여기서 패널은 둘 이상의 유전적으로 상이한 희소돌기아교세포를 포함한다. 일부 구체예들에서 이러하 희소돌기아교세포의 패널이 제공되는데, 여기서 희소돌기아교세포는 복수의 후보 물질 또는 다른 치료적 개입, 또는 복수 용량의 후보 물질 또는 다른 치료적 개입 처리된다. 후보 물질은, 제한없이, 소분자, 즉, 약물, 관심대상의 RNA 발현, 전기적 전하 등을 증가 또는 감소시키는 유전자 구조체들을 포함한다.
질병-관련 세포에 대한 후보 작용제의 활성을 결정하기 위한 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 후보 물질을 인간 만능성 줄기 세포로부터 분화된, 예컨대, hESC 또는 hiPSC로부터 분화된 하나의 세포 또는 세포 패널과 접촉시키는 단계, 여기서 만능성 줄기 세포는 신경 질환과 관련된 돌연변이를 인코딩하는 적어도 하나의 대립유전자를 선택적으로 포함하고; 그리고 유전자 발현 프로파일링을 포함한 (제한없음), 형태학적, 유전적 또는 기능적 파라미터에 대한 제제의 효과를 결정하는 단계. 유전적 질환 모델 이외에도, 이들 방법은 산소 장력, 온도 및 가해진 힘의 변화를 포함하는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 희소돌기아교세포 성숙 및 수초화에 영향을 미치는 환경 조작에 적용될 수있다.
인간 희소돌기-구형체 (hOS) 및 내부에 포함된 세포들, 예를 들어, 신경 전구체, 희소돌기아교세포 전구 세포 (OPCs), 성상세포, 수초화 희소돌기아교세포 및 체세포로부터의 뉴런을 비롯한, 세포들의 생성은 다단계 과정을 이용한다. 먼저, hiPSC는 임의의 편리한 출처로부터 얻을 수 있거나 해당 분야에 알려진 방법들을 사용하여 체세포로부터 생성될 수 있다. hiPSC는, 바람직하게는 단일 세포로서 해리될 때, 지지세포 (feeders)로부터 해리되고 FGF2가 없는 현탁액 배양에서 성장된다. 특정 구체예에서, 배양물은 지지세포층이 없으며, 예컨대, 시험관내 코팅된 용기에서 성장하는 경우, 그리고 hiPSC는 단일 세포 현탁액으로서 해리되고 특정 크기의 구형체로 응집된다. 배양물은 또한 비-인간 성분들이 없을 수 있다, 즉, 제노-프리 (xeno-free) 일 수 있다. 현탁액 성장은 선택적으로 배양 배지에서 초기 배양 기간 동안, 최대 약 6 시간, 약 12 시간, 약 18 시간, 약 24 시간, 약 36 시간, 약 48 시간 동안, 유효량의 선택적 Rho- 관련 키나제 (ROCK) 저해제를 포함한다 (예를 들어, Watanabe 외. (2007) Nature Biotechnology 25:681 686 참고. 이러한 목적으로 유용한 저해제들에는, 제한없이, Y-27632; 티아조비빈 (Cell Res, 2013, 23(10):1187-200; 파수딜 (HA-1077) HCl (J Clin Invest, 2014, 124(9):3757-66); GSK429286A (Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(12):E1140-8); RKI-1447; AT13148; 등이 포함된다.
hiPSC의 현탁액 배양물은 신경 운명으로 유도된다. 이 배양물은 지지세포가 없을 수 있다. 신경 유도의 경우, 유효량의 BMP 저해제 및 TGFβ 경로가 약 2 일 이상, 약 3 일 이상, 약 4 일 이상, 약 5 일 이상, 내지 최대 약 10 일, 최대 약 9 일, 최대 약 8 일, 최대 약 7 일, 최대 약 6 일, 최대 약 5 일의 기간 동안 배지에 첨가된다. 예를 들어, 도르소몰핀 (DM)은 최소한 약 0.1 μM, 최소한 약 1 μM, 최소한 약 5 μM, 최소한 약 10 μM, 최소한 약 50 μM, 최대 약 100 μM 농도의 유효량으로 첨가될 수 있으며, 이는 골 형성 단백질 (BMP) 유형 I 수용체 (ALK2, ALK3 및 ALK6)를 저해한다. 다른 유용한 BMP 저해제들에는, 제한 없이, A 83-01; DMH-1; K 02288; ML 347; SB 505124; 등이 포함된다. SB-431542는 최소한 약 0.1 μM, 최소한 약 1 μM, 최소한 약 5 μM, 최소한 약 10 μM, 최소한 약 50 μM 내지 최대 약 100 μM 농도의 유효량으로 첨가될 수 있으며, 이는 TGFβ 신호전달을 저해하지만 BMP 신호전달에는 아무 영향이 없다. 다른 유용한 TGFβ 저해제들에는, 제한 없이, LDN-193189 (J Clin Invest, 2015, 125(2):796-808); 갈루니서팁 (LY2157299) (Cancer Res, 2014, 74(21):5963-77); LY2109761 (Toxicology, 2014, 326C:9-17); SB525334 (Cell Signal, 2014, 26(12):3027-35); SD-208; EW-7197; 카르토제닌; DMH1; LDN-212854; ML347; LDN-193189 HCl (Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(52):E5039-48); SB505124; 피르페니돈 (Histochem Cell Biol, 2014, 10.1007/s00418-014-1223-0); RepSox; K02288; 헤스페레틴; GW788388; LY364947, 등이 포함된다.
Wnt 저해제의 유효량은 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일차에서 시작하는 배양 배지에, 예를 들어, 약 0.1 μM 내지 약 100 μM 의 농도로 포함될 수 있으며, 선택되는 저해제의 활성에 따라 약 1 μM 내지 약 25 μM 일 수 있다. 예시적인 저해제들에는, 제한 없이, 무세포 분석법에서 11 nM/4 nM의 IC50을 가지며 탄킬라제 (tankyrase) 1/2 저해를 통한 Wnt/β카테닌-매개된 전사를 선택적으로 저해하는 XAV-939; Wnt/β카테닌/TCF-매개된 전사를 길항하고 3 μM의 IC50을 가지며 요소-결합 단백질 (CBP)에 특이적으로 결합하는 ICG-001; Wnt3A를 발현하는 L-세포들에서 180 nM의 IC50을 가지는 Wnt 경로 저해제로, Axin2 단백질 수준을 유도하여 액신-스캐폴드 파괴 복합체 (Axin-scaffolded destruction complexes)를 안정화시킴으로써 β카테닌 인산화를 촉진시키는 IWR-1-엔도; HEK293 세포들에서 74 pM의 IC50을 가지며, 다량체화 TCF-결합 부위 유도 루시페라제의 Wnt3A-매개된 활성화에 대한 PORCN 저해제인 Wnt-C59 (C59); TM3 세포들에서 0.4 nM의 IC50을 가지며, 효능있고 특이적인 PORCN 저해제로, Wnt 신호전달을 저해하는 LGK-974; Wnt 신호전달을 저해함으로써 hPSCs의 카디오미오사이트로의 분화를 촉진하고, APC 및 GSK3β의 하류에서 작용할 수 있는 KY02111; 무세포 분석법에서 27 nM의 IC50을 가지며 Wnt 과정 및 분비의 저해제로, Porcn-매개된 Wnt 팔미토일화를 선택적 차단하고, 일반적으로 Wnt/β카테닌에 영향을 미치지 않으며 Wnt-자극된 세포 반응들에 대하여 효과를 전혀 나타내지 않는 IWP-2; 매우 효능있는 Porcn 저해제로 0.5 nM의 EC50을 가지는 IWP-L6; 새로운 탄킬라제 저해제로 TNKS2에 대하여 15 nM의 IC50을 가지며, Wnt/베타-카테닌 신호전달의 저해를 초래하는 WIKI4; Wnt/β카테닌 신호전달 저해제이며 또한 이중 PPARγ및 PPARδ길항제인 FH535가 포함된다. Wnt 저해제 대신, 레티노산은 10 nM 내지 1 μM 범위 농도로 배양 배지에 포함될 수 있다.
소닉 헤지호그 경로의 효현제가 또한 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일차 시작시 첨가될 수 있다. 가능한 효현제에는 SAG 및 퍼모파민이 포함되며, 100 nm 내지 10 μM 범위의 농도로 사용된다.
현탁액 배양 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일 후, 부유 구형체들은 신경 전구체를 분화시키기 위해 신경 배지로 이동된다. 배지에 유효량의 FGF2 및 EGF가 보충된다. 상기 성장 인자들은 각각 최소한 약 0.5 ng/ml, 최소한 약 1 ng/ml, 최소한 약 5 ng/ml, 최소한 약 10 ng/ml, 최소한 약 20 ng/ml, 최대 약 500 ng/ml, 최대 약 250 ng/ml, 최대 약 100 ng/ml의 농도로 제공될 수 있다.
초기 전구체의 희소돌기아교세포로의 분화를 촉진시키기 위하여, FGF2/EGF 노출 약 1 주, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주 후 FGF2, EGF, IWP-2, 및 SAG를 유효량의 PDGF-AA, IGF-1, HGF, BDNF 및 NT3로 교체하기 위하여 신경 배지를 바꾼다. 상기 성장 인자들은 각각 최소한 약 0.5 ng/ml, 최소한 약 1 ng/ml, 최소한 약 5 ng/ml, 최소한 약 10 ng/ml, 최소한 약 20 ng/ml, 최대 약 500 ng/ml, 최대 약 250 ng/ml, 최대 약 100 ng/ml의 농도로 제공될 수 있다. 상기 배지는 추가로, 예를 들어, 인슐린, T3, cAMP 유사체, 비오틴, 등을 포함할 수 있으며, 인슐린에 대한 농도는 최대 약 50 μg/ml, 최대 약 25 μg/ml이다.
분화 인자들에 대한 노출 후 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주 후, 구형체들은 성장 인자들이 없는 신경 배지에서 장기 시기 동안, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 또는 그 이상의 기간 동안 유지될 수 있다. 신경 배지는 아스코르브산, 25 μg/mL 인슐린, 1μM cAMP 유사체, 60 ng/mL T3, 및 100 ng/mL 비오틴을 포함할 수 있으며 배지는 4-5 일 마다 교환한다.
세포들의 모집단은 구형체들로부터, 유세포 분석, 자기 면역선택, 면역패닝법, 등을 비롯한 임의의 편리한 방법으로 단리될 수 있다. 편의상, PDGFR 및/또는 MBP가 희소돌기아교세포 전구체 및 희소돌기아교세포 각각에 대한 양성 선택 마커로 사용된다. 이와 같이 단리된 세포는 허용가능한 배지에 재현탁 될 수 있고 배양에서 유지되고, 동결되고, 관심 매개변수에 대해 분석 될 수 있으며; 인간 또는 동물 모델로 이식; 등이 될 수 있다. 희소돌기아교세포 전구 세포 또는 희소돌기아교세포의 모집단은, 예를 들어, CNS 뉴런의 재수초화 방법에서, 예컨대, 외상 손상 후 뉴런의 재성장에서, 탈수초화 질환, 가령, 다발성 경화증의 치료적 치료 등에서 관심 대상이 되며, 여기서 유효량의 세포들이 필요로 하는 환자에게 제공된다.
스크리닝 분석
등소분자들에 대한 스크리닝 분석에서, 세포들의 패널 및 세포 환경을 사용하여 배양 중 세포들에 대한 후보 물질의 첨가 효과가 테스트되는데, 여기서 세포 환경은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 이온성의 변화를 비롯한 전기 자극, 관심 후보 물질로의 자극, 뉴런 및 신경 전구체, 면역 효과기 세포, 가령, T 세포, 미세신경아교 세포, 대식세포, 등을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 다른 세포들과의 접촉 등이며, 이 때 희소돌기아교세포의 패널들은 제공되는 물질의 용량 등에서 관심 환경에 대한 노출 이전에는 유전자형이 다를 수 있다. 일반적으로 최소한 하나의 대조, 예를 들어, 음성 대조 및 양성 대조가 포함된다. 세포들의 배양은 전형적으로 무균 환경에서, 예를 들어, 가습된 92-95% 공기/5-8% CO2 대기를 내포하는 배양기에서 37oC에서 실시된다. 세포 배양은 정의되지 않은 생물학적 유체들, 가령, 우 태아 혈청 (fetal calf serum)을 내포하는 영양 혼합물에서, 또는 완전히 정의된 그리고 무혈청 배지에서 실시될 수 있다. 형태학적, 기능적 및 유전자 변화를 비롯한 다수의 출력 매개변수들을 모니터링하여 환경 변화 효과를 평가한다.
유전 물질들에 대한 스크리닝 분석에서, 세포의 유전적 조성을 변화시키기 위하여 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 패널 세포들에 첨가될 수 있다. 출력 매개변수는 표현형의 변화 존재여부를 결정하기 위해 모니터된다. 이러한 방식으로, 관심 경로에서 단백질들의 발현을 인코드하는 또는 이에 영향을 미치는 유전자 서열이 확인된다. 결과는 데이터 처리장치에 입력되어 스크리닝 결과 데이터세트를 제공할 수 있다. 상이한 조건들하에 얻어진 스크리닝 결과들의 비교 및 분석을 위한 알고리즘들이 사용된다.
예컨대, 상기 기재된 바와 같이 다음과 같은 단일 세포에서의 분석 방법들이 특히 관심 대상이다: 원자력 현미경, 단일 세포 유전자 발현, 단일 세포 RNA 시퀀싱, 칼슘 이미징, 유세포 분석, 수초화, 전자 현미경, 라이브 이미징 등. 다양한 매개변수들이 측정되어 희소돌기아교세포에 대한 약물 또는 치료의 효과를 결정할 수 있다.
매개변수들은 세포의 정량화 가능한 성분, 특히, 바람직하게는 높은 처리량 시스템에서 정확하게 측정될 수 있는 성분이다. 매개변수는 또한 세포 표면 결정 인자, 수용체, 단백질 또는 이의 구조적 또는 번역 후 변형, 지질, 탄수화물, 유기 또는 무기 분자, 핵산, 예컨대, mRNA, DNA 등, 또는 이러한 세포 구성 요소로부터 유래한 일부분 또는 이의 조합을 포함하는 임의의 세포 성분 또는 세포 생성물 일 수있다. 대부분의 매개변수들은 정량적 판독값을 제공할 것이나, 일부 사례에서 반-정량적 또는 정성적 결과가 허용가능할 것이다. 판독값은 하나의 결정된 값을 포함할 수 있으며, 또는 평균, 중앙값 또는 편차 등을 포함할 수 있다. 변이성이 예상되며 단일 값을 제공하는 데 사용되는 공통 통계 방법과 함께 표준 통계 방법을 사용하여 각 테스트 매개변수 세트에 대한 값 범위를 얻을 수 있다.
관심 있는 매개변수는 세포질, 세포 표면 또는 분비된 생체분자, 종종 생물폴리머, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 다양한 수초 성분을 비롯한, 폴리펩티드, 다당류, 폴리 뉴클레오티드, 지질 등 바이오 폴리머의 검출을 포함한다. 세포 표면, 수초 및 분비된 분자는 이들이 세포 통신 및 세포 효과기 반응을 매개하고 보다 쉽게 분석될 수 있기 때문에 바람직한 매개변수 유형이다. 한 구체예에서, 매개변수들은 특이적 에피토프들을 포함한다. 에피토프는 종종 특이적 단클론 항체 또는 수용체 프로브를 사용하여 식별된다. 일부 사례들에서 에피토프를 포함하는 분자 엔터티는 둘 이상의 물질들로부터 유래하며 정의된 구조를 포함한다. 매개변수는 특이적으로 변형된 단백질 또는 소당류의 탐지가 될 수 있다. 매개변수는 특이적 단클론 항체 또는 수용체 결합 결정인자에 의해 결정될 수 있다.
관심 후보 물질들은 수많은 화학종들, 주로 유기 분자들을 포함하는 생물학적 활성 물질들이며, 이는 유기금속 분자, 무기 분자, 유전자 서열 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 중요한 한 양상은 후보 약물을 평가하고, 바람직한 생물학적 반응 기능을 가지는 치료 항체 및 단백질-기반 치료제들을 선택하는 것이다. 후보 약물들은 단백질과의 구조적 상호작용, 특히 수소 결합에 필요한 작용기들을 포함하고, 전형적으로 최소한 아민, 카르보닐, 하이드록실 또는 카르복실기, 종종 상기 화학적 작용기들 중 최소한 2개를 포함한다. 후보 물질은 종종 고리형 탄소 또는 헤테로고리 구조 및/또는 상기 작용기들 중 하나 이상으로 치환된 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함한다. 후보 물질들은 또한 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 다당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 유도체, 구조 유사체 또는 이의 조합을 비롯한 생물분자들 중에서 발견된다.
약리학적 활성 약물, 유전자 활성 분자 등이 포함된다. 관심 화합물들에는 화학치료제, 항-염증제, 호르몬 또는 호르몬 길항제, 이온 채널 개질제, 신경활성 물질이 포함된다. 본 발명에 적합한 제약학적 물질들의 예는, 문헌 “Pharmacological Basis of Therapeutics,”Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, New York, (1996), Ninth edition의 다음 섹션에 기재되어 있다: Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites; Cardiovascular Drugs; Vitamins, Dermatology; 및 Toxicology, 모두 본 명세서에 참고로 포함된다.
테스트 화합물들은 상기 기재된 모든 종의 분자들을 포함하며, 공지되지 않은 내용의 샘플들을 추가로 포함할 수 있다. 관심 대상은 자연 출처, 가령, 식물들로부터 유래한 자연 발생 화합물들의 복합 혼합물이다. 많은 샘플들은 용액으로 화합물들을 포함할 것이지만, 적합한 용매에 용해될 수 있는 고체 샘플 또한 분석될 수 있다. 관심 샘플들에는 환경 샘플, 예컨대, 지하수, 해수, 광업 폐기물, 등; 생물학적 샘플, 예컨대, 작물, 조직 샘플 등으로부터 준비된 용해물; 제조 샘플, 예컨대, 의약품 제조 중 시간 경과; 뿐만 아니라 분석을 위해 준비된 화합물들의 라이브러리가 포함된다. 관심 샘플들은 잠재적인 치료 가치에 대해 평가되는 화합물들, 즉, 약물 후보물을 포함한다.
용어 샘플은 또한 추가 성분들, 예를 들어, 이온 강도, pH, 총 단백질 농도, 등에 영향을 주는 성분들이 추가되어 있는, 상기 기재된 바와 같은 유체들을 포함한다. 또한, 샘플들은 최소한 부분적인 분율 또는 농도를 구현하기 위해 처리될 수 있다. 생물학적 샘플들은, 해당 화합물의 분해를 감소시키기 위한 주의가 필요한 경우, 예컨대, 질소하에, 동결, 또는 이의 조합으로 보관될 수 있다. 사용되는 샘플의 부피는 측정가능하게 탐지할 수 있기에 충분하며, 통상적으로 생물학적 샘플의 약 0.1 :l 내지 1 ml가 충분하다.
후보 물질들을 비롯한 화합물들은, 합성 또는 자연 화합물들의 라이브러리를 비롯한 널리 다양한 출처들로부터 얻는다. 예를 들어, 무작위화된 올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드의 발현을 비롯한, 널리 다양한 유기 화합물 및 생물분자들의 무작위 및 직접 합성을 위한 많은 수단들을 이용할 수 있다. 대안적으로, 세균, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물들의 라이브러리가 이용가능하거나 용이하게 제조된다. 추가적으로, 자연 또는 합성적으로 생성된 라이브러리 및 화합물들은 종래의 화학적, 물리적 및 생화학적 수단들을 통해 용이하게 변형되며, 조합 라이브러리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 공지된 약리학적 물질들은 직접 또는 무작위 화학적 변형, 가령, 아실화, 알킬화, 에스터화, 아미드화, 등을 거쳐 구조 유사체를 생성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전 물질"은 폴리뉴클레오티드 및 이의 유사체를 지칭하며, 이때 이러한 물질은 유전 물질의 세포에 대한 첨가에 의해 본 발명의 스크리닝 분석에서 테스트된다. 유전 물질의 도입은 세포의 전체 유전적 조성의 변화를 초래한다. 유전 물질, 가령, DNA는, 일반적으로 염색체로의 서열 통합을 통해, 세포 게놈에 실험적으로 도입되는 변화를 생성할 수 있다. 유전적 변화는 또한 일시적일 수 있으며, 이 때 외인성 서열은 통합되지 않지만 에피좀 물질로서 유지된다. 유전 물질, 가령, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 세포의 유전자형을 변화시키지 않고, mRNA의 전사 또는 번역을 간섭함으로써 단백질의 발현에 영향을 줄 수 있다. 유전 물질의 효과는 세포에 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 증가 또는 감소시키는 것이다.
폴리펩티드를 인코드하는 발현 벡터의 도입은 해당 서열이 없는 세포들에서 인코드되는 생성물을 발현시키기 위해, 또는 해당 생성물을 과발현시키기 위해 사용될 수 있다. 항시적인 또는 외부 조절을 받는 다양한 프로모터들이 사용될 수 있으며, 외부 조절을 받는 상황인 경우, 유전자의 전사를 작동시키거나 작동시키지 않을 수 있다. 이들 코딩 서열들은 전장 cDNA 또는 유전자 클론, 이로부터 유래한 단편들, 또는 다른 코딩 서열들의 기능적 또는 구조적 도메인들과 자연 발생 서열을 조합하는 키메라를 포함할 수 있다. 대안적으로, 도입되는 서열은 자연 서열들의 안티-센스 서열을 인코드 할 수 있고; 안티-센스 올리고뉴클레오티드일 수 있으며; RNAi는 우성 음성 돌연변이, 또는 우성 또는 항시적으로 활성인 돌연변이들; 변화된 조절 서열들, 등을 인코드할 수 있다.
안티센스 및 RNAi 올리고뉴클레오티드는 해당 분야에 공지된 방법들에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드들은, 그 세포내 안정성 및 결합 친화력을 증가시키기 위해, 고유 포스포다이에스터 구조로부터 화학적으로 변형된다. 이러한 많은 변형들이 문헌들에 설명된 바 있으며, 이러한 변형들은 골격, 당 또는 헤테로사이클릭 염기의 화학을 변화시킨다. 그 중에서 골격 화학에서 유용한 변화들은 포스포로티오에이트; 포스포로디티오에이트이며, 여기서 비-가교 산소들 모두는 황; 포스포라미다이트, 알킬 포스포트라이에스터 및 보라노포스페이트로 치환된다. 아키랄 포스페이트 유도체에는 3'-O'-5'-S-포스포로티오에이트, 3'-S-5'-O-포스포로티오에이트, 3'-CH2-5'-O-포스포네이트 및 3'-NH-5'-O-포스포로아미데이트가 포함된다. 펩티드 핵산은 전체 리보스 포스포다이에스터 골격을 펩타이드 링키지로 대체한다. 당 변형, 예컨대, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 유사체들 또한 안정성 및 친화력을 개선하기 위해 사용된다. 데옥시리보스의 α-아노머가 사용될 수 있으며, 여기서 염기는 자연 β-아노머에 대해 반전된다. 리보스 당의 2'리보스 당-OH은 2'-O-메틸 또는 2'-O-알릴 당을 형성하기 위해 변형될 수 있으며, 이는 친화력을 손상시키지 않고 분해에 대한 내성을 제공한다.
물질들은 하나의 또는 복수의 환경 조건에서, 예컨대, β-아드레날린 효현제로 자극 후, 전기적 또는 기계적 자극 후, 등에서 최소한 하나의 그리고 통상적으로 복수의 세포들에 해당 물질을 첨가함으로써 생물학적 활성에 대해 스크린된다. 해당 물질에 반응하여 매개변수 판독값의 변화가 측정되고, 바람직하게는 정규화되고, 생성된 스크리닝 결과는 이어서 참조 스크리닝 결과, 예를 들어, 다른 관심 대상 돌연변이를 갖는 세포, 정상 희소돌기아교세포, 다른 가족 구성원으로부터 유래된 희소돌기아교세포 등과 비교하여 평가될 수 있다. 참조 스크리닝 결과는 상이한 환경 변화의 존재 및 부재하에서의 판독값, 공지된 약물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 다른 물질로 얻은 스크리닝 결과 등을 포함 할 수 있다.
해당 물질은 배양 중인 세포의 배지에 용액 또는 쉽게 용해되는 형태로 편리하게 첨가된다. 상기 물질은 유수식 시스템 (flow-through system)에, 스트림으로서 간헐적 또는 연속적으로 추가될 수 있고, 또는 대안적으로 화합물의 볼루스를 그 외 정적 용액에 한번에 또는 점진적으로 늘려 첨가 될 수 있다. 유수식 시스템에서, 두 개의 유체들이 사용되는데, 여기서 하나는 생리학적 중성 용액이고, 다른 하나는 테스트 화합물이 첨가된 동일한 용액이다. 첫 번째 유체가 세포들을 통해 통과한 다음 두 번째 유체가 통과한다. 단일 용액 방법에서, 테스트 화합물의 볼루스가 상기 세포들을 둘러싸는 일정 부피의 배지에 첨가된다. 배양 배지의 성분들의 전체 농도는 볼루스 첨가로, 또는 유수식 방법에서 두 개 용액들 간에 유의하게 변화하지 않아야 한다.
바람직한 물질 제제들은 전체 제제에 유의한 효과를 가져올 수 있는 추가적인 성분들, 가령, 보존제를 포함하지 않는다. 그러므로 바람직한 제제들은 생물학적 활성 화합물 및 생리학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 물, 에탄올, DMSO, 등으로 본질적으로 구성된다. 그러나, 화합물이 용매없는 액체인 경우, 제제는 본질적으로 화합물 그 자체로 구성될 수 있다.
다양한 농도에 대한 차등 반응을 얻기 위해 복수의 분석이 상이한 물질 농도로 병렬로 수행 될 수 있다. 해당 분야에 공지된 바와 같이, 물질의 유효 농도 결정은 전형적으로 1:10 농도 범위, 또는 다른 로그 스케일의 희석으로 생성된 농도 범위를 사용한다. 필요에 따라, 농도는 일련의 2차 희석으로 추가 정제될 수 있다. 전형적으로, 이들 농도 중 하나는, 즉, 제로 농도에서 또는 물질의 탐지 수준 이하에서 또는 표현형에서 탐지가능한 변화를 제공하지 않는 제제의 농도 이하에서 음성 대조로서 작용한다.
상기 기재된 기능적 매개변수들 이외에, 선택된 매개변수들의 존재를 정량하기 위하여 다양한 방법들이 이용될 수 있다. 존재하는 분자의 양을 측정하기 위해, 편리한 방법은 탐지가능한 모이어티로 분자를 표지하는 것인데, 이러한 모이어티는 형광, 발광, 방사성, 효소 활성 등이고, 특히, 매개변수에 높은 친화력으로 결합함에 특이적인 분자이며, 형광 모이어티는 사실상 임의의 생체분자, 구조 또는 세포 유형을 표지하기 위해 쉽게 이용가능하다. 면역형광 모이어티는 특이적 단백질 뿐만 아니라 특이적 형태들, 절단 생성물들, 또는 인산화와 같은 부위 변형들에 결합하도록 지시될 수 있다. 개개의 펩타이드 및 단백질들은, 예컨대, 세포들 내부에서 녹색 형광 단백질 키메라로서 이들을 발현시킴으로써, 자가형광하도록 조작될 수 있다 (검토를 위해, Jones 외. (1999) Trends Biotechnol. 17(12):477-81을 참고하라). 그러므로, 항체들은 형광 염료를 이들 구조의 일부로서 제공하도록 유전자 변형될 수 있다.
선택된 표지에 따라, 매개변수들은 형광 표지 이외의 것들을 사용하여, 방사면역측정법 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡광 측정법 (ELISA), 균질 효소 면역분석법, 및 관련된 비-효소적 기법들과 같은 면역분석 기법들을 사용하여 측정될 수 있다. 이들 기법들은 특정 항체들을 리포터 분자로 이용하며, 이는 특히 단일 분자 표적에 대한 부착에 고도의 특이성으로 인해 특히 유용하다. 미국 특허 제 4,568,649는 섬광 계수 (scintillation counting)를 사용하는 리간드 탐지 시스템을 설명한다. 이들 기법들은 단백질 또는 변형된 단백질 매개변수들 또는 에피토프, 또는 탄수화물 결정잉ㄴ자들에 특히 유용하다. 단백질 및 다른 세포 결정인자들에 대한 세포 판독값들은 형광 또는 그 외 태그된 리포터 분자를 사용하여 얻을 수 있다. 세포 기반 ELISA 또는 관련 비-효소적 또는 형광-기반 방법들은 세포 표면 매개변수들 및 분비된 매개변수들의 측정을 가능하게 한다. 포획 ELISA 및 관련된 비-효소적 방법들은 통상적으로 2개 특이적 항체들 또는 리포터 분자를 이용하고 용액에서 매개변수들을 측정함에 유용하다. 유세포 분석법들은 세포 표면 및 세포내 매개변수들, 뿐만 아니라 모양 변화 및 세분성(granularity)을 측정하기 위해 그리고 항체- 또는 프로브-결합된 시약들로서 사용되는 비드들의 분석에 유용하다. 이러한 분석으로부터의 판독값은 개별 형광 항체-탐지된 세포 표면 분자 또는 사이토카인과 관련된 평균 형광, 또는 평균 형광 강도, 중앙값 형광 강도, 형광 강도의 변화, 또는 이들 간의 일부 관계일 수 있다.
입력 세포 유형이 식별되고 정량적 영상화 및 형광에 의해 매개변수가 판독되는 단일 세포 다중매개변수 및 다세포 다중매개변수 멀티플렉스 검정 모두가 해당 분야에서 사용되며, 이는 Confocal Microscopy Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology Vol. 122.)을 참고하라. Paddock, Ed., Humana Press, 1998. 이들 방법들은 1999년 11월 23일 등록된 미국 특허 5,989,833에 기재되어 있다.
핵산, 특히, 전령 RNA의 정량 또한 매개변수로서 관심 대상이다. 이들은 핵산 뉴클레오티드의 서열에 의존하는 혼성화 기법들에 의해 측정될 수 있다. 기법들은 중합효소 연쇄 반응 방법 및 유전자 배열 기법을 포함한다. 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 외., eds, John Wiley & Sons, New York, NY, 2000; Freeman 외. (1999) Biotechniques 26(1):112-225; Kawamoto 외. (1999) Genome Res 9(12):1305-12; 및 Chen 외. (1998) Genomics 51(3):313-24를 참고한다.
테스트 화합물로부터 얻은 스크리닝 결과와 참조 스크리닝 결과(들)의 비교는 적합한 추론 프로토콜, AI 시스템, 통계 비교 등을 사용하여 이루어진다. 바람직하게는, 스크리닝 결과는 참조 스크리닝 결과들의 데이터베이스와 비교된다. 참조 스크리닝 결과들의 데이터베이스는 컴파일 될 수 있다. 이들 데이터 베이스는 공지의 물질들 또는 이러한 물질들의 조합을 포함하는 패널들로부터 얻은 참조 결과들 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 환경 조건들 또는 매개변수들이 제거되거나 특이적으로 변경되어 있는 환경 조건들하에서 처리된 세포들의 분석으로부터 얻은 참조들을 포함할 수 있다. 참조 결과들은 또한 특이적 세포 경로들을 선택적으로 표적 또는 조절하는 유전자 구조체들을 가지는 세포들을 내포하는 패널들로부터 생성될 수도 있다.
판독값은 평균, 평균값, 중앙값 또는 편차 또는 그 외 해당 측정값과 관련된 통계적 또는 수학적으로 유도된 값들이 될 수 있다. 매개변수 판독값 정보는 상응하는 참조 판독값과 직접 비교하여 추가로 개선될 수 있다. 동일한 조건에서 각 매개변수에 대해 얻은 절대값은 살아있는 생물학적 시스템에 내재된 변이성을 나타낼 뿐만 아니라 개별 세포 변이성 및 개체들 사이에 내재된 변이성을 반영한다.
편의상, 본 발명의 시스템은 키트로 제공될 수 있다. 키트는, 이는 생존력을 유지하기 위해 냉동, 냉장 또는 다른 방식으로 처리될 수 있는 사용될 세포, 파라미터를 측정하기 위한 시약 및 스크리닝 결과를 준비하기 위한 소프트웨어를 포함할 수 있다. 소프트웨어는 결과들을 받아서 분석을 실시하게 되며 참조 데이터를 포함할 수 있다. 소프트웽는 또한 결과들을 대조 배양으로부터 얻은 결과들을 사용하여 정규화할 수 있다. 조성물은 선택적으로 적합한 용기에, 원하는 목적, 가령, 스크리는 방법에 관한 서면 지침 등과 함께 패키징될 수 있다.
본 발명의 실시에 유용한 일반적인 기술을 더욱 구체화하기 위해, 의사는 표준 생물학 교과서 및 세포 생물학, 조직 배양, 배아학 및 신경생물학의 검토내용을 참고할 수있다. 조직 배양 및 배아 줄기 세포와 관련하여, 독자는 다음과 같은 기형암 및 배아 줄기 세포에 관한 내용을 참고할 수 있다: A practical approach (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); Guide to Techniques in Mouse Development (P. M. Wasserman 외. eds., Academic Press 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology 및 Gene Therapy (P. D. Rathjen 외., Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998).
분자 및 세포 생물학에서 일반적인 방법들은 표준 교과서들, 가령, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook 외., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel 외. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag 외., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner 외. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)에서 찾을 수 있다. 이 문헌에서 언급된 유전자 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터, 및 키트들은 상업적 공급업체들, 가령, BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, 및 ClonTech사로부터 구입 가능하다.
본 명세서에서 인용된 각 문헌은 그 전문이 모든 목적을 위해 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 동물종 또는 속, 및 시약들에 제한되지 않으며, 이에 따라 변화할 수 있음을 이해하여야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 구체예들을 오직 설명하기 위한 것이며, 제한을 하고자 하는 것이 아니므로, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임을 또한 이해하여야 한다.
본 출원에서 사용되는, 단수형 “하나" 및 “그것”은 내용상 명확히 달리 언급이 없는 한, 복수형들을 포함한다. 그러므로 예를 들면, "하나의 세포"에 대한 지칭은 복수의 이러한 세포들을 포함하며 "배양"에 대한 지칭은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 하나 또는 그 이상의 배양물들 및 이의 균등물들, 등에 대한 지칭을 포함한다. 본 출원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 명확히 달리 언급이 없는 한 본 발명이 속하는 해당 분야의 숙련된 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
다음의 실시예들은 본 발명을 제조하는 방법 및 사용하는 방법에 관한 완전한 개시 및 설명을 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 제공하기 위해 제시되며, 발명자들이 자신의 발명이라고 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니며 또한 다음의 실험들이 실시되는 모든 실험들임을 또는 단 하나의 실험임을 나타내고자 하는 것도 아니다. 사용되는 값들 (예컨대, 양, 온도, 등)에 관하여 정확도를 보장하기 위하여 노력을 하였으나, 일부 실험 오차 및 편차를 고려하여야 한다. 달리 언급이 없는 한, 부분은 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 그리고 압력은 대기압 또는 대기압 근방이다.
실험
실시예 1
인간 희소돌기아교세포를 생성하고 시험관내 수초화 과정을 모델하기 위한 선행 방법들이 2차원 (2D) 배양물에서 실시된 바 있다. 이들 프로토콜에서, 수초화는 합성 나노필러를 둘러싼 희소돌기아교세포 감싸기 (wrapping) 과정들로서 연구된다. 수초화는 3차원 과정으로서 인간 뇌에서 일어나기 때문에 이들 방법들로는 수초화를 연구할 수 없다. 대안적으로, 인간 줄기 세포-유래된 희소돌기아교세포를 설치류에 이식하였으나, 어느 정도로 생쥐 환경이 인간 희소돌기아교세포 생물학 및 수초화에 영향을 미치는지에 대해서는 공지되어 있지 않으며, 그리고 이들 방법들은 힘이 들고 높은 처리량의 스크리닝을 할 수 없게 한다. 아래에 기재된 방법은 인간 hiPSC 또는 hESC에서만 유래된 3차원 (3D) 배양물에서 시험관내 수초화 희소돌기아교세포를 최초로 생성하여, 시험관내 건강 및 질환 병태에서 인간 수초화를 연구 할 수 있게 한다.
hiPSC 유지 및 응집. 인간 유도된 만능성 줄기 세포 (hiPSC) 계통들을 iPSC 배지 (100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 내포하는 완전 E8 배지)에서 비트로넥틴 (0.5 μg/cm2)으로 코팅된 조직 배양-처리된 플레이트 상에서 배양하였다. 부유 응집물을 형성하기 위하여, Aggrewell 플레이트를 먼저 500 μL의 hiPSC 배지+ ROCK 저해제 Y-27632 (10 nM)를 5분 동안 2,000 g에서 원심분리하여 준비하였다. hiPSCs를 Y-27632로 1 시간 동안 예비처리한 다음 예열된 아큐타제로 5-7분 동안 처리하여 해리시켰다. 해리되면, hiPSC를 수집하고 hiPSC 배지에 희석시킨 다음 계수하였다. 3백만개의 hiPSCs 분취량을 15 mL 팔콘 시험관에 옮기고, 2,000 g에서 5분 동안 원심분리한 다음, Y-27632가 있는 1.5 mL의 hiPSC 배지에 재현탁시켰다. 이어서 3백만개 세포 현탁액들을 준비된 Aggrewell 플레이트의 개개 웰들에 첨가하고, 플레이트들을 100 g에서 3분 동안 원심분리하였다. 이어서 Aggrewell 플레이트들을 5% CO2의 37 ℃ 배양기에서 하룻밤 동안 보관하였다.
다음날, hiPSC 응집체들을 컷 팁 (cut tip)을 사용하여 P-1000 피펫으로 피펫팅하여 Aggrewells로부터 세척하였다. 분리된 응집체들을 40 μm 세포 필터를 사용하여 변형시키고, 100U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 보유한 E6 배지를 함유하는 100 mm 초저 부착 조직 배양 접시로 옮겼다.
신경 유도 및 희소돌기생성의 촉진. 신경 유도를 위해, 도르소몰핀 (5 μM) 및 SB-431542 (10 μM)를 처음 6일 동안 매일 첨가하였다. 2개의 구형체 변형들을 생성하였으며, 여기서 일부는 3일차에 시작하여 매일 모든-트랜스 레티노산 (RA, 100 nM)에 노출되었으며, 나머지는 4일차에 시작하여 매일 Wnt 경로 저해제 IWP-2 (5 μM)에 노출되었다. 현탁액에서 6일차에, 부유 구형체들을, DMEM/F12, N-2 보충, 비타민 A가 없는 B-27 혈청 치환, GlutaMax (1:100), MEM 비필수 아미노산 용액 (1:100), 0.1 nM β머캅토에탄올, 100 U/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 내포하는 신경 배지 (NM)로 옮겼다. NM는 또한 20 ng/ml FGF2 및 20 ng/ml EGF로 19일 동안 보충되었으며, 처음 10일 동안 매일, 후속 9일 동안 격일로 배지를 교체하였다. 11일차에, 평활화 (smoothened) 효현제 SAG (1 μM)를 또한 배지에 매일 첨가하였다. 신경 전구체의 희소돌기아교세포로의 분화를 촉진하기 위하여, FGF2, EGF, IWP-2, RA, 및 SAG를 제거하고 10 ng/mL PDGF-AA, 10 ng/mL IGF-1, 5 ng/mL HGF, 25 μg/mL 인슐린, 1 μM cAMP 유사체, 60 ng/mL T3, 100 ng/mL 비오틴, 20 ng/ml BDNF 및 20 ng/ml NT3를 25일차에 시작하여 NM 배지에 첨가하였다. 배지는 25일차부터 43일차까지 격일로 교체하였다. 43 일차 이후, 구형체들은 20μg/mL 아스코르브산, 25 μg/mL 인슐린, 1μM cAMP 유사체, 60 ng/mL T3 및 100ng/mL 비오틴이 있는 NM에서 배양되었으며, 배지는 4-5 일마다 교체되었다.
결과:
도 1a-1b. 3D 배양에서 희소돌기아교세포의 유도. 51일 배양 후, 구형체들을 4% PFA에서 하룻밤 동안 고정시켰다. 구형체들을 OCT에 포매시키고, 분획하고, 희소돌기아교세포 전구 세포를 함께 식별하는 마커인 NKX2.2 및 OLIG2에 대한 항체들을 사용하여 면역형광 표지하였다. 동일한 절차를 사용하여 100-일된 hOS로부터 얻은 분획들을 고정 및 준비한 다음, 어린 및 성숙 희소돌기아교세포에 대한 표면 마커인 O4, 그리고 성숙 희소돌기아교세포에 대한 표면 마커인 O1로 면역형광 표지하였다. NKX2.2/OLIG2+ 세포들 및 다극성 O4+ 및 O1+ 세포들의 존재는 희소돌기아교세포 전구 세포 및 성숙 희소돌기아교세포 모두가 상기 기재된 방법에 의해 유도된 인간 구형체에 존재함을 제시한다.
도 1c-e. 3D 배양에서 세포 유형들 간의 상호작용. 115-일된 hOS로부터 분획들을 준비하였으며 MBP- 수초의 형성에 관여하는 단백질이며 성숙 희소돌기아교세포의 마커, GFAP- 성상세포에 대한 마커, 및 신경필라멘트- 축삭에 대한 마커에 대한 항체들로 표지하였다. MBP+와 GFAP+ 과정들 간의 중첩은 희소돌기아교세포-성상세포 상호작용을 나타낸다. 신경필라멘트+ 과정들을 둘러싸는 MBP+ 과정들의 감싸기는 115-일된 hOS에서 희소돌기아교세포가 축삭을 감싸고 있음을 제시한다.
도 1f. 인간 hiPSC-유래 3D 배양 (hOS)에서 수초화. 배양 100일 후, 상기 기재된 방법에 의해 유도된 구형체들을 고정시키고 투과 전자 현미경 처리하였다. 축삭을 둘러싸고 있는 고리형 층들의 존재는 수초화와 일치한다.
중요성 및 응용
수초화는 정상적인 뇌 기능에 필수적이며, 수초화에 있어서의 이상은 수많은 신경계 장애의 기초가 된다. 본 발명의 방법에서 설명된 인간 신경 3D 구형체는 최초로 수초화 희소돌기아교세포를 포함하고 건강한 그리고 질병중인 수초화 과정을 체계적으로 연구하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 이 프로토콜에서 사용된 hiPSC가 탈수초화 장애를 가진 환자의 피부 세포로부터 직접 재프로그래밍 될 수 있기 때문에 질병 모델링에 특히 적합하다. 또한, 상기 방법의 확장성으로 인해, 이들 배양물은 또한 건강한 그리고 질병-특이적 맥락 모두에서 수초화에 영향을 미치는 화합물을 식별하기 위한 약물 스크리닝에 사용될 수있다. 또한, 이것은 인간 발달에서, 뉴런과 희소돌기아교세포 사이, 희소돌기아교세포와 성상세포 사이, 등의 중요한 세포-세포 상호작용을 연구할 수 있게 하는 최초의 시스템이다. 마지막으로, 이들 배양물에서 유래한 희소돌기아교세포는 탈수초화 장애의 향후 치료에서 이식을 위한 세포의 공급원이 될 수 있다.
전술한 내용은 단순히 본 발명의 원리를 설명한다. 해당 분야의 숙련된 기술자는 본 명세서에서 명시적으로 설명 또는 도시되지는 않았지만 본 발명의 원리를 구현하고 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 구성을 고안 할 수 있음을 이해할 것이다. 또한 본 명세서에서 언급된 모든 실시예들 및 조건부 언어들은 원칙적으로 독자들이 본 발명의 원리 및 발명자들이 본 발명의 기술을 발전시키기 위해 기여한 개념을 이해하는 것을 돕고자 하는 것이며, 이러한 구체적으로 언급된 실시예 및 조건들에 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 더욱이, 본 발명의 원리, 양상 및 구체예 및 이의 특정 구체예들을 언급하는 모든 진술은 그 구조적 및 기능적 균등물을 모두 포함하는 것으로 한다 또한, 이러한 균등물은 현재 알려진 균등물 및 장래에 개발될 균등물, 즉, 구조에 관계없이 동일한 기능을 수행하는 모든 요소를 포함하는 것으로 한다. 그러므로 본 발명의 범위는 본 명세서에 제시되고 설명된 예시적 실시예들에 제한되는 것이 아니다. 그보다, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구범위에 의해 구체화된다.

Claims (19)

  1. 다음을 포함하는, 시험관내 인간 희소돌기아교세포 제조 방법:
    만능성 줄기 세포 현탁액 배양물에서 신경 운명을 유도하여, 신경 전구 세포의 구형체를 제공하는 단계;
    구형체에서 신경 전구 세포를 분화시켜, 희소돌기아교세포를 포함하는 인간 희소돌기-구형체 (hOS)를 분화시키는 단계;
    hOS 구형체를 장기화된 시기 동안 신경 배지에서 유지시켜 수초화 희소돌기아교세포, 뉴런 및 성상세포를 포함하는 배양물을 유도하는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 수초 장애와 관련된 최소한 하나의 대립유전자를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 1-2 중 어느 하나에 있어서, 상기 만능성 줄기 세포는 유도된 만능성 줄기 세포임을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1-3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능성 줄기 세포 현탁액 배양물은 유효 용량의 BMP 저해제 및 TGFβ 저해제를 포함하는 배지에서 만능성 줄기 세포의 무손상 콜로니들을 배양함으로써 신경 운명으로 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 만능성 줄기 세포를 신경 운명으로 유도함에 효과적인 용량의 도르소몰핀 및 SB-431542를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 현탁액 배양물은 지지세포층이 없음을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 배지는 유효량의 wnt 저해제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 세포들은 신경 전구 세포를 유지함에 효과적인 용량의 FGF2 및 EGF를 포함하는 신경 배지에서의 배양에 의해 신경 전구체로 분화됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 소닉 헤지호그 경로 효현제 및 레티노산으로 또는 소닉 헤지호그 경로 효현제 및 Wnt 저해제로 구형체를 패턴화하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, FGF2 및 EGF가 없고, PDGF-AA, IGF-1, HGF, BDNF, NT3, 인슐린, cAMP, T3, 및 비오틴의 유효량을 포함하는 신경 배지에서의 배양에 의해 신경 전구체를 희소돌기아교세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 성장 인자들은 없으나 아스코르브산, 인슐린, cAMP, T3, 및 비오틴을 포함하는 신경 배지에서 장기 시기 동안 희소돌기-구형체를 유지시키는 단계를 추가로 포함하여 제조됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 유세포 분석, 자기 면역선택법, 또는 면역패닝법에 의해 피질 구로부터 희소돌기아교세포를 단리하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 단리된 희소돌기아교세포는 후보 물질 또는 관심 치료에 노출됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 희소돌기아교세포는 뉴런 또는 뉴런 전구 세포와 조합됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 9 또는 10의 방법에 의해 수득된 희소돌기아교세포의 모집단.
  16. 다음을 포함하는, 인간 희소돌기아교세포에 대한 후보 물질의 효과를 결정하는 방법: 후보 물질을 청구항 9 또는 10의 방법에 따라 유도된 인간 만능성 줄기 세포 (hiPSC)로부터 분화된 성상세포 중 하나 또는 이들의 패널과 접촉시키는 단계, 이 때 희소돌기아교세포는 신경 질환과 연관된 돌연변이를 인코드하는 최소한 하나의 대립유전자를 선택적으로 포함하고; 및 형태학적, 유전적 또는 기능적 매개변수들에 대한 상기 물질의 효과를 결정하는 단계.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 후보 물질은 면역 효과기 세포 또는 면역 조절 물질임을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 희소돌기아교세포의 패널은 상이한 유전자형을 가지는 최소한 2개의 성상세포를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 희소돌기아교세포의 패널은 상이한 환경 조건하의 희소돌기아교세포를 포함함을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021235848A1 (ko) * 2020-05-20 2021-11-25 고려대학교 산학협력단 희소돌기아교세포로 분화가 특화된 신경줄기세포로부터 희소돌기아교세포를 포함하는 오가노이드의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 오가노이드 및 이의 용도
KR20220112508A (ko) 2021-02-04 2022-08-11 한국과학기술원 고분자 박막이 코팅된 소수성 기판을 이용한 뇌 아교세포 분리 배양 방법

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210163888A1 (en) * 2018-04-17 2021-06-03 Case Western Reserve University Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids
US20210261924A1 (en) * 2018-06-22 2021-08-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Functional cortico-spinal-muscle assembled spheroids
US20230021826A1 (en) * 2019-12-17 2023-01-26 Corestem Co.,Ltd. Differentiation method for procuring large amount of oligodendrocytes by disassembling 3d organoids generated from human pluripotent stem cells
US20230364303A1 (en) * 2020-09-18 2023-11-16 University Of Tsukuba Nerve fascicle and method of producing nerve fascicle
CN113444787A (zh) * 2021-07-05 2021-09-28 中山大学附属第七医院(深圳) 一种自闭症的脂质生物标志物及其应用
CN115612667B (zh) * 2022-11-02 2023-09-08 广州瑞臻再生医学科技有限公司 一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质细胞的制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008013918A2 (en) * 2006-07-26 2008-01-31 Myelin Repair Foundation, Inc. Cell cycle regulation and differentiation
WO2009018587A2 (en) * 2007-07-30 2009-02-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Derivation of neural stem cells from embryonic stem cells and methods of use thereof
WO2011094738A1 (en) * 2010-02-01 2011-08-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced efficiency of induced pluripotent stem cell generation
KR20130011023A (ko) * 2011-07-20 2013-01-30 연세대학교 산학협력단 전능성 줄기세포로부터 희소돌기아교전구세포의 제조 방법
KR20170005844A (ko) * 2014-05-22 2017-01-16 뉴욕 스템 셀 파운데이션, 인코포레이티드 다능성 줄기 세포로부터 유래된 기능성 희소돌기아교세포 및 이의 제조 및 사용 방법

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2200709A1 (en) * 1994-09-23 1996-03-28 Samuel Weis In vitro models of cns function and dysfunction
US20050101014A1 (en) * 2002-07-11 2005-05-12 Keirstead Hans S. Oligodendrocytes derived from human embryonic stem cells for remyelination and treatment of spinal cord injury
US7732206B2 (en) * 2005-04-04 2010-06-08 California Institute Of Technology Oligodendrocyte determination genes and uses thereof
WO2010108126A2 (en) * 2009-03-19 2010-09-23 Fate Therapeutics, Inc. Reprogramming compositions and methods of using the same
US9453205B2 (en) * 2009-10-31 2016-09-27 Genesis Technologies Limited Methods for reprogramming cells and uses thereof
EP3502236B1 (en) * 2011-02-18 2023-08-23 The Scripps Research Institute Directed differentiation of oligodendrocyte precursor cells to a myelinating cell fate
EP3186632A1 (en) 2014-08-28 2017-07-05 Stemonix Inc. Method of fabricating cell arrays and uses thereof
US10494602B1 (en) * 2015-05-19 2019-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Functional astrocytes and cortical neurons from induced pluripotent stem cells and methods of use thereof
US11248212B2 (en) 2015-06-30 2022-02-15 StemoniX Inc. Surface energy directed cell self assembly
WO2017100705A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Robert John Petcavich Mammalian cell in vitro topological neuron network
US11054408B2 (en) 2016-05-06 2021-07-06 StemoniX Inc. Projected capacitive multi electrode eukaryotic cell array
WO2018075890A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 StemoniX Inc. Electronic neuron pain assay

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008013918A2 (en) * 2006-07-26 2008-01-31 Myelin Repair Foundation, Inc. Cell cycle regulation and differentiation
WO2009018587A2 (en) * 2007-07-30 2009-02-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Derivation of neural stem cells from embryonic stem cells and methods of use thereof
WO2011094738A1 (en) * 2010-02-01 2011-08-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced efficiency of induced pluripotent stem cell generation
KR20130011023A (ko) * 2011-07-20 2013-01-30 연세대학교 산학협력단 전능성 줄기세포로부터 희소돌기아교전구세포의 제조 방법
KR20170005844A (ko) * 2014-05-22 2017-01-16 뉴욕 스템 셀 파운데이션, 인코포레이티드 다능성 줄기 세포로부터 유래된 기능성 희소돌기아교세포 및 이의 제조 및 사용 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Brain Research, 2006, 1123권, 페이지 27-33 *
Stem cell Research & Therapy, 2016, 7권, 논문번호 146, 페이지 1-12 *
Stem Cells Translational Medicine, 2013, 2권, 페이지 862-870 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021235848A1 (ko) * 2020-05-20 2021-11-25 고려대학교 산학협력단 희소돌기아교세포로 분화가 특화된 신경줄기세포로부터 희소돌기아교세포를 포함하는 오가노이드의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 오가노이드 및 이의 용도
KR20220112508A (ko) 2021-02-04 2022-08-11 한국과학기술원 고분자 박막이 코팅된 소수성 기판을 이용한 뇌 아교세포 분리 배양 방법

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