BR112019021435A2

BR112019021435A2 - sistema de cultura neural 3d personalizado para gerar oligodendrócitos humanos e estudar mielinação in vitro

Info

Publication number: BR112019021435A2
Application number: BR112019021435A
Authority: BR
Inventors: Marton Rebecca; P Pasca Sergiu
Original assignee: Univ Leland Stanford Junior
Priority date: 2017-04-13
Filing date: 2018-04-13
Publication date: 2020-05-05
Also published as: US20180298333A1; EP3609511A1; AU2018251989A1; CA3059578A1; SG11201909501TA; EP3609511A4; JP2020519237A; US11760974B2; CN110709092A; KR102598310B1; KR20190140451A; WO2018191656A1; CN110709092B

Abstract

a presente invenção refere-se a células-tronco pluripotentes humanas que são diferenciadas in vitro em oligodendro-esferoides compreendendo oligodendrócitos para uso em análises, programas de triagem e semelhantes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para SISTEMA DE CULTURA NEURAL 3D PERSONALIZADO PARA GERAR OLIGODENDRÓCITOS HUMANOS E ESTUDAR MIELINAÇÃO IN VITRO.

Pesquisa e Desenvolvimento Patrocinados pelo Governo Federal [0001] Esta invenção foi feita com o apoio do Governo sob o contrato MH107800, concedido pelo National Institutes of Health. Ο Governo tem certos direitos na invenção.

Antecedentes da invenção [0002] O progresso na compreensão do complexo desenvolvimento do sistema nervoso central humano e na elucidação dos mecanismos de distúrbios neurológicos e psiquiátricos em pacientes foi bastante limitado pelo acesso restrito ao tecido cerebral humano funcional. Embora estudos em roedores e outros mamíferos tenham fornecido informações importantes sobre os princípios fundamentais do desenvolvimento neural, sabemos pouco sobre os processos celulares e moleculares responsáveis pela expansão maciça do cérebro anterior em primatas, nem sobre muitas de suas características humanas específicas. Nos últimos anos, uma mudança de paradigma foi alcançada no campo com a introdução da reprogramação celular, um processo durante o qual as células somáticas terminalmente diferenciadas podem ser convertidas em células-tronco pluripotentes, denominadas células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC). Essas hiPSCs podem ser geradas de qualquer indivíduo e, principalmente, podem ser direcionadas para diferenciar in vitro em todos os derivados da camada germinativa, incluindo células neurais.

[0003] Embora os métodos e a eficiência da geração de hiPSCs tenham sido significativamente aprimorados e padronizados em laboratórios, os métodos para derivar tipos específicos de células neurais e gliais continuam desafiadores. Na última década, melhorias

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2/39 na especificação neural e nos protocolos de diferenciação de célulastronco pluripotentes em monocamada levaram à geração de uma variedade de tipos de células. No entanto, é improvável que os métodos bidimensionais (2D) recapitulem a citoarquitetura do sistema nervoso tridimensional (3D) em desenvolvimento ou a complexidade e funcionalidade das redes e circuitos neurais in vivo. Além disso, esses métodos são trabalhosos e caros, têm eficiência limitada e dão origem a neurônios relativamente imaturos.

[0004] Os oligodendrócitos são células da glia no sistema nervoso central que desempenham um papel crítico na função cerebral. Os oligodendrócitos estendem processos que envolvem os axônios dos neurônios com camadas isolantes, permitindo uma transmissão mais rápida de sinais entre os neurônios. Os oligodendrócitos também desempenham um papel de suporte, fornecendo aos neurônios fatores tróficos e protegendo o ambiente extracelular. A perda de mielinização pode levar à morte de neurônios e à função neural prejudicada. Como resultado, muitas doenças humanas estão associadas a uma perda ou redução da mielinização, como esclerose múltipla ou doença da substância branca evanescente.

[0005] O estudo da mielinização em saúde e doença é limitado pela disponibilidade de modelos apropriados. Roedores são comumente usados como substitutos para estudar aspectos da biologia humana; no entanto, a mielinização é muito mais extensa no cérebro humano que no de roedores. Além disso, a disponibilidade limitada de amostras saudáveis do cérebro de pacientes humanos impede a possibilidade de estudar extensivamente a mielinização no cérebro humano. Nos últimos anos foram feitas tentativas para gerar células progenitoras de oligodendrócitos (OPC) e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas humanas (hESC, hiPSCs) para o estudo da mielinização in vitro.

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3/39 [0006] Os modelos de mielinização derivados de hESC e hiPSC não são apenas essenciais para o estudo dos processos de desenvolvimento e mielinização de oligodendrócitos em condições normais e de doença, mas também podem ser aplicados para triagem de fármacos. Esses modelos podem ser usados para rastrear compostos que corrigem anormalidades específicas relacionadas a certos estados de doença e para testar a toxicidade de novos compostos terapêuticos e substâncias químicas antes da exposição a humanos. Particularmente, no campo da neurotoxicidade, ainda faltam ensaios capazes de avaliar o comprometimento da função neuronal ou glial das células humanas.

[0007] Portanto, o desenvolvimento de plataformas de triagem in vitro que recapitulam tecidos humanos altamente funcionais, incluindo mielinização de neurônios, é de extrema importância.

[0008] Publicações. Métodos para reprogramar células somáticas diferenciadas de primatas para um estado pluripotente incluem transferência nuclear de células somáticas diferenciadas, fusão de células somáticas diferenciadas com células-tronco pluripotentes e reprogramação direta para produzir células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS) (Takahashi K, et al. (2007) Cell 131:861-872; Park IH, et al. (2008) Nature 451:141-146; Yu J, et al. (2007) Science 318:1917-1920; Kim D, et al. (2009) Cell Stem Cell 4:472-476; Soldner F, et al. (2009) Cell. 136: 964-977; Huangfu D, et al. (2008) Nature Biotechnology 26: 1269-1275; Li W, et al. (2009) Cell Stem Cell 4: 1619).

Sumário da invenção [0009] São fornecidas composições e métodos para gerar in vitro OPCs humanos e oligodendrócitos mielinizantes, que podem ser cultivados em um sistema tridimensional com neurônios do sistema nervoso central. Uma característica da invenção é a capacidade de

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4/39 gerar OPCs e oligodendrócitos a partir de amostras de pacientes, permitindo a geração relevante para a doença e a triagem das células para fármacos terapêuticos e regimes de tratamento. Os métodos utilizam células-tronco pluripotentes humanas induzidas (hiPSCs), que podem ser obtidas de amostras de pacientes ou células transportadoras, por exemplo, adipócitos, queratinócitos, fibroblastos e semelhantes. As hiPSCs são induzidas a desenvolver um destino de ectoderma in vitro e subsequentemente são diferenciados em esferoides que contêm oligodendrócitos - oligodendro-esferoides humanos (hOS), bem como progenitores neurais, astrócitos e neurônios. As populações de células podem ser isoladas do hOS ou o hOS intacto pode ser usado como modelo para interagir com as populações de células. O hOS e as células derivadas dele podem ser utilizados para transplante, para avaliação experimental, como fonte de linhagem e produtos específicos de células e semelhantes. Em algumas modalidades, as culturas de células são isentas de alimentador e isentas de xeno.

[0010] Em algumas modalidades da invenção, são fornecidas populações de OPC ou oligodendrócitos humanos purificados, incluindo, entre outros, oligodendrócitos relevantes para a doença, em que as células são diferenciadas das células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs). Em algumas modalidades, é fornecido um painel dessas células derivadas in vitro, em que o painel inclui duas ou mais células geneticamente diferentes. Em algumas modalidades, é fornecido um painel de tais células, em que as células podem ser submetidas a uma pluralidade de agentes candidatos ou a uma pluralidade de doses de um agente candidato. Os agentes candidatos incluem pequenas moléculas, isto é, fármacos, construtos genéticos que aumentam ou diminuem a expressão de um RNA de interesse, alterações elétricas e semelhantes. Em algumas modalidades, um

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5/39 painel se refere a um sistema ou método que utiliza células específicas do paciente de duas ou mais condições distintas e pode ser três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais condições geneticamente distintas.

[0011] Em algumas modalidades da invenção são fornecidos métodos para determinar a atividade de um agente candidato em oligodendrócitos do hOS, o método compreendendo o colocar o agente candidato em contato com um ou o painel de neurônios purificados, astrócitos, OPSs ou populações de oligodendrócitos diferenciadas das células-tronco pluripotentes humanas induzidas (hiPSCs). As populações de células opcionalmente compreendem pelo menos um alelo que codifica uma mutação associada ou causando uma doença mielinizante ou desmielinizante ou um distúrbio de desenvolvimento de oligodendrócitos; e determinar o efeito do agente nos parâmetros morfológicos, genéticos ou funcionais, incluindo, entre outros, o perfil da expressão genética. Os métodos de triagem podem ser combinados com células efetoras imunes para determinar a atividade dessas células imunes de oligodendrócitos e mielinização ou a interação entre oligodendrócitos, astrócitos em hOS e células imunes autólogas de pacientes. Os métodos de análise no nível de célula única são de particular interesse, por exemplo, ensaios de mielinização, expressão de gene de célula única, efeito de oligodendrócitos em neurônios ou astrócitos, transmissão de sinal de células neuronais e semelhantes. Os agentes candidatos incluem células efetoras imunes, por exemplo, células T, células microgliais, macrófagos, células NK, etc., e proteínas efetoras imunes, por exemplo, IFN-γ, TGF-β, citocinas, interferons, etc. e semelhantes, particularmente essas células e proteínas suspeitas de envolvimento em doenças inflamatórias desmielinizantes.

[0012] Os métodos da invenção utilizam as interações naturais entre células neurais e progenitores na diferenciação de

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6/39 oligodendrócitos e formação de bainhas de mielina. Em algumas modalidades, a diferenciação de hiPSCs para oligodendrócitos é realizada em meio substancialmente isento de soro.

[0013] Após diferenciação no hOS, os tipos de células individuais de interesse, incluindo e entre outros de oligodendrócitos, podem ser isolados para vários propósitos. As células são coletadas em um estágio apropriado de desenvolvimento, que pode ser determinado com base na expressão de marcadores e características fenotípicas do tipo de célula desejado. As culturas podem ser testadas empiricamente por imunocoloração ou expressão genética quanto à presença de marcadores de interesse, por determinação morfológica etc. As células são opcionalmente enriquecidas antes ou após a etapa de seleção positiva por seleção de fármaco, panning, centrifugação por gradiente de densidade, etc. Em outra modalidade, é realizada uma seleção negativa, em que a seleção é baseada na expressão de um ou mais marcadores encontrados em células humanas ES, fibroblastos, células neurais, células epiteliais e semelhantes. A seleção pode utilizar métodos de panning, seleção magnética de partículas, seleção de classificador de partículas e semelhantes.

[0014] Várias células somáticas encontram uso como fonte de hiPSCs; de particular interesse são células-tronco derivadas de adipose, fibroblastos, queratinócitos, células sanguíneas periféricas e semelhantes. O uso de hiPSCs de indivíduos de genótipos variados, particularmente genótipos potencialmente associados a distúrbios neurológicos e psiquiátricos, é de particular interesse. As hiPSCs são dissociadas como células únicas, agregadas em esferoides de números específicos de células e depois crescidas em suspensão; depois induzidas a um destino neural por inibição das vias de BMP e TGFp. Os esferoides são então movidos para o meio na presença de FGF2 e EGF e são padronizados com inibidores da via Wnt ou ácido retinoico, bem

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7/39 como ativadores da via sônica de hedgehog. Para promover a diferenciação, os esferoides são alterados para meio compreendendo PDGF-AA, IGF-1, HGF, insulina, BDNF, NT3, cAMP, T3 e biotina. Após essa cultura, os esferoides podem ser mantidos por longos períodos de tempo em meio neural contendo insulina, ácido ascórbico, cAMP, T3 e biotina na ausência de fatores de crescimento, por exemplo, por períodos de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses ou mais.

[0015] Estes e outros objetos, vantagens e características da invenção se tornarão evidentes para os versados na técnica após a leitura dos detalhes dos métodos e composições em questão, conforme descrito mais detalhadamente a seguir.

Breve descrição dos desenhos [0016] A invenção é mais bem compreendida a partir da descrição detalhada a seguir, quando lida em conjunto com os desenhos anexos. É enfatizado que, de acordo com a prática comum, as várias características dos desenhos não estão em escala. Pelo contrário, as dimensões das várias características são arbitrariamente expandidas ou reduzidas para maior clareza. As seguintes figuras estão incluídas nos desenhos.

[0017] FIG. 1a-1f. FIG. 1a Células progenitoras de oligodendrócitos e oligodendrócitos maduros produzidos em oligoesferoides derivados de iPSC 3D humanos (hOS). As células progenitoras de oligodendrócitos NKX2. 2/OLIG2⁺ estão presentes em seções fixas de hOS com 51 dias. FIG. 1b Exemplos de oligodendrócitos O4⁺ e 01 ⁺ em seções fixas de hOS com 100 dias. FIG. 1c Marcação imunofluorescente demonstrando a distribuição de oligodendrócitos maduros de MBP⁺ em seções fixas de hOS com 115 dias. FIG. 1d Exemplos de processos de oligodendrócitos de MBP⁺ e processos de astrócitos de GFAP + interagindo fisicamente em seções fixas em hOS de 115 dias. FIG. 1e Exemplo de processos de oligodendrócitos MBP⁺

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8/39 envolvendo neurofilamento + axônios em seções fixas de hOS com 115 dias. FIG. 1f Exemplos de mielinização em hOS humanos derivados de iPSC. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de axônios mielinizados foram tiradas no dia 100 in vitro.

Descrição detalhada da invenção [0018] Antes de as presentes composições e métodos serem descritos, deve-se entender que esta invenção não está limitada a composições e métodos específicos descritos, pois tais podem, é claro, variar. Também deve-se entender que a terminologia utilizada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares somente e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações anexas. [0019] Quando uma faixa de valores é provida, entende-se que cada valor interveniente, para o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto indique claramente o contrário, entre os limites superior e inferior dessa faixa também é especificamente divulgado. Cada intervalo menor entre qualquer valor declarado ou valor interveniente em um intervalo declarado e qualquer outro valor declarado ou interveniente nesse intervalo declarado é englobado dentro desta invenção. Os limites superior e inferior desses intervalos menores podem ser incluídos ou excluídos de forma independente no intervalo, e cada intervalo em que um ou outro ou ambos os limites são incluídos nos intervalos menores também está incluído nesta invenção, sujeito a qualquer limite especificamente excluído no intervalo declarado. Onde a faixa indicada inclui um ou ambos os limites, as faixas excluindo qualquer um ou ambos os limites incluídos também são incluídas na invenção.

[0020] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um versado na técnica

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9/39 à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, alguns métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas neste documento por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão com os quais as publicações são citadas. Entende-se que a presente divulgação substitui qualquer divulgação de uma publicação incorporada na medida em que existe uma contradição.

[0021] Deve-se observar que como usado neste documento e na reivindicação anexa, as formas singulares um, uma, o e a incluem referência plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a um polipeptídeo de fator de reprogramação inclui uma pluralidade de tais polipeptídeos e a referência a células-tronco pluripotentes induzidas inclui referência a uma ou mais células-tronco pluripotentes induzidase equivalentes das mesmas conhecidas pelos versados na técnica e assim por diante.

[0022] As publicações discutidas aqui são fornecidas unicamente para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não é intitulada para preceder tal publicação em virtude de invenção prévia. Adicionalmente, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais que podem precisar ser confirmadas de forma independente.

Definições [0023] Por pluripotência e células-tronco pluripotentes, entendese que essas células têm a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células de um organismo. O termo célula-tronco pluripotente induzida abrange células pluripotentes que, como as células-tronco embrionárias (ESC), podem ser cultivadas por um longo período de

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10/39 tempo, mantendo a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células de um organismo, mas que, diferente das ESCs são derivadas de células somáticas diferenciadas, ou seja, células que possuem um potencial mais estreito e definido e que, na ausência de manipulação experimental, não podem dar origem a todos os tipos de células no organismo. A hiPSC possui uma morfologia semelhante à ESC humana, crescendo como colônias planas com grandes proporções nucleocitoplasmáticas, bordas definidas e núcleos proeminentes. Além disso, a hiPSC expressa vários marcadores de pluripotência conhecidos por um versado na técnica incluindo, entre outros, fosfatase alcalina, SSEA3, SSEA4, SOX2, OCT3/4, NANOG, TRA-160, TRA-181, TDGF1, DNMT3B, TERT e ZFP42. Além disso, a hiPSC é capaz de formar teratomas. Elas são capazes de formar ou contribuir para tecidos de ectoderma, mesoderma ou endoderme em um organismo vivo.

[0024] Como usado aqui, fatores de reprogramação se refere a um ou mais, ou seja, um coquetel, de fatores biologicamente ativos que atuam em uma célula para alterar a transcrição, reprogramando assim uma célula para multipotência ou pluripotência. Os fatores de reprogramação podem ser fornecidos às células, por exemplo, células de um indivíduo com histórico familiar ou constituição genética de interesse para doenças cardíacas, como fibroblastos, adipócitos, etc . ; individualmente ou como uma composição única, ou seja, como uma composição pré-misturada, de fatores de reprogramação. Os fatores podem ser fornecidos na mesma razão molar ou em diferentes razões molares. Os fatores podem ser fornecidos uma ou várias vezes no transcorrer da cultura das células da presente invenção. Em algumas modalidades, o fator de reprogramação é um fator de transcrição incluindo, entre outros, Oct3/4; SOX2; KLF3; c-MYC; NANOG; e LIN-28. [0025] As células somáticas são colocadas em contato com fatores de reprogramação, conforme definido anteriormente, em uma

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11/39 combinação e quantidade suficientes para reprogramar a célula para pluripotência. Os fatores de reprogramação podem ser fornecidos às células somáticas individualmente ou como uma composição única, isto é, como uma composição pré-misturada, dos fatores de reprogramação. Em algumas modalidades, os fatores de reprogramação são fornecidos como uma pluralidade de sequências de codificação em um vetor. As células somáticas podem ser fibroblastos, adipócitos, células estromais e semelhantes, como conhecido na técnica. As células somáticas ou hiPSC podem ser obtidas de bancos de células, de doadores normais, de indivíduos com uma doença neurológica ou psiquiátrica de interesse, etc.

[0026] Após a indução da pluripotência, a hiPSC é cultivada de acordo com qualquer método conveniente, por exemplo, em células alimentadoras irradiadas e em meio comercialmente disponível. A hiPSC pode ser dissociada dos alimentadores digerindo com protease, por exemplo, acutase, preferivelmente em uma concentração e por um período de tempo suficiente para separar células únicas da placa.

[0027] Os genes podem ser introduzidos nas células somáticas ou na hiPSC derivadas delas para uma variedade de finalidades, por exemplo, substituir genes com perda de mutação da função, fornecer genes marcadores etc. Alternativamente, são introduzidos vetores que expressam mRNA ou ribozimas antissenso, bloqueando assim a expressão de um gene indesejado. Outros métodos de terapia genética são a introdução de genes de resistência a fármacos para permitir que células progenitoras normais tenham uma vantagem e estejam sujeitas a pressão seletiva, por exemplo, o gene de resistência a múltiplos fármacos (MDR) ou genes antiapoptose, como BCL-2. Várias técnicas conhecidas na técnica podem ser utilizadas para introduzir ácidos nucleicos nas células alvo, por exemplo, eletroporação, DNA precipitado com cálcio, fusão, transfecção, lipofecção, infecção e semelhantes,

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12/39 como discutido anteriormente. A maneira particular pela qual o DNA é introduzido não é crítica para a prática da invenção.

[0028] Os termos oligodendrócitos, célula progenitora de oligodendrócitos etc. podem abranger células da linhagem de oligodendrócitos, isto é, células progenitoras neurais que acabam por dar origem a oligodendrócitos, células precursoras de oligodendrócitos e oligodendrócitos maduros e mielinizantes que, para os fins da presente invenção surgem de uma célula não oligodendrócita por manipulação experimental. Os oligodendrócitos podem ser identificados por marcadores específicos para células da linhagem de oligodendrócitos, como discutido a seguir. Os oligodendrócitos podem ter características funcionais, ou seja, podem ter a capacidade de mielinizar neurônios; e semelhantes. Um precursor de oligodendrócito ou célula progenitora de oligodendrócitos é definido como uma célula capaz de dar origem a progênies que incluem oligodendrócitos.

[0029] Os oligodendrócitos são as células formadoras de mielina do sistema nervoso central. Um oligodendrócito se estende a muitos processos que entram em contato e envolvem repetidamente trechos de axônios. A condensação subsequente dessas camadas envolvidas da membrana de oligodendrócitos forma a bainha de mielina. Um axônio pode conter segmentos de mielina de muitos oligodendrócitos diferentes.

[0030] A mielinização requer inúmeras etapas sequenciais na maturação da linhagem celular oligodendroglial. Essas etapas são acompanhadas por alterações coordenadas na expressão de antígenos da superfície celular. Os marcadores de células progenitoras de oligodendrócitos incluem, por exemplo, receptor α do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-α). Os outros marcadores de oligodendrócitos incluem Nestina, proteína proteolipídica; forma polissialilada da molécula de adesão de células neurais (NCAM),

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13/39 gangliosídeo GD3 e anidrase carbônica II (CA-II). Alguns marcadores, como CA-II, cobrem todos os estágios da linhagem e também são marcadores de oligodendrócitos adultos. As galactosilceramidas e as sulfogalactosilceramidas também são marcadores precoces que permanecem presentes na superfície dos oligodendrócitos maduros. Outros genes que codificam proteínas específicas da mielina são expressos em diferentes estágios de diferenciação e maturação de oligodendrócitos. Por exemplo, os genes 2 ', 3'-nucleotídeo cíclico-3'fosfo-hidrolase (CNP), proteína básica de mielina (MBP), PLP/DM-20, glicoproteína associada à mielina (MAG) e glicoproteína da mielina/oligodendrócitos (MOG), bem como outras proteínas menores de mielina são todos marcadores para oligodendrócitos maduros.

[0031] Especula-se que são necessários vários fatores para a maturação e sobrevivência dos oligodendrócitos. Estes fatores podem ser testados com as culturas de oligodendrócitos humanos da presente invenção. Os fatores de interesse podem incluir PDGF, FGF básico, fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I), neurotrofina 3 (NT3), fator de crescimento glial (GGF), fator neurotrófico ciliar (CNTF), IL6, fator de crescimento transformador (TGF)-p e IL-2.

[0032] A bainha de mielina constitui a estrutura de membrana mais abundante no sistema nervoso dos vertebrados. A abundância de lipídios e o baixo teor de água na mielina permitem o isolamento elétrico dos axônios, e a estrutura segmentar única das regiões mielinizadas é responsável pela condução saltatória dos impulsos nervosos. Isso permite que a bainha de mielina suporte a condução nervosa rápida nos axônios relativamente finos do sistema nervoso central dos vertebrados. A condução em alta velocidade, a fidelidade da sinalização de transferência em longas distâncias e a economia espacial são as principais vantagens conferidas ao sistema nervoso dos vertebrados pela bainha de mielina.

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14/39 [0033] O mecanismo de mielinização e os sinais que regulam esse processo complexo podem ser estudados com as células e a cultura da presente invenção. Existem etapas sequenciais que envolvem a migração de oligodendrócitos para axônios que devem ser mielinizados dentro dos esferoides 3D; a adesão do processo oligodendrócito ao axônio; e a espiralização do processo ao redor do axônio, com um número predeterminado de bainhas de mielina e o reconhecimento do espaço a não ser mielinizado. Cada uma dessas etapas pode ser estudada e manipulada em células vivas na invenção proposta. Além disso, a interação entre oligodendrócitos e astrócitos durante o desenvolvimento pode ser estudada nos esferoides 3D aqui apresentados. A longa vida de cultura dos esferoides também permite o estudo da plasticidade da mielina e alterações nessas interações ao longo do tempo.

[0034] A migração de oligodendrócitos entre regiões do cérebro também pode ser estudada na invenção proposta. Durante o desenvolvimento do cérebro, ondas precoces de oligodendrócitos são produzidas no subpálio e migram para o córtex, ou pálio. Os esferoides contendo oligodendrócitos podem ser fundidos com esferoides corticais para modelar a dinâmica migratória, sinais direcionais e sinais opostos que governam a migração de oligodendrócitos para o córtex. Este sistema também pode ser usado para estudar doenças nas quais a migração ou distribuição anormal de oligodendrócitos pode desempenhar um papel. É provável que a migração de oligodendrócitos seja mais bem preservada no modelo 3D proposto, pois os oligodendrócitos in vivo migram através dos tecidos, em oposição a uma superfície plana, como nos modelos de oligodendrócitos 2D.

[0035] Além de vários usos como células cultivadas in vitro, os oligodendrócitos podem ser testados em um modelo animal adequado. Em um nível, as células são avaliadas quanto à sua capacidade de

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15/39 sobreviver e manter seu fenótipo in vivo. As composições celulares são administradas a animais imunodeficientes (como camundongos nude ou animais imunodeficientes quimicamente ou por irradiação). Os tecidos são coletados após um período de recrescimento e avaliados quanto à presença de células ou progênie administradas ainda presentes e podem ser fenotipados para resposta a um tratamento de interesse. A adequação também pode ser determinada em um modelo animal, avaliando o grau de recuperação que se segue após a lesão ou em um contexto de doença como resultado do tratamento com as células diferenciadoras da invenção.

[0036] Relevância da doença. Várias patologias estão associadas à disfunção de oligodendrócitos. As doenças hereditárias da mielina em humanos, leucodistrofias, podem ser o resultado da dismielinização, hipomielinização ou desmielinização. A dismielinização e hipomielinização são falhas no mielinato que ocorrem durante a vida fetal ou na primeira infância, como observado em diferentes formas da doença de Pelizaeus-Merzbacher. A desmielinização, a degradação da mielina, é característica das leucodistrofias metabólicas, como doença de Krabbe, leucodistrofia metacromática, ALD, doença de Canavan, doença de Alexander, leucodistrofia ortocromática ou distúrbios mitocondriais. A dismielinização e a desmielinização podem ser combinadas em algumas formas de leucodistrofias.

[0037] Algumas doenças genéticas podem dar origem a leucoencefalopatias nas quais a desmielinização é secundária a alterações vasculares, mitocondriais ou neuronais ou pode estar ligada a uma doença metabólica que pode ter sinais onipresentes. A arteriopatia autossômica dominante cerebral com infarto subcortical e leucoencefalopatia (CADASIL) é uma arteriopatia cerebral autossômica dominante. A MRI evidencia múltiplos infartos subcorticais, com desmielinização da substância branca que pode ser mais ou menos

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16/39 extensa. MELAS (miopatia mitocondrial, encefalopatia, acidose lática, episódios parecidos a um acidente vascular cerebral) apresenta uma acidose lática com um aumento da razão lactato/piruvato no soro e no CSF. MRI mostra que modificações da substância branca estão presentes juntamente com atrofia cortical.

[0038] A fenilcetonúria pode estar associada à desmielinização. As anormalidades do metabolismo intermediário também podem causar desmielinização. Algumas doenças genéticas neuronais podem afetar a mielina (gangliosidoses GM2, doença de Wilson e doenças degenerativas do CNS).

[0039] A quebra da barreira hematoencefálica é um evento primário nas manifestações patológicas da doença desmielinizante do CNS, como esclerose múltipla (MS), formas desmielinizantes de EAE e desmielinização induzida por vírus. As células T desempenham um papel central nesse processo. O acesso de células T ativadas ao CNS pode ser responsável pela liberação de células inflamatórias, macrófagos e microglia e de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNFα e interferon-γ.

[0040] Os termos tratamento, tratando e tratar e semelhantes são usados no presente documento para se referir geralmente à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir completa ou parcialmente uma doença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de uma estabilização ou cura parcial ou completa de uma doença e/ou efeito adverso atribuído à doença. Tratamento, conforme usado neste documento, cobre qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, particularmente em um humano e inclui:(a) prevenir que a doença ou sintoma ocorra em um indivíduo que pode ser predisposto à doença ou sintoma, mas ainda não foi diagnosticado como tendo; (b) inibir o sintoma da doença, isto é, impedir o seu desenvolvimento; ou (c)

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17/39 aliviar o sintoma da doença, isto é, provocar a regressão da doença ou sintoma.

[0041] Os termos indivíduo, sujeito, hospedeiro e paciente são aqui utilizados indistintamente e se referem a qualquer indivíduo mamífero para quem o diagnóstico, tratamento ou terapia é desejado, particularmente humanos.

Métodos da invenção [0042] São fornecidos métodos para obter e utilizar as culturas de células in vitro de oligodendroesferoides humanos (hOS) e células compreendidas neles, incluindo especificamente oligodendrócitos e neurônios, em que as células são diferenciadas de células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC). Em algumas modalidades, a hiPSC é derivada de células somáticas obtidas de indivíduos neurologicamente normais. Em outras modalidades, a hiPSC é derivada de células somáticas obtidas de um indivíduo compreendendo pelo menos um alelo que codifica uma mutação associada a uma doença neural incluindo, entre outros, as doenças associadas à mielinização descritas anteriormente. Em algumas modalidades é fornecido um painel de tais oligodendrócitos, em que o painel inclui dois ou mais oligodendrócitos geneticamente diferentes. Em algumas modalidades é fornecido um painel de tais oligodendrócitos, em que os oligodendrócitos são submetidos a uma pluralidade de agentes candidatos ou outra intervenção terapêutica ou a uma pluralidade de doses de um agente candidato ou outra intervenção terapêutica. Os agentes candidatos incluem, entre outros, moléculas pequenas, isto é, fármacos, construtos genéticos que aumentam ou diminuem a expressão de um RNA de interesse, alterações elétricas e semelhantes.

[0043] Também são fornecidos métodos para determinar a atividade de um agente candidato em uma célula relevante para a doença, o método compreendendo o colocar o agente candidato em

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18/39 contato com um ou o painel de células diferenciado das células-tronco pluripotentes humanas, por exemplo, diferenciado do hESC ou da hiPSC, em que células-tronco pluripotentes opcionalmente compreendem pelo menos um alelo que codifica uma mutação associada a uma doença neural; e determinar o efeito do agente nos parâmetros morfológicos, genéticos ou funcionais incluindo, entre outros, o perfil da expressão genética. Além dos modelos de doenças genéticas, esses métodos podem ser aplicados a manipulações ambientais que influenciam a maturação e mielinização de oligodendrócitos incluindo, entre outras, alterações na tensão de oxigênio, temperatura e a força aplicada.

[0044] A geração de oligodendroesferoides humanos (hOS) e as células compreendidas nos mesmos incluindo, por exemplo, progenitores neurais, células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs), astrócitos, oligodendrócitos mielinizantes e neurônios de células somáticas utilizam um processo de várias etapas. Inicialmente, a hiPSC pode ser obtida de qualquer fonte conveniente ou pode ser gerada de células somáticas usando métodos reconhecidos na técnica. As hiPSC são dissociadas dos alimentadores e crescidas em cultura em suspensão na ausência de FGF2, preferivelmente quando dissociadas como células únicas. Em determinadas modalidades, a cultura é isenta de camada alimentadora, por exemplo, quando cultivada em vasos revestidos com vitronectina e a hiPSC é dissociada como uma suspensão de célula única e agregada em esferoides de tamanhos específicos. A cultura pode ainda ser isenta de componentes não humanos, ou seja, isenta de xeno. O crescimento da suspensão inclui opcionalmente, no meio de cultura, uma dose eficaz de um inibidor seletivo da quinase associada à Rho (ROCK) durante o período inicial da cultura, por até cerca de 6 horas, cerca de 12 horas, cerca de 18 horas, cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas (ver, por

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19/39 exemplo, Watanabe et al. (2007) Nature Biotechnology 25: 681 686). Inibidores úteis para esse fim incluem, sem limitação, Y-27632; Tiazovivina (Cell Res, 2013, 23 (10): 1187-200; Fasudil (HA-1077) HCI (J Clin Invest, 2014, 124 (9): 3757-66); GSK429286A (Proc Natl Acad Sci USA, 2014) 111 (12): E1140-8); RKI-1447; AT13148; etc.

[0045] A cultura de suspensão da hiPSC é então induzida a um destino neural. Essa cultura pode ser isenta de alimentador. Para indução neural, uma dose eficaz de um inibidor das vias BMP e TGFp é adicionada ao meio, por um período de pelo menos cerca de 2 dias, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 4 dias, pelo menos cerca de 5 dias e até aproximadamente 10 dias, até aproximadamente 9 dias, até aproximadamente 8 dias, até aproximadamente 7 dias, até aproximadamente 6 dias, até aproximadamente 5 dias. Por exemplo, a dorsomorfina (DM) pode ser adicionada a uma dose eficaz de pelo menos cerca de 0,1 μΜ, pelo menos cerca de 1 μΜ, pelo menos cerca de 5 μΜ, pelo menos cerca de 10 μΜ, pelo menos cerca de 50 μΜ, até uma concentração de cerca de 100 μΜ, que inibe os receptores do tipo I da proteína morfogenética óssea (BMP) (ALK2, ALK3 e ALK6). Outros inibidores úteis da BMP incluem, entre outros, A 83-01; DMH-1; K 02288; ML 347; SB 505124; etc. SB-431542 pode ser adicionado a uma dose eficaz de pelo menos cerca de 0,1 μΜ, pelo menos cerca de 1 μΜ, pelo menos cerca de 5 μΜ, pelo menos cerca de 10 μΜ, pelo menos cerca de 50 μΜ, até concentração de cerca de 100 μΜ, que inibe a sinalização de TGFp, mas não tem efeito na sinalização de BMP. Outros inibidores úteis de TGFp incluem, entre outros, LDN-193189 (J Clin Invest, 2015, 125(2):796-808); Galunisertib (LY2157299) (Cancer Res, 2014, 74(21):5963-77); LY2109761 (Toxicology, 2014, 326C:9-17); SB525334 (Cell Signal, 2014, 26( 12):3027-35); SD-208; EW-7197; Kartogenin; DMH1; LDN-212854; ML347; LDN-193189 HCI (Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(52):E5039-48); SB505124; Pirfenidona

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20/39 (Histochem Cell Biol, 2014, 10.1007/s00418-014-1223-0); RepSox; K02288; Hesperetina; GW788388; LY364947, etc.

[0046] Uma dose eficaz de um inibidor de Wnt pode ser incluída no meio de cultura começando no dia 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, por exemplo, em uma concentração de cerca de 0,1 μΜ a cerca de 100 μΜ e pode ser de cerca de 1 μΜ a cerca de 25 μΜ, dependendo da atividade do inibidor selecionado. Os inibidores exemplares incluem, entre outros, o XAV939 inibe seletivamente a transcrição mediada por Wnt/p-catenina através da inibição de tanquirase1/2 com IC50 de 11 nM/4 nM em ensaios sem células; O ICG-001 antagonize a transcrição mediada por Wnt/p-catenina/TCF e se liga especificamente à proteína de ligação ao elemento (CBP) com IC50 de 3 μΜ; IWR-1-endo é um inibidor da via Wnt com IC50 de 180 nM em células L que expressam Wnt3A, induz os níveis de proteína Axin2 e promove a fosforilação da β-catenina estabilizando os complexos de destruição por andaimes Axin; Wnt-C59 (C59) é um inibidor de PORCN para a ativação mediada por Wnt3A de um local de ligação a TCF multimerizado que gera luciferase com IC50 de 74 pM em células HEK293; LGK-974 é um inibidor PORCN potente e específico, e inibe a sinalização Wnt com IC50 de 0,4 nM nas células TM3; KY02111 promove a diferenciação de hPSCs para cardiomiócitos por inibir a sinalização de Wnt, podendo atuar a jusante de APC e GSK3P; IWP-2 é um inibidor do processamento e secreção de Wnt com IC50 de 27 nM em um ensaio sem células, bloqueio seletivo da palmitoilação de Wnt mediada por Porcn não afeta a Wnt/p-catenina em geral e não mostra efeito contra Wnt estimulado respostas celulares; IWP-L6 é um inibidor de Porcn altamente potente com EC50 de 0,5 nM; WIKI4 é um novo inibidor de Tanquirase com IC50 de 15 nM para TNKS2 e leva à inibição da sinalização de Wnt/beta-catenina; O FH535 é um inibidor da sinalização de Wnt/p-catenina e também um antagonista duplo do PPARy e PPARõ. Em vez de um inibidor de Wnt,

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21/39 o ácido retinoico pode ser incluído nos meios de cultura em concentrações que variam de 10 nM a 1 μΜ.

[0047] Os agonistas da via sônica de hedgehog também podem ser adicionados a partir dos dias 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Os agonistas potenciais incluem SAG e purmorfamina, usados em concentrações que variam de 100 nm a 10 μΜ.

[0048] Após cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, cerca de 8 dias, cerca de 9 dias, cerca de 10 dias em cultura em suspensão, os esferoides flutuantes são movidos para meios neurais para diferenciar progenitores neurais. O meio é suplementado com uma dose eficaz de FGF2 e EGF. Os fatores de crescimento podem ser fornecidos em uma concentração para cada um de pelo menos cerca de 0,5 ng/mL, pelo menos cerca de 1 ng/mL, pelo menos cerca de 5 ng/mL, pelo menos cerca de 10 ng/mL, pelo menos cerca de 20 ng/mL, até cerca de 500 ng/mL, até cerca de 250 ng/mL, até cerca de 100 ng/mL.

[0049] Para promover a diferenciação de progenitores iniciais em oligodendrócitos, após cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas após a exposição ao FGF2/EGF, o meio neural é alterado para substituir o FGF2, EGF, IWP-2 e SAG por uma dose eficaz de PDGF-AA, IGF-1, HGF, BDNF e NT3. Os fatores de crescimento podem ser fornecidos em uma concentração para cada um de pelo menos cerca de 0,5 ng/mL, pelo menos cerca de 1 ng/mL, pelo menos cerca de 5 ng/mL, pelo menos cerca de 10 ng/mL, pelo menos cerca de 20 ng/mL, até cerca de 500 ng/mL, até cerca de 250 ng/mL, até cerca de 100 ng/mL. O meio pode ainda compreender, por exemplo, insulina, T3, análogo de cAMP, biotina, etc., para insulina a uma concentração de até cerca de 50 pg/mL, até cerca de 25 pg/mL.

[0050] Após cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas após a exposição a fatores de diferenciação, as esferas podem ser mantidas por longos períodos de

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22/39 tempo no meio neural na ausência de fatores de crescimento, por exemplo, por períodos de 1, 2, 3, 4, 5,6,7,8,9, 10, 11, 12 meses ou mais. O meio neural pode compreender ácido ascórbico, 25 pg/mL de insulina, análogo de 1 μΜ cAMP, 60 ng/mL de T3 e 100 ng/mL de biotina, com mudanças de meio a cada 4 a 5 dias.

[0051] As populações de células podem ser isoladas das esferas por qualquer método conveniente incluindo citometria de fluxo, imunosseleção magnética, imunopanning, etc. Convenientemente, PDGFR e/ou MBP são utilizados como marcadores de seleção positiva para progenitores e oligodendrócitos de oligodendrócitos, respectivamente. As células assim isoladas podem ser ressuspensas em um meio aceitável e mantidas em cultura, congeladas, analisadas quanto a parâmetros de interesse; transplantadas para um modelo humano ou animal; e semelhante. As populações de células progenitoras de oligodendrócitos ou oligodendrócitos são de interesse, por exemplo, em métodos de remielinização de neurônios do CNS, por exemplo, no recrescimento de neurônios após danos traumáticos, no tratamento terapêutico de doenças desmielinizantes, como esclerose múltipla e semelhantes, em que uma dose eficaz de células é fornecida a um paciente em necessidade.

Ensaios de varredura [0052] Em ensaios de triagem para moléculas pequenas, o efeito da adição de um agente candidato a células em cultura é testado com um painel de células e ambientes celulares, em que o ambiente celular inclui um ou mais dos seguintes itens: estimulação elétrica, incluindo alterações na ionicidade, estimulação com um candidato a agente de interesse, contato com outras células, incluindo, entre outras, neurônios e progenitores neurais, células efetoras imunológicas, como células T, células microgliais, macrófagos, etc. e semelhantes e em que os painéis de oligodendrócitos podem variar em genótipo, em exposição prévia a

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23/39 um ambiente de interesse, na dose de agente fornecida, etc. Geralmente, pelo menos um controle é incluído, por exemplo, um controle negativo e um controle positivo. A cultura de células é tipicamente realizada em um ambiente estéril, por exemplo, a 37° C em uma incubadora contendo uma atmosfera umidificada de 92 a 95% de ar/5 a 8% de CO2. A cultura celular pode ser realizada em misturas de nutrientes contendo fluidos biológicos indefinidos, como soro fetal de bezerro ou meio totalmente definido e isento de soro. O efeito da alteração do ambiente é avaliado através do monitoramento de vários parâmetros de saída, incluindo alterações morfológicas, funcionais e genéticas.

[0053] Nos ensaios de triagem para agentes genéticos, os polinucleotídeos podem ser adicionados a uma ou mais das células em um painel para alterar a composição genética da célula. Os parâmetros de saída são monitorados para determinar se há uma alteração no fenótipo. Dessa maneira, são identificadas sequências genéticas que codificam ou afetam a expressão de proteínas em vias de interesse. Os resultados podem ser inseridos em um processador de dados para fornecer um conjunto de dados de resultados de triagem. Algoritmos são usados para a comparação e análise dos resultados de triagem obtidos sob diferentes condições.

[0054] Os métodos de análise no nível de célula única são de particular interesse, por exemplo, como descrito anteriormente: microscopia de força atômica, expressão de gene de célula única, sequenciamento de RNA de célula única, imagem de cálcio, citometria de fluxo, mielinização, microscopia eletrônica, imagem ao vivo e semelhantes. Vários parâmetros podem ser medidos para determinar 0 efeito de um fármaco ou tratamento nos oligodendrócitos.

[0055] Os parâmetros são componentes quantificáveis das células, particularmente componentes que podem ser medidos com precisão, de

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24/39 maneira desejável em um sistema de alto rendimento. Um parâmetro também pode ser qualquer componente celular ou produto celular, incluindo determinante da superfície celular, receptor, proteína ou modificação conformacional ou pós-traducional, lipídio, carboidrato, molécula orgânica ou inorgânica, ácido nucleico, por exemplo, mRNA, DNA, etc. ou uma porção derivada de tal componente celular ou combinações dos mesmos. Embora a maioria dos parâmetros forneça uma leitura quantitativa, em alguns casos, um resultado semiquantitativo ou qualitativo será aceitável. As leituras podem incluir um único valor determinado ou podem incluir média, valor mediano ou variância, etc. A variação é esperada e uma faixa de valores para cada conjunto de parâmetros de teste será obtida usando métodos estatísticos padrão, usando um método estatístico comum para fornecer valores únicos.

[0056] Os parâmetros de interesse incluem detectar biomoléculas citoplasmáticas, de superfície celular ou segregadas, frequentemente biopolímeros, por exemplo, polipeptídeos, polissacarídeos, polinucleotídeos, lipídios, etc., incluindo vários componentes de mielina, como aqui divulgados. A superfície celular, a mielina e as moléculas segregadas são um tipo de parâmetro preferido, pois medeiam a comunicação celular e as respostas efetoras celulares e podem ser mais prontamente analisadas. Em uma modalidade, os parâmetros incluem epitopos específicos. Os epitopos são frequentemente identificados usando anticorpos monoclonais específicos ou sondas receptoras. Em alguns casos, as entidades moleculares que compreendem o epitopo são de duas ou mais substâncias e compreendem uma estrutura definida. Um parâmetro pode ser a detecção de uma proteína ou oligossacarídeo especificamente modificado. Um parâmetro pode ser definido por um anticorpo monoclonal específico ou um determinante de ligação ao ligante ou ao receptor.

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25/39 [0057] Os agentes candidatos de interesse são agentes biologicamente ativos que abrangem inúmeras classes químicas, principalmente moléculas orgânicas, que podem incluir moléculas organometálicas, moléculas inorgânicas, sequências genéticas etc. Um aspecto importante da invenção é avaliar fármacos candidatos, selecionar anticorpos terapêuticos e terapêuticos à base de proteína, com funções de resposta biológica preferidas. Os agentes candidatos compreendem grupos funcionais necessários para a interação estrutural com proteínas, particularmente ligações de hidrogênio e tipicamente incluem pelo menos um grupo amina, carbonila, hidroxila ou carboxila, frequentemente pelo menos dois dos grupos químicos funcionais. Os agentes candidatos compreendem frequentemente estruturas cíclicas de carbono ou heterocíclicas e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas por um ou mais dos grupos funcionais anteriores. Os agentes candidatos também são encontrados entre as biomoléculas incluindo peptídeos, polinucleotídeos, sacarídeos, ácidos graxos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estruturais ou combinações dos mesmos.

[0058] Estão incluídos fármacos farmacologicamente ativos, moléculas geneticamente ativas, etc. Os compostos de interesse incluem agentes quimioterapêuticos, agentes anti-inflamatórios, hormônios ou antagonistas de hormônios, modificadores de canal iônico e agentes neuroativos. Exemplos de agentes farmacêuticos adequados para esta invenção são os descritos em The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, New York, (1996), nona edição, nas seções:Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites; Cardiovascular Drugs; Vitamins, Dermatology; and Toxicology, todos aqui incorporados por referência.

[0059] Os compostos de teste incluem todas as classes de moléculas descritas anteriormente e podem ainda compreender

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26/39 amostras de conteúdo desconhecido. De interesse são misturas complexas de compostos naturais derivados de fontes naturais, como plantas. Embora muitas amostras compreendam compostos em solução, também podem ser analisadas amostras sólidas que podem ser dissolvidas em um solvente adequado. As amostras de interesse incluem amostras ambientais, por exemplo, água subterrânea, água do mar, resíduos de mineração, etc.; amostras biológicas, por exemplo, lisados preparados de culturas, amostras de tecidos, etc.; amostras de fabricação, por exemplo, curso de tempo durante a preparação de produtos farmacêuticos; bem como bibliotecas de compostos preparados para análise; e semelhantes. As amostras de interesse incluem compostos sendo avaliados quanto ao potencial valor terapêutico, ou seja, candidatos a fármacos.

[0060] O termo amostras também inclui os fluidos descritos anteriormente aos quais foram adicionados componentes adicionais, por exemplo, componentes que afetam a força iônica, pH, concentração total de proteínas, etc. Além disso, as amostras podem ser tratadas para atingir pelo menos fracionamento ou concentração parcial. As amostras biológicas podem ser armazenadas se for tomado cuidado para reduzir a degradação do composto, por exemplo, sob nitrogênio, congeladas ou uma combinação dos mesmos. O volume de amostra utilizado é suficiente para permitir a detecção mensurável, geralmente de cerca de 0,1 :1 a 1 ml_ de uma amostra biológica é suficiente.

[0061] Os compostos, incluindo os agentes candidatos, são obtidos de uma ampla variedade de fontes, incluindo bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais. Por exemplo, estão disponíveis inúmeros meios para a síntese aleatória e dirigida de uma ampla variedade de compostos orgânicos, incluindo biomoléculas, incluindo a expressão de oligonucleotídeos e oligopeptídeos randomizados. Alternativamente, bibliotecas de compostos naturais na forma de extratos bacterianos,

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27/39 fúngicos, vegetais e animais estão disponíveis ou são prontamente produzidas. Adicionalmente, as bibliotecas e os compostos naturais ou produzidos sinteticamente são facilmente modificados através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais e podem ser utilizados para produzir bibliotecas combinatórias. Os agentes farmacológicos conhecidos podem ser submetidos a modificações químicas direcionadas ou aleatórias, como acilação, alquilação, esterificação, amidificação, etc. para produzir análogos estruturais.

[0062] Como usado aqui, o termo agente genético se refere a polinucleotídeos e seus análogos, cujos agentes são testados nos ensaios de triagem da invenção por adição do agente genético a uma célula. A introdução do agente genético resulta em uma alteração da composição genética total da célula. Agentes genéticos, tal como o DNA podem resultar em uma alteração introduzida experimentalmente no genoma de uma célula, geralmente através da integração da sequência em um cromossomo. As alterações genéticas também podem ser transitórias, em que a sequência exógena não é integrada, mas é mantida como um agente epissomal. Os agentes genéticos, tais como oligonucleotídeos antissenso, também podem afetar a expressão de proteínas sem alterar o genótipo da célula, interferindo na transcrição ou tradução do mRNA. O efeito de um agente genético é aumentar ou diminuir a expressão de um ou mais produtos genéticos na célula.

[0063] A introdução de um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo pode ser usada para expressar o produto codificado em células sem a sequência ou para superexpressar o produto. Podem ser utilizados vários promotores constitutivos ou sujeitos a regulação externa em que, nesta última situação, é possível ativar ou desativar a transcrição de um gene. Estas sequências de codificação podem incluir cDNA de comprimento total ou clones genômicos, fragmentos derivados deles ou quimeras que combinam uma sequência que ocorre

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28/39 naturalmente com domínios funcionais ou estruturais de outras sequências de codificação. Alternativamente, a sequência introduzida pode codificar uma sequência antissenso; ser um oligonucleotídeo antissenso; RNAi, codifica uma mutação dominante negativa ou mutações dominantes ou constitutivamente ativas de sequências nativas; sequências regulatórias alteradas, etc.

[0064] Os oligonucleotídeos antissenso e RNAi podem ser sintetizados quimicamente por métodos conhecidos na técnica. Os oligonucleotídeos preferidos são quimicamente modificados a partir da estrutura fosfodiéster nativa, a fim de aumentar sua estabilidade intracelular e afinidade de ligação. Várias dessas modificações foram descritas na literatura, as quais alteram a química da cadeia principal, açúcares ou bases heterocíclicas. Entre as mudanças úteis na química da cadeia principal estão os fosforotioatos; fosforoditioatos, em que ambos os oxigênios sem ponte são substituídos por enxofre; fosforamamiditos; fosfotriésteres de alquila e boranofosfatos. Os derivados de fosfato aquiral incluem 3'-O'-5'-S-fosforotioato, 3'-S-5'-Ofosforotioato, 3'-CH2-5'-O-fosfonato e 3'-NH-5'-O -fosfororoamidato. Os ácidos nucleicos peptídicos substituem a estrutura principal do fosfodiéster ribose por uma ligação peptídica. Modificações de açúcar também são usadas para aumentar a estabilidade e afinidade, por exemplo, análogos de oligonucleotídeo de morfolina. O α-anômero da desoxirribose pode ser usado, em que a base é invertida em relação ao β-anômero natural. O 2'-OH do açúcar ribose pode ser alterado para formar açúcares 2'-O-metila ou 2'-O-alila, o que fornece resistência à degradação sem compreender a afinidade.

[0065] Os agentes são rastreados quanto à atividade biológica adicionando o agente a pelo menos uma e geralmente uma pluralidade de células, em uma ou em várias condições ambientais, por exemplo, após estimulação com um agonista β-adrenérgico, após estimulação

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29/39 elétrica ou mecânica, etc. A mudança na leitura do parâmetro em resposta ao agente é medida, desejável mente normalizada, e os resultados da triagem resultantes podem ser avaliados por comparação com os resultados da triagem de referência, por exemplo, com células com outras mutações de interesse, oligodendrócitos normais, oligodendrócitos derivados de outros membros da família e semelhantes. Os resultados da triagem de referência podem incluir leituras na presença e ausência de diferentes alterações ambientais, resultados de triagem obtidos com outros agentes, que podem ou não incluir fármacos conhecidos, etc.

[0066] Os agentes são convenientemente adicionados em solução, ou forma facilmente solúvel, ao meio das células em cultura. Os agentes podem ser adicionados em um sistema de fluxo contínuo, como uma corrente, intermitente ou contínua, ou alternativamente, adicionando um bolo do composto, individual ou incrementalmente, a uma solução estática. Em um sistema de fluxo contínuo, são utilizados dois fluidos, sendo que um é uma solução fisiologicamente neutra e o outro é a mesma solução com o composto de teste adicionado. O primeiro fluido é passado sobre as células, seguido pelo segundo. Em um método de solução única, é adicionado um bolo do composto de teste ao volume do meio que circunda as células. As concentrações gerais dos componentes do meio de cultura não devem mudar significativamente com a adição do bolo ou entre as duas soluções em um método de escoamento.

[0067] As formulações de agentes preferidas não incluem componentes adicionais, tais como conservantes, que podem ter um efeito significativo na formulação geral. Assim, as formulações preferidas consistem essencialmente em um composto biologicamente ativo e um veículo fisiologicamente aceitável, por exemplo, água, etanol, DMSO, etc. No entanto, se um composto for líquido sem solvente, a

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30/39 formulação pode consistir essencialmente no próprio composto.

[0068] Uma pluralidade de ensaios pode ser executada em paralelo com diferentes concentrações de agente para obter uma resposta diferencial às várias concentrações. Como é conhecido na técnica, a determinação da concentração efetiva de um agente normalmente usa uma faixa de concentrações resultantes de diluições 1:10 ou outra escala logarítmica. As concentrações podem ser refinadas ainda mais com uma segunda série de diluições, se necessário. Tipicamente, uma dessas concentrações serve como controle negativo, ou seja, na concentração zero ou abaixo do nível de detecção do agente ou na concentração ou abaixo da concentração do agente que não fornece uma alteração detectável no fenótipo.

[0069] Vários métodos podem ser utilizados para quantificar a presença de parâmetros selecionados, além dos parâmetros funcionais descritos anteriormente. Para medir a quantidade de uma molécula que está presente, um método conveniente é rotular uma molécula com uma porção detectável, que pode ser fluorescente, luminescente, radioativa, enzimaticamente ativa, etc., particularmente uma molécula específica para ligação ao parâmetro com porções fluorescentes de alta afinidade estão prontamente disponíveis para marcação de praticamente qualquer biomolécula, estrutura ou tipo de célula. As porções imunofluorescentes podem ser direcionadas para se ligarem não apenas a proteínas específicas, mas também a conformações específicas, produtos de divagem ou modificações no local, como a fosforilação. Os peptídeos e proteínas individuais podem ser projetados para autofluorescência, por exemplo, expressando-os como quimeras de proteínas fluorescentes verde dentro das células (para uma revisão, ver Jones et al. (1999) Trends Biotechnol. 17(12):477-81). Assim, os anticorpos podem ser geneticamente modificados para fornecer um corante fluorescente como parte de sua estrutura.

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31/39 [0070] Dependendo do rótulo escolhido, os parâmetros podem ser medidos usando outros marcadores que não fluorescentes, usando técnicas de imunoensaio como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), imunoensaios enzimáticos homogêneos e técnicas não enzimáticas relacionadas. Essas técnicas utilizam anticorpos específicos como moléculas repórteres, que são particularmente úteis devido ao seu alto grau de especificidade para ligação a um único alvo molecular. A Patente US 4.568.649 descreve sistemas de detecção de ligantes, os quais empregam contagem de cintilação. Estas técnicas são particularmente úteis para parâmetros ou epitopos de proteínas ou proteínas modificadas ou determinantes de carboidratos. As leituras de células para proteínas e outros determinantes celulares podem ser obtidas usando moléculas repórteres fluorescentes ou marcadas de outro modo. O ELISA baseado em células ou métodos não enzimáticos ou baseados em fluorescência relacionados permitem a medição dos parâmetros da superfície celular e dos parâmetros segregados. O ELISA de captura e os métodos não enzimáticos relacionados geralmente empregam dois anticorpos específicos ou moléculas repórteres e são úteis para medir os parâmetros em solução. Os métodos de citometria de fluxo são úteis para medir a superfície celular e os parâmetros intracelulares, bem como a mudança de forma e granularidade e para análises de esferas utilizadas como reagentes ligados a anticorpos ou sondas. As leituras de tais ensaios podem ser a fluorescência média associada a moléculas ou citocinas de superfície celular detectadas por anticorpos fluorescentes individuais ou a intensidade média de fluorescência, a intensidade mediana de fluorescência, a variação na intensidade de fluorescência ou alguma relação entre elas.

[0071] Os ensaios tanto de multiparâmetros de célula única quanto de multiparâmetros multiplexes, em que os tipos de células de entrada

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32/39 são identificados e os parâmetros são lidos por imagem quantitativa e fluorescência e microscopia confocal são usadas na técnica, ver Confocal Microscopy Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology Vol. 122.) Paddock, Ed., Humana Press, 1998. Esses métodos são descritos na patente US 5.989.833, depositada em 23 de novembro de 1999.

[0072] A quantificação de ácidos nucleicos, especialmente RNAs mensageiros, também é de interesse como um parâmetro. Estes podem ser medidos por técnicas de hibridação que dependem da sequência de nucleotídeos de ácidos nucleicos. As técnicas incluem métodos de reação em cadeia da polimerase, bem como técnicas de arranjo genético. Ver Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds, John Wiley & Sons, New York, NY, 2000; Freeman et al. (1999) Biotechniques 26(1):112-225; Kawamoto et al. (1999) Genome Res 9(12):1305-12; e Chen et al. (1998) Genomics 51(3):313-24, por exemplos.

[0073] A comparação dos resultados da triagem obtidos de urn composto de teste e os resultados de triagem de referência são realizados pelo uso de protocolos de dedução adequados, sistemas de Al, comparações estatísticas, etc. Preferivelmente, os resultados da triagem são comparados com uma base de dados dos resultados de triagem de referência. Uma base de dados de resultados de triagem de referência pode ser compilada. Essas bases de dados podem incluir resultados de referência de painéis que incluem agentes conhecidos ou combinações de agentes, bem como referências da análise de células tratadas sob condições ambientais nas quais os parâmetros ou condições ambientais únicos ou múltiplos são removidos ou especificamente alterados. Os resultados de referência também podem ser gerados de painéis contendo células com construtos genéticos que visam ou modulam seletivamente vias celulares específicas.

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33/39 [0074] A leitura pode ser uma média, média aritmética, mediana ou variância ou outro valor estatístico ou matematicamente derivado associado à medição. As informações de leitura de parâmetro podem ser refinadas ainda por comparação direta com a leitura de referência correspondente. Os valores absolutos obtidos para cada parâmetro em condições idênticas exibirão uma variabilidade inerente aos sistemas biológicos vivos e também refletem a variabilidade celular individual, bem como a variabilidade inerente entre os indivíduos.

[0075] Por conveniência, os sistemas da presente invenção podem ser fornecidos em kits. Os kits podem incluir as células a serem usadas, que podem ser congeladas, refrigeradas ou tratadas de alguma outra maneira para manter a viabilidade, reagentes para medir os parâmetros e software para preparar os resultados da triagem. O software receberá os resultados e executará a análise e pode incluir dados de referência. O software também pode normalizar os resultados com os resultados de uma cultura de controle. A composição pode opcionalmente ser embalada em um recipiente adequado com instruções escritas para uma finalidade desejada, como métodos de triagem e semelhantes.

[0076] Para uma elaboração adicional de técnicas gerais úteis na prática desta invenção, o médico pode consultar livros didáticos e revisões padrão em biologia celular, cultura de tecidos, embriologia e neurobiologia. No que diz respeito à cultura de tecidos e células-tronco embrionárias, o leitor pode se referir a teratocarcinomas e células-tronco embrionárias:A practical approach (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); Guide to Techniques in Mouse Development (P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (Μ. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P. D. Rathjen et al., Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998).

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34/39 [0077] Métodos gerais em bioquímica molecular e celular podem ser encontrados em livros-texto padrão como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); e Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Reagentes, vetores de clonagem e kits para manipulação genética referidos nesta divulgação estão disponíveis em fornecedores comerciais como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich e ClonTech.

[0078] Cada publicação citada neste relatório descritivo é incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.

[0079] Deve-se entender que esta invenção não se limita à metodologia, protocolos, linhas celulares, espécies ou gêneros de animais e reagentes descritos, pois tais podem variar. Também deve-se entender que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades específicas apenas e não se pretende limitar o escopo da presente invenção, o qual será limitado somente pelas reivindicações anexas.

[0080] Como usado neste documento, as formas no singular um(a), e, e o(a) incluem referentes no plural, a menos que o contexto expresse claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a uma célula inclui uma pluralidade de tais células e a referência a a cultura inclui referência a uma ou mais culturas e equivalentes das mesmas conhecidas pelos versados na técnica, e assim por diante. Todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é comumente entendido por um versado

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35/39 na técnica ao qual esta invenção pertence, a menos que claramente indicado de outra forma.

[0081] Os exemplos seguintes são apresentados de modo a prover aos versados na técnica uma divulgação e descrição completa de como fazer e usar a presente invenção e não se destinam a limitar o escopo que os inventores consideram sua invenção nem pretendem representar que os experimentos a seguir são todos ou os únicos experimentos realizados. Foram feitos esforços para garantir a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. A menos que indicado de outra forma, as partes são partes em peso, peso molecular é o peso molecular médio, temperatura é em graus centígrados e pressão é atmosférica ou próxima à atmosférica.

Experimentos

Exemplo 1 [0082] Os métodos anteriores para gerar oligodendrócitos humanos e modelar o processo de mielinização in vitro foram realizados em culturas bidimensionais (2D). Nestes protocolos, a mielinização é estudada como o envolvimento de processos de oligodendrócitos em torno de nanopilares sintéticos. Esses métodos não permitem o estudo da mielinização, uma vez que ela ocorre no cérebro humano como um processo tridimensional. Alternativamente, os oligodendrócitos derivados de células-tronco humanas foram transplantados para roedores, no entanto, não se sabe até que ponto o ambiente do camundongo influencia na biologia e na mielinização dos oligodendrócitos humanos e esses métodos são trabalhosos e não permitem exames de alto rendimento. O método descrito a seguir é o primeiro a gerar oligodendrócitos mielinizantes in vitro em culturas tridimensionais (3D) derivadas exclusivamente de hiPSCs ou hESC

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36/39 humanas, permitindo o estudo da mielinização humana em condições saudáveis e de doenças in vitro.

[0083] Manutenção e agregação de hiPSC. As linhas de célulastronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) foram cultivadas em placas tratadas com cultura de tecidos revestidas com vitronectina (0,5 pg/cm²) em meio iPSC (meio E8 completo contendo 100 U/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina). Para formar agregados flutuantes, as placas de Aggrewell foram preparadas pela centrifugação de 500 pL de meio hiPSC mais o inibidor de ROCK Y-27632 (10 nM) por 5 minutos a 2.000 g. As hiPSCs foram pré-tratadas com Y-27632 por 1 hora e depois foram dissociadas por tratamento com acutase préaquecida por 5 a 7 minutos. Uma vez dissociadas, as hiPSCs foram coletadas e diluídas em meios hiPSC e então contadas. Alíquotas de 3 milhões de hiPSCs foram transferidas para tubos de falcon de 15 mL, centrifugadas a 2.000 g por 5 minutos e depois ressuspensas em 1,5 mL de meios de hiPSC com Y-27632. As 3 milhões de suspensões de células foram então adicionadas aos poços individuais da placa de Aggrewell preparada e as placas foram centrifugadas durante 3 minutos a 100 g. As placas de Aggrewell foram então armazenadas em uma incubadora a 37 C com 5% de CO₂ durante a noite.

[0084] No dia seguinte, os agregados de hiPSC foram lavados dos Aggrewells pipetando com uma pipeta P-1000 usando uma ponta cortada. Os agregados deslocados foram filtrados usando um filtro de células de 40 pm e transferidos para placas de cultura de tecidos de inserção ultrabaixa de 100 mm contendo meio E6 com 100 U/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina.

[0085] Indução neural e promoção da oligodendrogênese. Para indução neural, dorsomorfina (5 pM) e SB-431542 (10 pM) foram adicionadas diariamente durante os primeiros 6 dias. Foram geradas duas variações de esferoides, nas quais algumas foram expostas ao

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37/39 ácido retinoico trans (RA, 100 nM) diariamente a partir do terceiro dia e outras ao inibidor da via Wnt IWP-2 (5 μΜ) a partir do quarto dia. No sexto dia em suspensão, os esferoides flutuantes foram transferidos para meio neural (NM) contendo DMEM/F12, suplemento N-2, substituto sérico B-27 sem vitamina A, GlutaMax (1:100), solução de aminoácido não essencial MEM (1:100), β-mercaptoetanol 0,1 nM, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 pg/mL. O NM também foi suplementado com 20 ng/mL de FGF2 e 20 ng/mL de EGF por 19 dias, com mudança diária média nos primeiros 10 dias e a cada dois dias nos 9 dias subsequentes. No dia 11, o agonista suavizado SAG (1 μΜ) também foi adicionado diariamente ao meio. Para promover a diferenciação dos progenitores neurais em oligodendrócitos, FGF2, EGF, IWP-2, RA e SAG foram removidos e 10 ng/mL de PDGF-AA, 10 ng/mL de IGF-1, 5 ng/mL de HGF, 25 pg/mL de insulina, análogo de 1 μΜ cAMP, 60 ng/mL de T3, 100 ng/mL de biotina, 20 ng/mL de BDNF e 20 ng/mL de NT3 foram adicionados ao meio NM a partir do dia 25. As mudanças de meios aconteceram em dias alternados do dia 25 ao dia 43. A partir do dia 43, os esferoides foram cultivados em NM com 20 pg/mL de ácido ascórbico, 25 pg/mL de insulina, 1 μΜ de análogo de cAMP, 60 ng/mL de T3 e 100 ng/mL de biotina, com alterações de meios acontecendo a cada 4 a 5 dias.

Resultados:

[0086] Figuras 1 a-1 b. Derivação de oligodendrócitos em cultura 3D. Após 51 dias em cultura, os esferoides foram fixados durante a noite em PFA a 4%. Os esferoides foram incorporados na OCT, seccionados e marcados imunofluorescentemente usando anticorpos contra NKX2. 2 e OLIG2, marcadores que juntos identificam células progenitoras de oligodendrócitos. O mesmo procedimento foi usado para fixar e preparar seções de hOS com 100 dias, que foram marcadas imunoflorescentemente com 04, um marcador de superfície para

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38/39 oligodendrócitos jovens e maduros e 01, um marcador de superfície para oligodendrócitos maduros. A presença de células NKX2. 2/OLIG2⁺e células multipolares 04⁺ e 01⁺ sugere que células progenitoras de oligodendrócitos e oligodendrócitos maduros estão presentes nos esferoides humanos derivados pelo método descrito.

[0087] Figura 1c-e. Interações entre tipos de células na cultura 3D. As seções foram preparadas a partir de hOS com 115 dias e marcadas com anticorpos contra MBP- uma proteína envolvida na formação de mielina e marcador de oligodendrócitos maduros, GFAP- um marcador de astrócitos e Neurofilamento - um marcador de axônios. A sobreposição entre os processos MBP⁺ e GFAP⁺ indica interação oligodendrócito-astrócito. O envolvimento dos processos MBP⁺ em torno dos processos de Neurofilamento* sugere que os oligodendrócitos estão envolvendo axônios na hOS de 115 dias.

[0088] Figura 1 f. Mielinização em cultura 3D humana derivada de hiPSC (hOS). Após 100 dias de cultura, os esferoides derivados pelo método descrito foram fixados e processados para microscopia eletrônica de transmissão. A presença de camadas semelhantes a anéis ao redor dos axônios é consistente com a mielinização.

[0089] Significância e aplicações. A mielinização é essencial ao funcionamento normal do cérebro e as aberrações subjacentes a inúmeras desordens neurológicas. Os esferoides 3D neurais humanos descritos neste método são os primeiros a conter oligodendrócitos mielinizantes e podem ser usados para estudar sistematicamente o processo de mielinização em saúde e doença. Esse método é especialmente passível de modelagem de doenças, pois as hiPSCs utilizadas neste protocolo podem ser reprogramadas diretamente das células da pele de pacientes com distúrbios desmielinizantes. Além disso, devido à escalabilidade do método, essas culturas também podem ser usadas na triagem de fármacos para identificar compostos

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39/39 que influenciam na mielinização, tanto em contextos saudáveis quanto em doenças específicas. Além disso, este também é o primeiro sistema a permitir o estudo da interação célula-célula chave no desenvolvimento humano, entre neurônios e oligodendrócitos, oligodendrócitos e astrócitos, etc. Finalmente, os oligodendrócitos derivados dessas culturas podem servir como fonte de células para o transplante em tratamentos futuros de distúrbios desmielinizantes.

[0090] O exposto anteriormente ilustra meramente os princípios da invenção. Será percebido que os versados na técnica serão capazes de planejar vários arranjos que, embora não explicitamente descritos ou mostrados neste documento, incorporam os princípios da invenção e estão incluídos dentro de seu espírito e escopo. Além disso, todos os exemplos e a linguagem condicional relatados aqui destinam-se, principalmente, a auxiliar o leitor na compreensão dos princípios da invenção e dos conceitos contribuídos pelos inventores para promover a técnica, e devem ser interpretados como sendo entre outros a tais exemplos e condições especificamente relatados. Além disso, todas as declarações neste documento que relatam princípios, aspectos e modalidades da invenção, bem como seus exemplos específicos, se destinam a abranger equivalentes estruturais e funcionais dos mesmos. Além disso, pretende-se que tais equivalentes incluam os equivalentes conhecidos atualmente e os equivalentes desenvolvidos no futuro, isto é, quaisquer elementos desenvolvidos que realizam a mesma função, independentemente da estrutura. O escopo da presente invenção, portanto, não se destina a estar limitado às modalidades exemplares mostradas e descritas aqui. Preferivelmente, o escopo e o espírito da presente invenção estão incorporados pelas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir oligodendrócitos humanos in vitro, ο método caracterizado pelo fato de que compreende:

induzir, em uma cultura de suspensão de células-tronco pluripotentes, um destino neural para fornecer um esferoide de células progenitoras neurais;

diferenciar as células progenitoras neurais em um esferoide para diferenciar oligodendro-esferoides humanos (hOS) incluindo oligodendrócitos;

manter o esferoide hOS por um longo período de tempo em meio neural para derivar culturas que incluem oligodendrócitos mielinizantes, neurônios e astrócitos.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células compreendem pelo menos um alelo associado a um distúrbio da mielina.
3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que as células-tronco pluripotentes são células-tronco pluripotentes induzidas.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cultura de suspensão de célulastronco pluripotentes é induzida a um destino neural por cultura de colônias intactas das células-tronco pluripotentes em meio compreendendo uma dose eficaz de um inibidor de BMP e um inibidor de TGFp.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o meio compreende uma dose de dorsomorfina e SB-431542 eficaz para induzir células-tronco pluripotentes a um destino neural.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a cultura de suspensão é livre de camada alimentadora.

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7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o meio compreende ainda uma dose eficaz de um inibidor de wnt.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as células são diferenciadas em progenitores neurais por cultura em meio neural compreendendo uma dose de FGF2 e EGF eficaz para manter as células progenitoras neurais.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda padronizar esferoides com agonistas da via sônica de hedgehog e ácido retinóico ou com agonistas da via sônica do hedgehog e inibidores de Wnt.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda diferenciar progenitores neurais em oligodendrócitos por cultura em meios neurais sem FGF2 e EGF e compreendendo uma dose eficaz de PDGF-AA, IGF-1, HGF, BDNF, NT3, insulina, cAMP, T3 e biotina.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda manter os oligodendro-esferoides assim produzidos por um período prolongado de tempo em meio neural sem fatores de crescimento, mas incluindo ácido ascórbico, insulina, cAMP, T3 e biotina.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda isolar oligodendrócitos de uma esfera cortical por citometria de fluxo, imunosseleção magnética ou imunopanning.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os oligodendrócitos isolados são expostos a um agente candidato ou tratamento de interesse.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os oligodendrócitos são combinados com neurônios ou

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3/3 células progenitoras neuronais.
15. População de oligodendrócitos, caracterizada pelo fato de que é obtida pelo método, como definido na reivindicação 9 ou 10.
16. Método que determina o efeito de um agente candidato em oligodendrócitos humanos, o método caracterizado pelo fato de que compreende: colocar o agente candidato em contato com um ou o painel de astrócitos diferenciados de células-tronco pluripotentes humanas induzidas (hiPSC) de acordo com o método, como definido na reivindicação 9 ou 10, em que os oligodendrócitos opcionalmente compreendem pelo menos um alelo que codifica uma mutação associada a uma doença neural; e determina o efeito do agente nos parâmetros morfológicos, genéticos ou funcionais.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o agente candidato é uma célula efetora imunológica ou um agente modulador imunológico.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que um painel de oligodendrócitos compreende pelo menos dois astrócitos com genótipos diferentes.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que um painel de oligodendrócitos compreende oligodendrócitos em diferentes condições ambientais.