WO2022059793A1

WO2022059793A1 - 神経束および神経束の製造方法

Info

Publication number: WO2022059793A1
Application number: PCT/JP2021/034424
Authority: WO
Inventors: 博石川; 愛樹丸島; 祐司松丸; 正雄國府田; 明松村; 寛樹武川; 晃弘大山; 順子豊村; 美穂渡邊; 哲哉安部; 昇平高岡; 洋介柴尾; 英明松村
Original assignee: 国立大学法人筑波大学
Priority date: 2020-09-18
Filing date: 2021-09-17
Publication date: 2022-03-24
Also published as: JPWO2022059793A1; US20230364303A1

Abstract

［課題］神経系細胞の軸索を効率的に伸長させることを含む、神経束の製造方法を提供する。［解決手段］神経系細胞を、血管構成細胞、血管周囲細胞およびオリゴデンドロサイトから選択される少なくとも一種の細胞を含むフィーダー細胞の存在下で培養する。

Description

神経束および神経束の製造方法

　本発明は、神経束および神経束の製造方法に関する。

　近年、神経変性疾患や物理的な原因で損傷を受けた神経の機能を回復するために、神経を移植する方法が開発されている。神経を移植する方法としては、神経幹細胞を注射により患部に注入する方法が広く用いられている。しかしながら、この方法では、注入した神経幹細胞が体内で移動しやすく、また生着しにくいため、脳や脊髄、複雑な末梢神経等の神経組織の損傷部位を効率的に修復することが困難であるという問題があった。

　この問題を解決するために、軸索を伸長させた神経細胞の束（神経束）を、損傷を受けた部位の残存する神経と接合して移植する方法が開発されている。移植するための神経束を得るための方法として、神経系細胞を培養して神経細胞の軸索を伸長させて神経束を作製する方法が報告されているが（特許文献１および２）、これらの方法では神経細胞の軸索を効率よく伸長および肥大させることはできず、移植に十分な長さおよび太さ（径）の軸索を有する神経束を得ることが困難であるという問題があった。

　また、中枢神経系の損傷、特に脊髄損傷の場合には、生体維持の観点から、損傷後短期間のうちに神経機能を回復させる必要があるため、移植するのに十分な長さおよび径の軸索を有する神経束を短期間で作製する必要がある。

　このような状況下、移植に十分な長さおよび径の軸索を有する神経束を効率よく得ることができる方法が求められている。

国際公開第２０１７／１８７６９６号特開２０１４－１３６１２８号公報

　本発明者らは、特定のフィーダー細胞およびグリア細胞の存在下で神経系細胞を培養することにより、神経系細胞の軸索を効率よく伸長させることができることを見出した。また、本発明者らは、神経系細胞の軸索の伸長に伴い、軸索を肥大させることができることも見出した。かかる本発明によれば、移植に十分な長さおよび径の軸索を有する神経束を効率よく作製することができる。本発明はこれらの知見に基づくものである。

　本発明には、以下の発明が包含される。
［１］神経系細胞含有細胞集団を、血管構成細胞、血管周囲細胞およびオリゴデンドロサイトから選択される少なくとも一種のフィーダー細胞、およびグリア細胞の存在下で培養し、神経系細胞の軸索を伸長させることを含む、神経束を製造する方法。
［２］前記フィーダー細胞が、周皮細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞およびオリゴデンドロサイトからなる群から選択される少なくとも一種の細胞を含む、［１］に記載の方法。
［３］前記フィーダー細胞が、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ－２、ＮＧＦＢおよびＥＧＦからなる群から選択される少なくとも一種の成長因子を分泌する細胞を含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記グリア細胞がオリゴデンドロサイトを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記神経束が、オリゴデンドロサイトを含む髄鞘を有する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］（ａ）少なくとも一つの凹部と、該凹部に接続する溝部であって、フィーダー細胞で被覆されている溝部とを備える基板を準備する工程、
　（ｂ）前記神経系細胞含有細胞集団およびグリア細胞を前記凹部に添加する工程、
　（ｃ）前記神経系細胞含有細胞集団および前記グリア細胞を培養して、神経系細胞の軸索を前記溝部に沿って伸長させる工程
を含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］（ａ）二つの凹部と、該二つの凹部を接続する溝部であって、前記フィーダー細胞で被覆されている溝部とを備える基板を準備する工程、
　（ｂ）前記神経系細胞含有細胞集団およびグリア細胞を前記凹部に添加する工程、
　（ｃ）前記神経系細胞含有細胞集団および前記グリア細胞を培養して、神経系細胞の軸索を前記溝部に沿って伸長させる工程
を含む、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記工程（ａ）において、前記溝部を前記フィーダー細胞で被覆する前に、前記溝部が線維芽細胞で被覆される、［６］または［７］に記載の方法。
［９］前記神経系細胞含有細胞集団が内皮細胞をさらに含む、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記神経系細胞含有細胞集団に含まれる内皮細胞が血管由来の内皮細胞である、［９］に記載の方法。
［１１］前記血管由来の内皮細胞が歯髄、歯肉、皮下組織、体腔内動脈、体腔内静脈および臍帯からなる群から選択される少なくとも一つの組織の血管由来の内皮細胞である、［１０］に記載の方法。
［１２］前記工程（ｃ）において、前記神経系細胞含有細胞集団に含まれる内皮細胞に由来する管を形成することをさらに含む、［９］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］前記神経系細胞および内皮細胞が同一の個体に由来するものである、［９］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］前記神経系細胞含有細胞集団が生体適合性材料をさらに含み、前記神経系細胞および内皮細胞が、それぞれ別個の生体適合性材料の表面に層状に存在する、［９］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］前記生体適合性材料がコラーゲンを含む、［１４］に記載の方法。
［１６］前記生体適合性材料がコラーゲンビーズを含む、［１４］または［１５］に記載の方法。
［１７］前記溝部の長さが３ｍｍ以上である、［６］～［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］［１］～［１７］のいずれかに記載の方法により製造される、神経束。
［１９］［１］～［１７］のいずれかに記載の方法により製造される神経束を、生体適合材料のシートにより被覆することを含む、移植材料を製造する方法。
［２０］前記シートが線維芽細胞を含む、［１９］に記載の方法。
［２１］前記移植材料が神経再生用移植材料である、［１９］または［２０］に記載の方法。
［２２］［１９］～［２１］のいずれかに記載の方法により製造される、移植材料。
［２３］神経系細胞を、血管構成細胞、血管周囲細胞およびオリゴデンドロサイトから選択される少なくとも一種の細胞を含むフィーダー細胞、およびグリア細胞の存在下で培養することを含む、神経系細胞の軸索を伸長させる方法。
［２４］前記フィーダー細胞が、周皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞およびオリゴデンドロサイトからなる群から選択される少なくとも一種の細胞を含む、［２３］に記載の方法。
［２５］前記グリア細胞がオリゴデンドロサイトを含む、［２３］または［２４］に記載の方法。
［２６］軸索が伸長した神経系細胞、および該軸索に沿って存在する内皮細胞の管を有する神経束であって、ＨＮＫ－１糖鎖発現細胞およびｐ７５ＮＴＲ発現細胞の少なくとも１種の細胞を含み、前記軸索がオリゴデンドロサイトを含む髄鞘を有する、前記神経束。
［２７］ＨＮＫ－１糖鎖発現細胞およびｐ７５ＮＴＲ発現細胞を含む、［２６］に記載の神経束。
［２８］ＮＳ２００発現細胞、ペリフェリン発現細胞、ミエリン塩基性タンパク質発現細胞、Ｓ１００発現細胞、ＭＰＺ発現細胞、ペリアキシン発現細胞、ＣＤ３１発現細胞およびＰＤＧＦＲβ発現細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞を含む、［２６］および［２７］に記載の神経束。
［２９］ＮＳ２００発現細胞、ペリフェリン発現細胞、ミエリン塩基性タンパク質発現細胞、Ｓ１００発現細胞、ＭＰＺ発現細胞、ペリアキシン発現細胞、ＣＤ３１発現細胞およびＰＤＧＦＲβ発現細胞を含む、［２６］～［２８］のいずれかに記載の神経束。
［３０］前記神経束が、前記神経系細胞の軸索に沿って該軸索の少なくとも一部を被覆する、線維芽細胞および周皮細胞の少なくとも１つの細胞を含む細胞層を有し、前記内皮細胞の管が前記細胞層の内部に存在する、［２６］～［２９］のいずれかに記載の神経束。
［３１］前記内皮細胞の管が周皮細胞をさらに含む、［２６］～［３０］のいずれかに記載の神経束。
［３２］［２６］～［３１］のいずれかに記載の神経束を含む、移植材料。
［３３］神経再生用移植材料である、［３２］に記載の移植材料。
［３４］少なくとも一つの第１凹部と、少なくとも第１および第２端部を有する少なくとも一つの第１溝部とを有する神経束を製造するための装置であって、
　前記第１溝部が、少なくとも第１および第２端部を有し前記第１溝部と平行に延びる少なくとも一つの第２溝部を有し、
　前記第１凹部と前記第１および第２溝部のそれぞれの第１端部とが接続している、
前記装置。
［３５］前記第１および第２溝部の少なくとも１つの溝部に、血管構成細胞、血管周囲細胞およびオリゴデンドロサイトから選択される少なくとも一種のフィーダー細胞、およびグリア細胞が配置されている、［３４］に記載の装置。
［３６］前記第１および第２溝部の第２端部が第２凹部と接続している、［３４］および［３５］に記載の装置。
［３７］前記第１凹部が、直径３～１０ｍｍの開口部、水平または凹状に湾曲した底部有する深さ４～８ｍｍの凹部であり、
　前記第１溝部が、水平または凹状に湾曲した底部を有し、淵部の幅４～６ｍｍ、前記第１端部から第２端部までの長さ２～３ｃｍ、深さ４～６ｍｍの溝部である、［３４］～［３６］のいずれかに記載の装置。
［３８］前記第２溝部が、水平または凹状に湾曲した底部を有し、淵部の幅２～２．５ｍｍ、深さ１．５～２ｍｍの溝部である、［３４］～［３７］のいずれかに記載の装置。
［３９］前記第２凹部が、直径２～５ｍｍの開口部、水平または凹状に湾曲した底部を有する深さ３～６ｍｍの凹部である、［３６］～［３８］のいずれかに記載の装置。
［４０］前記第１溝部が３つの前記第２溝部を有する、［３４］～［３９］のいずれかに記載の装置。
［４１］前記装置がポリジメチルシロキサンからなる、［３４］～［４０］のいずれかに記載の装置。

　本発明によれば、神経系細胞の軸索を効率よく伸長させることができる。また、本発明によれば、神経系細胞の軸索を効率よく肥大させることができる。かかる本発明によれば、移植に十分な長さおよび径の軸索を有する神経束を効率よく作製することができる。さらに、本発明によれば、神経系細胞および該神経系細胞の軸索に沿って存在する内皮細胞の管を有する神経束を得ることができる。

図１ＡおよびＢは、歯髄由来神経系細胞をオルニチンおよび／またはリジンでコーティングしたシャーレで培養して分化・成長させて得られた二次元の網目状の神経系細胞の位相差顕微鏡写真である。図１Ａの矢印部分は、神経系細胞の細胞体部分に発生・付着した小型細胞を示す。図１Ｂの矢印部分は、神経系細胞の軸索部分に発生・付着した小型細胞を示す。図２Ａは、神経系細胞の細胞体部分に発生・付着した小型細胞を用いて作製した脊髄神経用神経束を、抗Ｏｌｉｇ２抗体を用いて免疫染色した免疫染色写真である。図２Ｂは、神経系細胞の細胞体部分に発生・付着した小型細胞を用いて作製した脊髄神経用神経束を、抗Ｓ１００抗体を用いて免疫染色した免疫染色写真である。図３Ａは、神経系細胞の軸索部分に発生・付着した小型細胞を用いて作製した末梢神経用神経束を、抗Ｏｌｉｇ２抗体を用いて免疫染色した免疫染色写真である。図３Ｂは、神経系細胞の軸索部分に発生・付着した小型細胞を用いて作製した末梢神経用神経束を、抗Ｓ１００抗体を用いて免疫染色した免疫染色写真である。図４は、神経束を作製するための装置の概略図である。図４Ａは、装置の上面図である。図４Ｂは、装置の溝部の断面図（クローバー状）である。図４Ｃは装置に各種細胞を添加した場合の装置全体および溝部の模式図である。図４Ｃの溝部の一部（クローバーの一つの小葉）の拡大模式図は、線維芽細胞および各種フィーダー細胞を順に添加した場合の模式図である。図５は、フィーダー細胞として各種細胞を用いた場合の培養日数と神経線維（軸索）の長さの関係を表すグラフである。図６Ａは、フィーダー細胞（血管周皮細胞）が存在する場合の神経束の形状を示す位相差顕微鏡写真である。図６Ｂは、フィーダー細胞（血管周皮細胞）が存在しない場合の神経束の形状を示す位相差顕微鏡写真である。図７は、実施例７の方法により作製された神経束（脊髄用の血管内在神経束）の肉眼写真および免疫染色写真である。図７Ａは肉眼写真である。図７Ｂは抗ＭＢＰ抗体および抗ＮＦ２００を用いた免疫染色写真である。図７Ｃは抗ＮＦ２００および抗ｖＷＦ抗体を用いた免疫染色写真である。図８は、ＮＦ２００およびミエリン塩基性タンパク質について蛍光免疫染色を行った神経束の横断面の蛍光免疫染色写真である。図９は、ＮＦ２００およびｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子について蛍光免疫染色を行った神経束の横断面の蛍光免疫染色写真である。図１０Ａは、ラットのＴ９椎弓のみを切除した写真である。図１０Ｂは、ラットのＴ９椎弓および胸髄を切除した後の切除部分の写真である。図１１Ａは、ラットの脊髄（胸髄）に神経束移植材料を移植する直前の移植対象部位の写真である。図１１Ｂは、ラットの脊髄（胸髄）に神経移植材料を移植した直後の移植部位の写真である。図１２は、胸髄を切除したままのラットと胸髄を切除した後に神経束移植材料を移植したラットの移植（切除）後の運動機能の回復（ＢＢＢスコア）を示すグラフである。図１３Ａは、胸髄を切除した後に神経束移植材料を移植しなかったラットにおける、胸髄の切除後６週の切除部位の縦断面のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像である。図１３Ｂは、胸髄を切除した直後に神経束移植材料を移植したラットにおける、神経束移植材料の移植後６週の移植部位の縦断面のＨＥ染色像である。図１４Ａは、胸髄を切除した直後に神経束移植材料を移植したラットにおける、神経束移植材料の移植後６週の切除・移植部位の縦断面のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像である。図１４Ｂは、図１４Ａの染色像における、神経束移植材料とラット（ホスト）の切除された胸髄の神経部分との接合部分（図１４Ａの片矢印部分）を拡大したＨＥ染色像である。図１５Ａ～Ｃは、それぞれＳ１００、ｐ７５ＮＴＲおよびＤＡＰＩについて蛍光免疫染色を行った神経束の縦断面の蛍光免疫染色写真である。図１５Ｄは、図１５Ａ～Ｃの写真をマージした写真である。図１６Ａ～Ｄは、それぞれＨＮＫ－１糖鎖、ｐ７５ＮＴＲ、ＭＰＺおよびＤＡＰＩについて蛍光免疫染色を行った神経束の縦断面の蛍光免疫染色写真である。図１６Ｅは、図１６Ａ～Ｄの写真をマージした写真である。図１７は、ＮＦ２００およびミエリン塩基性タンパク質について蛍光免疫染色を行った神経束の横断面の蛍光免疫染色写真である。図１８Ａは、ＮＦ２００およびＳ１００について蛍光免疫染色を行った神経束の横断面の蛍光免疫染色写真である。図１８Ｂは、ＮＦ２００およびペリフェリンについて蛍光免疫染色を行った神経束の横断面の蛍光免疫染色写真である。図１９Ａは、ＮＦ２００およびペリアキシンについて蛍光免疫染色を行った神経束の横断面の蛍光免疫染色写真である。図１９ＢおよびＣは、いずれもＮＦ２００およびペリアキシンについて蛍光免疫染色を行った神経束の縦断面の蛍光免疫染色写真である。図２０ＡおよびＢは、いずれもＣＤ３１およびＰＤＧＦＲβについて蛍光免疫染色を行った神経束の横断面の蛍光免疫染色写真である。図２１Ａは、ＣＤ３１およびＰＤＧＦＲβについて蛍光免疫染色を行った神経束の横断面の蛍光免疫染色写真である。図２１Ｂは、図２１Ａの一部を拡大した蛍光免疫染色写真である。図２２は、ＣＤ３１およびＰＤＧＦＲβについて蛍光免疫染色を行った神経束の横断面の一部を拡大した蛍光免疫染色写真である。図２３Ａは、自家神経移植ラットの移植１２週後の移植部位の写真である。図２３Ｂは、神経束移植材料移植ラットの移植１２週後の移植部位の写真である。図２３Ｃは、人工神経移植ラットの移植１２週後の移植部位の写真である。図２３Ｄは、坐骨神経切離ラットの切離１２週後の移植部位の写真である。図２４Ａは、坐骨神経機能指数を算出するための数式である。図２４Ｂは、各移植ラットおよび坐骨神経切離ラットの、移植（切離）後の坐骨神経機能指数を示すグラフである。図２５は、各移植ラットおよび坐骨神経切離ラットの移植部位の遠位端側の腓腹筋の湿重量を示すグラフである。図２６Ａ～Ｄは、それぞれＳＴＥＭ１２１、ｐ７５ＮＴＲ、ＭＰＺおよびＤＡＰＩについて蛍光免疫染色を行った神経束の横断面の蛍光免疫染色写真である。図２６Ｅは、図２６Ａ～Ｄの写真をマージした写真である。

発明の具体的説明

（神経束の製造方法）
　本発明の一つの態様によれば、神経束を製造する方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう）が提供される。本発明の製造方法によれば、移植に十分な長さの軸索を有する神経束を作製することができる。

　神経束を製造する方法は、神経系細胞含有細胞集団を、血管構成細胞、血管周囲細胞およびオリゴデンドロサイトから選択される少なくとも一種の細胞を含むフィーダー細胞、およびグリア細胞（神経膠細胞）の存在下で培養して、神経系細胞の軸索を伸長させる工程を含む。

　本明細書において「神経系細胞含有細胞集団」とは、後述する神経系細胞を含有する細胞集団を意味する。神経系細胞含有細胞集団は、神経系細胞以外の細胞を含んでいてもよい。

　神経系細胞含有集団に含有される神経系細胞としては、神経系を構成する細胞だけではなく、神経系を構成する細胞に分化し得る細胞が挙げられる。神経系細胞としては、具体的には、神経幹細胞、神経細胞やグリア細胞に分化し得る細胞、神経細胞やグリア細胞への分化途中の細胞（例えば未成熟神経細胞、未成熟グリア細胞等）、分化した成熟神経細胞（例えば、成熟神経細胞、成熟グリア細胞等）のいずれも用いることができる。これらの神経系細胞は市販のものであってもよく、生体から単離して調製したものであってもよく、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から分化・誘導したものであってもよい。また、神経系細胞は、移植対象の個体に由来する細胞（自家細胞）であってもよいし、移植対象以外の個体に由来する細胞（他家細胞）であってもよい。好ましい実施形態において、神経系細胞含有集団は、神経幹細胞、神経細胞に分化し得る細胞、神経細胞への分化途中の細胞および／または成熟神経細胞を含有する。なお、神経系細胞含有細胞集団に含まれる神経系細胞は、本発明の神経束の移植対象において抗原性を示さないものであれば特に限定されず、いずれに由来するものであっても用いることができる。神経系細胞の由来としては、例えば、神経束の移植対象と同一の個体、神経束の移植対象と異なる個体、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ）ホモドナー等が挙げられる。また、神経系細胞の由来としては、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）遺伝子をゲノム編集技術により改変することによって免疫拒絶反応が抑制されている細胞、例えばユニバーサルドナー細胞等が挙げられる。

　神経系細胞含有細胞集団は、本発明の効果が奏される限りどのような形態であってもよいが、例えば、培地（αＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ－１２混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、ハム１０、ハム１２、ＲＰＭＩ１６４０培地、各種神経細胞培養培地等）に神経系細胞含有細胞集団が懸濁された形態、浮遊細胞の形態等である。

　神経系細胞含有細胞集団における神経系細胞の含有量は、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、例えば、神経系細胞の数として１０^３～１０^１０個、好ましくは１０^４～１０^９個、より好ましくは１０^５～１０^８個である。

　神経系細胞含有細胞集団に含まれる神経系細胞以外の細胞としては、例えば、内皮細胞、赤血球等が挙げられる。内皮細胞としては、好ましくは血管を形成し得る内皮細胞が用いられ、具体的には血管内皮細胞が挙げられる。なお、神経系細胞含有細胞集団に含まれる神経系細胞以外の細胞は、本発明の神経束の移植対象において抗原性を示さないものであれば特に限定されず、いずれに由来するものであっても用いることができる。神経系細胞以外の細胞の由来としては、例えば、神経束の移植対象と同一の個体、神経束の移植対象と異なる個体、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ）ホモドナー等が挙げられる。また、神経系細胞の由来としては、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）遺伝子をゲノム編集技術により改変することによって免疫拒絶反応が抑制されている細胞、例えばユニバーサルドナー細胞等が挙げられる。

　神経系細胞含有細胞集団が内皮細胞を含む場合、神経系細胞含有細胞集団をフィーダー細胞の存在下で培養することにより該内皮細胞が増殖・分化して、伸長した軸索に沿って内皮細胞に由来する管が形成される。その結果、得られる神経束が、軸索が伸長した神経系細胞（神経線維）の束に加え、神経線維（軸索）と同方向に伸び、神経線維（軸索）に付着する内皮細胞の管（血管）を有する。

　神経系細胞含有細胞集団に含まれる内皮細胞としては、内皮幹細胞、内皮細胞への分化途中の細胞、分化した成熟内皮細胞のいずれも用いることができる。また、神経系細胞含有細胞集団に含まれる内皮細胞の由来は特に限定されないが、好ましくは血管由来の内皮細胞、より好ましくは歯髄、歯肉、皮下組織、体腔内動脈、体腔内静脈または臍帯の血管由来の内皮細胞、より一層好ましくは歯髄の血管由来の内皮細胞が用いられる。これらの内皮細胞は市販のものであってもよく、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から分化・誘導したものであってもよい。また、内皮細胞は、移植対象の個体に由来する自家細胞であってもよいし、移植対象以外の個体に由来する他家細胞であってもよい。

　神経系細胞含有細胞集団における内皮細胞の含有量は、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、例えば、内皮細胞の数として２×１０^３～３×１０^１０個、好ましくは２×１０^４～３×１０^９個、より好ましくは２×１０^５～３×１０^８個である。好ましい実施形態において、神経細胞含有集団における内皮細胞の数は神経系細胞の数より多い。

　神経系細胞含有細胞集団は、上述した細胞の他に生体適合性材料を含んでいてもよい。生体適合性材料は、神経系細胞含有細胞集団に含まれる細胞が接着することができ、細胞の成長・増殖の過程で細胞により代謝・消費されるものであれば特に限定されることなく用いることができる。そのような生体適合性材料としては、例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ゼラチン、マトリゲル（登録商標）等が挙げられる。

　生体適合性材料の形状としては、上述した効果が奏される限り特に限定されないが、例えばビーズ（球状、略球状）状、棒状、膜状等が挙げられる。

　生体適合性材料の大きさとしては、例えば、形状がビーズ状の場合、直径５０～４００μｍ、好ましくは１００～３００μｍ、より好ましくは１００～２００μｍである。

　ビーズ状の生体適合性材料は、公知の方法を用いて適宜作製することができるが、例えば、油相に生体適合性材料を滴下して油相中に液滴を形成することにより作製することができる。油相を構成する油脂は、生体適合性材料の液滴が形成される限り特に限定されず、例えば、コーン油、ナタネ油、ゴマ油等の食用油、石油、天然ガス、石炭等に由来する鉱物油（ミネラルオイル）等が挙げられる。また、ビーズ（液滴）の径は、滴下量（速度）を変えることにより適宜調整することができる。

　神経系細胞含有細胞集団に含まれる神経系細胞は、生体適合性材料の表面に層状に存在することが好ましい。具体的には、神経系細胞を生体適合性材料の表面に層状に存在させることにより、培養後、軸索が伸長した各神経系細胞がひとまとまりの束となるため、径が大きい（太い）神経束を容易に作製することができるという利点がある。

　神経系細胞を生体適合性材料の表面に層状に存在させる方法としては、公知の方法を用いることができるが、例えば、生体適合性材料と神経系細胞含有細胞集団とを混合し、混合物を非接着性シャーレ等の容器に入れて旋回培養する方法が挙げられる。

　生体適合性材料の単位質量（ｇ）当たりの神経系細胞含有細胞集団の量は、例えば、神経系細胞の数として２００～１０００個、好ましくは３００～８００個、より好ましくは４００～６００個であるである。また、旋回培養の旋回条件は、例えば３０～６０ｒｐｍ、好ましくは３５～５５ｒｐｍ、より好ましくは４０～５０ｒｐｍである。

　神経系細胞含有細胞集団が内皮細胞を含む場合、神経系細胞含有細胞集団に含まれる内皮細胞は、生体適合性材料の表面に層状に存在することが好ましい。具体的には、内皮細胞を生体適合性材料の表面に層状に存在させることにより、培養の過程で、神経系細胞含有細胞集団に含まれる内皮細胞に由来する内皮細胞の層を有する複数の生体適合性材料が接触・融合し、その結果、表面が内皮細胞で構成され、内部に生体適合性材料を含む内皮細胞の管を形成することができる。そして、管内部の生体適合性材料を、管表面を構成する内皮細胞が成長・増殖する過程で取り込み、代謝・消費する結果、中空の内皮細胞の管を形成し得る。形成された内皮細胞の管は、作製される神経束の神経系細胞に酸素、栄養等を供給する管（血管）の役割を担うことができ、神経束が壊死するのを防ぐことができるという利点がある。なお、内皮細胞を生体適合性材料の表面に層状に存在させる方法としては、上述した神経系細胞を生体適合性材料の表面に層状に存在させる方法と同じ方法を用いることができる。

　神経系細胞および内皮細胞のそれぞれを生体適合性材料の表面に層状に存在させることの利点を達成するために、神経系細胞および内皮細胞はそれぞれ別個の生体適合性材料の表面に層状に存在させることが好ましい。具体的には、生体適合材料の表面に層状に神経系細胞を存在させ、別の生体適合材料の表面に層状に内皮細胞を存在させることが好ましい。

　生体適合性材料には、予め神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞成長因子β（β－ＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、栄養因子等の神経系細胞の成長・増殖を促進する物質（神経細胞成長因子）を混合してもよい。生体適合性材料が神経細胞成長因子を含むことにより、生体適合性材料の表面に存在する神経系細胞の成長をより効率的に促進することができる。

　生体適合性材料に混合する神経細胞成長因子の割合は、作製される神経束の大きさ等によって適宜設定することができるが、例えば、生体適合性材料の全質量に対して１～１０００ｎｇ／ｍｇ、５～７５０ｎｇ／ｍｇ、１０～５００ｎｇ／ｍｇである。

　神経細胞成長因子は単独で用いてもよいが、糖鎖の一種であるガングリオシド３（ＧＤ３）をさらに混合してもよい。生体適合性材料に混合するＧＤ３の量は特に限定されないが、例えば１０～１００ｎｇ／ｍｇ、１０～７５ｎｇ／ｍｇ、１０～５０ｎｇ／ｍｇ等である。生体適合性材料と神経細胞成長因子とを別々に凹部に添加する場合、神経細胞成長因子（ＧＤ３を用いる場合には神経細胞成長因子およびＧＤ３）を凹部に入れ、その後に神経系細胞を入れることにより、軸索の伸長をより促進することができる。

　神経系細胞含有細胞集団が内皮細胞を含む場合、生体適合性材料には、予め血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）等の内皮細胞の成長・増殖を促進する物質（内皮細胞成長因子）を混合してもよい。生体適合性材料が内皮細胞成長因子を含むことにより、生体適合性材料の表面に存在する内皮細胞の成長をより効率的に促進することができる。

　生体適合性材料に混合する内皮細胞成長因子の割合は、作製される神経束の大きさ等によって適宜設定することができるが、例えば生体適合性材料の全質量に対して１０～３００ｎｇ／ｍｇ、２０～２００ｎｇ／ｍｇ、３０～１００ｎｇ／ｍｇ等である。

　生体適合性材料と内皮細胞とを別々に凹部に添加する場合、生体適合性材料の表面に内皮細胞が付着するように生体適合性材料と内皮細胞とを凹部に添加することが好ましい。このように生体適合性材料と内皮細胞とを添加することにより、内腔を有する血管の形成をより促進することができる。

　神経系細胞含有細胞集団が内皮細胞を含む場合、生体適合性材料には、予め赤血球を混合してもよい。生体適合性材料が赤血球を含むことにより、神経系細胞含有細胞集団を培養する過程で形成された中空の内皮細胞の管の内部に赤血球を存在させることができる。その結果、完全な中空を有する内皮細胞の管を作製することができる。そして、作製された中空を有する内皮細胞の管を介して、作製された神経束において、赤血球や培養液により神経系細胞に酸素が供給されるため、神経束が壊死するのを防ぐことができる。

　生体適合性材料に混合する赤血球の量は、作製される神経束の大きさ等によって適宜設定することができるが、例えば、生体適合性材料の量に対して２～２０質量％、好ましくは３～１０質量％、より好ましくは４～７質量％である。

　本明細書において「フィーダー細胞」とは、神経系細胞および任意に内皮細胞の生存、増殖、分化を誘導または保持する物質を産生・分泌し、神経系細胞の伸長・肥大を促進する細胞をいう。フィーダー細胞により産生・分泌される物質としては、上述した機能を有する物質であれば特に限定されないが、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ－β）、栄養因子、成長ホルモン様作用物質、ＩＧＦ－１等が挙げられる。

　フィーダー細胞は、上述のような物質を産生・分泌する細胞を含むものであり、具体的には、血管を構成する血管構成細胞、血管の周囲に存在する血管周囲細胞およびオリゴデンドロサイトから選択される少なくとも一種の細胞を含む。

　オリゴデンドロサイトは中枢神経系の中のグリア細胞の１つであり、希突起膠細胞とも呼ばれる。なお、後述するグリア細胞がオリゴデンドロサイトを含む場合、フィーダー細胞はオリゴデンドロサイトを含んでもよいが、好ましくはフィーダー細胞はオリゴデンドロサイトを含まない。

　血管構成細胞としては、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、例えば、周皮細胞（例えば、血管周皮細胞）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞）等が挙げられる。また、血管周囲細胞としては、例えば、線維芽細胞（例えば、血管周囲線維芽細胞）、平滑筋細胞（例えば、血管平滑筋細胞）等が挙げられる。

　本明細書において「グリア細胞」とは、神経系を構成する細胞のうち、神経細胞ではない細胞であって、神経細胞の生存、発達、機能発現を補助する細胞全般を意味し、例えば、オリゴデンドロサイト（希突起膠細胞）、アストロサイト（星状膠細胞）、シュワン細胞（鞘細胞）、ミクログリア（小膠細胞）、上衣細胞等が挙げられる。本発明の好ましい態様によれば、グリア細胞はオリゴデンドロサイトを含む。

　本発明の好ましい実施形態によれば、本発明において用いられるグリア細胞は、以下の方法により調製される。
　まず、抜去歯から得られた歯髄を酵素（トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ等）により処理し、歯髄を構成する細胞を分離させる。次いで、分離させた細胞を親水性シャーレに播種し、神経誘導培地（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．（Ｈｕｍａｎ　Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．３０，　Ｉｓｓｕｅ　２，　ｐｐ６０－７１）に記載された分化誘導培地に任意にＥＧＦおよび／またはＦＧＦを添加した培地）で１～２日、温度３７℃、ＣＯ_２濃度４．７～５％で培養して小型球形細胞を得る。次いで、小型球形細胞を細胞非吸着性シャーレに播種し、維持培地（例えば、Ｂ２７　Ｐｌｕｓ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｙｓｔｅｍ）で１日程度、温度３７℃、ＣＯ_２濃度４．７～５％で旋回培養する。旋回培養の旋回速度は、好ましくは３０～１００ｒｐｍ、より好ましくは４０～８０ｒｐｍ、より一層好ましくは５０～６０ｒｐｍである。細胞集合体（スフェロイド）を形成させる。次いで、形成した細胞集合体をトリプシン／ＥＤＴＡ、コラゲナーゼまたはディスパーゼにより処理し、細胞集合体を構成する細胞を分離させる。次いで、分離させた細胞を親水性シャーレに播種して神経系細胞を得る。次いで、得られた神経系細胞を、オルニチンおよび／またはリジンをコーティングしたシャーレまたはフラスコで培養することにより、神経系細胞を二次元の網目状に分化・成長させる。網目状に分化・成長した神経系細胞の細胞体部分および軸索部分に、それぞれ小型細胞が発生・付着する。これらの小型細胞はいずれもグリア細胞であり、神経系細胞の細胞体部分において発生・付着した小型細胞は、グリア細胞の中でも特にオリゴデンドロサイトに分化し、軸索部分において発生・付着した小型細胞は、シュワン細胞に分化する。このような方法により、グリア細胞、特にオリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞を効率的に調製することができることは、従来知られていなかった驚くべき事実である。なお、神経系細胞の細胞体部分において発生・付着した小型細胞が、オリゴデンドロサイトまたはシュワン細胞であることは、免疫染色等の従来公知の方法により簡便に確認することができる。

　一つの実施形態によれば、本発明の方法により製造される神経束は、該神経束を構成する神経系細胞の少なくとも一部、好ましくは全部が、その軸索部分にグリア細胞の一種であるオリゴデンドロサイトを含む髄鞘を有し得る。したがって、本発明の方法により製造される神経束は、特に脳、脊髄等の中枢神経系における神経束として用いることができる。具体的には、本発明の方法により製造される神経束を用いることに重症脊髄損傷により四肢または両下肢の運動機能が完全にまたは部分的に失われた患者において、四肢または両下肢の運動機能を回復させることができる。

　神経束を製造する方法は、神経系細胞含有細胞集団を、血管構成細胞、血管周囲細胞およびオリゴデンドロサイトから選択される少なくとも一種の細胞を含むフィーダー細胞、およびグリア細胞の存在下で培養して、神経系細胞の軸索を伸長させる工程を含む限り特に限定されないが、当該工程は、例えば以下の工程（ａ）～（ｅ）のようにして行うことができる。

工程（ａ）
　本工程では、少なくとも一つの凹部と、該凹部に接続する少なくとも一つの溝部であって、フィーダー細胞で被覆されている溝部とを備える基板が準備される。好ましい実施形態において、基板は、少なくとも一つの凹部、該凹部に接続し放射状に存在する複数の溝部であって、前記凹部と反対側の先端部分に別の凹部（先端凹部）を有する溝部を備える。溝部の数は特に限定されないが、例えば、３～３０個、５～２０個、７～１５個等とすることができる。基板が複数の溝部を備えることにより、一度に複数の神経束を作製することができる。また、好ましい実施形態において、基板の凹部には、フィーダー細胞により被覆する前に予め内皮細胞を添加し、内皮細胞により被覆する。具体的には、凹部に内皮細胞を約１０^６個添加し、６時間後静置した後、Ｈａｎｋｓ’液で洗浄することにより凹部を内皮細胞で被覆する。

　基板の材質は、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、例えば、ジメチルポリシロキサン、ポリスチレン、ポリプロピレン等が挙げられる。

　基板の形状および寸法は、本願発明の効果が奏される限り適宜設定することができる。基板の形状としては、少なくとも一つの平面を有することが好ましく、例えば直方体状、立方体状、円筒状等の形状であり、好ましくは直方体状である。

　基板の寸法は、少なくとも一つの凹部および溝部を備えることができれば特に限定されず、例えば、形状が直方体の場合、その寸法は、縦および横の長さが５～２０ｃｍ、５～１５ｃｍ、５～１０ｃｍ、高さ（深さ）が１～１０ｃｍ、１～５ｃｍ、１～３ｃｍである。

　基板は、神経系細胞含有細胞集団およびグリア細胞を収容するための少なくとも一つの凹部を備える。基板が複数の凹部を備える場合、該複数の凹部の配置は本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、好ましくは複数の凹部は基板の同一の平面上に存在する。例えば、基板は二つの凹部を備え、該二つの凹部は基板の同一の平面上に存在する。

　凹部の形状および寸法は、本発明の効果が奏される限り適宜設定することができる。凹部の形状としては、例えば円筒状、直方体状、立方体状、半球状等の形状が挙げられる。

　凹部の形状が円筒状の場合、その寸法は、例えば、開口部の直径が１～１５ｍｍ、好ましくは１～１０ｍｍ、より好ましくは１～７ｍｍであり、高さ（深さ）が２～８ｍｍ、好ましくは３～７ｍｍ、より好ましくは４～６ｍｍである。なお、基板が複数の凹部を備える場合、それらの形状および／または寸法は、互いに同一であっても異なっていてもよい。

　基板は、凹部に接続する溝部を備える。溝部は、フィーダー細胞で被覆される前に、線維芽細胞で被覆されてもよい。溝部が線維芽細胞で被覆される場合、溝部は、被覆された線維芽細胞に重ねてフィーダー細胞で被覆される。また、溝部は、グリア細胞によってさらに被覆されてもよい。溝部がグリア細胞で被覆される場合、グリア細胞は、好ましくはフィーダー細胞に重ねて被覆される。本発明の好ましい態様においては、溝部は、最初に線維芽細胞で被覆され、次いで、フィーダー細胞として内皮細胞、次いで重ねてフィーダー細胞として周皮細胞で被覆され次いで、被覆されたフィーダー細胞に重ねてグリア細胞で被覆される（図４Ｃを参照されたい）。

　溝部の配置は本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、溝部と凹部とは同一平面上に存在する。また、基板が複数の凹部を備える場合、各凹部はそれぞれ溝部と接続しており、好ましくは溝部を介して複数の凹部が接続されている。好ましい実施形態において、基板は、中心となる一つの凹部、および該凹部の周囲に放射状に存在する複数の凹部を備え、中心となる凹部と放射状に存在する複数の凹部とをそれぞれ接続する溝部を備える。中心となる凹部の周囲に放射状に存在する凹部の数は特に限定されないが、例えば、３～３０個、５～２０個、７～１５個等とすることができる。基板がこのような構造を備えることにより、一度に複数の神経束あるいはこれらを束ねた太い神経束を作製することができる。

　溝部の形状（断面形状）および寸法（長さ、深さ）は、本発明の効果が奏される限り適宜設定することができる。溝部の形状としては、例えば、クローバー状、凹字状、Ｖ字状、Ｕ字状、Ω型形状等が挙げられる。好ましい実施形態において、溝部の形状はクローバー状とされる。基板がクローバー状の溝部を備える場合、その断面形状におけるクローバーの小葉部分の直径は、例えば０．５～２ｍｍ、０．７５～１．５ｍｍ、１～１．２ｍｍとすることができる。

　溝部の長さ（凹部からの距離）としては、例えば３～５０ｍｍ、好ましくは１５～４０ｍｍ、より好ましくは２０～３０ｍｍである。また、溝の深さとしては、例えば、１～１０ｍｍ、好ましくは２～７ｍｍ、より好ましくは３～５ｍｍである。また、溝の幅としては、例えば、１～５ｍｍ、好ましくは１．５～４ｍｍ、より好ましくは２～３ｍｍである。なお、基板が複数の凹部を備える場合、溝部の長さは凹部間の長さ（距離）をいう。

工程（ｂ）
　本工程では、神経系細胞含有細胞集団およびグリア細胞が凹部に添加される。好ましい実施形態において、神経系細胞含有細胞集団およびグリア細胞は、それぞれ別個の生体適合性材料、好ましくはコラーゲンビーズ等のビーズの表面に層状に存在する状態で凹部に添加される。なお、神経系細胞含有細胞集団が内皮細胞を含む場合、神経系細胞含有細胞集団に含まれる神経系細胞と内皮細胞とが、それぞれ別個の生体適合性材料、好ましくはコラーゲンビーズ等のビーズの表面に層状に存在する状態で凹部に添加される。凹部に添加される神経系細胞含有細胞集団の量としては、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、例えば、神経系細胞の数として１０^３～１０^１０個、好ましくは１０^４～１０^９個、より好ましくは１０^５～１０^８個である。また、神経系細胞含有細胞集団が内皮細胞を含む場合、凹部に添加される内皮細胞の量は、神経系細胞の数と内皮細胞の数との比（神経系細胞の数：内皮細胞の数）として、例えば１：１～１：１０、１：２～１：７、１：３～１：５である。

　凹部に添加されるグリア細胞の量としては、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、例えば、グリア細胞の数として１０^４～１０^６個、好ましくは５×１０^４～５×１０^５個、より好ましくは８×１０^４～１０^５個である。また、神経系細胞含有細胞集団に含まれるグリア細胞の数と神経系細胞の数との比（グリア細胞の数：神経系細胞の数）は、例えば、１：３～１：１００、１：５～１：５０、１：１０～１：３０である。

工程（ｃ）
　本工程では、基板の凹部および溝部に培養液を添加して、凹部に添加された神経系細胞含有細胞集団およびグリア細胞を培養することにより、基板の溝部に沿って神経系細胞の軸索が伸長される。好ましい実施形態において、神経系細胞含有細胞集団およびグリア細胞の培養は還流培養により行われる。また、神経系細胞の軸索が伸長するのと並行して、グリア細胞（オリゴデンドロサイト）が神経系細胞の軸索に付着し、オリゴデンドロサイトの髄鞘が形成される。

　添加される培養液としては、神経系細胞の培養に通常用いられる培養液であれば特に限定されず、例えば、神経細胞培養液、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＥＭＥＭ、ハム１０、ハム１２等の基本培地、基本培地を改良したＤＭＥＭ／Ｆ１２等が挙げられる。これらの培地には、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アラニン等の各種アミノ酸、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の添加剤、アルブミン等を添加してもよい。培地にＦＢＳを添加する場合、その濃度は、培地に対して、例えば５～２０質量％、７～１５質量％、１０～１５質量％である。また、培養液の添加方法としては、凹部および溝部のそれぞれに培養液を添加してもよく、予め培養液を満たした容器に基板を浸して、凹部および溝部のそれぞれに培養液を供給してもよい。

　培養条件としては、神経系細胞含有細胞集団に含まれる細胞およびグリア細胞が成長・増殖する限り特に限定されないが、例えば、温度３５～３８℃、ＣＯ_２濃度３～５％、培養時間２０～２４時間の条件での静置培養が挙げられる。なお、神経系細胞の軸索の伸長の程度に応じて、静置培養と還流培養とを組み合わせてもよい。還流培養の条件は、例えば、温度３５～３８℃、ＣＯ_２濃度３～５％、還流速度１～１０ｍｌ／時間、好ましくは２～５ｍｌ／時間、培養時間７２時間～６０日間とすることができる。

（本発明の製造方法により製造される神経束）
　本発明の一つの態様によれば、上記方法により製造される神経束が提供される。本発明の製造方法により製造される神経束は、必要に応じて適切な加工をすることにより、移植材料、特に中枢神経再生用の移植材料として用いることができる。

　神経束は、必要に応じて複数を組み合わせて、神経束の束として用いることもできる。神経束の束は、予め準備した生体適合性材料のシートで複数の神経束をロール（被覆）することによって作製することができる。生体適合性材料のシートとしては、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、例えば、線維芽細胞のシート、膠原線維網のシート、弾性線維網のシート等が挙げられる。

　一つの実施形態によれば、神経束を、予め準備した線維芽細胞のシートの上に複数配置し、複数の神経束を線維芽細胞のシートで巻き物（海苔巻き）状にロールすることによって神経束の束とすることができる。神経束の束の太さ（径）は、線維芽細胞のシートに配置する神経束の数により任意に変えることができる。このように、神経束を線維芽細胞のシートでロールした場合、該線維芽細胞のシートの端部と、移植対象となる神経の損傷部（神経断端）とを縫合することにより、容易に移植することが可能となる。

　別の実施形態によれば、予め準備した線維芽細胞のシートの表面に複数の神経束を揃えて隙間なく並べて付着させ、そのようにして神経束を付着させた線維芽細胞のシートを２枚準備し、２枚の生体適合性材料のシートを、神経束を付着させた表面同士が接触するよう、かつ、神経束の向きが揃うように重ねることにより神経束の束とすることができる。神経束の束の太さは、線維芽細胞のシートの表面に付着させる神経束の数により任意に変えることができる。また、さらに別の実施形態によれば、神経束を付着させた線維芽細胞のシートを１枚準備し、一方で、神経系細胞ビーズ、内皮細胞ビーズおよびグリア細胞ビーズを質量比おおよそ３：１：１とした細胞混合物が充填された管を準備する。次いで、準備した線維芽細胞のシートおよび管を、シート表面の神経束の少なくとも一方の端部と管の端部とが接触するように配置し、神経束と管とを一体的に線維芽細胞のシートでロールして筒状にし、その後、管内部に充填された細胞混合物を前記筒の内部に放出して、筒の内部に充填する。次いで、細胞混合物が充填された筒状の線維芽細胞のシートを３時間静置培養した後に還流培養する。そうすることにより、細胞混合物が分化、増殖して神経束をさらに伸長する。その結果、より長い神経束の束を得ることが可能となる。なお、用いられる管としては、例えばガラス管が挙げられる。また、管の太さ（径）は特に限定されず、目的とする神経束の束に応じて適宜設定することができる。

　神経束は、損傷を受けた神経の代替となる移植材料（神経再生用移植材料）として用いることができる。移植対象は特に限定されず、例えば、中枢神経系、末梢神経系等に移植することができるが、好ましくは中枢神経系に移植される。

　神経束は、移植対象の個体に由来する細胞（自家細胞）を用いて作製することもできるし、移植対象以外の個体に由来する細胞（他家細胞）を用いて作製することもできる。したがって、自家細胞を用いて本発明の神経束を作製することによって、神経束の材料となる細胞の由来である個体に対して拒絶反応をほとんど引き起こすことなく神経束を移植（自家移植）することが可能となる。

（神経系細胞の軸索の伸長方法）
　本発明の一つの態様によれば、神経系細胞の軸索を伸長させる方法（以下、「本発明の方法」ともいう）が提供される。本発明の方法によれば、神経系細胞の軸索を効率的に伸長させることが可能となる。また、本発明の方法によれば、神経の軸索の径を効率的に大きくすることも可能となる。

　本発明の方法は、神経系細胞含有細胞集団を、血管構成細胞、血管周囲細胞およびオリゴデンドロサイトから選択される少なくとも一種の細胞を含むフィーダー細胞およびグリア細胞の存在下で培養して、神経系細胞の軸索を伸長させる工程を含む。

　本発明の方法において、神経系細胞含有細胞集団、フィーダー細胞およびグリア細胞は、上述の神経束の製造方法において説明したのと同じものを用いることができる。

　本発明の方法において、神経系細胞含有細胞集団を、血管構成細胞、血管周囲細胞およびオリゴデンドロサイトから選択される少なくとも一種の細胞を含むフィーダー細胞およびグリア細胞の存在下で培養して、神経系細胞の軸索を伸長させる工程の具体的な条件等は、上述の神経束の製造方法において説明したのと同じものを用いることができる。

（神経束）
　本発明の一つの態様によれば、軸索が伸長した神経系細胞、および該軸索に沿って存在する内皮細胞の管を有する神経束であって、ＨＮＫ－１糖鎖発現細胞およびｐ７５ＮＴＲ発現細胞の少なくとも１種の細胞を含み、前記軸索がオリゴデンドロサイトを含む髄鞘を有する神経束（以下、「本発明の神経束」ともいう）が提供される。

　ＨＮＫ－１（Ｈｕｍａｎ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｋｉｌｌｅｒ－１）糖鎖はＣＤ５７とも呼ばれ、モノクローナル抗体ＨＮＫ－１により認識されるヒトナチュラルキラー細胞上に発現する糖鎖抗原として見出された。ＨＮＫ－１糖鎖は、ヒトをはじめとする多くの脊椎動物の神経系において発現することが知られている。

　また、ｐ７５ＮＴＲ（ｐ７５　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、低親和性神経栄養因子受容体とも呼ばれ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに属する分子量７５ｋＤａの一回膜貫通型の神経栄養因子に対する受容体である。

　ＨＮＫ－１糖鎖およびｐ７５ＮＴＲはいずれも、脊椎動物（特にヒト）において、神経堤細胞が背側神経管から分離する発生の初期段階において主に発現する神経堤幹細胞マーカーとして知られている。すなわち、ＨＮＫ－１糖鎖およびｐ７５ＮＴＲは、胚発生段階の脊椎動物の未成熟な神経系において発現するのに対して、胚発生後の脊椎動物の神経系においては、ＨＮＫ－１糖鎖およびｐ７５ＮＴＲのいずれも発現が極めて減弱するか、または発現しなくなる。したがって、正常な成体の脊椎動物の成熟した神経系においては、ＨＮＫ－１糖鎖およびｐ７５ＮＴＲのいずれも、発現が極めて弱いか、または発現していない。

　一般的に、発生の初期段階の胚の未成熟な神経系から神経束を入手することは極めて困難であり、実質的に不可能であることから、従来、ＨＮＫ－１糖鎖および／またはｐ７５ＮＴＲを発現する細胞を含む神経束は存在しなかった。したがって、本発明の神経束は、ＨＮＫ－１糖鎖および／またはｐ７５ＮＴＲを実質的に発現する点で極めて特異であると言える。

　好ましい実施形態において、本発明の神経束は、ＨＮＫ－１糖鎖発現細胞およびｐ７５ＮＴＲ発現細胞を含む。ＨＮＫ－１糖鎖発現細胞およびｐ７５ＮＴＲ発現細胞は同一の細胞であってもよく、異なる細胞であってもよい。すなわち、１つの細胞中でＨＮＫ－１糖鎖およびｐ７５ＮＴＲの両方が発現していてもよく、異なる細胞でそれぞれＮＨＫ－１糖鎖およびｐ７５ＮＴＲが発現していてもよい。

　ＨＮＫ－１糖鎖およびｐ７５ＮＴＲについて、「ＨＮＫ－１糖鎖発現細胞」および「ｐ７５ＮＴＲ発現細胞」とは、それぞれＨＮＫ－１糖鎖およびｐ７５ＮＴＲを実質的に発現する細胞をいう。ここで、「実質的に発現する」、「実質的に発現している」等の表現は、細胞内に遺伝子の転写産物または翻訳産物が生成される状態を指す。具体的には、ｐ７５ＮＴＲは、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ））、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ））、ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ＮＴ－３）、ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－４／５（ＮＴ－４／５）等と結合し、神経細胞の軸索伸長を制御する。また、ＮＨＫ－１糖鎖は、神経の発達段階において発現の上昇がみられ、神経回路形成に関与している。ｐ７５ＮＴＲおよびＨＮＫ－１糖鎖はいずれも神経堤幹細胞のマーカーであり、成熟した神経系においては発現が極めて弱いか、または発現していないことが知られている。よって、これらのマーカーが発現している本発明の神経束は、正常な末梢神経や、成熟した神経系の神経細胞を用いて得られる従来の神経束および移植材料とは異なるものであると言える。

　本発明において、細胞におけるＨＮＫ－１糖鎖およびｐ７５ＮＴＲの発現は、ＨＮＫ－１糖鎖およびｐ７５ＮＴＲに対する各抗体を用いた免疫染色により各遺伝子の発現を検出することによって確認することができる。

　好ましい実施形態において、ＨＮＫ－１糖鎖発現細胞および／またはｐ７５ＮＴＲ発現細胞は、神経系細胞である。すなわち、好ましい実施形態においては、本発明の神経束は、ＨＮＫ－１糖鎖および／またはｐ７５ＮＴＲを発現する神経系細胞を含む。

　好ましい実施形態において、本発明の神経束は、ＮＳ２００を発現する細胞（ＮＳ２００発現細胞）、ペリフェリンを発現する細胞（ペリフェリン発現細胞）、ミエリン塩基性タンパク質を発現する細胞（ミエリン塩基性タンパク質発現細胞）、Ｓ１００を発現する細胞（Ｓ１００発現細胞）、ＭＰＺを発現する細胞（ＭＰＺ発現細胞）、ペリアキシンを発現する細胞（ペリアキシン発現細胞）、ＣＤ３１を発現する細胞（ＣＤ３１発現細胞）およびＰＤＧＦＲβを発現する細胞（ＰＤＧＦＲ発現細胞）からなる群から選択される少なくとも１種の細胞を含む。上記の各遺伝子を発現する細胞は、同一の細胞であってもよく、異なる細胞であってもよい。すなわち、１つの細胞中で上記遺伝子の２種以上が発現する場合も、本実施形態に包含される。例えば、ＮＳ２００発現細胞とは、上記遺伝子のうちＮＳ２００のみを発現する細胞であってもよく、ＮＳ２００に加えて上記遺伝子のいずれかの遺伝子を発現する細胞であってもよい。

　特に好ましい実施形態において、本発明の神経束は、ＮＳ２００発現細胞、ペリフェリン発現細胞、ミエリン塩基性タンパク質発現細胞、Ｓ１００発現細胞、ＭＰＺ発現細胞、ペリアキシン発現細胞、ＣＤ３１発現細胞およびＰＤＧＦＲ発現細胞の全てを含む。

　ＮＦ２００、ペリフェリン、ミエリン塩基性タンパク質、Ｓ１００、ＭＰＺおよびペリアキシンの各遺伝子はいずれも神経系の発現マーカーとして知られている。具体的には、ＮＦ２００（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　２００）はおよびペリフェリン（Ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｎ）は、それぞれ有髄神経のニューロンマーカーとして知られている。なお、Ｓ１００はシュワン細胞のマーカーとしても知られている。また、ミエリン塩基性タンパク質、Ｓ１００、ＭＰＺ（Ｍｙｅｌｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｚｅｒｏ）およびペリアキシン（Ｐｅｒｉａｘｉｎ）は、それぞれ髄鞘のマーカーとして知られている。

　一方、ＣＤ３１およびＰＤＧＦＲβの各遺伝子はいずれも血管系の発現マーカーとして知られている。具体的には、ＣＤ３１は、血管内皮細胞のマーカーとして知られている。また、ＰＤＧＦＲβ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　β、血小板由来成長因子受容体β）は、血管周皮細胞および線維芽細胞のマーカーとして知られている。

　上記各遺伝子の発現の有無の確認は、上述したＨＮＫ－１糖鎖およびｐ７５ＮＴＲの発現の有無を確認するのと同様の方法により行うことができる。

　本発明の神経束は、神経系細胞の軸索に沿って存在する内皮細胞の管を有する。管を構成する内皮細胞の少なくとも一部の細胞は、好ましくは血管由来の内皮細胞、より好ましくは歯髄、歯肉、皮下組織、体腔内動脈、体腔内静脈または臍帯の血管由来の内皮細胞、より一層好ましくは歯髄の血管由来の内皮細胞である。また、内皮細胞は、神経束の移植対象の個体に由来する自家細胞であってもよいし、移植対象以外の個体に由来する他家細胞であってもよい。内皮細胞の管は、神経束の神経系細胞に酸素、栄養等を供給する管（血管）の役割を担うことができ、神経束が壊死するのを防ぐことができるという利点がある。

　好ましい実施形態において、上述した内皮細胞の管は周皮細胞をさらに含む。内皮細胞の管が周皮細胞をさらに含むことにより、具体的には、内皮細胞の管を周皮細胞が裏打ちすることにより、内皮細胞の管が補強される。本発明の神経束が、内皮細胞の管が血管の役割を担う場合には、内皮細胞の管がより強固であることにより、血液が内皮細胞の管の中を安定的に流動することができる。

　好ましい実施形態において、本発明の神経束は、神経系細胞の軸索に沿って軸索の少なくとも一部、好ましくは全部を被覆する、線維芽細胞および周皮細胞の少なくとも１種の細胞を含む細胞層を有する。特に好ましい実施形態において、本発明の神経束は、当該細胞層の内部に、上述した内皮細胞の管を有する。

　本発明の神経束は、損傷を受けた神経の代替となる移植材料、特に神経再生用移植材料として用いることができる。神経束の移植対象は特に限定されず、例えば、中枢神経系、末梢神経系等に移植することができるが、好ましくは末梢神経系に移植される。

［神経束を製造するための装置］
　本発明の一つの態様によれば、神経束を製造するための装置（以下、「本発明の装置」ともいう。）が提供される。本発明の装置は少なくとも一つの第１凹部と、少なくとも第１および第２端部を有する少なくとも一つの第１溝部とを有し、前記第１溝部が、少なくとも第１および第２端部を有し前記第１溝部と平行に延びる少なくとも一つの第２溝部を有し、前記第１凹部と前記第１および第２溝部のそれぞれの第１端部とが接続している装置である。

　一つの実施形態において、第１凹部は、直径３～１０ｍｍの開口部、水平または凹状に湾曲した底部有する深さ４～８ｍｍの凹部である。好ましい実施形態において、第１凹部は、直径８ｍｍの開口部、水平または凹状に湾曲した底部を有する深さ６ｍｍの凹部である。

　一つの実施形態において、第１溝部は、水平または凹状に湾曲した底部を有し、淵部の幅４～６ｍｍ、第１端部から第２端部までの長さ２～３ｃｍ、深さ４～６ｍｍの溝部である。好ましい実施形態において、第１溝部は、水平または凹状に湾曲した底部を有し、淵部の幅５ｍｍ、第１端部から第２端部までの長さ２～３ｃｍ、深さ６ｍｍの溝部である。

　一つの実施形態において、第２溝部は、水平または凹状に湾曲した底部を有し、淵部の幅２～２．５ｍｍ、深さ１．５～２ｍｍの溝部である。特に好ましい実施形態において、第２溝部は、水平または凹状に湾曲した底部を有し、淵部の幅２．５ｍｍ、深さ２ｍｍの溝部である。

　第１溝部は、第２溝部を１つ有していてもよく、複数有していてもよい。好ましい実施形態において、第１溝部は３つの第２溝部を有する。この場合、第１溝部における第２溝部の配置は、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、図４Ｂに示すような配置とすることが好ましい。

　本発明の装置は、第１凹部に加えて第２凹部を有していてもよい。第２凹部は１つであってもよく、複数であってもよい。好ましい実施形態において、第１および第２溝部の第２端部が第２凹部と接続している。第２凹部が複数ある場合、異なる第１および第２溝部の第２端部がそれぞれ第２凹部と接続している。

　一つの実施形態において、第２凹部は、直径２～５ｍｍの開口部、水平または凹状に湾曲した底部を有する深さ３～６ｍｍの凹部である。好ましい実施形態において、第２凹部は、直径３．５ｍｍの開口部、水平または凹状に湾曲した底部を有する深さ４ｍｍの凹部である。

　第１および／または第２溝部は、親水性を向上させるための表面処理がされていることが好ましい。親水処理としては、細胞毒性を奏さない限り特に限定されないが、例えば、プラズマ処理等が挙げられる。

　本発明の装置の大きさは、上述した各部位が収まる限り特に限定されないが、例えば、縦４～１０ｃｍ、横４～１０ｃｍ、厚さ０．８～１．５ｃｍであり、前記縦および横の長さを有する平面に、上記の各部位が形成されている。好ましい実施形態において、本発明の装置の大きさは、縦８ｃｍ、横８ｍ、厚さ１ｃｍである。

　本発明の装置の材料は、細胞毒性を奏さない限り特に限定されないが、例えば、ポリジメチルシロキサン等が挙げられる。

　一つの実施形態において、第１凹部には、神経系細胞、血管内皮細胞、オリゴデンドロサイトが配置される。これらの各細胞としては、それぞれ上述した本発明の製造方法において記載したのと同じものを用いることができる。

　一つの実施形態において、第１および第２溝部の少なくとも１つの溝部に、血管構成細胞、血管周囲細胞およびオリゴデンドロサイトから選択される少なくとも一種のフィーダー細胞、およびグリア細胞が配置される。これらの各細胞としては、それぞれ上述した本発明の製造方法において記載したのと同じものを用いることができる。

　本発明の装置を用いて、上述した本発明の製造方法に従って、神経束を作製することができる。

　以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：グリア細胞の調製
　以下の手順に従って、本実施例において用いられるグリア細胞を調製した。
　親知らず（Ｍ３）から得られた歯髄を酵素（０．１％トリプシンン／０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（－））により処理し、歯髄を構成する細胞を分離させた。次いで、分離させた細胞を親水性シャーレに播種し、神経誘導培地（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍａｎ　Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．３０，　Ｉｓｓｕｅ　２，　ｐｐ６０－７１に記載された分化誘導培地）で１～２日、温度３７℃、ＣＯ_２濃度４．７％で培養して小型球形細胞に分化させた。次いで、ピペッティングで小型球形細胞を採取し、遠心（１５００ｒｐｍ）し、神経維持培地を用いて細胞非吸着性シャーレに播種し、神経維持培地で１日程度、温度３７℃、ＣＯ_２濃度４．７％で旋回培養（６０ｒｐｍ）し、細胞集合体（スフェロイド）を形成させた。次いで、形成した細胞集合体を上記トリプシン／ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（－）により処理し、細胞集合体を構成する細胞を分離させた。次いで、分離させた細胞を親水性シャーレに播種して神経系細胞を得た。次いで、得られた神経系細胞を、オルニチンおよびリジンを含む神経維持培地で培養することにより、神経系細胞を二次元の網目状に分化・成長させた。二次元の網目状に分化・成長した神経系細胞の位相差顕微鏡写真を図１ＡおよびＢに示す。次いで、網目状に分化・成長した神経系細胞の細胞体部分および軸索部分のそれぞれに発生・付着した小型細胞を採取した（図１Ａの矢印および図１Ｂの矢頭は、それぞれ神経系細胞の細胞体部分および軸索部分に発生・付着した小型細胞を示す）。次いで、各小型細胞について抗Ｓ１００抗体および抗Ｏｌｉｇ２抗体を用いて免疫染色したところ、神経系細胞の細胞体部分に発生・付着した小型細胞はグリア細胞の一種のオリゴデンドロサイトであり、軸索部分に発生・付着した小型細胞はグリア細胞の一種のシュワン細胞であることが確認された。すなわち、図２ＡおよびＢに示すように、細胞体部分に発生・付着した小型細胞は、シュワン細胞マーカーの一つであるＳ１００に対して陰性であったのに対し、オリゴデンドロサイトのマーカーの一つであるＯｌｉｇ２に対して陽性であった。一方、図３ＡおよびＢに示すように、軸索部分に発生・付着した小型細胞は、シュワン細胞マーカーの一つであるＳ１００に対して陽性であったのに対し、オリゴデンドロサイトのマーカーの一つであるＯｌｉｇ２に対して陰性であった。

実施例２：神経系細胞含有細胞集団の作製
　以下の手順に従って、本実施例において用いられる神経系細胞含有細胞集団を作製した。
　ヒトの歯髄、歯肉上皮組織下層、口腔内上皮組織下層から採取された口腔内間葉細胞を細胞接着性シャーレ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し、ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を使用して、３７℃、ＣＯ_２濃度４．５～５．５％で３～７継代まで培養し、トリプシン・ＥＤＴＡ液で細胞を分離させ、分離した細胞を新しいシャーレに薄く播種し、増殖能の高い大きなコロニーをコニアルクローニング（ｃｏｌｏｎｉａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ）して、歯髄由来間葉幹細胞を得た。得られた幹細胞を、Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．（Ｈｕｍａｎ　Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．３０，　Ｉｓｓｕｅ　２，　ｐｐ６０－７１）に記載された分化誘導培地に上皮成長因子（ＥＧＦ）を１０ｎｇ／ｍｌおよび線維芽細胞増殖因子β（β－ＦＧＦ）を１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地を使用して、３７℃、ＣＯ_２濃度４．５～５．５％で培養し、分化を誘導して神経系細胞含有細胞集団を作製した。免疫染色およびＲＴ－ＰＣＲで分析をしたところ、分化誘導後の細胞として、神経幹細胞、未成熟神経細胞、未成熟グリア細胞、成熟神経細胞および成熟グリア細胞が含まれていることが確認された。また、チロシンヒドロキシラーゼの免疫染色により、分化誘導後の細胞としてドーパミン細胞が含まれていることが確認された。

実施例３：内皮細胞の作製
　以下の手順に従って、本実施例において用いられる内皮細胞を作製した。
　ヒトの口腔内から採取された血管網含有組織を消化酵素で処理して細胞を分離させ、初代培養を行った。形態的に判別できる内皮細胞のコロニーをコロニアルクローニング（ｃｏｌｏｎｉａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ）で分離し、これを増殖させて内皮細胞を得た。

実施例４：神経系細胞ビーズの作製
　以下の手順に従って、本実施例において用いられる神経系細胞ビーズを作製した。
　アテロコラーゲン液（株式会社高研製）に、１０倍に濃縮したダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ－１２混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を、アテロコラーゲン液に対して１０質量％となるように添加し、撹拌・混合してアテロコラーゲン混合液を得た。得られたアテロコラーゲン混合液を、アテロコラーゲンの粒子（ビーズ）径が２００μｍとなるように、コーン油に滴下して生体適合性材料（コラーゲンビーズ）を作製した。得られたコラーゲンビーズと実施例２で作製された神経系細胞含有細胞集団とを質量比１：５００となるように混合し、混合後、非接着性シャーレ（ＩＷＡＫＩ社製）に入れて４０～６０ｒｐｍの旋回速度で培養し、コラーゲンビーズの表面に神経系細胞含有細胞集団を層状に保持させて、神経系細胞ビーズを作製した。

実施例５：内皮細胞ビーズの作製
　以下の手順に従って、本実施例において用いられる内皮細胞ビーズを作製した。
　アテロコラーゲン液（株式会社高研製）に、８～１０倍に濃縮したＲＰＭＩ１６４０培地をアテロコラーゲン液に対して１０質量％となるように添加した。さらに、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｓｉｇｍａ社製）を５０ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、さらに赤血球を５質量％となるよう添加し、撹拌・混合してアテロコラーゲン混合液を得た。得られたアテロコラーゲン混合液を、アテロコラーゲンの粒子（ビーズ）径が１００μｍとなるように、コーン油に滴下して生体適合性材料（コラーゲンビーズ）を作製した。得られたコラーゲンビーズと実施例３で作製された内皮細胞とを質量比１：５００となるように混合し、混合後、非接着性シャーレ（ＩＷＡＫＩ社製）に入れて４０～６０ｒｐｍの旋回速度で培養し、コラーゲンビーズの表面に内皮細胞を層状に保持させて、内皮細胞ビーズを作製した。

実施例６：神経束作製装置の作製
　以下の手順に従って、神経束作製のための装置を作製した。
　ジメチルポリシロキサンの基板（縦８ｃｍ×横８ｃｍ×厚み１ｃｍ）の表面中央に直径５ｍｍ、深さ５ｍｍの円筒状の凹部を形成した。さらに、該凹部を中心として、放射状に１２個の溝部（長さ３ｃｍ、深さ４ｍｍ、幅２．５ｍｍ）を形成した。各溝部の先端部分（前記凹部と接続する側とは反対側の先端部分）にそれぞれ円筒状の凹部（先端凹部、直径３ｍｍ、深さ５ｍｍ）を形成した。各溝部に、各小葉の直径が約１ｍｍとなるようにクローバー状の溝を形成して、神経束作製のための装置を作製した。作製された装置の概略図および溝部の概略図をそれぞれ図４ＡおよびＢに示す。

実施例７：神経束の作製
　神経束の作製に先立ち、以下の手順により、神経系細胞の軸索を伸長させるのに好適なフィーダー細胞を検討した。
　実施例６で作製された装置を４つ準備し、それぞれ装置の溝部に、フィーダー細胞として血管構成細胞（血管周皮細胞、血管内皮細胞、血管由来平滑筋細胞）、血管周囲細胞（血管周囲線維芽細胞）、オリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞を播種した。その後、各装置を培養容器に入れ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１５質量％となるように添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を培養容器に添加した。培養容器をＣＯ_２インキュベーター（温度３７℃、ＣＯ_２濃度４．７％）内に静置して、各装置の溝部の細胞を培養し、溝部に単層の各細胞の層を形成させた。次いで、実施例４で作製された神経系細胞ビーズおよび実施例５で作製された内皮細胞ビーズを、質量比３：１となるように混合し、各装置の二つの凹部のそれぞれにマイクロピペットで添加した。それぞれの凹部にＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を添加して、各装置をＣＯ_２インキュベーター（温度３７℃、ＣＯ_２濃度４．７％）内に静置して２０時間培養した。次いで、各装置をチャンバー（縦６ｃｍ×横６ｃｍ×厚み２ｃｍ）内に入れ、７２～１６８時間還流培養（流速２ｍｌ／分、温度３７℃、ＣＯ_２濃度４．７％）し、神経系細胞の軸索を溝部の各細胞層上に伸長させて、培養日数と神経束の長さとの関係を検討した。結果を図５に示す。なお、図５には示していないが、血管周皮細胞、血管内皮細胞、血管周囲線維芽細胞および血管由来平滑筋細胞をフィーダー細胞として用いた場合の培養開始後３０日における軸索の径は、それぞれ１００～１５０μｍ程度、５０～８０μｍ程度、２０～３０μｍ程度および１０～２０μｍ程度であった。一方、フィーダー細胞を用いなかった場合には、神経系細胞の軸索はほとんど伸長、肥大せず、培養開始後３０日における長さは５～１０μｍ程度、径は５～１０μｍ程度であった。

　図５の結果から、血管構成細胞、血管周囲細胞またはオリゴデンドロサイトをフィーダー細胞として用いた場合には、神経系細胞の軸索が効率的に伸長することが示された。特に、血管構成細胞である血管周皮細胞もしくは血管内皮細胞、またはオリゴデンドロサイトをフィーダー細胞として用いた場合には、神経系細胞の軸索が非常に効率的に伸長することが示された。

　また、予備的に、実施例６で作成された装置を用いて神経束を作製する場合に、フィーダー細胞の有無が神経束の伸長にもたらす影響について検討を行った。具体的には、血管周皮細胞（血管周皮線維芽細胞）が装置の溝部に存在する場合と存在しない場合とで、神経束の伸長を観察した。血管周皮細胞が装置の溝部に存在する場合および存在しない場合の神経束の位相差顕微鏡写真を、それぞれ図６ＡおよびＢに示す。図６Ａの写真から、血管周皮細胞が存在する場合には、オリゴデンドロサイトが直線的に伸長し、神経束が直線的に伸長することが示唆された。一方、図６Ｂの写真から、血管周皮細胞が存在しない場合には、オリゴデンドロサイトが分岐状に伸長し、神経束が直線的に伸長せず、分岐状に伸長することが示唆された。一般的に、神経束を移植材料として用いる場合には、直線状の神経束が好適に用いられることから、神経束の作成に当たってはフィーダー細胞、特に血管周皮細胞を用いることが好ましいことが示唆された。

　以下、血管周皮細胞をフィーダー細胞として用いて、以下の手順に従って神経束を作製した。
　実施例６で作製された装置の各溝部に線維芽細胞を播種して、単層の線維芽細胞の層を形成した。次いで、線維芽細胞の上にヒト由来の血管周皮細胞を播種して、単層～多層の血管周皮細胞の層を形成した。その後、装置を培養容器に入れ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１５質量％となるように添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を培養容器に添加した。培養容器をＣＯ_２インキュベーター（温度３７℃、ＣＯ_２濃度４．７％）内に静置して、装置の各溝部の線維芽細胞および血管周皮細胞を培養し、各溝部に単層の線維芽細胞層および線維芽細胞層上に接着した単層の血管周皮細胞の層を形成した。次いで、実施例１で作製されたグリア細胞（オリゴデンドロサイト）、実施例４で作製された神経系細胞ビーズおよび実施例５で作製された内皮細胞ビーズを、質量比がおおよそ１：４：２となるように混合し、装置の凹部のそれぞれにマイクロピペットで添加した。それぞれの凹部にＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を添加して、装置をＣＯ_２インキュベーター（温度３７℃、ＣＯ_２濃度４．７％）内に静置して２０時間培養した。次いで、装置をチャンバー（縦６ｃｍ×横６ｃｍ×厚み２ｃｍ）内に入れ、３０日間還流培養（流速２ｍｌ／分、温度３７℃、ＣＯ_２濃度４．７％）し、神経系細胞の軸索を各溝部の線維芽細胞層および血管周皮細胞層上に伸長させて、軸索が伸長した神経系細胞（神経繊維）の束（神経束）を得た。なお、得られた神経束は、それぞれの軸索が伸長した神経系細胞（神経線維）の束に加え、神経線維（軸索）と同方向に伸び、神経線維（軸索）に付着する内皮細胞の管（血管）を有していた。また、神経束の長さは約３ｃｍ、径は約１５００～２２００μｍであった。また、線維芽細胞層を構成する線維芽細胞が成長・増殖し、各溝部に線維芽細胞のシートが形成された。図７に、得られた神経束の顕微鏡写真（図７Ａ）および免疫染色写真（図７ＢおよびＣ）をそれぞれ示す。図７Ｂはオリゴデンドロサイトの髄鞘および神経系細胞の軸索を示し、図７Ｃは内皮細胞の管（血管）および神経系細胞の軸索を示す。これらの結果から、本実施例の方法により作製された神経束は、軸索が伸長した神経系細胞に加えて、軸索に沿って存在する内皮細胞の管（血管）および軸索沿って存在するオリゴデンドロサイトの髄鞘を有することが確認された。

　また、上記の通りに作製された神経束を、ＮＦ２００およびミエリン塩基性タンパク質について蛍光免疫染色を行い、ＮＦ２００およびミエリン塩基性タンパク質の発現の有無について確認した。次いで、神経細胞の軸索の伸長方向に対して直角に神経束を切断した。切断された神経束の切断面（横断面）の写真を図８に示す。図８の写真から、ＮＦ２００およびその周囲におけるミエリン塩基性タンパク質の発現が認められた。ＮＦ２００は有髄神経のニューロンマーカー、ミエリン塩基性タンパク質はオリゴデンドロサイトのマーカーとして知られていることから、図８の写真から、神経束がオリゴデンドロサイトの髄鞘を有する神経細胞を含むことが示唆された。

　同様にして、神経束を、ＮＦ２００およびｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子について蛍光免疫染色を行い、ＮＦ２００およびｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の発現の有無について確認した。次いで、神経細胞の軸索の伸長方向に対して直角に神経束を切断した。切断された神経束の切断面（横断面）の写真を図９に示す。図９の写真から、ＮＦ２００およびその周囲における円状のｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の発現が認められた。ＮＦ２００は有髄神経のニューロンマーカー、ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子は血管内皮細胞のマーカーとして知られていることから、図９の写真から、神経束が神経細胞、および神経細胞の軸索に沿って存在する血管内皮細胞の管を有することが示唆された。

　次いで、各溝部に形成した神経束を、溝部に形成した線維芽細胞のシートでロールして被覆した。次いで、各神経束を溝部と両端の凹部との境界部分で切断して装置から採取した。予めシャーレで作製しておいた２枚の大きな線維芽細胞シートのそれぞれ表面に、採取された神経束を６本ずつ揃えて隙間なく並べ、１時間静置して各神経束を線維芽細胞シートに付着させた。６本の神経束を付着させた２枚の線維芽細胞シートを、神経束を付着させた表面同士が接触するよう、かつ、神経束の向きが揃うように重ね、３０分静置した。次いで、神経束の長軸方向に沿って線維芽細胞シートを切断して移植材料とし、後述する移植に供した。

実施例８：神経束の移植１（ラット脊髄への移植）
　実施例７で作製された神経束の移植材料を、以下の方法に従って脊髄損傷モデルラットに移植した。
　ラット（Ｗｉｓｔａｒラット、８週齢、体重約２００ｇ、日本エスエルシー社製）を三種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン（０．１５ｍｇ／０．１５ｍｌ／ｋｇ）、ミタゾラム（２ｍｇ／０．４ｍｌ／ｋｇ）、酒石酸ブトルファノール（２．５ｍｇ／０．５ｍｌ／ｋｇ）および生理食塩水（１．４５ｍｌ／ｋｇ）の混合物）を腹腔内投与して全身麻酔し、Ｔ９椎弓および胸髄の一部（１髄節分である２ｍｍ）を切除した。Ｔ９椎弓および胸髄の一部を切除した後のラットの写真を図１０に示す（Ａ：Ｔ９椎弓切除後、Ｂ：Ｔ９椎弓および胸髄切除後）。実施例７で作製された神経束移植材料（長さ約５～８ｍｍ、径約２～３ｍｍ）を、切除した胸髄の神経部分に移植した。神経束移植材料の移植前後の移植部位の写真を図１１に示す（Ａ：移植前、Ｂ：移植後）。なお、図１１Ｂの写真中央分の白色部分が移植された神経束移植材料である。神経束移植材料を移植した後のラットの経過を観察したところ、自家神経を移植した比較対照のラットと同様に活動し、左右の下肢の運動が回復した。また、寿命が短縮する等の影響も見られなかった。

　胸髄を切除したままのラット１０匹、および胸髄を切除した後に神経束移植材料を移植したラット１５匹のそれぞれの運動機能の回復を、脊髄損傷ラットの運動機能回復の指標として一般的に用いられるＢＢＢスコア（Ｂａｓｓｏ－Ｂｅａｔｔｉｅ－Ｂｒｅｓｎａｈａｎ　Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ法）に基づいて評価した。評価結果を図１２に示す。神経束移植材料を移植したラットの群におけるＢＢＢスコアの一週間ごとの推移（移植後１～６週）は、０．５、１．５、２．０、４．０、４．７、５．４であった。一方、胸髄を切除したままのラットの群におけるＢＢＢスコアの一週間ごとの推移は、０．８、１．３、１．９、２．１、２．２、２．３であった。統計学的検討の結果、移植後４週、５週および６週で、神経束移植材料を移植したラットの群と胸髄を切除したままのラットの群との間に有意な差が認められた。また、神経束移植材料を移植したラットの群では、移植後４週以降に下肢の運動機能の回復が認められた。一方、神経束移植材料を移植したラットの群において、移植後６週のラットの移植部位を再度切除した場合には、下肢の運動機能が低下し、ＢＢＢスコアが１に低下することが確認された。これらの結果から、胸髄を切除したままのラットと比較して、胸髄を切除した後に神経束移植材料を移植したラットにおいて、有意に高い運動機能の回復が認められた。

　胸髄を切除した直後に神経束移植材料を移植したラットおよび神経束移植材料を移植しなかったラットのそれぞれについての、胸髄の切除（移植）後６週における切除（移植）部位の縦断面のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像を図１３に示す。図１３Ａは、胸髄を切除した後に神経束移植材料を移植しなかったラットにおける、胸髄の切除後６週の切除部位の縦断面のＨＥ染色像である。図１３Ｂは、胸髄を切除した直後に神経束移植材料を移植したラットにおける、神経束移植材料の移植後６週の移植部位の縦断面のＨＥ染色像である。図１３Ｂの写真から、胸髄の切除部位に神経束移植材料を移植することにより、神経束移植材料と胸髄の切除部位とが接合することが示された。

　胸髄を切除した直後に神経束移植材料を移植したラットについて、胸髄の切除（移植）後６週における移植部位の縦断面のＨＥ染色像を図１４に示す。図１４Ａは、移植部位の全体を示すＨＥ染色像である。図１４Ｂは、図１４Ａの染色像における神経束移植材料とラット（ホスト）の切除された胸髄の神経部分との接合部分（図１４Ａの片矢印部分）を拡大したＨＥ染色像である。特に図１４Ｂの写真から、移植された神経束移植材料が、移植後６週でも細胞を伴う神経の連続性を保持し、ラット（ホスト）の切除された胸髄の神経部分と接合していることが示された。

　これらの結果から、胸髄の切除部位に移植された神経束移植材料が、胸髄の切除部分を接合し、胸髄の神経部分に代わって機能することが示された。

実施例９：神経束の蛍光免疫染色１
　実施例７で作製された神経束を４％パラホルムアルデヒドで固定して、ｐ７５ＮＴＲおよびＳ１００について蛍光免疫染色を行い、ｐ７５ＮＴＲおよびＳ１００の発現の有無について確認した。次いで、神経細胞の軸索の伸長方向に対して平行に神経束を切断した。切断された神経束の切断面（縦断面）の写真を図１５に示す。図１５Ａ～Ｃの写真は、それぞれＳ１００、ｐ７５ＮＴＲおよびＤＡＰＩの発現を示す。図１５Ｄの写真は、図１５Ａ～Ｃの写真をマージした写真である。図１５の写真から、神経束において、神経細胞の軸索の伸長方向に沿ってｐ７５ＮＴＲおよびＳ１００の発現が認められた。

実施例１０：神経束の蛍光免疫染色２
　実施例７で作製された神経束を４％パラホルムアルデヒドで固定して、ＨＮＫ－１糖鎖、ｐ７５ＮＴＲおよびＭＰＺについて蛍光免疫染色を行い、ＨＮＫ－１糖鎖、ｐ７５ＮＴＲおよびＭＰＺの発現の有無について確認した。次いで、神経細胞の軸索の伸長方向に対して平行に神経束を切断した。切断された神経束の切断面（縦断面）の写真を図１６に示す。図１６Ａ～Ｄの写真は、それぞれＨＮＫ－１糖鎖、ｐ７５ＮＴＲ、ＭＰＺおよびＤＡＰＩの発現を示す。図１６Ｅは、図１６Ａ～Ｄの写真をマージした写真である。図１６Ａ～Ｃの写真から、神経束において、神経細胞の軸索の伸長方向に沿ってＨＮＫ－１、ｐ７５ＮＴＲおよびＭＰＺの発現が認められた。また、図１６Ｅの写真から、ＨＮＫ－１、ｐ７５ＮＴＲおよびＭＰＺは、ほぼ同一の位置において発現することが確認された。ＭＰＺは髄鞘、特に未成熟の髄鞘のマーカーとして知られていることから、図１６Ｅの写真から、神経束が髄鞘を有する神経細胞を含み、ＨＮＫ－１およびｐ７５ＮＴＲが髄鞘において発現していることが示唆された。

実施例１１：神経束の蛍光免疫染色３
　実施例７で作製された神経束を４％パラホルムアルデヒドで固定して、ＮＦ２００およびミエリン塩基性タンパク質について蛍光免疫染色を行い、ＮＦ２００およびミエリン塩基性タンパク質の発現の有無について確認した。次いで、神経細胞の軸索の伸長方向に対して直角に神経束を切断した。切断された神経束の切断面（横断面）の写真を図１７に示す。図１７の写真から、ＮＦ２００およびその周囲におけるミエリン塩基性タンパク質の発現が認められた。ＮＦ２００は有髄神経のニューロンマーカー、ミエリン塩基性タンパク質はシュワン細胞のマーカーとして知られていることから、図１７の写真から、神経束がシュワン細胞の髄鞘を有する神経細胞を含むことが示唆された。

実施例１２：神経束の蛍光免疫染色４
　実施例７で作製された神経束を４％パラホルムアルデヒドで固定して、ＮＦ２００、Ｓ１００およびペリフェリンについて蛍光免疫染色を行い、ＮＦ２００、Ｓ１００およびペリフェリンの発現の有無について確認した。次いで、神経細胞の軸索の伸長方向に対して直角に神経束を切断した。切断された神経束の切断面（横断面）の写真を図１８に示す。図１８Ａの写真は、ＮＦ２００およびＳ１００の発現を示す。図１８Ｂは、Ｓ１００およびペリフェリンの発現を示す。図１８Ａの写真から、ＮＦ２００およびその周囲におけるＳ１００の発現が認められた。ＮＦ２００は有髄神経のニューロンマーカー、Ｓ１００はシュワン細胞のマーカーとして知られていることから、図１８Ａの写真から、神経束がシュワン細胞の髄鞘を有する神経細胞を含むことが示唆された。また、図１８Ｂの写真から、ペリフェリンおよびその周囲におけるＳ１００の発現が認められた。ペリフェリンは主に末梢神経系のニューロンマーカーとして知られていることから、図１８Ｂからも、神経束がシュワン細胞の髄鞘を有する神経細胞を含むことが示唆された。

実施例１３：神経束の蛍光免疫染色５
　実施例７で作製された神経束を４％パラホルムアルデヒドで固定して、ＮＦ２００およびペリアキシンについて蛍光免疫染色を行い、ＮＦ２００およびペリアキシンの発現の有無について確認した。次いで、神経細胞の軸索の伸長方向に対して直角および平行に神経束を切断した。切断された神経束の切断面（横断面）の写真を図１９Ａに示す。また、神経束の切断面（縦断面）の写真を図１９ＢおよびＣに示す。図１９Ａの写真から、ＮＦ２００およびその周囲におけるペリアキシンの発現が認められた。また、図１９ＢおよびＣから、神経細胞の軸索の伸長方向に沿ってＮＦ２００およびペリアキシンの発現が認められた。ＮＦ２００は有髄神経のニューロンマーカー、ペリアキシンはシュワン細胞のマーカーとして知られていることから、図１９Ａ～Ｃの写真から、神経束がシュワン細胞の髄鞘を有する神経細胞を含むことが示唆された。

実施例１４：神経束の蛍光免疫染色６
　実施例７で作製された神経束を４％パラホルムアルデヒドで固定して、ＣＤ３１およびＰＤＧＦＲβについて蛍光免疫染色を行い、ＣＤ３１およびＰＤＧＦＲβの発現の有無について確認した。次いで、神経細胞の軸索の伸長方向に対して直角に神経束を切断した。切断された神経束の切断面（横断面）の写真を図２０ＡおよびＢに示す。図２０ＡおよびＢの写真から、神経束の神経細胞（軸索）の周囲にＣＤ３１およびＰＤＧＦＲβの発現が認められた。ＣＤ３１は血管内皮細胞のマーカー、ＰＤＧＦＲβは血管周皮細胞および線維芽細胞のマーカーとして知られていることから、図２０ＡおよびＢの写真から、神経束が神経細胞の軸索周囲に周皮細胞または線維芽細胞の層を含み、該層中に存在する血管内皮細胞の管を含むことが示唆された。

実施例１５：神経束の蛍光免疫染色７
　実施例７で作製された神経束を４％パラホルムアルデヒドで固定して、ＣＤ３１およびＰＤＧＦＲβについて蛍光免疫染色を行い、ＣＤ３１およびＰＤＧＦＲβの発現の有無について確認した。次いで、神経細胞の軸索の伸長方向に対して直角に神経束を切断した。切断された神経束の切断面（横断面）の写真を図２１に示す。図２１Ａは、神経束の切断面（横断面）の一部の拡大写真であり、図２１Ｂは、図２１Ａの写真においてＣＤ３１およびＰＤＧＦＲβの発現が特に強く観察される部分の拡大写真である。図２１ＡおよびＢの写真から、ＣＤ３１が円状に発現し、さらにＣＤ３１の円の外側を囲むようにＰＤＧＦＲβが発現していることが確認された。ＣＤ３１は血管内皮細胞のマーカー、ＰＤＧＦＲβは血管周皮細胞および線維芽細胞のマーカーとして知られていることから、図２１ＡおよびＢの写真から、神経束が神経細胞の軸索周囲に周皮細胞または線維芽細胞の層を含み、該層中に存在する血管内皮細胞の管を有すること、さらに血管内皮細胞の管が血管周皮細胞および／または線維芽細胞により裏打ちされていることが示唆された。

実施例１６：神経束の蛍光免疫染色８
　実施例１５と同様にして蛍光免疫染色および切断を行った別の神経束の切断面（横断面）においてＣＤ３１およびＰＤＧＦＲβの発現が特に強く観察される部分の拡大写真を図２２に示す。図２２の写真から、ＣＤ３１が円状に発現し、さらにＣＤ３１の円の外側を囲むようにＰＤＧＦＲβが発現していることが確認された。したがって、図２２の写真からも、神経束が神経細胞の軸索周囲に周皮細胞または線維芽細胞の層を含み、該層中に存在する血管内皮細胞の管を有すること、さらに血管内皮細胞の管が血管周皮細胞および／または線維芽細胞により裏打ちされていることが示唆された。

実施例１７：神経束の移植２（ラット坐骨神経への移植）
　実施例７で作製された神経束の移植材料を、以下の方法に従ってラットの坐骨神経に移植した。
　ラット（ヌードラットＦ３４４／ＮＪｃｌ－ｒｎｕ／ｒｎｕ、１５週齢、雄、日本クレア社製）を、三種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン（０．１５ｍｇ／０．１５ｍｌ／ｋｇ）、ミタゾラム（２ｍｇ／０．４ｍｌ／ｋｇ）、酒石酸ブトルファノール（２．５ｍｇ／０．５ｍｌ／ｋｇ）および生理食塩水（１．４５ｍｌ／ｋｇ）の混合物）を腹腔内投与して全身麻酔し、坐骨神経の一部を切除した。実施例６で作製された神経束移植材料（長さ約１ｃｍ、径約１ｍｍ）の２つの端部のそれぞれを、坐骨神経切除後の２つの神経断端のそれぞれに手術用縫合糸（１０－０ナイロン）を用いて３針縫合し、切除した坐骨神経部分に神経束移植材料を移植した。同様の方法に従って、切除した神経を遠位端と近位端とを反転して移植したラット（自家神経移植ラット）、および人工神経（ナーブリッジ（登録商標）、東洋紡株式会社製）を移植したラット（人工神経移植ラット）を準備した。また、坐骨神経を切離したラット（坐骨神経切離ラット）を準備した。移植１２週後の各ラットの移植部位、切離部位の写真を図２３に示す（Ａ：自家神経移植ラット、Ｂ：神経束移植材料移植ラット、Ｃ：人工神経移植ラット、Ｄ：坐骨神経切離ラット）。図２３の写真から、自家神経移植ラット、神経束移植材料移植ラットおよび人工神経移植ラットにおいて、移植された自家神経、神経束移植材料および人工神経が、それぞれラットの坐骨神経と接合されることが示された。また、神経束移植材料を移植した場合（図２３Ｂ）には、自家神経または人工神経を移植した場合（それぞれ図２３ＡおよびＣ）と比較して、神経束が線維芽細胞により著しく被覆されていること示された。

　また、自家神経移植ラット、神経束移植材料移植ラット、人工神経移植ラットおよび坐骨神経切離ラットをそれぞれ６匹、３匹、４匹、４匹準備して、各ラットについて、移植後（または切離後）の坐骨神経機能指数（ＳＦＩ：Ｓｃｉａｔｉｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｎｄｅｘ）の経時的な変化を観察した。なお、坐骨神経機能指数は、文献「Ｂａｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｓｔ　Ｒｅｃｏｎｓｔｒ　Ｓｕｒｇ　８３：　１２９－１３９　（１９８９）」に記載されている。坐骨神経機能指数は、各ラットの足の裏にインクを付けて歩行させ、得られる足跡から図２４Ａに示す数式に基づいて算出した。各ラットの坐骨神経機能指数の経時的変化を図２４Ｂに示す。図２４Ｂから、自家神経移植ラット、神経束移植材料移植ラットおよび人工神経移植ラットにおいては、移植直後と比較して、移植６週後に坐骨神経機能指数が増大することが示された。また、自家神経移植ラットおよび神経束移植材料移植ラットにおいては、移植６週後と比較して、移植１２週後に坐骨神経機能指数がさらに増大することが示された。

　また、坐骨神経機能指数を算出した各ラットについて、移植後（または切離後）１２週目に、移植部位の遠位端側の腓腹筋を切除し、その重量を坐骨神経非切除ラットの腓腹筋の湿重量に対する重量比として測定した。測定結果を図２５に示す。図２５から、自家神経移植ラット、神経束移植材料移植ラットおよび人工神経移植ラットにおいては、坐骨神経切離ラットと比較して、腓腹筋の重量が大きく、自家神経、神経束移植材料および人工神経のそれぞれがラットの坐骨神経として機能していることが示された。

実施例１８：坐骨神経への移植後の神経束の免疫染色
　実施例１７でラットの坐骨神経に移植された神経束移植材料を、移植１２週後に切除し、切除された神経束移植材料を４％パラホルムアルデヒドで固定して、ＳＴＥＭ１２１、ｐ７５ＮＴＲおよびＭＰＺについて蛍光免疫染色を行い、ＳＴＥＭ１２１、ｐ７５ＮＴＲおよびＭＰＺの発現の有無について確認した。次いで、神経細胞の軸索の伸長方向に対して直角に神経束移植材料を切断した。切断された神経束移植材料の切断面（横断面）の写真を図２６に示す。図２６Ａ～Ｄの写真は、それぞれＳＴＥＭ１２１、ｐ７５ＮＴＲ、ＤＡＰＩおよびＭＰＺの発現を示す。図２６Ｅは、図２６Ａ～Ｄをマージした写真である。図２６Ａ、ＢおよびＤの写真から、ＳＴＥＭ１２１、ｐ７５ＮＴＲおよびＭＰＺがほぼ同じ位置に発現していることが認められた。ＳＴＥＭ１２１は、神経束移植材料中の神経細胞を示すものであることから、神経束移植材料中の神経束、特に神経細胞においてｐ７５ＮＴＲおよびＭＰＺが発現していることが示唆された。

　本発明によれば、神経系細胞の軸索を効率よく伸長および肥大させることができることができる。その結果、移植に十分な長さおよび径の軸索を有する神経束を効率よく作製することができ、神経の移植に必要な神経束移植材料を効率よく提供することが可能となる。

　１　　　　神経束作製装置
　２　　　　ジメチルポリシロキサン基板
　３　　　　凹部
　４　　　　凹部（先端凹部）
　５　　　　溝部

Claims

　神経系細胞含有細胞集団を、血管構成細胞、血管周囲細胞およびオリゴデンドロサイトから選択される少なくとも一種のフィーダー細胞、およびグリア細胞の存在下で培養し、神経系細胞の軸索を伸長させることを含む、神経束を製造する方法。
　前記フィーダー細胞が、周皮細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞およびオリゴデンドロサイトからなる群から選択される少なくとも一種の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
　前記フィーダー細胞が、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ－２、ＮＧＦＢおよびＥＧＦからなる群から選択される少なくとも一種の成長因子を分泌する細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
　前記グリア細胞がオリゴデンドロサイトを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
　前記神経束が、オリゴデンドロサイトを含む髄鞘を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
　（ａ）少なくとも一つの凹部と、該凹部に接続する溝部であって、フィーダー細胞で被覆されている溝部とを備える基板を準備する工程、
　（ｂ）前記神経系細胞含有細胞集団およびグリア細胞を前記凹部に添加する工程、
　（ｃ）前記神経系細胞含有細胞集団および前記グリア細胞を培養して、神経系細胞の軸索を前記溝部に沿って伸長させる工程
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
　（ａ）二つの凹部と、該二つの凹部を接続する溝部であって、前記フィーダー細胞で被覆されている溝部とを備える基板を準備する工程、
　（ｂ）前記神経系細胞含有細胞集団およびグリア細胞を前記凹部に添加する工程、
　（ｃ）前記神経系細胞含有細胞集団および前記グリア細胞を培養して、神経系細胞の軸索を前記溝部に沿って伸長させる工程
を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
　前記工程（ａ）において、前記溝部を前記フィーダー細胞で被覆する前に、前記溝部が線維芽細胞で被覆される、請求項６または７に記載の方法。
　前記神経系細胞含有細胞集団が内皮細胞をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
　前記神経系細胞含有細胞集団に含まれる内皮細胞が血管由来の内皮細胞である、請求項９に記載の方法。
　前記血管由来の内皮細胞が歯髄、歯肉、皮下組織、体腔内動脈、体腔内静脈および臍帯からなる群から選択される少なくとも一つの組織の血管由来の内皮細胞である、請求項１０に記載の方法。
　前記工程（ｃ）において、前記神経系細胞含有細胞集団に含まれる内皮細胞に由来する管を形成することをさらに含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
　前記神経系細胞および内皮細胞が同一の個体に由来するものである、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。
　前記神経系細胞含有細胞集団が生体適合性材料をさらに含み、前記神経系細胞および内皮細胞が、それぞれ別個の生体適合性材料の表面に層状に存在する、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。
　前記生体適合性材料がコラーゲンを含む、請求項１４に記載の方法。
　前記生体適合性材料がコラーゲンビーズを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
　前記溝部の長さが３ｍｍ以上である、請求項６～１６のいずれか一項に記載の方法。
　請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法により製造される、神経束。
　請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法により製造される神経束を、生体適合材料のシートにより被覆することを含む、移植材料を製造する方法。
　前記シートが線維芽細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
　前記移植材料が神経再生用移植材料である、請求項１９または２０に記載の方法。
　請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法により製造される、移植材料。
　神経系細胞を、血管構成細胞、血管周囲細胞およびオリゴデンドロサイトから選択される少なくとも一種の細胞を含むフィーダー細胞、およびグリア細胞の存在下で培養することを含む、神経系細胞の軸索を伸長させる方法。
　前記フィーダー細胞が、周皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞およびオリゴデンドロサイトからなる群から選択される少なくとも一種の細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
　前記グリア細胞がオリゴデンドロサイトを含む、請求項２３または２４に記載の方法。
　軸索が伸長した神経系細胞、および該軸索に沿って存在する内皮細胞の管を有する神経束であって、ＨＮＫ－１糖鎖発現細胞およびｐ７５ＮＴＲ発現細胞の少なくとも１種の細胞を含み、前記軸索がオリゴデンドロサイトを含む髄鞘を有する、前記神経束。
　ＨＮＫ－１糖鎖発現細胞およびｐ７５ＮＴＲ発現細胞を含む、請求項２６に記載の神経束。
　ＮＳ２００発現細胞、ペリフェリン発現細胞、ミエリン塩基性タンパク質発現細胞、Ｓ１００発現細胞、ＭＰＺ発現細胞、ペリアキシン発現細胞、ＣＤ３１発現細胞およびＰＤＧＦＲβ発現細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞を含む、請求項２６および２７に記載の神経束。
　ＮＳ２００発現細胞、ペリフェリン発現細胞、ミエリン塩基性タンパク質発現細胞、Ｓ１００発現細胞、ＭＰＺ発現細胞、ペリアキシン発現細胞、ＣＤ３１発現細胞およびＰＤＧＦＲβ発現細胞を含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の神経束。
　前記神経束が、前記神経系細胞の軸索に沿って該軸索の少なくとも一部を被覆する、線維芽細胞および周皮細胞の少なくとも１つの細胞を含む細胞層を有し、前記内皮細胞の管が前記細胞層の内部に存在する、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の神経束。
　前記内皮細胞の管が周皮細胞をさらに含む、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の神経束。
　請求項２６～３１のいずれか一項に記載の神経束を含む、移植材料。
　神経再生用移植材料である、請求項３２に記載の移植材料。