CN114375328A

CN114375328A - 包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法

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Publication number: CN114375328A
Application number: CN202080061852.5A
Authority: CN
Inventors: 神山淳; 镰田泰裕; 中村雅也; 冈野荣之; 齐藤美帆; 井上满博
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd; Keio University
Current assignee: Keio University; Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2022-04-19
Also published as: EP4011449A1; US20220323507A1; EP4011449A4; CA3152504A1; JPWO2021045217A1; KR20220052946A; WO2021045217A1

Abstract

本发明涉及的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法包括以下步骤：步骤(1)，在含有1种以上的SMAD信号传导抑制剂及1种以上的Wnt信号传导激活剂的类胚体形成培养基中，不存在饲养细胞的情况下，将多潜能干细胞悬浮培养5天～10天，由此形成细胞聚集体；步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在含有维甲酸的类胚体形成培养基中悬浮培养；步骤(3)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在含有维甲酸及1种以上的SHH信号传导激活剂的类胚体形成培养基或神经·胶质增殖用培养基中悬浮培养；以及步骤(4)，将步骤(3)中得到的细胞聚集体在不含维甲酸、且含有1种以上的SHH信号传导激活剂的神经·胶质增殖用培养基中悬浮培养。

Description

包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法

技术领域

本发明涉及源自多潜能干细胞的包含胶质前体细胞的细胞聚集体、及其制备方法等。

背景技术

包括脊髓损伤在内的脱髓鞘疾病及基于胶质细胞受损的疾病很少有自然治愈的病例，大多数病例不仅形成髓磷脂的胶质细胞的脱落，还引起轴突变性及细胞体变性而恶化。特别是对脊髓损伤而言，尽管部分患者中可观察到康复的效果，但没有使已失去的神经轴突、胶质细胞再生的根治性疗法，疾病未能满足的医疗需求(unmet medical needs)较高。通过移植来补充细胞被认为有希望作为基于神经再生及髓鞘再生的治疗策略。

已报道了大量旨在实现移植神经前体细胞的治疗的研究成果，近年来，已知有由多潜能干细胞分化诱导神经前体细胞的方法(例如非专利文献1及2)。另外，作为神经系统细胞的培养方法，已知有在无血清培养基中形成类胚体进行悬浮培养的方法(例如非专利文献3)。

脊髓损伤中髓磷脂的脱落是明显的，因此认为对其治疗而言，移植包含大量胶质细胞之中的少突胶质细胞的细胞是重要的(非专利文献4、6及7)，但迄今为止尚未明确含有多少程度的哪种细胞种类即可显示治疗效果。

另外，为了细胞移植的实用化，必须不残留未分化的多潜能干细胞以防止移植后的细胞演化成肿瘤，并且，期望不含有异种细胞来源成分以避免混入感染原。然而，迄今为止报道的包含少突胶质前体细胞的细胞聚集体(非专利文献4、5及专利文献1)是在小鼠细胞等饲养细胞存在下制备的，因此可能会含有饲养细胞或源自饲养细胞的异种细胞来源成分。因此，有必要建立一种更适合临床应用且不可能含有异种细胞来源成分的制备方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2017-524340号公报

非专利文献

非专利文献1：Fukusumi H等，Stem Cells International,Volume 2016,ArticleID 7235757(2016)

非专利文献2：Sugai K等，Molecular Brain、9:85(2016)

非专利文献3：Eiraku M等，Cell Stem Cell 3,519-532(2008)

非专利文献4：Douvaras P等，NatureProtocols 10,1143-1154(2015)

非专利文献5：Numasawa-Kuroiwa Y等，StemCell Reports,2:648-661(2014)

非专利文献6：Kawabata S等，Stem CellReports,6:1-8(2016)

非专利文献7：Yasuda A等，Stem Cells 29,1983-1994.(2011)

非专利文献8：Nori等，Stem Cell Reports,4:360-73.(2015)

非专利文献9：Choi SS等，PLoS ONE 9(4)(2014):e92325

非专利文献10：Kunlin Jin等，J Clin Invest.2002；110(3):311-319

非专利文献11：Thorsten R Doeppner等，J Cereb Blood Flow Metab 2011；31:1251-1262

非专利文献12：Shigeki Ohta等，Journal of Cell Science 2012 125:3210-3220

非专利文献13：Vincent Pons等，Front.Cell.Neurosci.2018 12:499

非专利文献14：Jeff A Stogsdill等，Current Opinion in Neurobiology 2017,42:1-8

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于提供对再生医学有用的不含异种细胞来源成分且胶质前体细胞的含有率高的细胞聚集体、及不可能混入异种细胞来源成分的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法。

用于解决课题的手段

本申请发明人着眼于降低病灶中的髓磷脂-神经细胞-星形胶质细胞的相互作用，并认为用于移植的细胞包含少突胶质前体细胞、神经前体细胞及星形胶质前体细胞中的所有是重要的，研究了能够由iPS细胞分化诱导这种细胞聚集体且更适合临床应用的分化诱导方法。

本申请发明人首先对作为以往的分化诱导方法的非专利文献5中记载的方法进行了研究。非专利文献5中记载的方法中，在作为饲养细胞的小鼠细胞上对iPS细胞进行维持培养。即，由于使用含有异种细胞来源成分的培养基对iPS细胞进行分化诱导，因此所得到的包含少突胶质前体细胞的细胞聚集体可能会含有异种细胞来源成分。另一方面，在临床应用中，期望尽可能地排除异种细胞来源成分。因此，本申请发明人为了开发出使用不含异种细胞来源成分的培养基、由不依赖饲养细胞(即无饲养层)的iPS细胞分化诱导包含少突胶质前体细胞的细胞聚集体的方法而进行了认真研究。

本申请的发明人参考非专利文献5中记载的方法，尝试了在不含异种细胞来源成分的未分化维持培养基中、使用不存在饲养细胞的情况下培养的无饲养层iPS细胞进行分化诱导。结果，根据iPS细胞的细胞株的不同，存在无法形成类胚体(Embryoid Body；以下有时简写作“EB”)的情况，另外，判明了最终诱导成不具有分化成少突胶质细胞的能力的细胞聚集体的概率高，暗示了该分化诱导方法不稳定。

对此，研究了形成EB的方法，结果通过将培养方法变更为快速聚集无血清悬浮培养法(Serum-Free Embryonic Body quick；以下有时简写作“SFEBq法”)，且在分化诱导的过程中采用特定的培养基与分化诱导剂的组合，由此能够稳定地形成EB，且能够得到具有分化成少突胶质细胞的能力的包含胶质前体细胞的细胞聚集体(神经球)。还获知了该细胞聚集体在被移植至损伤模型动物时显示出治疗效果。即，本申请发明人首次成功地确立了可大量制备不含异种细胞来源成分的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法。

即，本发明涉及以下内容。

[1]

制备方法，其为包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

步骤(1)，在含有1种以上的SMAD信号传导抑制剂及1种以上的Wnt信号传导激活剂的类胚体形成培养基中，不存在饲养细胞的情况下，将多潜能干细胞悬浮培养5天～10天，由此形成细胞聚集体；

步骤(2)将步骤(1)中得到的细胞聚集体在含有维甲酸的类胚体形成培养基中悬浮培养；

步骤(3)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在含有维甲酸及1种以上的SHH信号传导激活剂的类胚体形成培养基或神经·胶质增殖用培养基中悬浮培养；以及

步骤(4)，将步骤(3)中得到的细胞聚集体在不含维甲酸、且含有1种以上的SHH信号传导激活剂的神经·胶质增殖用培养基中悬浮培养，

也可以进一步包括以下步骤：

步骤(5)，将步骤(4)中得到的细胞聚集体在不含维甲酸及SHH信号传导激活剂这两者的神经·胶质增殖用培养基中悬浮培养。

[2]

如[1]所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，使用具有多个均匀形状的孔的培养容器培养多潜能干细胞。

[3]

如[1]或[2]所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，持续进行步骤(1)直至与步骤(1)开始时相比满足以下条件中的至少一项，然后开始步骤(2)：

1)得到SOX1、PAX6、HES4及HES5中的至少1种RNA的表达量上升100倍以上的细胞聚集体；

2)得到OCT3/4的RNA的表达量降低至200分之1以下的细胞聚集体；以及

3)得到NANOG的RNA的表达量降低至400分之1以下的细胞聚集体。

[4]如[1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，

在步骤(2)中，持续进行步骤(2)直至与步骤(2)开始时相比满足以下条件中的至少一项，然后开始步骤(3)：

1)得到ASCL1、DCX、HEY1、ZBTB20、βIII微管蛋白、ELAVL3及SLIT1中的至少1种RNA的表达量上升5倍以上的细胞聚集体；以及

2)得到HOXB3、HOXA4、HOXB4、HOXB6及HOXB8中的至少1种RNA的表达量上升5倍以上的细胞聚集体。

[5]

如[1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(2)进行4天～11天。

[6]

如[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(1)及步骤(2)中，氧浓度为3％～10％。

[7]

如[1]～[6]中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(3)中，持续进行步骤(3)直至与步骤(3)开始时相比满足以下条件中的至少一项，然后开始步骤(4)：

1)得到HEY2、NKX6.2及NKX2.2中的至少1种RNA的表达量上升5倍以上的细胞聚集体；以及

2)得到OLIG1及/或OLIG2的RNA的表达量上升10倍以上的细胞聚集体。

[8]

如[1]～[7]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(3)进行4天～11天。

[9]

如[1]～[8]中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，持续进行步骤(4)直至与步骤(4)开始时相比满足以下条件中的至少一项，然后开始步骤(5)：

1)得到NFIA、NFIB、SLC1A3、S100B及FABP7中的至少1种RNA的表达量上升10倍以上的细胞聚集体；以及

2)得到PAX6的RNA的表达量降低至5倍以下的细胞聚集体。

[10]

如[1]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(4)进行4天以上。

[11]

如[1]～[10]中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，在该步骤开始时使步骤(3)中得到的细胞聚集体分散，然后将经分散的细胞悬浮培养，由此再次形成细胞聚集体。

[12]

如[1]～[11]中任一项所述的制备方法，其中，上述方法包括步骤(5)，在步骤(5)中，在该步骤开始时使步骤(4)中得到的细胞聚集体分散，然后将经分散的细胞悬浮培养5天～100天，由此再次形成细胞聚集体。

[13]

如[1]～[12]中任一项所述的制备方法，其中，上述方法包括步骤(5)，在步骤(5)中，持续进行步骤(5)直至选自O4抗原、NG2、OLIG2、PDGFRα、SOX10、SPON1、FAM181B、TIMP4、SOX6、GRIK3、LHFPL3、KLF9、A2B5抗原、CNP及PLP中的1种以上的标志物表达。

[14]

如[1]～[12]中任一项所述的制备方法，其中，上述方法包括步骤(5)，在步骤(5)中，持续进行步骤(5)直至在培养细胞聚集体的培养基中检测到选自由SPARCL1、MIF、MCP-1、IL-8、SCF、M-CSF、HGF、GRO-α、LIF、IFN-γ及TRAIL组成的组中的1种以上的蛋白质。

[15]

如[1]～[14]中任一项所述的制备方法，其中，SMAD信号传导抑制剂为TGFβ抑制剂及BMP抑制剂这2种。

[16]

如[15]所述的制备方法，其中，TGFβ抑制剂为选自由SB431542、A83-01、SB202190、SB505124、NPC30345、SD093、SD908、SD208、LY2109761、LY364947、LY580276、Galunisertib(LY2157299)、LY3200882、SB525334、GW788388、RepSox及Lefty-1组成的组中的1种以上。

[17]

如[15]或[16]所述的制备方法，其中，BMP抑制剂为选自由头蛋白(Noggin)、LDN-193189、LDN-212854、Dorsomorphin、K02288、脊索发生素(Chordin)及卵泡抑素组成的组中的1种以上。

[18]

如[1]～[17]中任一项所述的制备方法，其中，Wnt信号传导激活剂为选自由GSK3β抑制剂、Wnt3a、Wnt激动剂、Dkk及R-Spondin组成的组中的1种以上。

[19]

如[1]～[18]中任一项所述的制备方法，其中，Wnt信号传导激活剂为选自由CHIR99021、BIO、肯帕罗酮、SB216763及L803-mts组成的组中的1种以上。

[20]

如[1]～[19]中任一项所述的制备方法，其中，SHH信号传导激活剂为选自由嘌吗啡胺(Purmorphamine)、SAG、SHH蛋白及SHH片段组成的组中的1种以上。

[21]

如[1]～[20]中任一项所述的制备方法，其中，多潜能干细胞为诱导性多潜能干细胞。

[22]

如[1]～[20]中任一项所述的制备方法，其中，多潜能干细胞为人诱导性多潜能干细胞。

[23]

如[1]～[22]中任一项所述的制备方法，其中，包含胶质前体细胞的细胞聚集体具有以下特征：

(a)包含少突胶质前体细胞、星形胶质前体细胞及神经前体细胞；

(b)表达脊髓区域标志物；及

(c)不含有饲养细胞及源自饲养细胞的成分。

[24]

制备方法，其为包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群的制备方法，其包括下述步骤：使用成熟化培养基将通过[1]～[23]中任一项所述的制备方法制备的包含胶质前体细胞的细胞聚集体培养5天～60天。

[25]

如[24]所述的制备方法，其中，包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群包含：

(i)表达选自由O4抗原、GalC、MBP、APC、GSTπ、CNP、PLP、OLIG2、SOX10、PDGFRα及NG2组成的组中的1种以上的标志物的细胞；

(ii)表达选自由βIII微管蛋白、MAP2及ELAVL3组成的组中的1种以上的标志物的细胞；以及

(iii)表达选自由SLC1A3、S100B、AQP4、GFAP及NG2组成的组中的1种以上的标志物的细胞。

[26]

如[24]或[25]所述的制备方法，其中，成熟化培养基为含有T3、NT-3及LIF中的至少1种的培养基。

[27]

如[26]所述的制备方法，其中，成熟化培养基还含有CNTF。

[28]

包含胶质前体细胞的细胞聚集体，其是通过[1]～[23]中任一项所述的制备方法而得到的。

[29]

包含胶质细胞前体细胞的细胞聚集体，其具有以下特征：

(b)包含表达脊髓区域标志物的细胞；

(c)不含有饲养细胞及源自饲养细胞的成分；及

(d)具有分化成包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群的能力。

[30]

如[29]所述的细胞聚集体，其中，脊髓区域标志物为选自由HOXB3、HOXB4、HOXB6及HOXD8组成的组中的1种以上的标志物。

[31]

如[29]或[30]所述的细胞聚集体，其还包含表达选自由NKX2.1、NKX2.2、NKX6.1及NKX6.2组成的组中的1种以上的标志物的细胞。

[32]

如[29]～[31]中任一项所述的细胞聚集体，其具有以下特征：

(I)包含表达选自由NFIA、NFIB、SOX9、HEY1、HEY2、ZBTB20、SLC1A3、S100B、MLC1、SLIT1、TIMP3、SPARCL1、GFAP及AQP4组成的组中的1种以上的标志物的细胞；

(II)包含表达选自由OLIG2、PDGFRα、SOX10、SPON1、FAM181B、TIMP4、SOX6、GRIK3、LHFPL3、KLF9、A2B5抗原、CNP及PLP组成的组中的1种以上的标志物的细胞；

(III)包含表达选自由DCX、βIII微管蛋白、MAP2、ELAVL3、NTRK2、GRIA2、PTPRO及EPHA3组成的组中的1种以上的标志物的细胞；

(IV)包含表达选自由SOX1、SOX2、NESTIN、MEIS1、MEIS2、DLL3及ASCL1组成的组中的1种以上的标志物的细胞；

以及，

(V)具有分化成包含下述细胞的细胞群的能力：

(ii)表达选自由βIII微管蛋白、MAP2及ELAVL3组成的组中的1种以上的标志物的细胞；及

[33]

如[29]～[32]中任一项所述的细胞聚集体，其还具有以下特征：(VI)包含表达选自由C1ORF61及SERPINE2组成的组中的1种以上的标志物的细胞。

[34]

如[29]～[33]中任一项所述的细胞聚集体，其还包含表达或分泌选自由SPARCL1、MIF、MCP-1、IL-8、SCF、M-CSF、HGF、GRO-α、LIF、IFN-γ及TRAIL组成的组中的1种以上的标志物的细胞。

[35]

包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群，其是通过[24]～[27]中任一项所述的制备方法而得到的。

[36]

药物组合物，其含有[28]～[34]中任一项所述的细胞聚集体或[35]所述的细胞群作为有效成分。

[37]

脱髓鞘疾病及基于胶质细胞受损的疾病或伴有胶质细胞受损的疾病的治疗方法，其包括将有效剂量的[28]～[34]中任一项所述的细胞聚集体或[35]所述的细胞群移植至需要移植的对象。

[38]

如[37]所述的治疗方法，其中，脱髓鞘疾病及基于胶质细胞受损的疾病或伴有胶质细胞受损的疾病为急性期、亚急性期或慢性期的脊髓损伤。

[39]

如[28]～[34]中任一项所述的细胞聚集体或[35]所述的细胞群，其用于在脱髓鞘疾病及基于胶质细胞受损的疾病或伴有胶质细胞受损的疾病的治疗中的应用。

[40]

如[39]所述的细胞聚集体或细胞群，其中，脱髓鞘疾病及基于胶质细胞受损的疾病或伴有胶质细胞受损的疾病为急性期、亚急性期或慢性期的脊髓损伤。

[41]

评价方法，其为用于评价受试物质的毒性或药效的方法，其中，包括使[28]～[34]中任一项所述的细胞聚集体或[35]所述的细胞群与上述受试物质接触，针对上述受检物质对上述细胞聚集体或上述细胞群造成的影响进行检测或定量。

[42]

判别包含胶质前体细胞的细胞聚集体适合移植的方法，其以选自由C1ORF61及SERPINE2组成的组中的1种以上的标志物是否表达为指标。

[43]

胶质前体细胞或胶质的分化取向性高的神经干细胞的鉴定方法，其包括检测选自由C1ORF61及SERPINE2组成的组中的1种以上的基因、由该基因编码的蛋白质及它们的片段。

发明效果

根据本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法，能够制备不含饲养细胞及源自饲养细胞的异种细胞来源成分的、包含胶质前体细胞的细胞聚集体。若对该包含胶质前体细胞的细胞聚集体进一步进行培养，则能够制备包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群。通过本发明的制备方法得到的细胞聚集体或细胞群作为细胞治疗用移植用材料是有用的。

附图说明

[图1A]为示出1中的分化第35天和第49天的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的明场像的图像。

[图1B]为示出实施例1中的包含胶质前体细胞的细胞聚集体终末分化14天后的免疫荧光染色的结果的荧光显微镜图像。

[图2]为示出包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法的实验方案的一个例子的图。

[图3A]为示出实施例2中的分化诱导过程的基因表达分析结果的图。

[图3B]为示出实施例2中的分化诱导过程的基因表达分析结果的图。

[图3C]为示出实施例2中的分化诱导过程的基因表达分析结果的图。

[图3D]为示出实施例2中的分化诱导过程的基因表达分析结果的图。

[图4A]为示出实施例3中的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的免疫荧光染色的结果的荧光显微镜图像。

[图4B]为示出实施例3中的相对于构成包含胶质前体细胞的细胞聚集体的细胞总数而言的OLIG2阳性细胞及NFIA阳性细胞的比例的分析结果的图。

[图5]为示出实施例4中的Gliogenic NPC及Neurogenic NPC中属于各团簇(cluster)的细胞数的比例的图。

[图6A]为示出实施例4中的Gliogenic NPC及Neurogenic NPC中每1个细胞的各基因的表达量的分布的图。

[图6B]为示出实施例4中的Gliogenic NPC及Neurogenic NPC中每1个细胞的各基因的表达量的分布的图。

[图7A]为示出实施例5中的包含胶质前体细胞的细胞聚集体终末分化31天后的免疫荧光染色的结果的荧光显微镜图像。

[图7B]为示出实施例5中的、包含胶质前体细胞的细胞聚集体终末分化后31天后的O4阳性细胞、GFAP阳性细胞及Tuj1阳性细胞的比例的图。

[图8]为示出实施例6中的包含胶质前体细胞的细胞聚集体终末分化前后的各基因表达量的相对值的图。

[图9]为示出实施例8中的将包含胶质前体细胞的细胞聚集体移植至亚急性期脊髓损伤模型小鼠后的基于BMS评分的后肢运动功能评价结果的图。

[图10]为示出实施例9中的将包含胶质前体细胞的细胞聚集体移植至亚急性期脊髓损伤模型小鼠后的基于转棒仪实验的协调运动评价的结果的图。

[图11A]为示出实施例10中的将包含胶质前体细胞的细胞聚集体移植至亚急性期脊髓损伤模型小鼠后的基于步幅的步态模式评价的结果的图。

[图11B]为示出实施例10中的将包含胶质前体细胞的细胞聚集体移植至亚急性期脊髓损伤模型小鼠后的基于肢相对于行进方向所呈的角度的步态模式评价的结果的图。

[图12]为示出实施例11中的将包含胶质前体细胞的细胞聚集体移植至亚急性期脊髓损伤模型小鼠后的基于运动学分析评价关节运动的结果的图。(A)示出后肢从离开地面到接触地面为止的轨迹的代表例。(B)示出步行周期1个周期中髋关节、膝关节、踝关节、足趾的关节角度变化。

[图13]为示出实施例12中的将包含胶质前体细胞的细胞聚集体移植至亚急性期脊髓损伤模型小鼠后的组织切片的观察结果的荧光显微镜图像。(A)为使用STEM121抗体进行免疫荧光染色的矢状面切片的结果，(B)为经HE染色的矢状面切片的结果，(C)为使用抗HNA抗体进行免疫荧光染色的(1)从损伤中心部向头侧4mm的横截面切片的结果；(2)损伤中心部的横截面切片的结果；(3)从损伤中心部向尾侧4mm的横截面切片的结果。

[图14A]为实施例12中的用人特异性标志物和各种标志物进行荧光免疫共染色的矢状面切片的荧光显微镜图像。

[图14B]为示出实施例12中的矢状面切片中HNA阳性移植细胞中的各种阳性细胞率的图。

[图15]为示出实施例12中的使用Tuj1抗体、抗HNA抗体与抗小鼠特异性Bassoon(Bsn)及抗人突触素(hSyn)抗体进行免疫荧光染色的矢状面切片的荧光显微镜图像。

[图16A]为实施例12中的从损伤中心部向头侧(Rostral)0.48mm的LFB染色图像、损伤中心部(Epi-center)的LFB染色图像及从损伤中心部向尾侧(Caudal)0.48mm的LFB染色图像。

[图16B]为示出实施例12中的对经LFB染色的横截面切片中从损伤中心部至头尾侧0.96mm为止的髓鞘组织的LFB阳性区域进行定量的结果的图。

[图17]为实施例12中的使用STEM121抗体和抗MBP抗体进行免疫荧光染色的横截面切片的荧光显微镜图像。

[图18]为实施例12中的通过免疫电镜法检测到STEM121抗体反应部位的横截面切片的电子显微镜图像。用箭头示出利用以胶体金颗粒标记的二抗检测到的STEM121抗体反应部位(黑点)。(A)及(B)为分别拍摄不同视野的图像。

[图19]为示出实施例14中的将包含胶质前体细胞的细胞聚集体移植至慢性期脊髓损伤模型大鼠后的基于BBB评分的后肢运动功能评价结果的图。

[图20]为示出实施例15中的将包含胶质前体细胞的细胞聚集体移植至慢性期脊髓损伤模型大鼠后12周的步态模式评价的结果的图。(A)示出步幅，(B)示出肢相对于行进方向所呈的角度。

[图21]示出实施例16中的将包含胶质前体细胞的细胞聚集体移植至慢性期脊髓损伤模型大鼠后的组织切片的观察结果。(A)为经HE染色的矢状面切片的结果；(B)为使用抗HNA抗体进行免疫荧光染色的矢状面切片的结果。

[图22]示出实施例16中的将包含胶质前体细胞的细胞聚集体移植至慢性期脊髓损伤模型大鼠后的组织切片的观察结果。(A)为使用抗HNA抗体和抗OCT3/4抗体进行免疫荧光染色的矢状面切片的结果；(B)为使用抗HNA抗体和抗Hu抗体进行免疫荧光染色的矢状面切片的结果；(C)为使用抗HNA抗体和抗GFAP抗体进行免疫荧光染色的矢状面切片的结果；(D)为使用抗HNA抗体和抗APC抗体进行免疫荧光染色的矢状面切片的结果。

[图23]为示出实施例17中的细胞接种后第1天、第8天及第14天的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的明场像的图像。

[图24]为实施例17中的包含胶质前体细胞的细胞聚集体终末分化28天后使用O4抗体、抗GFAP抗体、Tuj1抗体进行免疫荧光染色的荧光显微镜图像。(A)为自培养8天后起开始终末分化的细胞聚集体；(B)为自培养14天后起开始终末分化的细胞聚集体。

具体实施方式

〔定义〕

本说明书中，“干细胞”是指具有分化能力及维持分化能力的增殖能力(特别是自我复制能力)的未分化细胞。干细胞中，根据分化能力而包括多潜能干细胞(pluripotentstem cell)、多能干细胞(multipotent stem cell)、单能干细胞(unipotent stem cell)等亚群。

多潜能干细胞是指可在体外进行培养、且具有可分化成属于三胚层(外胚层、中胚层、内胚层)及/或胚外组织的所有细胞谱系的能力(分化多潜能性(Pluripotency))的干细胞。多能干细胞是指具有可分化成多种但不是所有种类的组织、细胞的能力的干细胞。单能干细胞是指具有可分化成特定的组织、细胞的能力的干细胞。

多潜能干细胞能够由受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织内干细胞、体细胞等诱导。作为多潜能干细胞，可举出胚胎干细胞(ES细胞：Embryonic Stem cell)、EG细胞(Embryonic Germ cell)、诱导性多潜能干细胞(iPS细胞：induced Pluripotent Stemcell)等。由间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell；MSC)得到的Muse细胞(应激耐受多系分化细胞，Multi-lineage differentiating stress enduring cell)、由生殖细胞(例如睾丸)制作的GS细胞也包括在多潜能干细胞中。

人胚胎干细胞于1998年建立，并逐步用于再生医学。胚胎干细胞能够通过在饲养细胞上或在含有FGF2的培养基中培养囊胚期的内部细胞团而制备。例如WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等中记载了胚胎干细胞的制备方法。胚胎干细胞能够从规定的机构获得，另外，也可购买市售品。例如，作为人胚胎干细胞的KhES-1、KhES-2及KhES-3可从京都大学再生医科学研究所获得。作为人胚胎干细胞的Crx：：Venus株(源自KhES-1)可从国立研究开发法人理化学研究所获得。

本说明书中，“诱导性多潜能干细胞”为利用已知方法等将体细胞重编程(reprogramming)而被诱导出多潜能性的细胞。

诱导性多潜能干细胞由山中等人于2006年用小鼠细胞而建立(Cell，2006，126(4)，pp.663-676)。于2007年还用人成纤维细胞建立了诱导性多潜能干细胞，其与胚胎干细胞同样地具有多潜能性和自我复制能力(Cell，2007，131(5)，pp.861-872；Science，2007，318(5858)，pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.，2008，26(1)，pp.101-106)。

对于诱导性多潜能干细胞，具体而言，可举出通过选自包括OCT3/4、SOX2、KLF4、MYC(c-MYC、N-MYC、L-MYC)、GLIS1、NANOG、SALL4、LIN28、ESRRB等的重编程基因组中的多种基因的任意组合的表达从而将成纤维细胞、外周血单核细胞等已分化的体细胞重编程而诱导出多分化能力的细胞。作为优选的重编程因子的组合，可举出(1)OCT3/4、SOX2、KLF4、及MYC(c-MYC或L-MYC)；(2)OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28及L-MYC(Stem Cells、2013；31：458-466)。

作为诱导性多潜能干细胞，除了利用基于基因表达的直接重编程进行制备的方法以外，还能够通过添加化合物等由体细胞诱导得到诱导性多潜能干细胞(Science，2013，341，pp.651-654)。

另外，也可获得株系化的诱导性多潜能干细胞，例如京都大学建立的201B7细胞、201B7-Ff细胞、253G1细胞、253G4细胞、1201C1细胞、1205D1细胞、1210B2细胞、1231A3细胞等人诱导性多潜能细胞株可从京都大学及iPS Academia Japan,Inc.获得。作为株系化的诱导性多潜能干细胞，例如京都大学建立的QHJI01s04细胞可从京都大学获得。

本说明书中，多潜能干细胞优选为胚胎干细胞或诱导性多潜能干细胞，更优选为诱导性多潜能干细胞。

本说明书中，多潜能性干细胞为哺乳动物的多潜能性干细胞，优选为啮齿类(例如小鼠、大鼠)或灵长类(例如人、猴)的多潜能性干细胞，更优选为人多潜能性干细胞，还优选为人诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)或人胚胎干细胞(ES细胞)。

人iPS细胞等多潜能性干细胞能够用本领域技术人员已知的方法进行维持培养及扩大培养。

本说明书中，“胶质(Glia)”也称为“胶质细胞(Glial cell)”、“神经胶质细胞”，为构成神经系统的除神经细胞以外的细胞的总称，估计在人脑中以细胞数计存在神经细胞的10倍以上。作为胶质细胞，可举出星形胶质细胞(Astrocyte)、少突胶质细胞(Oligodendrocyte)等，它们在神经组织中存在于神经细胞的周围，承担各种功能。

本说明书中，“标志物”为存在于细胞中的物质，是指能够基于其存在、存在量来鉴定或判别该细胞的种类或性质等的物质。作为标志物，具体而言，可举出mRNA、由该mRNA编码的蛋白质及糖链、以及它们的片段。

本说明书中，“分化标志物”是指用于检测处于特定分化阶段的细胞的分化程度(水平)的标志物。

本说明书中，“胶质前体细胞”是指具有分化成胶质细胞的能力的细胞，例如可举出星形胶质前体细胞、少突胶质前体细胞。

本说明书中，“少突胶质细胞”为存在于中枢神经系统中的胶质细胞的一种，通过以缠绕在神经元(神经细胞)的轴突周围的方式存在，形成髓磷脂(髓鞘)，承担加快神经细胞间的信号传导速度的作用。少突胶质细胞能够通过少突胶质细胞中特异性表达的标志物而进行鉴定，作为该标志物，例如已知有PLP、GalC、APC、MBP、MAG、MOG、GST-π、SOX10、O4(O-4)抗原、NG2(CSPG4)及CNP等，例如通过使用基因扩增法、原位杂交、免疫组织学方法、流式细胞术分析等进行分析，可判别出表达上述mRNA、糖链或蛋白质中的至少1种的细胞作为少突胶质细胞。需要说明的是，将上述标志物中的已知在星形胶质细胞中也表达的NG2作为指标时，期望与其他标志物一同进行鉴定。

本说明书中，“少突胶质前体细胞”是指具有分化成少突胶质细胞的能力的细胞。少突胶质前体细胞的存在能够通过已知在少突胶质前体细胞中确认到显著表达的标志物而进行鉴定。作为少突胶质前体细胞的标志物，例如已知有PDGFRα及OLIG2等，例如通过使用基因扩增法、原位杂交、免疫组化染色法等进行分析，可判别出表达上述mRNA或蛋白质中的至少1种标志物的细胞作为少突胶质前体细胞。需要说明的是，未形成髓磷脂的未成熟的少突胶质细胞也包括在少突胶质前体细胞中。

本说明书中，“星形胶质细胞”为存在于中枢神经系统中的胶质细胞的一种，认为其通过在结构上支持神经元的功能、调节神经递质、能量及细胞外离子浓度，从而有助于激活神经传导。另外，认为其对上述少突胶质细胞供给促进髓磷脂形成的物质，是在神经组织中与神经元及少突胶质细胞一同承担重要功能的细胞。能够通过在星形胶质细胞中特异性表达的标志物来进行鉴定，作为该标志物，例如已知有GFAP、S100B、AQP4、NG2及SLC1A3(也称作GLAST或EAAT1)等，例如通过使用免疫组织学方法进行分析，可判别出表达上述mRNA、糖链或蛋白质中的至少1种的细胞作为星形胶质细胞。需要说明的是，将上述标志物中的已知在少突胶质细胞中也表达的NG2作为指标时，期望与其他标志物一同进行鉴定。

本说明书中，“星形胶质前体细胞”是指具有分化成星形胶质细胞的能力的细胞。星形胶质前体细胞的存在能够通过已知在星形胶质前体细胞中确认到显著表达的标志物而进行鉴定。作为星形胶质前体细胞的标志物，例如可举出NFIA、NFIB、SOX9、HEY1、HEY2、FABP7及ZBTB20等。

在由多潜能性干细胞向少突胶质细胞分化的过程中，首先，多潜能性干细胞分化成神经干细胞(Neural stem cell)，进而依次分化成少突胶质前体细胞、少突胶质细胞。神经干细胞具有多分化能力(Multipotency)，可分化成神经前体细胞、星形胶质前体细胞、少突胶质前体细胞中的任一种，当分化成少突胶质前体细胞时，注定会分化成少突胶质细胞。另外，当分化成神经前体细胞时，注定会分化成神经细胞，当分化成星形胶质前体细胞时，注定会分化成星形胶质细胞。

此处，注定会分化成星形胶质细胞的情况能够通过是否表达以下的1种以上的标志物来确认：NFIA、NFIB、SOX9、HEY1、HEY2、ZBTB20、SLC1A3及S100B中的至少一种；优选通过是否表达SOX9、HEY1、HEY2、ZBTB20、SLC1A3及S100B中的至少一种来确认。此处S100B也称作S100β。

本说明书中，神经细胞是指由细胞体、树突及轴突构成的神经单元，也称作神经元。神经细胞能够通过显著表达的标志物而进行鉴定，作为该标志物，例如可举出βIII微管蛋白、MAP2及ELAVL3等。

神经细胞是指具有将来自其他神经细胞或感受刺激的细胞的刺激传导给其他神经细胞、肌肉或腺细胞的功能的细胞。神经细胞根据神经细胞所产生的神经递质的不同，可分类为5-羟色胺能神经、运动神经等，但在本说明书中，神经递质的种类没有特别限定。

本说明书中，“神经前体细胞”是指具有分化成神经细胞的能力，注定会分化成神经细胞的细胞，可通过神经细胞黏附分子(NCAM)、多聚唾液酸化NCAM、神经标志物(DCX、βIII微管蛋白等)等进行鉴定。

本说明书中，“神经干细胞”是指同时具有分化成神经前体细胞的能力、及分化成包括星形胶质前体细胞或少突胶质前体细胞的胶质前体细胞的能力的细胞，可通过中间丝蛋白(巢蛋白(nestin)、波形蛋白(vimentin)等)、转录因子SOX1、PAX6等原始神经外胚层及神经干细胞的标志物等进行鉴定。

本说明书中，“脊髓区域标志物”是指在发育阶段中伴随着分化成脊髓而表达的标志物，具体而言，可举出HOXB3、HOXB4、HOXB6及HOXD8等基因或该基因编码的蛋白质等。

本说明书中，“腹侧区域标志物”是指在发育阶段中伴随着分化成腹侧而表达的标志物，具体而言，可举出NKX2.1、NKX2.2、NKX6.1及NKX6.2等基因或该基因编码的蛋白质等。

本说明书中，“细胞聚集体”(Cell Aggregate)只要为多个细胞彼此黏附而形成的立体结构，则没有特别限定，例如，分散在培养基等介质中的细胞聚集形成的团块、或经过细胞分裂而形成的细胞的团块等。细胞聚集体也包含形成特定组织的情况。另外，类胚体也包括在细胞聚集体中。本说明书中，“细胞群”可以为细胞聚集体(球状细胞群)，也可以为层状的细胞群。

本说明书中，“培养基”只要为动物细胞的培养中常用的培养基即可，只要能够维持动物细胞的生命则没有特别限定，优选对于目标细胞提供能增殖的环境的培养基。培养基可以自行制备，也可以购买市售的培养基而使用。本说明书中，“类胚体形成培养基”、“神经·胶质增殖用培养基”及“成熟化培养基”以上述培养基作为基础培养基，可通过添加符合各自目的的因子等而制备。

从用于制备适合移植的细胞聚集体的角度出发，优选本发明中使用的培养基为无血清培养基。本发明中的“无血清培养基”是指不含无调整或未提纯的血清的培养基。本说明书中，即使是混入有提纯的血液来源成分或动物组织来源成分(例如生长因子)的培养基，只要不含无调整或未提纯的血清，则都包括在无血清培养基中。无血清培养基也可适当含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲液、无机盐类等。

本发明中使用的培养基也可含有血清替代物。作为血清替代物，例如可举出适当含有白蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’硫醇甘油(3’thiolglycerol)或它们的等效物等物质。该血清替代物例如能够通过WO98/30679中记载的方法而制备。作为血清替代物，也可使用市售品。作为该市售的血清替代物，例如可举出Knockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific公司制；以下有时记作KSR)、“StemSure(注册商标)Serum Replacement(SSR)”Chemically-defined Lipidconcentrated(Thermo Fisher Scientific公司制)、B27补充剂(Thermo FisherScientific公司制)、N2补充剂(Thermo Fisher Scientific公司制)、ITS补充剂(ThermoFisher Scientific公司制)，优选举出B27补充剂。

本发明中使用的培养基优选为无Xeno(Xeno-Free)培养基。此处“无Xeno”是指已排除了源自与培养对象的细胞的物种不同的物种的成分(异种来源成分，也称作异种因子(Xenogenic factor))的条件。无血清培养基中的一部分可以为无Xeno培养基。

本说明书中，饲养细胞是指培养多潜能性干细胞等干细胞时使其共存的除该干细胞以外的细胞。作为饲养细胞，例如可举出小鼠成纤维细胞(MEF等)、人成纤维细胞、SNL细胞、STO细胞等。饲养细胞也可以为经增殖抑制处理的饲养细胞。此处，作为增殖抑制处理，可举出增殖抑制剂(例如丝裂霉素C)处理或基于γ射线照射或紫外线照射等的处理。

本说明书中，源自饲养细胞的成分是指该干细胞中不含有、而饲养细胞中含有的或饲养细胞所分泌的成分。

本说明书中，“异种细胞”是指源自与培养对象的细胞不同的物种的细胞，与“异种动物细胞”同义使用。“异种细胞来源成分”为源自该异种细胞的成分，是指培养对象的细胞中不含有的成分。

对于源自饲养细胞的异种细胞来源成分而言，饲养细胞源自与培养对象的细胞不同的物种的情况下，其表示作为源自该饲养细胞的成分、且是培养对象的细胞中不含有的成分。

作为具体的成分，至少可举出碱基序列或氨基酸序列等不同的蛋白质成分、糖及脂质等。

本发明中，“悬浮培养”是指使细胞以悬浮于培养基中的状态存活。本说明书中，细胞以单个细胞或多个细胞聚集的团块(细胞聚集体或细胞群)的状态进行悬浮培养。经悬浮培养的细胞会增殖及/或分化。

〔包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法〕

作为本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法的一个方式，可举出包括下述步骤的制备方法：

步骤(1)，在含有1种以上的SMAD信号传导抑制剂及1种以上的Wnt信号传导激活剂的类胚体形成培养基中，不存在饲养细胞的情况下，将多潜能性干细胞悬浮培养5天～10天，由此形成细胞聚集体；

步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在含有维甲酸的类胚体形成培养基中悬浮培养；

所述制备方法也可进一步包括以下步骤：

＜步骤(1)＞

在步骤(1)中，培养多潜能性干细胞，形成类胚体。“类胚体(Embryoid Body；EB)”是指通过悬浮培养多潜能性干细胞而形成的三维的细胞聚集体。为了使多潜能性干细胞高效地分化成目标细胞，优选在分化中途形成的类胚体含有大量具有分化成包含目标细胞的胚层(外胚层、中胚层或内胚层)的能力的细胞。例如，意欲使多潜能性干细胞分化成神经细胞、胶质细胞的情况下，优选在分化中途形成的类胚体中含有大量具有分化成外胚层的能力的细胞。即，本说明书中，类胚体优选为具有分化成外胚层的能力的类胚体。当然，在类胚体形成的过程中也会开始多潜能性干细胞的分化，类胚体也可包含被分类成外胚层的细胞。

在步骤(1)中，使用含有有效浓度的1种以上的SMAD信号传导抑制剂及1种以上的Wnt信号传导激活剂等分化诱导因子的类胚体形成培养基培养多潜能性干细胞。步骤(1)中使用的培养基能够通过在类胚体形成培养基中混合有效浓度的上述规定的分化诱导因子而制备。

本说明书中，SMAD信号传导抑制剂只要可抑制由SMAD介导的信号传导，则没有特别限定，也可适当组合使用1种以上的SMAD信号抑制剂。作为SMAD信号传导抑制剂，例如可举出通过在SMAD信号的上游抑制SMAD的磷酸化从而抑制SMAD信号传导的TGFβ超家族的抑制剂，具体而言，可举出TGFβ抑制剂及BMP抑制剂。就SMAD信号传导抑制剂而言，优选使用TGFβ抑制剂及BMP抑制剂这两种，例如也可适当组合使用1种以上的TGFβ抑制剂(优选1种TGFβ抑制剂)和1种以上的BMP抑制剂(优选1种BMP抑制剂)。

本说明书中，TGFβ抑制剂只要可抑制由TGFβ介导的信号传导，则没有特别限定，可以为核酸、蛋白质、低分子有机化合物中的任何。作为TGFβ抑制剂，例如可举出直接作用于TGFβ的物质(例如蛋白质、抗体、适配体等)、抑制编码TGFβ的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸、siRNA等)、抑制TGFβ受体与TGFβ的结合的物质、抑制基于TGFβ受体的信号传导引起的生理活性的物质(例如TGFβ受体的抑制剂等)。作为TGFβ抑制剂，可举出抑制与作为受体的ALK家族的结合的物质、或抑制基于ALK家族的SMAD的磷酸化的物质。

本说明书中，作为具体的TGFβ抑制剂，例如可举出SB431542、SB202190(R.K.Lindemann等，Mol.Cancer 2：20(2003))、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly ResearchLaboratories)、A-83-01(WO2009146408)、Galunisertib(LY2157299)、LY3200882、SB525334、GW788388、RepSox、Lefty-1(作为NCBI登录号，可例示出小鼠：NM＿010094、人：NM＿020997)、Lefty-2(作为NCBI登录号，可例示出小鼠：NM＿177099、人：NM＿003240及NM＿001172425)、及它们的衍生物等，能够使用至少1种的TGFβ抑制剂。作为TGFβ抑制剂，优选为选自由作为TGFβ受体(ALK5)及活化素受体(ALK4/7)的抑制剂而为人所知的SB431542及A83-01组成的组中的1种以上。

培养基中的TGFβ抑制剂的浓度可在能够抑制由TGFβ介导的信号传导的范围内适当设定。例如SB431542的浓度只要为可抑制ALK5的浓度，没有特别限定，例如为100nM～100μM，优选为500nM～30μM，还优选为1μM～20μM。当为其他TGFβ抑制剂时，可适当设定为能显示与上述浓度的SB431542相当的ALK抑制活性或TGFβ抑制活性的浓度。

本说明书中，BMP抑制剂只要为参与介由BMP(骨形态发生蛋白，BoneMorphogenetic Protein)与BMP受体(I型或II型)的结合的BMP信号传导(BMP signaling)的抑制的抑制剂，则没有特别限定，可以为核酸、蛋白质、低分子有机化合物中的任何。作为BMP抑制剂，包括直接作用于BMP的物质(例如蛋白质、抗体、适配体等)、抑制编码BMP的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸、siRNA等)、具有通过抑制BMP与BMP受体的结合从而抑制上述BMP信号传导的生物活性的物质、抑制基于BMP受体的信号传导引起的生理活性的物质(例如，BMP受体的抑制剂等)、BMP I型受体激酶抑制剂等。

对于具有通过抑制BMP和BMP受体的结合从而抑制上述BMP信号传导的生物活性的物质的具体例，可举出Dorsomorphin、头蛋白及它们的衍生物。另外，对于BMP I型受体激酶抑制剂的具体例，可举出LDN-193189(即，4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉)及其衍生物(例如LDN-212854)。作为其他BMP抑制剂，可举出K02288、脊索发生素及卵泡抑素。

作为BMP抑制剂，优选为选自由头蛋白、LDN-193189、Dorsomorphin及K02288(PLoSOne.2013；8(4)：e62721.)组成的组中的1种以上。

培养基中的BMP抑制剂的浓度例如可在能够抑制由BMP介导的信号传导的范围内适当设定。例如，LDN-193189的浓度只要为可抑制BMP I型受体激酶的浓度，则没有特别限定，例如为1nM～10μM，优选为10nM～5μM，还优选为50nM～3μM，还更优选为50nM～1μM。为其他BMP抑制剂时，可适当设定为能显示与上述浓度的LDN-193189相当的BMP I型受体激酶抑制活性或BMP抑制活性的浓度。

本说明书中，Wnt信号激活剂只要可激活由Wnt介导的信号传导，则没有特别限定。作为Wnt信号激活剂，例如可举出Wnt蛋白(Wnt3a等)、Wnt激动剂、Dkk(Wnt信号传导抑制蛋白的抑制剂)、GSK3β(糖原合成酶激酶3β)抑制剂、R-Spondin等。

本说明书中，GSK3β抑制剂被定义为抑制糖原合成酶激酶(GSK)3β蛋白的激酶活性的物质，作为其具体例，可举出BIO(别称：GSK-3β抑制剂IX；6-溴靛玉红-3’-肟(6-Bromoindirubin-3’-oxime))等靛玉红(indirubin)衍生物、SB216763等马来酰亚胺衍生物、GSK-3β抑制剂VII等α-溴甲基酮化合物、CHIR99021、L803-mts等磷酸化细胞穿透肽及它们的衍生物。

本说明书中，Wnt信号激活剂优选为GSK3β抑制剂，另外，优选为选自由作为GSK3β抑制剂的CHIR99021、BIO、肯帕罗酮、SB216763及L803-mts组成的组中的1种以上。

培养基中的Wnt信号激活剂的浓度例如可在能够使由Wnt3a介导的信号传导亢进的范围内适当设定。例如CHIR99021的浓度只要为可抑制GSK3β的浓度，则没有特别限定，例如为100nM～100μM，优选为500nM～30μM，还优选为1μM～10μM。为其他Wnt信号激活剂时，可适当设定为能显示与上述浓度的CHIR99021相当的GSK3β抑制活性或由Wnt3a介导的信号传导的促进的浓度。

在步骤(1)中，在不存在饲养细胞的情况下培养多潜能性干细胞。不存在饲养细胞的情况也称作无饲养层，是指培养基中不存在饲养细胞的状态。作为不存在饲养细胞的情况下的培养条件，例如可举出未添加成纤维细胞、SNL细胞、STO细胞等饲养细胞的培养条件。

本说明书中，“类胚体形成培养基”只要为可在通过悬浮培养多潜能性干细胞制备类胚体时使用的培养基，则没有特别限定。作为类胚体形成培养基，可以为适合形成类胚体、且适合多潜能性干细胞的无饲养层培养的无饲养层培养基。类胚体形成培养基例如能够通过在基础培养基中根据需要添加血清替代物及营养源等添加因子而制备。

作为基础培养基，例如可举出BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、GlasgowMEM(GMEM)培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F-12培养基、IMDM/F12培养基、ham培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、或它们的混合培养基等能够用于培养动物细胞的培养基。这些基础培养基中含有糖质、氨基酸等碳源、维生素、无机盐类等。

作为类胚体形成培养基，例如能够使用从用于以未分化的状态维持培养多潜能性干细胞的培养基(未分化维持培养基)中去除了维持未分化所需的因子(未分化维持因子)中的一部分或全部而得的培养基、或后述的将一部分或全部的未分化维持因子的浓度降低至有效浓度以下而得的培养基。这样的培养基例如能够通过以包含与该培养基同等的成分的方式进行配合而制备。或者，例如也能够使用在DMEM等基础培养基中添加有血清替代物、激素等营养素的培养基。或者，未分化维持培养基有时以能够适当混合多种液体而使用的试剂盒的形式销售，这种情况下，也可通过以不添加含未分化维持因子的液体的方式进行配合，由此制备类胚体形成培养基。例如为Stem Fit AK03N(AJINOMOTO HEALTHY SUPPLYCO.,INC.制)时，其分成A液、B液及C液，因此可去除含FGF2的C液，仅用A液及B液制备类胚体形成培养基而进行使用。

使用以未分化维持培养基为基础的培养基作为类胚体形成培养基时，具有在步骤(1)开始时使所期望的添加因子适当变化成所期望的浓度即可、不会大幅度改变培养基的基本组成的优点。由此，具有细胞的培养环境不会大幅度改变的优点。

优选在类胚体形成培养基中以不会对步骤(1)带来影响的程度、例如不起作用的程度的浓度而含有或者不含有对SMAD信号传导抑制剂及Wnt信号传导激活剂等分化诱导因子的作用进行抑制或拮抗的成分。

作为步骤(1)中使用的培养基的具体例，可举出将从作为未分化维持培养基的StemFit AK03N培养基(AJINOMOTO HEALTHY SUPPLY CO.,INC.制)中去除了试剂盒中被称作C液的FGF2而得的培养基(AK03N-C)作为类胚体形成培养基，并添加有50nM～3μM、优选100nM的LDN-193189(SMAD信号传导抑制剂)、1μM～20μM、优选3μM的SB431542(SMAD信号传导抑制剂)及1μM～10μM、优选3μM的CHIR99021(Wnt信号传导激活剂)(均为StemGen公司制)的培养基。

在步骤(1)中，将多潜能性干细胞在类胚体形成培养基中悬浮培养5天～10天。在一个实施方式中，对于悬浮培养而言，在细胞已形成细胞聚集体(或类胚体)的状态下进行悬浮培养。作为悬浮培养，优选作为所谓的SFEBq法(非专利文献3)而为人所知的悬浮培养法。SFEBq法为通过使用具有多个均匀形状的孔的培养容器悬浮培养多潜能性干细胞来形成细胞聚集体的方法。SFEBq法中，细胞在步骤(1)开始时作为分散的单一的细胞在培养容器(孔)内悬浮培养，最终在一个孔中悬浮的细胞彼此黏附，从而形成三维结构，在各孔中形成各1个细胞聚集体。

作为SFEBq法中使用的具有多个均匀形状的孔的培养容器，优选：一个培养容器中具有多个、例如6个、12个、24个、96个或384个独立的用于培养细胞的空间(孔)，这些孔具有相同的形状及大小。培养容器的各个孔可以为柱状，底面的形状没有特别限定，可以为正圆、正方形、长方形、多边形、椭圆等，优选为正圆(即，孔为圆柱状)。另外，孔的底面可以为平底，也可以为圆底(U底)或V底或M底，优选为U底或V底或M底，更优选为V底或M底，最优选为V底。这是因为通过使底的形状变尖，混悬(悬浮)于孔内的细胞易聚集，容易在一定时间内形成球状。另外，优选孔的底面使用了细胞非吸附性材料或细胞低吸附性材料的培养容器。

就培养容器中的孔而言，底面积以平底换算计为0.1～2.0cm²，优选为0.5～1.2cm²，更优选为0.35cm²左右，内径为0.3～16.5mm，优选为3～11mm，更优选为6～8mm左右，高度为0.1～20mm，优选为0.3～17mm，更优选为8～12mm。

作为培养容器，可举出通常能够通过市售获得的培养容器，例如6孔板(底面积以平底换算计为9.5cm²左右，内径为35mm左右)、12孔板(底面积以平底换算计为3.8cm²左右，内径为23mm左右)24孔板(底面积以平底换算计为1.88cm²左右，内径为16mm左右)、48孔板(底面积以平底换算计为1.0cm²左右，内径为11mm左右)、96孔板(底面积以平底换算计为0.35cm²左右，内径为6～8mm左右)、384孔板(底面积以平底换算计为0.1cm²左右，内径为3～4mm左右)。优选96孔板，更优选V底的96孔板。

作为96孔板，能够使用PrimeSurface 96V板、96M板、96U板、96缝隙井板(96Slit-well Plate)(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.制)、Ultra-Low Attachment Surface 96圆形底板(CORNING公司制)。另外，培养容器只要具有可独立地形成均匀大小的细胞聚集体的形状，就无需像96孔板那样各个孔明确地独立，例如也能够使用培养皿的底面具有凹凸或凹陷的培养容器。作为这样的培养容器，可举出Multi-Dimple，可利用60mm～150mm的Multi-Dimple，但并不限定于此。

当96孔板的所有孔中分注了细胞悬液时，原理上可得到96个均匀的细胞聚集体，通过增加培养板的数目、或Multi-Dimple那样的每单位井(well)的孔数目增加而一次得到大量的细胞聚集体。作为市售的Multi-Dimple，例如能够使用Elplasia(KURARAY公司制)、AggreWell(STEMCELL Technologies公司制)、EZSPHERE(AsahiTechno Glass公司制)，但并不限定于此。

SFEBq法中，首先将具有均匀的细胞密度的细胞悬液等量分注于培养容器的各个孔中。在96孔板的情况下，细胞密度可以为3000细胞/孔～20000细胞/孔，优选为5000细胞/孔～10000细胞/孔，更优选为约9000细胞/孔。并且，在从培养开始的短时间内，例如24小时以内、优选12小时以内、更优选8小时以内，各个孔的中央部分形成有各1个具有几乎相同大小的细胞聚集体。另外，可通过调节分注的细胞悬液的量、细胞密度来控制细胞聚集体的直径及细胞数。进而，通过使用SFEBq法，得到的多个细胞聚集体成为球状，能够以高重现性形成细胞聚集体。

步骤(1)中的悬浮培养可进行大约5天～10天，优选进行大约7天～10天，更优选进行大约7天。培养时间根据所期望的细胞分化程度确定即可。细胞分化程度能够通过测定分化标志物而确定，在步骤(1)中，例如能够通过SOX1、PAX6、HES4及HES5的表达量的上升、OCT3/4的表达量的降低及NANOG的表达量的降低来确定培养时间。具体而言，持续进行步骤(1)直至与步骤(1)开始时相比满足以下条件中的至少一项的时间，然后开始步骤(2)：

1)得到SOX1、PAX6、HES4及HES5中至少1种的表达量以RNA水平计上升100倍以上的细胞聚集体；

2)得到OCT3/4的表达量以RNA水平计降低至200分之1以下的细胞聚集体；以及

3)得到NANOG的表达量以RNA水平计降低至400分之1以下的细胞聚集体。

本说明书中，“以RNA水平计多表达X倍”、“表达量以RNA水平计上升X倍”或“RNA的表达量上升X倍”是指在步骤中的2个时间点取得一个或多个悬浮细胞或构成细胞聚集体的细胞，使用能够对细胞中的RNA表达量进行绝对或相对的定量的方法，进行比较分析，结果较之一个时间点，另一个时间点的RNA表达量多X倍(上升X倍)。另外，“以RNA水平计少表达X倍”、“表达量以RNA水平计降低X倍”、或“RNA的表达量降低X倍”是指较之一个时间点，另一个时间点的RNA表达量少X倍(降低X倍)。所用的手法只要可进行RNA的定量，则没有特别限定，可使用利用了RNA序列、实时PCR测定、微阵列、Northern印迹、及原位杂交等的测定方法，优选使用RNA序列、实时PCR测定、微阵列进行比较测定。

步骤(1)中的悬浮培养的培养条件没有特别限定，例如可以为35℃～37℃、优选37℃的温度、90％～95％、优选95％的湿度、3％～5％、优选5％的CO₂浓度的条件，还优选低氧培养条件。“低氧培养条件”是指在比大气中的氧浓度(约21％)低的氧浓度下培养细胞的条件。此处，氧浓度是指培养装置中与含细胞的培养基接触的空气中的氧浓度。氧浓度只要为20％以下，则没有特别限定，优选为3％～10％的范围，更优选为4％～6％的范围，最优选为5％。

需要说明的是，在分化前，即在步骤(1)之前，也可以用未分化维持培养基对多潜能性干细胞进行维持培养。未分化维持培养基仅含有维持未分化状态所需的因子(未分化维持因子)，为能够维持多潜能性的培养基。作为未分化维持因子，可举出成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β(TGFβ家族)因子、活化素A等。

本说明书中的“成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factors、FGF)”是指作用于成纤维细胞生长因子受体并激活FGF信号的因子。作为FGF，例如可举出FGF2(也称作bFGF)、FGF4及FGF8。

本说明书中的未分化维持培养基为可在无饲养层条件下维持培养多潜能性干细胞的培养基，即无饲养层培养基。作为可使用的无饲养层培养基，已开发并市售各种各样的培养基，例如可举出Essential 8(Thermo Fisher Scientific公司制)。Essential 8培养基在DMEM/F-12培养基中含有作为添加剂的L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/l)、硒化钠(14μg/1)、胰岛素(19.4mg/l)、NaHCO₃(543mg/l)、运铁蛋白(10.7mg/l)、FGF2(100ng/ml)、及TGFβ(TGFβ1(2ng/ml)或Nodal(100ng/ml))(Nature Methods、8、p424-429(2011))。

作为市售的未分化维持培养基，还可举出S-medium(DS Pharma Biomedical公司制)、StemPro(Thermo Fisher Scientific公司制)、hESF9(Proc Natl Acad Sci U SA.2008 Sep 9；105(36)：13409-14)、mTeSR1(STEMCELL Technologies公司制)、mTeSR2(STEMCELL Technologies公司制)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司制)、CellartisDEF-CS 500 Xeno-Free Culture Medium(Takara Bio Inc.制)或StemFit(AJINOMOTOHEALTHY SUPPLY CO.,INC.制)。

可从上述未分化维持培养基的成分中降低未分化维持因子的浓度，制备去除了未分化维持因子的组成的培养基，将其用作步骤(1)的类胚体形成培养基。因此，步骤(1)中使用的类胚体形成培养基优选为无饲养层培养基，且为降低了未分化维持因子的浓度、或去除了未分化维持因子的未分化维持培养基。具体而言，可举出不含FGF2等FGF的无饲养层培养用的未分化维持培养基。另外，也能够将后述的神经·胶质增殖用培养基或与其类似组成的培养基、未分化维持培养基以1:1等的比率混合而成的培养基用作类胚体形成培养基。

＜步骤(2)＞

在步骤(2)中，在含有维甲酸的类胚体形成培养基中悬浮培养步骤(1)中得到的细胞聚集体。类胚体形成培养基及悬浮培养如上所述。步骤(2)中使用的培养基能够通过在类胚体形成培养基中混合维甲酸而制备。

步骤(2)中使用的培养基可以是除了含有维甲酸、不含1种以上的SMAD信号传导抑制剂及1种以上的Wnt信号传导激活剂这2点以外与步骤(1)中使用的培养基具有同一组成的培养基。作为“维甲酸”，可举出类视黄醇类(例如维甲酸)。作为步骤(2)中使用的培养基的具体例，可举出将从StemFit AK03N培养基(AJINOMOTO HEALTHY SUPPLY CO.,INC.制)中去除了试剂盒中被称作C液的FGF2而得的培养基(AK03N-C)作为类胚体形成培养基、并添加有1μM维甲酸(Sigma-Aldrich公司制)的培养基。

培养基中的类视黄醇类的浓度可在能够使由维甲酸介导的信号传导亢进的范围内适当设定。例如，维甲酸的浓度只要可显示活性、即区域特异性的后部化作用，则没有限定，例如为10nM～100μM，优选为100nM～10μM，还优选为500nM～5μM。为其他类视黄醇类时，可适当设定为能显示与上述浓度的维甲酸相当的活性的浓度。

完成步骤(1)时，从培养容器中去除步骤(1)中使用的培养基，将培养基更换为步骤(2)中使用的培养基，从而能够开始步骤(2)。步骤(2)中，当使用与步骤(1)相同的培养容器时，从保护细胞聚集体的角度出发，优选更换一半量左右的培养基，通过多次重复该操作，能够更换一半量以上的培养基。另外，此时，根据需要，也可在使用除步骤(2)中使用的培养基以外的培养基或磷酸缓冲液等清洗细胞聚集体后，开始用步骤(2)中使用的培养基进行培养。或者，也可在完成步骤(1)时回收(1)中得到的所有细胞聚集体，根据需要清洗细胞聚集体后，使其混悬于步骤(2)中使用的培养基中，从而开始步骤(2)。步骤(2)中使用的培养容器只要为悬浮培养用的培养器材，则没有特别限定，能够使用本领域技术人员常用的培养皿、培养板。例如可举出PrimeSurface 96V板及超低吸附培养瓶(CORNING公司制)等。

步骤(2)中的悬浮培养可进行大约3天～21天，优选进行大约4天～11天，更优选进行大约7天。培养时间根据所期望的细胞分化程度确定即可。细胞分化程度能够通过测定分化标志物而确定，例如能够采集细胞并测定表达的分化标志物的mRNA量或蛋白量。或者也可以采集培养上清液，测定从细胞分泌至培养基中的分化标志物的蛋白量。步骤(2)中，例如能够通过选自由ASCL1、DCX、SLIT1、HEY1、ZBTB20、βIII微管蛋白、ELAVL3、HOXB3、HOXA4、HOXB4、HOXB6及HOXB8组成的组中的1种以上的标志物的RNA或蛋白质的表达量来确定培养时间。具体而言，持续进行步骤(2)直至与步骤(2)开始时相比满足以下条件中的至少一项，然后开始步骤(3)：

1)得到ASCL1、DCX、HEY1、ZBTB20、βIII微管蛋白、ELAVL3及SLIT1中至少1种的表达量以RNA水平计上升5倍以上的细胞聚集体；以及

2)得到HOXB3、HOXA4、HOXB4、HOXB6及HOXB8中至少1种的表达量以RNA水平计上升5倍以上的细胞聚集体。

步骤(2)中的悬浮培养的培养条件可以与步骤(1)同样，还优选为低氧培养条件。作为低氧培养条件的氧浓度，只要为20％以下，则没有特别限定，优选为3％～10％的范围，更优选为4％～6％的范围，最优选为5％。

＜步骤(3)＞

步骤(3)中，在含有维甲酸及1种以上的SHH信号传导激活剂的类胚体形成培养基或神经·胶质增殖用培养基中悬浮培养(2)中得到的细胞聚集体。类胚体形成培养基如上所述。步骤(3)中使用的培养基能够通过在类胚体形成培养基或神经·胶质增殖用培养基中混合维甲酸及1种以上的SHH信号传导激活剂而制备。当使用类胚体形成培养基时，还能够通过在步骤(2)中使用的培养基中进一步混合1种以上的SHH信号传导激活剂而制备。

本说明书中，“神经·胶质增殖用培养基”是指适合胶质前体细胞、胶质细胞、神经前体细胞及神经细胞(Neuron；神经元)的增殖培养的培养基，只要为可维持上述细胞的存活、且能够使其分化·增殖的培养基，则没有特别限定。神经·胶质增殖用培养基也能够在上述基础培养基中适当添加适合胶质前体细胞、胶质细胞、神经前体细胞及神经细胞的存活的营养素等而制作，特别地，也可适当组合作为适合神经系统细胞的维持培养或分化诱导的培养基而市售的培养基或部分变更其组成而使用。例如，也可选择市售的Neurobasal或市售的DMEM/F-12等基础培养基等，并向其中适当添加上述营养素等而使用。

上述“适合……存活的营养素”可适当组合使用本领域技术人员已知的作为培养神经系统细胞时添加的因子的营养素，具体而言，可举出胰岛素、亚硒酸钠、黄体酮、运铁蛋白、腐胺、生长因子、维生素、cAMP激活剂、激素、神经营养因子等，能够从上述之中选择1种以上的因子而使用。

本说明书中的神经·胶质增殖用培养基中特别优选为使胶质前体细胞、胶质细胞、神经前体细胞及神经细胞全部适当地分化·增殖而含有1种以上的生长因子，优选含有血小板源生长因子(PDGF)。作为血小板源生长因子，能够使用PDGF-AA。在本说明书中的神经·胶质增殖用培养基中，作为其他生长因子，可举出FGF(例如FGF2)、EGF、IGF-1或HGF等。作为优选的一个方式，神经·胶质增殖用培养基中含有PDGF-AA、EGF、IGF-1及FGF(优选为FGF2)。

作为神经营养因子，可举出人NT-3(人体重组型神经营养蛋白3)、BDNF、NGF、GDNF或CNTF等。作为维生素，可举出生物素或抗坏血酸等。作为cAMP激活剂，可举出cAMP、双丁酰cAMP或毛喉素等。作为激素，可举出黄体酮(progesterone)或T3等。作为优选的一个方式，神经·胶质增殖用培养基中除了上述生长因子以外，还含有T3等甲状腺激素、NT-3等神经营养因子。

作为适当配合了上述营养素的混合物，市售有N1补充剂(以下，有时记作N1)、N2补充剂(以下，有时记作N2)、B27补充剂(包括去除了维生素A的补充剂；以下，有时记作B27)等，因此可以方便地使用并添加到基础培养基中。例如N2中含有胰岛素、运铁蛋白、黄体酮、硒酸纳及腐胺(putrescine)。当使用N2时，优选还含有人NT-3、及/或B27(优选去除维生素A)。

作为神经·胶质增殖用培养基，例如可举出在DMEM/F-12培养基中添加了N2、B27(可使用去除了维生素A的补充剂)、Glutamax(注册商标)、FGF2、EGF、T3、NT-3、PDGF-AA及IGF-1的培养基。另外，可举出在DMEM/F-12培养基中添加了葡萄糖、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、HEPES、胰岛素、运铁蛋白、黄体酮、亚硒酸钠、腐胺、B27、MEM NEAA、FGF2、EGF、T3、NT-3、PDGF-AA、及IGF-1的培养基。另外，可举出在DMEM/F-12培养基中添加了Glutamax、β-巯基乙醇、B27、N2、MEM NEAA、FGF2、EGF、T3、NT-3、PDGF-AA、及IGF-1的培养基。还可举出在DMEM/F-12培养基中添加了N1、B27、T3、生物素、双丁酰cAMP、PDGF-AA、IGF-1及NT-3的培养基。

从含有1种以上的上述适合神经系统细胞存活的营养素的角度出发，优选神经·胶质增殖用培养基中不含或以低于有效浓度的浓度含有阻遏或抑制该成分的生物活性的物质。

作为神经·胶质增殖用培养基的具体例，可举出在DMEM/F-12培养基(ThermoFisher Scientific公司制)中添加了下述成分的培养基：1％N2(Thermo FisherScientific公司制)；维生素A的浓度为5μg/ml％以下、优选不含维生素A的B27(ThermoFisher Scientific公司制)；10ng/ml～100ng/ml、优选60ng/ml的T3(Sigma-Aldrich公司制)；5ng/ml～100ng/ml、优选10ng/ml的PDGF-AA(PeproTech公司制)；10ng/ml～100ng/ml、优选20ng/ml的FGF2；5ng/ml～100ng/ml、优选10ng/ml的EGF(PeproTech公司制)；10ng/ml的胰岛素样生长因子1(R&D SYSTEMS公司制)；及5ng/ml～100ng/ml、优选10ng/ml的NT-3(Neurotrophin-3，神经营养蛋白3)(R&D SYSTEMS公司制)。

本说明书中，SHH信号传导激活剂被定义为会引起由SHH(Sonic Hedgehog；音猬因子)与作为受体的Patched(Ptch1)结合所引起的Smoothened(Smo)的去抑制及后续的Gli2的激活的物质。作为SHH信号传导激活剂，例如为属于Hedgehog家族的蛋白质，具体而言，可例示出SHH或IHH(Indian Hedgehog；印度豪猪蛋白)、或Sonic Hedgehog N-Terminus(Shh-N)、重组人Sonic Hedgehog(C24II)N-Terminus(SHH-C24II)、及重组小鼠Sonic Hedgehog(C25II)N-Terminus(SHH-C25II)等SHH或IHH的部分肽、SHH受体、SHH受体激动剂、Hh-Ag1.5(Li、X.等，Nature Biotechnology、23、215～221(2005).)、Smoothened激动剂(SAG)、[N-Methyl-N’-(3-pyridinylbenzyl)-N’-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane；N-甲基-N’-(3-哌啶基苯基)-N’-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,4-二甲基氨基环己烷]、20a-羟基胆固醇、嘌吗啡胺(PMA；9-环己基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)-9H-嘌呤-6-胺)以及它们的衍生物等(Stanton BZ等，Mol Biosyst.6：44-54、2010)。

作为步骤(3)中的SHH信号传导激活剂，可以为选自由嘌吗啡胺、SAG、SHH蛋白及SHH片段(例如SHH C25II或SHH C24II)组成的组中的1种以上，优选为选自由SHH蛋白、SHH片段、嘌吗啡胺、SAG组成的组中的1种以上。

培养基中的SHH信号传导激活剂的浓度可在能够使由SHH介导的信号传导亢进的范围内适当设定。例如，嘌吗啡胺的浓度只要呈现区域特异性的腹侧化作用，则没有限定，例如为10nM～10μM，优选为100nM～10μM，还优选为500nM～5μM。为其他SHH信号传导激活剂时，可适当设定为显示与上述浓度的嘌吗啡胺相当的、引起Smoothened(Smo)的去抑制作用及后续Gli2的激活作用、或区域特异性的腹侧化作用的浓度。

作为步骤(3)中使用的培养基，具体而言，可举出在类胚体形成培养基或神经·胶质增殖用培养基中添加了1μM维甲酸(Sigma-Aldrich公司制)及1μM嘌吗啡胺(Millipore公司制)的培养基。

完成步骤(2)时，回收(2)中得到的所有细胞聚集体，根据需要，可用步骤(3)中使用的培养基、其他培养基(例如可举出DMEM/F-12，但并不限定于此)或磷酸缓冲液等清洗回收的细胞聚集体，然后混悬于步骤(3)中使用的培养基中，从而开始步骤(3)。或者，从保护细胞聚集体的角度出发，也能够更换一半量左右的培养基以避免急剧的培养环境的变化，也能够通过多次重复该操作，更换一半量以上的培养基。步骤(3)中使用的培养容器只要为悬浮培养用的培养器材，没有特别限定，能够适当使用本领域技术人员常用的培养瓶、培养板。例如可举出PrimeSurface 96V板、96缝隙井板及超低吸附培养瓶(CORNING公司制)等。

步骤(3)中的悬浮培养可进行大约4天～11天，优选进行大约4天～7天，更优选进行大约7天。培养时间根据所期望的细胞分化程度确定即可。培养期间，也可适当地每数天更换1次(例如每3天或每4天1次)全部或部分培养基。

细胞分化程度能够通过测定分化标志物而确定，例如能够采集细胞并测定表达的分化标志物的mRNA量或蛋白量。或者也可采集培养上清液，测定从细胞分泌至培养基中的分化标志物的蛋白量。步骤(3)中，例如能够通过选自由HEY2、NKX6.2、NKX2.2、OLIG1及OLIG2组成的组中的1种以上的标志物的RNA或蛋白质的表达量来确定培养时间。具体而言，持续进行步骤(3)直至与步骤(3)开始时相比满足以下条件中的至少一项的时间，然后开始步骤(4)：

1)得到HEY2、NKX6.2及NKX2.2中至少1种的表达量以RNA水平计上升5倍以上的细胞聚集体；以及

2)得到OLIG1及/或OLIG2的表达量以RNA水平计上升10倍以上的细胞聚集体。

该RNA的表达量的评价方法如步骤(1)中所述。

步骤(3)中的悬浮培养的培养条件没有特别限定，例如可以为35℃～37℃、优选37℃的温度、90％～95％、优选95％的湿度、3％～5％、优选5％的CO₂浓度、10％～20％、优选20％的O₂浓度的条件。

＜步骤(4)＞

在步骤(4)中，在不含维甲酸、且含有1种以上的SHH信号传导激活剂的神经·胶质增殖用培养基中悬浮培养(3)中得到的细胞聚集体。神经·胶质增殖用培养基及SHH信号传导激活剂如上所述。

在步骤(4)中，可以在完成步骤(3)时，将培养基更换为步骤(4)的培养基，以细胞聚集体的状态悬浮培养步骤(3)中得到的细胞聚集体；也可以为了将无法在步骤(4)中使用的培养基中存活、增殖的细胞作为非目标细胞而去除、提高作为目标的少突胶质前体细胞、星形胶质前体细胞及神经前体细胞的含有率而使步骤(3)中得到的细胞聚集体分散，然后悬浮培养经分散的细胞，由此再次形成细胞聚集体。

“使细胞聚集体分散”是指，将形成细胞聚集体的细胞解离成一个细胞单元(单个细胞)，或者一边维持多个细胞彼此黏附的状态一边破坏原本的细胞聚集体的形状。作为分散的方法，可举出物理刺激方法、使用了化合物的方法，通过使用任一种或组合使用两种方法，能够破坏细胞聚集体。即，原本的细胞聚集体包含约1000个～10万个、优选约3000个～5万个、更优选约1000个～5万个、还更优选约3000个～3万个的细胞，优选使细胞聚集体分散后，即使在多个细胞彼此黏附而形成小的细胞团块的状态下，该团块所含的细胞数也为100个以下左右，还优选分散至相对于解离前的细胞聚集体而言，90％以上的细胞成为单一的状态。

具体而言，使用类胰蛋白酶(例如胰蛋白酶、TrypLE(注册商标))、Accutase(注册商标)、Accumax(注册商标)、或金属螯合剂(EDTA、EGTA等)使细胞彼此的黏附解离，进一步使用微量移液器给与物理刺激，由此能够有效地分散细胞聚集体。作为用于使细胞进一步分散至单个细胞的方法，能够利用通过细胞滤网的技术。为了实施本发明，可通过在悬浮培养条件下将细胞培养一定时间，从而达成使经分散的细胞聚集体聚合，再次形成细胞聚集体，为了得到大小更均匀的细胞凝集块，能够使用上述SFEBq法。

步骤(4)中的悬浮培养可进行大约4天以上，优选进行大约10天以上，更优选进行大约14天以上、尤其更优选进行大约14天～21天。培养时间根据所期望的细胞分化程度确定即可。

细胞分化程度能够通过测定分化标志物而确定，例如能够采集细胞并测定表达的分化标志物的mRNA量或蛋白量。或者也可以采集培养上清液，测定从细胞分泌至培养基中的分化标志物的蛋白量。步骤(4)中，例如能够通过选自由NFIA、NFIB、SLC1A3、S100B、FABP7及PAX6组成的组中的1种以上的标志物的RNA或蛋白质的表达量来确定培养时间。具体而言，持续进行步骤(4)直至与步骤(4)开始时相比满足以下条件中的至少一项的时间，然后开始步骤(5)：

1)得到NFIA、NFIB、SLC1A3、S100B及FABP7中至少1种的表达量以RNA水平计上升10倍以上的细胞聚集体；以及

2)得到PAX6的表达量以RNA水平计降低至5倍以下的细胞聚集体。

该RNA的表达量的评价方法如步骤(1)中所述。

例如可举出PrimeSurface 96V板、96缝隙井板及超低吸附培养瓶(CORNING公司制)等。

步骤(4)中使用的培养容器只要为细胞培养用的悬浮培养用的培养器材，则没有特别限定，能够适当使用本领域技术人员常用的培养瓶、培养板及培养皿。例如可举出Nunc(商标)EasYFlask(商标)细胞培养瓶(Thermo Fisher Scientific公司制)、超低吸附培养瓶(CORNING公司制)、SFEBq法中使用的具有多个均匀形状的孔的培养容器等。

步骤(4)中的悬浮培养的培养条件没有特别限定，例如可以为35℃～37℃、优选37℃的温度、90％～95％、优选95％的湿度、2％～5％、优选5％的CO₂浓度、10％～20％、优选20％的O ₂浓度的条件。

培养期间中，可以每约2～7天进行1次培养基更换、或每约2日～5天进行1次培养基更换、或每约3～4天进行1次培养基更换，对于该培养基更换，可以更换全部量的培养基，也可以为了避免细胞的环境发生显著变化而更换例如1/3或1/2左右的培养基。也可在除培养基更换以外的时机适当补充培养基中含有的生长因子或神经营养因子等成分。例如，步骤(4)中，优选以维持PDGF-AA的浓度(例如10ng/ml)的方式例如每2～3天添加1次PDGF-AA。

就步骤(4)中使用的神经·胶质增殖用培养基而言，当步骤(3)中使用神经·胶质增殖用培养基时，步骤(4)中可以使用相同组成的培养基作为神经·胶质增殖用培养基，也可以适当变更成分。

步骤(4)中使用的神经·胶质增殖用培养基优选含有5ng/ml～100ng/ml、还优选含有约10ng/ml的PDGF-AA。

＜步骤(5)＞

在步骤(5)中，在不含维甲酸及SHH信号传导激活剂这两者的神经·胶质增殖用培养基中悬浮培养(4)中得到的细胞聚集体。神经·胶质增殖用培养基如上所述。

在步骤(5)中，可以在完成步骤(4)时，将培养基更换为步骤(5)的培养基，以细胞聚集体的状态悬浮培养步骤(4)中得到的细胞聚集体；也可以为了将无法在步骤(5)中使用的培养基中存活、增殖的细胞作为非目标细胞而去除、提高作为目标的少突胶质前体细胞、星形胶质前体细胞及神经前体细胞的含有率而使步骤(4)中得到的细胞聚集体分散，然后悬浮培养经分散的细胞，由此再次形成细胞聚集体。具体的方法与步骤(4)相同。

步骤(5)中的悬浮培养只要在不过度分化、且细胞聚集体不会变得过大的条件下，一边适当进行培养基更换及传代一边进行培养，则能够继续培养，其时间没有特别限定。步骤(5)的培养可进行大约5天～100天，优选进行大约5天～20天或7天～50天，更优选进行大约7天～35天，还优选进行7天～28天，最优选进行14天～28天。在步骤(5)中，培养期间，可以按照细胞数、培养基量，每数天适当进行1次培养基更换，例如，每7天以内1次、每约2～7天1次、或每约2天～5天1次、或每约3～4天1次，该培养基更换可以更换全部量的培养基，也可以为了避免细胞的环境发生显著变化而更换例如1/3或1/2左右的培养基。传代次数没有限制，例如也可以传代0次～5次。例如，可开始步骤(5)，培养14天，在该时间点结束步骤；也可进一步进行1次传代，然后继续培养8天或14天，然后结束步骤。

细胞分化程度能够通过测定分化标志物而确定，例如能够采集细胞并测定表达或存在的分化标志物的量。作为分化标志物，至少可举出mRNA或蛋白质、糖、脂质等。或者也可以采集培养上清液，测定从细胞分泌至培养基中的分化标志物的量。

步骤(5)中，例如能够通过选自由O4抗原、NG2、OLIG2、PDGFRα、SOX10、SPON1、FAM181B、TIMP4、SOX6、GRIK3、LHFPL3、KLF9、A2B5(Epitope A2B5)抗原、CNP及PLP组成的组中的1种以上的标志物的表达量或存在量来确定培养时间。

作为步骤(5)中使用的神经·胶质增殖用培养基，只要不含有维甲酸及SHH信号传导激活剂，可以使用与步骤(4)相同组成的培养基，也可以适当变更成分。

步骤(5)中使用的培养容器只要为细胞培养用的器材，则没有特别限定，能够适当使用本领域技术人员常用的培养瓶、培养板。例如可举出Nunc(商标)EasYFlask(商标)细胞培养瓶(Thermo Fisher Scientific公司制)、超低吸附培养瓶(CORNING公司制)、96孔板、96孔缝隙井板等。步骤(5)中的悬浮培养的培养条件没有特别限定，例如只要为37℃的温度、95％的湿度、5％的CO₂浓度、20％的O₂浓度的条件即可。培养期间，优选每约7天进行1次培养基更换、每约3～4天添加1次PDGF-AA(例如10ng/ml)。

步骤(5)后得到的包含胶质前体细胞的细胞聚集体(本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体)具有以下特征：

(b)表达脊髓区域标志物；及

(c)不含有饲养细胞及源自饲养细胞的成分。

在步骤(5)中，出于确认是否得到具有上述特征(a)的细胞的目的，可持续进行步骤(5)直至确认到细胞聚集体表达选自O4抗原、NG2、OLIG2、PDGFRα、SOX10、SPON1、FAM181B、TIMP4、SOX6、GRIK3、LHFPL3、KLF9、A2B5抗原、CNP及PLP中的1种以上、优选2种以上、还优选5种以上的标志物。

进而，在步骤(5)中，出于确认是否得到具有上述特征(b)的细胞的目的，可持续进行步骤(5)直至确认到细胞聚集体表达选自由HOXB3、HOXB4、HOXB6及HOXD8组成的组中的1种以上、优选2种以上的标志物。

进而，在步骤(5)中，可持续进行步骤(5)直至在培养细胞聚集体的培养基中检测到选自由SPARCL1、MIF、MCP-1、IL-8、SCF、M-CSF、HGF、GRO-α、LIF、IFN-γ及TRAIL组成的组中的1种以上的蛋白质。

上述包含胶质前体细胞的细胞聚集体的直径为约100μm～800μm，例如为约100μm～300μm、约200μm～400μm、或约400μm～600μm的球状。该包含胶质前体细胞的细胞聚集体可通过继续进行适合分化的培养而分化成包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞聚集体。另外，当将该包含胶质前体细胞的细胞聚集体移植至生物体时，可在生物体中分化成包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群。

〔包含胶质前体细胞的细胞聚集体〕

作为本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的一个方式，具有以下特征：

(b)表达脊髓区域标志物；

(c)不含有饲养细胞及源自饲养细胞的成分；及

(a)一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体包含少突胶质前体细胞、星形胶质前体细胞及神经前体细胞作为构成细胞聚集体的细胞。

胶质前体细胞的概念同时包含少突胶质前体细胞及星形胶质前体细胞。

本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体中的少突胶质前体细胞的特征在于，表达选自O4抗原、NG2、OLIG2、PDGFRα、SOX10、SPON1、FAM181B、TIMP4、SOX6、GRIK3、LHFPL3、KLF9、A2B5抗原、CNP及PLP中的1种以上、优选2种以上、还优选5种以上的标志物。该少突胶质前体细胞优选至少表达A2B5抗原、O4抗原、OLIG2及FAM181B。

本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体中的星形胶质前体细胞的特征在于，表达选自NFIA、NFIB、SOX9、HEY1、HEY2、FABP7、ZBTB20、SLC1A3、S100B、MLC1、SLIT1、TIMP3、SPARCL1、GFAP及AQP4中的1种以上、优选2种以上、还优选5种以上的标志物。该星形胶质前体细胞优选至少表达NFIA、NFIB、SLC1A3及SPARCL1。

在上述星形胶质前体细胞中表达的标志物之中，NFIA、NFIB、SOX9、HEY1、HEY2、FABP7及ZBTB20为在下述细胞中表达的标志物：所述细胞被分类为胶质前体细胞，且尽管未分化成完整的星形胶质前体细胞但注定会向星形胶质细胞诱导分化，是成熟度低的星形胶质前体细胞。即，本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于包含该成熟度低的星形胶质前体细胞。

因此，更优选本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体中同时包含：

1)成熟度低的星形胶质前体细胞，其特征在于，表达选自NFIA、NFIB、SOX9、HEY1、HEY2、FABP7及ZBTB20中的1种以上、优选2种以上、还优选5种以上的标志物；以及

2)星形胶质前体细胞，其特征在于，表达选自SLC1A3、S100B、MLC1、SLIT1、TIMP3、SPARCL1、GFAP及AQP4中的1种以上、优选2种以上、还优选5种以上的标志物。

本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体包含神经前体细胞及相对更不成熟的(分化程度低的)神经干细胞。该神经干细胞的特征在于，表达选自SOX1、SOX2、NESTIN、MEIS1、MEIS2、DLL3及ASCL1中的1种以上、优选2种以上、还优选4种以上的标志物。该神经干细胞优选至少表达SOX1、ASCL1、NESTIN。

本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体中的神经前体细胞的特征在于，表达选自由DCX、βIII微管蛋白、MAP2、ELAVL3、NTRK2、GRIA2、PTPRO及EPHA3组成的组中的1种以上、优选2种以上、还优选5种以上的标志物。该神经前体细胞优选至少表达DCX、βIII微管蛋白及ELAVL3。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体中，优选：相对于构成细胞聚集体的所有细胞而言，包含5％以上、优选包含10％～60％、更优选包含20％～50％、还优选包含20％～40％的少突胶质前体细胞。另外，优选：包含10％以上、优选包含10％～80％、更优选包含10％～50％、还优选包含20％～30％的星形胶质前体细胞。进而，优选：包含10％以上、优选包含20％～60％、更优选包含30％～50％的神经前体细胞。此处少突胶质前体细胞、星形胶质前体细胞及神经前体细胞的总计不超过100％，占该细胞聚集体中所含的细胞总数的80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、还优选95％以上。

此处包含胶质前体细胞的细胞聚集体中各个细胞种类的比例没有特别限定，作为一个方式，可举出星形胶质前体细胞或神经前体细胞的含量大于少突胶质前体细胞的含量的细胞聚集体。

各细胞相对于构成细胞聚集体的所有细胞的含有比例能够通过各个细胞标志物的表达来确定。例如可通过FACS、免疫染色、或单细胞RNA序列分析等本领域技术人员已知的手法，使用对标志物的mRNA、蛋白质或它们的片段进行测定(检测或定量)并算出的数值来判断存在于一定范围内的目标细胞相对于所有细胞的比例。细胞总数例如可通过核染色来进行计数，存在于同一范围内的目标细胞数可用表达特异性表达于目标细胞中的标志物的细胞数进行计数。

(b)一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，表达脊髓区域标志物，例如以mRNA水平表达选自HOXB3、HOXB4、HOXB6及HOXD8中的1种以上、优选2种以上的脊髓区域标志物。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，表达腹侧区域标志物，例如以mRNA水平表达选自NKX2.1、NKX2.2、NKX6.1及NKX6.2中的1种以上、优选2种以上的腹侧区域标志物。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，包含以mRNA水平表达选自HOXB3、HOXB4、HOXB6及HOXD8中的1种以上、优选2种以上的脊髓区域标志物、且表达选自NKX2.1、NKX2.2、NKX6.1及NKX6.2中的1种以上、优选2种以上的腹侧区域标志物的细胞。

(c)一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，不含有饲养细胞及源自饲养细胞的成分；饲养细胞源自异种动物时，不含异种细胞来源成分。这种细胞聚集体能够通过在不存在饲养细胞的情况下培养多潜能性干细胞而得到。此处，异种细胞来源成分是指源自与培养对象的细胞的物种不同的物种的成分，本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体中，不含有除iPS细胞或由iPS细胞分化诱导的细胞以外的细胞、或它们的细胞特异性成分。需要说明的是，本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体也包含下述形态：不含有源自饲养细胞的成分、例如源自异种的饲养细胞的成分，而且也不含有源自其他的异种细胞的成分、异种来源成分(Xenogenic Factor)。这种细胞聚集体可通过在上述不存在饲养细胞的条件的基础上使用无Xeno培养基来得到。

(d)一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体具有分化成包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群的能力。可通过下述方法来确认本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体具有该能力：在后述成熟化培养基中用后述培养方法培养5天～60天、更具体而言培养10天，然后确认是否分化成了包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群。即，向包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群的分化可通过检测后述的标志物的表达来鉴定。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，(I)包含优选以mRNA水平表达选自NFIA、NFIB、SOX9、HEY1、HEY2、FABP7、ZBTB20、SLC1A3、S100B、MLC1、SLIT1、TIMP3、SPARCL1、GFAP及AQP4中的1种以上、优选2种以上、还优选5种以上的标志物的细胞。

优选的是，实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于包含下述细胞，所述细胞的特征在于：以mRNA水平表达选自NFIA、NFIB、SOX9、HEY1、HEY2及ZBTB20中的1种以上、优选2种以上、还优选5种以上的标志物，且以mRNA水平表达选自SLC1A3、S100B、MLC1、SLIT1、TIMP3、SPARCL1、GFAP及AQP4中的1种以上、优选2种以上、还优选5种以上的标志物。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，(II)包含优选以mRNA水平表达选自OLIG2、PDGFRα、SOX10、SPON1、FAM181B、TIMP4、SOX6、GRIK3、LHFPL3、KLF9、A2B5抗原、CNP及PLP中的1种以上、优选2种以上、还优选5种以上的标志物的细胞。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，(III)包含表达选自由DCX、βIII微管蛋白、MAP2、ELAVL3、NTRK2、GRIA2、PTPRO及EPHA3组成的组中的1种以上的标志物的细胞。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，(IV)包含表达选自由SOX1、SOX2、NESTIN、MEIS1、MEIS2、DLL3及ASCL1组成的组中的1种以上的标志物的细胞。

就一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体而言，(V)具有分化成包含下述细胞的细胞群的能力：

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，具有经过上述培养而分化成至少包含5％以上、优选包含约5％～20％的O4阳性细胞的细胞群的能力。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，具有经过上述培养而分化成至少包含10％以上、优选包含约10％～50％的APC阳性细胞的细胞群的能力。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，具有经过上述培养而分化成至少包含10％以上、优选包含约10％～40％的GFAP阳性细胞的细胞群的能力。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，具有经过上述培养而分化成至少包含15％以上、优选包含约15％～50％的βIII微管蛋白阳性细胞的细胞群的能力。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，具有经过上述培养而分化成至少包含10％以上、优选包含约10％～30％的Hu阳性细胞的细胞群的能力。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，(VI)以mRNA水平表达选自C1ORF61及SERPINE2中的1种以上的标志物。

就一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体而言，(VII)还具有以下(A)～(C)中的至少1个特征：

(A)相对于构成细胞聚集体的所有细胞而言，60％以上、优选70％以上、还优选70％～90％、还更优选75％～85％的细胞表达NFIA；

(B)相对于构成细胞聚集体的所有细胞而言，10％以上、优选20％以上、还优选20％～50％、还更优选20％～40％的细胞表达OLIG2；以及

(C)相对于构成细胞聚集体的所有细胞而言，20％以上、优选30％以上、还优选30％～60％、还更优选30％～50％的细胞表达选自HEY2、C1ORF61、FAM181B、NFIA、NFIB、ITM2B、LHFPL3及MLC1中的1种以上的标志物。

此处各标志物阳性细胞的比率能够通过利用免疫染色进行染色的细胞数的计数、单细胞水平上的基因表达分析来计算。

就一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体而言，(VIII)不包含多潜能性干细胞。不包含多潜能性干细胞可通过以OCT3/4及NANOG在mRNA水平或蛋白质水平上均不表达、或表达量降低作为指标来确认。具体而言，例如能够以OCT3/4的表达量与iPS细胞相比降低至200分之1以下、及/或NANOG的表达量与iPS细胞相比降低至400分之1以下作为指标。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征在于，(IX)分化至不表达PAX6的程度。此处，可通过以PAX6在mRNA水平或蛋白质水平上不表达、或表达量降低作为指标来确认。具体而言，例如能够将下述情况作为指标：与开始步骤(3)的时机(例如本申请实施例中的分化第14天)相比，PAX6的表达量在实施步骤(4)或(5)回收移植用细胞聚集体的时机(例如本申请实施例中的分化第49天)降低至10分之1以下。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体可以为(X)直径为约100μm～800μm的球状的细胞聚集体，例如，也可以为约100μm～300μm、约200μm～400μm、或约400μm～600μm。以单位细胞聚集体计的细胞数可以为约1000～100000个，优选为约3000～50000个，更优选为约3000～30000个。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体具有上述(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)及(X)中的至少2个、至少4个、至少6个、至少8个或全部的特征。

一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体包含：表达或分泌选自由SPARCL1、MIF、MCP-1、IL-8、SCF、M-CSF、HGF、GRO-α、LIF、IFN-γ及TRAIL组成的组中的1种以上的标志物的细胞；或在该细胞聚集体的培养上清液中检测到上述标志物的细胞。一个实施方式的包含胶质前体细胞的细胞聚集体优选包含：表达或分泌选自由SPARCL1、MIF、MCP-1、IL-8、SCF、M-CSF、HGF、及GRO-α组成的组中的1种以上的标志物的细胞；或在该细胞聚集体的培养上清液中检测到上述标志物的细胞；更优选包含表达或分泌选自由SPARCL1、MIF、MCP-1、SCF、M-CSF及HGF组成的组中的1种以上的标志物的细胞、或在该细胞聚集体的培养上清液中检测到上述标志物的细胞。

在一个实施方式中，当在包含胶质前体细胞的细胞聚集体的培养上清液中检测到SPARCL1时，例如在培养了48小时的情况下，在每1000个细胞中检测到0.1ng以上、优选1ng以上、更优选10ng以上的SPARCL1。在一个实施方式中，在每1000个细胞中检测到0.1ng～1000ng、优选1ng～1000ng、更优选10ng～60ng的SPARCL1。

在一个实施方式中，当在包含胶质前体细胞的细胞聚集体的培养上清液中检测到MIF时，例如在培养了48小时的情况下，在每1000个细胞中检测到0.1pg以上、优选0.2pg以上、更优选0.5pg以上的MIF。在一个实施方式中，在每1000个细胞中检测到0.1pg～100pg、优选0.1pg～10pg、更优选0.5pg～5pg的MIF。

在一个实施方式中，当在包含胶质前体细胞的细胞聚集体的培养上清液中检测到MCP-1时，例如在培养了48小时的情况下，在每1000个细胞中检测到0.1pg以上、优选0.2pg以上、更优选0.5pg以上的MCP-1。在一个实施方式中，在每1000个细胞中检测到0.1pg～100pg、优选0.1pg～10pg、更优选0.5pg～8pg的MCP-1。

在一个实施方式中，当在包含胶质前体细胞的细胞聚集体的培养上清液中检测到SCF时，例如在培养了48小时的情况下，在每1000个细胞中检测到0.001pg以上、优选0.01pg以上、更优选0.02pg以上的SCF。在一个实施方式中，在每1000个细胞中检测到0.001pg～10pg、优选0.01pg～1pg、更优选0.02pg～0.2pg的SCF。

在一个实施方式中，当在包含胶质前体细胞的细胞聚集体的培养上清液中检测到M-CSF时，例如在培养了48小时的情况下，在每1000个细胞中检测到0.001pg以上、优选0.005pg以上、更优选0.01pg以上的M-CSF。在一个实施方式中，在每1000个细胞中检测到0.0001pg～10pg、优选0.001pg～1pg、更优选0.005pg～0.1pg的M-CSF。

在一个实施方式中，当在包含胶质前体细胞的细胞聚集体的培养上清液中检测到HGF时，例如在培养了48小时的情况下，在每1000个细胞中检测到0.0001pg以上、优选0.001pg以上、更优选0.01pg以上的HGF。在一个实施方式中，在每1000个细胞中检测到0.0001pg～10pg、优选0.001pg～1pg、更优选0.005pg～0.5pg的HGF。

在一个实施方式中，当在包含胶质前体细胞的细胞聚集体的培养上清液中检测到LIF时，例如在培养了48小时的情况下，在每1000个细胞中检测到0.0001pg以上、优选0.001pg以上、更优选0.01pg以上的LIF。在一个实施方式中，在每1000个细胞中检测到0.0001pg～10pg、优选0.001pg～1pg、更优选0.005pg～0.5pg的LIF。

〔包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群的制备方法〕

作为本发明的包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群的制备方法的一个方式，通过使用成熟化培养基，将包含胶质前体细胞的细胞聚集体培养5天～60天而进行。

“成熟化培养基”是指用于使胶质细胞及神经细胞成熟的培养基，为含有胶质细胞及神经细胞的成熟所需的因子的培养基。就作为基础的培养基(基础培养基)而言，只要为可使神经系统细胞存活的培养基，则没有特别限定，可与上述神经·胶质增殖用培养基共通。作为基础培养基，例如可举出在DMEM/F-12等基础培养基中添加了N2及/或B27等神经系统细胞培养用补充剂的培养基。其中，期望不含有神经·胶质增殖用培养基中所含的、主要有助于细胞增殖的生长因子类：FGF(例如FGF2)、EGF及PDGF(例如PDGF-AA)。

另一方面，成熟化培养基含有有助于分化成胶质细胞的神经营养因子、甲状腺激素及/或细胞因子。作为神经营养因子，可举出NT-3。作为甲状腺激素，可举出T3。作为该细胞因子，可举出LIF。

作为成熟化培养基，例如能够使用含有T3、NT-3及LIF中的至少1种、优选2种、还优选全部的培养基。另外，作为用于分化成星形胶质细胞的成熟化培养基，能够使用还含有CNTF的培养基。可以在培养基中添加上述因子而使用，也可以使用配合了上述因子的培养基。成熟化培养基中的T3的浓度为5ng/ml以上即可，优选为30ng/ml～100ng/ml，更优选为60ng/ml～100ng/ml。另外，成熟化培养基中的NT-3的浓度为10ng/ml以上即可，优选为10ng/ml～100ng/ml，更优选为10ng/ml～50ng/ml。另外，成熟化培养基中的LIF的浓度为10ng/ml以上即可，优选为10ng/ml～100ng/ml，更优选为10ng/ml～50ng/ml。进而，成熟化培养基中的CNTF的浓度为5ng/ml以上即可，优选为10ng/ml～50ng/ml，更优选为25ng/ml～50ng/ml。

通过包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群的制备方法而得到的“包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群”(本发明的包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群)只要为在构成细胞群的细胞中以可检测到的水平包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞这3种细胞的细胞群，则各个细胞种类的含有比例没有特别限定。上述细胞群可以为具有立体结构(球状)的细胞聚集体，也可以为具有二次的层状结构的细胞群。层状的细胞群能够通过在Matrigel等细胞黏附因子的存在下对包含胶质前体细胞的细胞聚集体进行贴壁培养而制备。

为了检测各个细胞，例如能够使用免疫组织学方法及(RT-qPCR及RNA序列等)基因分析。当使用基因分析时，能够按照本说明书实施例2中记载的方法，鉴定细胞聚集体中所含的mRNA及其表达水平。

得到的本发明的包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群也可包含作为起始细胞的少突胶质前体细胞、星形胶质前体细胞及神经前体细胞。该细胞群优选以细胞总数的50％以上、还优选70％以上包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞。该细胞群包含2％以上、优选包含5％～50％、更优选包含10％～40％的少突胶质细胞。另外，包含10％以上、优选包含10％～70％、更优选包含10％～50％的星形胶质细胞。进而，包含10％以上、优选包含20％～60％、更优选包含30％～50％的神经细胞。此处少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的总计不超过100％，占该细胞聚集体中所含的细胞总数的50％以上，优选占70％以上。

本发明的包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群包含：

(i)表达选自由O4抗原、GalC、MBP、APC、GSTπ、CNP、PLP、OLIG2、SOX10、PDGFRα及NG2组成的组中的1种以上的标志物、优选3种以上的标志物、还优选5种以上的标志物、还更优选全部的标志物的细胞；

(ii)表达选自由βIII微管蛋白、MAP2及ELAVL3组成的组中的1种以上的标志物、优选2种以上的标志物、还优选全部的标志物的细胞；以及

(iii)表达选自由SLC1A3、S100B、AQP4、GFAP及NG2组成的组中的1种以上的标志物、优选2种以上的标志物、还优选3种以上的标志物、还更优选全部的标志物的细胞。

包含胶质前体细胞的细胞聚集体的培养可以为悬浮培养。培养条件没有特别限定，例如为35℃～37℃、优选37℃的温度、90％～95％、优选95％的湿度、3％～5％、优选5％的CO₂浓度、10％～20％、优选20％的O₂浓度的条件即可。培养容器只要为细胞培养用器材，则没有特别限定，能够使用本领域技术人员常用的培养瓶、培养皿。例如可举出Nunc(商标)EasYFlask(商标)细胞培养瓶(Thermo Fisher Scientific公司制)、超低吸附培养瓶(CORNING公司制)等。

〔药物组合物〕

作为本发明的一个方式，可举出以本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体、或本发明的包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群、或包含源自该细胞聚集体或细胞群的细胞的移植用细胞群作为有效成分的药物组合物。本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体可通过本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法而制备。本发明的包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群可通过本发明的包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群的制备方法而制备。

该有效成分的有效剂量因施予目的、施予方法、及施予对象的状况(性别、年龄、体重、病情等)而有所不同，例如以细胞数计，能够设为1×10⁴个～1×10⁸个、1×10⁵个～3×10⁵个、1×10⁶个～3×10⁶个、或1×10⁷～3×10⁷个。

除上述有效剂量的有效成分以外，一个实施方式的药物组合物也可含有药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体，能够使用生理性水性介质(生理盐水、缓冲液、无血清培养基等)。药物组合物中，根据需要也可含有在移植医学中常用于含有移植的组织或细胞的药物中的防腐剂、稳定剂、还原剂、等渗剂等。

通过将移植用细胞聚集体或移植用细胞群混悬于适当的生理性水性介质中，能够制备成细胞悬液。若有必要，也可添加冷冻保存剂将上述移植用细胞群冷冻保存，在使用时解冻，用缓冲液清洗，用于移植医学。

本发明的移植用细胞群可以为使细胞聚集体混悬而成的悬液，也可以为使该细胞聚集体从细胞聚集体分散成细胞而成的悬液、片剂。

另外，就本发明的制备方法中得到的移植用细胞群而言，通过在实施包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法中的步骤(4)之后，在支架上进行培养，能够将其成型为立体状，制成作为三维组织的细胞组织结构体。

如下述所记载的，包含本发明的细胞的药物组合物由于能够在无血清的情况下获得，因此不含有血清来源成分等会对治疗带来问题的成分，对脊髓损伤模型动物(例如小鼠)施予时，会发挥修复损伤部位中的损伤神经系统以及恢复运动功能的显著的效果。因此，本发明的药物组合物作为迄今为止不存在有效治疗手段的脱髓鞘疾病及基于胶质细胞受损的疾病或伴有胶质细胞受损的疾病、以及急性期、亚急性期或慢性期脊髓损伤等基于或伴有急性期、亚急性期或慢性期的胶质细胞的受损的疾病的治疗药物是有用的。

而且，由本说明书中记载的包含胶质前体细胞的细胞聚集体形成的移植用细胞群是由株系化的多潜能性干细胞制备的，并利用标志物等进行鉴定及质量管理，由此能够大量制备品质稳定的移植用细胞群，并用于移植。另外，由于能够保存移植用细胞群，因此能够根据患者的移植时间来准备移植用细胞群。

“脱髓鞘疾病”只要为包括在神经细胞的轴突周围形成髓鞘的髓磷脂的炎症、消退的受损，则没有特别限定。作为脱髓鞘疾病，例如可举出脊髓损伤、多发性硬化症、肾上腺脑白质营养不良、白质消融性脑病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacherdisease)(广义上为先天性脑白质营养不良病)及脑白质营养不良。作为上述脊髓损伤，可举出急性期骨髓损伤、亚急性期脊髓损伤或慢性期的脊髓损伤。

“伴有胶质细胞受损的疾病”(也称作“基于胶质细胞的疾病”)只要为伴有胶质细胞、即选自由星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞及小胶质细胞组成的组中的一个或多个细胞种类受损的疾病，则没有特别限定。作为伴有胶质细胞受损的疾病，具体而言，可举出脊髓损伤、脑梗塞、精神分裂症等精神神经疾病、脱髓鞘疾病、神经退行性疾病。更具体而言，可举出视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)、肌萎缩侧索硬化、帕金森病、亚历山大病、先天性脑白质营养不良病、亨廷顿病、阿尔茨海默病及精神分裂症、进行性多病灶脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、脑桥中央髓鞘溶解症(CPM)、沃勒变性(Walleriandegeneration)、肾上腺脑白质营养不良、黄斑裂孔、脊髓小脑变性症、多系统萎缩等其他的多种神经受损及神经退行性状态等。将上述疾病之中自发病起经过了一定时间的情况称为慢性期的脱髓鞘疾病或慢性期的伴有胶质细胞受损的疾病。例如，对于脊髓损伤，观察到许多损伤后经过3个月～6个月时于损伤部形成非常坚硬的瘢痕组织、病况固定化的病例，将该病况称作慢性期的脊髓损伤。

在伴有胶质细胞受损的疾病中，作为包含胶质细胞的膜组织的损伤状态，例如可举出少突胶质细胞或星形胶质细胞等胶质细胞变性死亡的状态等。

〔治疗方法·治疗药物〕

作为本发明的一个方式，可举出脱髓鞘疾病及基于或伴有胶质细胞受损的疾病的治疗方法，该方法包括将有效剂量的本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体、或本发明的包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群、或包含源自该细胞聚集体或该细胞群的细胞的移植用细胞群移植至需要移植的对象。此处，脱髓鞘疾病及基于或伴有胶质细胞受损的疾病也可以为慢性期的脱髓鞘疾病及慢性期的基于或伴有胶质细胞受损的疾病。需要说明的是，将从受损或疾病的发病起经过一定时间的情况(例如，为慢性期脊髓损伤时，损伤后经过3个月～6个月以上的情况)判断为慢性期。

本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体对于脱髓鞘疾病、及伴有胶质细胞受损的疾病的移植医学而言是有用的。因此，本发明提供脱髓鞘疾病及伴有胶质细胞受损的疾病的治疗药物，其包含本发明的细胞聚集体、或包含由该细胞聚集体得到的细胞的移植用细胞群。

另外，本发明还提供治疗方法，其包括将该治疗药物以细胞聚集体或其悬液、经分散的细胞的悬液、与血纤蛋白、水凝胶等生物降解性生物材料形成的悬液、及以它们为支架进行培养的细胞组织结构体的形态施予(移植)至患者。作为脱髓鞘疾病及伴有胶质细胞受损的疾病的治疗药物，或为了在该含胶质细胞的组织的损伤状态下对该损伤部位进行补充，能够使用本发明的细胞聚集体(细胞群)或包含由该细胞聚集体(细胞群)得到的细胞的移植用细胞群。

通过对需要移植的脱髓鞘疾病及伴有胶质细胞受损的疾病、或含胶质细胞的组织的损伤状态的患者移植本发明的细胞聚集体或包含由该细胞聚集体得到的细胞的移植用细胞群、或补充已受损的含胶质细胞的组织本身，能够治疗脱髓鞘疾病及伴有胶质细胞受损的疾病、或含胶质细胞的组织的损伤状态。

移植医学中，组织相容性抗原的差异引起的排斥反应经常成为问题，通过使用由移植的受体的体细胞建立的多潜能性干细胞(例如诱导性多潜能干细胞)能够克服该问题。即，在本发明的优选的一个方式中，通过使用由受体的体细胞建立的多潜能性干细胞(例如诱导性多潜能干细胞)作为多潜能性干细胞，针对该受体制备免疫学上的自身的细胞聚集体(细胞群)，将该细胞聚集体(细胞群)或包含由该细胞聚集体(细胞群)得到的细胞的移植用细胞群移植至该受体。

另外，可以从由与受体免疫相容的(例如，HLA型或MHC型相容)其他人的体细胞建立的多潜能性干细胞(例如，诱导性多潜能干细胞)制备同种异体(allo)(异体)的细胞聚集体(细胞群)，将该细胞聚集体(细胞群)或包含由该细胞聚集体(细胞群)得到的细胞的移植用细胞群移植至该受体。

另外，通过使用组织相容性抗原(例如，构成HLA类I、HLA类II的抗原蛋白)或该抗原的表达所需的因子的表达被抑制的iPS细胞制备本发明的细胞聚集体(细胞群)，从而即使是异体的细胞移植也能够避免排斥反应。

本发明的治疗方法中，作为对患者或受体进行施予或移植的治疗药物，能够使用上述药物组合物。

作为本发明的一个方式，可举出本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体、或本发明的包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群的用途，其用于脱髓鞘疾病、以及基于胶质细胞受损的疾病及伴有胶质细胞受损的疾病的治疗中的应用。

〔毒性·药效评价方法〕

作为本发明的一个方式，可举出用于评价受试物质的毒性或药效的方法，其包括使本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体、或本发明的包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群与受试物质接触，针对受试物质对该细胞聚集体或该细胞群造成的影响进行检测或定量。

本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体、以及包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群能够作为疾病模型细胞，用于脱髓鞘疾病以及基于胶质细胞受损的疾病及伴有胶质细胞受损的疾病(统称为胶质疾病)的治疗药物、或其预防药物的筛选、药效评价。

另外，本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体、以及包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群能够作为健康模型细胞，用于化学物质等的安全性试验、负荷试验、毒性试验、副作用试验、感染或混入试验。另外，本发明的细胞聚集体或细胞群由于包含少突胶质前体细胞、星形胶质前体细胞等胶质前体细胞、神经前体细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞等，因此也可用于包含上述细胞的神经组织(中枢神经系统、脊髓、肌神经接合点)的功能试验，具体而言，可用于评价5-羟色胺能神经、运动神经等的功能、胶质及神经前体细胞的增殖能力、分化能力。

作为其评价方法，除了细胞凋亡评价等刺激·毒性试验以外，可举出评价化学物质对由胶质前体细胞正常分化成胶质细胞造成的影响的试验(基于各种基因标志物的RT-PCR、细胞因子的ELISA等的表达蛋白分析、吞噬试验)等。例如能够用于探索促进分化成少突胶质细胞的能力的化合物、针对使源自脱髓鞘疾病、胶质疾病等的患者的iPS细胞分化而得的细胞探索挽救疾病特异性表型的化合物、蛋白质等。

另外，作为用于上述试验的细胞材料，例如能够提供使本发明的细胞聚集体的细胞分散并将其接种吸附的培养板、细胞悬液、其片或成形体。

本发明的包含胶质前体细胞的细胞聚集体、以及包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群、或使它们分散而成的细胞能够用于人及动物试验的外推试验。

〔用于评价·判别包含胶质前体细胞的细胞聚集体的新型标志物〕

作为本发明的一个方式，可举出以选自由C1ORF61及SERPINE2组成的组中的1种以上的标志物是否表达为指标，判别包含胶质前体细胞的细胞聚集体适合移植的方法。

对于本发明的判别方法而言，针对C1ORF61或SERPINE2是否表达，可通过检测这些标志物的蛋白质、mRNA或它们的片段来实施。即，作为一个方式，本发明的判别方法包括以下步骤：

步骤(1)，检测细胞聚集体样品中表达的源自选自由C1ORF61及SERPINE2组成的组中的1种以上的标志物的蛋白质或其片段；

步骤(2)，当上述源自标志物的蛋白质或其片段的表达量大于基准值时，确定该细胞聚集体样品为适合移植的包含胶质前体细胞的细胞聚集体。

另外，作为一个方式，本发明的判别方法包括以下步骤：

步骤(1)，检测细胞聚集体样品中表达的源自选自由C1ORF61及SERPINE2组成的组中的1种以上的标志物的mRNA或其片段；

步骤(2)，当上述源自标志物的mRNA或其片段的表达量大于基准值时，确定该细胞聚集体样品为适合移植的包含胶质前体细胞的细胞聚集体。

作为本发明的一个方式，可举出胶质前体细胞或胶质的分化取向性高的神经干细胞的鉴定方法，其包括检测选自由C1ORF61及SERPINE2组成的组中的1种以上的基因、由该基因编码的蛋白质及它们的片段。此处“胶质的分化取向性高”表示在成熟化培养基中诱导终末分化时，分化成胶质的比例高(例如30％以上)的神经干细胞的性质。

对于本发明的鉴定方法而言，针对C1ORF61或SERPINE2是否表达，可通过检测这些标志物的蛋白质、mRNA或它们的片段来实施。即，作为一个方式，本发明的鉴定方法包括以下步骤：

步骤(1)，检测细胞群样品中表达的源自选自由C1ORF61及SERPINE2组成的组中的1种以上的标志物的蛋白质或其片段；

步骤(2)，当上述源自标志物的蛋白质或片段的表达量大于基准值时，鉴定该细胞群样品为胶质的分化取向性高的胶质前体细胞或神经干细胞。

另外，作为一个方式，本发明的鉴定方法包括以下步骤：

步骤(1)，检测细胞群样品中表达的源自选自由C1ORF61及SERPINE2组成的组中的1种以上的标志物的mRNA或其片段；

步骤(2)，当上述源自标志物的mRNA或其片段的表达量大于基准值时，确定该细胞群样品为胶质的分化取向性高的胶质前体细胞或神经干细胞。

下述的表1示出本说明书中记载的基因及其GenBank登录号。

[表1]

实施例

以下举出实施例对本发明进行详细说明，但本发明并非限定于此。

＜实施例1细胞聚集体的制备＞

作为iPS细胞株，使用了作为由京都大学iPS细胞研究所建立的临床级外周血来源无饲养层iPS细胞株的QHJI01s04株。分化前，在添加有层粘连蛋白511E8片段(iMatrix-511E8；Nippi.Inc.制)(0.5mg/ml)的StemFit(注册商标)AK03N培养基(Ajinomoto Co.,Inc.制)中进行维持培养。

为了将iPS细胞分化诱导成神经前体细胞，使用了快速聚集无血清悬浮培养法(SFEBq法)形成类胚体。具体而言，用0.5×TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific公司制)/0.25mM EDTA(乙二胺四乙酸)/PBS(磷酸盐缓冲生理盐水、Thermo FisherScientific公司制)将维持培养的QHJI01s04株分离成单个细胞，以9000细胞/孔接种于96孔低吸附培养板(商品名：PrimeSurface(注册商标)96V板、Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.制)上，将接种日设为分化第0天，在5％CO₂/5％O₂下于37℃开始诱导。使用表2所示的添加有各因子的类胚体形成培养基(AK03N-C培养基)，每天更换一半量的培养基。

[表2]

分化第14天，从96孔板回收类胚体，用DMEM/F-12(商品名：D-MEM/Ham’s F-12；Dulbecco’s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12，FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制)清洗1次。然后，从分化第14天至第21天，在表3所示的条件1、2、3及4下，使用低吸附培养瓶(商品名：Ultra-Low Attachment 75cm² Rectangular CantedNeck Cell Culture Flask with Vent Cap、CORNING公司制)，在5％CO₂/20％O₂下于37℃每3天更换1次培养基，培养7天。

[表3]

条件	培养基	因子
			1	神经·胶质增殖用培养基	1μM维甲酸(RA，Sigma-Aldrich公司)
2	神经·胶质增殖用培养基	1μM嘌吗啡胺(PM，Millipore公司制)
			3	神经·胶质增殖用培养基	1μM RA及1μM PM
4	AK03N-C培养基	1μM RA及1μM PM

作为表3中的神经·胶质增殖用培养基，使用了在DMEM/F-12(含有3.15lg/L葡萄糖、15mM HEPES、2.5mM L-谷氨酰胺、0.5mM丙酮酸钠，FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制)中添加有B27补充剂(Thermo Fisher Scientific公司制)、N2补充剂(Thermo Fisher Scientific公司制)、60ng/ml T3(3，3’，5-三碘代-L-甲腺原氨酸钠盐，Sigma-Aldrich公司制)、10ng/ml PDGF-AA(血小板源生长因子AA(Platelet-DerivedGrowth Factor-AA)、PeproTech公司制)、10ng/ml IGF-1(胰岛素样生长因子1(Insulin-like Growth Factor-1)、R&D Systems公司制)、10ng/ml NT-3(神经营养蛋白3(Neurotrophin-3)、PeproTech公司制)、10ng/ml EGF(表皮生长因子(Epidermal GrowthFactor)、PeproTech公司制)、20ng/ml FGF2(成纤维细胞生长因子2(Fibroblast GrowthFactor 2)、PeproTech公司制)的培养基。

分化第21天，回收类胚体，使用TrypLE Select分散成单个细胞后，使用含1μM PM的神经·胶质增殖用培养基，在组织培养用培养瓶(Thermo Fisher Scientific公司制)中，每7天更换1次培养基，进行悬浮培养(传代数1)。14天后，在分化第35天的时间点，再次使其分散成单个细胞后，在神经·胶质增殖用培养基中进行悬浮培养(传代数2)。图1A示出分化第35天和第49天的明场像。

另外，为了确认分化第49天得到的细胞聚集体的终末分化能力，以细胞聚集体的状态将其接种于用经DMEM/F-12稀释的1％Matrigel Basement Membrane Matrix GrowthFactor Reduced(CORNING公司制)进行了处理的8孔腔室载玻片(IWAKI公司制)，使其贴附于Matrigel上，在成熟化培养基中培养14天，使其终末分化。作为成熟化培养基，使用了在KBM神经干细胞(KOHJIN BIO公司制)中添加有B27补充剂、1％非必需氨基酸(ThermoFisher Scientific公司制)、60ng/ml T3、10ng/ml NT-3、25ng/ml CNTF、及10ng/ml LIF的培养基。

使用终末分化第14天(分化第63天)的细胞，对各标志物进行免疫荧光染色。免疫荧光染色使用了6种一抗及与其对应的经荧光标记的二抗。一抗如表4所示，各混合3种，用封闭液稀释，制备2种一抗溶液(一抗溶液1及一抗溶液2)。二抗也同样如表4所示地各混合3种，进一步添加用于核染色的Hoechst33342(稀释倍数1:1000，同仁化学公司制)，用封闭液稀释，制备2种二抗溶液(二抗溶液1及二抗溶液2)。

[表4]

^*：稀释倍数1∶1000，Thermo Fisher Scientific公司制

对于免疫荧光染色，在终末分化第14天(分化第63天)，使用4％多聚甲醛(PFA、FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)将条件1、2、3及4中得到的各细胞于室温下固定25分钟，用PBS清洗3次后，将10％山羊血清(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制)/PBS作为封闭液于室温下孵育1小时。然后，添加上述表4所示的一抗溶液(一抗溶液1或一抗溶液2)，于4℃孵育过夜，进行共染色。然后，用PBS清洗3次，进一步添加与一抗溶液对应的二抗溶液(二抗溶液1或二抗溶液2)，于室温下孵育1小时。然后，用PBS清洗3次，于4℃下保存。

显微镜观察及图像采集使用荧光显微镜BZ-X710(KEYENCE公司制)而进行。图1B示出免疫荧光染色图像。需要说明的是，Merge为叠加了3种荧光的图像。在条件1、2、3及4中的任意条件下均检测到了神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞，但条件1下终末分化第14天的时间点，O4阳性细胞的形态为未成熟，未检测到GalC阳性细胞，因此成熟缓慢；条件2下，检测到GFAP非阳性细胞群，由此可知条件3或条件4为最佳的条件。

根据以上研究，确立了包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法(图2)。需要说明的是，图2中，类胚体形成培养基为AK03N-C培养基，神经·胶质增殖用培养基为上述神经·胶质增殖用培养基，化合物的S表示SB431542，L表示LDN193189，C表示CHIR99021，Y表示Y-27632，RA表示维甲酸，PM表示嘌吗啡胺。

＜实施例2细胞聚集体的特性评价1(分化诱导过程中的基因表达变化)＞

为了研究分化诱导过程中的基因表达变化，对分化诱导的中间产物实施基于RNA测序的基因表达分析。使用QHJI01s04株以实施例1的条件3的方法开始分化诱导，使用RNeasy Plus Mini试剂盒(QIAGEN公司制)从分化前(iPS细胞株)、分化第7天、第14天、第21天、第35天的细胞提取总RNA，使用Illumina公司的TruSeq Stranded mRNA Library Prepkit制作文库，使用HiSeq 2500，进行80个循环的测序。基于每1个细胞为3000万读段(read)以上的数据进行基因表达分析(图3A～3D)。

对分化诱导前(iPS细胞)与分化第7天的基因表达谱进行比较，结果，在分化第7天的时间点，作为多潜能性标志物的NANOG及POU5F1(OCT3/4)的表达量显著降低，另外，分化第7天，作为神经干细胞标志物的SOX1、PAX6、HES4及HES5的表达量显著上升(图3A)。对分化第7天与分化第14天的基因表达谱进行比较，结果，作为在分化第14天较之分化第7天而言基因表达上升的基因，可举出ASCL1、HEY1、DCX、βIII微管蛋白(TUBB3)、ELAVL3、ZBTB20、SLIT1、HOXB3、HOXA4、HOXB4、HOXB6、HOXB8等(图3B)。另外，对分化第14天与分化第21天的基因表达谱进行比较，结果，作为在分化第21天的时间点较之分化第14天而言基因表达上升的基因，可举出HEY2、NKX6.2、NKX2.2、OLIG1、OLIG2等(图3C)。对分化第21天与分化第35天的基因表达谱进行比较，结果，作为在分化第35天的时间点较之分化第21天而言表达量上升的基因，可举出NFIA、NFIB、SLC1A3、S100B、FABP7(图3D)。另外，PAX6的表达量显著降低(图3A)。

＜实施例3细胞聚集体的特性评价2(细胞聚集体的免疫荧光染色)＞

作为iPS细胞株，使用作为由京都大学iPS细胞研究所建立的脐带血来源无饲养层iPS细胞株的Ff-WJ14s01株，以实施例1的条件3的方法制备包含胶质前体细胞的细胞聚集体，实施针对各分化标志物的免疫荧光染色。对于免疫荧光染色，使用了8种一抗及与之对应的荧光标记二抗。一抗如表5所示，各混合2种或3种，用封闭液稀释，制备3种一抗溶液(一抗溶液1、一抗溶液2、一抗溶液3)。对于二抗，也同样如表5所示地各混合2种或3种，进一步添加用于核染色的Hoechst33342(稀释倍数1:1000，同仁化学公司制)，用封闭液稀释，制备3种二抗溶液(二抗溶液1、二抗溶液2、二抗溶液3)。

[表5]

^＊：稀释倍数1∶1000，Thermo Fisher Scientific公司制

在分化第77天的时间点，使用4％PFA将细胞聚集体于室温下固定20分钟，用PBS清洗3次。使用OCT包埋剂(Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.制)在干冰上对固定后的细胞进行冷冻包埋，制作10μm厚的冷冻切片，于-80℃下保管。用PBS对冷冻切片进行1次清洗后，将10％山羊血清(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)/PBS作为封闭液于室温下孵育1小时。然后，添加上述表5所示的一抗溶液(一抗溶液1、一抗溶液2或一抗溶液3)，于4℃孵育过夜，进行共染色。然后，用PBS清洗3次，进一步添加与一抗溶液对应的二抗溶液(二抗溶液1或二抗溶液2或二抗溶液3)，于室温下孵育1小时。用封固剂PermaFluor(ThermoFisher Scientific公司制)封固后于4℃下保存。

显微镜观察及图像采集使用荧光显微镜BZ-X710(KEYENCE公司制)而进行。图4A示出免疫荧光染色图像。观察到GFAP阳性细胞、NESTIN阳性细胞、Tuj1阳性细胞、OLIG2阳性细胞、ELAVL3阳性细胞、MAP2阳性细胞、NFIA阳性细胞。另外，使用BZ-X710附带的分析软件(BZ-H3C)对相对于构成1个球体(细胞聚集体)的细胞总数而言的OLIG2阳性细胞及NFIA阳性细胞的比例进行定量，计算6个球体的平均值。结果，OLIG2阳性细胞以30.9±6.6％的比例存在，NFIA阳性细胞以87.6±1.8％的比例存在(图4B)。

＜实施例4细胞聚集体的特性评价3(单细胞基因表达分析)＞

对包含胶质前体细胞的细胞聚集体的特征基因进行研究。针对以实施例1的条件3的方法由Ff-WJ14s01株制备的包含胶质前体细胞的细胞聚集体(Gliogenic NPC)、和以非专利文献2的方法由Ff-WJ14s01株制备的包含大量神经的分化取向性高的细胞的细胞聚集体(Neurogenic NPC)，用“Hayashi等，Nature Communications，volume 9，Article number619(2018)”中记载的方法进行单细胞RNA测序(RamDA-seq)。使用Illumina的HiSeq 2500，在Single-End模式下进行50个循环的测序。对通过质量评价的Gliogenic NPC：150个、Neurogenic NPC：91个(总计241个)进行基因表达分析。

根据基因表达谱，241个细胞被分类为3个团簇(C1～C3)。已分析的NeurogenicNPC细胞总数的91.2％被分类为C1，8.8％被分类为C3，未分类为C2。另一方面，已分析的Gliogenic NPC细胞总数的5.3％被分类为C1，58.0％被分类为C2，36.7％被分类为C3(图5)。这暗示了Neurogenic NPC与Gliogenic NPC的基因表达谱差异很大。

表6示出各团簇中特征性表达的基因(排位前10个)。作为在属于仅有GliogenicNPC被分类的C2的细胞中高度表达的基因，发现了HEY2、C1ORF61、FAM181B、NFIB、ITM2B、NFIA、LHFPL3、MLC1(表6、图6A、图6B)。另外，作为与Neurogenic NPC相比在Gliogenic NPC中表达水平高的基因，发现了ASCL1、MEIS1、MEIS2、DLL3、HEY1、ZBTB20、SOX9、SLC1A3、S100B、SLIT1、SPARCL1、TIMP3、TIMP4、SPON1、KLF9、GRIK3、SOX6、EPHA3、NTRK2、GRIA2、PTPRO、KCND3、SERPINE2(图6A、图6B)。需要说明的是，表6中记载的基因的一部分的GenBank登录号示于表1。另外，LOC541471记载于Oncol Lett.2019Feb；17(2):2457-2464中。

[表6]

＜实施例5细胞聚集体的特性评价4(终末分化能力评价)＞

对于包含胶质前体细胞的细胞聚集体，通过免疫荧光染色对是否在终末分化后分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞这3类进行研究。对于以实施例1的条件3的方法制备的源自Ff-WJ14s01株的包含胶质前体细胞的细胞聚集体(分化第77天)，以实施例1中记载的方法，使用成熟化培养基，进行终末分化诱导。终末分化31天后(分化第108天)，以实施例1中记载的方法使用4％PFA将细胞于室温下固定25分钟，用PBS清洗3次后，进行免疫荧光染色。显微镜观察及图像采集使用荧光显微镜BZ-X710(KEYENCE公司制)及共聚焦荧光显微镜LSM880(ZEISS公司制)而进行。结果，检测到Tuj1及MAP2阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞、O4阳性、GalC阳性及MBP阳性少突胶质细胞。可见，确认到分化成3类细胞的能力(图7A)。另外，使用In Cell Analyzer的分析软件Developer Toolbox(GE HEALTHCARE公司制)对各阳性细胞率进行定量。结果，对于阳性细胞率，O4阳性细胞为10％左右，GFAP阳性细胞为30％左右，Tuj1阳性细胞为30％左右(图7B)。

＜实施例6细胞聚集体的特性评价5(终末分化前后的基因表达变化＞

对于包含胶质前体细胞的细胞聚集体，对终末分化前后的各分化细胞标志物的基因表达水平进行分析。针对以实施例1的条件3的方法由QHJI01s04株制备的包含胶质前体细胞的细胞聚集体(分化第48天)，以实施例1中记载的方法，使用成熟化培养基，进行终末分化诱导。使用RNeasy Plus Mini试剂盒(QIAGEN公司制)，从终末分化前(分化第48天)和终末分化34天后(分化第82天)的细胞中提取总RNA。使用SuperScript III First-StrandSynthesis System for RT-PCR(Thermo Fisher Scientific公司制)，将提取的总RNA反转录成cDNA。然后，使用Fast SYBR(商标)Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific公司制)，利用定量RT-PCR法，使用Step One Plus Realtime PCR System(Thermo FisherScientific公司制)测定GFAP、CSPG4(NG2)、OLIG2、PLP1(PLP)、PDGFRA(PDGFRα)、SOX10、CNP、MBP、TUBB3(βIII微管蛋白)、MAP2的表达量。需要说明的是，作为内源性对照，使用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。

表7示出靶基因的扩增反应中使用的引物组。图8示出结果。以终末分化后的表达量相对于终末分化前的表达量(设为1)而言的相对表达量进行表示。终末分化后的细胞中，星形胶质细胞标志物及少突胶质细胞标志物的表达量上升，由此暗示了通过基于成熟化培养基的终末分化诱导，分化成了成熟的星形胶质细胞及少突胶质细胞。作为神经标志物的βIII微管蛋白与MAP2的基因表达量在终末分化前后几乎没有变化，而根据实施例3中所研究的细胞聚集体的免疫荧光染色的结果，可认为包含胶质前体细胞的细胞聚集体自终末分化前的细胞聚集体的时间点起表达βIII微管蛋白及MAP2，且在终末分化后也维持表达。

[表7]

＜实施例7包含胶质前体细胞的细胞聚集体在亚急性期脊髓损伤模型小鼠中的移植实验＞

NOD-SCID(NOD.CB17-Prkdcscid·J)小鼠(Charles River Laboratories公司)按照庆应义塾大学及NIH的动物实验操作指南进行处理。动物实验计划得到庆应义塾大学内的动物实验管理委员会批准。通过对8周龄的雌性NOD-SCID小鼠腹腔施予氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)从而进行麻醉。以“Scheff等，Journal of neurotrauma 20，179-193(2003)”中记载的方法，用IH打击器(60-70kdyn、Precision Systems andInstrumentation公司制)向第10胸椎水平施加挤压伤，然后立即肌内注射氨苄青霉素(12.5mg/kg)。施加损伤7天后，以“Basso等，Journal of Neurotrauma，23：635-59(2006)”中记载的方法，使用Basso Mouse Scale(BMS)评价后肢运动功能。在损伤后7天的时间点，自然恢复至BMS为2.5以上的个体无法测定细胞移植效果，因此将其排除，并分成2组(对照组12只、细胞移植组14只)，分组以使各组的BMS平均值相同的方式进行。

损伤后第9天(亚急性期)，使用定位固定注射系统(室町机械株式会社制)，用28G的金属针将2μl细胞悬浮液移植至细胞移植组的损伤中心部，将2μl PBS移植至对照组的损伤中心部。细胞以源自Ff-WJ14s01株的包含胶质前体细胞的细胞聚集体(5.0×10⁵细胞)聚集在2μl的PBS中的状态用于移植。实施各种运动功能评价至移植后12周为止。另外，在移植后12周的时间点，深度麻醉下，通过将4％PFA灌流至心脏从而固定脊髓，于4℃进行保管。然后，将固定的脊髓于4℃保管在30％蔗糖/PBS中后，使用OCT包埋剂进行冷冻包埋，制作矢状面切片(14μm厚)及横截面切片(16μm厚)，于-80℃下保管。对于组织染色，进行用于观察组织图像的苏木精-伊红(HE)染色、及用于髓鞘组织染色的髓鞘染色液(Luxol Fast Blue)(LFB)染色。

另外，为了更详细的组织评价，进行免疫荧光染色。用PBS清洗3次后，将含有0.1％TritonX-100的Blocking One(NACALAI TESQUE公司制)作为封闭液，于室温下孵育1小时。然后，制备用封闭液稀释一抗而成的一抗溶液，于4℃孵育过夜。本实施例中使用的一抗为人抗Hu抗体(稀释倍数：1:1000，由洛克菲勒大学Dr.Robert Darnell提供)、小鼠抗GFAP抗体(稀释倍数1:5000，Abcam公司制)、小鼠抗APC抗体(稀释倍数1:300，Abcam公司制)、兔抗人特异性NESTIN抗体(稀释倍数1:200，IBL公司制)、兔抗Ki67抗体(稀释倍数1:1000，LeicaBiosystems公司制)、小鼠抗OCT3/4抗体(稀释倍数1:100，SANTA CRUZ公司制)、小鼠抗人特异性核抗体(HNA)(稀释倍数1:100，Millipore公司制)、小鼠抗人特异性胞质抗体(STEM121)(稀释倍数1:100、Millipore公司制)、小鼠抗人Tau抗体(稀释倍数1:500，ThermoFisher Scientific公司制)、小鼠抗Bassoon抗体(稀释倍数1:200，GeneTech公司制)、小鼠抗人突触素抗体(稀释倍数1:200，Millipore公司制)。然后，用PBS清洗3次后，进一步制备用封闭液分别对与一抗对应的Alexa Fluor标记二抗和用于核染色的Hoechst33342(稀释倍数1:1000，同仁化学公司制)进行稀释而成的二抗溶液，于室温下孵育1小时。用PBS清洗3次后，使用封固剂PermaFluor(Thermo Fisher Scientific公司制)封固后于4℃下保存。使用荧光显微镜BZ-X710(KEYENCE公司制)及共聚焦荧光显微镜LSM700(ZEISS公司制)对样品进行观察及图像采集。

＜实施例8包含胶质前体细胞的细胞聚集体对亚急性期脊髓损伤模型小鼠的有效性评价＞(BMS评分)

为了对实施例7中记载的实验中移植细胞的有效性评价进行研究，直至移植后12周为止，每7天实施1次基于BMS评分的后肢运动功能评价。自损伤后第14天(移植后第5天)的时间点起至损伤后第91天(移植后第82天)的评价最终日为止，与对照组相比，细胞移植组的BMS评分显著增加(＊：p＜0.05)(图9)。

＜实施例9包含胶质前体细胞的细胞聚集体对亚急性期脊髓损伤模型小鼠的有效性评价(转棒仪实验)＞

在移植后12周的时间点，实施运动协调性评价(转棒仪实验)。测定可在每1分钟旋转20次的转棒仪(Rotarod)(室町机械株式会社制)上行走的时间。与对照组相比，细胞移植组可在转棒仪上行走显著较长的时间(＊：p＜0.05)(图10)。

＜实施例10包含胶质前体细胞的细胞聚集体对亚急性期脊髓损伤模型小鼠的有效性评价(步态模式评价)＞

在移植后12周的时间点，使用DigiGait系统(Mouse Specific公司制)实施步态模式评价。使小鼠在跑步机(treadmill)(7cm/秒)上行走，测定步幅和步行角度。与对照组相比，细胞移植组的步幅显著较长(＊＊：p＜0.01)(图11A)。另外，与对照组相比，细胞移植组的肢相对于行进方向所呈的角度显著较小(＊：p＜0.05)，由此暗示了两肢平行地接地，是更接近正常的步行模式(图11B)。

＜实施例11包含胶质前体细胞的细胞聚集体对亚急性期脊髓损伤模型小鼠的有效性评价(运动学分析)＞

在移植后12周的时间点，为了评价关节运动，使用三维动作分析软件KinemaTracer(KISSEI COMTEC公司制)实施分析。使在肩关节、髋关节、膝关节、踝关节、足趾上附有标签的小鼠在跑步机上行走，用高速数码相机(GoPro公司制)从两个侧面及前后这4个方向拍摄视频，使各标记物的轨迹三维可视化。图12的(A)示出后肢从离开地面到接触地面为止的轨迹的代表例。与对照组相比，细胞移植组的肢离地面更远，示出了更平滑的轨迹。另外，图12的(B)示出了步行周期1周期中髋关节、膝关节、踝关节、足趾的关节角度变化。分别以5步(step)对6个个体进行分析，各图的细线示出1个个体的5步的平均关节角度变化，粗线表示6个个体的平均值。暗示了与对照组相比，细胞移植组每次行走的关节运动的参差小。

＜实施例12亚急性期脊髓损伤模型小鼠的脊髓的组织评价＞

在移植后12周的时间点，使用STEM121抗体对矢状面切片进行免疫荧光染色(图13的(A))，以检测移植细胞。在包括远离损伤中心部的部位的大范围内检测到移植细胞，确认到移植细胞的植活。另外，对相邻的切片实施HE染色，观察从头侧至尾侧的大范围的组织图像，结果未观察到肿瘤样结构(图13的(B))。另外，使用抗HNA抗体，对损伤中心部(2)、从损伤中心部向头侧4mm(1)、从损伤中心部向尾侧4mm(3)的横截面切片进行免疫荧光染色(图13的(C))。在作为移植部位的损伤中心部及头侧4mm、尾侧4mm的切片中检测到HNA阳性细胞，由此暗示了移植细胞在大范围内迁移。

为了更详细地分析移植细胞的特性，对矢状面切片实施人特异性标志物和各种标志物的荧光免疫共染色。首先，根据iPS细胞来源神经前体细胞演化成肿瘤时呈OCT3/4阳性的报道(非专利文献8)，使用抗OCT3/4抗体及抗Ki67(增殖性标志物)抗体、和抗HNA抗体进行免疫荧光染色。另外，为了分析移植细胞的特性，使用抗NESTIN(神经干细胞标志物)抗体、抗Hu(神经标志物)抗体、抗GFAP(星形胶质细胞标志物)抗体、抗APC(少突胶质细胞标志物)抗体、抗HNA抗体进行免疫荧光染色，对阳性细胞进行定量。

结果，未检测到HNA⁺/OCT3/4⁺共阳性细胞，由此暗示了移植细胞未演化成肿瘤(图14A)。HNA⁺/Ki67⁺共阳性细胞为4.71±0.20％，暗示了移植细胞中存在增殖性细胞。另外，HNA⁺/NESTIN⁺共阳性神经前体细胞为17.02±3.10％，HNA⁺/Hu⁺共阳性的神经细胞为18.12±1.22％，HNA⁺/GFAP⁺共阳性星形胶质细胞为27.23±1.92％，HNA⁺/APC⁺共阳性少突胶质细胞为36.56±2.82％(图14B)。可见暗示了在移植后91天的时间点，尽管存在一部分未成熟的神经前体细胞及胶质前体细胞，但是移植细胞大部分分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞这3类。

接着，为了研究源自移植细胞的神经元是否与宿主的小鼠神经元形成神经回路，使用Tuj1抗体、抗HNA抗体和抗小鼠特异性Bassoon(前突触标志物)及抗人突触素(突触小泡蛋白)抗体对矢状面切片进行免疫荧光染色。结果，HNA⁺/Tuj1⁺共阳性的移植细胞来源神经元与小鼠特异性Bassoon共定位(图15的(A))。另外，HNA^-/Tuj1⁺的宿主神经元与人特异性突触素共定位(图15的(B))。根据上述结果，暗示了作为宿主的小鼠神经元与移植细胞来源神经元形成神经回路。

接着，研究细胞移植带来的髓鞘再生效果。图16A分别示出头侧(Rostral)0.48mm、损伤中心部(Epi-center)及尾侧(Caudul)0.48mm的LFB染色图像。针对从损伤中心部至头尾侧0.96mm为止的横截面切片，利用LFB染色观察髓鞘组织，对LFB阳性区域进行定量。结果，与对照组相比，细胞移植组中观察的所有切片中的LFB阳性面积显著增大(＊：p＜0.05；＊＊：p＜0.01)(图16A、图16B)。另外，对横截面切片进行成熟少突胶质细胞标志物MBP与STEM121的免疫荧光染色。结果，检测到STEM121⁺/MBP⁺共阳性区域(图17)。进而，为了更详细的观察，以“Shibata等，Frontiers in Neural Circuits，.2019；13：29.”中记载的方法，对横截面切片实施使用了STEM121抗体的免疫电镜法，利用以胶体金颗粒标记的二抗检测STEM121抗体反应部位。在电子显微镜下观察髓鞘，结果，在髓鞘检测到胶体金颗粒(图18箭头)。根据上述结果，暗示了源自移植细胞的成熟少突胶质细胞使神经轴突重新形成髓鞘。

＜实施例13包含胶质前体细胞的细胞聚集体在慢性期脊髓损伤模型大鼠中的移植实验＞

Nude(F344/NJcl-rnu/rnu)大鼠(日本CLEA公司)按照庆应义塾大学及NIH的动物实验操作指南进行处理。动物实验计划得到庆应义塾大学内的动物实验管理委员会批准。通过对8周龄的雌性Nude大鼠经腹腔施予三种混合麻醉(美托咪定：0.375mg/kg、咪达唑仑：2mg/kg、布托啡诺：2.5mg/kg)进行麻醉。以“Scheff等，Journal of neurotrauma 20，179-193(2003)”中记载的方法，用IH打击器(220kdyn、Precision Systems andInstrumentation公司制)向第10胸椎水平施加挤压伤，皮下注射奥比沙星(5mg/kg)后，通过腹腔施予美托咪定拮抗剂(阿替美唑：0.75mg/kg)促进苏醒。在施加损伤翌日及损伤后每1周，以“Basso等，Journal of Neurotrauma，12：1-21(1995)”中记载的方法，使用BassoBeattie Bresnahan(BBB)评价后肢运动功能。在损伤后41天的时间点，自然恢复至BBB为9以上的个体无法测定细胞移植效果，因此将其排除，分成2组(对照组13只、细胞移植组18只)，分组以使各组的BBB平均值相同的方式进行。

损伤后第42天(慢性期)，使用定位固定注射系统(室町机械株式会社制)，用27G的金属针向细胞移植组的损伤中心部的头尾侧2处各移植2μl细胞悬液，向对照组的损伤中心部的头尾侧2处各移植2μl PBS。细胞悬液以源自QHJI01s04株的包含胶质前体细胞的细胞聚集体(5.0×10⁵细胞/2μl)聚集在PBS中的状态用于移植。实施后肢运动功能评价直至移植后12周为止。另外，在移植后12周的时间点，实施步态模式评价，然后在深度麻醉下，通过将4％PFA由心脏灌流至全身从而固定·采集脊髓，在4％PFA浸渍下于4℃进行保管。然后，将固定的脊髓于4℃保管在30％蔗糖/PBS中后，使用OCT包埋剂进行冷冻包埋，制作矢状面切片(14μm厚)及横截面切片(20μm厚)，于-80℃下保管。对于组织染色，进行用于观察组织图像的苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin：HE)染色、及免疫荧光染色。

＜实施例14包含胶质前体细胞的细胞聚集体对慢性期脊髓损伤模型大鼠的有效性评价＞(BBB评分)

为了对实施例13中记载的实验中移植细胞的有效性评价进行研究，直至移植后12周为止，每7～14天实施1次基于BBB评分的后肢运动功能评价。自损伤后第63天(移植后第21天)的时间点起至损伤后第126天(移植后第84天)的评价最终日为止，与对照组相比，细胞移植组的BBB评分显著增加(＊：p＜0.05、＊＊：p＜0.01)(图19)。

＜实施例15包含胶质前体细胞的细胞聚集体对慢性期脊髓损伤模型大鼠的有效性评价(步态模式评价)＞

在移植后12周的时间点，使用DigiGait系统(Mouse Specific公司制)实施步态模式评价。使小鼠在跑步机(10cm/秒)行走，测定步幅和步行角度。与对照组相比，细胞移植组的步幅显著较长(＊＊：p＜0.01)(图20的(A))。另外，与对照组相比，细胞移植组的肢相对于行进方向所呈的角度显著较小(＊＊：p＜0.01)，由此暗示了两肢平行地接地，是更接近正常的步行模式(图20的(B))。

＜实施例16慢性期脊髓损伤模型大鼠的脊髓的组织评价＞

对以实施例13中记载的方法制作的矢状面切片实施HE染色，结果未观察到肿瘤样结构(图21的(A))。另外，使用抗HNA抗体对相邻的切片实施免疫荧光染色。结果，在大范围检测到HNA阳性细胞，由此确认移植细胞的植活(图21的(B))。

为了更详细地分析移植细胞的特性，以实施例12中记载的方法，对矢状面切片实施人特异性标志物和各种标志物的荧光免疫共染色。为了评价致肿瘤性，使用抗OCT3/4抗体和抗HNA抗体进行免疫荧光染色。结果，未检测到HNA+/OCT3/4+共阳性细胞，由此暗示了移植细胞未演化成肿瘤(图22的(A))。另外，为了研究移植细胞的终末分化能力，使用抗Hu(神经标志物)抗体、抗GFAP(星形胶质细胞标志物)抗体及抗APC(少突胶质细胞标志物)抗体、和抗HNA抗体进行免疫荧光染色。结果，检测到HNA+/Hu+共阳性细胞(图22的(B))、HNA+/GFAP+共阳性细胞(图22的(C))、HNA+/APC+共阳性细胞(图22的(D))。可见，暗示了移植细胞在大鼠脊髓内分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。

＜实施例17制备均匀尺寸的细胞聚集体＞

将以实施例1的条件3的方法由QHJI01s04株制备的包含胶质前体细胞的细胞聚集体在分化49天的时间点使用TrypLE Select分散成单个细胞后，以10000细胞/孔及20000细胞/孔接种于96孔低吸附培养板(商品名：PrimeSurface(注册商标)96缝隙井板、SumitomoBakelite Co.,Ltd.制)，在5％CO₂/20％O₂下于37℃在神经·胶质增殖培养基中进行培养。结果，自接种翌日起确认到细胞聚集体的形成。每3天进行1次半量培养基更换，培养8天及14天(图23)。在培养8天及14天(分化57天及63天)的时间点，将1个细胞聚集体转移至用经DMEM/F-12稀释的1％Matrigel Matrix Basement Membrane Growth Factor Reduced(CORNING公司制)进行了处理的96孔板(CORNING公司制)中的1个孔，在成熟化培养基中培养28天，进行终末分化诱导。

在终末分化28天(分化85天及91天)的时间点，用4％PFA于室温固定25分钟，用PBS清洗3次后，将10％山羊血清(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)/PBS作为封闭液于室温下孵育1小时。然后，添加上述表4所示的一抗溶液3，于4℃孵育过夜，进行共染色。然后，用PBS清洗3次，进一步添加与一抗溶液3对应的二抗溶液3，于室温下孵育1小时。然后，用PBS清洗3次，于4℃下保存。

显微镜观察及图像采集使用荧光显微镜BZ-X710(KEYENCE公司制)而进行。图24示出免疫荧光染色图像。在研究的所有条件(接种细胞数(10000细胞及20000细胞)和培养天数(8天(A)及14天(B))下，检测到O4阳性少突胶质细胞、GFAP阳性星形胶质细胞、MAP2阳性神经元。

＜实施例18源自包含胶质前体细胞的细胞聚集体的分泌因子的检测＞

以实施例1的条件3的方法由QHJI01s04株制备包含胶质前体细胞的细胞聚集体。在分化45天的时间点，对神经·胶质增殖培养基进行培养基更换，在5％CO₂/20％O₂下于37℃进行培养。48小时后回收培养液，通过离心分离(1000rpm、5分种)回收培养上清液。使用TrypLE Select将残留的细胞团块分散成单个细胞，测定总细胞数。另外，为了测定神经·胶质增殖培养基中所含的细胞因子浓度，在同一条件(5％CO₂/20％O₂/37℃)下处理48小时后，仅回收神经·胶质增殖培养基。

以2个方法检测培养上清液中的分泌因子。作为第一方法，使用Bio-Plex Pro(注册商标)Human Cytokine Screening 48-Plex Panel(Bio-Rad公司制)，按照制造商的说明书，测定48种细胞因子(FGFbasic、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-1α、IL-2Rα、IL-3、IL-12(p40)、IL-16、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1(MCAF)、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、VEGF、CTACK、MIF、TRAIL、IL-18、M-CSF、及TNF-β)的浓度。

首先，分别将50μl偶联磁珠(Conjugated magnetic beads)添加于96孔板中，用试剂盒附带的洗涤液(Wash Buffer)清洗2次。需要说明的是，使用自动化的磁力清洁系统(Bio-Plex ProII Wash Station，Bio-Rad公司制)实施清洗步骤。接着，分别向各孔中添加各50μl的使用试剂盒附带的标准品(Standard)制作的8个梯度的4倍稀释系列(n＝2)与样品(仅培养上清液和培养基，n＝3)，一边使其以850rpm震荡，一边于室温、遮光下反应30分钟。然后，用洗涤液清洗3次。接着，分别向各孔中添加各25μl试剂盒附带的检测抗体(Detection Antibodies)，一边使其以850rpm震荡，一边于室温遮光下反应30分钟。然后，用洗涤液清洗3次。接着，分别向各孔中添加各50μl试剂盒附带的链霉亲和素-藻红蛋白，一边使其以850rpm震荡一边于室温、遮光下反应10分钟。然后，用洗涤液清洗3次。分别向各孔中添加各125μl试剂盒附带的分析液(Assay Buffer)，使用Bio-Plex 200系统(Bio-Rad公司制)测定荧光值。

根据各细胞因子的标准品稀释系列的测定数据，使用Bio-Plex Manager软件ver6.1(Bio-Rad公司)并通过5参数逻辑曲线回归制作标准曲线，对各样品中的细胞因子浓度进行定量。然后，从培养上清液的测定数据减去作为背景值的仅培养基的测定数据，由此计算分泌至培养上清液中的细胞因子浓度。表8示出在培养上清液中检测到的细胞因子的排位前10个的浓度及每单位细胞的分泌量。

[表8]

	pg/ml	pg/1000细胞
			MIF	433	1.50
MCP-1	250	0.867
			IL-8	11.5	0.0398
SCF	8.83	0.0306
			M-CSF	6.65	0.0230
HGF	5.48	0.0190
			GRO-α	5.43	0.0188
LIF	3.29	0.0114
			IFN-γ	3.07	0.0106
TRAIL	3.01	0.0104

MIF、MCP-1、IL-8、及GRO-α作为源自星形胶质细胞的分泌因子而被报道(非专利文献9)，另外，根据SCF、HGF及MIF促进神经前体细胞的增殖·分化(非专利文献10～12)、以及M-CSF在少突胶质前体细胞的存活·分化中发挥重要作用(非专利文献13)的情况，可知从包含胶质前体细胞的细胞聚集体分泌了有助于神经新生的细胞因子。

另外，作为第二方法，使用Human SPARC-like 1/SPARCL1 DuoSet ELlSA(R&Dsystems公司制)和DuoSet Ancillary Reagent Kit 2(R&D systems公司制)测定培养上清液中的SPARCL1的浓度。

首先，按照制造商的说明书，分别向96孔板中添加100μl Human SPARC-like 1Capture Antibody，于室温下吸附过夜。然后，用试剂盒附带的洗涤液清洗3次。接着，向各孔中添加各300μl试剂盒附带的Reagent Diluent，于室温下反应80分钟。然后，用洗涤液清洗3次。接着，分别向各孔中添加各100μl使用试剂盒附带的标准品制作的11个梯度的2倍稀释系列(n＝2)和样品(仅培养上清液和培养基，n＝3)，于室温、遮光下反应2小时。然后，用洗涤液清洗3次。接着，分别向各孔中添加各100μl试剂盒附带的Human SPARC-like 1Detection Antibody，于室温、遮光下反应2小时。然后，用洗涤液清洗3次。接着，分别向各孔中添加100μl试剂盒附带的链霉亲和素-辣根过氧化物酶，于室温、遮光下反应20分钟。然后，用洗涤液清洗3次。接着，分别向各孔中添加各100μl底物溶液(将试剂盒附带的ColorReagent A和Color Reagent B以1∶1混合而成)，于室温、遮光下反应20分钟。接着，分别向各孔中添加各50μl试剂盒附带的终止溶液从而终止反应，立即使用微孔板检测仪Enspire(PerkinElmer公司制)测定吸光度，计算从450nm的吸光度减去540nm的吸光度得到的值。

根据标准品稀释系列的测定数据，使用Excel(微软公司制)，由双对数刻度的绘图制作校准曲线，对各样品中的SPARCL1浓度进行定量。从培养上清液的测定数据减去作为背景值的仅培养基的测定数据，由此计算分泌至培养上清液中的SPARCL1浓度。另外，计算每单位细胞的SPARCL1分泌量(表9)。

[表9]

	ng/ml	ng/1000细胞
			SPARCL1	6489.09	22.47

由分析的结果可见，包含胶质前体细胞的细胞聚集体的培养上清液中存在高浓度的SPARCL1。已知SPARCL1为源自星形胶质细胞的分泌因子，控制突触形成(非专利文献14)，因此认为SPARCL1作为在胶质前体细胞的培养上清液中被检测到的标志物是妥当的。因此，SPARCL1可用作通过单独使用或与其他标志物组合使用来确认在制备步骤中能够获得目标细胞的标志物。

Claims

1.制备方法，其为包含胶质前体细胞的细胞聚集体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

也可进一步包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，使用具有多个均匀形状的孔的培养容器培养多潜能性干细胞。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，持续进行步骤(1)直至与步骤(1)开始时相比满足以下条件中的至少一项，然后开始步骤(2)：

3)得到NANOG的RNA的表达量降低至400分之1以下的细胞聚集体。

4.如权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，持续进行步骤(2)直至与步骤(2)开始时相比满足以下条件中的至少一项，然后开始步骤(3)：

5.如权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，步骤(2)进行4天～11天。

6.如权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(1)及步骤(2)中，氧浓度为3％～10％。

7.如权利要求1～6中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(3)中，持续进行步骤(3)直至与步骤(3)开始时相比满足以下条件中的至少一项，然后开始步骤(4)：

8.如权利要求1～7中任一项所述的制备方法，其中，步骤(3)进行4天～11天。

9.如权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，持续进行步骤(4)直至与步骤(4)开始时相比满足以下条件中的至少一项，然后开始步骤(5)：

2)得到PAX6的RNA的表达量降低至5倍以下的细胞聚集体。

10.如权利要求1～9中任一项所述的制备方法，其中，步骤(4)进行4天以上。

11.如权利要求1～10中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，在该步骤开始时使步骤(3)中得到的细胞聚集体分散，然后将经分散的细胞悬浮培养，由此再次形成细胞聚集体。

12.如权利要求1～11中任一项所述的制备方法，其中，所述方法包括步骤(5)，在步骤(5)中，在该步骤开始时使步骤(4)中得到的细胞聚集体分散，然后将经分散的细胞悬浮培养5天～100天，由此再次形成细胞聚集体。

13.如权利要求1～12中任一项所述的制备方法，其中，所述方法包括步骤(5)，在步骤(5)中，持续进行步骤(5)直至选自O4抗原、NG2、OLIG2、PDGFRα、SOX10、SPON1、FAM181B、TIMP4、SOX6、GRIK3、LHFPL3、KLF9、A2B5抗原、CNP及PLP中的1种以上的标志物表达。

14.如权利要求1～12中任一项所述的制备方法，其中，所述方法包括步骤(5)，在步骤(5)中，持续进行步骤(5)直至在培养细胞聚集体的培养基中检测到选自由SPARCL1、MIF、MCP-1、IL-8、SCF、M-CSF、HGF、GRO-α、LIF、IFN-γ及TRAIL组成的组中的1种以上的蛋白质。

15.如权利要求1～14中任一项所述的制备方法，其中，SMAD信号传导抑制剂为TGFβ抑制剂及BMP抑制剂。

16.如权利要求15所述的制备方法，其中，TGFβ抑制剂为选自由SB431542、A83-01、SB202190、SB505124、NPC30345、SD093、SD908、SD208、LY2109761、LY364947、LY580276、Galunisertib(LY2157299)、LY3200882、SB525334、GW788388、RepSox及Lefty-1组成的组中的1种以上。

17.如权利要求15或16所述的制备方法，其中，BMP抑制剂为选自由头蛋白、LDN-193189、LDN-212854、Dorsomorphin、K02288、脊索发生素及卵泡抑素组成的组中的1种以上。

18.如权利要求1～17中任一项所述的制备方法，其中，Wnt信号传导激活剂为选自由GSK3β抑制剂、Wnt3a、Wnt激动剂、Dkk及R-Spondin组成的组中的1种以上。

19.如权利要求1～17中任一项所述的制备方法，其中，Wnt信号传导激活剂为选自由CHIR99021、BIO、肯帕罗酮、SB216763及L803-mts组成的组中的1种以上。

20.如权利要求1～19中任一项所述的制备方法，其中，SHH信号传导激活剂为选自由嘌吗啡胺、SAG、SHH蛋白及SHH片段组成的组中的1种以上。

21.如权利要求1～20中任一项所述的制备方法，其中，多潜能性干细胞为诱导性多潜能干细胞。

22.如权利要求1～20中任一项所述的制备方法，其中，多潜能性干细胞为人诱导性多潜能干细胞。

23.如权利要求1～22中任一项所述的制备方法，其中，包含胶质前体细胞的细胞聚集体具有以下特征：

(b)表达脊髓区域标志物；及

(c)不含饲养细胞及源自饲养细胞的异种细胞来源成分。

24.制备方法，其为包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群的制备方法，其包括下述步骤：使用成熟化培养基将通过权利要求1～23中任一项所述的制备方法制备的包含胶质前体细胞的细胞聚集体培养5天～60天。

25.如权利要求24所述的制备方法，其中，包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群包含：

26.如权利要求24或25所述的制备方法，其中，成熟化培养基为含有T3、NT-3及LIF中的至少1种的培养基。

27.如权利要求26所述的制备方法，其中，成熟化培养基进一步含有CNTF。

28.包含胶质前体细胞的细胞聚集体，其是通过权利要求1～23中任一项所述的制备方法而得到的。

29.包含胶质细胞前体细胞的细胞聚集体，其具有以下特征：

(b)包含表达脊髓区域标志物的细胞；

(c)不含饲养细胞及源自饲养细胞的异种细胞来源成分；及

30.如权利要求29所述的细胞聚集体，其中，脊髓区域标志物为选自由HOXB3、HOXB4、HOXB6及HOXD8组成的组中的1种以上的标志物。

31.如权利要求29或30所述的细胞聚集体，其还包含表达选自由NKX2.1、NKX2.2、NKX6.1及NKX6.2组成的组中的1种以上的标志物的细胞。

32.如权利要求29～31中任一项所述的细胞聚集体，其具有以下特征：

(I)包含表达选自由NFIA、NFIB、SOX9、HEY1、HEY2、FABP7、ZBTB20、SLC1A3、S100B、MLC1、SLIT1、TIMP3、SPARCL1、GFAP及AQP4组成的组中的1种以上的标志物的细胞；

以及，

(V)具有分化成包含下述细胞的细胞群的能力：

33.如权利要求29～32中任一项所述的细胞聚集体，其还具有以下特征：(VI)包含表达选自由C1ORF61及SERPINE2组成的组中的1种或多种标志物的细胞。

34.如权利要求29～33中任一项所述的细胞聚集体，其还包含表达或分泌选自由SPARCL1、MIF、MCP-1、IL-8、SCF、M-CSF、HGF、GRO-α、LIF、IFN-γ及TRAIL组成的组中的1种以上的标志物的细胞。

35.包含少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经细胞的细胞群，其是通过权利要求24～27中任一项所述的制备方法而得到的。

36.药物组合物，其含有权利要求28～34中任一项所述的细胞聚集体、或权利要求35所述的细胞群作为有效成分。

37.脱髓鞘疾病及基于胶质细胞受损的疾病或伴有胶质细胞受损的疾病的治疗方法，其包括将有效剂量的权利要求28～34中任一项所述的细胞聚集体、或权利要求35所述的细胞群移植至需要移植的对象。

38.如权利要求37所述的治疗方法，其中，脱髓鞘疾病及基于胶质细胞受损的疾病或伴有胶质细胞受损的疾病为急性期、亚急性期或慢性期的脊髓损伤。

39.如权利要求28～34中任一项所述的细胞聚集体或权利要求35所述的细胞群，其用于在脱髓鞘疾病及基于胶质细胞受损的疾病或伴有胶质细胞受损的疾病的治疗中的应用。

40.如权利要求39所述的细胞聚集体或细胞群，其中，脱髓鞘疾病及基于胶质细胞受损的疾病或伴有胶质细胞受损的疾病为急性期、亚急性期或慢性期的脊髓损伤。

41.评价方法，其为用于评价受试物质的毒性或药效的方法，其包括下述步骤：使权利要求28～34中任一项所述的细胞聚集体或权利要求35所述的细胞群与所述受试物质接触，针对所述受检物质对所述细胞聚集体或所述细胞群造成的影响进行检测或定量。

42.判别包含胶质前体细胞的细胞聚集体适合移植的方法，其以选自由C1ORF61及SERPINE2组成的组中的1种以上的标志物是否表达为指标。

43.胶质的分化取向性高的胶质前体细胞或神经干细胞的鉴定方法，其包括检测选自由C1ORF61及SERPINE2组成的组中的1种以上的基因、由所述基因编码的蛋白质及它们的片段。