CN110869509A - 用于完整和片段化的标志物的方法 - Google Patents

Abstract

本文所述的发明涉及通过如下分离样品中的分析物的所有变型的方法：使变型与具有附接的分析标记物的颗粒结合，和从所述样品分离所述颗粒，随后从颗粒移取分析标记物和通过测量分析标记物来测量分析物分子。颗粒上分离的分析标记物然后能够用于测量结合变型的分析物的变型。

Description

用于完整和片段化的标志物的方法

本申请根据35 U.S.C. 第119节要求2017年4月1日提交的题为“Method ForComplete And Fragmented Markers”的美国临时专利申请号62/480,370的优先权益处；并且其以其整体通过引用并入本文。

背景

本发明涉及用于相对于非稀有分子富集和检测稀有分子的方法。在一些方面，本发明涉及用于检测怀疑含有稀有分子和非稀有分子的一种或多种不同群体的样品中的稀有分子的一种或多种不同群体的方法、设备和试剂盒。在一些方面，本发明涉及用于检测在样品中自由循环的稀有分子的一种或多种不同群体的方法和试剂盒。在其他方面，本发明涉及用于检测怀疑含有稀有细胞和非稀有细胞的一种或多种不同群体的样品中的与稀有细胞缔合的稀有分子的一种或多种不同群体的方法和试剂盒。

1至50,000个拷贝/10 µL(飞摩尔(fM)或更少)范围内的稀有分子的检测不能通过常规亲和力测定法实现，所述常规亲和力测定法需要远高于对于稀有分子发现的那些的分子拷贝数。例如，免疫测定法通常不能实现1皮摩尔(pM)或更小的检测限值。免疫测定法受抗体的亲和力结合常数的限制，所述亲和力结合常数通常不高于10^-12 (1 pM)。免疫测定法需要至少100倍抗体过量，因为解离速率通常为10^-13，并且样品中的所有分析物的完全结合都受抗体溶解度的限制。抗体溶解度的该相同问题阻止常规免疫测定法达到亚阿托摩尔检测水平。

细胞结合或包含在细胞内的稀有分子的检测在医学应用中、诸如在诊断可以从单一细胞传播的疾病中也是重要的。含有稀有和非稀有分子的混合物的样品使循环稀有分子的检测复杂化。所述材料可以是细胞的，例如在细胞内部或“无细胞”材料，并且不与任何完整细胞结合或缔合。无细胞稀有分子在医学应用、诸如例如诊断组织中的癌症中是重要的。在癌症的情况下，稀有分子从组织脱落进入循环，并且应理解，无细胞稀有分子与分布在全身的患病组织(例如肿瘤)中的稀有分子的总量相关。无细胞分析需要从样品中的所有分子的非常小级分分离并检测循环的稀有分子。当无细胞分子从组织中的患病细胞脱落至外周血中时，这些分子与从健康细胞脱落的分子混合。例如，在1 cm³的患病组织中存在近似109个细胞。如果该组织块完全溶解至5 L血液(成人的平均血液体积)中，则这将仅为200万个细胞/10 mL血液，并且被认为是稀有的，考虑到每10 mL血液存在平均7500万个白细胞和500亿个红细胞(其各自释放非稀有分子)。

当期望测量相应的蛋白和肽时，样品中的肽和蛋白变型的复杂性引起重大问题。在利用抗体用于肽和蛋白分离的研究中，已使用SELDI亲和质谱方法表明变型的这些问题(Pugia, Glycoconj J 2007)。已知肽和蛋白在酶的作用下片段化并在生物系统中经历翻译后修饰。例如，由于检测到数百种不同形式的片段化和糖-缀合，在不同患者的生物样品中检测到高度尿胰蛋白酶抑制剂的变型。检测到的形式取决于患者、疾病、样品类型和用于分离的亲和剂。独特的亲和剂对其他蛋白表现出不同的交叉反应性。这种变型引起分析的问题。例如，源自相同肽或蛋白的单独、独特片段的测量经常产生不同的结果。需要确定哪些片段的重要性更高或更低，可能需要相似片段的求和，并且用于方法的亲和试剂对某些片段的反应性更高或更低。肽和蛋白的变型随着这些变体变得被其他生物分子结合而增加，所述其他生物分子可以改变变体的功能。

肽和蛋白的高度变型变为一个问题，因为免疫测定方法经常必须能够独立地检测每种变体。夹心免疫测定法通常用于特异性测量分析物的独特片段或形式，并且依赖于通过结合两个分开的位置来测量变型。夹心免疫测定法需要足够的空间用于两种单独的抗体结合相同片段；然而，由于这些片段含有与那些其他变体相同的肽或蛋白区域，因此区域经常不适合与抗体结合用于特定测定。其他生物分子的额外结合可以阻断抗体或引起交叉反应性。半胱氨酸可以形成二硫键，并且其他二级分子可以结合片段或被切割并改变抗体结合，仅举通过免疫测定法测量具有高度的变型的肽和蛋白中的一些问题。多重化是免疫测定方法的另一个问题，因为大多数方法使用光学检测标记物 - 无论是化学发光的，荧光的还是比色的 – 其提供有限数目的可分辨信号，用于在相同分析内同时测量。由于该原因，数百至数千种变型的分析是光学系统的问题。这些方法需要在多重化的组和阵列中进行多个、单独的测量，这增加成本和复杂性。

解决高度的变型的问题的常见替代方法是通过使用待测量的肽或蛋白作为酶、蛋白酶和肽酶的作用的底物。这些测量基于观察到的蛋白酶活性，并且可用于测量酶、蛋白酶、肽酶及其抑制剂。例如，这些方法已用于分析胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶(弹性蛋白酶、组织蛋白酶、类胰蛋白酶、胰蛋白酶、激肽释放酶、凝血酶、纤溶酶和因子VII和X)及其抑制剂(双库尼茨抑制剂、乌司他丁和尿胰蛋白酶抑制剂)(Corey US6955921)。在这些情况下，该肽用作底物，在氨基酸切割位点处附接至发色团。在被蛋白酶切割后，片段被释放并被活化以生成颜色。当添加已知量的蛋白酶时，测量抑制剂的浓度。在这里，抑制剂的量与释放的底物的量成反比，因为抑制剂降低蛋白酶的活性。然而，发色团对干扰敏感，其中样品pH、氧化剂、还原剂或反应物逆转或过早生成颜色。

质谱法测量肽或蛋白底物的用途已用于消除与发色团相关的问题。例如，已经针对肾素-血管紧张素-醛固酮系统显示这一点。在该系统中，血管紧张素原I (Ang I)(DRVYIHPFHL)通过肾素的酶促切割中的两个C-末端氨基酸的切割转化为Ang II(DRVYIHPF)(Popp 2014)。Ang I的测量允许通过利用固定至亲和珠的抗Ang I抗体以同时捕获来自血浆的内源性Ang I连同稳定的同位素标记的Ang I来进行血浆肾素活性测定。将血浆样品分开并在37℃下孵育3 h或在冰上孵育。确定两种血浆孵育条件的Ang I浓度的差异，允许计算患者的血浆肾素活性。该酶、蛋白酶和肽酶测定法仍然对干扰敏感，其中样品pH、样品稳定性、抑制剂、辅因子、时间和温度抑制或活化活性。

质谱法(MS)是一种极端灵敏和特异性的技术，其非常良好地适合用于检测低至pM浓度的小分子且样品消耗量少(1微升(µL)或更少)。MS还具有在单一测定中同时测量复杂生物介质中存在的数百种组分(多重化)而无需标记试剂的能力。该方法提供了特异性和灵敏度，直至生物学复杂性引起信号重叠(同重元素干扰)或导致离子抑制。MS与预分离步骤(诸如液相色谱法(LC-MS))的联用是增加灵敏度和限制同重元素干扰并克服高丰度非分析物样品组分的离子抑制的广泛使用的方法；然而，这大大增加分析运行时间、成本和样品制备复杂性。串联MS (MS/MS)可用于在高背景干扰的情况下增加信噪比并区分同重元素分析物(共有相同的母体质荷比(m/z))，但表现出质谱仪内的独特片段化；然而，MS/MS数据的分析不是简单的任务，尤其是在翻译后修饰的蛋白和肽的情况下，并且仍然受到离子抑制的影响，尤其是在片段离子化差的情况下。使用飞行时间质谱仪的基质辅助的激光解吸/离子化(MALDI-TOF)非常适合于低丰度分子的高灵敏度分析；然而，样品复杂性和基质干扰频繁导致同重元素干扰。

MS的当前状态不与常规临床诊断系统竞争，其中注意到以下问题：不能分离目标标志物(样品制备)，由于临床样品中的高背景而灵敏度丧失，一些片段的离子化无效以及复杂样品诸如血液中的同重元素干扰。此外，由于样品中存在的更容易离子化的分子的离子抑制，MS经常无法检测某些质量。这些问题通常引起错误结果。

蛋白水解消化经常用于通过MS分析和定量蛋白和肽。消化用于将蛋白或肽分解为更小、更容易检测到的片段，其与用LC-MS的情况一样，可以在MS分析之前更好地分离。尽管用于增加分析灵敏度，但蛋白水解消化经常无法重现–并非所有蛋白和结合形式都可以被片段化，某些片段不容易被检测到(方法偏向于容易离子化的片段)，各种基质组分可以抑制所用的消化酶，并且多余的氨基酸序列可以导致数据分析期间的模糊。在这些条件下检测到的片段经常与临床状态无关，因为它们不是相关的分子区域。此外，片段的定量需要包括稳定的同位素内标。

解决MS的灵敏度和定量的问题的一种方法是将标记物化学添加至待测量的分子(Demmer 2012)。该质谱标记方法已有助于通过质谱法检测细胞、组织、肽和蛋白。化学标记通过经由化学反应将已知质量的带电基团直接引入待测量的分子上来工作。尽管这些质量标记方法允许质量更容易离子化和独特地鉴定，但它们仍受同重元素干扰的影响，要求分析物具有适合于质量标记物引入的官能团，并且受待测量的分析物的质量的限制。因此，寻求其他方法来避免或减少与这些当前的质谱分析方法相关的问题。

一种常见方法利用亲和剂以捕获分析物并在通过MS(经常被称为亲和质谱)检测之前去除污染物。亲和质谱法的一种方法是表面增强的激光解吸和离子化或SELDI (均属于Hutchens和Yip的美国专利号5,719,060和美国专利号6,225,047)。该方法使用亲和剂将分析物特异性吸附至表面，其有助于捕获分子的离子化(Zhu 2006)。其他实例包括在具有样品呈递表面的柔性或刚性的固体基质上的亲和剂。其他“亲和质谱”方法使用附接至捕获表面或颗粒的亲和剂(如抗体)，用于分离成液体，随后离子化。尽管这些方法已成功用于临床测量(Popp 2014)，但它们经常需要酶促消化以产生可通过MS检测的片段。该样品制备方法仍然是对于自动化困难且复杂的多步骤过程，并且不与临床实验室中使用的其他检测技术竞争。

通过将金属与针对目标稀有细胞分子的抗体偶联，已经实现利用亲和剂的质量标记方法(Bandura 2009, Lee 2008)。在该情况下，将整个样品进行原子化，并使用金属含量来测定稀有分子的存在，其导致整个样品的破坏。在Pugia PCT/US2015/033278中，季铵化合物通过二硫键附接至纳米颗粒。纳米颗粒还与稀有分子的亲和剂缀合。在这里，化学品用作“改变剂”，以通过断裂二硫键以从亲和剂释放质量标记物，即二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)。该方法允许µM范围内的灵敏度，以检测样品中的有限数目的肽和蛋白变体。组合亲和剂和质量标记用于使用纳米颗粒和质量标记物的质谱法显示于09/24/16提交的Cooks PCT/US16/53610中。在该实例中，亲和标签和具有季铵基团的质量标记物通过可裂解的缩酮连接连接至颗粒。该方法使用亲和标签以连接至亲和剂。尽管该方法允许在nM范围内的高灵敏度以检测样品中的有限数目的肽和蛋白变体，但其由于亲和标签与非分析物分子的结合而缺乏特异性。这使得该方法不能准确地测量分析物的所有变型，且因此导致假阳性。

一些标记策略，诸如用于相对和绝对定量的同重元素标签(iTRAQ™，SCIEX)或串联质量标签(TMT™，Thermo Scientific)提供了适合于多重化样品测量和相对定量的直接标记方法。在TMT和iTRAQ两者中，分开的蛋白水解消化物与试剂反应，所述试剂将独特的带电基团引入至N-末端氨基酸以及半胱氨酸、赖氨酸和羰基部分上。然后将标记的样品合并，并在相同LC-MS运行中进行分析。结果是能够在相同LC-MS分析中进行相对定量的可多重化(最多达10重)测定。所述试剂使得能够通过产生同重元素、色谱无法区分的衍生肽来多重化，所述肽可以为来自相同合并物中分析的不同样品的相同肽产生独特的报告离子。由于该方法仍依赖于通过LC的预分离、蛋白水解消化以及独立样品衍生化的额外复杂性，所以其经历与前面讨论的方法相关的相同问题。

该领域需要能够检测样品中的肽和蛋白的所有变型的改进方法。该方法不应依赖于进一步的酶促处理，肽酶反应，并且能够在单一测定中测量任何和所有分析物的变型。组合亲和剂和分析标记的新方法必须对样品中的肽和蛋白的变型敏感，并且允许在患者和样品间的一致的测量。

发明概述

本文所述的发明涉及通过如下分离样品中的分析物分子的变型的方法：使变型与具有附接的分析标记物和亲和剂的颗粒结合，从所述样品分离所述颗粒，从颗粒移取分析标记物，和随后测量所述分析标记物用于间接分析分析物分子。

根据本发明的一些实例涉及通过使分析物的所有变型与带有分析标记物的颗粒结合来分离样品中的分析物的所有变型的方法；其中多个相同的分析标记物通过X-Y键附接至颗粒，并通过断裂X-Y键释放。

根据本发明的一些实例涉及通过使分析物的第一变型与具有第一分析标记物的颗粒结合来分离样品中的分析物的第一变型的方法；分析物的额外变型与具有额外分析标记物的颗粒进一步结合，其中所有分析标记物通过X-Y键附接，并通过断裂X-Y键释放。

根据本发明的一些实例涉及通过使分析物的所有变型与具有分析标记物的颗粒结合来分离样品中的分析物的变型的方法；其中多个相同的亲和剂通过X-Y键附接至颗粒，但不通过断裂X-Y键的条件而释放。

根据本发明的一些实例涉及通过使分析物的第一变型与具有第一亲和剂的颗粒结合来分离样品中的分析物的第一变型的方法；分析物的额外变型与具有额外亲和剂的颗粒进一步结合，其中所有亲和剂通过X-Y键附接，但通过断裂X-Y键释放。

附图简述

本文提供的附图不是按比例的，并且为了便于理解根据本文所述的原理的某些实例的目的而提供，并且通过举例说明而非限制随附权利要求的范围的方式来提供。

图1是举例说明通过根据本文所述的原理的设备、方法或试剂盒检测的分析物的变型的形成的实例的示意图。分析物的原始形式、诸如基因产物1的形成受到能够通过片段化生成分析物的变型的一组试剂2(例如蛋白酶)的作用，其导致10种或更多种片段3。通过片段化实现的分析物的变型3受到能够生成分析物的变型的一组试剂4的作用以产生10种或更多种额外变型5。通过添加物5的分析物的变型受到能够通过结合诸如蛋白生成分析物的变型的一组试剂6作用以得到10种或更多种额外变型，其能够通过片段化生成分析物的变型，导致10种或更多种片段3。在三个循环之后，分析物的变型数已经为106。

图2是描绘根据本文所述的原理的方法的实例的示意图，所述方法用于通过当与含有分析物的变型、诸如抗原11(项目4)的溶液孵育时使分析物的特定变型结合具有附接的分析标记物9(项目2)和附接的亲和剂10(项目3)的颗粒8(项目1)来分离样品中的分析物的一种或多种变型。从具有完整分析标记物的散装样品分离具有捕获的分析物的变型12(项目5)的颗粒，其中多种相同的分析标记物通过X-Y键附接至颗粒，并通过断裂X-Y键释放以释放分析标记物13(项目6)，并允许通过与参考标准品(项目8)比较来进行释放的分析标记物14(项目7)的检测和定量。

图3是描绘根据本文所述的原理的方法的实例的另一个示意图，所述方法涉及通过当与含有分析物的变型、诸如抗原21(项目6)的溶液孵育时使分析物的所有变型结合具有附接的分析标记物17(项目2)和独特的附接的亲和剂18、19和20(项目3、4和5)的颗粒16(项目1)来分离样品中的分析物的所有变型的方法。从具有完整分析标记物的散装样品分离具有捕获的分析物的变型、诸如抗原22、23和24(项目7、8和9)的颗粒，其中多种相同的分析标记物通过X-Y键附接至颗粒，并通过断裂X-Y键释放以释放分析标记物25(项目10)，并允许通过与参考标准品26(项目11)比较来进行释放的分析标记物25(项目10)的检测和定量。

图4是描绘根据本文所述的原理的方法的实例的额外示意图，所述方法用于通过当与含有分析物的变型、诸如抗原33(项目7)的溶液孵育时使分析物的所有变型结合具有附接的独特的分析标记物29和30(项目3和4)和附接的独特的亲和剂31和32(项目5和6)的多种颗粒27和28(项目1和2)来分离样品中的分析物的所有变型。从具有完整分析标记物的散装样品分离具有捕获的分析物的变型、诸如抗原34和35(项目8和9)的颗粒，其中多种相同的分析标记物通过X-Y键附接至颗粒，并通过断裂X-Y键释放以释放分析标记物36和37(项目10和11)，并允许通过与参考标准品38(项目12)比较来进行释放的分析标记物36和37(项目10和11)的可多重化检测和定量。

具体实施方案的详述

根据本文所述的发明的方法、设备和试剂盒在检测或分离稀有分子中具有应用。此类应用的实例包括，通过例举说明而非限制的方式，通过如下分离分析物的变型的方法：使变型与具有附接的分析标记物的颗粒结合，和从所述样品分离所述颗粒，随后从颗粒移取分析标记物和通过测量分析标记物来测量分析物分子。

根据本文所述的发明的一些实例是通过如下分离样品中的分析物分子的变型的方法：通过附接至还附接有分析标记物的颗粒的亲和剂使变型与颗粒结合，和从所述样品分离所述颗粒，随后从所述颗粒移取分析标记物和通过测量分析标记物来测量分析物分子。

根据本文所述的发明的一些实例是通过如下分离样品中的分析物分子的变型的方法：经由通过X-Y键附接至颗粒的亲和剂使变型与颗粒结合，所述颗粒还通过X-Y键附接至分析标记物。从样品分离颗粒，其后通过将分析标记物连接至颗粒的X-Y键的断裂从颗粒释放分析标记物。然后进行释放的分析标记物的测量，作为间接测量分析物分子的手段。

根据本发明的一些实例涉及无细胞的分析物的变型的检测或分离，而其他实例涉及细胞结合或含有细胞的分析物的变型的检测或分离。其他实例涉及已从非稀有细胞的存在移取的稀有细胞中包括的分析物的变型的分离和检测。在一些实例中，通过多孔基质从非稀有细胞的存在移取稀有细胞。

术语“分析物的变型”是生物或非生物来源的分子的部分、片、片段或修饰，包括小分子，如代谢物、辅因子、底物、氨基酸、金属、维生素、脂肪酸、生物分子、肽、碳水化合物或其他，包括大分子，如糖缀合物、脂质、核酸、多肽、受体、酶、蛋白，以及细胞和组织，包括细胞结构、过氧化物酶体、内质网、内体、外排体、溶酶体、线粒体、细胞骨架、膜、核、细胞外基质或通常测量的其他分子。

如上文在附图的简要描述中所解释，图1是描绘通过片段化、添加或结合形成“分析物的变型”的实例的示意图，并且显示如下的实例：一组蛋白酶或肽酶作用于单个大分子、诸如蛋白，随后是通过一组酶作用以产生单一蛋白的变型组的额外反应。可以从细胞和组织的部分和片以及小分子生成分析物的变型。结合和缔合反应还通过生成作为与非结合形式不同的变型的结合形式而导致“分析物的变型”中的额外差异。

根据本文所述的原理的一些实例涉及检测怀疑含有分析物和非分析物分子的变型的一种或多种不同群体的样品中的分析物的变型的一种或多种不同群体的方法。术语“分析物的变型”包括分子，但不限于生物分子，诸如碳水化合物、脂质、核酸、肽和蛋白。分析物的这些变型可用于测量作用以形成分析物的变型的酶、蛋白酶、肽酶、蛋白和抑制剂。分析物的这些变型可以形成为天然或人工来源，诸如生物制剂、治疗学剂或其他。分析物的这些变型可以由分析物的片段化、添加、结合或其他修饰有意导致。根据本文所述的原理的一些实例涉及在分离的方法之前添加肽酶、酶、抑制剂或其他试剂，使得形成分析物的变型。分析物的这些变型可以是有意的亲和力反应以在用该方法分析之前分离分析物的变型的结果。

术语“分析标记物”是指化学实体(有机或无机)，其能够直接在多孔基质上或在液体中生成可通过光学、MS或电化学手段检测到的信号。可以将分析标记物附接至对分析物的变型特异性的亲和剂，或附接至标记颗粒。另外，可以通过断裂化学键从亲和剂或标记颗粒释放分析标记物。所述分析标记物可用于标识亲和剂、颗粒标记物或分析物的变型。所述分析标记物可用作亲和剂、标记颗粒或分析物的变型的可标识代码(条形码)。在一些实例中，可以用内标作为校准物来测量分析标记物，所述内标在结构上与分析标记物相似或相同。

根据本文所述的发明的一些实例涉及使用质量标记物作为分析标记物用于检测分析物的变型的方法。术语“质量标记物”是指具有对应于且用于确定稀有分子或稀有分子的亲和标签的存在和/或量的独特质谱特征的分子。质量标记物在性质上可以另外是荧光的、化学发光的或电化学的。在一些情况下，质量标记物可以是具有独特片段化模式的肽。电荷可以是永久性或临时性电荷。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可互换用来指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“亲和剂”是指能够选择性结合特定分子的分子。所述亲和剂可以直接结合目标分析物的变型，或针对亲和标签。亲和剂可以附接至捕获颗粒或标记颗粒，或者可以通过静电、疏水、空间、离子或其他相互作用结合颗粒，将分析物的变型或亲和标签吸引至亲和剂。

术语“标记颗粒”是指通过连接与分析标记物和亲和剂结合的颗粒。术语“捕获颗粒”是指通过连接附接至额外的亲和剂或亲和标签的颗粒，并且可用于捕获分析物的变型。术语“连接”是指两个基团之间的键，其表示为X-Y键。所述亲和剂通过作为X-Y键的连接附接至标记颗粒，并且分析标记物通过作为X-Y键的连接附接至标记颗粒。该连接当经受如本文所述的某些条件时可以是可裂解的或者可以是永久的(在所用条件下不经历裂解)。术语键通常是化学键，即共价键或离子键。优选的连接是共价键连接。

根据本文所述的发明的一些实例涉及测量分析物的方法，其通过将多个分析标记物附接至标记颗粒而使用分析标记物的颗粒扩增。在一些实例中，针对扩增的方法，存在附接至具有亲和剂的标记颗粒的多个分析标记物。在其他实例中，可以将额外的亲和剂连接至捕获颗粒，并且捕获颗粒用于将具有亲和剂的标记颗粒分离至多孔基质或磁体上。根据本文所述的原理的其他实例涉及结合和分离分析物的变型的方法，其中在多孔基质或磁性颗粒上分离标记颗粒和细胞，并保留结合的材料用于分析。

根据本文所述的发明的实例涉及用于分析的方法和试剂盒。根据本文所述的原理的其他实例涉及用于分析的设备。

用于根据本文描述的发明检测分析物的单一变型的方法、设备或试剂盒的实例描绘于图2中。如以上在图2的简单描述中所解释，在该实例中，分析标记物和亲和剂 - 其能够结合分析物的变型 - 通过在标签颗粒上的分析标记物之间建立的连接以及亲和剂和标签颗粒之间的单独连接而附接。在第一步骤中，将具有附接的亲和剂的标记颗粒与含有分析物的变型的样品混合。在第二步骤中，亲和剂结合分析物的变型，且标记颗粒可以原样捕获，或被捕获的颗粒或细胞结合，且通过各种手段、诸如多孔基质上的大小排阻过滤、磁性分离或离心从样品移取。以这种方式，将与颗粒结合的分析物的变型与不与分析物的变型结合的颗粒分离。在第三步骤中，将具有捕获的分析物(诸如抗原)的变型的标记颗粒经历这样的条件，其通过断裂X-Y键从标记颗粒释放分析标记物，并允许通过与参考标准品比较来可定量检测释放的分析标记物。

用于根据本文描述的发明检测一种或多种分析物的多种变型的方法、设备或试剂盒的另一实例描绘于图3中。如以上在图3的描述中所解释，在该实例中，分析标记物和多种亲和剂 - 其能够结合一种或多种分析物的不同变型 - 通过在标签颗粒上的分析标记物之间建立的连接以及亲和剂和标签颗粒之间的单独连接而附接。在第一步骤中，将具有附接的亲和剂的标记颗粒与含有一种或多种分析物的变型的样品混合。在第二步骤中，亲和剂结合一种或多种分析物的变型，且标记颗粒可以原样捕获，或被捕获的颗粒或细胞结合，且通过各种手段、诸如多孔基质上的大小排阻过滤、磁性分离或离心从样品移取。以这种方式，将与颗粒结合的一种或多种分析物的变型与不与一种或多种分析物的变型结合的颗粒分离。在第三步骤中，将具有捕获的一种或多种分析物(诸如抗原)的变型的标记颗粒经历这样的条件，其通过断裂X-Y键从标记颗粒释放分析标记物，并允许通过与参考标准品比较来可定量检测释放的分析标记物。

用于根据本文描述的发明检测一种或多种分析物的多种变型的分析的方法、设备或试剂盒的另外的实例描绘于图4中。如以上在图4的描述中所解释，显示了通过与具有分析标记物的标记颗粒结合来分离样品中的一种或多种分析物的变型的实例。在第一步骤中，将具有独特的附接的亲和剂的多种标记颗粒与含有一种或多种分析物的变型的样品混合。使用多种颗粒，其各自具有独特的亲和剂和独特的分析标记物。在第二步骤中，亲和剂结合一种或多种分析物的变型，且标记颗粒可以原样捕获，或被捕获的颗粒或细胞结合，且通过各种手段、诸如多孔基质上的大小排阻过滤、磁性分离或离心从样品移取。以这种方式，将与颗粒结合的一种或多种分析物的变型与不与一种或多种分析物的变型结合的颗粒分离。在第三步骤中，将具有捕获的一种或多种分析物(诸如抗原)的变型的标记颗粒经历这样的条件，其通过断裂X-Y键从标记颗粒释放分析标记物，并允许通过与参考标准品比较来可定量检测相同样品内的多种释放的分析标记物。

分析物的变型的实例

根据所述原理，“分析物的变型”可以衍生自生物学或非生物学来源的分子。分析物的变型包括但不限于生物分子，诸如碳水化合物、脂质、核酸、肽和蛋白。分析物的变型可以是反应、生物学过程、疾病或有意反应的结果，并且可用于测量疾病或天然状态。分析物的变型可以由人造或天然来源的分子(诸如蛋白、酶、生物制剂或肽)的变化导致，并且包括生物活性和非生物活性分子，诸如用于医疗装置、治疗用途、诊断用途、用于测量过程的那些，以及用作食品、用于农业、生产、用作益生菌或益生元、用于微生物或细胞生产、用作过程的化学品、用于细胞的生长、测量或控制、用于食品安全和环境评价、用于兽医产品和用于化妆品的那些。

分析物的变型可以是较大部分的片段或结合形式，并且其本身可用于测量其他分子，诸如酶、肽酶和其他。其他分子(诸如酶、肽酶和其他)的测量可以基于分析物的变型(诸如酶促或蛋白水解产物)的形成。其他分子(诸如天然抑制剂、合成抑制剂和其他)的测量可以基于缺乏分析物的变型的形成。

分析物的变型可以作为翻译或通过酶促或非酶促修饰的翻译后修饰的结果。翻译后修饰是指蛋白生物合成期间或之后的蛋白的共价修饰。翻译后修饰可以通过酶促或非酶促化学反应进行。磷酸化是用于调节酶的活性的非常普遍的机制，并且是最常见的翻译后修饰。酶可以是如酶分类数据库(诸如http://enzyme.expasy.org/或http://www.enzyme-database.org/，其具有超过6000个条目)中通常已知的氧化还原酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶或转移酶。

分析物的变型的常见修饰包括添加疏水基团用于膜定位，添加辅因子用于增强酶促活性，形成白喉酰胺，形成羟丁赖氨酸，乙醇胺磷酸甘油附接，酰化，烷基化，酰胺键形成，诸如氨基酸添加或酰胺化，取决于维生素K的丁酰化γ-羧化作用[15]，糖基化，将糖基添加至精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、羟基赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或色氨酸，产生糖蛋白，丙二酰化羟基化，碘化，核苷酸添加，诸如ADP-核糖基化，磷酸酯(O-连接的)或氨基磷酸酯(N-连接的)形成，诸如磷酸化或腺苷酸化，丙酰化焦谷氨酸形成，S-谷胱甘肽化，S-亚硝基化S-亚磺酰基化(又名S-亚磺酰化、琥珀酰化或硫酸化)。非酶促修饰包括糖的附接，氨基甲酰化，羰基化或有意重组或合成缀合，诸如生物素化或添加亲和剂，如组氨酸氧化，胱氨酸残基之间形成二硫键，或聚乙二醇化(添加聚环氧乙烷基团)。

用于分析物(诸如肽和蛋白)的变型的有意片段化和形成的常用试剂包括肽酶或已知与肽和蛋白反应的试剂。有意片段化可以基于蛋白酶(也称为肽酶或蛋白酶)和已知与肽和蛋白序列反应的化学品的预期切割位点生成特定片段。用于有意片段化的常见的肽酶和化学品包括Arg-C、Asp-N、BNPS oNCS/脲、胱天蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(低特异性)、梭菌蛋白酶、CNBr、肠激酶、因子Xa、甲酸、Glu-C、颗粒酶B、HRV3C蛋白酶、羟胺、碘苯甲酸、Lys-C、Lys-N、轻度酸水解、NBS、NTCB、弹性蛋白酶、胃蛋白酶A、脯氨酰内肽酶、蛋白酶K、TEV蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、凝血酶和胰蛋白酶。用于有意抑制片段化的常用试剂包括酶、肽酶、蛋白酶、还原剂、氧化剂、化学反应物以及酶、肽酶、蛋白酶的化学抑制剂(包括上面列出的化学品)。

可断裂连接的实例

根据本发明，分析标记物和亲和剂通过连接附接至标记颗粒。另外，通过断裂连接从亲和剂或标记颗粒释放分析标记物。可断裂连接被定义为“ X-Y键”。短语“ X-Y键”是指允许亲和剂或分析标记物与标记颗粒的可断裂连接的一组分子。短语“ X-Y键”是指允许连接断裂的一组分子。所述分析标记物含有原子(Y)，其连接至标记颗粒上的原子(X)。所述亲和剂可以含有原子(Y)，其连接至标记颗粒上的原子(X)。X-Y键可以包括硫化物、吡啶基二硫化物、酯、醚、硫酯、酰胺、硫代酰胺、N-氧化物、氮-氮、硫醚、肽、羧酸酯、螯合物、胍、金属等等。X-Y键可以例如是脂肪族烃链、多肽、聚合物、芳族烃、脂肪族脂肪酸、蛋白、金属、碳水化合物、有机胺、醚、酯、硫化物、磷酸酯、硫酸酯、核酸、有机醇和其他(包括上面所列化合物的混合物)的一部分，例如，其结构可以通过取代、质量和链长而变化。在聚合材料的情况下，以使得优化与亲和剂或分析标记物的反应的方式调节重复单元的数目。在一些情况下，X-Y键可以是长接头基团的一部分，以引起在亲和剂或分析标记物和标记颗粒之间的空间。

在一些实例中，分析标记物结合原子(Y)可以是与原子(X)(其也是硫醇基)形成键的硫醇基，诸如烷基、芳族基团、肽和蛋白上的那些。在其他实例中，连接二硫键可以由分析标记物或亲和剂上的游离硫醇与颗粒上存在的吡啶基二硫醇基反应而产生。

在一些实例中，X和Y可以是S、O、C、P、N、B、Si、Ni、Pd、Co、Ag、Fe、Cu或Au的任何组合。存在于连接基团中的官能团可以包括酯、硫酯、酰胺、硫代酰胺、醚、胍、N-氧化物、氮-氮、硫醚、羧酸酯等等。在还有其他实例中，X或Y可以是结合金属的金属结合分子，诸如金属螯合剂，其附接至亲和剂、分析标记物或标记颗粒，例如但不限于含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸或酪氨酸或硫醇基团的蛋白、肽或分子，诸如聚组氨酸标签、聚精氨酸标签、谷胱甘肽S-转移酶(GST标签)、免疫球蛋白或许多其他。

在一些情况下，通过X-Y连接基团添加至标记颗粒的亲和剂是彼此结合的亲和剂或亲和标签。亲和标签和亲和剂对包括但不限于作为亲和标签的生物素，其作为亲和剂结合链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白；荧光素，其作为亲和剂结合抗荧光素抗体。亲和标签包括被抗体或蛋白结合并且可以充当这些亲和剂的结合配偶体的其他分子。在其他实例中，这些亲和标签可以是非抗体的结合蛋白的分子，诸如但不限于结合链霉抗生物素蛋白-内动蛋白蛋白的strep II标签肽(具有SEQ ID NO:19 WSHPQFEK的肽)，结合链霉抗生物素蛋白蛋白的链霉抗生物素蛋白结合(SBP)肽标签(具有SEQ ID NO:20 MDEKTTGWRGGHVVEGLAGE LEQLRARLEH HPQGQREP的肽)，结合钙调蛋白的钙调蛋白结合肽(CBP)(具有SEQID NO:21 GVMPREETDSKTASPWKSAR的肽)。在其他实例中，亲和标签可以是碳水化合物分子，如直链淀粉，其作为亲和剂结合麦芽糖结合蛋白(MBP)(396个氨基酸残基)。在一些情况下，可以将亲和标签添加至第二亲和剂，诸如与结合分析物的变型的抗体结合的生物素。在该情况下，中性抗生物素蛋白是通过X-Y连接添加至标记颗粒的亲和剂，并且中性抗生物素蛋白结合与抗体结合的生物素，所述抗体可以结合分析物的变型。

在一些情况下，亲和标签可以直接附接至分析物的变型。实例包括但不限于FLAG多肽标签(具有SEQ ID NO:22 DYKDDDDK的肽)、流感血凝素(HA)多肽标签(具有SEQ ID NO:23 YPYDVPDYA的肽)、c-Myc多肽标签(具有SEQ ID NO:24 EQKLISEEDL的肽)、S-标签多肽标签(具有SEQ ID NO:25 KETAAAKFERQHMDE的肽)、共价连接至翻译的肽或其他分子的嘌呤霉素。具有分析物的变型的这些亲和标签被作为亲和剂的抗体结合，其通过X-Y连接基团添加至标记颗粒。在一些情况下，这些亲和标签可以是多肽，在使用各种宿主生物(大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞)的各种载体的其cDNA的亚克隆或基因表达期间，所述多肽与重组蛋白融合。另外，所述亲和标签可以向分析物增加特性，例如MBP和S-标签亲和标签增加蛋白稀有分子的溶解度，并且FLAG肽标签可以用特异性蛋白酶、例如肠激酶(肠肽酶)切割。

分析标记物的实例

根据本文所述的原理的一些实例中，在所述方法、试剂盒和设备中，分析标记物用于检测和测量分析物的一种或多种变型的不同群体。分析标记物是分子、金属、离子、原子或电子，其可使用分析方法检测，以得到关于样品中的一种或多种变型的存在和量的信息。本文所述的原理涉及使用分析标记物检测怀疑含有稀有分子和非稀有分子的一种或多种不同群体的样品中的分析物的一种或多种不同变型的方法。在一些实例中，所述分析物的变型在细胞中或是细胞来源的。在其他实例中，所述分析物的变型是不含细胞的或“不含细胞”。在其他实例中，所述分析物的变型是细胞。根据本文所述的原理的一些实例中，一定浓度的分析物的变型的一种或多种不同群体保留在多孔基质或捕获颗粒上，并且反应以从多孔基质或捕获颗粒生成分析标记物。

当保留在多孔基质上并从膜释放至分析液中时，可以检测到分析标记物。当保留在捕获颗粒或细胞上并从捕获颗粒或细胞释放至分析液中时，可以检测到分析标记物。在一些实例中，所述分析标记物从分析标记物前体释放至分析液中，而没有释放分析物的变型。在其他实例中，所述分析标记物从分析标记物前体释放至分析液中，其中还释放分析物的变型。在其他实例中，所述分析标记物不从分析标记物前体释放至具有分析物的变型的分析液中。

可以对多孔基质或分析液进行分析以确定每种不同分析标记物的存在和/或量。每个不同分析标记物的存在和/或量与样品中的靶稀有分子的每个不同群体的存在和/或量有关。所述分析标记物可以作为光学分析标记物、电化学分析标记物或质谱分析标记物(质量标记物)通过光学、电化学或质谱方法测量。可以将每种不同类型的标记物(无论是光学分析标记物、电化学分析标记物还是质谱分析标记物)的存在和/或量相互关联，以确定保留在多孔基质和/或捕获颗粒上的靶稀有分子的每种不同群体的存在和/或量。

在一些实例中，具有分析标记物的分析液可以被转移至通过分析仪采样的液体接收区域。在其他实例中，具有分析标记物的分析液可以保留在通过分析仪采样的多孔基质上。在其他情况下，所述液体接收区域可以在分析仪内部，并且可以直接分析具有分析标记物的分析液。在一些分析实例中，将多孔基质移取并置于分析仪中，在所述分析仪中进行分析标记物的分析并将其转换为关于一种或多种分析物的每种不同变型的存在和/或量的信息。

在根据本文所述的发明的一些方法中，分析标记物通过从分析标记物前体释放而生成。在许多实例中，分析标记物可以在与化学品反应以断裂键之后生成。在其他实例中，分析标记物由分析标记物前体底物、诸如化学物质生成，所述分析标记物前体底物、诸如化学物质经历与酶诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、黄酮氧化酶、脲酶或甲基转移酶(仅举几例)反应，以生成标记物。在其他实例中，所述分析标记物可以在与电子或离子、诸如电化学发光(ECL)标记物反应之后生成。

如上文所提及，一个或多个连接基团X-Y是通过裂解剂裂解的可裂解部分。裂解剂的性质取决于可裂解部分的性质。可裂解部分的裂解可以通过化学或物理方法来实现，所述方法涉及例如以下中的一种或多种：氧化、还原、溶剂分解，例如水解、光解、热解、电解、超声处理和化学取代。可裂解部分和对应裂解剂的实例(通过举例说明而非限制的方式)包括例如可以使用还原剂、例如硫醇裂解的二硫化物；可以使用氧化剂、例如高碘酸盐裂解的二醇；可以通过高锰酸盐或四氧化锇裂解的二酮；可以用次硫酸盐裂解的醚、酯、重氮连接或肟连接；可以在碱性条件下裂解的β-砜；可以用碱裂解的其中α-碳例如用羰基或硝基活化的四烷基铵、三烷基锍、四烷基鏻；可以在碱性条件下使用水解剂、诸如例如羟胺、氨或三烷基胺(例如三甲胺或三乙胺)裂解的酯和硫酯连接；其中在还原下进行消除的醌类；可以光解裂解的被取代的苯甲醚；可以热裂解的碳酸酯；其中配体可以用更高亲和力配体置换的金属螯合剂；可以用单态氧裂解的硫醚；在酸性条件下可裂解的腙连接；季铵盐(可通过例如氢氧化钠水溶液裂解)；三氟乙酸可裂解的部分，诸如例如苯甲醇衍生物、替考拉宁糖苷配基、缩醛和硫缩醛；可以使用例如HF或甲酚裂解的硫醚；磺酰基(可通过例如三氟甲烷磺酸、三氟乙酸或苯硫基甲烷裂解)；亲核试剂可裂解的位点，诸如邻苯二甲酰胺(可例如用被取代的肼裂解)；离子缔合(带相反电荷的部分的吸引)，其中裂解可以通过改变介质的离子强度、加入破坏性离子物质、降低或升高pH、加入表面活性剂、超声处理和加入带电化学品来实现；以及可用具有适当波长的光，诸如例如300nm或更大的UV光裂解的光可裂解键。

在一个实例中，可以使用与N-丁二酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)(SPDP)缀合，形成可裂解的连接。例如，包括胺官能团的标记颗粒与SPDP缀合并且然后所得的缀合物可以与含有硫醇官能团的分析标记物反应，其导致MS标记部分连接至缀合物。二硫化物还原剂(诸如例如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧基乙基)膦(TCEP))可以用作裂解剂以将硫醇化肽作为分析标记物释放。

短语“光学分析标记物”是指允许通过光学手段进行特异性检测的一组分子，诸如：化学发光标记物，如鲁米诺、异鲁米诺、吖啶鎓酯、金刚烷基1,2-二氧杂环丁烷芳基磷酸酯、本领域中的研究人员通常可得的金属衍生物或其他；荧光标记物，如荧光素、镧系金属、Hoechst 33258、R-藻蓝蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、若丹明、DyLight dyes™、德克萨斯红、金属或本领域中的研究人员通常可得的其他列表(参见http://www.fluorophores.org/)或；发色标记物，诸如四甲基联苯胺(TMB)、颗粒、金属或其他。光学分析标记物可通过光学方法如显微镜、照相机、光学阅读器、比色计、荧光计、发光计、反射计和其他检测。

短语“电化学分析标记物”是指电位、电容和氧化还原活性化合物，诸如：金属，如Pt、Ag、Pd、Au和许多其他，或；颗粒，如金溶胶、氧化石墨烯和其他，或；电子传输分子，如二茂铁、亚铁氰化物、Os(VI)bipy和许多其他，或；电化学氧化还原活性分子，如芳族醇和胺，诸如4-氨基苯基磷酸酯、2-萘酚、对硝基苯酚磷酸酯；硫醇或二硫化物，诸如芳族化合物、脂肪族化合物、氨基酸、肽和蛋白上的那些；含有非碳环原子(如氧、氮或硫)的芳族杂环，诸如如咪唑、吲哚、喹诺酮、噻唑、苯并呋喃和许多其他。电化学分析标记物可通过阻抗、电容、安培、电化学阻抗谱和其他测量法检测。

标记颗粒可以包括例如1至约10⁸个分析标记物，或约10至约10⁴个分析标记物，或约10³至约10⁵个分析标记物，或约10⁴至约10⁸个分析标记物，或约10⁶至约10⁸个分析标记物。所述标记颗粒可以由蛋白、多肽、聚合物、颗粒、碳水化合物、核酸、脂质或能够通过经由X-Y连接附接而与分析标记物形成键的其他大分子构成。单一标记颗粒上的多个分析标记物允许扩增，因为每个标记颗粒都可以生成许多分析标记物。

短语“质量标记物”或“质谱分析标记物”是指生成独特的质谱特征的一组分子，其对应于并用于确定一种或多种分析物的每种不同变型的存在和/或量。所述质量标记物是具有定义的结构和分子量的分子，其例如包括但不限于肽、聚合物、脂肪酸、碳水化合物、有机胺、核酸和有机醇。质量标记物的分子量可以例如通过取代和链大小来改变。在聚合物材料的情况下，调节重复单元的数目，使得由质量标记物形成并由质谱仪检测的一个或多个离子处于没有背景干扰的区域中。

“质量标记物”是当通过质谱进行分析时导致独特质谱模式的任何分子。“质量标记物前体”是可以由其形成或生成质量标记物的任何分子、颗粒或两者的组合。质量标记物前体可以例如通过改变剂的作用，通过裂解、通过与部分反应、通过衍生化或通过加入或通过减去分子、电荷或原子或上述的两种或更多种的组合转化成质量标记物。

质量标记物前体的性质取决于例如以下中的一种或多种：质量标记物的性质、采用的MS方法的性质、采用的MS检测器的性质、靶稀有分子的性质、亲和剂的性质、采用的任何免疫测定的性质、样品的性质、采用的任何缓冲液的性质、分离的性质。在一些实例中，质量标记物前体是其质量可以通过取代和/或链大小而变化的分子。由质量标记物前体产生的质量标记物是不应存在于待分析的样品中的具有定义分子量和结构的分子。此外，质量标记物应当可通过MS检测器检测到，并且不应受到样品或分析液的背景干扰。用于根据本文所述的原理的方法中以产生质量标记物的质量标记物前体的实例(通过举例说明而非限制的方式)包括(通过举例说明而非限制的方式)例如多肽、有机和无机聚合物、脂肪酸、碳水化合物、环状烃、脂肪族烃、芳族烃、有机羧酸、有机胺、核酸、有机醇(例如烷基醇、酰基醇、酚类、多元醇(例如二醇)、硫醇、环氧化物、伯胺、仲胺和叔胺、吲哚、叔铵和季铵化合物、氨基醇、氨基硫醇、酚类胺、吲哚羧酸、酚类酸、插烯酸、羧酸酯、磷酸酯、羧酰胺、来自聚酰胺和聚酯的羧酸、腙、三甲基硅烷基烯醇醚、缩醛、缩酮、氨基甲酸酯、胍、异氰酸酯、磺酸、磺酰胺磺酰基、硫酸酯、单酸甘油酯、甘油醚、神经鞘胺醇碱、神经胺、脑苷脂、类固醇、前列腺素、碳水化合物、核苷和治疗药物。

可以充当质量标记物的肽的实例包括(通过举例说明而非限制的方式)含有以下中的两种或更多种的肽：组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、脯氨酸、缬氨酸、酪氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、半胱氨酸和异亮氨酸和其衍生物。在一些实例中，肽具有约100至约3,000 Da的分子量并且可以含有3至30个氨基酸，无论是天然存在的还是合成的。肽中的氨基酸数目由例如采用的MS技术的性质决定。例如，当使用MAFDI用于检测时，肽可以具有在约600至约3,000范围内的质量并且由约6至约30个氨基酸构成。或者，当使用电喷雾离子化用于质谱分析时，肽具有在约100至约1,000范围内的质量并且例如由1至30个氨基酸或其衍生物构成。在一些实例中，肽标记物中的氨基酸数目可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。所述质量标记物可以包括离子化的基团，诸如季铵盐(如肉碱、精氨酸盐、胍盐及其衍生物)；季芳族铵盐(如咪唑、吡咯、组氨酸、喹啉、吡啶、吲哚、嘌呤嘧啶等)；四烷基铵离子、三烷基锍离子、四烷基鏻离子和其他实例。

肽用作质量标记物具有几种优点，其包括但不限于以下：1)相对容易缀合至蛋白、抗体、颗粒和其他生物化学实体；2)质量相对容易改变，以允许许多不同的质量，因此提供多重测定格式和标准；以及3)分子量针对用于检测的质谱仪的最佳性能可调节。对于缀合，肽可以具有用于缀合中的末端半胱氨酸。为了帮助有效离子化，肽可以具有永久带电或容易离子化的氨基。在一些实例中，肽具有N-末端游离胺和/或C-末端游离酸。在一些实例中，肽并入一个或多个稳定同位素或用一个或多个稳定同位素衍生化。肽可以缀合至小分子，诸如例如生物素或荧光素，用于结合针对小分子的对应结合配偶体，在此实例中该结合配偶体是链霉抗生物素蛋白或针对荧光素的抗体。

多肽质量标记物是由氨基酸的重复单元或序列构成的任何质量标记物。在多肽质量标记物的情况下，可以调节氨基酸亚基的身份和/或数目以得到展现质谱特征或不受背景干扰的峰的质量标记物。此外，质谱分析标记物可以由具有独特质谱特征的不存在于测试的样品中的分析标记物前体产生。多肽分析标记物前体可以包括额外的氨基酸或衍生氨基酸，这允许多重测量，以在单次分析中获得超过一个结果。多肽质量标记物前体的实例包括但不限于例如聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚丝氨酸、聚苏氨酸、聚半胱氨酸、聚缬氨酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸、聚甲硫氨酸、聚脯氨酸、聚苯丙氨酸、聚酪氨酸、聚色氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚天冬酰胺、聚谷氨酰胺、聚组氨酸、聚赖氨酸和聚精氨酸。在一些实例中，多肽通过催化来改性。例如，通过举例说明而非限制的方式，苯酚和芳族胺可以加入聚苏氨酸，使用过氧化酶作为催化剂。在另一个实例中，通过举例说明而非限制的方式，使用过氧化酶作为催化剂，电子可以转移至芳族胺。在另一个实例中，通过举例说明而非限制的方式，使用磷酸酶作为催化剂，可以从有机磷酸酯移出磷酸酯。

在另一个实例中，采用衍生剂以从质量标记物前体产生质量标记物。例如，二硝基苯基和其他硝基苯基衍生物可以由质量标记物前体形成。其他实例包括(通过举例说明而非限制的方式)酯化、酰化、硅烷化、保护性烷基化、通过酮-碱缩合(诸如希夫碱(Schiffbase))衍生、环化、形成荧光衍生物和无机阴离子。衍生反应可以在MS分析前，在亲和力反应后发生，或用于产生缀合至亲和试剂的质量标记物前体。

在一些实例中，质量标记物前体可以包括一个或多个同位素，诸如但不限于²H、¹³C和¹⁸O，其保留在衍生自质量标记物前体的质量标记物中。质量标记物可以基于质谱特征检测。在一些实例中，质量标记物前体例如是具有相对较高的引起键裂解的潜能的质量标记物前体，诸如但不限于烷基化胺、缩醛、伯胺和酰胺。

内标是质谱分析的一个重要方面。在一些实例中，将第二质量标记物或结构相似的化合物添加至分析液(作为内标)，其用于定量用于检测靶稀有分子的质量标记物。在一些情况下，所述内标是同重元素的(与质量标记物共享相同的母体m/z)，但当在质谱仪内部片段化时表现出独特的质谱模式。在其他情况下，选择内标，使得母体m/z与质量标记物的m/z略微不同。内标也可以含有额外氨基酸或衍生氨基酸。或者，内标可以例如通过并入一种或多种同位素元素、诸如(但不限于)²H (D)、¹³C和¹⁸O来制备。在此情况下，质量标记物(或内标)具有不同于天然存在的物质的质量。例如甘油-C-d7、乙酸钠-C-d7、丙酮酸钠-C-d7、D-葡萄糖-C-d7、氘化葡萄糖和右旋糖-C-d7，将分别充当甘油、乙酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖和右旋糖的内标。

在一些情况下，用于多重分析的内标和/或同重元素质量标记物利用具有氨基酸取代的不同肽，使得肽质量标记物的标称分子量保持不变，而质谱仪内部的片段化导致不同质量物标记肽的独特的质谱特征。此类肽的实例包括但不限于共有528.7.7 Da的分子量的GAIIR和AAIVR或共有631.8 Da的分子量的RAAVIC和RGIAIC的氨基酸序列。在其他情况下，同重元素质量标记肽和内标利用混杂的氨基酸序列，使得质谱分析程序期间的片段化产生一个或多个独特的可检测片段。可以用作内标或可多重化质量标记物的具有混杂的氨基酸序列的质量标记肽的实例包括但不限于GAIIR、AIIGR和IGIAR的氨基酸序列，其都共有527.7 Da的分子量。

可以修饰质量标记肽，使得游离胺基(诸如N-末端胺)或游离羧基(诸如C-末端羧基)改变为不同的官能团。通过实例而非限制的方式，可以将游离胺修饰为乙酰基、甲酰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、琥珀酰基(Suc)、氯乙酰基(Cl-Ac)、马来酰亚胺(Mal)、苄氧基羰基(CBZ)、溴乙酰基(Br-Ac)、次氮基三乙酰基、叔丁氧羰基(Boc)、4-羟基苯基丙酸(HPP)、硫辛酸(LA)、聚乙二醇化、烯丙氧羰基(Alloc)等。游离羧基修饰的实例包括但不限于酰胺化(NH2)、肽醛、醇肽、氯甲基酮(CMK)、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、对硝基苯胺(pNA)、对硝基苯酚(-ONP)、羟基琥珀酰亚胺酯(-OSu)等。通过实例而非限制的方式，可以对游离胺和/或羧基进行修饰，用于增加离子化效率、改变质谱模式、生成同重元素质量标记肽以引入可以用于将质量标记肽偶联至标记颗粒的官能团或改变质量标记肽的质量的目的。

MS分析确定分子的质荷比(m/z)用于准确鉴定和测量。离子的生成(离子化)可以通过几种技术完成，所述技术包括但不限于例如基质辅助激光解吸离子化(MALDI)、大气压化学离子化(APCI)、电喷雾离子化(ESI)、感应电喷雾离子化(iESI)、化学离子化(CI)、电子轰击离子化(EI)、高速原子轰击(FAB)、场解吸/场离子化(FC/FI)、热喷雾离子化(TSP)和纳米喷雾离子化。通过几种技术通过质谱监测质量，所述技术包括(通过举例说明而非限制的方式)飞行时间(Time-of-Flight，TOF)、离子阱、四极滤质器、磁性区域(magneticsectors)、电区域(electric sectors)和傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)。可以连续重复MS方法(MSn)，其中选择母体离子并进行片段化，其后测量在MS分析仪内生成的片段。片段可以在MS分析仪内进行额外片段化，用于随后的分析。样品处理步骤经常在MS分析之前进行，诸如，通过实例而非限制的方式，液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、离子迁移谱仪(IMS)和亲和分离。

在通过质谱进行分析后，每个不同质量标记物的存在和/或量与靶稀有细胞和/或颗粒结合的靶稀有分子的每个不同群体的存在和/或量相关。质量标记物和靶分子之间的关系通过使用对靶分子特异性的亲和剂建立。校准物用于建立来自质量标记物的信号的量和样品中的靶稀有分子的量之间的关系。

亲和剂的实例

亲和剂是能够选择性结合靶分子的分子。选择性结合涉及对分子之一的特异性识别，相比之下，对其他分子的识别显著更少。术语“结合(binding)”或“结合(bound)”是指其中两个部分彼此缔合的方式。

亲和剂可以是免疫球蛋白、蛋白、肽、金属、碳水化合物、金属螯合剂、核酸或能够选择性结合特定分子的其他分子。特异性结合涉及两种不同分子之一对另一种的特异性识别，相比之下，对其他分子的识别显著更少。所述缔合通过非共价结合，诸如特异性离子结合、疏水结合、口袋结合等。相反，“非特异性结合”可以由几种因素导致，所述因素包括对一类相似分子中的任何特定分子通用且非特异性的分子之间的疏水或静电相互作用。

作为免疫球蛋白的亲和剂可以包括完整的抗体或其片段，包括各种类型和同种型，诸如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。其片段可以例如包括Fab、Fv和F(ab')2和Fab'。另外，可以适当地使用免疫球蛋白或其片段的聚集物、聚合物和缀合物，只要维持对特定分子的结合亲和力即可。

抗体对于稀有分子是特异性的，并且可以是单克隆或多克隆的。此类抗体可以通过如下制备：本领域中众所周知的技术，诸如宿主免疫和收集血清(多克隆)，或制备连续杂交细胞系和收集分泌蛋白(单克隆)，或克隆和表达至少编码天然抗体的特异性结合所需的氨基酸序列的核苷酸序列或其诱变版本。

多克隆抗体和单克隆抗体可以通过本领域中众所周知的技术制备。例如，在一种方法中，单克隆抗体通过体细胞杂交技术来获得。单克隆抗体可以根据Köhler和Milstein,Nature 265:495-497, 1975的标准技术产生。单克隆抗体技术的综述可见于LymphocyteHybridomas,编. Melchers, 等人 Springer-Verlag (New York 1978), Nature 266:495 (1977), Science 208: 692 (1980)和Methods of Enzymology 73 (Part B): 3-46(1981)。一般来说，单克隆抗体可以通过已知技术纯化，所述技术诸如例如但不限于色谱法，例如DEAE色谱法、ABx色谱法和HPLC色谱法；以及过滤。

亲和剂可以另外是能够选择性结合稀有分子的“细胞亲和剂”，其用于将稀有细胞分型或测量细胞的生物学细胞内过程。这些亲和剂可以是免疫球蛋白，其特异性识别并结合与特定细胞类型相关的抗原，且由此该抗原是细胞的组分。细胞亲和剂能够被吸附至细胞内或细胞上。选择性细胞结合通常涉及“相对依赖于结合对(亲和剂和靶稀有分子)的特定结构的分子之间的结合。选择性结合不依赖于非特异性识别。

标记物和捕获颗粒的实例

亲和剂可以附接至分析标记物和/或颗粒，用于检测或分离稀有分子的目的。该附接可以通过“标记颗粒”发生，所述“标记颗粒”进而附接至分析标记物。亲和剂也可以附接至“捕获颗粒”，其允许分离结合和未结合的分析标记物或稀有分子。术语“附接(attached)”或“附接(attachment)”是指其中两个部分连接的方式。这可以通过两个部分之间的直接键或两个部分之间的连接基团(共价或其他方式)来实现。或者，可以使用额外的“结合配偶体”将亲和剂附接至分析标记物和/或颗粒。短语“结合配偶体”是指作为结合彼此各自的配偶体而不是其他分子的亲和剂或“亲和标签”的特异性结合对的成员的分子。在一些实例中，所述亲和标签可以是肽、多肽或蛋白，诸如聚组氨酸标签、聚凝集素标签、谷胱甘肽S-转移酶(GST标签)、免疫球蛋白或许多其他。在一些情况下，所述亲和剂可以是免疫对的成员，所述免疫对诸如抗原对抗体，或半抗原对抗体，生物素对抗生物素蛋白，生物素对中性抗生物素蛋白，生物素对链霉抗生物素蛋白，IgG对蛋白A，二抗对一抗，抗体对荧光标记物等等。

“标记颗粒”是通过接头臂或结合对附接至亲和剂的颗粒材料。“标记颗粒”能够在标记颗粒和分析标记物之间以及在标记颗粒和亲和剂或标签之间形成X-Y可裂解的连接。标记颗粒的大小足够大，以容纳1至108个分析标记物和1至108个亲和剂或标签。单个标记颗粒上的分析标记物和亲和剂或标签的比率例如可以是108：1、106：1或105：1或104：1或103：1或102：1或10：1。与标记颗粒相关的亲和剂或标签和分析标记物的数目例如取决于亲和剂或标签的性质和大小、标记颗粒的性质和大小、接头臂的性质、标记颗粒上的官能团的数目和类型以及分析标记物上的官能团的数目和类型中的一种或多种。

所述标记颗粒可以与捕获颗粒组合使用，其中捕获颗粒附接至对于分析物的特定变型特异性的额外亲和剂。“捕获颗粒”和/或标记颗粒是可以通过直接连接或结合对附接至亲和剂或标签的颗粒材料。标记物或捕获颗粒实体的组成可以是有机或无机的，磁性或非磁性的。有机聚合物包括(通过举例说明而非限制的方式)例如硝化纤维素、乙酸纤维素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(苯乙烯/二乙烯基苯)、聚(苯乙烯/丙烯酸酯)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、树状聚合物、蜜胺树脂、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)，其本身使用或与其他材料(包括乳胶)结合使用。颗粒还可以由例如碳(例如碳纳米管)、金属(例如金、银和铁，包括其金属氧化物)、胶体、树状聚合物、树突和脂质体构成。在一些实例中，所述颗粒可以是二氧化硅。

在其他一些实例中，颗粒可以是磁性的。通过实例而非限制的方式，颗粒可以表现出或被修饰以表现出游离的羧酸、胺或甲苯磺酰基。在一些实例中，颗粒可以是中孔的并且在孔内包括分析标记物。

标记物或捕获颗粒的直径例如取决于稀有分子的性质、样品的性质、细胞的通透性、细胞的大小、核酸的大小、亲和剂的大小、应用于分离的磁力、过滤基质的性质和孔径、颗粒对基质的粘附、颗粒的表面、基质的表面、液体离子强度、液体表面张力以及液体中的组分、相关标记颗粒的数目、大小、形状和分子结构中的一种或多种。在一些实例中，捕获颗粒的平均直径为至少1μm，但不大于约20μm。

术语“通透性”意指颗粒和分子扩散通过屏障诸如细胞壁或细胞膜的能力。在细胞内进行稀有分子检测的情况下，标记颗粒的直径必须足够小，以允许亲和剂(附接至标记颗粒)进入细胞。或者，标记颗粒和亲和剂之间的连接必须具有足够的长度并且具有足够的通透性，以允许亲和剂进入细胞内部。所述标记颗粒可能包被有增加“通透性”的材料，如胶原酶、肽、蛋白、脂质、表面活性剂和已知增加就细胞而言的颗粒通透性的其他化学品。

当在过滤分离步骤中采用多孔基质时，标记颗粒的直径必须足够小以有效地通过多孔基质的孔。另外，捕获颗粒的直径必须足够大以不通过多孔基质的孔，以将结合的稀有分子保留在基质上。在细胞结合的稀有分子检测的情况下，细胞必须具有足够的大小以不通过多孔基质的孔。在根据本文所述的原理的一些实例中，标记颗粒的平均直径应当为至少0.01微米(10 nm)且不大于约10μm。在一些实例中，颗粒对表面的粘附足够强，使得尽管直径小于基质的孔，但颗粒保留在多孔基质上。

亲和剂可以通过经由连接基团直接附接至捕获颗粒或标记颗粒而制备。所述连接基团也可以是大分子，诸如多糖、肽、蛋白、核苷酸和树状聚合物。所述连接基团可以含有一个或多个可裂解或不可裂解的连接部分。可裂解部分的裂解不仅可以通过电化学还原实现，而且可以通过化学或物理方法实现。此类方法可以涉及例如进一步的氧化、还原、溶剂分解，例如水解、光解、热分解、电解、超声处理和化学取代。可例如用具有适当波长的光(例如，UV光)裂解光裂解键。裂解剂的性质取决于可裂解部分的性质。

颗粒和亲和剂之间的连接基团可以是具有1至约200或更多个原子的链，所述原子各自独立地选自通常由碳、氧、硫、氮和磷、通常碳和氧组成的组。连接基团中的杂原子数目可以范围为约0至约8、约1至约6或约2至约4。连接基团的原子可以被除了氢以外的原子取代，所述原子诸如例如碳、氧和氮中的一个或多个，其呈例如烷基、芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基或芳烷氧基的形式。一般说来，为了方便合成，可以任意地选择特定连接基团的长度，其限制条件为由连接基团引起的干扰最小，其中连接的分子能够执行与本文公开的方法相关的其功能。

对于分开和分离后保留的标记物和捕获颗粒的量而言获得可重复性对于稀有分子分析是重要的。另外，进入细胞的颗粒的量的知识对于使特异性结合的量最大化是重要的。知道洗涤后剩余的颗粒的量对于使非选择性结合的量最小化是重要的。为了进行这些测定，颗粒包括“光学标记物”(其包括荧光、有色或化学发光标记物)是有帮助的。因此，可以凭借光学标记物的存在来测量标记颗粒的存在。光学标记物可以通过显微镜测量，并比较含有和缺乏分析物的样品的结果。荧光标记物包括但不限于例如dylight™、FITC、若丹明化合物、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、对苯二甲醛、荧光稀土螯合剂、氨基-香豆素、伞形酮、噁嗪、德克萨斯红、吖啶酮、二萘嵌苯、indacines(诸如例如4,4-二氟-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-indacene和其变体)、9,10-双-苯基乙炔基蒽、方酸染料和荧光胺。然后荧光显微镜或荧光分光仪可以用于测定标记颗粒的位置和量。化学发光标记物实例包括鲁米诺、吖啶酯和吖啶磺酰胺，仅举几例。有色标记物包括彩色颗粒、金色颗粒、导致比色反应的酶，仅举几例。

多孔基质和过滤的实例

在本文的实例中，多孔基质用于在稀有分子的分离和/或检测期间分离捕获颗粒和细胞。在颗粒足够小于基质的孔径的情况下使用多孔基质，使得颗粒在物理上可以通过孔。在其他实例中，颗粒足够大于基质的孔径，使得颗粒在物理上不能通过孔。

在根据本文所述的原理的一些方法中，对于稀有分子的每种不同群体，将样品与由分析标记物和标记颗粒组成的亲和剂一起孵育。所述亲和剂包含对于稀有分子的群体之一的稀有分子特异性并结合稀有分子的群体之一的稀有分子的特异性结合配偶体。所述稀有分子可以是细胞结合的或无细胞的。具有分析标记物和标记颗粒的亲和剂保留在膜的表面上。

在一些实例中，用于过滤的多孔基质使得孔具有足够的大小以允许未结合的标记颗粒通过孔，同时包含稀有分子的细胞与结合至所述细胞的标记颗粒一起保留在多孔基质上。在还有其他方法中，标记颗粒上的亲和剂可以另外通过“结合配偶体”或“夹心测定法”结合至捕获颗粒(例如磁性颗粒)或表面。在现有情况下，捕获颗粒保留在多孔基质的表面上。

在一些实例中，稀有分子的一种或多种不同群体的浓度相比于非稀有分子的浓度增强，以形成浓缩的样品。在一些实例中，所述样品进行使用多孔基质的过滤程序，所述多孔基质保留稀有分子，同时允许非稀有分子通过多孔基质，由此增加稀有分子的浓度。在一个或多个稀有分子是非细胞的、即不与细胞或其他生物颗粒缔合的情况下，将样品与一个或多个捕获颗粒实体组合，其中每个捕获颗粒实体包含非细胞稀有分子的每个群体的非细胞稀有分子的结合配偶体，使得非细胞稀有分子呈颗粒形式，即形成颗粒结合的非细胞稀有分子。将样品和捕获颗粒实体的组合保持一段时间并保持一定温度，其允许非细胞稀有分子与捕获颗粒实体的相应结合配偶体结合。将压力梯度(即真空)应用至多孔基质上的样品，以促进非稀有细胞、非稀有分子和其他样品内容物通过基质。应用的压力梯度取决于例如稀有细胞和/或颗粒试剂的不同群体的性质和大小、多孔基质的性质和多孔基质的孔的大小中的一种或多种。

样品与多孔基质的接触继续一段足以使细胞稀有分子和/或颗粒结合的非细胞稀有分子保留在表面上的时间，如上所讨论。时间段例如取决于稀有细胞和/或颗粒结合的稀有分子的不同群体的性质和大小、多孔基质的性质、多孔基质的孔的大小、应用于多孔基质上的血液样品的真空水平、待过滤的体积以及多孔基质的表面积中的一种或多种。在一些实例中，接触的时段是例如约1分钟至约1小时，约5分钟至约1小时，或约5分钟至约45分钟，或约5分钟至约30分钟，或约5分钟至约20分钟，或约5分钟至约10分钟，或约10分钟至约1小时，或约10分钟至约45分钟，或约10分钟至约30分钟，或约10分钟至约20分钟。

根据本文所述的原理的方法中利用的每种不同的亲和剂的量例如取决于稀有分子的每种不同群体的性质和潜在量、分析标记物的性质、附接的性质、亲和剂的性质、细胞的性质(如果存在的话)、颗粒的性质(如果采用的话)和封闭剂的量和性质(如果采用的话)中的一种或多种。在一些实例中，采用的每种不同的修饰的亲和剂的量是例如约0.001 µg/µL至约100 µg/µL，或约0.001 µg/µL至约80 µg/µL，或约0.001 µg/µL至约60 µg/µL，或约0.001 µg/µL至约40 µg/µL，或约0.001 µg/µL至约20 µg/µL，或约0.001 µg/µL至约10 µg/µL，或约0.5 µg/µL至约100 µg/µL，或约0.5 µg/µL至约80 µg/µL，或约0.5 µg/µL至约60 µg/µL，或约0.5 µg/µL至约40 µg/µL，或约0.5 µg/µL至约20 µg/µL，或约0.5 µg/µL至约10µg/µL。

所述多孔基质是固体或半固体材料，其根据本文所述的发明是液体不可渗透的(除了通过基质的一个或多个孔)。所述多孔基质与多孔基质容纳器和液体容纳孔缔合。多孔基质和容纳器之间的缔合可以用使用粘合剂来实现。容纳器中的多孔基质和液体容纳孔之间的缔合可以通过直接接触或用柔性垫圈表面实现。

所述多孔基质是固体或半固体材料，并且可以由有机或无机的水不溶性材料构成。所述多孔基质是非吸水的，其意味着该膜不能吸收液体。在一些实例中，多孔基质吸收的液体的量小于约2%(按体积计)，或小于约1%，或小于约0.5%，或小于约0.1%，或小于约0.01%或0%。多孔基质是无纤维的，这意味着膜至少95%不含纤维，或至少99%不含纤维，或至少99.5%或至少99.9%不含纤维，或100%不含纤维。

所述多孔基质可以具有多种形状中的任一种，诸如，例如平面或平坦表面(例如，条、盘、薄膜、基质和板)。所述基质可以由各种各样的材料构造，所述材料可以是天然存在的，或合成、聚合或非聚合的。所述多孔基质的形状取决于例如膜的容纳器、微流体表面、液体容纳孔的性质或形状中的一种或多种。在一些实例中，所述多孔基质的形状例如是圆形、椭圆形、矩形、正方形、轨道蚀刻的、平面或平坦的表面(例如，条、盘、薄膜、膜和板)。

所述多孔基质和容纳器可以由各种各样的材料制成，所述材料可以是天然存在的，或合成、聚合或非聚合的。此类用于制造多孔基质的材料的实例包括例如(通过举例说明而非限制的方式)塑料，诸如例如聚碳酸酯、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚-(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二酯)、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、聚(氯三氟乙烯)、聚(丁酸乙烯酯)、聚酰亚胺、聚氨酯和聚对二甲苯；硅烷；硅；氮化硅；石墨；陶瓷材料(诸如例如氧化铝、氧化锆、PZT、碳化硅、氮化铝)；金属材料(诸如例如金、钽、钨、铂和铝)；玻璃(诸如例如硼硅酸盐、钠钙玻璃和pyrex®)；以及生物可吸收的聚合物(如例如聚乳酸、聚己内酯和聚乙醇酸)；其本身使用或与彼此和/或其他材料结合使用。用于制造多孔基质和容纳器的材料是不吸水的，并且不包括纤维材料，诸如纤维素(包括纸)、硝化纤维素、乙酸纤维素、人造丝、二乙酸盐、木质素、矿物纤维、纤维状蛋白、胶原蛋白、合成纤维(诸如例如尼龙、涤纶、烯烃、丙烯酸类、聚酯纤维)或吸水性和/或可渗透并且因此不根据本文所述的原理的其他纤维材料(玻璃纤维、金属纤维)。用于制造多孔基质和容纳器的材料可以是相同或不同的材料。

每个液体容纳孔的多孔基质包含至少一个孔和不多于约2,000,000个孔/平方厘米(cm²)。在一些实例中，每cm²多孔基质的孔的数目是例如1至约2,000,000，或1至约1,000,000，或1至约500,000，或1至约200,000，或1至约100,000，或1至约50,000，或1至约25,000,或1至约10,000，或1至约5,000，或1至约1,000，或1至约500，或1至约200，或1至约100，或1至约50，或1至约20，或1至约10，或2至约500,000，或2至约200,000，或2至约100,000，或2至约50,000，或2至约25,000，或2至约10,000，或2至约5,000，或2至约1,000，或2至约500，或2至约200，或2至约100，或2至约50，或2至约20，或2至约10，或5至约200,000，或5至约100,000，或5至约50,000，或5至约25,000，或5至约10,000，或5至约5,000，或5至约1,000，或5至约500，或5至约200，或5至约100，或5至约50，或5至约20，或5至约10。多孔基质中的孔的密度是例如多孔基质的表面积的约1%至约20%，或约1%至约10%，或约1%至约5%，或约5%至约20%，或约5%至约10%。在一些实例中，多孔基质的孔的大小足以优先保留液体，同时允许根据本文所述的原理形成的液滴通过。多孔基质的孔的大小例如取决于液体的性质、细胞的大小、捕捉颗粒的大小、分析标记物的大小、分析物的大小、标记颗粒的大小、非稀有分子的大小和非稀有细胞的大小。在一些实例中，多孔基质的孔的平均大小是例如约0.1至约20微米，或约0.1至约5微米，或约0.1至约1微米，或约1至约20微米，或约1至约5微米，或约1至约2微米，或约5至约20微米，或约5至约10微米。

基质内的孔可以根据本文所述的原理、通过例如微机电(MEMS)技术、金属氧化物半导体(CMOS)技术、用于产生微筛的微制造方法、激光技术、辐照、模制和微机械加工(例如)或其组合来制造。

在一些情况下，所述多孔基质永久地附接至可以与液体容纳孔的底部以及真空歧管的顶部缔合的容纳器，其中定位多孔基质，使得液体可以从液体容纳孔流至真空歧管。在一些实例中，所述容纳器中的多孔基质可以与微流体表面、顶盖表面和/或底盖表面缔合。容纳器可以由与多孔基质的材料相容的任何合适材料构成。此类材料的实例包括(通过实例而非限制的方式)上文关于多孔基质所列的任一材料。外壳和多孔基质的材料可以相同或可以不同。所述容纳器也可以由无孔玻璃或塑料薄膜构成。

塑料薄膜材料的实例包括聚苯乙烯、聚亚烷基(polyalkylene)、聚烯烃、环氧树脂、Teflon®、PET、氯氟乙烯、聚偏二氟乙烯、PE-TFE、PE-CTFE、液晶聚合物、Mylar®、聚酯、聚甲基戊烯、聚苯硫醚和PVC塑料薄膜。所述塑料薄膜可以诸如用铝金属化。所述塑料薄膜可以具有相对低的透湿率，例如，0.001 mg/m²-天。可以通过使用热粘合、机械紧固的粘合或通过使用永久性粘合剂(诸如干燥粘合剂，如聚乙酸乙烯酯)、压敏粘合剂(如基于丙烯酸酯的聚合物)、接触粘合剂(如天然橡胶和聚氯丁烯)、热熔性粘合剂(如乙烯-乙酸乙烯酯)和反应性粘合剂(如聚酯、多元醇、丙烯酸、环氧树脂、聚酰亚胺、基于硅酮橡胶和改性丙烯酸酯和聚氨酯组合物)、天然粘合剂(如糊精、酪蛋白、木质素)，将多孔基质永久地固定至容纳器。所述塑料薄膜或粘合剂可以是导电材料，并且导电材料涂层或材料可以在容纳器表面的特定区域间进行图案化。

容纳器中的多孔基质通常是过滤模块的一部分，其中多孔基质是组件的一部分，用于在过滤期间方便使用。所述容纳器具有这样的表面，其促进与相关表面的接触，但不是永久地附接固定至这些表面并且可以移除。可能将顶部垫圈应用至液体容纳孔之间的可移除容纳器。可能将底部垫圈应用至真空歧管之间的可移除容纳器。垫圈是柔性材料，其在压缩后促进液体或空气不可渗透的密封。所述容纳器可能由垫圈材料构成。垫圈形状的实例包括平坦的、压花的、图案化的或模制的片、环、圆形、椭圆形，其具有切出的区域以允许样品从多孔基质流至真空歧管。垫圈材料的实例包括纸、橡胶、硅酮、金属、软木、毡、氯丁橡胶、腈橡胶、纤维玻璃、聚四氟乙烯(如PTFE或Teflon)或塑料聚合物(如聚氯三氟乙烯)。

在一些实例中，将真空应用至多孔基质上的浓缩且处理的样品，以促进非稀有细胞通过基质。应用的真空水平取决于例如生物颗粒的不同群体的性质和大小、多孔基质的性质和多孔基质的孔的大小中的一种或多种。在一些实例中，应用的真空水平是例如约1毫巴至约100毫巴，或约1毫巴至约80毫巴，或约1毫巴至约50毫巴，或约1毫巴至约40毫巴，或约1毫巴至约30毫巴，或约1毫巴至约25毫巴，或约1毫巴至约20毫巴，或约1毫巴至约15毫巴，或约1毫巴至约10毫巴，或约5毫巴至约80毫巴，或约5毫巴至约50毫巴，或约5毫巴至约30毫巴，或约5毫巴至约25毫巴，或约5毫巴至约20毫巴，或约5毫巴至约15毫巴，或约5毫巴至约10毫巴。在一些实例中，所述真空是振荡真空，这意味着以规则或不规则的间隔间歇地应用真空，所述间隔例如可以是例如约1秒至约600秒，或约1秒至约500秒，或约1秒至约250秒，或约1秒至约100秒，或约1秒至约50秒，或约10秒至约600秒，或约10秒至约500秒，或约10秒至约250秒，或约10秒至约100秒，或约10秒至约50秒，或约100秒至约600秒，或约100秒至约500秒，或约100秒至约250秒。在该方法中，在对血液样品应用真空的部分或全部期间，真空以例如约0毫巴至约10毫巴，或约1毫巴至约10毫巴，或约1毫巴至约7.5毫巴，或约1毫巴至约5.0毫巴，或约1毫巴至约2.5毫巴振荡。振荡真空例如使用打开-关闭开关实现，并且可以自动或手动进行。

处理的样品与多孔基质的接触继续足够的时间段，足以实现稀有细胞或颗粒结合的稀有分子保留在多孔基质的表面上，以获得具有如上所讨论的稀有细胞或颗粒结合的稀有分子的不同群体的多孔基质的表面。所述时间段例如取决于稀有细胞或颗粒结合的稀有分子的不同群体的性质和大小、多孔基质的性质、多孔基质的孔的大小、应用于多孔基质上的样品的真空水平、待过滤的体积以及多孔基质的表面积中的一种或多种。在一些实例中，所述接触时间是例如约1分钟至约1小时，约5分钟至约1小时，或约5分钟至约45分钟，或约5分钟至约30分钟，或约5分钟至约20分钟，或约5分钟至约10分钟，或约10分钟至约1小时，或约10分钟至约45分钟，或约10分钟至约30分钟，或约10分钟至约20分钟。

稀有分子的实例

短语“稀有分子”是指可以被检测为样品中的分析物的分子。分析物的一种或多种变型指示稀有分子的特定群体。短语“分子的群体”是指一组稀有分子，其共有专门定义一组稀有分子的分子结构的共同部分。短语“对…特异性”意味着通常稀有分子将稀有分子组与其他分子区别开。

短语“无细胞稀有分子”是指未与细胞结合和/或在样品中自由循环的稀有分子。此类非细胞稀有分子包括可用于医学诊断和疾病治疗的生物分子。疾病的医学诊断包括，但不限于，例如，用于检测癌症、心脏损害、心血管疾病、神经系统疾病、止血/止血、胎儿母体评价、生育力、骨骼状况、激素水平、维生素、过敏、自身免疫性疾病、高血压、肾病、代谢疾病、糖尿病、肝病、传染病的生物标志物和可用于疾病的医学诊断的其他生物分子。

以下是其中可以测量稀有分子的样品的非限制性实例。待分析的样品是怀疑含有稀有分子的样品。所述样品可以是生物样品或非生物样品。生物样品可以来自植物、动物、原生生物或其他活生物，包括动物界、真菌、植物、藻物界或原生动物或其他真核生物物种或细菌、古细菌或其他原核生物物种。非生物样品包括水溶液、环境、产品、化学反应产物、废物流、食品、原料、肥料、燃料等。生物样品包括生物流体，诸如全血、血清、血浆、痰液、淋巴液、精液、外排体、脂质、阴道粘液、粪便、尿、脊髓液、唾液、粪便、脑脊髓液、泪液、粘液或组织。生物组织包括(通过举例说明的方式)毛发、皮肤、来自器官或其他身体部分的切片或切除组织，例如，稀有分子可以来自组织，例如肺、支气管、结肠、直肠、细胞外基质、皮肤、血管、茎、叶(lead)、根、种子、花、胰腺、前列腺、乳房、肝脏、胆管、膀胱、卵巢、脑、中枢神经系统、肾脏、骨盆、子宫体、口腔或咽或癌症。在许多情况下，所述样品是水性的，诸如尿液、全血、血浆或血清样品，在其他情况下，必须将样品制成溶液或悬浮液用于测试。

所述样品可以是含有细胞、诸如例如非稀有细胞和稀有细胞的样品，其中从稀有细胞检测到稀有分子。来自细胞的稀有细胞可以来自任何生物，并且是(但不限于)例如病原体，诸如细菌、病毒、真菌和原生动物；恶性细胞，例如恶性肿瘤或癌细胞；循环内皮细胞；循环肿瘤细胞；循环癌症干细胞；循环癌症间充质细胞；循环上皮细胞；胎细胞；免疫细胞(B细胞、T细胞、巨噬细胞、NK细胞、单核细胞)；以及干细胞。在根据本文所述的发明的方法的其他实例中，待测试的样品是例如来自生物(诸如，但不限于，植物或动物受试者)的血液样品。根据本文所述的原理的方法的一些实例中，待测试的样品是例如来自生物(诸如，但不限于，哺乳动物受试者)的样品。具有稀有分子的细胞可以来自哺乳动物的组织，例如肺、支气管、结肠、直肠、胰腺、前列腺、乳房、肝脏、胆管、膀胱、卵巢、脑、中枢神经系统、肾脏、骨盆、子宫体、口腔或咽或癌症。

稀有分子片段可用于测量目标肽酶，包括MEROPS中的那些，所述MEROPS是肽酶(也称为蛋白酶)的在线数据库，并且天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、金属、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和一般肽酶催化类型的总共~902212种不同序列被进一步分类且包括对于以下通路列出的那些：2-氧代羧酸代谢、ABC转运蛋白、非洲锥虫病、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、同种异体移植物排斥、阿尔茨海默氏病、氨基糖和核苷酸糖代谢、阿米巴病、AMPK信号传导通路、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、抗原加工和呈递、凋亡、花生四烯酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、哮喘、自身免疫性甲状腺疾病、B细胞受体信号传导通路、细菌分泌系统、基础转录因子、β-丙氨酸代谢、胆汁分泌、氨基酸的生物合成、次级代谢物的生物合成、不饱和脂肪酸的生物合成、生物素代谢、双酚降解、膀胱癌、cAMP信号传导通路、碳代谢、心肌收缩、细胞粘附分子(CAMs)、细胞周期、细胞周期-酵母、查加斯病(美国锥虫病)、化学致癌作用、胆碱能突触、结肠直肠癌、补体和凝血级联、氰基氨基酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、细胞因子-细胞因子受体相互作用、胞质溶胶DNA-传感通路、芳族化合物的降解、扩张型心肌病、二恶英降解、DNA复制、背-腹轴形成、药物代谢-其他酶、内分泌和其他因子调节的钙重吸收、内吞作用、幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号传导、爱泼斯坦-巴尔病毒感染、雌激素信号传导通路、范可尼贫血通路、脂肪酸延长、局灶性粘附、叶酸生物合成、foxO信号传导通路、谷胱甘肽代谢、甘油脂质代谢、甘油磷脂代谢、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、GnRH信号传导通路、移植物抗宿主病、hedgehog信号传导通路、造血细胞谱系、乙型肝炎、单纯疱疹感染、HIF-1信号传导通路、hippo信号传导通路、组氨酸代谢、同源重组、HTLV-I感染、亨廷顿氏病、肥厚型心肌病(HCM)、甲型流感、胰岛素信号传导通路、军团菌病、利什曼病、白细胞跨内皮迁移、赖氨酸生物合成、溶酶体、疟疾、MAPK信号传导通路、减数分裂-酵母、黑色素瘤、代谢通路、细胞色素P450对外源性物质的代谢、多种环境中的微生物代谢、癌症中的微RNA、矿物质吸收、错配修复、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、神经活性配体-受体相互作用、NF-κB信号传导通路、氮代谢、NOD样受体信号传导通路、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、notch信号传导通路、嗅觉转导、卵母细胞减数分裂、破骨细胞分化、其他聚糖降解、卵巢类固醇生成、氧化磷酸化、p53信号传导通路、胰腺分泌、泛酸和CoA生物合成、帕金森氏病、癌症中的通路、青霉素和头孢菌素生物合成、肽聚糖生物合成、过氧化物酶体、百日咳、吞噬体、苯丙氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、类苯基丙烷生物合成、PI3K-Akt信号传导通路、植物-病原体相互作用、血小板活化、PPAR信号传导通路、朊病毒疾病、蛋白酶体、蛋白消化和吸收、蛋白输出、内质网中的蛋白加工、癌症中的蛋白聚糖、嘌呤代谢、嘧啶代谢、丙酮酸代谢、Rap1信号传导通路、Ras信号传导通路、肌动蛋白细胞骨架的调控、自噬的调控、肾细胞癌、肾素-血管紧张素系统、逆向性内源性大麻素信号传导、类风湿关节炎、RIG-I样受体信号传导通路、RNA降解、RNA转运、唾液分泌、沙门氏菌感染、血清素能突触、小细胞肺癌、剪接体、金黄色葡萄球菌感染、系统性红斑狼疮、T细胞受体信号传导通路、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、萜类骨架生物合成、TGF-β信号传导通路、TNF信号传导通路、Toll样受体信号传导通路、弓形虫病、癌症中的转录失调、色氨酸代谢、结核病、双组分系统、I型糖尿病、泛醌和其他萜类-醌生物合成、泛素介导的蛋白水解、万古霉素耐药性、病毒致癌作用、病毒性心肌炎、维生素消化和吸收Wnt信号传导通路。

可用于测量目标肽酶抑制剂的稀有分子片段包括MEROPS(肽酶抑制剂的在线数据库)中的那些，其包括总共~133535种不同序列，其中家族是具有同源性的同源肽酶抑制剂的集合。通过氨基酸序列与该家族的类型抑制剂或与已经显示与该类型抑制剂(且因此是其成员)同源的另一种蛋白的显著相似性来显示同源性。该家族的参考生物显示为卵类粘蛋白抑制剂单元3(吐绶鸡(Meleagris gallopavo))、抑肽酶(牛(Bos taurus))、大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(大豆(Glycine max))、蛋白酶抑制剂B(慈菇(Sagittaria sagittifolia))、α-1-肽酶抑制剂(智人(Homo sapiens))、海鞘胰蛋白酶抑制剂(海菠萝(Halocynthia roretzi))、鸭脚稗种子胰蛋白酶/α-淀粉酶抑制剂(Eleusine coracana)、胰蛋白酶抑制剂MCTI-1 (苦瓜(Momordica charantia))、家蚕枯草杆菌蛋白酶抑制剂(家蚕(Bombyx mori))、肽酶B抑制剂(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、marinostatin(Alteromonas sp.)、ecotin (大肠杆菌)、Bowman-Birk抑制剂单元1(大豆(Glycinemax))、水蛭抑制剂c(水蛭(Hirudo medicinalis))、水蛭素(水蛭(Hirudo medicinalis))、antistasin抑制剂单元1(Haementeria officinalis)、链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂(白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus))、分泌型白细胞抑制剂结构域2(智人(Homo sapiens))、芥菜胰蛋白酶抑制剂-2(白芥子(Sinapis alba))、肽酶抑制剂LMPI抑制剂单元1(东亚飞蝗(Locusta migratoria))、马铃薯肽酶抑制剂II抑制剂单元1(马铃薯(Solanum tuberosum))、分泌粒蛋白V(智人(Homo sapiens))、BsuPI肽酶抑制剂(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、pinA Lon肽酶抑制剂(肠杆菌噬菌体T4)、胱抑素A(智人(Homo sapiens))、卵囊抑素(原鸡(Gallus gallus))、金属肽酶抑制剂(矛头蝮蛇(Bothrops jararaca))、钙蛋白酶抑素抑制剂单元1(智人(Homo sapiens))、细胞毒性T-淋巴细胞抗原-2α(小家鼠(Mus musculus))、equistatin抑制剂单元1(草莓海葵(Actinia equina))、存活素(智人(Homo sapiens))、aspin(猪蛔虫(Ascaris suum))、saccharopepsin抑制剂(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、timp-1(智人(Homo sapiens))、链霉菌金属肽酶抑制剂(黑色链霉菌(Streptomyces nigrescens))、马铃薯金属羧肽酶抑制剂(马铃薯(Solanum tuberosum))、金属肽酶抑制剂(Dickeya chrysanthemi)、α-2-巨球蛋白(智人(Homo sapiens))、chagasin (主要利什曼虫(Leishmania major))、oprin (黑耳负鼠(Didelphis marsupialis))、金属羧肽酶A抑制剂(猪蛔虫(Ascaris suum))、水蛭金属羧肽酶抑制剂(水蛭(Hirudo medicinalis))、胶乳素(智人(Homo sapiens))、clitocypin(Lepista nebularis)、proSAAS (智人(Homo sapiens))、杆状病毒P35胱天蛋白酶抑制剂(斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus))、p35同源物(桑灯蛾昆虫肠痘病毒(Amsacta moorei entomopoxvirus))、丝氨酸羧肽酶Y抑制剂(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、蜱抗凝血肽(非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata))、Madain 1(长角血蜱(Haemaphysalis longicornis))、南瓜天冬氨酸肽酶抑制剂(黄瓜(Cucumis sativus))、staphostatin B (金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、staphostatin A (金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、triabin (Triatoma pallidipennis)、嗜酸性粒细胞前主要碱性蛋白(智人(Homo sapiens))、血栓稳定素(西方角蝇(Haematobia irritans))、香菇肽酶抑制剂(香菇(Lentinula edodes))、菠萝蛋白酶(菠萝(Ananas comosus))、蜱羧肽酶抑制剂(囊形扇头蜱(Rhipicephalus bursa))、streptopain抑制剂(化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes))、falstatin(镰状疟原虫(Plasmodium falciparum))、chimadanin(长角血蜱(Haemaphysalis longicornis))、{婆婆纳属}胰蛋白酶抑制剂(Veronica hederifolia)、variegin (饰钝眼蜱(Amblyomma variegatum))、噬菌体λ CIII蛋白(噬菌体λ)、凝血酶抑制剂(刺舌蝇(Glossina morsitans))、anophelin (白魔按蚊(Anopheles albimanus))、曲霉菌弹性蛋白酶抑制剂(烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus))、AVR2蛋白(Passalora fulva)、IseA蛋白(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、toxostatin-1 (刚地弓形虫(Toxoplasma gondii))、AmFPI-1(印度柞蚕(Antheraea mylitta))、cvSI-2(美洲巨蛎(Crassostrea virginica))、大环蛋白1 (雨伞菇(Macrolepiota procera))、HflC (大肠杆菌)、oryctin (犀角金龟(Oryctes rhinoceros))、胰蛋白酶抑制剂(紫茉莉(Mirabilis jalapa))、F1L蛋白(牛痘病毒(Vaccinia virus))、NvCI羧肽酶抑制剂(Nerita versicolor)、Sizzled蛋白(非洲爪蟾(Xenopus laevis))、EAPH2蛋白(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))和Bowman-Birk样胰蛋白酶抑制剂(竹叶臭蛙(Odorrana versabilis))。稀有分子片段可用于测量肽酶抑制剂的合成抑制。前述数据库还包括可以模拟任何成员或上面列出的家族的抑制特性的数千种不同小分子抑制剂的实例。

代谢感兴趣的稀有分子包括但不限于影响以下的浓度的那些：ACC乙酰辅酶A羧化酶、Adpn脂联素、AdipoR脂联素受体、AG脱水葡萄糖醇、AGE Advance糖化最终产物、Akt蛋白激酶B、AMBK 前-α-1-微球蛋白/双库尼茨抑制剂、AMPK 5'-AMP活化蛋白激酶、ASP酰化刺激蛋白、Bik双库尼茨抑制剂、BNP B型利钠肽、CCL趋化因子(C-C基序)配体、CINC细胞因子诱导的嗜中性白细胞趋化剂、脂联素受体的CTF C-末端片段、CRP C-反应蛋白、DGAT酰基辅酶A二酰基甘油转移酶、DPP-IV二肽基肽酶-IV、EGF表皮生长因子、eNOS内皮NOS、EPO促红细胞生成素、ET内皮素、Erk细胞外信号-调节的激酶、FABP脂肪酸结合蛋白、FGF成纤维细胞生长因子、FFA游离脂肪酸、FXR Farnesoid X受体a、GDF生长分化因子、GH生长激素、GIP葡萄糖依赖性的促胰岛素多肽、GLP胰高血糖素样肽-1、GSH谷胱甘肽、GHSR生长激素促分泌素受体、GULT葡萄糖转运蛋白、GCD59糖化CD59(又名glyCD59)、HbA1c血红蛋白A1c、HDL高密度脂蛋白、HGF肝细胞生长因子、HIF缺氧诱导因子、HMG 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶、I-α-I间-α-抑制剂、Ig-CTF免疫球蛋白附接的AdipoR的C-末端片段、胰岛素、IDE胰岛素降解酶、IGF胰岛素样生长因子、IGFBP IGF结合蛋白、IL白介素细胞因子、ICAM细胞间粘附分子、JAK STAT Janus激酶/信号转导物和转录激活物、JNK c-Jun N-末端激酶、KIM肾脏损伤分子、LCN-2脂质运载蛋白、LDL低密度脂蛋白、L-FABP肝型脂肪酸结合蛋白、LPS脂多糖、Lp-PLA2脂蛋白相关的磷脂酶A2、LXR肝X受体、LYVE内皮透明质酸受体、MAPK丝裂原活化蛋白激酶、MCP单核细胞趋化蛋白、MDA丙二醛、MIC巨噬细胞抑制性细胞因子、MIP巨噬细胞炎性蛋白、MMP基质金属蛋白酶、MPO髓过氧化物酶、哺乳动物雷帕霉素的mTOR、NADH烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、NGF神经生长因子、活化的B细胞的NFκB核因子κ轻链增强剂、NGAL嗜中性粒细胞明胶酶脂质运载蛋白、NOS一氧化氮合酶NOX NADPH氧化酶NPY神经肽Y葡萄糖、胰岛素、胰岛素原、c肽OHdG羟基脱氧鸟苷、oxLDL氧化低密度脂蛋白、P-α-I前白介素-α-抑制剂、PAI-1纤溶酶原激活物抑制剂、PAR蛋白酶活化的受体、PDF胎盘生长因子、PDGF血小板衍生生长因子、PKA蛋白激酶A、PKC蛋白激酶C、PI3K磷脂酰肌醇3-激酶、PLA2磷脂酰肌醇3-激酶、PLC磷脂酶C、PPAR过氧化物酶体增殖物活化的受体、PPG餐后葡萄糖、PS磷脂酰-丝氨酸、PR蛋白酶、PYY神经肽(如肽Y)、RAGE AGE的受体、ROS反应性氧物质、S100钙粒蛋白、sCr血清肌酐、SGLT2钠-葡萄糖转运蛋白2、SFRP4分泌的卷曲相关蛋白4前体、SREBP甾醇调节元件结合蛋白、含SMAD无菌α基序结构域的蛋白、SOD超氧化物歧化酶、sTNFR可溶性TNFα受体、TACE TNFαα切割蛋白酶、TFPI组织因子通路抑制剂、TG甘油三酸酯、TGFβ转化生长因子–β、TIMP金属蛋白酶的组织抑制剂、TNFα肿瘤坏死因子-α、TNFR TNFα受体、THP Tamm-Horsfall蛋白、TLRToll样受体、TnI肌钙蛋白I、tPA组织纤溶酶原激活物、TSP血小板反应蛋白、Uri乌司他丁、uTi尿胰蛋白酶抑制剂、uPA尿激酶型纤溶酶原激活物、uPAR uPA受体、VCAM血管细胞粘附分子、VEGF血管内皮生长因子和YKL-40几丁质酶-3-样蛋白。

由胰腺组织高度表达或在胰腺中发现的目标稀有分子包括胰岛素、胰岛素原、c-肽、PNLIPRP1胰腺脂肪酶相关蛋白1、SYCN协同蛋白(syncollin)、PRSS1蛋白酶、丝氨酸、1(胰蛋白酶1)细胞内、CTRB2胰凝乳蛋白酶原B2细胞内、CELA2A胰凝乳蛋白酶样弹性蛋白酶家族、成员2A、CTRB1胰凝乳蛋白酶原B1细胞内、CELA3A胰凝乳蛋白酶样弹性蛋白酶家族、成员3A细胞内、CELA3B胰凝乳蛋白酶样弹性蛋白酶家族、成员3B细胞内、CTRC胰凝乳蛋白酶C(降钙素)、CPA1羧肽酶A1(胰腺)细胞内、PNLIP胰脂肪酶和CPB1羧肽酶B1(组织)、AMY2A淀粉酶、α2A(胰腺)、PDX1胰岛素启动子因子1、MAFA转录因子的Maf家族、GLUT2葡萄糖转运蛋白2型、ST8SIA1 α-N-乙酰神经氨酸苷α-2,8-唾液酸转移酶、CD9四跨膜蛋白、ALDH1A3醛脱氢酶、CTFR囊性纤维化跨膜电导调节剂以及糖尿病自身免疫抗体、诸如针对GAD、IA-2、IAA、ZnT8等。

稀有分子片段包括由以下已知天然作用于胰岛素的肽酶生成的胰岛素、胰岛素原或c肽的那些：古细菌溶血素(archaelysin)、十二指肠酶(duodenase)、钙蛋白酶1、ammodytase亚家族M12B肽酶、ALE1肽酶、CDF肽酶、组织蛋白酶E、甲基多巴α亚基、jerdohagin (Trimeresurus jerdonii)、羧肽酶E、二元加工内肽酶1、yapsin-1、yapsin A、PCSK1肽酶、氨基肽酶B、PCSK1肽酶、PCSK2肽酶、胰岛素溶酶(insulysin)、基质金属肽酶-9和其他。这些片段包括但不限于75%准确同源性内的以下序列：SEQ ID NO:1MALWMRLLPLLALLALWGP、SEQ ID NO:2 MALWMRLLPL、SEQ ID NO:3 ALLALWGPD、SEQ ID NO:4AAAFVN- QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR、SEQ ID NO:5 PAAAFVNQHLCGSHLVEAL- YLVC、SEQ ID NO:6 PAAAFVNQHLCGS、SEQ ID NO:7 CGSHLVEALYLV、SEQ ID NO:8 VEALYLVC、SEQID NO:9 LVCGERGF、SEQ ID NO:10 FFYTPK、SEQ ID NO:11REAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSL、SEQ ID NO:12 REAEDLQVGQVE、SEQ ID NO:13LGGGPGAG、SEQ ID NO:14 SLQPLALEGSL、SEQ ID NO:15 GIVEQCCTSICSL- YQLENYCN、SEQ IDNO:16 GIVEQCCTSICSLY、SEQ ID NO:17 QLENYCN和SEQ ID NO:18 CSLYQLE变型。变型包括天然和修饰的氨基酸。

胰岛素的稀有分子片段可用于基于片段的形成来测量作用于胰岛素的肽酶。这包括天然已知的肽酶以及添加至生物系统的其他肽酶的列表。胰岛素的额外稀有分子片段可用于基于片段的缺乏形成来测量作用于胰岛素的肽酶的抑制剂。这些抑制剂包括脂联素受体的c末端片段、双库尼茨抑制剂、乌司他丁以及抑制剂数据库中列出的古细菌溶血素、十二指肠酶、钙蛋白酶1、ammodytase亚家族M12B肽酶、ALE1肽酶、CDF肽酶、组织蛋白酶E、甲基多巴α亚基、jerdohagin (Trimeresurus jerdonii)、羧肽酶E、二元加工内肽酶、yapsin-1、yapsin A、PCSK1肽酶、氨基肽酶B、PCSK1肽酶、PCSK2肽酶、胰岛素溶素和基质金属肽酶9的其他已知的天然和合成抑制剂。

生物活性的治疗性蛋白和肽的稀有分子片段可用于测量其存在或不存在，以指示治疗有效性、稳定性、用法、代谢、对生物通路的作用(诸如用蛋白酶、肽酶、酶、受体或其他生物分子的作用)、抑制通路的作用以及与生物系统的其他相互作用。实例包括但不限于在批准的治疗性肽和蛋白的数据库(诸如http://crdd.osdd.net/)以及用于膳食补充剂、益生菌、食品安全性、兽医产品和化妆品用法的肽和蛋白的其他数据库中列出的那些。467种批准的肽和蛋白疗法的列表包括用于癌症、代谢性病症、血液病症、免疫学病症、遗传病症、激素病症、骨骼病症、心脏病症、传染病、呼吸系统病症、神经学病症、辅助疗法、眼部病症和吸收不良病症中的生物活性蛋白和多肽的实例。生物活性蛋白和肽包括用作抗凝血酶、纤溶酶、抗肿瘤剂、激素、生育剂、免疫抑制剂、骨相关剂、抗糖尿病剂和抗体的那些。

治疗性蛋白和肽的一些特定实例包括胰高血糖素、胃饥饿素、瘦素、生长激素、催乳激素、人胎盘、催乳素、促黄体激素、促卵泡激素、绒毛膜促性腺激素、促甲状腺激素、促肾上腺皮质激素、加压素、催产素、血管紧张素、副甲状腺激素、胃泌素、布舍瑞林、抗血友病因子、胰脂肪酶、胰岛素、门冬胰岛素、猪胰岛素、赖脯胰岛素、低精蛋白胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、甘精胰岛素、免疫球蛋白、干扰素、亮丙瑞林、denileukin、天冬酰胺酶、促甲状腺素、α-1 -蛋白酶抑制剂、艾塞那肽、白蛋白、凝血因子、阿糖苷酶α、鲑鱼降钙素、加压素、dpi真皮生长因子(EGF)、胆囊收缩素(CCK-8)、疫苗、人生长激素和其他。治疗性蛋白和肽的一些新实例包括GLP-1-GCG、GLP-1-GIP、GLP-1、GLP-1- GLP-2和GLP-1-CCKB。

由脂肪组织高度表达的目标稀有分子包括但不限于ADIPOQ脂联素、C1Q和含胶原蛋白结构域、TUSC5肿瘤抑制候选物5、LEP瘦素、CIDEA诱导细胞死亡的DFFA样效应子a、CIDEC诱导细胞死亡的DFFA样效应子C、FABP4脂肪酸结合蛋白4、脂肪细胞、LIPE、GYG2、PLIN1 周脂素1、PLIN4周脂素4、CSN1S1、PNPLA2、RP11-407P15.2蛋白LOC100509620、LGALS12凝集素、半乳糖苷结合、可溶性12、GPAM甘油-3-磷酸酯酰基转移酶、线粒体、PR325317.1预测蛋白、ACACB乙酰辅酶A羧化酶β、ACVR1C激活素A受体、IC型、AQP7水通道蛋白7、CFD补体因子D (抑渴蛋白)m CSN1S1酪蛋白αs1、FASN脂肪酸合酶GYG2糖原蛋白2KIF25驱动蛋白家族成员25 LIPE脂肪酶、含激素敏感的PNPLA2马铃薯糖蛋白样磷脂酶结构域2、SLC29A4溶质标记家族29(平衡核苷转运蛋白)、成员4、SLC7A10溶质标记家族7(中性氨基酸转运蛋白轻链、asc系统)、成员10、SPX Spexin激素和TIMP4 TIMP金属肽酶抑制剂4。

由肾上腺和甲状腺高度表达的目标稀有分子包括但不限于CYP11B2细胞色素P450家族11、亚家族B、多肽2、CYP11B1细胞色素P450、家族11、亚家族B、多肽1、CYP17A1细胞色素P450、家族17、亚家族A、多肽1、MC2R黑皮质素2受体(促肾上腺皮质激素)、CYP21A2细胞色素P450、家族21、亚家族A、多肽2、HSD3B2羟基-δ-5-甾体脱氢酶、3β-和甾体δ-异构酶2、TH酪氨酸羟化酶、AS3MT亚砷酸甲基转移酶、CYP11A1细胞色素P450、家族11、亚家族A、多肽1、DBH多巴胺β-羟化酶(多巴胺β-单加氧酶)、HSD3B2羟基-δ-5-甾体脱氢酶、3β-和甾体δ-异构酶2、TH酪氨酸羟化酶、AS3MT亚砷酸甲基转移酶、CYP11A1细胞色素P450、家族11、亚家族A、多肽1、DBH多巴胺β-羟化酶(多巴胺β-单加氧酶)、AKR1B1 醛-酮还原酶家族1、成员B1(醛糖还原酶)、NOV肾母细胞瘤过表达的、FDX1铁氧还蛋白1、DGKK二酰基甘油激酶、κ、MGARP线粒体定位的谷氨酸富集蛋白、VWA5B2含Von Willebrand因子A结构域的5B2、C18orf42染色体18开放阅读框42、KIAA1024、MAP3K15丝裂原激活的蛋白激酶激酶激酶15、STAR类固醇生成急性调节蛋白钾通道、亚家族K、成员2、NOV肾母细胞瘤过表达的、PNMT苯乙醇胺N-甲基转移酶、CHGB嗜铬粒蛋白B(分泌粒蛋白)1和PHOX2A配对样同源盒2a。

由骨髓高度表达的目标稀有分子包括但不限于DEFA4防御素α4皮质抑素、PRTN3蛋白酶3、AZU1天青杀素1、DEFA1防御素α1、ELANE弹性蛋白酶、嗜中性粒细胞表达的、DEFA1B防御素α1B、DEFA3防御素α 3嗜中性粒细胞特异性的、MS4A3跨膜4-结构域、亚家族A、成员3(造血细胞特异性)、RNASE3核糖核酸酶RNA酶A家族3、MPO髓过氧化物酶、HBD血红蛋白、δ和PRSS57蛋白酶、丝氨酸57。

由脑高度表达的目标稀有分子包括但不限于GFAP神经胶质纤维酸性蛋白、OPALIN少突胶质髓磷脂结节旁和内环蛋白、OLIG2少突胶质细胞谱系转录因子2、GRIN1谷氨酸受体离子移变的、N-甲基D-天冬氨酸1、OMG少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白、SLC17A7溶质标记家族17(囊泡谷氨酸转运蛋白)、成员7、C1orf61染色体1开放阅读框61、CREG2 E1A刺激的基因的细胞阻遏物2、NEUROD6神经元分化6、ZDHHC22含锌指DHHC型22、VSTM2B V-集合和含跨膜结构域2B和PMP2外周髓磷脂蛋白2。

由子宫内膜、卵巢或胎盘高度表达的目标稀有分子包括但不限于MMP26基质金属肽酶26、MMP10基质金属肽酶10(基质溶素2)、RP4-559A3.7未表征的蛋白和TRH促甲状腺激素释放激素。

由胃肠道、唾液腺、食道、胃、十二指肠、小肠或结肠高度表达的目标稀有分子包括但不限于GKN1胃动蛋白1、GIF胃内在因子(维生素B合成)、PGA5胃蛋白酶原5组I(胃蛋白酶原A)、PGA3胃蛋白酶原3、组I(胃蛋白酶原A、PGA4胃蛋白酶原4组I(胃蛋白酶原A)、LCT乳糖酶、DEFA5防御素、α5潘氏细胞特异性的、CCL25趋化因子(C-C基序)配体25、DEFA6防御素α6潘氏细胞特异性的、GAST胃泌素、MS4A10跨膜4结构域亚家族A成员10、ATP4A和ATPase、H+/K+交换α多肽。

由心脏或骨骼肌高度表达的目标稀有分子包括但不限于NPPB利钠肽B、TNNI3肌钙蛋白I 3型(心脏)、NPPA利钠肽A、MYL7肌球蛋白轻链7调节的、MYBPC3肌球蛋白结合蛋白C(心脏)、TNNT2肌钙蛋白T 2型(心脏)、LRRC10含亮氨酸富集重复10、ANKRD1锚蛋白重复结构域1(心肌)、RD3L视网膜变性3样、BMP10骨形态发生蛋白10、CHRNE胆碱能受体烟碱ε(肌肉)、以及SBK2 SH3结构域结合激酶家族成员2。

由肾脏高度表达的目标稀有分子包括但不限于UMOD尿调节素、TMEM174跨膜蛋白174、SLC22A8溶质标记家族22(有机阴离子转运蛋白)成员8、SLC12A1溶质标记家族12(钠/-钾/氯化物转运蛋白)成员1、SLC34A1溶质标记家族34(II型钠/磷酸转运蛋白)成员1、SLC22A12溶质标记家族22(有机阴离子/尿酸转运蛋白)成员12、SLC22A2溶质标记家族22(有机阳离子转运蛋白)成员2、MCCD1线粒体卷曲螺旋结构域1、AQP2水通道蛋白2(收集管)、SLC7A13溶质标记家族7(阴离子氨基酸转运蛋白)成员13、KCNJ1钾内向整流通道、亚家族J成员1和SLC22A6溶质标记家族22(有机阴离子转运蛋白) )成员6。

由肺高度表达的目标稀有分子包括但不限于SFTPC表面活性剂蛋白C、SFTPA1表面活性剂蛋白A1、SFTPB表面活性剂蛋白B、SFTPA2表面活性剂蛋白A2、AGER高级糖基化最终产物特异性受体、SCGB3A2分泌球蛋白家族3A成员2、SFTPD表面活性剂蛋白D、ROS1原癌基因1受体酪氨酸激酶、MS4A15跨膜4结构域亚家族A成员15、RTKN2 rhotekin 2、NAPSA napsin A天冬氨酸肽酶和LRRN4富含亮氨酸的重复神经4。

由肝脏或胆囊高度表达的目标稀有分子包括但不限于APOA2载脂蛋白A-II、A1BGα-1-B糖蛋白、AHSGα-2-HS-糖蛋白、F2凝血因子II(凝血酶)、CFHR2补体因子H相关2、HPX血液结合素、F9凝血因子IX、CFHR2补体因子H相关2、SPP2分泌的磷蛋白2(24kDa)、C9补体组分9、MBL2甘露糖结合的凝集素(蛋白C)2可溶性的和CYP2A6细胞色素P450家族2亚家族A多肽6。

由睾丸或前列腺高度表达的目标稀有分子包括但不限于PRM2鱼精蛋白2、PRM1鱼精蛋白1、TNP1转换蛋白1(在组蛋白至鱼精蛋白替换期间)、TUBA3C微管蛋白、α3cLELP1late角质化的包膜样富含脯氨酸的1、BOD1L2染色体在细胞分裂中的生物定向1样2、ANKRD7锚蛋白重复结构域7、PGK2磷酸甘油酯激酶2、AKAP4 A激酶(PRKA)锚定蛋白4、TPD52L3肿瘤蛋白D52样3、UBQLN3泛醌蛋白3和ACTL7A肌动蛋白样7A。

稀有细胞和稀有细胞标志物的实例

稀有细胞是与样品中的非稀有细胞的量相比，以相对小的量存在于样品中的那些细胞。在一些实例中，稀有细胞以怀疑含有稀有细胞的样品中的总细胞群体的约10^-8重量%至约10^-2重量%的量存在。短语“细胞稀有分子”是指在细胞中结合并且可以或不可以在样品中自由循环的稀有分子。这种细胞稀有分子包括可用于上述疾病的医学诊断中的生物分子，并且还包括所有稀有分子和先前描述为无细胞稀有分子的用途以及用于测量稀有细胞的生物分子的那些。稀有细胞可以是但不限于例如恶性细胞，诸如恶性肿瘤或癌细胞；循环细胞，内皮细胞(CD146)；上皮细胞(CD326/EpCAM)；间质细胞(VIM)，细菌细胞，病毒，皮肤细胞，性细胞，胎儿细胞；免疫细胞(白细胞诸如嗜碱性粒细胞，粒细胞(CD66b)和嗜酸性粒细胞)，淋巴细胞诸如B细胞(CD19、CD20)，T细胞(CD3、CD4、CD8)，浆细胞和NK细胞(CD56)，巨噬细胞/单核细胞(CD14、CD33)，树突状细胞(CD11c、CD123)，Treg细胞和其他)，干细胞/前体(CD34)，其他血细胞，诸如祖细胞，胚细胞，红细胞，凝血细胞，血小板(CD41、CD61、CD62)和未成熟细胞；来自组织诸如肝脏、脑、胰腺、肌肉、脂肪、肺、前列腺、肾脏、泌尿道、脂肪、骨髓、子宫内膜、胃肠道、心脏、睾丸或其他的其他细胞。

短语“细胞的群体”是指在其表面或细胞内部具有抗原或核酸的一组细胞，其中该抗原对于该组的所有细胞是共有的，并且其中该抗原是对于该细胞组特异性的。这种抗原或核酸被称为“稀有细胞标志物”。非稀有细胞是与样品中的稀有细胞的量相比以相对大量存在的那些细胞。在一些实例中，非稀有细胞是怀疑含有非稀有细胞和稀有细胞的样品中的总细胞群体中的稀有细胞的量的至少约10倍，或至少约10²倍，或至少约10³倍，或至少约10⁴倍，或至少约10⁵倍，或至少约10⁶倍，或至少约10⁷倍，或至少约10⁸。非稀有细胞可以是但不限于例如白血细胞、血小板和红血细胞。

术语“稀有细胞标志物”包括，但不限于，癌细胞类型生物标志物、癌症生物标志物、化学抗性生物标志物、转移性潜在生物标志物和细胞分型标志物、分化簇(名称或分类决定簇，经常缩写为CD)，其为用于鉴定和研究提供细胞的免疫表型分析的靶标的细胞表面分子的方案。癌细胞型生物标志物包括(通过举例说明而非限制的方式)例如细胞角蛋白(CK)(CK1、CK2、CK3、CK4、CKS、CK6、CK7、CK8和CK9、CK10、CK12、CK 13、CK14、CK16、CK17、CK18、CK19和CK2)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、N-钙粘素、E-钙粘素和波形蛋白。由于突变而可能治疗相关的致癌蛋白和致癌基因包括但不限于例如WAF、BAX-1、PDGF、JAGGED 1、NOTCH、VEGF、VEGHR、CAlX、MIB1、MDM、PR、ER、SELS、SEM1、PI3K、AKT2、TWIST1、EML-4、DRAFF、C-MET、ABL1、EGFR、GNAS、MLH1、RET、MEK1、AKT1、ERBB2、HER2、HNF1A、MPL、SMAD4、ALK、ERBB4、HRAS、NOTCH1、SMARCB1、APC、FBXW7、IDH1、NPM1、SMO、ATM、FGFR1、JAK2、NRAS、SRC、BRAF、FGFR2、JAK3、RA、STK11、CDH1、FGFR3、KDR、PIK3CA、TP53、CDKN2A、FLT3、KIT、PTEN、VHL、CSF1R、GNA11、KRAS、PTPN11、DDR2、CTNNB1、GNAQ、MET、RB1、AKT1、BRAF、DDR2、MEK1、NRAS、FGFR1和ROS1。

在某些实施方案中，稀有细胞可以是内皮细胞，其可以使用标志物(通过举例说明而非限制的方式)CD136、CD105/内皮因子、CD144/VE-钙粘素、CD145、CD34、Cd41CD136、CD34、CD90、CD31/PECAM-1、ESAM、VEGFR2/Fik-1、Tie-2、CD202b/TEK、CD56/NCAM、CD73/VAP-2、紧密连接蛋白5、Z0-1和波形蛋白进行检测。潜在的转移生物标志物包括但不限于尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、脂联素受体的C末端片段(脂联素受体C末端片段或脂联素CTF)、激酶(AKT-PIK3、MAPK)、血管粘附分子(例如，ICAM、VCAM、E-选择素)、细胞因子信号传导(TNF-α、IL-1、IL-6)、反应性氧化物质(ROS)、蛋白酶激活受体(PAR)、金属蛋白酶(TIMP)、转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、内皮透明质酸受体1 (LYVE-1)、缺氧诱导因子(HIF)、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、胎盘生长因子(PDF)、肝细胞生长因子(HGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、生长分化因子(GDF)、VEGF受体(可溶性Flt-1 )、微RNA(MiR-141)、钙粘素(VE、N、E)、S100 Ig-CTF核受体(例如，PPARα)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)、CD95、丝氨酸蛋白酶(例如，纤溶酶和ADAM，例如)；丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如，双库尼茨抑制剂)；基质金属蛋白酶(例如，MMP9)；基质金属蛋白酶抑制剂(例如，TIMP-1)；和DNA的氧化损伤。

化学抗性生物标志物包括(通过举例说明而非限制的方式)PL2L piwi样、5T4、ADLH、β-整联蛋白、α-6-整联蛋白、c-kit、c-met、LIF-R、趋化因子(例如，CXCR7、CCR7、CXCR4)、ESA、CD 20、CD44、CD133、CKS、TRAF2和ABC转运蛋白；缺乏CD45或CD31但含有指示癌症干细胞的CD34的癌细胞；以及含有CD44但缺乏CD24的癌细胞。

来自细胞的稀有细胞可以来自任何生物，其包括但不限于例如病原体，诸如细菌、病毒、真菌和原生动物；恶性细胞，诸如恶性肿瘤或癌细胞；循环内皮细胞；循环肿瘤细胞；循环癌症干细胞；循环癌症间充质细胞；循环上皮细胞；胎细胞；免疫细胞(B细胞、T细胞、巨噬细胞、NK细胞、单核细胞)；以及干细胞。在根据本文所述的原理的方法的一些实例中，待测试的样品是例如来自哺乳动物(诸如但不限于人受试者)的血液样品。

目标稀有细胞可以是免疫细胞，并且包括但不限于白血细胞(WBC)、Treg(调节性T细胞)、B细胞、T细胞、巨噬细胞、单核细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突状细胞、嗜酸性粒细胞和粒细胞的标志物。例如，白血细胞上存在的标志物诸如但不限于CD3、CD4、CD8、CD11c、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD31、CD33、CD45、CD52、CD56、CD 61、CD66b、CD123、CTLA-4、免疫球蛋白、蛋白受体和细胞因子受体以及其他CD标志物可用于指示细胞不是目标稀有细胞。

在具体非限制性实例中，白血细胞标志物包括CD45抗原(也称为蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型或PTPRC)，并且最初称为白细胞共同抗原可用于检测所有白血细胞。另外，CD45可以用于区分可能被视为稀有细胞的不同类型的白血细胞。例如，粒细胞由CD45+、CD15+或CD16+或CD66b+指示；单核细胞由CD45+、CD14+指示；T淋巴细胞由CD45+、CD3+指示；T辅助细胞由CD45+、CD3+、CD4+指示；细胞毒性T细胞由CD45+、CD3+、CDS+指示；B-淋巴细胞由CD45+、CD19+或CD45+、CD20+指示；凝血细胞由CD45+、CD61+指示；并且自然杀伤细胞由CD16+、CD56+和CD3-指示。此外，两种常用的CD分子，即CD4和CD8，一般分别用作辅助和细胞毒性T细胞的标志物。这些分子与CD3+组合界定，因为一些其他白细胞也表达这些CD分子(一些巨噬细胞表达低水平的CD4；树突状细胞表达高水平的CD11c和CD123。这些实例并不包括所有标志物，并且例如是唯一的。

在一些情况下，淋巴细胞的稀有分子片段包括作为淋巴细胞的部分产生的蛋白和肽，诸如免疫球蛋白链、主要组织相容性复合体(MHC)分子、T细胞受体、抗原性肽、细胞因子、趋化因子及其受体(例如，白介素、CXC趋化因子受体等)、程序性死亡配体和受体(Fas、PDL1和其他)以及作为淋巴细胞的部分或结合淋巴细胞的其他蛋白和多肽。

在其他情况下，所述稀有细胞可以是干细胞，并且包括但不限于干标记细胞的稀有分子片段，包括PL2L piwi样、5T4、ADLH、β-整联蛋白、α6整联蛋白、c-kit、c-met、LIF-R、CXCR4、ESA、CD 20、CD44、CD133、CKS、TRAF2和ABC转运蛋白，缺乏CD45或CD31、但含有指示癌症干细胞的CD34的癌细胞；和含有CD44、但缺乏CD24的癌细胞。干细胞标志物包括常见的多能性标志物，如FoxD3、E-Ras、Sall4、Stat3、SUZ12、TCF3、TRA-1-60、CDX2、DDX4、Miwi、MillGCNF、Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、TIF 1βPiwil、巢蛋白、整联蛋白、notch、AML、GATA、Esrrb、Nr5a2、C/EBPα、Lin28、Nanog、胰岛素、neuroD、脂联素、脂联素受体、FABP4、PPAR和KLF4等。

在其他情况下，所述稀有细胞可能是病原体、细菌或病毒或其组，其包括但不限于革兰氏阳性细菌(例如肠球菌属B群链球菌、凝血酶阴性葡萄球菌属草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和腐生葡萄球菌(saprophyicus)、乳杆菌属(Lactobacillus)和其抗性菌株，例如)；酵母，包括但不限于例如白色念珠菌(Candida albicans)；革兰氏阴性细菌，诸如但不限于例如大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、类白喉菌(Diphtheroids)(gnb)、Rosebura, 霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、Faecalibacterium prauznitzli、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseria)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、中间普雷沃菌(Prevotella Intermedia)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、挑剔真杆菌(E. eligens)、细长真杆菌(E. dolichum)、多形拟杆菌(B. thetaiotaomicron)、直肠真杆菌(E. rectale)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、多形拟杆菌(B. thetaiotaomicron)、拟杆菌属(Bacteroides)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、Vulgatus、脆弱芽孢杆菌(B. fragilis)，细菌分类群诸如厚壁菌门(Firmicuties) (梭状芽孢杆菌(Clostridia)、杆菌(Bacilli)、柔膜菌(Mollicutes))、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌(Actinobacteria)、蓝藻菌(Cyanobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)、古细菌(Archaea)、变形菌(Proteobacteria)和其抗性菌株；病毒，诸如但不限于例如HIV、HPV、Flu和MRSA；以及性传播疾病。在检测稀有细胞病原体的情况下，添加包含结合稀有细胞病原体群体的亲和剂的捕获颗粒。另外，对于病原体上细胞稀有分子的每个群体，添加包含结合群体中的细胞稀有分子的针对细胞稀有分子的亲和剂的试剂。

如上所提及，根据本文描述的原理的一些实例涉及检测细胞的方法，所述细胞包括天然和合成细胞。所述细胞通常来自怀疑含有靶稀有分子、非稀有细胞和稀有细胞的生物学样品。所述样品可以是生物样品或非生物样品。生物样品可以来自哺乳动物受试者或非哺乳动物受试者。哺乳动物受试者可以是例如人或其他动物物种。

用于进行方法的试剂盒

用于进行根据本文所述的原理的方法的设备和试剂可以存在于可用于方便地进行该方法的试剂盒中。在一个实施方案中，试剂盒在包装组合中包含用于待分离的一种或多种不同稀有分子的修饰的亲和剂。所述试剂盒还可以包含一种或多种用于细胞稀有分子的亲和剂、多孔基质、捕获颗粒以及用于喷雾、过滤和反应分析标记物的溶液。标记颗粒的组成可以例如如上面对于捕获颗粒实体所述。多孔基质和电极可以在组件中，其中所述组件可以具有通风孔、毛细管、腔室、液体入口和出口。所述多孔基质可以是可移除的或永久固定至组件。

取决于用于分析稀有分子的方法，在下文中更详细讨论的试剂可以用于或可以不用于在从稀有细胞和无细胞样品提取分子期间、之前或之后处理样品。

试剂盒中的各种试剂的相对量可以广泛变化，以提供基本上优化需要在本发明方法期间发生的反应的试剂浓度并且进一步优化方法的灵敏度。在适当情况下，试剂盒中的一种或多种试剂可以作为干粉提供，通常冻干，包含赋形剂，其一旦溶解，将提供具有适于进行根据本文所述的原理的方法的浓度的试剂溶液。试剂盒可以进一步包括利用根据本文所述的原理的试剂的方法的书面描述。

如本文所用，短语“至少”意指指定项目的数目可以等于或大于所述的数目。如本文所用，短语“约”意指所述的数目可以变化±10%；例如“约5”意指4.5至5.5的范围。

喷雾溶剂可以是电喷雾质谱法中采用的任何喷雾溶剂。在一些实例中，用于电喷射离子化的溶剂包括但不限于例如极性有机化合物，诸如例如醇(例如甲醇、乙醇和丙醇)、乙腈、二氯甲烷、二氯乙烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲亚砜和硝基甲烷；非极性有机化合物，诸如例如己烷、甲苯、环己烷；以及水，或其中两种或更多种的组合。任选地，溶剂可以含有一种或多种酸或碱作为改性剂(诸如例如挥发性盐和缓冲液，例如乙酸铵、碳酸氢铵；挥发性酸，诸如甲酸、乙酸、三氟乙酸、七氟丁酸、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸；和非挥发性盐或缓冲液，诸如例如钠和钾的氯化物和磷酸盐。

在许多实例中，以上提及的喷雾溶剂可能与以下组合使用：水性介质，其可以仅仅是水或也可以含有有机溶剂，诸如例如极性非质子溶剂；极性质子溶剂，诸如例如二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、有机酸或醇；以及可与水混溶的非极性溶剂，诸如例如二氧杂环己烷，其量为按体积计约0.1%至约50%，或约1%至约50%，或约5%至约50%，或约1%至约40%，或约1%至约30%，或约1%至约20%，或约1%至约10%，或约5%至约40%，或约5%至约30%，或约5%至约20%，或约5%至约10%。在一些实例中，水性介质的pH是范围为约4至约9的中等pH。各种缓冲液可以用于实现期望的pH并在任何孵育期期间维持pH。说明性缓冲液包括但不限于硼酸盐、磷酸盐(例如磷酸盐缓冲盐水)、碳酸盐、TRIS、巴比妥、PIPES、HEPES、MES、ACES、MOPS和BICINE。

细胞裂解试剂是涉及用裂解剂破坏细胞膜的完整性、由此释放细胞的细胞内内容物的那些。许多裂解剂是本领域中已知的。可以采用的裂解剂可以是物理和/或化学剂。物理裂解剂包括，例如，共混、研磨和超声处理，以及它们的组合或两种或更多种。化学裂解剂包括，但不限于，例如，非离子型去污剂、阴离子型去污剂、两性型去污剂、低离子强度水溶液(低渗溶液)、细菌剂和引起补体依赖性裂解的抗体，以及其两种或更多种的组合，以及以上的两种或更多种的组合。可以被用作裂解剂的非离子型去污剂包括合成去污剂和天然去污剂两者。

采用的裂解剂的性质和量或浓度例如取决于细胞的性质、细胞内容物的性质、待实施的分析的性质以及裂解剂的性质。裂解剂的量至少足以引起细胞的裂解以释放细胞的内容物。在一些实例中，裂解剂的量是(百分比以重量计)例如约0.0001%至约0.5%、约0.001%至约0.4%、约 0.01%至约0.3%、约0.01%至约0.2%、约0.1%至约0.3%、约0.2%至约0.5%、约0.1%至约0.2%。

通过举例说明而非限制的方式，可以使用去污剂、表面活性剂、溶剂和粘合剂以及上述中的两种或更多种的组合来实施脂质的去除。如上所讨论的作为裂解剂的表面活性剂或去污剂的使用完成细胞裂解和脂质的去除。用于去除脂质的试剂的量至少足以去除来自细胞膜的脂质的至少约50%，或至少约60%，或至少约70%，或至少约80%，或至少约90%，或至少约95%。在一些实例中，裂解剂的量是(重量百分比)例如约0.0001%至约0.5%、约0.001%至约0.4%、约 0.01%至约0.3%、约0.01%至约0.2%、约0.1%至约0.3%、约0.2%至约0.5%、约0.1%至约0.2%。

在一些实例中，可能期望从细胞去除蛋白或使其变性，其可以使用蛋白水解剂(例如诸如但不限于蛋白酶、热、酸、苯酚和胍盐以及其中两种或更多种的组合)来实现。蛋白水解剂的量至少足以降解细胞中的蛋白的至少约50%，或至少约60%，或至少约70%，或至少约80%，或至少约90%，或至少约95%。在一些实例中，裂解剂的量是(重量百分比)例如约0.0001%至约0.5%、约0.001%至约0.4%、约0.01%至约0.3%、约0.01%至约0.2%、约0.1%至约0.3%、约0.2%至约0.5%、约0.1%至约0.2%。

在一些实例中，将样品从受试者身体收集到合适的容器中，容器例如(但不限于)杯子、袋子、瓶子、毛细管或针。例如，血液样品可以收集到vacutainer®(容器。容器可以含有递送样品的收集介质。收集介质可以是干燥或液体的并且可以包括当与血液样品混合时有效实现血液样品中的血小板失活的量的血小板失活剂。

血小板失活剂可以添加至样品，诸如，但不限于，螯合剂，诸如例如包含三乙酸部分或其盐、四乙酸部分或其盐、五乙酸部分或其盐或六乙酸部分或其盐的螯合剂。在一些实例中，螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)和其盐或乙二醇四乙酸酯(EGTA)和其盐。血小板失活剂的有效量取决于例如以下中的一种或多种：血小板失活剂的性质、血液样品的性质、血小板活化的水平和离子强度。在一些实例中，对于作为抗血小板剂的EDTA，容器中无水EDTA的量是将产生约1.0至约2.0mg/mL血液或约1.5mg/mL血液的浓度的量。血小板失活剂的量是足以实现血小板失活的至少约90%或至少约95%或至少约99%的量。

通常采用中等温度，其可以例如范围为约5℃至约70℃或约15℃至约70℃或约20℃至约45℃。孵育期的时间段是例如约0.2秒至约6小时，或约2秒至约1小时，或约1分钟至约5分钟。

在许多实例中，以上组合提供于水性介质中，所述水性介质可以仅仅是水或也可以含有有机溶剂，诸如例如极性非质子或质子溶剂，诸如例如二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、有机酸或醇；以及可与水混溶的非极性溶剂，诸如例如二氧杂环己烷，其量按体积计为约0.1%至约50%，或约1%至约50%，或约5%至约50%，或约1%至约40%，或约1%至约30%，或约1%至约20%，或约1%至约10%，或约5%至约40%，或约5%至约30%，或约5%至约20%，或约5%至约10%。

采用的水性介质的量取决于大量因素，诸如例如但不限于样品的性质和量、试剂的性质和量、稀有细胞的稳定性和稀有分子的稳定性。在根据本文所述的原理的一些实例中，每10mL样品的水性介质的量是例如约5 mL至约100 mL，或约5 mL至约80 mL，或约5 mL至约60 mL，或约5 mL至约50 mL，或约5 mL至约30 mL，或约5 mL至约20 mL，或约5 mL至约10 mL，或约10 mL至约100 mL，或约10 mL至约80 mL，或约10 mL至约60 mL，或约10 mL至约50 mL，或约10 mL至约30 mL，或约10 mL至约20 mL，或约20 mL至约100 mL，或约20 mL至约80 mL，或约20 mL至约60 mL，或约20 mL至约50 mL，或约20 mL至约30 mL。

在稀有分子中的一种或多种是细胞的一部分的情况下，水性介质还可以包含用于裂解细胞的裂解剂。裂解剂是破坏细胞的基质的完整性、释放细胞的细胞内内含物的化合物或化合物的混合物。裂解剂的实例包括但不限于例如非离子型去污剂、阴离子型去污剂、两性去污剂、低离子强度水溶液(低渗溶液)、细菌剂、脂肪族醛和引起补体依赖性裂解的抗体。各种辅助物质可以存在于稀释介质中。水性介质中的所有物质都以足以实现期望的作用或功能的浓度或量存在。

在一些实例中，可能期望固定样品的蛋白、肽、核酸或细胞。固定使蛋白、肽、核酸的结构固定并保持且维持细胞处于近似于细胞处于类似体内的条件下的条件下和目标抗原能够被特定亲和剂识别的条件下。采用的固定剂的量是保持核酸或细胞、但不会在随后测定中导致错误结果的量。固定剂的量例如取决于固定剂的性质和细胞的性质中的一种或多种。在一些实例中，固定剂的量例如是以重量计约0.05%至约0.15%或约0.05%至约0.10%或约0.10%至约0.15%。用于实施细胞的固定的试剂包括但不限于例如交联剂，诸如例如醛类试剂(诸如例如甲醛、戊二醛和多聚甲醛)；醇(诸如例如C₁-C₅醇，诸如甲醇、乙醇和异丙醇)；酮(诸如C₃-C₅酮，诸如丙酮)。名称C₁-C₅或C₃-C₅是指醇或酮中的碳原子数目。可以使用缓冲水性介质，在固定细胞上进行一个或多个洗涤步骤。

在其中采用固定的实例中，核酸的提取可以包括在扩增前去固定的程序。通过举例说明而非限制的方式，可以采用例如能够逆转交联键的热或化学品或两者的组合来实现去固定。

在利用该技术的一些实例中，可能有必要使稀有细胞进行透化。透化使得能够穿过细胞膜接近目标核酸。采用的透化剂的量是破坏细胞膜并且允许接近核酸的量。透化剂的量取决于例如透化剂的性质和稀有细胞的性质和量中的一种或多种。在一些实例中，透化剂的量是例如以重量计约0.1%至约0.5%，或约0.1%至约0.4%，或约0.1%至约0.3%，或约0.1%至约0.2%，或约0.2%至约0.5%，或约0.2%至约0.4%，或约0.2% 至约0.3%。用于实施细胞的透化的试剂包括但不限于醇(诸如例如C₁-C₅醇，诸如甲醇和乙醇)；酮(诸如C₃-C₅酮，诸如丙酮)；去污剂(诸如例如皂苷、Triton® X-100和Tween®-20)。可以使用缓冲水性介质，在透化的细胞上进行一个或多个洗涤步骤。

以下实施例通过举例说明而非限制的方式进一步描述本发明的具体实施方案并且意欲描述且不限制本发明的范围。除非另有指示，否则本文公开的所有份数和百分比是以体积计。

实施例

除非另有说明，所有化学品均可购自Sigma-Aldrich Company (St. Louis MO)。

缩写：

WBC = 白血细胞

DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚

DMSO = 二甲亚砜(ThermoFisher Scientific)

min = 分钟

µm = 微米

mL = 毫升

mg = 毫克

µg = 微克

PBS = 磷酸盐缓冲盐水(3.2 mM Na₂HPO₄, 0.5 mM KH₂PO₄, 1.3 mM KCl, 135 mMNaCl, pH 7.4)

K₃EDTA = 乙二胺四乙酸钾盐

mBar = 毫巴

w/w = 重量比

RT = 室温

hr = 小时

QS = 足量

ACN = 乙腈

TFA = 三氟乙酸

TCEP = 三(2-羧乙基)膦盐酸盐 (Sigma-Aldrich)

SPDP = N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)

SH-NeutrAvidin = 巯基修饰的中性抗生物素蛋白

NeutrAvidin= 生物素的亲和剂

Ab = 抗体

mAb = 单克隆抗体

vol = 体积

MW = 分子量

wt. = 重量

分析细胞 = SKBR3人乳腺癌细胞(ATCC)

Her2nue = 人表皮生长因子受体2

分析物的变型 = 从裂解的SKBR3人乳腺癌细胞(ATCC)获得的Her2nue

Her2nue的亲和剂 = 单克隆抗Her2nue抗体(NB3克隆)(ATCC)

标记颗粒 = 丙胺官能化的二氧化硅纳米颗粒80 nm，

载玻片 = FISHERBRAND™ SUPERFROST™ Plus显微镜载片(ThermoFisherScientific Inc.)

封闭剂 = 酪蛋白，封闭溶液(Candor Biosience GmbH, Allgau Germany)

捕获颗粒 = 通过与颗粒直接缀合而制备的具有链霉抗生物素蛋白(Bangs Lab Inc.)与抗Her2nue抗体(来自ATCC的NB3克隆)的BioMag®羟基二氧化硅微粒(46.2 mg/mL，1.5 µm)

磁体 = 动态磁性颗粒浓缩器

多孔基质 = WHATMAN® NUCLEOPORE^TM轨道蚀刻基质，25 mm直径以及8.0和1.0 µM孔径

MS = 通过在Thermo LTQ(线性离子阱)质谱仪(来自Thermo Electron North AmericaLLC)上的纳米电喷雾离子化的质谱分析。

以下实施例根据本文所述的原理，其中通过如下分离样品中的分析物分子的变型的方法：经由通过X-Y键附接至颗粒的亲和剂使变型与颗粒结合，所述颗粒还通过X-Y键附接至分析标记物，和从所述样品分离所述颗粒，随后从颗粒移取分析标记物和通过测量在通过断裂与分析标记物的X-Y键的条件释放之后的分析标记物来测量分析物分子。

实施例1

通过X-Y键的分析标记物和亲和剂的颗粒附接

在以下利用–S-S-键(二硫化物)的实施例中显示通过X-Y键的亲和剂和分析标记物的附接。在本实施例中，将胺化的二氧化硅纳米颗粒(标记颗粒)悬浮于DMSO中至20 mg/mL的最终浓度。将SPDP溶解于分开管中的DMSO中至20 nmol/µL的最终浓度。将SPDP储备溶液逐滴添加至DMSO中的20 mg/mL胺化的二氧化硅纳米颗粒，同时轻轻涡旋。使混合物在RT下在恒定混合下反应至少60分钟。在反应时间之后，将反应混合物离心，去除并丢弃上清液，并将颗粒重悬浮于DMSO中。将该洗涤程序再重复3次，其后通过超声处理将SPDP反应的纳米颗粒重悬浮至3.3 mg/mL的最终浓度。

将包含游离SH的肽(分析标记物)溶解于PBS-EDTA中。将预先修饰为每个NeutrAvidin平均含有一个游离硫醇(经由用Traut氏试剂缀合)的NeutrAvidin(亲和标签)添加至含有分析标记物的溶液中。分析标记物和NeutrAvidin的最终浓度分别为近似1 mM和20 µM。向SH-肽/SH-中性抗生物素蛋白的溶液中添加SPDP修饰的纳米颗粒于DMSO中的悬浮液，并使反应物在室温下在搅拌下孵育过夜。反应之后，将颗粒用PBS洗涤3次，并重悬浮于1 mL PBS中。

为了在X是金属诸如Ni、Co、Fe或Cu时的情况下制备X-Y键，可以将二氧化硅胺纳米颗粒与螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)或其他缀合，以允许金属的结合。为了在X是金属诸如Pd、Ag或Au时的情况下制备X-Y，将二氧化硅胺纳米颗粒与作为螯合剂的巯基(-SH)基团缀合以允许金属的结合。通过形成作为硫化物、醚、酯、硫酯、酰胺、缩酮、硫代酰胺、N-氧化物、氮-氮或硫醚的键，通过作为S、O、C、P、N、B、Si的Y，将与二氧化硅胺标记物缀合的金属附接至亲和剂或分析标记物。这些键可通过标准的螯合金属有机化学品(诸如O、C、P、N或B阴离子)形成，以与金属基团形成键。为了在X是有机原子(诸如O、C、P、N或B)时的情况下制备X-Y键，将二氧化硅胺纳米颗粒与连接剂缀合，其中X基团附接至羧酸且Y基团附接至胺基。羧酸附接至二氧化硅胺纳米颗粒，且胺基附接至亲和剂和分析标记物。然后可以改变X-Y键，以包括-S-S-硫化物、-C-O-醚、-[C=O]-O-C-酯、-[C=O]-S-C-硫酯、-[C=O]-N- C酰胺、(-C-O-)₂缩酮、[C=O]-N- S硫代酰胺、-N-O- N-氧化物、-N-N-氮-氮或-S-O-硫醚。

实施例2

用来自实施例1的颗粒分离分析物分子的变型

在以下实施例中显示通过经由亲和剂使变型与颗粒结合来分离分析物分子的变型，其使用人表皮生长因子受体2(Her2nue)作为样品中的分析物分子的变型的实例。发现Her2nue蛋白通过图1中显示的机理被切割并转化为许多变型。通过经由Her2nue的亲和剂(其与生物素缀合)(亲和标签)使变型与颗粒结合来表明分离。

在本实施例中，NeutrAvidin充当生物素的亲和剂，并且通过X-Y键(在本实施例中为S-S-键)与颗粒结合。标记颗粒还通过相同的S-S键附接有分析标记物。在本实施例中，以两种方式证明从样品分离颗粒。在第一种情况下，颗粒与细胞(即SKBR3细胞)上的Her2nue变型结合，并且结合的颗粒经由大小排阻过滤与该细胞分离。在第二种情况下，将颗粒与不含细胞(即来自裂解的SKBR细胞)的Her2nue结合变型结合，并用具有Her2nue的第二亲和剂的捕获颗粒分离与颗粒结合的Her2nue。通过磁力移取具有与颗粒结合的Her2nue的捕获颗粒。

通过离心500 µL含有近似2x105个癌细胞(SKBR3)细胞/mL的溶液，以细胞形式制备Her2nue蛋白。添加约1 mL的PBS来洗涤细胞沉淀，其通过将管颠倒几次以混合、以2000的相对离心力再次离心3 min并去除洗涤液来实现。通过如下使细胞透化：添加1 mL的PBS中的0.2% Triton-X，将管颠倒几次并孵育7分钟，随后洗涤。通过添加1 mL片段化酪蛋白缓冲液并将混合物轻轻涡旋混合来将细胞封闭以减少非特异性结合。将混合物再次离心，去除液体，并再一次重复洗涤步骤。将细胞混合物用PBS稀释至1 mL，并在显微镜下检查10 μL样品以测定细胞计数。通过裂解细胞以无细胞形式制备Her2nue蛋白。通过从健康供体收集血液(每个供体9 mL)来制备用于测试的样品，并在Transfix管中储存最长达5天。向血液样品中掺入Her2nue变型，其为使用储备物以得到~1000个细胞/0.5 mL的SKBR3人乳腺癌细胞(ATCC)细胞。还向第二血液样品中掺入约~1000个裂解的SKBR3细胞，掺入0.5 mL血液中，以提供无细胞的分析物分子的变型。

为了分离无细胞的Her2nue分子的变型，首先通过向1 mL样品中添加50μL捕获颗粒来将具有裂解的SKBR3细胞的样品捕获于捕获颗粒(与抗Her2nue抗体缀合的磁珠)上。通过颠倒混合样品，并将混合物在室温下孵育15分钟，以使颗粒捕获无细胞的Her2nue分子的变型。这随后添加标记颗粒连同额外的Her2neu亲和剂。通过将管以1700g离心3分钟(或在具有1 µm孔的多孔膜上过滤或用磁体捕获至小瓶的壁)来分离捕获颗粒，并去除上清液。用250 µL PBS稀释磁珠，以悬浮珠粒的沉淀。将颗粒用PBS洗涤5次。

为了分离细胞Her2nue分子的变型，首先根据先前公开的方法使用提供流体动力的真空将SKBR3细胞捕获于多孔基质上(Pugia等人, A Novel Strategy for Detectionand Enumeration of Circulating Analyte Cell Populations in Metastatic CancerPatients Using Automated Fluidic Filtration and Multiplex Immunoassay PLoSONE 014166 (2015))。将具有完整SKBR3细胞和WBC的全血稀释于PBS中，并根据如前面所述的过滤方法过滤通过。该方法的唯一改变是对装有多孔基质的标准ELISA板使用真空过滤单元(Biotek Inc)。将样品过滤通过具有8.0 μm孔的膜。在过滤期间，使多孔基质上的样品经受负压，即与大气压相比降低大于约-100 mBar。过滤期间应用的真空从-10至-100 mBar变化。将稀释的样品在不混合的情况下置于过滤站中，并将稀释的样品过滤通过多孔基质。对于每种样品，SKBR3细胞的回收率为>60%。

然后通过亲和反应使分离的SKBR3细胞与标记颗粒反应，并根据先前公开的方法和颗粒进行。总之，过滤后，将多孔基质用PBS洗涤，并将样品用甲醛固定，用PBS洗涤，使用PBS中的0.2% TRITON® X100进行透化，并再次用PBS洗涤。采用封闭步骤，其中将10%酪蛋白于PBS中的封闭缓冲液分配在基质上。5 min的孵育时段后，将基质用PBS洗涤以封闭与基质的非特异性结合。对于第一亲和反应进行封闭步骤和透化步骤，并且对于第二和第三亲和反应不重复。每个亲和反应后进行五次PBS TWEEN®表面活性剂洗涤。然后使用亲和反应和免疫细胞化学(ICC)与附接至CK8/18的抗体的荧光标记物来测量稀有细胞。Her2nue的mAb与SBKR细胞结合，而不与WBC结合，如显示SBKR3细胞中仅存在Dy550的显微镜所表明。

在两种情况下，样品都被非稀有分子(诸如白血细胞(WBC)和红血细胞(RBC))污染。在细胞情况下，WBC中的SBKR细胞的纯度在0.1%和0.01%之间。无论是使用捕获颗粒还是在SBKR3细胞中用结合目标片段且不结合污染的WBC或RBC的抗体，捕获高百分比的Her2nue分子变型(>80%)。无论是否将更多的Her2nue亲和剂(TA1或NB3克隆)附接至相同颗粒并且当用不同的亲和剂和独特的分析标记物附接至不同的颗粒时，该方法都有效。

实施例3

通过断裂来自颗粒的X-Y键来移取分析标记物

首先用试剂处理分离的细胞或颗粒以断裂X-Y键并从标记颗粒释放分析标记物。在–S-S-的X-Y键的情况下，将样品用10 µL释放溶液(10 mM TCEP，5 nM内标，在10 mM乙酸铵缓冲液中，pH 4.5)处理以释放分析标记物。通过质谱(MS)分析表明>90%捕获和释放效率。进行一系列实验以计算分析灵敏度，以检测全血样品中的细胞和无细胞Her2nue分子变型。通过测量具有添加至全血中的0、50、100、200、500和1000个完整或裂解的SKBR3细胞的样品，测定观察到的分析灵敏度。方法限值被确定为零水平信号的10倍，并通过经由显微镜技术光学计数细胞捕获数来证实。使用多种类型的分析标记物、显微光学、质谱、化学发光、电化学和显微荧光读出值，并且检测限值是相当的，并且典型检测限值报告于表1中。另外，细胞和无细胞检测限值是相当的，并且典型检测限值报告于表1中。

表1. 检测限值的比较

<i>情况</i>	<i>与标记物的-X-Y-键</i>	<i>与亲和剂的-X-Y-键</i>	<i>与亲和标签的-X-Y-键</i>	<i>检测限值(细胞)</i>
					<i>1</i>	不可断裂的	不可断裂的	无	~5000-10,000
<i>2</i>	可断裂的	可断裂的	无	~100-400
					<i>3</i>	可断裂的	无	可断裂的	~1000-3000
<i>4</i>	可断裂的	不可断裂的	无	~100-400
					<i>5</i>	可断裂的	可断裂的(多种抗体)	无	~10-100
<i>6</i>	可断裂的	可断裂的(多种颗粒)	无	~10-100

实例2、4、5和6的检测限值显示于表1中的数据中，其根据本文所述的原理，并且涉及通过使所有分析物的变型与具有分析标记物的颗粒结合来分离样品中的分析物的变型的方法；其中多个相同的亲和剂通过X-Y键附接至颗粒，但不通过断裂X-Y键的条件而释放。在实例1中，使用不可断裂的X-Y键，与其中X-Y键是可断裂的实例2相比，该方法灵敏度低得多，并且不能检测到~100-400个SKBR3细胞。令人惊讶地，如果如实例3中那样用亲和标签替代颗粒上的亲和剂，则该方法不能检测到实例2的~100-400。如所预期，如果如实例5中那样在颗粒上使用多种亲和剂，或如根据本发明使用具有不同亲和剂的多种颗粒，则该方法能够检测到比实例2的~100-400甚至更少的细胞。另外，如果与亲和剂的X-Y键不断裂，则检测到的细胞数目仍然与实例2相同。总之，这表明本发明的益处是使分析标记物和亲和剂通过X-X键附接至颗粒。

本申请中引用的所有专利、专利申请和出版物，包括那些专利、申请和出版物中所有引用的参考文献，出于所有目的以其整体通过引用并入本文，其程度如同每个单独的专利、专利申请或出版物都被单独表示如此一样。

尽管本发明的许多实施方案已经在上面公开并且包括目前优选的实施例方案，但在本公开的范围内以及以下所附权利要求中，许多其他实施方案和变型是可能的。因此，提供的优选实施方案和实施例的细节不应解释为限制性的。应当理解，本文使用的术语仅仅是描述性的而不是限制性的，并且在不脱离请求保护的发明的精神或范围的情况下，可以做出各种改变、许多等同方案。

参考文献

1. Karen A. Sap和Jeroen A. A. Demmers (2012). Labeling Methods in MassSpectrometry Based Quantitative Proteomics, Integrative Proteomics, Dr. Hon-Chiu Leung (编), ISBN: 978-953-51-0070-6, InTech, 可得自: http://www.intechopen.com/books/integrative- proteomics/labeling-methods-in-mass-spectrometry-basedquantitative-proteomics

2. Y. Zhu, R. Valdes Jr., C. Q. Simmons, M. W. Linder, M. J. Pugia, S. A.Jortani. Analysis of Ligand binding by Bioaffinity Mass Spectrometry. ClinChem Acta 371(1-2), 71-8 (2006).

3. Robert Popp · David Malmström · Andrew G Chambers, D. Lin, A. GCamenzind, J Grace van der Gugten, D. T. Holmes, M. Pugia, M. Jaremek, SCornett , D. Suckau, C H Borchers AAn Automated Assay for the ClinicalMeasurement of Plasma Renin Activity by immuno- MALDI (iMALDI). Biochimica etBiophysica Acta - Proteins & Proteomics 10/; 1854(6) (2014).

4. Dmitry R. Bandura, Vladimir I. Baranov, Olga I. Ornatsky, AlexeiAntonov, Robert Kinach, Xudong Lou, Serguei Pavlov, Sergey Vorobiev, John E.Dick, 和Scott D. Tanner. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single CellMultitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-FlightMass Spectrometry. Anal. Chem. 2009, 81, 6813– 6822

5. Jung Rok Lee, Juhee Lee, Sang Kyung Kim, Kwang Pyo Kim, Hyung SoonPark, Woon-Seok Yeo. Mass Spectrometry Signal Amplification Method forAttomolar Detection of Antigens Using Small-Molecule-Tagged GoldMicroparticles Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9518 –9521

6. M. Pugia等人 Immunological evaluation of urinary trypsin inhibitors inblood and urine: Role of N- & O-linked glycoproteins Glycoconj J (2007) 24:5–15

7. 共同拥有的2018年3月30日提交的题为Methods And Apparatus For Removal OfSmall Volume From A Filtration Device的在审美国申请号15/941,059和2018年3月30日提交的题为Methods And Apparatus For Selective Nucleic Acid Analysis的在审美国申请号15/941,125，其都通过引用并入本文。

序列表

<110> Pugia, Mike Joseph

Baird, Zane

Cao, Zehui

<120> 用于完整和片段化的标志物的方法

<130> IBRI004PCT

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Trp Gly Pro

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

Ala Leu Leu Ala Leu Trp Gly Pro Asp

1 5

<210> 4

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu

1 5 10 15

Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

20 25 30

Thr Arg

<210> 5

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val

1 5 10 15

Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys

20

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser

1 5 10

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val

1 5 10

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

1 5

<210> 11

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly

1 5 10 15

Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu

20 25 30

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu

1 5 10

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly

1 5

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu

1 5 10

<210> 15

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn

20

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 17

Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

1 5

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 18

Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 20

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly

1 5 10 15

Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro

20 25 30

Gln Gly Gln Arg Glu Pro

35

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 21

Gly Val Met Pro Arg Glu Glu Thr Asp Ser Lys Thr Ala Ser Pro Trp

1 5 10 15

Lys Ser Ala Arg

20

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 22

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 23

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 24

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 25

Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Glu

1 5 10 15

Claims (19)

1.分离和测量分析物样品中的变型的方法，所述方法包括：

(a)使具有变型的所述分析物样品与具有附接的分析标记物的颗粒结合；

(b)从所述样品分离所得的颗粒，

(c)从所述颗粒移取所述分析标记物；和

(d)通过测量分析标记物来测量分析物分子。

2.权利要求1的方法，其中所述分析标记物通过X-Y键附接至所述颗粒，并且通过断裂所述X-Y键而释放。

3.权利要求1的方法，其中所述分析物的变型通过一种或多种亲和剂与所述颗粒结合。

4.权利要求1的方法，其中所述亲和剂通过X-Y键附接并通过断裂X-Y键而释放。

5.权利要求2的方法，其中用于附接所述分析标记物的X-Y键是硫化物、醚、酯、硫酯、酰胺、缩酮、硫代酰胺、N-氧化物、氮-氮或硫醚。

6.权利要求4的方法，其中用于附接所述亲和剂的X-Y键是硫化物、醚、酯、硫酯、酰胺、缩酮、硫代酰胺、N-氧化物、氮-氮或硫醚。

7.权利要求2的方法，其中X-Y选自S、O、C、P、N、B、Si、Ni、Pd、Fe Co、Ag、Cu或Au。

8.权利要求4的方法，其中X-Y选自S、O、C、P、N、B、Si、Ni、Pd、Fe Co、Ag、Cu或Au。

9.权利要求2的方法，其中所述X-Y键可以是长接头基团的一部分，以引起在亲和剂或分析标记物和标记颗粒之间的空间。

10.权利要求3的方法，其中分析物的多种变型的所述亲和剂附接至相同颗粒。

11.权利要求1的方法，其中多种颗粒用不同的亲和剂结合变型并具有附接至所述颗粒的分析标记物。

12.权利要求1的方法，其中所述分析物的变型可以是人造的或天然来源的。

13.权利要求1的方法，其中所述分析物的变型可以是生物活性的或非生物活性的分子。

14.权利要求1的方法，其中所述分析物的变型可以是细胞的或无细胞的。

15.权利要求1的方法，其中所述分析物的变型可以是引起抑制变型的其他分子的测量值。

16.权利要求1的方法，其中分析物的变型可以是有意的或通过片段化、添加或结合而生成。

17.权利要求1的方法，其中所述分析物的变型可以是代谢物、辅因子、底物、氨基酸、金属、维生素、脂肪酸、生物分子、肽、碳水化合物或其他以及大分子，如糖缀合物、脂质、核酸、多肽、受体、酶、蛋白以及细胞和组织，包括细胞结构、过氧化物酶体、内质网、内体、外排体、溶酶体、线粒体、细胞骨架、膜、核、细胞外基质或通常测量的其他分子。

18.权利要求1的方法，其中通过多孔基质、捕获颗粒、细胞或磁性颗粒或其组合移取结合分析物的变型的颗粒。

19.权利要求1的方法，其中通过质谱、荧光、化学发光或光学标记物或其组合来检测分析标记物。

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