KR20200016835A - 완전하고 단편화된 마커를 위한 방법 - Google Patents

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마이클 조셉 푸기아
제인 베어드
제후이 차오
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인디애나 바이오사이언시스 리서치 인스티튜트, 인코포레이티드
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Abstract

본원에 기재된 발명은 변종을, 부착된 분석학적 표지를 사용하여 입자에 결합시키고 상기 입자를 샘플로부터 분리함에 이어서 입자로부터 분석학적 표지를 제거하고 분석학적 표지를 측정하여 분석물 분자를 측정함에 의해 샘플 중에 모든 분석물 변종의 단리 방법에 관한 것이다. 상기 입자 상에 분리된 분석학적 표지는 이어서 또한 분석물 결합 변종의 변화를 측정하기 위해 사용될 수 있다.

Description

완전하고 단편화된 마커를 위한 방법
본 출원은 “완전하고 단편화된 마커를 위한 방법”이란 발명의 명칭으로 2017년 4월 1일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/480,370호를 35 U.S.C. 섹션 119 하에 우선권으로 주장하고 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
본 발명은 비-희귀 분자에 비해 희귀 분자를 농축시키고 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 일부 양상에서, 본 발명은 희귀 분자들 및 비-희귀 분자들의 하나 이상의 상이한 집단을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 중에 희귀 분자들의 하나 이상의 상이한 집단을 검출하기 위한 방법, 장비 및 키트에 관한 것이다. 일부 양상에서, 본 발명은 샘플 중에서 자유롭게 순환하는 희귀 분자들의 하나 이상의 상이한 집단을 검출하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다. 다른 양상에서, 본 발명은 희귀 분자들 및 비-희귀 분자들의 하나 이상의 상이한 집단을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 중에 희귀 세포들과 연관된 희귀 분자들의 하나 이상의 상이한 집단을 검출하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.
10 μL 당 1 내지 50,000 카피물 (펨토몰 (fM) 이하)의 범위에서 희귀 분자들의 검출은 희귀 분자에 대해 발견되는 것들을 훨씬 초과하는 분자 카피수를 필요로 하는 통상적인 친화성 검정에 의해 성취될 수 없다. 예를 들어, 면역검정은 전형적으로 1피코몰 (pM) 이하의 검출 한계치를 성취할 수 없다. 면역검정은 전형적으로 10-12 (1 pM) 보다 높지 않은, 항체의 친화성 결합 상수에 의해 제한된다 . 면역검정은 오프-레이트 (off-rate)는 일반적으로 10-13이고 샘플 중 모든 분석물의 완전한 결합은 항체 용해도에 의해 제한됨으로써 적어도 100배의 항체 과량을 요구한다. 동일한 항체 용해도 문제는 통상적인 면역검정이 서브-아토몰(sub-attomolar) 검출 수준에 도달하지 못하게 한다.
세포 결합되거나 세포 내 함유된 희귀 분자의 검출은 또한 단일 세포로부터 파생될 수 없는 질환 진단에서와 같은 의학적 적용에 중요하다. 희귀 분자를 순환시키는 검출은 희귀 및 비-희귀 분자의 혼합물을 함유하는 샘플에 의해 복잡해진다. 상기 물질은 세포성 물질, 예를 들어, 세포 내부 물질 또는 “무세포” 물질 및 임의의 온전한 세포에 의해 결합되거나 연합되어 있지 않은 물질일 수 있다. 무세포 희귀 분자는 예를 들어, 조직 내 암의 진단과 같은 의학적 적용에 중요하다. 암의 경우에, 희귀 분자들은 조직으로부터 순환계로 방출되고 무세포 희귀 분자들은 신체 전반에 걸쳐 분포된 환부 조직, 예를 들어, 종양 내 희귀 분자들의 총양과 상호 관련되는 것으로 이해된다. 무세포 분석은 샘플 중 모든 분자들의 매우 작은 분획으로부터 순환 희귀 분자들의 단리 및 검출을 요구한다. 무세포 분자가 조직 내 병에 걸린 세포로부터 말초 혈액으로 방출되는 경우, 이들 분자들은 건강한 세포로부터 방출되는 분자들과 혼합된다. 예를 들어, 대략 109개 세포들이 1 cm3의 환부 조직에 존재한다. 상기 조직 매쓰가 5 L의 혈액(평균 성인의 혈액 용적)으로 완전히 용해된 경우, 이것은 단지 10mL 혈액 당 2백만 세포이고 이들 각각이 비-희귀 분자를 방출하는, 10mL의 혈액 당 7천5백만 백혈구 및 500억 적혈구가 있는 것을 고려하여, 희귀한 것으로 고려된다.
샘플 중 펩타이드 및 단백질 변화의 복잡성은 각각의 단백질 및 펩타이드의 측정이 요구되는 경우 유의적 문제를 유발한다. 이들 변화의 문제는 펩타이드 및 단백질 단리를 위해 항체를 사용하는 연구에서 SELDI 친화성 매쓰 분광측정 방법을 사용하여 입증되었다(문헌참조: Pugia, Glycoconj J 2007). 펩타이드 및 단백질은 효소 작용하에 생물학적 시스템에서 단편화되고 해독 후 변형을 진행하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 뇨 트립신 억제제의 고도의 변화는 단편화의 결과로서 및 검출된 수백개의 상이한 형태와의 당-접합의 결과로서 상이한 환자들의 생물학적 샘플 중에 검출되었다. 검출된 형태는 환자, 질환, 샘플 유형 및 단리를 위해 사용되는 친화성 제제에 의존한다. 특유의 친화성 제제는 다른 환자에 대해 상이한 교차 반응성을 나타냈다. 상기 변화는 분석에 대한 문제점을 유발한다. 예를 들어, 동일한 펩타이드 또는 단백질로부터 기원하는 별도의 특유한 단편의 측정은 흔히 상이한 결과를 생성한다. 상기 단편이 다소 유의적인지의 결정이 요구되고, 유사 단편의 합계가 요구될 수 있고, 방법을 위해 사용되는 친화성 시약은 특정 단편에 다소 반응성일 수 있다. 펩타이드 및 단백질의 변화는 이들 변종이 변종의 기능을 변화시킬 수 있는 다른 생분자들에 의해 결합됨에 따라 증가한다.
펩타이드 및 단백질 내 고도의 변화는 면역검정 방법이 흔히 각각의 변종을 독립적으로 검출할 수 있어야만 함으로 문제가 된다. 샌드위치 면역검정은 전형적으로 분석물의 특유 단편 또는 형태를 특이적으로 측정하기 위해 사용되고 2개의 별도의 위치에 결합함에 의해 변화를 측정하는 것에 의존한다. 샌드위치 면역검정은 2개의 별도의 항체가 동일한 단편에 결합하기 위해서는 적당한 공간을 요구하지만, 이들 단편은 상기 다른 변종과 동일한 펩타이드 또는 단백질 영역을 함유함으로써 영역들은 흔히 특이적 검정용 항체로의 결합을 위해 적합하지 않다. 다른 생분자에 의한 추가의 결합은 항체로의 차단일 수 있거나 교차 반응성을 유발한다. 시스테인은 디설파이드 결합을 형성할 수 있고 다른 2차 분자는 단편에 결합할 수 있거나 절단되어 항체 결합을 변화시켜 면역검정에 의한 고도로 변화된 펩타이드 및 단백질의 측정에서 여러 문제점들이 나타난다. 다중복합체화는 대부분의 방법이 화학발광성, 형광성 또는 색측정 이든 상관 없이 동일한 분석 내 동시 측정을 위한 제한된 수의 분석될 수 있는 신호를 제공하는 광학 검출 표지를 사용함으로써 면역검정 방법에 대해 또 다른 문제이다. 상기 이유 때문에, 수백개 내지 수천개의 변화 분석은 광학 시스템에 대한 문제이다. 이들 방법은 비용 및 복잡성을 증가시키는 다중복합체화된 패널 및 어레이에서 다중의 별도의 측정을 요구한다.
고도의 변화의 문제점을 해결하기 위한 통상의 대안적 방법은 효소, 프로테아제 및 펩티다제의 작용을 위한 기질로서 측정될 펩타이드 또는 단백질의 사용을 통해서이다. 이들 측정은 관찰된 프로테아제 활성을 기준으로 하고 효소, 프로테아제 및 이의 억제제를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들 방법을 사용하여 트립신 패밀리의 세린 프로테아제 (엘라스타제, 카뎁신, 트립타제, 트립신, 칼리크레인, 트롬빈, 플라스민 및 인자 VII 및 X) 및 이들의 억제제(비쿠닌, 우리스타틴 및 뇨 트립신 억제제) (문헌참조: Corey US6955921)를 분석하였다. 이들 경우에, 상기 펩타이드는 아미노산 절단 부위에서 형광단에 부착된, 기질로서 사용된다. 프로테아제에 의한 절단 시, 단편은 방출되고 활성화되어 색을 생성한다. 억제제의 농도는 공지된 양의 프로테아제가 첨가된 경우 측정된다. 여기서, 억제제의 양은, 억제제가 프로테아제의 활성을 감소시키기 때문에 방출된 기질의 양에 반비례한다. 그러나, 형광단은 색이 샘플 pH, 산화물, 환원물 또는 반응물에 의해 역전되거나 미성숙하게 생성되는 경우 간섭에 민감하다.
펩타이드 또는 단백질 기질을 측정하기 위한 질량 분광측정기를 형광단과 연관된 문제를 제거하기 위해 사용하였다. 예를 들어, 이것은 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템에 대해서 나타났다. 상기 시스템에서, 안지오텐시노겐 I (Ang I) (DRVYIHPFHL)는 레닌에 의한 효소적 절단에서 2개 C-말단 아미노산의 절단에 의해 Ang II (DRVYIHPF)로 전환된다(문헌참조: Popp 2014). Ang I의 측정은 안정한 동위원소-표지된 AngI로부터 내인성 AngI를 동시에 포획하기 위해 친화성 비드에 고정화된 항-AngI 항체를 사용함에 의해 혈장 레닌 활성 검정을 가능하게 한다. 혈장 샘플을 스플릿하고 빙상에서 3시간 동안 37 ℃에서 항온처리하였다. 2개 혈장 항온처리 조건에 대한 AngI 농도에서의 차이에 대한 결정은 환자의 혈장 레닌 활성의 계산을 가능하게 한다. 상기 효소, 프로테아제 및 펩티다제 검정은 여전히 활성이 샘플 pH, 샘플 안정성, 억제제, 조인자, 시간 및 온도에 의해 억제되거나 활성화되는 경우 간섭에 민감하다.
질량 분광측정 (MS)은 매우 민감하고, 작은 샘플 소비 (1마이크로리터(μL) 이하)와 함께 pM 농도 미만으로 소분자를 검출하기 위해 매우 적합한 특이적 기술이다. MS는 또한 표지된 시약에 대한 필요 없이 단일 검정에서 복합 생물학적 매질 내 존재하는 수백개의 성분들 (다중복합체화)을 동시에 측정하는 능력을 갖는다. 상기 방법은 생물학적 복잡성이 중복 신호 (동중원자핵 변화 간섭)을 유발하거나 이온 억제를 유발할때까지 특이성 및 민감성을 제공한다. 액체 크로마토그래피 (LC-MS)와 같은 예비-분리와 MS의 커플링 단계는 민감성을 증가시키고 동중원자핵 변화 간섭을 제한하여 매우 풍부한 비-분석물 샘플 성분들에 의한 이온 억제를 극복하기 위해 광범위하게 사용되는 방법이지만 이것은 분석 전개 시간, 비용 및 샘플 제조 복잡성을 크게 증가시킨다. 탠덤 MS (MS/MS)는 높은 백그라운드 간섭의 경우에 신호 대 노이즈를 증가시키는 것 뿐만 아니라 동중원자핵 변화 분석물 (동일한 모 질량 대 전하 (m/z)를 공유하는)을 구분하는 것 둘다에 사용될 수 있고, 질량 분광측정기 내 특유의 단편화를 나타내지만, MS/MS 데이터의 분석은 특히 해독 후 변형된 단백질 및 펩타이드의 경우에 단순한 작업이 아니고 여전히 특히 불량하게 이온화될 수 있는 단편의 경우에 이온 억제 효과를 나타낸다. 비행시간 질량 분광측정기(time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF))를 사용한 매트릭스-원조 레이져 탈착/이온화는 소량의 분자의 높은 민감성 분석을 매우 적합하지만 샘플 복잡성 및 매트릭스 간섭은 흔히 동중원자핵 변화 간섭을 유도한다.
현재 MS의 상태는 혈액과 같은 복잡한 샘플 중에서 관심 대상의 마커(샘플 제제)를 분리하지 못하는 무능력, 임상 샘플에서 높은 백그라운드로 인한 민감성 상실, 일부 단편의 비효율적인 이온화 및 혈액과 같은 복합 샘플에서 동중원자핵 변화 간섭에서 주지되는 문제점과 함께 통상의 임상적 진단 시스템과 경쟁하지 못한다. 추가로, MS는 흔히 샘플 중에 존재하는 보다 용이하게 이온화될 수 있는 분자에 의한 이온 억제로 인해 특정 매쓰를 검출할 수 없다. 이들 문제는 전형적으로 거짓 결과를 유발한다.
단백질 용해성 분해는 흔히 MS에 의한 단백질 및 펩타이드의 분석 및 정량을 위해 사용된다. 상기 분해는 LC-MS를 사용하는 경우에서와 같이 MS 분석 전 보다 잘 분리될 수 있는 보다 작은, 보다 용이하게 검출될 수 있는 단편으로 단백질 또는 펩타이드를 절단하는 작용을 한다. 분석학적 민감성을 증가시키는 작용을 하면서, 단백질용해 분해는 흔히 재현될 수 없고 - 모든 단백질 및 결합된 형태는 단편화될 수 없고, 특정 단편은 용이하게 검출되지 않고 (이러한 방법은 용이하게 이온화될 수 있는 단편에 대한 것으로 편향되어 있다), 다양한 매트릭스 성분은 사용되는 분해효소를 억제할 수 있고 중복 아미노산 서열은 데이터 분석동안에 모호함을 유도할 수 있다. 이들 조건하에서 검출된 단편은 흔히 이들이 관련 분자 영역이 아니기 때문에 임상적 상태와 관련되지 않는다. 추가로, 단편의 정량은 안정한 동위원소 내부 표준물의 내포를 요구한다.
MS에 의한 민감성 및 정량 문제를 해결하기 위한 한가지 접근법은 측정될 분자에 표지를 화학적으로 부가하는 것이다(Demmer 2012). 이러한 매쓰 표지화 접근법은 질량 분광측정법에 의한 세포, 조직, 펩타이드 및 단백질의 검출에 도움이 된다. 화학적 표지화는 화학적 반응을 통해 측정된 분자 상에 직접 공지된 매쓰의 하전된 그룹을 도입함에 의해 수행한다. 이들 매쓰 표지화 접근법은 매쓰가 보다 용이하게 이온화되고 특유하게 동정되도록 하지만, 이들은 여전히 동중원자핵 변화 간섭의 효과를 나타내어 분석물이 매쓰 표지 도입에 순응할 수 있는 기능성 그룹을 갖는 것이 요구되고 측정될 분석물의 질량에 의해 제한된다. 따라서, 다른 접근법은 이들 현재 질량 분광측정 분석 방법과 연관된 문제점을 회피하거나 감소시키기 위해 모색된다.
하나의 통상적인 접근법은 분석물을 포획하고 흔히 친화성 질량 분광측정으로 호칭되는 MS에 의한 검출 전 오염물을 제거하기 위해 친화성 제제를 사용한다. 친화성 질량 분광측정의 한가지 방법은 표면 증진된 레이져 탈착 및 이온화 또는 SELDI(미국 특허 번호 제5,719,060호 및 제6,225,047호, 이 둘다는 후첸 및 입 (Hutchens and Yip)이다). 상기 방법은 포획된 분자의 이온화를 도와주는 표면으로 분석물을 특이적으로 흡수시키기 위해 친화성 제제를 사용한다(Zhu 2006). 다른 예는 샘플-제공 표면을 갖는, 가요성 또는 강성의 고체 기판 상에 친화성 제제를 포함한다. 다른 “친화성 질량 분광측정” 방법은 액체로의 단리를 위해 표면 또는 입자를 포획하고 이어서 이온화하기 위해 부착된 항체와 같은 친화성 제제를 사용한다. 이들 방법은 임상적 측정을 위해 성공적으로 사용되었지만(문헌참조: Popp 2014), 이들은 흔히 MS에 의해 검출될 수 있는 단편을 생성하기 위해 효소적 분해를 필요로 한다. 샘플 제제의 상기 방법은 자동화하기 위해 어렵고 복잡한 다단계 공정으로 남아있고 임상적 연구에 사용되는 다른 검출 기술과 경쟁하지 못한다.
친화성 제제를 사용하는 매쓰 표지화 접근법은 관심 대상의 희귀 세포 분자에 대한 항체로의 금속의 커플링을 통해 성취되었다(문헌참조: Bandura 2009, Lee 2008). 이러한 경우에, 전체 샘플은 자동화에 적용되고 상기 금속 함량은 전체 샘플의 파괴를 유도하는, 희귀 분자의 존재를 검정하기 위해 사용된다. 문헌(Pugia PCT/US2015/033278)에서 4급 암모늄 화합물은 디설파이드 결합을 통해 나노입자에 부착된다. 상기 나노입자는 또한 희귀 분자에 대한 친화성 제제에 접합된다. 여기서, 화학물질은 디설파이드 결합을 절단함에 의해 친화성 제제로부터 매쓰 표지를 방출시키는 “변경 제제”, 즉 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리스 (2-카복시에틸)포스핀 (TCEP)으로서 사용된다. 상기 방법은 샘플 중 제한된 수의 펩타이드 및 단백질 변종을 검출하기 위해 μM 범위의 민감성을 가능하게 한다. 나노입자 및 매쓰 표지를 사용한 질량 분광측정을 위한 친화성 제제 및 매쓰 표지화의 조합은 문헌 (참조: Cooks PCT/US16/53610, 09/24/16 출원됨)에서 나타난다. 본 실시예에서, 친화성 태그, 및 4급 암모늄 그룹을 갖는 매쓰 표지는 절단가능한 케탈 연결에 의해 연결된다. 상기 방법은 친화성 제제로의 연결을 위해 친화성 태그를 사용한다. 상기 방법은 샘플 중에 제한된 수의 펩타이드 및 단백질 변종을 검출하기 위해 nM 범위의 높은 민감성을 가능하게 하지만, 비-분석물 분자로의 친화성 태그 결합으로 인한 특이성 부재를 갖는다. 이것은 상기 방법이 분석물의 모든 변화를 정확하게 측정할 수 없게 하여 가양성을 유도한다.
상대적이고 절대적인 정량을 위한 동중원자핵 변화 태그 (iTRAQ™, SCIEX) 또는 탠덤 매쓰 태그 (TMT™, Thermo Scientific)와 같은 일부 표지화 전략은 다중복합체화된 샘플 측정 및 상대적 정량에 순응할 수 있는 직접적인 표지화 접근법을 제공한다. TMT 및 iTRAQ 둘다에서, 별도의 단백질용해 분해물은 특유의 하전된 그룹을 N-말단 아미노산, 및 시스테인. 라이신 및 카보닐 모이어티 상으로 도입하는 시약과 반응시킨다. 상기 표지된 샘플은 이어서 모으고 동일한 LC-MS 전개에서 분석한다. 상기 결과는 동일한 LC-MS 분석 내 상대적 정량을 할 수 있는 다중복합체화할 수 있는 (10 플렉스 이하) 검정이다. 상기 시약은 동일한 풀에서 분석되는 상이한 샘플로부터 동일한 펩타이드에 대해 특유의 리포터 이온을 생성하는 동중원자핵 변화성, 크로마토그래피적으로 구별될 수 없는 유도체화된 펩타이드를 생성함에 의해 다중복합체화를 가능하게 한다. 상기 방법은, 여전히 LC 단백질용해 분해, 및 독립적 샘플 유도체화의 부가된 복잡성에 의한 예비-분리에 의존하기 때문에, 이전에 논의된 방법과 연관된 동일한 문제점을 갖는다.
상기 분야는 샘플 중 펩타이드 및 단백질의 모든 변화를 검출할 수 있는 개선된 방법을 필요로 한다. 상기 방법은 추가의 효소적 프로세싱, 펩티다제 반응에 의존하지 말아야 하고, 단일 결정으로 임의의 분석물 및 이의 모든 변화를 측정할 수 있다. 친화성 제제 및 분석학적 표지화를 조합하는 새로운 방법은 샘플 중의 펩타이드 및 단백질의 변화에 대해 민감해야만 하고 환자 및 샘플에 걸쳐 일관된 측정을 가능하게 한다.
발명의 요약
본원에 기재된 발명은 부착된 분석학적 표지 및 친화성 제제를 사용하여 변종을 입자에 결합시키고, 상기 입자를 샘플로부터 분리하고, 입자로부터 분석학적 표지를 제거하고 이어서 분석물 분자의 간접적 분석을 위한 분석학적 표지의 후속 측정에 의한 샘플 중에 분석물 분자의 변종의 단리 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 일부 실시예는 분석학적 표지를 갖는 입자로 분석물의 모든 변종을 결합시킴에 의해 샘플 중 모든 분석물의 변종을 단리하는 방법에 관한 것이고, 여기서, 다수의 동일한 분석학적 표지는 X-Y 결합에 의해 입자에 부착되고 X-Y 결합을 절단시킴에 의해 방출된다.
본 발명에 따른 일부 실시예는 제1 분석학적 표지를 갖는 입자로 분석물의 제1 변종을 결합시킴에 의해 샘플 중 분석물의 제1 변종을 단리하는 방법에 관한 것이고, 분석물의 추가의 변종은 추가의 분석학적 표지를 갖는 입자에 추가로 결합되고, 여기서, 모든 분석학적 표지는 X-Y 결합으로 부착되고 X-Y 결합을 절단시킴에 의해 방출된다.
본 발명에 따른 일부 실시예는 분석학적 표지를 갖는 입자로 분석물의 모든 변종을 결합시킴에 의해 샘플 중 분석물의 변종을 단리하는 방법에 관한 것이고, 여기서, 다수의 동일한 친화성 제제는 X-Y 결합에 의해 입자에 부착되지만 X-Y 결합을 절단시키는 조건에 의해 방출되지 않는다.
본 발명에 따른 일부 실시예는 제1 친화성 제제를 갖는 입자로 분석물의 제1 변종을 결합시킴에 의해 샘플 중 분석물의 제1 변종을 단리하는 방법에 관한 것이고, 분석물의 추가의 변종은 추가의 친화성 제제를 갖는 입자에 추가로 결합되고, 여기서, 모든 친화성 제제는 X-Y 결합으로 부착되고 X-Y 결합을 절단시킴에 의해 방출된다.
본원에 제공된 도면은 스케일이 아니며 본원에서 기재된 원리에 따라 특정 예의 이해를 용이하게 하기 위한 목적으로 제공되며 첨부된 청구항의 범위를 제한하는 것이 아니라 예시로서 제공된다.
도 1은 본원에 기재된 원리에 따라 장비, 방법 또는 키트에 의해 검출된 분석물의 변종 형성의 예를 도시하는 도식이다. 유전자 생성물 1과 같은 분석물의 본래 형태의 형성은 10개 이상의 단편 3을 유도하는 단편화에 의해 분석물의 변종을 생성할 수 있는 제제 2(10개 프로테아제)와 같은 그룹에 의해 작용한다. 단편화 3에 의해 성취되는 분석물의 변화는 10개 이상의 추가의 변화 5에 대해 분석물의 변종을 생성할 수 있는 제제 4의 그룹에 의해 작용한다. 첨가 5에 의한 분석물의 변화는 10개 이상의 단편 3을 유도하는 단편화에 의해 분석물의 변종을 생성할 수 있는 10개 이상의 추가의 변종 7에, 예를 들어, 단백질을 결합시킴에 의해 분석물의 변종을 생성할 수 있는 제제 6의 그룹에 대해 작용한다. 3개 사이클 후, 분석물의 변종 수는 이미 106개 이다.
도 2는 항원 11 (항목 4)과 같은 분석물의 변종을 함유하는 용액으로 항온처리되는 경우, 부착된 분석학적 표지 9 (항목 2) 및 부착된 친화성 제제 10 (항목 3)을 갖는 입자 8 (항목 1)로 분석물의 특이적 변종의 결합에 의해, 샘플 중 분석물의 하나 이상의 변종의 단리를 위한 본원에 기재된 원칙에 따른 방법의 예를 도시하는 도식이다. 분석물 12 (항목 5)의 포획된 변종을 갖는 입자는 온전한 분석학적 표지를 사용하여 벌크 샘플로부터 단리되고, 여기서, 다수의 동일한 분석학적 표지는 X-Y 결합에 의해 입자에 부착되고 X-Y 결합의 절단으로 분석학적 표지 13 (항목 6)을 유리시켜 방출되고 참조 표준물 (항목 8)과 비교함에 의해, 방출된 분석학적 표지 14 (항목 7)의 검출 및 정량을 가능하게 한다.
도 3은 항원 21 (항목 6)과 같은 분석물의 변종을 함유하는 용액으로 항온처리되는 경우, 부착된 분석학적 표지 17 (항목 2) 및 특유의 부착된 친화성 제제 18, 19 및 20 (항목 3, 4 및 5)을 갖는 입자 16 (항목 1)로 분석물의 모든 변종의 결합에 의해, 샘플 중 분석물의 모든 변종의 단리 방법에 대해 본원에 기재된 원칙에 따른 방법의 예를 도시하는 또 다른 도식이다. 항원 22, 23, 및 24(항목 7, 8 및 9)와 같은 분석물의 포획된 변종을 갖는 입자 는 온전한 분석학적 표지를 사용하여 벌크 샘플로부터 단리되고, 여기서, 다수의 동일한 분석학적 표지는 X-Y 결합에 의해 입자에 부착되고 X-Y 결합의 절단으로 분석학적 표지 25 (항목 10)을 유리시켜 방출되고 참조 표준물 26 (항목 11)과 비교함에 의해, 방출된 분석학적 표지 25 (항목 10)의 검출 및 정량을 가능하게 한다.
도 4는 항원 33 (항목 7)과 같은 분석물의 변종을 함유하는 용액으로 항온처리되는 경우, 부착된 특유의 분석학적 표지 29 및 30 (항목 3 및 4) 및 부착된 특유의 친화성 제제 31 및 32 (항목 5 및 6)를 갖는 다수의 입자 27 및 28 (항목 1 및 2)로 분석물의 모든 변종의 결합에 의해, 샘플 중 분석물의 모든 변종의 단리를 위한 본원에 기재된 원칙에 따른 방법의 예를 도시하는 추가의 도식이다. 항원 34 및 35(항목 8 및 9)와 같은 분석물의 포획된 변종을 갖는 입자는 온전한 분석학적 표지를 사용하여 벌크 샘플로부터 단리되고, 여기서, 다수의 동일한 분석학적 표지는 X-Y 결합에 의해 입자에 부착되고 X-Y 결합의 절단으로 분석학적 표지 36 및 37 (항목 10 및 11)을 유리시켜 방출되고 참조 표준물 38 (항목 12)과 비교함에 의해, 방출된 분석학적 표지 36 및 37 (항목 10 및 11)의 다중복합체화될 수 있는 검출 및 정량을 가능하게 한다.
본원에 기재된 발명에 따른 방법, 장비 및 키트는 희귀 분자들의 검출 또는 단리에 적용된다. 예시적이고 이에 제한되지 않는 상기 적용의 예는 부착된 분석학적 표지를 갖는 입자에 변종을 결합시키고 샘플로부터 입자를 분리함에 이어서 입자로부터 분석학적 표지를 제거하고 분석학적 표지의 측정을 통해 분석물 분자를 측정함에 의해 분석물의 변종의 단리 방법을 포함한다
본원에 기재된 발명에 따른 일부 예는, 부착된 분석학적 표지인 입자에 부착된 친화성 제제를 통해 입자에 변종을 결합시키고, 상기 입자를 샘플로부터 분리하고 이어서 입자로부터 분석학적 표지를 제거하고 이어서 분석학적 표지의 측정을 통해 분석물 분자를 측정함에 의해 샘플 중 분석물 분자의 변종을 단리하는 방법이다.
본원에 기재된 발명에 따른 일부 예는 또한 X-Y 결합에 의해 분석학적 표지에 부착된 X-Y 결합에 의한 입자에 부착된 친화성 제제를 통해 입자에 변종을 결합시킴에 의해 샘플 중 분석물 분자의 변종을 단리하는 방법이다. 입자는 샘플로부터 분리되고 이후 분석학적 표지는 분석학적 표지를 입자에 연결하는 X-Y 결합의 절단을 통해 입자로부터 방출된다. 방출된 분석학적 표지의 측정은 이어서 분석물 분자의 간접적 측정의 수단으로서 수행된다.
본 발명에 따른 일부 예는 무세포인 분석물의 변종의 검출 또는 단리에 대한 것이지만 다른 예는 세포 결합되거나 함유된 분석물의 변종의 검출 또는 단리에 대한 것이다. 다른 예는 비-희귀 세포의 존재로부터 제거된 희귀 세포 내 포함되는 분석물의 변종의 단리 및 검출에 대한 것이다. 일부 예에서, 희귀 세포는 다공성 매트릭스에 의해 비-희귀 세포의 존재로부터 제거한다.
용어 “분석물의 변종”은 대사물, 조-인자, 기질, 아미노산, 금속, 비타민, 지방산, 생분자, 펩타이드, 탄수화물 등과 같은 소분자를 포함하고, 당접합체, 지질, 핵산, 폴리펩타이드, 수용체, 효소, 단백질 및 세포 구조물, 퍼옥시좀, 소포체, 엔도좀, 엑소좀, 리소좀, 미토콘드리아, 세포골격, 막, 핵, 세포외 매트릭스 또는 전형적으로 측정되는 다른 분자를 포함하는 세포 및 조직과 같은 거대분자를 포함하는 생물학적 또는 비-생물학적 기원의 분자의 일부, 조각, 단편 또는 변형물이다.
상기 도면의 간단한 설명에서 설명한 바와 같이, 도 1은 단편화, 첨가 또는 결합에 의해 “분석물의 변종” 형성의 예를 도시하는 도식이고 단백질과 같은 단일 거대 분자에 작용하는 프로테아제 또는 펩티다제 그룹에 이어서 생성된 단일 단백질의 변종 그룹이 생성되도록 작용하는 효소 그룹에 의한 추가의 반응의 예를 보여준다. 분석물의 변종은 소분자 뿐만 아니라 세포 및 조직의 일부 및 조각으로부터 생성될 수 있다. 결합 및 연합 반응은 또한 미결합된 형태와는 상이한 변종인 결합된 형태를 생성함에 의해 “분석물의 변종”에서 추가의 차이를 유도한다.
본원에 기재된 원칙에 따른 일부 예는 분석물 및 비-분석물 분자의 변종의 하나 이상의 상이한 집단을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 중에 분석물 변종의 하나 이상의 상이한 집단을 검출하는 방법에 관한 것이다. 용어 “분석물의 변종”은 분자를 포함하지만 탄수화물, 지질, 핵산, 펩타이드 및 단백질과 같은 생분자에 제한되지 않는다. 분석물의 이들 변종을 사용하여 분석물의 변종을 형성하도록 작용하는 효소, 프로테아제, 펩티다제, 단백질 및 억제제를 측정할 수 있다. 분석물의 이들 변종은 생물학적, 치료학적 또는 기타와 같은 천연 또는 인조 기원으로서 형성될 수 있다. 분석물의 변종은 의도적으로 분석물의 단편화, 부가, 결합 또는 다른 변형으로부터 비롯될 수 있다. 본원에 기재된 원칙에 따른 일부 예는 분석물의 변종이 형성되도록 단리 방법 전에 펩티다제, 효소, 억제제 또는 다른 시약의 첨가에 대한 것이다. 분석물의 이들 변종은 상기 방법을 사용한 분석 전에 분해물의 변종을 단리하기 위한 의도적 친화성 반응의 결과일 수 있다.
용어 “분석학적 표지”는 다공성 매트릭스 상에서 또는 액체에서 직접 광학적, MS, 또는 전기화학적 수단에 의해 검토될 수 있는 신호를 생성할 수 있는 화학적 실체 (유기 또는 무기)를 언급한다. 분석학적 표지는 분석물의 변종에 특이적인 친화성 제제에 부착되거나 표지 입자에 부착될 수 있다. 추가로, 분석학적 표지는 화학적 결합을 절단함에 의해 친화성 제제 또는 표지 입자로부터 방출될 수 있다. 분석학적 표지는 친화성 제제, 입자 표지 또는 분석물의 변종을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 분석학적 표지는 친화성 제제, 표지 입자 또는 분석물의 변종에 대해 동정가능한 코드 (바코딩)로서 사용될 수 있다. 일부 예에서, 분석학적 표지는 분석학적 표지와 구조적으로 유사하거나 동일한 보정기로서 내부 표준물을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 기재된 본 발명에 따른 일부 예는 분석물의 변종을 검출하기 위한 분석학적 표지로서 매쓰 표지를 사용하는 방법에 대한 것이다. 용어 “매쓰 표지”는 이에 상응하는 특유의 질량 분광측정 시그네이쳐를 갖는 분자를 언급하고, 희귀 분자 또는 희귀 분자에 대한 친화성 태그의 존재 및/또는 양을 결정하기 위해 사용된다. 매쓰 표지는 추가로 천연적으로 형광성, 화학발광성 또는 전기화학적일 수 있다. 매쓰 표지는 일부 경우에 특유의 단편화 패턴을 갖는 펩타이드일 수 있다. 전하는 영구적 또는 일시적 전하일 수 있다.
용어 “폴리펩타이드,” “펩타이드” 및 “단백질”은 본원에서 아미노산 잔기들의 중합체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연적으로 존재하는 아미노산 중합체 및 비-천연적으로 존재하는 아미노산 중합체 뿐만 아니라 상응하는 천연적으로 존재하는 아미노산의 인공 화학적 모사체인 아미노산 중합체에 적용된다.
용어 “친화성 제제”는 특이적 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 분자를 언급한다. 상기 친화성 제제는 관심 대상의 분석물의 변종에 직접적으로 결합할 수 있거나 친화성 태그에 대한 것일 수 있다. 친화성 제제는 포획 입자 또는 표지 입자에 부착될 수 있거나 정전기, 소수성, 공간, 이온 또는 분석물의 변종 또는 친화성 태그를 친화성 제제로 끌어당기는 다른 상호작용을 통해 입자에 결합할 수 있다.
용어 “표지 입자”는 연결에 의해 분석학적 표지 및 친화성 제제에 결합된 입자를 언급한다. 용어 “포획 입자”는 연결에 의해 추가의 친화성 제제 또는 친화성 태그에 부착된 입자를 언급하고 분석물의 변종을 포획하기 위해 사용될 수 있다. 용어 “연결”은 X-Y 결합으로서 지칭되는 2개의 그룹 간의 결합을 언급한다. 친화성 제제는 X-Y 결합인 연결에 의해 표지 입자에 부착되고 분석학적 표지는 X-Y 결합인 연결에 의해 표지 입자에 부착된다. 상기 연결은 본원에 기재된 바와 같은 특정 조건에 적용되는 경우 절단될 수 있거나 영구적일 수 있다 (사용되는 조건 하에 절단을 진행하지 않는). 용어 결합은 전형적으로 화학적 결합, 즉, 공유 결합 또는 이온 결합이다. 바람직한 연결은 공유 결합 연결이다.
본원에 기재된 발명에 따른 일부 예는 다수의 분석학적 표지의 표지 입자로의 부착을 통해 분석학적 표지의 입자 증폭을 사용하는 분석물을 측정하는 방법에 관한 것이다. 증폭 방법에 대한 일부 예에서, 친화성 제제를 사용하여 표지 입자에 부착된 다수의 분석학적 표지가 있다. 다른 예에서, 추가의 친화성 제제는 포획 입자에 연결될 수 있고 포획 입자는 다공성 매트릭스 또는 자기 상으로 친화성 제제를 갖는 표지 입자를 단리하기 위해 사용된다. 본원에 기재된 원리에 따른 다른 예는 분석물의 변종의 결합 및 분리 방법에 관한 것이고, 여기서, 표지 입자 및 세포는 다공성 매트릭스 또는 자기 입자 상에서 단리되고 결합된 재료는 분석을 위해 보유된다.
본원에 기재된 발명에 따른 예는 분석 방법 및 키트에 대한 것이다. 본원에 기재된 원칙에 따른 다른 예는 분석용 장비에 관한 것이다.
본원에 기재된 발명에 따른 분석물의 단일 변종의 검출을 위한 방법, 장비 또는 키트의 예는 도 2에 도시되어 있다. 도 2의 간단한 설명에서 설명된 바와 같이, 본 실시예에서, 분석학적 표지 및 분석물의 변종에 결합할 수 있는 친화성 제제는 표지 입자 상의 분석학적 표지들 간에 만들어진 연결 및 친화성 제제와 표지 입자 간의 별도의 연결을 통해 부착된다. 제1 단계에서, 부착된 친화성 제제를 갖는 표지 입자는 분석물의 변종을 함유하는 샘플과 혼합된다. 제2 단계에서, 상기 친화성 제제는 분석물의 변종에 결합하고 상기 표지 입자는 그 자체가 포획될 수 있거나 포획된 입자 또는 세포에 의해 결합될 수 있고 다공성 매트릭스 상에 크기 배척 여과, 자기 분리, 또는 원심분리와 같은 다양한 수단에 의해 샘플로부터 제거된다. 상기 방식으로, 입자에 결합된 분석물의 변종은 분석물의 변종에 결합되지 않은 입자로부터 분리된다. 제3 단계에서, 항원과 같은 분석물의 포획된 변종을 갖는 표지 입자는 X-Y 결합을 절단함에 의해 표지 입자로부터 분석학적 표지를 방출하여 참조 표준물과 비교하여 방출된 분석학적 표지의 정량될 수 있는 검출을 가능하게 하는 조건에 적용된다.
분원에 기재된 발명에 따른 분석물 또는 분석물들의 다수의 변종의 검출을 위한 방법, 장비 또는 키트의 또 다른 예는 도 3에 도시되어 있다. 도 3의 기재에서 상기 설명된 바와 같이, 본 실시예에서, 분석물 또는 분석물들의 상이한 변종에 결합할 수 있는 분석학적 표지 및 다수의 친화성 제제는 표지 입자 상의 분석학적 표지들 간에 만들어진 연결 및 친화성 제제와 표지 입자 간의 별도의 연결을 통해 부착된다. 제1 단계에서, 부착된 친화성 제제를 갖는 표지 입자는 분석물 또는 분석물들의 변종을 함유하는 샘플과 혼합된다. 제2 단계에서, 상기 친화성 제제는 분석물 또는 분석물들의 변종에 결합하고 상기 표지 입자는 그 자체가 포획될 수 있거나 포획된 입자 또는 세포에 의해 결합될 수 있고 다공성 매트릭스 상에 크기 배척 여과, 자기 분리 또는 원심분리와 같은 다양한 수단에 의해 샘플로부터 제거될 수 있다. 상기 방식으로, 입자에 결합된 분석물 또는 분석물들의 변종은 분석물 또는 분석물들의 변종에 결합되지 않은 입자로부터 분리된다. 제3 단계에서, 항원과 같은 분석물 또는 분석물들의 포획된 변종을 갖는 표지 입자는 X-Y 결합을 절단함에 의해 표지 입자로부터 분석학적 표지를 방출하여 참조 표준물과 비교하여 방출된 분석학적 표지의 정량될 수 있는 검출을 가능하게 하는 조건에 적용된다.
분원에 기재된 발명에 따른 분석물 또는 분석물들의 다수의 변종의 검출을 위한 분석 방법, 분석 장비 또는 분석 키트의 추가의 예는 도 4에 도시되어 있다. 도 4의 기재에서 상기 설명된 바와 같이, 표지 입자와 분석학적 표지를 결합시킴에 의해 샘플 중 분석물 또는 분석물들의 변종의 단리의 예를 나타낸다. 제1 단계에서, 특유의 부착된 친화성 제제를 갖는 다수의 표지 입자는 분석물 또는 분석물들의 변종을 함유하는 샘플과 혼합된다. 다수의 입자들이 사용되고, 각각은 특유의 친화성 제제 및 특유의 분석학적 표지를 갖는다. 제2 단계에서, 상기 친화성 제제는 분석물 또는 분석물들의 변종에 결합하고 상기 표지 입자는 그 자체가 포획될 수 있거나 포획된 입자 또는 세포에 의해 결합될 수 있고 다공성 매트릭스 상에 크기 배척 여과, 자기 분리 또는 원심분리와 같은 다양한 수단에 의해 샘플로부터 제거될 수 있다. 상기 방식으로, 입자에 결합된 분석물 또는 분석물들의 변종은 분석물 또는 분석물들의 변종에 결합되지 않은 입자로부터 분리된다. 제3 단계에서, 항원과 같은 분석물 또는 분석물들의 포획된 변종을 갖는 표지 입자는 X-Y 결합을 절단함에 의해 표지 입자로부터 분석학적 표지를 방출하여 참조 표준물과 비교하여 동일한 샘플 내에서 방출된 분석학적 표지의 정량될 수 있는 검출을 가능하게 하는 조건에 적용된다.
분석물의 변종의 예
기재된 원칙에 따라, “분석물의 변종”은 생물학적 또는 비-생물학적 기원의 분자로부터 유래할 수 있다. “분석물의 변종”은 탄수화물, 지질, 핵산, 펩타이드 및 단백질과 같은 생분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 분석물의 변종은 반응, 생물학적 공정, 질환 또는 의도적 반응의 결과일 수 있고 질환 또는 천연 상태를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 분석물의 변종은 인조 또는 천연 기원의 단백질, 효소, 생물학적 제제 또는 펩타이드와 같은 분자 내 변화로부터 비롯될 수 있고, 의학적 장치, 치료학적 용도, 진단학적 용도에 사용되는 것들, 공정 측정을 위해 사용되는 것들 및 미생물 또는 세포성 생성물에서 프로- 또는 프레-바이오틱으로서, 식품 안전성 및 환경 평가에 사용되고, 수의학적 제품에 사용되고, 화장품에 사용되는 세포의 성장, 측정 또는 제어용 공정을 위한 화학물질로서 사용되는 것들과 같은 인조 또는 천연 기원의 단백질, 효소, 생물학적 제제 또는 펩타이드와 같은 생활성 및 비-생활성 분자를 포함한다.
분석물의 변종은 보다 큰 부분 또는 결합된 형태의 단편일 수 있고 이들 자체를 사용하여 효소, 펩티다제 및 기타와 같은 다른 분자를 측정할 수 있다. 효소, 펩티다제 및 기타와 같은 다른 분자의 측정은 효소적 또는 단백질용해 생성물과 같은 분석물의 변종의 형성을 기반으로 할 수 있다. 천연 억제제, 합성 억제제 등과 같은 기타 분자의 측정은 분석물의 변종의 형성 부재를 기반으로 할 수 있다.
분석물의 변종은 해독 또는 효소적 또는 비-효소적 변형에 의한 또는 해독후 변형의 결과일 수 있다. 해독 후 변형은 단백질 생합성 동안에 또는 생합성 후 단백질의 공유 변형을 언급한다. 해독 후 변형은 효소적 또는 비-효소적 화학 반응을 통한 것일 수 있다. 인산화는 효소의 활성을 조절하기 위한 매우 통상의 기전이고 가장 통상적인 해독 후 변형이다. 효소는 6000개 초과의 실체를 갖는 http://enzyme.expasy.org/ 또는 http://www.enzyme-database.org/ 와 같은 효소 분류 데이터베이스에서 통상적으로 공지된 바와 같은 옥시도리덕타제, 하이드롤라제, 리아제, 이소머라제, 리가제 또는 트랜스퍼라제일 수 있다.
분석물의 변종의 통상적인 변형은 막 위치화를 위해 소수성 그룹의 첨가, 증진된 효소적 활성을 위한 조인자의 첨가, 디프타미드 형성, 하이푸신 형성, 에탄올아민 포스포글리세롤 부착, 아실화, 알킬화, 아미드 결합된 형성, 예를 들어, 아미노산 첨가 또는 아미드화, 비타민 K[15]에 의존하는 부틸화 감마-카복실화, 글리코실화, 글리코실 그룹의 아르기닌, 시스테인, 하이드록실라이신, 세린, 트레오닌, 티로신 또는 당백질을 유도하는 트립토판으로 첨가, 말로닐화하이드록실화, 요오드화, 뉴클레오타이드 첨가, 예를 들어, ADP-리보실화, 포스페이트 에스테르 (O-연결된) 또는 포스포르아미데이트(N-연결된) 형성, 예를 들어, 인산화 또는 아데닐화, 프로피오닐화 피로글루타메이트 형성, S-글루타티오닐화, S-니트로실화 S-설페닐화 (아카 S-설페닐화, 숙시닐화 또는 황화를 포함한다. 비-효소적 변형은 당의 부착, 카바밀화, 카보닐화 또는 의도적 재조합물 또는 합성 접합, 예를 들어, 히스티딘 산화와 같은 친화성 제제의 비오티닐화 또는 첨가, 시스틴 잔기 간의 디설파이드 결합의 형성, 또는 페길화 (폴리에틸렌 옥사이드 그룹의 첨가)를 포함한다.
펩타이드 및 단백질과 같은 분석물의 변종의 의도적 단편화 및 형성을 위한 통상의 시약은 펩타이드와 단백질과 반응하는 것으로 공지된 펩티다제 또는 시약을 포함한다. 의도적 단편화는 프로테아제 (또한 펩티다제 또는 프로테이나제로서 호칭되는) 및 펩타이드 및 단백질 서열과 반응하는 것으로 공지된 화학물질에 대한 예측된 절단 부위를 기반으로 하는 특이적 단편을 생성할 수 있다. 의도적 단편화를 위한 통상의 펩티다제 및 화학물질은 Arg-C, Asp-N, BNPS oNCS/우레아, 카스파제, 키모트립신 (낮은 특이성), 클로스트리파인, CNBr, 엔테로키나제, 인자 Xa, 포름산, Glu-C, 그랜자임 B, HRV3C 프로테아제, 하이드록실아민, 요오도벤조산, Lys-C, Lys-N, 약산 가수분해, NBS, NTCB, 엘라스타제, 펩신 A, 프롤릴 엔도펩티다제, 프로테이나제 K, TEV 프로테아제, 써모라이신, 트롬빈 및 트립신을 포함한다. 단편화의 의도적 억제를 위한 통상의 시약은 효소, 펩티다제, 프로테아제, 리덕타제, 산화물, 화학적 반응물, 및 상기 열거된 화학물질을 포함하는, 효소, 펩티다제, 프로테아제에 대한 화학적 억제제를 포함한다.
절단가능한 연결의 예
본 발명에 따라, 분석학적 표지 및 친화성 제제는 연결에 의해 표지 입자에 부착된다. 추가로, 분석학적 표지는 상기 연결을 절단함에 의해 친화성 제제 또는 표지 입자로부터 방출된다. 절단될 수 있는 연결은 “X-Y 결합”으로서 정의된다. 용어 “X-Y 결합”은 친화성 제제 또는 분석학적 표지의 표지 입자로의 절단가능한 연결을 가능하게 하는 분자 그룹을 언급한다. 용어 “X-Y 결합”은 연결이 절단되도록 하는 분자 그룹을 언급한다. 분석학적 표지는 표지 입자 상에 원자 (X)에 연결되는 원자 (Y)를 함유한다. 친화성 제제는 표지 입자 상에 원자 (X)에 연결되는 원자 (Y)를 함유할 수 있다. X-Y 결합은 설파이드, 피리딜 디설파이드, 에스테르, 에테르, 티오에스테르, 아미드, 티오아미드, N-옥사이드, 질소-질소, 티오에테르, 펩타이드, 카복실레이트, 킬레이트, 구아니딘, 금속 등을 포함할 수 있다. X-Y 결합은, 이의 구조물이 예를 들어, 치환, 질량 및 쇄 길이에 의해 다양할 수 있는, 지방족 탄화수소 쇄, 폴리펩타이드, 중합체, 방향족 탄화수소, 지방족 지방산, 단백질, 금속, 탄수화물, 유기 아민, 에테르, 에스테르, 설파이드, 포스페이트, 설페이트, 핵산, 유기 알콜, 등 (상기 열거된 화합물의 혼합물을 포함하는)의 일부일 수 있다. 중합체 물질의 경우에, 반복 유닛의 수는 친화성 제제 또는 분석학적 표지와의 반응을 최적화하기 위한 방식으로 조정된다. 일부 경우에, X-Y 결합은 친화성 제제 또는 분석학적 표지와 표지 입자 간의 공간을 유발하는 긴 링커 그룹의 일부일 수 있다.
일부 실시예에서, 분석학적 표지 결합 원자 (Y)는 또한 알킬 그룹, 방향족 그룹, 펩타이드 및 단백질 상에서의 것들과 같은 티올 그룹인, 원자 (X)와 결합을 형성하는 티올 그룹일 수 있다. 다른 구현예에서, 연결 디설파이드 결합은 분석학적 표지 상의 유리된 티올 또는 친화성 제제와, 입자 상에 존재하는 피리딜디티오 그룹과의 반응으로부터 비롯될 수 있다.
일부 예에서, X 및 Y는 S, O, C, P, N, B, Si, Ni, Pd, Co, Ag, Fe, Cu, 또는 Au의 임의의 조합일 수 있다. 연결 그룹에 존재하는 기능성기는 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 티오아미드, 에테르, 구아니딘, N-옥사이드, 질소-질소, 티오에테르, 카복실레이트 등을 포함할 수 있다. 여전히 다른 예에서, X 또는 Y는 금속 결합 분자, 예를 들어, 금속에 결합하는 친화성 제제, 분석학적 표지 또는 표지 입자에 부착된 금속 킬레이트일 수 있지만, 예를 들어, 단백질, 펩타이드, 또는 폴리히스티딘 태그, 폴리아르기닌 태그, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST 태그), 면역글로불린 등과 같은, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌 또는 티로신 또는 티올 그룹을 함유하는 분자에 제한되지 않는다.
일부 경우에, X-Y 연결 그룹에 의해 표지 입자에 첨가된 친화성 제제는 서로 결합하는 친화성 제제 또는 친화성 태그이다. 친화성 태그 및 친화성 제제 쌍은 친화성 제제로서 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘에 결합하는 친화성 태그로서 비오틴, 친화성 제제로서 항-플루오레세인 항체에 결합하는 플루오레세인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 친화성 태그는 항체 또는 단백질에 의해 결합된 다른 분자를 포함하고 이들 친화성 제제에 대한 결합 파트너로서 작용할 수 있다. 다른 예에서, 이들 친화성 태그는 항체가 아닌 단백질에 결합하는 분자일 수 있고, 예를 들어, 스트렙타비딘-탁틴 단백질에 결합하는 strep II 태그 펩타이드 (서열번호 19 WSHPQFEK를 갖는 펩타이드), 스트렙타비딘 단백질에 결합하는 스트렙타비딘-결합(SBP) 펩타이드 태그 (서열번호 20 MDEKTTGWRG GHVVEGLAGE LEQLRARLEH HPQGQREP을 갖는 펩타이드), 칼모듈린에 결합하는 칼모듈린-결합 펩타이드(CBP) (서열번호 21 GVMPREETDSKTASPWKSAR을 갖는 펩타이드)이지만 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 친화성 태그는 친화성 제제로서 말토스-결합 단백질 (MBP) (396개 아미노산 잔기들)에 결합하는 아밀로스와 같은 탄수화물 분자일 수 있다. 일부 경우에, 친화성 태그는 분석물의 변종에 결합하는 항체에 결합된 비오틴과 같은 제2 친화성 제제에 결합될 수 있다. 이 경우에, 뉴트라비딘은 X-Y 연결에 의해 표지 입자에 첨가되는 친화성 제제이고 뉴트라비딘은 분석물의 변종에 결합할 수 있는 항체에 결합된 비오틴에 결합한다.
일부 경우에, 친화성 태그는 분석물의 변종에 직접 부착될 수 있다. 이들의 예는 FLAG 폴리펩타이드 태그(서열번호 22 DYKDDDDK를 갖는 펩타이드), 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 폴리펩타이드 태그 (서열번호 23 YPYDVPDYA를 갖는 펩타이드), c-Myc 폴리펩타이드 태그 (서열번호 24 EQKLISEEDL을 갖는 펩타이드), S-태그 폴리펩타이드 태그 (서열번호 25 KETAAAKFERQHMDE를 갖는 펩타이드), 해독된 펩타이드 또는 다른 분자에 공유적으로 연결되는 푸로마이신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 분석물의 변종과 함께 이들 친화성 태그는 X-Y 연결 그룹에 의해 표지 입자에 첨가되는 친화성 제제로서 항체에 의해 결합된다. 일부 경우에, 이들 친화성 태그는 다양한 숙주 유기체 (이. 콜리(E. coli), 효모, 곤충 및 포유동물세포)에 대해 다양한 벡터를 사용한 이의 cDNA 또는 유전자 발현의 서브클로닝 동안에 재조합 단백질에 융합되는 폴리펩타이드일 수 있다. 추가로, 상기 친화성 태그는 분석물에 성질을 부가할 수 있고, 예를 들어, MBP 및 S-태그 친화성 태그는 단백질 희귀 분자의 용해도를 증가시키고 FLAG 펩타이드 태그는 특이적 프로테아제, 예를 들어, 엔테로키나제 (엔테로펩티다제)로 절단될 수 있다.
분석학적 표지의 예
일부 예에서, 본원에 기재된 원칙에 따라, 분석학적 표지는 방법, 키트 및 장비에서 분석물의 하나 이상의 변종의 상이한 집단의 검출 및 측정을 위해 사용된다. 분석학적 표지는 샘플 중 하나 이상의 변종의 존재 및 양에 대한 정보를 산출하는 분석학적 방법을 사용하여 검출될 수 있는 분자, 금속, 이온, 원자 또는 전자이다. 본원에 기재된 원칙은 희귀 분자 및 비-희귀 분자의 하나 이상의 상이한 집단을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 중 분석물의 하나 이상의 상이한 변종을 검출하는 분석학적 표지를 사용한 방법에 관한 것이다. 일부 예에서, 분석물의 변종은 세포에 있거나 세포 기원이다. 다른 예에서, 분석물의 변종은 세포 부재 또는 “무세포”이다. 다른 예에서, 분석물의 변종은 세포이다. 본원에 기재된 원칙에 따른 일부 예에서, 분석물의 변종의 하나 이상의 상이한 집단의 농도는 다공성 매트릭스 또는 포획 입자 상에 보유되고 반응하여 다공성 매트릭스 또는 포획 입자로부터 분석학적 표지를 생성한다.
분석학적 표지는 다공성 매트릭스 상에 보유되고 막으로부터 분석 액체로 방출되는 경우 검출될 수 있다. 분석학적 표지는 포획 입자 또는 세포 상에 보유되고 포획 입자 또는 세포로부터 분석 액체로 방출되는 경우 검출될 수 있다. 일부 예에서, 분석학적 표지는 분석물의 변종의 방출 없이 분석학적 표지 전구체로부터 분석 액체로 방출된다. 다른 예에서, 분석학적 표지는 분석학적 표지 전구체로부터, 또한 방출되는 분석물의 변종을 갖는 분석 액체로 방출된다. 다른 예에서, 분석학적 표지는 분석학적 표지 전구체로부터, 분석물의 변종을 갖는 분석 액체로 방출되지 않는다.
다공성 매트릭스 또는 분석 액체는 분석에 적용되어 각각의 상이한 분석학적 표지의 존재 및/또는 양을 결정할 수 있다. 각각의 상이한 분석학적 표지의 존재 및/또는 양은 샘플 중 표적 희귀 분자의 각각의 상이한 집단의 존재 및/또는 양과 관련된다. 상기 분석학적 표지는 광학 분석학적 표지, 전기화학적 분석학적 표지 또는 질량 분광측정 분석학적 표지 (매쓰 표지)로서 광학적, 전기화학적 또는 질량 분광학적 방법에 의해 측정될 수 있다. 광학 분석학적 표지, 전기화학적 분석학적 표지 또는 질량 분광측정 분석학적 표지인지에 상관없이 각각의 상이한 유형의 표지의 존재 및/또는 양은 서로 관련시켜 다공성 기판 및/또는 포획 입자 상에 보유된 표적 희귀 분자의 각각의 상이한 집단의 존재 및/또는 양을 결정할 수 있다.
일부 예에서, 분석학적 표지를 갖는 분석 액체는 분석기에 의해 샘플 채취된 액체 수용 영역으로 전달될 수 있다. 다른 예에서, 분석학적 표지를 갖는 액체는 분석기에 의해 샘플 채취되는 다공성 매트릭스 상에 보유될 수 있다. 다른 경우에, 액체 수용 영역은 분석기 내부에 있을 수 있고 분석학적 표지를 갖는 분석 액체는 직접 분석될 수 있다. 일부 분석 예에서, 다공성 매트릭스는 제거되고 분석기에 위치되며, 여기서, 분석학적 표지의 분석이 수행되고 분석물 또는 분석물들의 각각의 상이한 변종의 존재 및/또는 양에 대한 정보로 전환된다.
본원에 기재된 발명에 따른 일부 방법에서, 분석학적 표지는 분석학적 표지 전구체로부터의 방출에 의해 생성된다. 많은 예에서, 분석학적 표지는 결합을 절단하는 화학물질과 반응시킨 후 생성될 수 있다. 다른 예에서, 분석학적 표지는 표지를 생성하기 위해 거론하자면 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 플라보-옥시다제 효소, 우레아제 또는 메틸트랜스퍼라제와 같은 효소와의 반응을 진행하는 화학적 종과 같은 분석학적 표지 전구체 기판으로부터 생성된다. 다른 예에서, 분석학적 표지는 전기-화학발광 (ECL) 표지와 같은 전자 또는 이온과의 반응 후 생성될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 하나 이상의 연결 그룹 X-Y는 절단 제제에 의해 절단되는 절단될 수 있는 모이어티이다. 절단 제제의 성질은 절단될 수 있는 모이어티의 성질에 의존한다. 절단될 수 있는 모이어티의 절단은 산화, 환원, 가용매 분해, 예를 들어, 가수분해, 광분해, 열분해, 전기분해, 초음파 처리 및 화학적 치환 중 하나 이상을 포함하는, 화학적 또는 물리적 방법에 의해 성취될 수 있다. 예시적이고 제한되지 않는, 절단될 수 있는 모이어티 및 상응하는 절단 제제의 예는 환원제, 예를 들어, 티올을 사용하여 절단될 수 있는 디설파이드; 산화제, 예를 들어, 페리오데이트를 사용하여 절단될 수 있는 디올; 과망간산염 또는 사산화오스뮴에 의해 절단될 수 있는 디케톤; 차아황산염으로 절단될 수 있는 에테르, 에스테르, 디아조 연결 또는 옥심 연결; 염기성 조건하에 절단될 수 있는 β-설폰; 테트랄킬암모늄, 트리알킬설포늄, 테트랄킬포스포늄 (여기서, 상기 α-탄소는 예를 들어, 염기로 절단될 수 있는 카보닐 또는 니트로를 사용하여 활성화된다); 알칼린 조건하에 예를 들어, 하이드록실아민, 암모니아 또는 트리알킬아민 (예를 들어, 트리메틸아민 또는 트리에틸아민)과 같은 가수분해 제제를 사용하여 절단될 수 있는 에스테르 및 티오에스테르 연결; 퀴논 (여기서, 제거는 환원과 함께 일어난다); 광분해적으로 절단될 수 있는 치환된 벤질 에테르; 열적으로 절단될 수 있는 카보네이트; 금속 킬레이트 (여기서, 상기 리간드는 보다 높은 친화성 리간드로 치환될 수 있다); 단일선 산소로 절단될 수 있는 티오에테르; 산성 조건하에 절단될 수 있는 하이드로존 연결; 4급 암모늄 염(예를 들어, 수성 수산화나트륨에 의해 절단될 수 있는); 트리플루오로아세트산-절단될 수 있는 모이어티, 예를 들어, 벤질 알콜 유도체, 테이코플라닌 아글리콘, 아세탈 및 티오아세탈; 예를 들어, HF 또는 크레졸을 사용하여 절단될 수 있는 티오에테르; 설포닐 (예를 들어, 트리플루오로메탄 설폰산, 트리플루오로아세트산, 또는 티오아니졸에 의해 절단될 수 있는); 친핵체-절단될 수 있는 부위, 예를 들어, 프탈라미드(예를 들어, 치환된 하이드라진으로 절단될 수 있는); 이온 연합(반대로 하전된 모이어티의 인력) (여기서, 절단은 매질의 이온 강도를 변화시키고, 파괴적 이온 물질을 첨가하고, pH를 저하시키거나 상승시키고, 계면활성제를 첨가하고, 초음파 처리하고/하거나 하전된 화학물질을 첨가함에 의해 실현될 수 있다); 예를 들어 300nm 이상의 UV 광과 같은 적당한 파장을 갖는 광으로 절단될 수 있는 광 절단될 수 있는 결합을 포함한다.
하나의 예에서, 절단가능한 연결은 N-숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트) (SPDP)를 사용한 접합을 사용하여 형성될 수 있다. 예를 들어, 아민 관능기를 포함하는 표지 입자는 SPDP에 접합되고 수득된 접합체는 이어서 티올 관능기를 함유하는 분석학적 표지와 반응할 수 있으며, 이는 매쓰 표지 모이어티의 접합체로의 연결을 유도한다. 디설파이드 환원제는 (예를 들어, 디티오트레이톨(DTT) 또는 트리스(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP)과 같은) 분석학적 표지로서 티올화된 펩타이드를 방출하는 절단 제제로서 사용될 수 있다.
용어 “광학적 분석학적 표지”는 다음과 같은, 광학 수단에 의한 특이적 검출을 가능하게 하는 분자 그룹을 언급한다: 루미놀, 이소루미놀, 아크리디늄 에스테르, 아다만틸 1,2-디옥세탄 아릴 포스페이트, 이의 금속 유도체, 당해 분야의 연구자들에게 통상적으로 가용한 것들과 같은 화학발광 표지; 플루오레세인, 란탄계 금속, Hoechst 33258, R-피코시아닌, B-피코에리트린, R-피코에리트린, 로다민, DyLight 25 dyes™, 텍사스 레드, 금속 또는 당해 분야의 연구자들에 의해 통상적으로 가용화된 기타의 것들과 같은 형광성 표지(참조: http://www.fluorophores.org/) 또는; 테트라메틸벤지딘 (TMB), 입자, 금속 또는 기타와 같은 발색성 표지. 광학적 분석학적 표지는 현미경, 카메라, 광학 판독기, 비색계, 형광계, 발광계, 굴절계 등와 같은 광학 방법에 의해 검출될 수 있다.
용어 “전기화학적 분석학적 표지”는 다음과 같은 전위차, 용량형 및 산화환원 활성 화합물을 언급한다: Pt, Ag, Pd, Au 및 기타 많은 것들과 같은 금속 또는; 금 졸, 그래핀 옥사이드 및 많은 기타의 것들과 같은 입자 또는; 페로센, 페로시아니드, Os(VI)bipy 및 많은 기타의 것들과 같은 전자 수송 분자 또는; 방향족 알콜 및 아민, 예를 들어, 4-아미노페닐 포스페이트, 2-나프톨, 파라-니트로페놀 포스페이트와 같은 전기화학적 산화환원 활성 분자; 티올 또는 디설파이드, 예를 들어, 방향족, 지방족, 아미노산, 펩타이드 및 단백질 상의 것들; 산소, 질소 또는 황과 같은 비-탄소 환 원자를 함유하는 방향족 헤테로사이클릭, 예를 들어, 이미다졸, 인돌, 퀴놀론, 티아졸, 벤조푸란 및 많은 기타의 것들. 전기화학적 분석학적 표지는 임피던스, 전기용량, 전류법, 전기화학적 임피던스 분광측정 및 다른 측정에 의해 검출가능하다.
표지 입자는 예를 들어, 1 내지 약 108 분석학적 표지, 또는 약 10 내지 약104 분석학적 표지, 또는 약 103 내지 약 105의 분석학적 표지, 또는 약 104 내지 약 108 분석학적 표지, 또는 약 106 내지 약 108 분석학적 표지를 포함할 수 있다. 표지 입자는 단백질, 폴리펩타이드, 중합체, 입자, 탄수화물, 핵산, 지질 또는 X-Y 연결을 통한 부착에 의해 분석학적 표지와 결합을 형성할 수 있는 기타 거대분자로 구성될 수 있다. 단일 표지 입자 상의 다수의 분석학적 표지는 모든 표지 입자가 많은 분석학적 수준을 생성할 수 있으므로 증폭을 가능하게 한다.
용어 “매쓰 표지” 또는 “매쓰 분광측정 분석학적 표지”는 이에 상응하고 분석물 또는 분석물들의 각각의 상이한 변종의 존재 및/또는 양을 결정하기 위해 사용되는 특유의 질량 분광측정 시그네이쳐를 생성하는 분자 그룹을 언급한다. 매쓰 표지는 예를 들어, 펩타이드, 중합체, 지방산, 탄수화물, 유기 아민, 핵산 및 유기 알콜을 포함하지만 이에 제한되지 않는 한정된 구조 및 분자량의 분자이다. 매쓰 표지의 분자량은 예를 들어, 치환 및 쇄 크기에 의해 다양할 수 있다. 중합체 재료의 경우에, 반복되는 유닛의 수는 매쓰 표지로부터 형성되고 질량 분광측정에 의해 검출되는 이온 또는 이온들이 백그라운드 간섭이 없는 영역에 있도록 조정된다.
“매쓰 표지”는 질량 분광측정에 의한 분석에 적용되는 경우 특유의 질량 분광측정 패턴을 유도하는 임의의 분자이다. “매쓰 표지 전구체”는 매쓰 표지가 이로부터 형성되거나 생성될 수 있는 임의의 분자, 입자 또는 둘다의 조합물이다. 매쓰 표지 전구체는 변형제의 작용을 통해 절단에 의해, 모이어티와의 반응에 의해, 유도체화에 의해, 또는 분자, 하전 또는 원자의 첨가 또는 공제에 의해, 예를 들어, 또는 상기 중 2개 이상의 조합에 의해 매쓰 표지로 전환될 수 있다.
매쓰 표지 전구체의 성질은 예를 들어, 매쓰 표지의 성질, 사용되는 MS 방법의 성질, 사용되는 MS 검출기의 성질, 표적 희귀 분자의 성질, 친화성 제제의 성질, 사용되는 임의의 면역검정의 성질, 샘플의 성질, 사용되는 임의의 완충제의 성질, 분리의 성질 중 하나 이상에 의존한다. 일부 예에서, 매쓰 표지 전구체는 이의 매쓰가 치환 및/또는 쇄 크기에 의해 다양할 수 있는 분자이다. 매쓰 표지 전구체로부터 생성된 매쓰 표지는 분석될 샘플에 존재하지 말아야만 하는 한정된 분자량 및 구조를 갖는 분자이다. 추가로, 매쓰 표지는 MS 검출기에 의해 검출될 수 있어야만하고 샘플 또는 분석 액체에 의한 백그라운드 간섭에 적용되지 말아야 한다. 예시적이고 제한되지 않는 매쓰 표지를 생성하기 위해 본원에 기재된 원칙에 따른 방법에 사용하기 위한 매쓰 표지 전구체의 예는 예시적이고 제한되지 않는, 폴리펩타이드, 유기 및 무기 중합체, 지방산, 탄수화물, 사이클릭 탄화수소, 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 유기 카복실산, 유기 아민, 핵산, 유기 알콜(예를 들어, 알킬 알콜, 아실 알콜, 페놀, 폴리올 (예를 들어, 글리콜), 티올, 에폭사이드, 1급, 2급 및 3급 아민, 인돌, 3급 및 4급 암모늄 화합물, 아미노 알콜, 아미노 티올, 페놀 아민, 인돌 카복실산, 페놀산, 비닐로거스산(vinylogous acid), 카복실산 에스테르, 포스페이트 에스테르, 카복실산 아미드, 폴리아미드 및 폴리에스테르로부터의 카복실산, 하이드라존, 옥심, 트리메틸실릴 에놀 에테르, 아세탈. 케탈, 카바메이트, 구아니딘, 이소시아네이트, 설폰산, 설폰아미드, 설포닐 설페이트 에스테르, 모노글리세라이드, 글리세롤 에테르, 스핑고신 염기, 세라민, 세레브로사이드, 스테로이드, 프로스타글란딘, 탄수화물, 뉴클레오시드 및 치료하적 약물을 포함한다.
매쓰 표지로서 기능할 수 있는 펩타이드의 예는 예시적이고 이에 제한되지 않는, 히스티딘, 라이신, 페닐알라닌, 류신, 알라닌, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 트립토판, 프롤린, 발린, 티로신, 글라이신, 트레오닌, 세린, 아르기닌, 시스테인 및 이소류신 및 이의 유도체 중 2개 이상을 함유하는 펩타이드를 포함한다. 일부 예에서, 펩타이드는 약 100 내지 약 3,000 Da의 분자량을 갖고 천연적으로 존재하거나 합성인, 3 내지 30개 아미노산을 함유할 수 있다. 펩타이드 내 아미노산의 수는 예를 들어, 사용되는 MS 기술의 성질에 의해 결정된다. 예를 들어, 검출을 위해 MALDI를 사용하는 경우, 펩타이드는 약 600 내지 약 3,000 범위 내 질량을 갖고 약 6 내지 약 30개 아미노산으로 구성된다. 대안적으로, 질량 분광측정 분석을 위한 전기분무 이온화를 사용하는 경우, 펩타이드는 약 100 내지 약 1,000의 범위에서 매쓰를 갖고 예를 들어, 1 내지 30개 아미노산 또는 이의 아미노산 유도체로 구성된다. 일부 구현예에서, 펩타이드 표지 내 아미노산의 수는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 일 수 있다. 매쓰 표지는 이온화된 그룹, 예를 들어, 카르니틴, 아르기닌 염, 구아니딘 염 및 이들의 유도체와 같은 4급 암모늄 염; 이미다졸, 피롤, 히스티딘, 퀴놀린, 피리딘, 인돌, 퓨린 피리미딘 등과 같은 4급 방향족 암모늄 염; 테트라 알킬 암모늄 이온, 트리알킬 설포늄 이온, 테트라 알킬 포스포늄 이온 및 기타 예를 포함할 수 있다.
매쓰 표지로서 펩타이드의 용도는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 이점을 갖는다: 1) 단백질, 항체, 입자 및 기타 생화학적 실체로의 상대적 접합 용이함; 2) 따라서 매쓰가 다중복합체화된 검정 포맷 및 표준물을 제공하는 많은 상이한 매쓰를 가능하도록 변형될 수 있는 상대적 용이함; 및 3) 검출을 위해 사용되는 질량 분광측정기를 사용한 최적의 수행능을 위한 분자량의 조정 능력. 접합을 위해, 펩타이드는 접합에 사용되는 말단 시스테인을 가질 수 있다. 효율적인 이온화를 원조하기 위해, 펩타이드는 영구적으로 하전되거나 용이하게 이온화될 수 있는 아민 그룹을 가질 수 있다. 일부 예에서, 펩타이드는 N-말단 부재 아민 및/또는 C-말단 부재 산을 갖는다. 일부 예에서, 펩타이드는 하나 이상의 안정한 동위원소가 혼입되어 있거나 하나 이상의 안정한 동위원소로 유도체화된다. 펩타이드는 예를 들어, 본 예에서 스트렙타비딘 또는 플루오레세인에 대한 항체인, 소분자에 대한 상응하는 결합 파트너에 결합하는 것에 대해 예를 들어, 비오틴 또는 플루오레세인과 같은 소분자에 접합될 수 있다.
폴리펩타이드 매쓰 표지는 아미노산의 반복 유닛 또는 서열로 구성되는 임의의 매쓰 표지이다. 폴리펩타이드 매쓰 표지의 경우에, 매쓰 표지, 아미노산 서브유닛의 정체 및/또는 수는 백그라운드 간섭에 적용되지 않는 질량 분광측정 시그네이쳐 또는 피크를 나타내는 매쓰 표지를 산출하도록 조정될 수 있다. 추가로, 질량 분광측정 분석학적 표지는 시험된 샘플 중에 존재하지 않는 특유의 질량 분광측정 시그네이쳐를 갖는 분석학적 표지 전구체로부터 생성될 수 있다. 폴리펩타이드 분석학적 표지 전구체는 단일 분석에서 하나 초과의 결과를 수득하기 위해 복합체화된 측정을 가능하게 하는, 추가의 아미노산 또는 유도체화된 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 매쓰 표지 전구체의 예는 예를 들어, 폴리글라이신, 폴리알라닌, 폴리세린, 폴리트레오닌, 폴리시스테인, 폴리발린, 폴리류신, 폴리이소류신, 폴리메티오닌, 폴리프롤린, 폴리페닐알라닌, 폴리티로신, 폴리트립토판, 폴리아스파르트산, 폴리글루탐산, 폴리아스파라긴, 폴리글루타민, 폴리히스티딘, 폴리라이신 및 폴리아르기닌을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 폴리펩타이드는 촉매에 의해 변형된다. 예를 들어, 예시적이고 이에 제한되지 않게, 페놀 및 방향족 아민은 촉매로서 퍼옥시다제 효소를 사용하여 폴리트레오닌에 부가될 수 있다. 또 다른 예에서, 예시적이지고 이에 제한되지 않게, 전자는 촉매로서 퍼옥시다제 효소를 사용하여 방향족 아민에 전달될 수 있다. 또 다른 예에서, 예시적이고 이에 제한되지 않게, 포스페이트는 촉매로서 포스파타제를 사용하여 유기 포스페이트로부터 제거될 수 있다.
또 다른 예에서, 유도체화제는 매쓰 표지 전구체로부터 매쓰 표지를 생성하기 위해 사용된다. 예를 들어, 디니트로페닐 및 다른 니트로페닐 유도체는 매쓰 표지 전구체로부터 형성될 수 있다. 다른 예는 예시적이고 이에 제한되지 않게, 에스테르화, 아실화, 실릴화, 보호 알킬화, 시프 염기 (Schiff base)와 같은 케톤-염기 응축에 의한 유도체화, 폐환, 형광성 유도체의 형성, 및 무기 음이온을 포함한다. 유도체화 반응은 MS 분석 전, 친화성 반응 후 일어날 수 있거나 친화성 시약에 접합된 매쓰 표지 전구체를 생성하도록 사용될 수 있다.
일부 예에서, 매쓰 표지 전구체는 이에 제한되지 않지만, 매쓰 표지 전구체로부터 유래되는 매쓰 표지에 남아있는, 예를 들어, 2H, 13C, 및 18O와 같은 하나 이상의 동위원소를 포함할 수 있다. 상기 매쓰 표지는 질량 분광측정 시그네이쳐를 기반으로 검출될 수 있다. 일부 예에서, 매쓰 표지 전구체는 이에 제한되지 않지만, 예를 들어, 알킬화된 아민, 아세탈, 1급 아민 및 아미드와 같은, 결합 절단을 유발하는 상대적으로 높은 잠재력을 갖는 하나이다.
내부 표준물은 질량 스펙트럼 분석의 중요한 양상이다. 일부 예에서, 제2 매쓰 표지 또는 구조적으로 유사한 화합물은 표적 희귀 분자의 검출을 위해 사용되는 매쓰 표지를 정량하기 위해 사용되는 분석 액체 (내부 표준물로서)에 첨가된다. 일부 경우에, 내부 표준물은 동중원자핵 변화성이지만(매쓰 표지와 동일한 모체 m/z를 공유하는) 질량 분광측정기 내부에서 단편화되는 경우 특유의 질량 분광측정 패턴을 나타낸다. 다른 경우에, 내부 표준물은 모체 m/z가 매쓰 표지의 것과 약간 상이하도록 선택된다. 내부 표준물은 또한 추가의 아미노산 또는 유도체화된 아미노산을 함유할 수 있다. 대안적으로, 내부 표준물은 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 2H (D), 13C, 및 18O와 같은 하나 이상의 동위원소 요소를 혼입시킴에 의해 제조될 수 있다. 상기 경우에, 매쓰 표지(또는 내부 표준물)는 천연의 물질과는 상이한 질량을 갖는다. 예를 들어, 글리세롤-C-d7, 나트륨 아세테이트-C-d7, 나트륨 피루베이트-C-d7, D-글루코스-C-d7, 중수소화된 글루코스, 및 덱스트로스-C-d7는 각각 글리세롤, 나트륨 아세테이트, 나트륨 피루베이트, 글루코스 및 덱스트로스에 대한 내부 표준물로서 작용한다.
일부 경우에, 내부 표준물 및/또는 다중복합체화된 분석을 위한 동중원자핵 변화성 매쓰 표지는 펩타이드 매쓰 표지의 정규 분자량이 변화되지 않도록 유지되고 질량 분광측정기 내부에서 단편화가 상이한 매쓰 표지 펩타이드에 대한 특유의 질량 분광측정 시그네이쳐를 유도하도록 아미노산 치환을 갖는 상이한 펩타이드를 사용한다. 상기 펩타이드의 예는 528.7.7 Da의 분자량을 공유하는 GAIIR 및 AAIVR, 또는 631.8Da의 분자량을 공유하는 RAAVIC 및 RGIAI의 아미노산 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 경우에, 동중원자핵 변화성 매쓰 표지 펩타이드 및 내부 표준물은 질량 분광측정 분석 동안에 단편화가 하나 이상의 특유의 검출가능한 단편을 생성하도록 스크램블된 아미노산 서열을 사용한다. 내부 표준물 또는 다중복합체화될 수 있는 매쓰 표지로서 사용될 수 있는, 스크램블된 아미노산 서열을 갖는 매쓰 표지 펩타이드의 예는 모두 527.7 Da의 분자량을 공유하는, GAIIR, AIIGR, 및 IGIAR의 아미노산 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
매쓰 표지 펩타이드는 유리된 아민 그룹 (예를 들어, N-말단 아민) 또는 유리된 카복실그룹(예를 들어, C-말단 카복실 그룹)이 변화되어 상이한 기능성 그룹이도록 변형될 수 있다. 예시적이고 이에 제한되지 않게, 유리된 아민은 아세틸 그룹, 포밀 그룹, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc), 숙시닐(Suc), 클로로아세틸 (Cl-Ac), 말레이미드(Mal), 벤질옥시카보닐(CBZ), 브로모아세틸(Br-Ac), 니트릴로트리아세틸, 테르부톡시카보닐(Boc), 4-하이드록시페닐프로피온산 (HPP), 리포산(LA), 페길화, 알킬옥시카보닐(Alloc), 등이도록 변형될 수 있다. 유리된 카복실 그룹 변형의 예는 아미드화 (NH2), 펩타이드 알데하이드, 알콜 펩타이드, 클로로메틸케톤(CMK), 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC), p-나트로아닐린(pNA), 파라-니트로페놀 (-ONP), 하이드록시숙신이미드 에스테르 (-OSu), 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적이고 제한되지 않게, 유리된 아민 및/또는 카복실 그룹으로의 변형은 이온화 효율을 증가시키거나, 질량 분광측정 패턴, 동중원자핵 변화성 매쓰 표지 펩타이드의 생성을 변화시키거나, 매쓰 표지 펩타이드를 표지 입자에 커플링시키기 위해 사용될 수 있는 기능성 그룹을 도입하거나 매쓰 표지 펩타이드의 매쓰를 변화시킬 목적을 위해 수행될 수 있다.
MS 분석은 정확한 동정 및 측정을 위해 분자의 질량 대 하전 비율 (m/z)을 결정한다. 이온 (이온화)의 생성은 여러 기술에 의해 성취될 수 있고, 상기 기술은 예를 들어, 매트릭스-원조 레이져 탈착 이온화(MALDI), 대기압 화학적 이온화(APCI), 전기분무 이온화(ESI), 유도성 전기분무 이온화(iESI), 화학적 이온화(CI), 전자 충격 이온화(EI), 고속 원자 충격(fast atom bombardment (FAB)), 장 탈착 (field desorption)/장 이온화(field ionization) (FC/FI), 열분무 이온화(TSP), 및 나노분무 이온화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 질량은 여러 기술에 의해 질량 분광측정기에 의해 모니터링되고 상기 기술은 예시적이고 이에 제한되지 않게, 비행 시간법(Time-of-Flight) (TOF), 이온 포집, 사중극 매쓰 필터, 자기 섹터, 전기 섹터, 및 퓨리어 변환 이온 사이클로트론 공명(FTICR)을 포함한다. 상기 MS 방법은 연속으로 반복 (MSn)될 수 있고, 여기서, 모체 이온이 선택되고 단편화에 적용되고 이후 MS 분석기 내 생성된 단편은 측정된다. 단편은 후속적 분석을 위한 MS 분석기 내 추가의 단편화에 적용될 수 있다. 샘플 프로세싱 단계는 흔히 예시적이고 이에 제한되지 않게, 액체 크로마토그래피(LC), 기체 크로마토그래피(GC), 이온 이동 분광측정기 (IMS), 및 친화성 분리와 같은 MS 분석 전에 수행된다.
질량 분광측정에 의한 분석 후, 각각의 상이한 매쓰 표지의 존재 및/또는 양은 표적 희귀 세포 및/또는 입자-결합된 표적 희귀 분자의 각각 상이한 집단의 존재 및/또는 양과 관련된다. 매쓰 표지와 표적 분자 간의 관계는 표적 분자에 특이적인, 친화성 제제의 사용을 통해 확립된다. 보정기를 사용하여 매쓰 표지로부터의 신호의 양과 샘플 중 표적 희귀 분자의 양 간의 관계를 확립한다.
친화성 제제의 예
친화성 제제는 표적 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 분자이다. 선택적 결합은 실질적으로 적은다른 분자의 인지와 비교하여, 분자 중 하나의 특이적 인지를 포함한다. 용어 “결합” 또는 “결합된”은 2개의 모이어티가 서로 관련되는 방식을 언급한다.
친화성 제제는 면역글로불린, 단백질, 펩타이드, 금속, 탄수화물, 금속 킬레이터, 핵산, 또는 특정 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 다른 분자일 수 있다. 선택적 결합은 실질적으로 적은 다른 분자의 인지와 비교하여, 다른 것에 대한 2개 상이한 분자 중 하나의 특이적 인지를 포함한다. 상기 연합은 특이적 이온 결합, 소수성 결합, 포켓 결합 등과 같은 비-공유 결합을 통해서이다. 대조적으로, “비-특이적 결합”은 유사 분자의 부류에서 일반적이고 임의의 특정 분자에 특이적이지 않은 분자들 간의 소수성 또는 정전기 관계를 포함하는 여러 인자들로부터 비롯될 수 있다.
면역글로불린인 친화성 제제는 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3, IgM, 등과 같은 다양한 부류 및 이소형을 포함하는, 완전한 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 이의 단편은 예를 들어, Fab, Fv 및 F(ab')2, 및 Fab'을 포함할 수 있다. 추가로, 면역글로불린 또는 이들의 단편의 응집체, 중합체 및 접합체는 특정 분자에 대한 결합 친화성이 유지되는 한, 적절한 경우 사용될 수 있다.
항체는 희귀 분자에 특이적이고 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 상기 항체는 숙주의 면역화 및 혈청 (폴리클로날)의 수거와 같은 기술 분야에 널리 공지된 기술에 의해 또는 연속 하이브리드 세포주를 제조하고 분비된 단백질 (모노클로날)을 수거함에 의해 또는 적어도 천연 항체의 특이적 결합을 위해 요구되는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 돌연변이된 버젼을 클로닝하거나 발현시킴에 의해 제조될 수 있다.
폴리클로날항체 및 모노클로날 항체는 당업계에 널리 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 하나의 접근법에서, 모노클로날 항체는 체세포 하이브리드화 기술에 의해 수득된다. 모노클로날 항체는 문헌(참조: Koehler and Milstein, Nature 265:495-497, 1975)의 표준 기술에 따라 생산될 수 있다. 모노클로날 항체 기술은 문헌(참조: Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers, et al. Springer-Verlag 20 (New York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980), and Methods of Enzymology 73 (Part B): 3-46 (1981))에서 검토된다. 일반적으로, 모노클로날 항체는 이에 제한되지 않지만, 예를 들어, 크로마토그래피, 예를 들어, DEAE 크로마토그래피, ABx 크로마토그래피, 및 HPLC 크로마토그래피; 및 여과와 같은 공지된 기술에 의해 정제될 수 있다.
친화성 제제는 추가로 희귀 세포를 분류하거나 세포의 생물학적 세포내 프로세스를 측정하기 위해 사용되는 희귀 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 “세포 친화성 제제”일 수 있다. 이들 친화성 제제는 특정 세포 유형과 관련된 항원을 특이적으로 인지하고 이에 결합하고, 상기 항원이 세포의 성분인 면역글로불린일 수 있다. 상기 세포 친화성 제제는 세포에 또는 세포 상에 흡수될 수 있다. 선택적 세포 결합은 전형적으로 “결합 쌍의 특이적 구조물에 상대적으로 의존하는 분자들 (친화성 제제 및 표적 희귀 분자) 간의 결합”을 포함한다. 선택적 결합은 비-특이적 인지에 의존하지 않는다.
표지 및 포획 입자의 예
친화성 제제는 희귀 분자를 검출하거나 단리할 목적으로 분석학적 표지 및/또는 입자에 부착될 수 있다. 상기 부착은 이어서 분석학적 표지에 부착되는 “표지 입자”를 통해 일어날 수 있다. 친화성 제제는 또한 “포획 입자”에 부착될 수 있고 이는 결합되고 비결합된 분석학적 표지 또는 희귀 분자의 분리를 가능하게 한다. 용어 “부착된” 또는 “부착”은 2개의 모이어티가 연결된 방식을 언급한다. 이것은 상기 2개의 모이어티 간의 직접적인 결합, 또는 상기 2개의 모이어티 간의 연결 그룹, 공유 결합 또는 또 다른 결합에 의해 성취될 수 있다. 대안적으로, 친화성 제제는 추가의 “결합 파트너”를 사용하여 분석학적 표지 및/또는 입자에 부착될 수 있다. 용어 “결합 파트너”는 각각의 파트너에 결합하지만 다른 분자에는 결합하지 않는 친화성 제제 또는 “친화성 태그”의 특이적 결합 쌍의 구성원인 분자를 언급한다. 일부 예에서, 친화성 태그는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 예를 들어, 폴리히스티딘 태그, 폴리아르기닌 태그, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST tag), 면역글로불린 또는 많은 기타의 것들일 수 있다. 일부 경우에, 친화성 제제는 무엇 보다 항체에 대한 항원 또는 항체에 대한 합텐, 아비딘에 대한 비오틴, 뉴트라비딘에 대한 비오틴, 스트렙타비딘에 대한 비오틴, 단백질 A에 대한 IgG, 1차 항체에 대한 2차 항체, 형광성 표지에 대한 항체와 같은 면역학적 쌍의 구성원일 수 있다.
“표지 입자”는 링커 아암 또는 결합 쌍을 통한 친화성 제제에 부착된 미립자 물질이다. “표지 입자”는 표지 입자와 친화성 제제 또는 태그 간에 뿐만 아니라 표지 입자와 분석학적 표지 간의 X-Y 절단될 수 있는 연결을 형성할 수 있다. 표지 입자의 크기는 1 내지 108개 분석학적 표지와 1개 내지 108개 친화성 제제 또는 태그를 수용하기에 충분히 크다. 단일 표지 입자 상의 분석학적 표지 및 친화성 제제 또는 태그의 비율은 예를 들어, 108 대 1, 106 대 1, 또는 105 대 1, 또는 104 대 1, 또는 103 대 1, 또는 102 대 1, 또는 10 대 1일 수 있다. 표지 입자와 연합된 친화성 제제 또는 태그 및 분석학적 표지의 수는 예를 들어, 친화성 제제 또는 태그의 성질 및 크기, 표지 입자의 성질 및 크기, 링커 아암의 성질, 표지 입자 상의 기능성 그룹들의 수 및 유형, 및 분석학적 표지 상의 기능성 그룹의 수 및 유형 중 하나 이상에 의존한다.
표지 입자는 분석물의 특정 변종에 특이적인 추가의 친화성 제제에 부착된 포획 입자와 조합하여 사용될 수 있다. “포획 입자” 및/또는 표지 입자는 직접 연결 또는 결합 쌍을 통해 친화성 제제 또는 태그로 부착될 수 있는 미립자 재료이다. 표지 또는 포획 입자 실체의 조성물은 유기 또는 무기, 자기성 또는 비-자기성일 수 있다. 유기 중합체는 예시적이고 이에 제한되지 않게, 예를 들어, 그들 자체 또는 라텍스를 포함하는 다른 재료와 함께 사용되는, 니트로셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트), 폴리(스티렌/디비닐-벤젠), 폴리(스티렌/아크릴레이트), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 덴드리머, 멜라민 수지, 나일론, 폴리(비닐 부티레이트)를 포함한다. 상기 입자는 또한 예를 들어, 탄소 (예를 들어, 탄소 나노튜브), 금속 (예를 들어, 이의 금속 산화물을 포함하는 금, 은 및 철), 콜로이드, 덴드리머, 덴드론, 및 리포좀으로 구성될 수 있다. 일부 예에서, 상기 입자는 실리카일 수 있다.
다른 일부 예에서, 입자는 자기성일 수 있다. 입자는 예시적이고 이에 제한되지 않게 유리된 카복실산, 아민 또는 토실 그룹을 나타낼 수 있거나 나타내도록 변형될 수 있다. 일부 예에서, 입자는 메소다공성 (mesoporous)일 수 있고 공극 내 분석학적 표지를 포함한다.
표지 또는 포획 입자의 직경은 예를 들어, 희귀 분자의 성질, 샘플의 성질, 세포의 투과성, 세포의 크기, 핵산의 크기, 친화성 제제의 크기, 분리를 위해 적용되는 자기력, 여과 매트릭스의 성질 및 공극 크기, 입자의 매트릭스로의 접착, 입자의 표면, 매트릭스의 표면, 액체 이온 강도, 액체 표면 장력 및 액체 내 성분들, 연합된 표지 입자의 수, 크기, 형태 및 분자 구조 중 하나 이상에 의존한다. 일부 예에서, 포획 이자의 평균 직경은 적어도 1 μm이지만 약 20 μm이하이다.
용어 “투과성”은 입자 및 분자가 세포벽 또는 세포막과 같은 벽을 통해 확산하는 능력을 의미한다. 세포 내부에서 희귀 분자 검출의 경우에, 표지 입자의 직경은 친화성 제제(표지 입자에 부착된)가 세포에 진입하도록 하기에 충분히 작아야만 한다. 대안적으로, 표지 입자와 친화성 제제 간의 연결은 충분한 길이를 가져야만 하고 친화성 제제의 세포 내부로의 접근을 가능하게 하기에 충분한 투과성을 가져야만 한다. 표지 입자는 콜라게나제, 펩타이드, 단백질, 지질, 계면활성제 및 세포에 대한 입자 투과성을 증가시키는 것으로 공지된 다른 화학물질과 같은 “투과성”을 증가시키는 재료로 코팅될 수 있다.
다공성 매트릭스가 여과 분리 단계에 사용되는 경우, 표지 입자의 직경은 다공성 매트릭스의 공극을 효율적으로 통과하기에 충분히 작아야만 한다. 추가로, 포획 입자의 직경은 매트릭스 상에 결합된 희귀 분자를 보유시키기 위해 다공성 매트릭스의 공극을 통과하지 못하도록 하기 위해 충분히 커야 한다. 세포-결합된 희귀 분자 검출의 경우에, 세포는 다공성 매트릭스의 공극을 통해 통과하지 못하도록 하기에 충분한 크기를 가져야만 한다. 본원에 기재된 원칙에 따른 일부 예에서, 표지 입자의 평균 직경은 적어도 0.01 마이크론 (10 nm) 및 약 10 μm 이하이어야만 한다. 일부 예에서, 입자의 표면으로의 접착은 입자가 매트릭스의 공극 보다 작은 직경을 가짐에도 불구하고 다공성 매트릭스 상에 보유되도록 하기 위해 충분히 강하다.
친화성 제제는 연결 그룹에 의한 포획 입자 또는 표지 입자에 직접적으로 부착시켜 제조될 수 있다. 연결 그룹은 또한 폴리사카라이드, 펩타이드, 단백질, 뉴클레오타이드 및 덴드리머와 같은 거대분자일 수 있다. 연결 그룹은 하나 이상의 절단가능하거나 절단가능하지 않은 연결 모이어티를 함유할 수 있다. 절단가능한 모이어티의 절단은 전기화학적 환원을 통해서 및 화학적 또는 물리적 방법을 통해서 성취될 수 있다. 상기 방법은 추가로, 예를 들어, 산화, 환원, 가용매 분해, 예를 들어, 가수분해, 광분해, 열분해, 전기분해, 초음파 처리 및 화학적 치환을 포함할 수 있다. 광절단가능한 결합은 적당한 파장을 갖는 광, 예를 들어, UV 광으로 절단될 수 있다. 절단 제제의 성질은 절단될 수 있는 모이어티의 성질에 의존한다.
입자와 친화성 제제 간의 연결 그룹은 각각 정상적으로 수소, 탄소, 산소, 황, 질소, 및 인, 통상적으로 수소, 탄소 및 산소로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 약 200개 이상의 원자의 쇄일 수 있다. 연결 그룹 내 헤테로원자의 수는 약 0 내지 약 8, 약 1 내지 약 6, 또는 약 2 내지 약 4의 범위일 수 있다. 연결 그룹의 원자는 예를 들어, 알킬, 아릴, 아르알킬, 하이드록실, 알콕시, 아릴옥시 또는 아르알콕시 그룹의 형태 내 하나 이상의 탄소, 산소 및 질소와 같은, 수소 이외의 다른 원자로 치환될 수 있다. 일반적으로, 특정 연결 그룹의 길이는 합성의 편의를 제공히기 위해 임의로 선택될 수 있고, 단, 본원에 기재된 방법과 관련된 이들의 기능을 수행하는 연결된 분자의 능력에 대해 연결 그룹에 의해 유발되는 간섭이 최소여야 한다.
분리 및 단리 후 보유되는 표지 및 포획 입자의 양과 관련된 재현성을 수득하는 것은 희귀 분자 분석을 위해 중요하다. 추가로, 세포에 진입하는 입자의 양에 대한 지식은 특이적 결합의 양을 최대화하기 위해 중요하다. 세척 후 잔류하는 입자의 양을 아는 것은 비-선택적 결합의 양을 최소화하기 위해 중요하다. 이들 결정을 하기 위해, 입자가 형광성, 발색 또는 화학발광 표지를 포함하는 “광학 표지”를 포함하는 경우 도움이 된다. 따라서, 표지 입자의 존재는 광학 표지의 존재에 의해 측정될 수 있다. 광학 표지는 현미경 및 분석물을 함유하고 함유하지 않는 샘플에 대해 비교된 결과에 의해 측정될 수 있다. 형광성 표지는 예를 들어, dylight™, FITC, 로다민 화합물, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프트알데하이드, 형광성 희토류 킬레이트, 아미노-쿠마린, 움벨리페론, 옥사진, 텍사스 레드, 아크리돈, 페릴렌, 예를 들어, 4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센 및 이의 변형체, 9,10-비스-페닐에티닐안트라센, 스쿠아린 염료 및 플루오레스카민과 같은 인다신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이어서 형광성 현미경 또는 형광성 분광측정기를 사용하여 표지 입자의 위치 및 양을 결정할 수 있다. 화학발광 표지의 예는 거론하자면 루미놀, 아크리디늄 에스테르 및 아크리디늄 설폰아미드를 포함한다. 발색 표지는 거론 하자면 색 입자, 금 입자, 비색 반응을 유도하는 효소를 포함한다.
다공성 매트릭스 및 여과의 예
본원의 예에서, 다공성 매트릭스를 사용하여 희귀 분자의 단리 및/또는 검출 동안에 포획 입자 및 세포를 단리한다. 다공성 매트릭스가 사용되고, 여기서, 입자는 물리적으로 입자가 공극을 통과할 수 있도록 매트릭스의 공극 크기 보다 충분히 작다. 다른 예에서, 입자는 물리적으로 입자가 공극을 통과할 수 없도록 매트릭스의 공극 크기 보다 충분히 크다.
본원에 기재된 원칙에 따른 일부 방법에서, 샘플은 희귀 분자의 각각의 상이한 집단에 대해 분석학적 표지 및 표지 입자로 이루어진 친화성 제제와 항온처리한다. 상기 친화성 제제는 희귀 분자의 집단 중 하나의 희귀 분자에 특이적이고 결합하는 특이적 결합 파트너를 포함한다. 희귀 분자는 세포 결합되어 있거나 세포 부재일 수 있다. 분석학적 표지 및 표지 입자와 함께 친화성 제제는 막의 표면 상에 보유된다.
일부 예에서 여과를 위해 사용되는 다공성 매트릭스는 공극이 비결합된 표지 입자가 공극을 통과하는 충분한 크기를 갖고 희귀 분자를 포함하는 세포는 세포에 결합된 표지 입자와 함께 다공성 매트릭스 상에 보유되도록 한다. 여전히 다른 방법에서, 표지 입자 상에 친화성 제제는 추가로 “결합 파트너” 또는 “샌드위치 검정”을 통해 포획 입자 (예를 들어, 자기 입자) 또는 표면에 결합될 수 있다. 이전의 경우에, 포획 입자는 다공성 매트릭스의 표면 상에 보유된다.
일부 예에서, 희귀 분자의 하나 이상의 상이한 집단의 농도는 비-희귀 분자의 것 보다 증진되어 농축된 샘플을 형성한다. 일부 예에서, 샘플은 희귀 분자를 보유하는 다공성 매트릭스를 사용하는 여과 공정에 적용하고 비-희귀 분자가 다공성 매트릭스를 통과하도록 하여 희귀 분자의 농도를 증가시킨다. 하나 이상의 희귀 분자가 비-세포성, 즉 세포 또는 다른 생물학적 샘플과 연합되어 있지 않은 경우, 샘플은 하나 이상의 포획 입자 실체와 조합되고, 여기서, 각각의 포획 입자 실체는 비-세포 희귀 분자가 미립자 형태로 되도록 하기 위해, 즉, 입자-결합된 비-세포 희귀 분자를 형성하기 위해 비-세포 희귀 분자의 집단 각각의 비-세포 희귀 분자에 대한 결합 파트너를 포함한다. 샘플과 포획 입자 실체의 조합은 일정 기간 동안 및 비-세포 희귀 분자와 포획 입자 실체의 상응하는 결합 파트너의 결합을 허용하는 온도에서 유지시킨다. 압력 구배 (즉, 진공)는 다공성 매트릭스 상의 샘플에 적용하여 비-희귀 세포, 비-희귀 분자 및 다른 샘플 내용물이 매트릭스를 용이하게 통과하도록 한다. 적용된 압력 구배는 예를 들어, 희귀 세포 및/또는 입자 시약의 상이한 집단의 성질 및 크기, 다공성 매트릭스의 성질 및 다공성 매트릭스의 공극의 크기 중 하나 이상에 의존한다.
샘플과 다공성 매트릭스의 접촉은 상기 논의된 바와 같이 표면 상에 세포 희귀 분자 및/또는 입자 결합된 비-세포 희귀 분자의 보유를 성취하기에 충분한 기간 동안 계속한다. 상기 기간은 예를 들어, 희귀 세포 및/또는 입자-결합된 희귀 분자의 성질 및 크기, 다공성 매트릭스의 성질, 다공성 매트릭스의 공극의 크기, 다공성 매트릭스 상의 혈액 샘플에 적용되는 진공 수준, 여과될 용적 및 다공성 매트릭스의 표면적 중 하나 이상에 의존한다. 일부 예에서, 접촉 기간은 예를 들어, 약 1분 내지 약 1시간, 약 5분 내지 약 1시간, 또는 약 5분 내지 약 45분, 또는 약 5분 내지 약 30분, 또는 약 5분 내지 약 20분, 또는 약 5분 내지 약 10분, 또는 약 10분 내지 약 1시간, 또는 약 10분 내지 약 45분, 또는 약 10분 내지 약 30분, 또는 약 10분 내지 약 20분이다.
본원에 기재된 원칙에 따른 방법에 사용되는 각각의 상이한 친화성 제제의 양은 예를 들어, 희귀 분자의 각각의 상이한 집단의 성질 및 잠재적 양, 분석학적 표지의 성질, 부착 성질, 친화성 제제의 성질, 존재하는 경우 세포의 성질, 사용되는 경우 입자의 성질, 및 사용되는 경우 차단제의 양 및 성질 중 하나 이상에 의존한다. 일부 예에서, 사용되는 각각의 상이한 변형된 친화성 제제의 양은 예를 들어, 약 0.001 μg/μL 내지 약 100 μg/μL, 또는 약 0.001 μg/μL 내지 약 80 μg/μL, 또는 약 0.001 μg/μL 내지 약 60 μg/μL, 또는 약 0.001 μg/μL 내지 약 40 μg/μL, 또는 약 0.001 μg/μL 내지 약 20 μg/μL, 또는 약 0.001 μg/μL 내지 약 10 μg/μL, 또는 약 0.5 μg/μL 내지 약 100 μg/μL, 또는 약 0.5 μg/μL 내지 약 80 μg/μL, 또는 약 0.5 μg/μL 내지 약 60 μg/μL, 또는 약 0.5 μg/μL 내지 약 40 μg/μL, 또는 약 0.5 μg/μL 내지 약 20 μg/μL, 또는 약 0.5 μg/μL 내지 약 10 μg/μL이다.
다공성 매트릭스는 고체 또는 반고체 재료이고 이는 본원에 기재된 발명에 따른 액체 (매트릭스의 하나 이상의 공극을 통한 것을 제외하고는)에 불투과성이다. 다공성 매트릭스는 다공성 매트릭스 홀더 및 액체 유지 웰과 연합되어 있다. 다공성 매트릭스와 홀더 간의 연합은 접착제의 사용으로 성취될 수 있다. 홀더 내 다공성 매트릭스와 액체 홀딩 웰 간의 연합은 직접적인 접촉 또는 가요성 개스킷 표면과의 접촉을 통해서일 수 있다.
다공성 매트릭스는 고체 또는 반-고체 재료이고 유기 또는 무기, 수불용성 재료로 구성될 수 있다. 다공성 매트릭스는 비-흡습성이고, 이는 상기 막이 액체를 흡수할 수 없음을 의미한다. 일부 예에서, 다공성 매트릭스에 의해 흡수되는 액체의 양은 약 2% (용적) 미만, 또는 약 1% 미만, 또는 약 0.5% 미만, 또는 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만, 또는 0%이다. 다공성 매트릭스는 비-섬유성이고, 이는 상기 막이 섬유의 적어도 95% 부재, 또는 섬유의 적어도 99% 부재, 또는 섬유의 적어도 99.5% 부재, 또는 적어도 99.9% 부재, 또는 100% 부재임을 의미한다.
다공성 매트릭스는 예를 들어, 평면 또는 편평한 표면(예를 들어, 스트립, 디스크, 필름, 매트릭스 및 플레이트)와 같은 임의의 다수의 형태를 가질 수 있다. 매트릭스는 천연 또는 합성, 중합체 또는 비중합체일 수 있는 다양한 재료로부터 제작될 수 있다. 다공성 매트릭스의 형태는 예를 들어, 막에 대한 홀더, 마이크로유체 표면, 액체 홀딩 웰의 성질 또는 형태 중 하나 이상에 의존한다. 일부 예에서, 다공성 매트릭스의 형태는 예를 들어, 환형, 타원형, 직사각형, 정사각형, 트랙-에칭형, 평면 또는 편형한 표면형(예를 들어, 스트립, 디스크, 필름, 막 및 플레이트)이다.
다공성 매트릭스와 홀더는 천연 또는 합성, 중합체 또는 비중합체일 수 있는 다양한 재료로부터 제작될 수 있다. 다공성 매트릭스를 제작하기 위한 상기 재료의 예는 예시적이고 제한되지 않으며, 예를 들어, 폴리카보네이트, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리-(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리-(에틸렌 테레프탈레이트), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 폴리(클로로트리플루오로에틸렌), 폴리(비닐-부티레이트), 폴리이미드, 폴리우레탄, 및 파라일렌과 같은 플라스틱; 실란; 규소; 질화규소; 흑연; 세라믹 재료 (예를 들어, 알루미나, 지르코니아, PZT, 탄화규소, 질화알루미늄); 금속 재료(예를 들어, 금, 탄탈룸, 텅스텐, 백금 및 알루미늄과 같은); 유리(예를 들어, 보로실리케이트, 소다 라임 유리, 및 pyrex®와 같은); 및 생흡수가능한 중합체 (예를 들어, 폴리락트산, 폴리카프롤락톤 및 폴리글리코산과 같은); 예를 들어, 이들 자체로 사용되는 것들 또는 서로 및/또는 다른 재료와 연계하여 사용되는 것들을 포함한다. 다공성 매트릭스 및 홀더의 제작을 위한 재료는 비-흡수성이고, 흡수성 및/또는 투과성임에 따라서 본원에 기재된 원칙에 따르지 않는, 셀룰로스(종이를 포함하는), 니트로셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 레이온, 디아세테이트, 리그닌, 미네랄 섬유, 섬유성 단백질, 콜라겐, 합성 섬유(예를 들어, 나일론, 다크론, 올레핀, 아크릴, 폴리에스테르 섬유) 또는 다른 섬유성 재료(유리 섬유, 금속 섬유)와 같은 섬유성 재료를 포함하지 않는다. 다공성 매트릭스 및 홀더의 제작을 위한 재료는 동일하거나 상이한 재료일 수 있다.
각각의 액체 홀딩 웰을 위한 다공성 매트릭스는 평방 센티미터 (cm2) 당 적어도 하나의 공극 및 약 2,000,000개 이하의 공극을 포함한다. 일부 예에서, cm2 당 다공성 매트릭스의 공극의 수는 예를 들어, 1 내지 약 2,000,000, 또는 1 내지 약 1,000,000, 또는 1 내지 약 500,000, 또는 1 내지 약 200,000, 또는 1 내지 약 100,000, 또는 1 내지 약 50,000, 또는 1 내지 약 25,000, 1 내지 약 10,000, 또는 1 내지 약 5,000, 또는 1 내지 약 1,000, 또는 1 내지 약 500, 또는 1 내지 약 200, 또는 1 내지 약 100, 또는 1 내지 약 50, 또는 1 내지 약 20, 또는 1 내지 약 10, 또는 2 내지 약 500,000, 또는 2 내지 약 200,000, 또는 2 내지 약 100,000, 또는 2 내지 약 50,000, 또는 2 내지 약 25,000, 또는 2 내지 약 10,000, 또는 2 내지 약 5,000, 또는 2 내지 약 1,000, 또는 2 내지 약 500, 또는 2 내지 약 200, 또는 2 내지 약 100, 또는 2 내지 약 50, 또는 2 내지 약 20, 또는 2 내지 약 10, 또는 5 내지 약 200,000, 또는 5 내지 약 100,000, 또는 5 내지 약 50,000, 또는 5 내지 약 25,000, 또는 5 내지 약 10,000, 또는 5 내지 약 5,000, 또는 5 내지 약 1,000, 또는 5 내지 약 500, 또는 5 내지 약 200, 또는 5 내지 약 100, 또는 5 내지 약 50, 또는 5 내지 약 20, 또는 5 내지 약 10이다. 다공성 매트릭스 내 공극의 밀도는 예를 들어, 다공성 매트릭스의 표면적의 약 1% 내지 약 20%, 또는 약 1% 내지 약 10%, 또는 약 1% 내지 약 5%, 또는 약 5% 내지 약 20%, 또는 약 5% 내지 약 10%이다. 일부 예에서, 다공성 매트릭스의 공극의 크기는 본원에 기재된 원칙에 따라 형성된 액적의 통과를 허용하면 액체를 우선적으로 보유하기에 충분한 크기이다. 다공성 매트릭스의 공극의 크기는 예를 들어, 액체의 성질, 세포의 크기, 포획 입자의 크기, 분석학적 표지의 크기, 분석물의 크기, 표지 입자의 크기, 비-희귀 분자의 크기 및 비-희귀 세포의 크기에 의존한다. 일부 예에서, 다공성 매트릭스의 공극의 평균 크기는 예를 들어, 약 0.1 내지 약 20 마이크론, 또는 약 0.1 내지 약 5 마이크론, 또는 약 0.1 내지 약 1 마이크론, 또는 약 1 내지 약 20 마이크론, 또는 약 1 내지 약 5 마이크론, 또는 약 1 내지 약 2 마이크론, 또는 약 5 내지 약 20마이크론, 또는 약 5 내지 약 10 마이크론이다.
매트릭스 내 공극은 예를 들어, 마이크로전자기계 (MEMS) 기술, 산화금속 반도체(CMOS) 기술, 마이크로시브 (microsieve)를 제조하기 위한 마이크로-제조 프로세스, 레이져 기술, 조사, 몰딩, 및 마이크로가공, 또는 이의 조합에 의해 본원에 기재된 원칙에 따라 제작될 수 있다.
일부 경우에, 다공성 매트릭스는 영구적으로 액체 홀딩 웰의 하부 및 진공 매니폴드의 상부로 연합될 수 있는 홀더에 부착되고, 여기서, 상기 다공성 매트릭스는 액체가 액체 홀딩 웰로부터 진공 매니폴드로 유동할 수 있도록 위치한다. 일부 예에서, 홀더 내 다공성 매트릭스는 마이크로유동성 표면, 상부 덮개 표면 및/또는 하부 덮개 표면에 연합될 수 있다. 홀더는 다공성 매트릭스의 재료와 상용성인 임의의 적합한 재료로 작제될 수 있다. 상기 재료의 예는 예시적이고 이에 제한되지 않으며 다공성 매트릭스에 대해 상기된 임의의 재료를 포함한다. 하우징을 위한 및 다공성 매트릭스를 위한 재료는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 홀더는 비-다공성 유리 또는 플라스틱 필름으로 작제될 수 있다.
플라스틱 필름 재료의 예는 폴리스티렌, 폴리알킬렌, 폴리올레핀, 에폭시, Teflon®, PET, 클로로-플루오로에틸렌, 폴리비닐리덴 플우오라이드, PE-TFE, PE-CTFE, 액정 중합체, Mylar®, 폴리에스테르, 폴리메틸펜텐, 폴리페닐렌 설파이드 및 PVC 플라스틱 필름을 포함한다. 플라스틱 필름은 예를 들어, 알루미늄과 금속화될 수 있다. 상기 플라스틱 필름은 상대적으로 낮은 수분 투과율, 예를 들어, m2-일 당 0.001mg을 갖는다. 상기 다공성 매트릭스는 열 결합, 기계적 결합을 사용하거나 폴리비닐 아세테이트와 같은 건조 접착제와 같은 영구 접착제, 아크릴레이트 기반 중합체와 같은 감압성 접착제, 천연 고무 및 폴리클로로프렌과 같은 접촉성 접착제, 에틸렌-비닐 아세테이트와 같은 고용융 접착제, 및 폴리에스테르, 폴리올, 아크릴, 에폭시, 폴리이미드, 실리콘 고무-기반 및 변형된 아크릴레이트 및 폴리우레탄 조성물과 같은 반응성 접착제, 덱스트린, 카제인, 리그닌과 같은 천연 접착제와 같은 반응성 접착제의 사용을 통한 접착에 의해 홀더에 영구적으로 고정 부착될 수 있다. 플라스틱 필름 또는 접착제는 전도성 재료일 수 있고 전도성 재료 코팅 또는 재료들은 홀더 표면의 특정 영역에 걸쳐 패턴화될 수 있다.
홀더 내 다공성 매트릭스는 일반적으로 여과 모듈의 일부이고, 여기서, 상기 다공성 매트릭스는 여과 동안에 통상적인 사용을 위한 어셈블리의 일부이다. 홀더는 연합된 표면과의 접촉을 촉진시키는 표면을 갖고 있지만 이들 표면에 영구적으로 고정 부착되어 있지 않고 제거될 수 있다. 상부 가스킷은 액체 홀딩 웰 사이에서 제거될 수 있는 홀더에 적용될 수 있다. 하부 가스킷은 진공을 위한 매니폴드 사이에서 제거될 수 있는 홀더에 적용될 수 있다. 가스킷은 압축시 액체 또는 기체 불투과성 밀봉을 촉진시키는 가요성 재료이다. 홀더는 가스킷 재료로 작제될 수 있다. 가스킷 형태의 예는 샘플이 다공성 매트릭스로부터 진공 매니폴드로 유동하도록 하는 컷 아웃 영역을 갖는, 편평한, 엠보싱된, 패턴화된 또는 성형된 시트, 고리, 원형, 타원형을 포함한다. 가스킷 재료의 예는 종이, 고무, 실리콘, 금속, 코크, 펠트, 네오프렌, 니트릴 고무, 유리섬유, PTFE 또는 테플론과 같은 폴리테트라-플루오로에틸렌 또는 폴리클로로트리플루오로에틸렌과 같은 플라스틱 중합체를 포함한다.
일부 예에서, 진공은 비-희귀 세포의 매트릭스로의 통과를 촉진시키기 위해 다공성 매트릭스 상의 농축되고 처리된 샘플에 적용된다. 적용된 진공 수준은 예를 들어, 생물학적 입자의 상이한 집단의 성질 및 크기, 다공성 매트릭스의 성질 및 다공성 매트릭스의 공극의 크기 중 하나 이상에 의존한다. 일부 예에서, 적용된 진공의 수준은 예를 들어, 약 1 밀리바 내지 약 100 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 80 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 50 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 40 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 30 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 25 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 20 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 15 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 10 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 80 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 50 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 30 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 25 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 20 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 15 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 10 밀리바이다. 일부 예에서, 진공은 진동 진공이고 이는 상기 진공이 규칙적 또는 불규칙적 간격으로 간헐적으로 적용됨을 의미하고 상기 간격은 예를 들어, 약 1 초 내지 약 600 초, 또는 약 1 초 내지 약 500 초, 또는 약 1 초 내지 약 250 초, 또는 약 1 초 내지 약 100 초, 또는 약 1 초 내지 약 50 초, 또는 약 10 초 내지 약 600 초, 또는 약 10 초 내지 약 500 초, 또는 약 10 초 내지 약 250 초, 또는 약 10초 내지 약 100 초, 또는 약 10 초 내지 약 50 초, 또는 약 100 초 내지 약 600 초, 또는 약 100 초 내지 약 500 초, 또는 약 100 초 내지 약 250 초일 수 있다. 상기 접근법에서, 진공은 진공의 혈액 샘플로의 적용 일부 또는 전부 동안에, 예를 들어, 약 0 밀리바 내지 약 10 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 10 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 7.5 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 5.0 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 2.5 밀리바로 진동한다. 진동 진공은 예를 들어, 온-오프 스위치를 사용하여 성취되고 자동으로 또는 수동으로 수행될 수 있다.
처리된 샘플과 다공성 매트릭스의 접촉은 상기 논의된 바와 같은 희귀 세포 또는 입자-결합된 희귀 분자의 상이한 집단을 갖는 다공성 매트릭스의 표면을 수득하기 위해 다공성 매트릭스의 표면 상에 희귀 세포 또는 입자-결합된 희귀 분자의 보유를 성취하기에 충분한 기간 동안 계속한다. 상기 기간은 예를 들어, 희귀 세포 또는 입자-결합된 희귀 분자의 성질 및 크기, 다공성 매트릭스의 성질, 다공성 매트릭스의 공극의 크기, 다공성 매트릭스 상의 샘플에 적용되는 진공 수준, 여과될 용적 및 다공성 매트릭스의 표면적 중 하나 이상에 의존한다. 일부 예에서, 접촉 기간은 예를 들어, 약 1분 내지 약 1시간, 약 5분 내지 약 1시간, 또는 약 5분 내지 약 45분, 또는 약 5분 내지 약 30분, 또는 약 5분 내지 약 20분, 또는 약 5분 내지 약 10분, 또는 약 10분 내지 약 1시간, 또는 약 10분 내지 약 45분, 또는 약 10분 내지 약 30분, 또는 약 10분 내지 약 20분이다.
희귀 분자의 예
용어 “희귀 분자”는 샘플 중에 분석물로서 검출될 수 있는 분자를 언급한다. 분석물의 하나 이상의 변종은 희귀 분자의 특정 집단을 지적한다. 용어 “분자의 집단”은 희귀 분자 그룹을 구체적으로 한정하는 분자 구조의 통상의 부분을 공유하는 희귀 분자 그룹을 언급한다. 용어 “에 특이적”은 통상의 희귀 분자가 희귀 분자 그룹을 다른 분자와 구분함을 의미한다.
용어 “무세포 희귀 분자”는 세포에 결합되지 않은 및/또는 샘플 중에서 자유롭게 순환하는 희귀 분자를 언급한다. 상기 비-세포 희귀 분자는 질환의 의학적 진단 및 치료에 유용한 생분자를 포함한다. 질환의 의학적 진단은 예를 들어, 암, 심장 손상, 심혈관 질환, 신경학적 질환, 지혈(hemostasis)/지혈(hemastasis), 태아 모계 평가, 생식력, 골 상태, 호르몬 수준, 비타민, 알레르기, 자가면역 질환, 고혈압, 신장 질환, 대사 질환, 당뇨병, 간 질환, 감염성 질환의 검출을 위한 바이오마커 및 질환의 의학적 진단에 유용한 다른 생분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하기는 측정될 수 있는 희귀 분자의 샘플의 비제한적인 예이다. 분석될 샘플은 희귀 분자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플이다. 샘플은 생물학적 샘플 또는 비-생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 식물, 동물 또는 동물계, 진균류, 식물계, 색조류계, 또는 원생동물을 포함하는 다른 생유기체 또는 다른 진핵세포 종 또는 세균, 고세균 또는 다른 원핵세포 종으로부터 기원할 수 있다. 비-생물학적 샘플은 수용액, 환경 생성물, 화학적 반응 생성, 폐기물 스트림, 식품, 공급 스톡, 비료, 연료 등을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 유체, 예를 들어, 전혈, 혈청, 혈장, 담, 림프구 유체, 정액, 엑소좀, 지질, 질 점액, 배설물, 뇨, 척수액, 타액, 배설물, 뇌척수액, 눈물, 근육 또는 조직을 포함한다. 생물학적 조직은 예를 들어, 모발, 피부, 기관 또는 다른 신체 부분으로부터의 섹션 또는 절단된 조직을 포함하고, 예를 들어, 희귀 분자는 조직, 예를 들어, 폐, 기관지, 결장, 직장, 세포외 매트릭스, 피부, 혈관, 줄기, 리드, 뿌리, 씨드, 꽃, 췌장, 전립선, 유방, 간, 담관, 방광, 난소, 뇌, 중추신경계, 신장, 골반, 자궁 체부, 구강 또는 인두 또는 암으로부터 기원할 수 있다. 많은 경우에, 샘플은 뇨, 전혈, 혈장 또는 혈청 샘플과 같은 수성이고, 다른 경우에, 샘플은 시험을 위한 용액 또는 현탁액으로 제조되어야만 한다.
샘플은 예를 들어, 비-희귀 세포 및 희귀 세포와 같은 세포를 함유하는 샘플일 수 있고, 여기서, 희귀 분자는 희귀 세포로부터 검출된다. 세포로부터의 희귀 분자는 임의의 유기체로부터 기원할 수 있고 병원체, 예를 들어, 세균, 바이러스, 진균류, 및 원생동물; 악성 세포, 예를 들어, 악성 신생물 또는 암 세포; 순환 내피 세포; 순환 종양 세포; 순환 암 줄기 세포; 순환 암 간엽 세포; 순환 상피 세포; 태아 세포; 면역 세포 (B 세포, T 세포, 대식세포, NK 세포, 단핵구); 및 줄기 세포로 제한되지 않는다. 본원에 기재된 본 발명에 따른 방법의 다른 예에서, 시험될 샘플은 이에 제한되지 않지만 예를 들어, 식물 또는 동물 대상체와 같은 유기체 기원의 혈액 샘플이다. 본원에 기재된 원칙에 따른 방법의 일부 예에서, 시험될 샘플은 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 포유동물 대상체와 같은 유기체 기원의 샘플이다. 희귀 분자를 갖는 세포는 포유동물의 조직, 예를 들어, 폐, 기관지, 결장, 직장, 췌장, 전립선, 유방, 간, 담관, 방광, 난소, 뇌, 중추 신경계, 신장, 골반, 자궁 체부, 구강 또는 인두 또는 암으로부터 기원할 수 있다.
희귀 분자 단편은 펩티다제(또한 프로테아제로서 공지된) 및 하기의 경로에 대해 추가로 분류되고 이에 대해 열거된 것들을 포함하는, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 메탈로, 아스파라긴, 세린, 트레오닌 및 일반 펩티다제 촉매 유형의 총 ~902212 상이한 서열에 대한 온-라인 데이터베이스인 MEROPS에서의 것들을 포함하는 관심 대상의 펩티다제를 측정하기 위해 사용될 수 있다: 2-옥소카복실산 대사, ABC 수송체, 아프리칸 파동편모충증, 알라닌, 아스파르테이트 및 글루타메이트 대사, 동종이식편 거부, 알츠하이머 질환, 아미노당 및 뉴클레오타이드 당 대사, 아메바증, AMPK 신호전달 경로, 근위축성측색경화증 (ALS), 항원 가공 및 제공, 아폽토시스, 아라키돈산 대사, 아르기닌 및 프롤린 대사, 부정맥유발 우심실 심근병증 (ARVC), 천식, 자가면역 갑상선 질환, B 세포 수용체 신호전달 경로, 세균 분비 시스템, 기저 전사 인자, 베타-알라닌 대사, 담 분비, 아미노산의 생합성, 2차 대사물의 생합성, 불포화 지방산의 생합성, 비오틴 대사, 비스페놀 분해, 방광암, cAMP 신호전달 경로, 탄소 대사, 심근 수축, 세포 접착 분자(CAM), 세포 사이클, 세포 사이클 - 효모, 샤가스 질환(chagas disease) (아메리칸 파동편모충증), 화학적 발암, 콜린성 시냅스, 결장직장암, 보충 및 응고 캐스케이드, 시아노아미노산 대사, 시스테인 및 메티오닌 대사, 사이토킨-사이토킨 수용체 상호작용, 시토졸 DNA-감지 경로, 방향족 화합물의 분해, 확장성 심근병증, 디옥신 분해, DNA 복제, 등배축 형성, 약물 대사 - 다른 효소, 내분비 및 다른 인자-조절된 칼슘 재흡수, 엔도사이토시스, 헬리코박터 파이롤리 감염에서 상피 세포 신호전달, 엡슈타인-바르 바이러스 감염, 에스트로겐 신호전달 경로, 판코니 빈혈 경로, 지방산 연장, 국소 접착, 폴레이트 생합성, foxO 신호전달 경로, 글루타티온 대사, 글리세로지질 대사, 글리세로인지질 대사, 글리코실포스포파티딜이노시톨(GPI)-앵커 생합성, 글리옥실레이트 및 디카복실레이트 대사, GnRH 신호전달 경로, 이식편-대-숙주 질환, 헷지호그 신호전달 경로, 조혈 세포 계통, B형 간염, 헤르페스 심플렉스 감염, HIF-1 신호전달 경로, 히포 신호전달 경로(hippo signaling pathway), 히스티딘 대사, 상동성 재조합, HTLV-I 감염, 헌팅톤 질환, 비후성 심근증(HCM), 인플루엔자 A, 인슐린 신호전달 경로, 레지오넬라증, 리슈마니아증, 백혈구 경내피 이동, 라이신 생합성, 리소좀, 말라리아, MAPK 신호전달 경로, 감수분열 - 효모, 흑색종, 대사 경로, 시토크롬 P450에 의한 생체이물의 대사, 다양한 환경에서 미생물 대사, 암에서 마이크로RNA, 미네랄 흡수, 미스매치 복구, 천연 킬러 세포 매개된 세포독성, 신경활성 리간드-수용체 상호작용, NF-카파 B 신호전달 경로, 질소 대사, NOD-유사 수용체 신호전달 경로, 비-알콜성 지방 간 질환(NAFLD), 노치 신호전달 경로(notch signaling pathway), 후각 형질도입, 난모세포 감수분열, 파골세포 분화, 다른 글리칸 분해, 난소 스테로이드 합성, 산화 인산화, p53 신호전달 경로, 췌장 분비, 판토테네이트 및 CoA 생합성, 파킨슨 질환, 암에서의 경로, 페니실린 및 세팔로스포린 생합성, 펩티도글리칸 생합성, 퍼옥시좀, 백일해, 식포, 페닐알라닌 대사, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 생합성, 페닐프로파노이드 생합성, PI3K-Akt 신호전달 경로, 식물-병원체 상호작용, 혈소판 활성화, PPAR 신호전달 경로, 프리온 질환, 프로테아좀, 단백질 소화 및 흡수, 단백질 배출, 소포체에서 단백질 프로세싱, 암에서 프로테오글리칸, 퓨린 대사, 피리미딘 대사, 피루베이트 대사, Rap1 신호전달 경로, Ras 신호전달 경로, 액틴 세포골격의 조절, 자가포식 조절, 신장 세포 암종, 레닌-안지오텐신 시스템, 역행 엔도칸나비노이드 신호전달, 류마티스 관절염, RIG-I-유사 수용체 신호전달 경로, RNA 분해, RNA 수송, 침샘 분비, 살모넬라(salmonella) 감염, 세로토닌 촉진성 시냅스, 소세포 폐암, 스플라이오좀, 스타필로코커스 아우레우스 (staphylococcus aureus) 감염, 전신 홍반성 루푸스, T 세포 수용체 신호전달 경로, 타우린 및 하이포타우린 대사, 테르페노이드 골격 생합성, TGF-베타 신호전달 경로, TNF 신호전달 경로, 톨형 수용체 신호전달 경로, 톡소플라스마증(toxoplasmosis), 암에서 잘못된 전사 조절, 트립토판 대사, 결핵, 2-성분 시스템, I형 진성 당뇨병, 유비퀴논 및 다른 테르페노이드-퀴논 생합성, 유비퀴틴 매개된 단백질용해, 반코마이신 내성, 바이러스l 발암, 바이러스 심근염, 비타민 분해 및 흡수 Wnt 신호전달 경로.
관심 대상의 펩티다제 억제제를 측정하기 위해 사용될 수 있는 희귀 분자 단편은 하나의 패밀리가 상동성을 갖는 상동성 펩티다제 억제제 세트인 총 ~133535의 상이한 서열을 포함하는 MEROPS (펩티다제 억제제에 대한 온-라인 데이터베이스 )에서의 것들을 포함한다. 상동성은 패밀리의 유형 억제제 또는 유형 억제제에 상동성임에 따라서 이의 구성원인 것으로 이미 나타난 또 다른 단백질에 대한 아미노산 서열에서 유의적 유사성을 나타낸다. 패밀리에 대한 참조 유기체는 난점액 억제제 유닛 3 (멜레아그리스 갈로파보(Meleagris gallopavo)), 아프로티닌(보스 타우루스(Bos taurus)), 대두 쿠니츠 트립신 억제제(soybean Kunitz trypsin inhibitor) (글라이신 max), 프로테이나제 억제제 B (사기타리아 사기티폴리아(Sagittaria sagittifolia)), 알파-1-펩티다제 억제제(호모 사피엔스(Homo sapiens)), 아시디안 트립신 억제제(ascidian trypsin inhibitor) (할로신티아 로레치(Halocynthia roretzi)), 라기 씨드 트립신(ragi seed trypsin)/알파-아밀라제 억제제(엘레우신 코라카나(Eleusine coracana)), 트립신 억제제 MCTI-1 (모모르디카 카란티아(Momordica charantia)), 봄빅스 서브틸리신 억제제(Bombyx subtilisin inhibitor) (봄빅스 모리(Bombyx mori)), 펩티다제 B 억제제(사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 마리노스타틴(marinostatin) (알테로모나스 종(Alteromonas sp.)), 에코틴(에스케리치아 콜리(Escherichia coli)), 보우만-비륵 억제제 유닛 1(Bowman-Birk inhibitor unit 1) (글라이신 max), 에글린 c (히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)), 히루딘(히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)), 안티스타신 억제제(antistasin inhibitor) 유닛 1 (해멘테리아 오피시날리스(Haementeria officinalis)), 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제(스트렙토마이세스 알보그리세오루스(Streptomyces albogriseolus)), 분비 백혈구 펩티다제 억제제 도메인 2 (호모 사피엔스(Homo sapiens)), 머스타드 트립신 억제제-2 (시나피스 알바(Sinapis alba)), 펩티다제 억제제 LMPI 억제제 유닛 1 (로쿠스타 미그라토리아(Locusta migratoria)), 감자 펩티다제 억제제 II 유닛 1 (솔라넘 튜버로섬(Solanum tuberosum)), 세크레토그라닌 (secretogranin) V (호모 사피엔스(Homo sapiens)), BsuPI 펩티다제 억제제(바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), pinA 론(Lon) 펩티다제 억제제(엔테로박테리아(Enterobacteria) 파아지 T4), 시스타틴 A (호모 사피엔스(Homo sapiens)), 오보시스타틴(ovocystatin) (갈루스 갈루스(Gallus gallus)), 메탈로펩티다제 억제제(보트로프스 야라라카(Bothrops jararaca)), 칼파스타틴 억제제 유닛 1 (호모 사피엔스(Homo sapiens)), 세포독성 T-림프구 항원-2 알파(무스 무스쿨루스(Mus musculus)), 에퀴스타틴 억제제 유닛 1 (악티니아 에쿠이나(Actinia equina)), 수르비빈(호모 사피엔스(Homo sapiens)), 아스핀(aspin) (아스카리스 숨(Ascaris suum)), 사카로펩신 억제제 (saccharopepsin inhibitor) (사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), timp-1 (호모 사피엔스(Homo sapiens)), 스트렙토마이세스 메탈로펩티다제 억제제(스트렙토마이세스 니그레센스(Streptomyces nigrescens)), 감자 메탈로카복시펩티다제 억제제 (솔라넘 튜버로섬(Solanum tuberosum)), 메탈로펩티다제 억제제(딕케야 크리산테미(Dickeya chrysanthemi)), 알파-2-마크로글로불린(호모 사피엔스(Homo sapiens)), 샤가신(chagasin) (레이슈마니아 메이저(Leishmania major)), 오프린(oprin) (디델피스 마르수피알리스(Didelphis marsupialis)), 메탈로카복시펩티다제 A 억제제(아스카리스 숨(Ascaris suum)), 거머리 메탈로카복시펩티다제 억제제(히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)), 라텍신(latexin)(호모 사피엔스(Homo sapiens)), 클리토시핀(clitocypin) (레피스타 네불라리스(Lepista nebularis)), proSAAS (호모 사피엔스(Homo sapiens)), 바쿨로바이러스 (baculovirus) P35 카스파제 억제제(스포도프테라 리투라 뉴클레오폴리헤드로바이러스(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus)), p35 상동체 (암삭타 무레이 엔토모폭스바이러스(Amsacta moorei entomopoxvirus)), 세린 카복시펩티다제 Y 억제제(사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 진드기 항응고 펩타이드(오르니토도로스 모우바타(Ornithodoros moubata)), 마다닌 1 (해마피살리스 론기코르니스(Haemaphysalis longicornis)), 스쿼시 (squash) 아스파르트산 펩티다제 억제제 (쿠쿠미스 사비부스(Cucumis sativus)), 스타포스타틴 (staphostatin) B (스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)), 스타포스타틴(staphostatin) A (스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)), 트리아빈(triabin) (트리아토마 팔리디페니스(Triatoma pallidipennis)), 프로-호산구 메이져 염기성 단백질(호모 사피엔스(Homo sapiens)), 트롬보스타신(thrombostasin) (해마토비아 이리탄스(Haematobia irritans)), 렌티누스(Lentinus) 펩티다제 억제제(렌티눌라 에도데스(Lentinula edodes)), 브로메인(아나나스 코모수스(Ananas comosus)), 진드기 카복시펩티다제 억제제(리피세팔루스 부르사(Rhipicephalus bursa)), 스트렙토파인 억제제(스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)), 팔스타틴(플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)), 키마다닌(chimadanin) (해마피살리스 론기코르니스(Haemaphysalis longicornis)), {베로니카(Veronica)} 트립신 억제제(베로니카 헤데리폴리아(Veronica hederifolia)), 바리에긴(variegin) (암블리오마 바이에가툼(Amblyomma variegatum)), 박테리오파아지 람다 CIII 단백질(박테리오파아지 라다(bacteriophage lambda)), 트롬빈 억제제(글로시나 모르시탄스(Glossina morsitans)), 아노펠린(anophelin) (아노펠레스 알비마누스(Anopheles albimanus)), 아스퍼길러스(Aspergillus) 엘라스타제 억제제(아스퍼길러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)), AVR2 단백질(파살로라 풀바(Passalora fulva)), IseA 단백질(바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 톡소스타틴-1 (톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)), AmFPI-1 (안테라에아 밀리타(Antheraea mylitta)), cvSI-2 (크라소스트레아 버기니카(Crassostrea virginica)), 마크로시핀 1 (마크로레피오타 프로세라(Macrolepiota procera)), HflC (에스케리치아 콜리(Escherichia coli)), 오릭틴(오릭테스 리노세로스(Oryctes rhinoceros)), 트립신 억제제(미라빌리스 야라파(Mirabilis jalapa)), F1L 단백질(백시니아 바이러스(Vaccinia virus)), NvCI 카복시펩티다제 억제제(네리타 버시컬러(Nerita versicolor)), 시즐드(Sizzled) 단백질(제노푸스 라비스(Xenopus laevis)), EAPH2 단백질(스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)), 및 보우만-비륵-유사 트립신 억제제(오도라나 버사빌리스(Odorrana versabilis))를 나타낸다. 희귀 분자 단편은 펩티다제 억제제의 합성 억제를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 언급된 데이터 베이스는 또한 상기 열거된 패밀리의 임의의 구성원에 대한 억제 성질을 모방할 수 있는 수천개의 상이한 소분자 억제제의 예를 포함한다.
관심 대상의 대사의 희귀 분자는 ACC 아세틸 조효소 A 카복실라제의 농도에 영향을 주는 것들, Adpn 아디포넥틴, AdipoR 아디포넥틴 수용체, AG 언하이드로글루시톨(Anhydroglucitol), AGE 어드밴스 당화 말단 생성물, Akt 단백질 키나제 B, AMBK 프레-알파-1-마이크로글로불린/비쿠닌, AMPK 5′-AMP 활성화된 단백질 키나제, ASP 아실화 자극 단백질, Bik 비쿠닌(Bikunin), BNP B-형 나트륨 뇨 펩타이드, CCL 케모카인 (C-C 모티프) 리간드, CINC 사이토킨-유도된 호중구 화학유인제, 아디포넥틴 수용체의 CTF C-말단 단편, CRP C-반응성 단백질, DGAT 아실 CoA 디아실글리세롤 트랜스퍼라제, DPP-IV 디펩티딜 펩티다제- IV, EGF 상피 성장 인자, eNOS 내피 NOS, EPO 에리트로포이에틴, ET 엔도텔린, Erk 세포외 신호-조절된 키나제, FABP 지방산-결합 단백질, FGF 섬유아세포 성장 인자, FFA 유리된 지방산, FXR 파네소이드(Farnesoid) X 수용체 a, GDF 성장 분화 인자, GH 성장 호르몬, GIP 글루코스-의존성 인슐린분비 자극 폴리펩타이드, GLP 글루카곤 유사 펩타이드-1, GSH 글루타티온, GHSR 성장 호르몬 분비촉진 수용체, GULT 글루코스 수송체, GCD59 당화 CD59 (aka glyCD59), HbA1c 헤모글로빈 A1c, HDL 고밀도 지질단백질, HGF 간세포 성장 인자, HIF 저산소증-유도성 인자, HMG 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 CoA 리덕타제, I-α-I 상호-α-억제제, AdipoR의 Ig-CTF 면역글로불린 부착된 C-말단 단편, 인슐린, IDE 인슐린-분해 효소, IGF 인슐린-유사 성장 인자, IGFBP IGF 결합 단백질, IL 인터류킨 사이토킨, ICAM 상호세포 접착 분자, JAK STAT 야누스 키나제/신호 변환기 및 전사 활성화제, JNK c-Jun N-말단 키나제, KIM 신장 손상 분자, LCN-2 리포칼린, LDL 저밀도 지질단백질, L-FABP 간형 지방산 결합 단백질, LPS 리포폴리사카라이드, Lp-PLA2 지질단백질-연합 포스포리파제 A2, LXR 간 X 수용체, LYVE 내피 하이알루로난 수용체, MAPK 미토겐-활성화된 단백질 키나제, MCP 단핵구 화학주성 단백질, MDA 말론디알데하이드, MIC 대식세포 억제성 사이토킨, MIP 대식세포 염증 단백질, MMP 매트릭스 메탈로프로테이나제, MPO 마이엘로퍼옥시다제, 라파마이신의 mTOR 포유동물, NADH 니코틴아미드 아데닌 디-뉴클레오타이드, NGF 신경 성장 인자, 활성화된 B 세포의 NFκB 핵 인자 카파-경쇄-인핸서, NGAL 호중구 겔라티나제 리포칼린, NOS 산화질소 신타제 NOX NADPH 옥시다제 NPY 신경펩타이드 Y 글루코스, 인슐린, 프로인슐린, c 펩타이드 OHdG 하이드록시-데옥시구아노신, oxLDL 산화된 저밀도 지질단백질, P-α-I 프레-인터류킨-α-억제제, PAI-1 플라스미노겐 활성화인자 억제제, PAR 프로테아제-활성화된 수용체, PDF 태반 성장 인자, PDGF 혈소판-유래된 성장 인자, PKA 단백질 키나제 A, PKC 단백질 키나제 C, PI3K 포스파티딜이노시톨 3-키나제, PLA2 포스파티딜이노시톨 3-키나제, PLC 포스포리파제 C, PPAR 퍼옥시좀 증식인자-활성화된 수용체, PPG 식후 글루코스, PS 포스파티딜-세린, PR 프로테이나제, PYY 신경펩타이드 유사 펩타이드 Y, AGE에 대한 RAGE 수용체, ROS 반응성 산소 종, S100 칼그라눌린, sCr 혈청 크레아티닌, SGLT2 나트륨-글루코스 수송체 2, SFRP4 분비된 프리즐된-관련 단백질 4 전구체, SREBP 스테롤 조절 요소 결합 단백질, SMAD 멸균 알파 모티프 도메인-함유 단백질, SOD 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, sTNFR 가용성 TNF α 수용체, TACE TNFα 알파 절단 프로테아제, TFPI 조직 인자 경로 억제제, TG 트리글리세리드, TGF β 형질전환 성장 인자-β, 메탈로프로테이나제의 TIMP 조직 억제제, TNF α 종양 괴사 인자-α, TNFR TNF α 수용체, THP Tamm-Horsfall 단백질, TLR 톨형 수용체, TnI 트로포닌 I, tPA 조직 플라스미노겐 활성화인자, TSP 트롬보스폰딘, Uri 우리스타틴, uTi 뇨 트립신 억제제, uPA 우로키나제 유사 플라스미노겐 활성화인자, uPAR uPA 수용체, VCAM 혈관 세포 접착 분자, VEGF 혈관 내피 성장 인자 및 YKL-40 키티나제-3-유사 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
췌장 조직에 의해 고도로 발현되거나 췌장에서 발견되는 관심 대상의 희귀 분자는 인슐린, 프로인슐린, c-펩타이드, PNLIPRP1 췌장 리파제-관련 단백질 1, SYCN 시노콜린, PRSS1 프로테아제, 세린, 1 (트립신 1) 세포내, CTRB2 키모트립시노겐 B2 세포내, CELA2A 키모트립신 유사 엘라스타제 패밀리, 구성원 2A, CTRB1 키모-트립시노겐 B1 세포내, CELA3A 키모트립신-유사 엘라스타제 패밀리, 구성원 3A 세포내, CELA3B 키모트립신 유사 엘라스타제 패밀리, 구성원 3B 세포내, CTRC 키모-트립신 C (칼데크린), CPA1 카복시펩티다제 A1 (췌장) 세포내, PNLIP 췌장 리파제, 및 CPB1 카복시펩티다제 B1 (조직), AMY2A 아밀라제, 알파 2A (췌장), PDX1 인슐린 프로모터 인자 1, 전사 인자의 MAFA Maf 패밀리, GLUT2 글루코스 수송체 2형, ST8SIA1 알파-N-아세틸뉴라미드 알파-2,8-시알트랜스퍼라제, CD9 테트라소파닌, ALDH1A3 알데하이드 데하이드로게나제, CTFR 낭성 섬유증 막관통 전도 조절제, 및 GAD, IA-2, IAA, ZnT8 등에 대한 당뇨성 자가 면역 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
희귀 분자 단편은 천연적으로 인슐린에 작용하는 것으로 공지된 하기의 펩티다제에 의해 생성되는 인슐린, 프로-인슐린 또는 c 펩타이드의 것들을 포함한다: 아카에라이신(archaelysin), 듀오데나제, 칼파인-1, 암모디타제 서브패밀리 M12B 펩티다제, ALE1 펩티다제, CDF 펩티다제, 카뎁신 E, 메프린 알파 서브유닛, 에르도하긴(jerdohagin)(트리메레수루스 이에도니(Trimeresurus jerdonii)), 카복시펩티다제 E, 이염기성 프로세싱 엔도펩티다제, 얍신-1, 얍신 A, PCSK1 펩티다제, 아미노펩티다제 B, PCSK1 펩티다제, PCSK2 펩티다제, 인술라이신(insulysin), 매트릭스 메탈로펩티다제-9 등. 이들 단편은 서열번호 1 MALWMRLLPLLALLALWGP, 서열번호 2 MALWMRLLPL, 서열번호 3 ALLALWGPD, 서열번호 4 AAAFVN-QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR, 서열번호 5 PAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVC, 서열번호 6 PAAAFVNQHLCGS, 서열번호 7 CGSHLVEALYLV, 서열번호 8 VEALYLVC, 서열번호 9 LVCGERGF, 서열번호 10 FFYTPK, 서열번호 11 REAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSL, 서열번호 12 REAEDLQVGQVE, 서열번호 13 LGGGPGAG, 서열번호 14 SLQPLALEGSL, 서열번호 15 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN, 서열번호 16 GIVEQCCTSICSLY, 서열번호 17 QLENYCN, 및 75%의 정확한 상동성 내 서열번호 18 CSLYQLE 변종의 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 변종은 천연 및 변형된 아미노산을 포함한다.
인슐린의 희귀 분자 단편은 단편의 형성을 기반으로 하는 인슐린에 작용하는 펩티다제를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 천연의 공지된 펩디다제 및 생물학적 시스템에 첨가되는 기타의 것들의 목록을 포함한다. 인슐린의 추가의 희귀 분자 단편을 사용하여 단편의 부재 형성을 기반으로 하는 인슐린에 작용하는 펩티다제에 대한 억제제를 측정할 수 있다. 이들 억제제는 아디포넥틴 수용체의 c-말단 단편, 비쿠닌, 우리스타틴 및 아카에라이신, 두오데나제, 칼파인-1, 암모디타제 서브패밀리 M12B 펩티다제, ALE1 펩티다제, CDF 펩티다제, 카뎁신 E, 메프린 알파 서브유닛, 이에도하긴(트리메레수루스 이에도니(Trimeresurus jerdonii)), 카복시펩티다제 E, 이염기성 프로세싱 엔도펩티다제, 얍신-1, 얍신 A, PCSK1 펩티다제, 아미노펩티다제 B, PCSK1 펩티다제, PCSK2 펩티다제, 인술라이신, 및 매트릭스 메탈로펩티다제-9의 기타 공지된 천연 및 합성 억제제를 포함하고 이들은 억제제 데이터베이스에 열거되어 있다.
생활성 치료학적 단백질 및 펩타이드의 희귀 분자 단편을 사용하여 치료학적 효과, 안정성, 용도, 대사, 생물학적 경로에 대한 작용 (프로테아제, 펩티다제, 효소, 수용체 또는 다른 생분자와의 작용과 같은), 생물학적 시스템과의 경로 및 다른 상호작용의 억제 작용의 징후로서 이의 존재 또는 부재를 측정할 수 있다. 이의 예는 승인된 치료학적 펩타이드 및 단백질의 데이터베이스 , 예를 들어, http://crdd.osdd.net/ 및 http://crdd.osdd.net/에서 식이 보충물, 프로바이오틱, 식품 안전성, 수의과용품 및 화장품 용도를 위한 펩타이드 및 단백질의 다른 데이터베이스에 열거된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 467개 승인된 펩타이드 및 단백질 치료요법의 목록은 암, 대사 장애, 혈액 장애, 면역학적 장애, 유전학적 장애, 호르몬 장애, 골 장애, 심장 장애, 감염성 질환, 호흡 장애, 신경학적 장애, 부속 치료요법, 눈 장애 및 흡수불량 장애에 사용하기 위한 생활성 단백질 및 펩타이드의 예를 포함한다. 생활성 단백질 및 펩타이드는 항-트롬빈, 피브린용해제, 효소, 항신생물제, 호르몬, 가임제, 면역억제제, 골 관련 제제, 항당뇨병제 및 항체로서 사용되는 것들을 포함한다.
치료학적 단백질 및 펩타이드의 일부 특정 예는 글루카곤, 그렐린, 렙틴, 성장 호르몬, 프롤락틴, 사람 태반 락토겐, 황체형성 호르몬, 여포 자극 호르몬, 융모막의 고나도트로핀, 갑상선 자극 호르몬, 아드레노코르티코트로픽 호르몬, 바소프레신, 옥시토신, 안지오텐신, 부갑상선 호르몬, 가스트린, 부세렐린, 항혈우병 인자, 판크레리파제(pancrelipase), 인슐린, 인슐린 아스파르트, 돼지 인슐린, 인슐린 리스프로(insulin lispro), 인슐린 이소판(insulin isophane), 인슐린 글루리신, 인슐린 데테미르(insulin detemir), 인슐린 글라르긴(insulin glargine), 면역글로불린, 인터페론, 류프롤리드, 데닐류킨, 아스파라기나제, 티로트로핀, 알파-1-프로테이나제 억제제, 엑세나티드, 알부민, 응고 인자, 알글루코시다제 알파, 연어 칼시토닌, 바소프레신, 상피 성장 인자(EGF), 콜레시스토키닌 (CCK-8), 백신, 사람 성장 호르몬 등을 포함한다. 치료학적 단백질 및 펩타이드의 일부 새로운 예는 GLP-1-GCG, GLP-1-GIP, GLP-1, GLP-1- GLP-2, 및 GLP-1-CCKB를 포함한다.
지방 조직에 의해 고도로 발현되는 관심 대상의 희귀 분자는 ADIPOQ 아디포넥틴, C1Q 및 TUSC5 종양 억제제 후보물 5를 함유하는 콜라겐 도메인, LEP 렙틴, CIDEA 세포사-유도 DFFA-유사 인자 a, CIDEC 세포사 유도 DFFA-유사 이펙터 C, FABP4 지방산 결합 단백질 4, 지방세포, LIPE, GYG2, PLIN1 페릴리핀 1, PLIN4 페릴리핀 4, CSN1S1, PNPLA2, RP11-407P15.2 단백질 LOC100509620, LGALS12 렉틴, 갈락토시드-결합, 가용성 12, GPAM 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제, 미토콘드리아, PR325317.1 예측된 단백질, ACACB 아세틸-CoA 카복실라제 베타, ACVR1C 액티빈 A 수용체, IC형, AQP7 아쿠아포린 7, CFD 상보체 인자 D (아딥신)m CSN1S1카제인 알파 s1, FASN 지방산 신타제 GYG2 글리코게닌 2 KIF25키네신 패밀리 구성원 25 LIPE리파제, 호르몬-민감성 PNPLA2 파타틴 유사 포스포리파제 도메인 함유 2 SLC29A4 용질 표지 패밀리 29 (균형 뉴클레오사이드 수송체), 구성원 4 SLC7A10 용질 표지 패밀리 7 (중성 아미노산 수송체 경쇄, asc 시스템), 구성원 10, SPX 스펙신 호르몬 및 TIMP4 TIMP 메탈로펩티다제 억제제 4를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
부신 및 갑상선에 의해 고도로 발현되는 관심 대상의 희귀 분자는 CYP11B2 시토크롬 P450, 패밀리 11, 서브패밀리 B, 폴리펩타이드 2, CYP11B1 시토크롬 P450, 패밀리 11, 서브패밀리 B, 폴리펩타이드 1, CYP17A1 시토크롬 P450, 패밀리 17, 서브패밀리 A, 폴리펩타이드 1, MC2R 멜라노코르틴 2 수용체(아드레노-코르티코트로픽 호르몬), CYP21A2 시토크롬 P450, 패밀리 21, 서브패밀리 A, 폴리펩타이드 2, HSD3B2 하이드록시-델타-5-스테로이드 데하이드로게나제, 3 베타- 및 스테로이드 델타-이소머라제 2, TH 티로신 하이드록실라제, AS3MT 아비산염 메틸트랜스퍼라제, CYP11A1 시토크롬 P450, 패밀리 25 11, 서브패밀리 A, 폴리펩타이드 1, DBH 도파민 베타-하이드록실라제(도파민 베타모노-옥시게나제), HSD3B2 하이드록시-델타-5-스테로이드 데하이드로게나제, 3 베타- 및 스테로이드 델타-이소머라제 2, TH 티로신 하이드록실라제, AS3MT 아비산염 메틸트랜스퍼라제, CYP11A1 시토크롬 P450, 패밀리 11, 서브패밀리 A, 폴리펩타이드 1, DBH 도파민 베타-하이드록실라제(도파민 베타-모노옥시게나제), AKR1B1 알도-케토 리덕타제 게열 1, 구성원 B1 (알도스 리덕타제), 과발현된 NOV 신경모세포종, FDX1 페레독신 1, DGKK 디아실글리세롤 키나제 카파, MGARP 미토콘드리아-국소화된 글루탐산-풍부 단백질, VWA5B2 폰 빌레브란트 인자 A 도메인 함유 5B2, C18orf42 염색체 18 개방 판독 프레임 42, KIAA1024, MAP3K15 미토켄-활성화된 단백질 키나제 키나제 키나제 15, STAR 스테로이드겐성 급성 조절 단백질 칼륨 채널, 서브패밀리 K, 구성원 2, 과발현된 NOV 신경모세포종, PNMT 페닐에탄올아민 N-메틸트랜스퍼라제, CHGB 크로모그라닌 B 5 (세크레토그라닌 1), 및 PHOX2A 쌍형성 유사 호메오박스 2a를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
골수에 의해 고도로 발현되는 희귀 분자는 DEFA4 데펜신 알파 4 코르티코스타틴, PRTN3 프로테이나제 3, AZU1 아주로시딘 1, DEFA1 데펜신 알파 1, ELANE 엘라스타제, 발현된 호중구, DEFA1B 데펜신 알파 1B, DEFA3 데펜신 알파 3 호중구-특이적, MS4A3 막-관통 4-도메인, 서브패밀리 A, 구성원 3 (조혈 세포-특이적), RNASE3 리보뉴클레아제 RNase A 패밀리 3, MPO 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), HBD 헤모글로빈, 델타 및 PRSS57 프로테아제, 세린 57을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
뇌에 의해 고도로 발현되는 관심 대상의 희귀 분자는 GFAP 신경교 섬유 산성 단백질, OPALIN 희소돌기아교세포 미엘린 마디결(myelin paranodal) 및 내부 루프 단백질, OLIG2 희소돌기아교세포 계통 전사 인자 2, GRIN1 글루타메이트 수용체 이오노트로픽, N-메틸 D-아스파르테이트 1, OMG 희소돌기아교세포 미엘린 당단백질, SLC17A7 용질 표지 패밀리 17 (소포 글루타메이트 수송체), 구성원 7, C1orf61 염색체 1 개방 판독 프레임 61, E1A-자극된 유전자 2의 CREG2 세포성 리프레서, NEUROD6 신경 분화 6, ZDHHC22 아연 핑거 DHHC-유형 함유 22, VSTM2B V-세트 및 막관통 도메인 함유 2B, 및 PMP2 말초 미엘린 단백질 2를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
자궁내막, 난소, 또는 태반에 의해 고도로 발현되는 관심 대상의 희귀 분자는 MMP26 매트릭스 메탈로펩티다제 26, MMP10 매트릭스 메탈로펩티다제 10 (스트로멜라이신 2), RP4- 559A3.7 특징으로 하지 않는 단백질 및 TRH 티로트로핀-방출 호르몬을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
위장관, 침샘, 식도, 위, 십이지장, 소장 또는 결장에 의해 고도로 발현되는 관심 대상의 희귀 분자는 GKN1 가스트로킨 1, GIF 위 고유 인자(비타민 B 합성) , PGA5 펩시노겐 5 그룹 I (펩시노겐 A), PGA3 펩시노겐 3, 그룹 I (펩시노겐 A, PGA4 펩시노겐 4 그룹 I (펩시노겐 A), LCT 락타제, DEFA5 데펜신, 알파 5 파네트 세포-특이적, CCL25 케모킨(C-C 모티프) 리간드 25, DEFA6 데펜신 알파 6 파네트 세포-특이적, GAST 가스트린, MS4A10 막-관통 4-도메인 서브패밀리 A 구성원 10, ATP4A 및 ATPase, H+/K+ 교환 알파 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
심장 또는 골격근에 의해 고도로 발현되는 관심 대상의 희귀 분자는 NPPB 나트륨 뇨 펩타이드 B, TNNI3 트로포닌 I형 3 (심장), NPPA 나트륨 뇨 펩타이드 A, MYL7 미오신 경쇄 7 조절, MYBPC3 미오신 결합 단백질 C (심장), TNNT2 트로포닌 T 2형(심장) LRRC10 류신 풍부 반복체 함유 10, ANKRD1 안키린 반복체 도메인 1 (심근), RD3L 망막 변성 3형, BMP10 골 형태형성 단백질 10, CHRNE 콜린성 수용체 니코틴 엡실론 (근육), 및 SBK2 SH3 도메인 결합 키나제 패밀리 구성원 2를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
신장에 의해 고도로 발현되는 관심 대상의 희귀 분자는 UMOD 우로모듈린, TMEM174 막관통 단백질 174, SLC22A8 용질 표지 패밀리 22 (유기 음이온 수송체) 구성원 8, SLC12A1 용질 표지 패밀리 12 (나트륨/- 칼륨/염화물 수송체) 구성원 1, SLC34A1 용질 표지 패밀리 34 (II형 나트륨/-포스페이트 수송체) 구성원 1, SLC22A12 용질 표지 패밀리 22 (유기 음이온/우레이트 수송체) 구성원 12, SLC22A2 용질 표지 패밀리 22 (유기 양이온 수용체) 구성원 2, MCCD1 미토콘드리아 코일-코일 도메인 1, AQP2 아쿠아포린 2 (수거 관), SLC7A13 용질 표지 패밀리 7 (음이온성 아미노산 수송체) 구성원 13, KCNJ1 칼륨 내향-보정 (inwardly- rectifying) 채널, 서브게열 J 구성원 1 및 SLC22A6 용질 표지 패밀리 22 (유기 음이온 수송체) 구성원 6을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
폐에 의해 고도로 발현되는 관심 대상의 희귀 분자는 SFTPC 계면활성제 단백질 C, SFTPA1 계면활성제 단백질 A1, SFTPB 계면활성제 단백질 B, SFTPA2 계면활성제 단백질 A2, AGER 어드밴스드 당화 말단 생성물-특이적 수용체, SCGB3A2 세크레토글로빈 패밀리 3A 구성원 2, SFTPD 계면활성제 단백질 D, ROS1 원발암유전자(proto-oncogene) 1 수용체 티로신 키나제, MS4A15 막-관통 4-도메인 서브패밀리 A 구성원 15, RTKN2 로테킨 2, NAPSA 냅신 A 아스파르트산 펩티다제, 및 LRRN4 류신 풍부 반복 신경원 4를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
간 또는 쓸개에 의해 고도로 발현되는 관심 대상의 희귀 분자는 APOA2 아포지질단백질 A-II, A1BG 알파-1-B 당단백질, AHSG 알파-2-HS-당단백질, F2 응고 인자 II (트롬빈), CFHR2 보체 인자 H-관련 2, HPX 헤모펙신, F9 응고 인자 IX, CFHR2 보체 인자 H-관련 2, SPP2 분비된 인단백질 2 (24kDa), C9 보체 성분 9, MBL2 만노스-결합 렉틴 (단백질 C) 2 가용성 및 CYP2A6 시토크롬 P450 패밀리 2 서브패밀리 A 폴리펩타이드 6을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
고환 또는 전립선에 의해 고도로 발현되는 관심 대상의 희귀 분자는 PRM2 프로타민 2 PRM1 프로타민 1 TNP1 전이 단백질 1 (히스톤의 프로타민으로의 대체 동안에) TUBA3C 튜불린, 세포 분열 1-유사 2 ANKRD7 안키린 반복체 도메인 7 PGK2 포스포글리세레이트 키나제 2 AKAP4 A 키나제 (PRKA) 앵커 단백질 4 TPD52L3 종양 단백질 D52-유사 3 UBQLN3 유비퀼린 3 및 ACTL7A 액틴-유사 7A에서 염색체의 알파 3c LELP1 레이트 코니파이드(cornified) 외피-유사 프롤린 풍부 1 BOD1L2 생물배향을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
희귀 세포 및 희귀 세포 마커의 예
희귀 세포는 샘플 중 비-희귀 세포의 양과 비교하는 경우 상대적으로 소량으로 샘플에 존재하는 세포들이다. 일부 예에서, 희귀 세포는 희귀 세포를 함유하는 것으로 의심되는 총세포 집단의 약 10-8 중량% 내지 약 10-2 중량%로 존재한다. 용어 “세포성 희귀 분자”는 세포에 결합되고/되거나 샘플 중에서 자유롭게 순환하거나 순환하지 않을 수 있는 희귀 분자를 언급한다. 상기 세포성 희귀 분자는 상기된 질환의 의학적 진단에 유용한 생분자를 포함하고 또한 무세포 희귀 분자로서 및 희귀 세포의 측정을 위해 사용되는 생분자에 대한 것들로서 이전에 기재된 모든 희귀 분자 및 용도를 포함한다. 희귀 세포는 이에 제한되지 않지만 예를 들어, 악성 종양 세포, 예를 들어, 악성 종양 신생물 또는 암 세포; 순환 세포, 내피 세포 (CD146); 상피 세포 (CD326/EpCAM); 중간엽 세포(VIM), 세균 세포, 바이러스, 피부 세포, 성 세포, 태아 세포; 면역 세포 (백혈구, 예를 들어, 호염기, 과립구 (CD66b) 및 호산구, 림프구, 예를 들어, B 세포 (CD19,CD20), T 세포 (CD3,CD4 CD8), 혈장 세포, 및 NK 세포 (CD56), 대식세포/단핵구 (CD14, CD33), 수지상 세포 (CD11c, CD123), Treg 세포 및 기타), 줄기 세포/전구체 (CD34), 다른 혈액 세포, 예를 들어, 선조체, 블라스트, 적혈구, 혈전세포, 혈소판(CD41, CD61, CD62) 및 미성숙 세포; 간, 뇌, 췌장, 근육, 지방, 폐, 전립선, 신장, 요로, 지방세포, 골수, 자궁내막, 위장관, 심장, 고환 또는 기타일 수 있다.
용어 “집단 세포”는 세포 표면상에 또는 내부에 항원 또는 핵산을 갖는 세포 그룹을 언급하고, 여기서, 상기 항원은 상기 그룹의 모든 세포에 공통되고 상기 항원의 세포 그룹에 대해 특이적이다. 상기 항원 또는 핵산은 “희귀 세포 마커”로 호칭된다. 비-희귀 세포는 샘플 중 희귀 세포의 양과 비교하는 경우 상대적으로 대량으로 존재하는 세포들이다. 일부 예에서, 비-희귀 세포는 비-희귀 세포 및 희귀 세포를 함유하는 것으로 의심되는 샘플 중에 총 세포 집단 중 희귀 세포의 양 보다 적어도 약 10배, 또는 적어도 약 102 배, 또는 적어도 약 103 배, 또는 적어도 약 104 배, 또는 적어도 약 105 배, 또는 적어도 약 106 배, 또는 적어도 약 107 배, 또는 적어도 약 108 배 초과이다. 비-희귀 세포는 예를 들어, 백혈구 세포, 혈소판 및 적혈구 세포일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
용어 “희귀 세포 마커”는 이에 제한되지 않지만 암 세포 유형 바이오마커, 암 바이오마커, 화학 내성 바이오마커, 전이성 잠재력 바이오마커, 및 세포 분류 마커, 세포의 면역표현형 분류를 위한 표적을 제공하는 세포 표면 분자의 동정 및 조사를 위해 사용되는 프로토콜인 분화 클러스터(흔히 CD로서 약칭되는 지정 또는 분류 결정인자의 클러스터)를 포함한다. 암 세포 유형의 바이오마커는 예시이고 이에 제한되지 않게, 예를 들어, 사이토케라틴 (CK) (CK1, CK2, CK3, CK4, CKS, CK6, CK7, CK8 및 CK9, CK10, CK12, CK 13, CK14, CK16, CK17, CK18, CK19 및 CK2), 상피 세포 접착 분자(EpCAM), N-캐드헤린, E-캐드헤린 및 비멘틴을 포함한다. 돌연변이로 인해 가능한 치료학적 관련성을 갖는 발암 단백질 및 발암 유전자는 예를 들어, WAF, BAX-1, PDGF, JAGGED 1, NOTCH, VEGF, VEGHR, CAlX, MIB1, MDM, PR, ER, SELS, SEM1, PI3K, AKT2, TWIST1, EML-4, DRAFF, C-MET, ABL1, EGFR, GNAS, MLH1, RET, MEK1, AKT1, ERBB2, HER2, HNF1A, MPL, SMAD4, ALK, ERBB4, HRAS, NOTCH1, SMARCB1, APC, FBXW7, IDH1, NPM1, SMO, ATM, FGFR1, JAK2, NRAS, SRC, BRAF, FGFR2, JAK3, RA, STK11, CDH1, FGFR3, KDR, PIK3CA, TP53, CDKN2A, FLT3, KIT, PTEN, VHL, CSF1R, GNA11, KRAS, PTPN11, DDR2, CTNNB1, GNAQ, MET, RB1, AKT1, BRAF, DDR2, MEK1, NRAS, FGFR1, 및 ROS1을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 희귀 세포는 마커, 예시하고 이에 제한되지 않게, CD136, CD105/엔도글린, CD144/VE-캐드헤린, CD145, CD34, Cd41 CD136, CD34, CD90, CD31/PECAM-1, ESAM,VEGFR2/Fik-1, Tie-2, CD202b/TEK, CD56/NCAM, CD73/VAP-2, 클라우딘 5, Z0-1, 및 비멘틴을 사용하여 검출된 내피 세포일 수 있다. 전이성 잠재력 바이오마커는 우로키나제 플라스미노겐 활성화인자 (uPA), 조직 플라스미노겐 활성화인자 (tPA), 아디포넥틴 수용체의 C 말단 단편(아디포넥틴 수용체 C 말단 단편 또는 아디포넥틴 CTF), 키나제(AKT-PIK3, MAPK), 혈관 접착분자(예를 들어, ICAM, VCAM, E-셀렉틴), 사이토킨 신호전달 (TNF-α, IL-1, IL-6), 반응성 산화 종(ROS), 프로테아제-활성화된 수용체(PAR), 메탈로프로테이나제(TIMP), 형질전환 성장 인자(TGF), 혈관 내피 성장인자 (VEGF), 내피 하이알루로난 수용체 1 (LYVE-1), 저산소증-유도성 인자(HIF), 성장 호르몬(GH), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 상피 성장 인자(EGF), 태반 성장 인자(PDF), 간세포 성장 인자 (HGF), 신경 성장 인자(NGF), 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 성장 분화 인자(GDF), VEGF 수용체(가용성 Flt-1), 마이크로RNA (MiR-141), 캐드헤린(VE, N, E), S100 Ig-CTF 핵 수용체 (예를 들어, PPARα), 플라스미노겐 활성화인자 억제제 (PAI-1), CD95, 세린 프로테아제(예를 들어, 플라스민 및 ADAM); 세린 프로테아제 억제제(예를 들어, 비쿠닌); 매트릭스 메탈로프로테이나제 (예를 들어, MMP9); 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제 (예를 들어, TIMP-1); 및 DNA의 산화 손상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
화학내성 바이오마커는 예시하고 제한되지 않게 PL2L 10 piwi 유사, 5T4, ADLH, β-인테그린, α-6-인테그린, c-kit, c-met, LIF-R, 케모킨(예를 들어, CXCR7, CCR7, CXCR4), ESA, CD 20, CD44, CD133, CKS, TRAF2 및 ABC 수송체, CD45 또는 CD31 부재이지만 CD34를 함유하는 암 세포로서 암 줄기 세포를 지시하는 암 세포; 및 CD44를 함유하지만 CD24가 부재인 암 세포를 포함한다.
세포로부터의 희귀 분자는 임의의 유기체로부터 기원할 수 있고, 병원체, 예를 들어, 세균, 바이러스, 진균류, 및 원생동물; 악성 세포, 예를 들어, 악성 신생물 또는 암 세포; 순환 내피 세포; 순환 종양 세포; 순환 암 줄기 세포; 순환 암 간엽 세포; 순환 상피 세포; 태아 세포; 면역 세포 (B 세포, T 세포, 대식세포, NK 세포, 단핵구); 및 줄기 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 원칙에 따른 방법의 일부 예에서, 시험될 샘플은 이에 제한되지 않지만 예를 들어, 사람 대상체와 같은 포유동물 기원의 혈액 샘플이다.
관심 대상의 희귀 세포는 면역 세포일 수 있고 백혈구 세포 (WBC), Tregs (조절 T 세포), B 세포, T 세포, 대식세포, 단핵구, 항원 제공 세포 (APC), 수지상 세포, 호산구 및 과립구에 대한 마커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 마커, 예를 들어, 이에 제하되지 않지만, CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD31, CD33, CD45, CD52, CD56, CD 61, CD66b, CD123, CTLA-4, 면역글로불린, 단백질 수용체 및 사이토킨 수용체 및 다른 CD 마커는 백혈구 상에 존재하고 이를 사용하여 세포가 관심 대상의 희귀 세포가 아님을 지적할 수 있다.
특정 비제한적인 예에서, 백혈구 세포 마커는 CD45 항원 (또한 단백질 티로신 포스파타제 수용체 C형 또는 PTPRC)을 포함하고 본래에 백혈구 통상의 항원은 모든 백혈구 세포를 검출하는데 유용하다. 추가로, CD45를 사용하여 희귀 세포로 고려될 수 있는, 상이한 유형의 백혈구 세포를 구분할 수 있다. 예를 들어, 과립구는 CD45+, CD15+, 또는 CD16+, 또는 CD66b+에 의해 지적되고; 단핵구는 CD45+, CD14+에 의해 지적되고; T 림프구는 CD45+, CD3+에 의해 지적되고; T 헬퍼 세포는 CD45+,CD3+, CD4+에 의해 지적되고; 세포독성 T 세포는 CD45+, CD3+, CDS+에 의해 지적되고; B-림프구는 CD45+, CD19+ 또는 CD45+, CD20+에 의해 지적되고; 혈전세포는 CD45+, CD61+에 의해 지적되고; 천연 킬러 세포는 CD16+, CD56+, 및 CD3-에 의해 지적된다. 추가로, 2개의 통상적으로 사용되는 CD 분자, 즉, CD4 및 CD8은 일반적으로 각각 헬퍼 및 세포독성 T 세포에 대한 마커로서 사용된다. 이들 분자는 CD3+과 함께 한정되는데 이는 일부 다른 백혈구가 또한 이들 CD 분자를 발현하기 때문이다(일부 대식세포는 저수준의 CD4를 발현하고; 수지상 세포는 고수준의 CD11c 및 CD123을 발현한다. 이들 예는 모든 마커를 포괄하지 않고 단지 예를 든 것이다.
일부 경우에, 림프구의 희귀 분자 단편은 면역글로불린 쇄, 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자, T 세포 수용체, 항원 펩타이드, 사이토킨, 케모킨 및 이들의 수용체 (예를 들어, 인터류킨, C-X-C 케모킨 수용체 등), 프로그램화된 사멸-리간드 및 수용체(Fas, PDL1, 및 기타)와 같은 림프구의 일부로서 생산되는 단백질 및 펩타이드 및 림프구의 일부이거나 림프구에 결합하는 다른 단백질 및 펩타이드를 포함한다.
다른 경우에, 희귀 세포는 줄기 세포일 수 있고 이에 제한되지 않지만 PL2L piwi 유사, 5T4, ADLH, β-인테그린, α6 인테그린, c-kit, c-met, LIF-R, CXCR4, ESA, CD 20, CD44, CD133, CKS, TRAF2 및 ABC 수송체를 포함하는 줄기 마커 세포의 희귀 분자 단편, CD45 또는 CD31 부재이지만 CD34를 함유하는 암 세포로서 암 줄기 세포를 지적하는 암 세포; 및 CD44를 함유하지만 CD24가 부재인 암 세포를 포함한다. 줄기 세포 마커는 FoxD3, E-Ras, Sall4, Stat3, SUZ12, TCF3, TRA-1-60, CDX2, DDX4, Miwi, Mill GCNF, Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, TIF 1Piwil, 네스틴, 인테그린, 노치, AML, GATA, Esrrb, Nr5a2, C/EBPα, Lin28, 나노그, 인슐린, neuroD, 아디포넥틴, 아프디포넥틴 수용체, FABP4, PPAR, 및 KLF4 등과 같은 통상의 만능 마커를 포함한다.
다른 경우에, 희귀 세포는 병원체, 세균, 또는 바이러스 또는 이의 그룹일 수 있고 이는 그람-양성 세균(예를 들어, 엔테로코커스 종(Enterococcus sp.) 그룹 B 스트렙토코커스(streptococcus), 코굴라제-음성 스타필로코커스 종(staphylococcus sp.) 스트렙토코커스 비리단스(Streptococcus viridans), 스파필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 사프로피쿠스(saprophyicus), 락토바실러스 (Lactobacillus) 및 이의 내성 균주); 이에 제한되지 않지만 예를 들어, 캔디다 알비칸스(Candida albicans)를 포함하는 효모; 그람 음성 세균, 예를 들어, 이에 제한되지 않고, 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 시트로박터 프륜디(Citrobacter freundii), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 디프테로이드 (gnb), 로세부라(Rosebura), 유박테리움 할리(Eubacterium hallii). 파에칼리박테리움 프라우니츨리(Faecalibacterium prauznitzli), 락토바실러스 가세리아(Lactobacillus gasseria), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 박테로이데스 테타이오타오마이크론(Bacteroides thetaiotaomicron), 프레보텔라 인터메디아(Prevotella Intermedia), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 유박테리움 렉탈레(Eubacterium rectale), 락토바실러스 아밀로보루스( Lactobacillus amylovorus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum), 유박테리움 렉탈레(Eubacterium rectale), 이. 엘리겐스(E. eligens), 이. 돌리쿰(E. dolichum), 비. 테타이오타오마이크론(B. thetaiotaomicron), 이. 렉탈레(E. rectale), 악티노박테리아(Actinobacteria), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 비. 테타이오타오마이크론(B. thetaiotaomicron), 박테로이데스 유박테리움 돌리쿰(Bacteroides Eubacterium dolichum), 불가투스(Vulgatus), 비. 프라길리스(B. fragilis), 세균 필라(bacterial phyla), 예를 들어, 피르미쿠티에스(Firmicuties) (클로스트리아(Clostridia), 바실리(Bacilli), 몰리쿠테스(Mollicutes)), 푸소박테리아(Fusobacteria), 악티노박테리아(Actinobacteria), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 아카에아(Archaea), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 및 예를 들어, 이의 내성 균주; 바이러스, 예를 들어, 이에 제한되지 않고, 예를 들어, HIV, HPV, Flu, 및 MRSA; 및 성 전염 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 희귀 세포 병원체를 검출하는 경우에, 희귀 세포 병원체 집단에 결합하는 친화성 제제를 포함하는 포획 입자가 첨가된다. 추가로, 병원체 상의 세포성 희귀 분자의 각각의 집단에 대해, 집단 중 세포성 희귀 분자에 결합하는 세포성 희귀 분자에 대한 친화성 제제를 포함하는 시약이 첨가된다.
상기 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 원칙에 따른 일부 예는 천연 및 합성 세포를 포함하는 세포를 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 세포는 일반적으로 표적 희귀 분자, 비-희귀 세포 및 희귀 세포를 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플로부터 기원한다. 샘플은 생물학적 샘플 또는 비-생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 포유동물 대상체 또는 비-포유동물 대상체로부터 기원할 수 있다. 포유동물 대상체는 예를 들어, 사람 또는 다른 동물 종일 수 있다.
방법을 수행하기 위한 키트
본원에 기재된 원칙에 따른 방법을 수행하기 위한 장비 및 시약은 상기 방법을 간편하게 수행하기 위해 유용한 키트에 존재할 수 있다. 하나의 구현예에서, 키트는 팩키징 조합으로, 단리될 하나 이상의 희귀 분자에 대해 변형된 친화성 제제를 포함한다. 상기 키트는 또한 세포성 희귀 분자, 다공성 매트릭스, 포획 입자 및 분석학적 표지를 분무하고 여과하고 반응시키기 위한 용액을 포함한다. 표지 입자의 조성물은 예를 들어, 포획 입자 실체에 대해 상기된 바와 같은 것일 수 있다. 다공성 매트릭스 및 전극은 어셈블리에 존재할 수 있고, 여기서, 상기 어셈블리는 통풍구, 모세관, 챔버 및 액체 주입구 및 출구를 가질 수 있다. 다공성 매트릭스는 제거될 수 있거나 어셈블리에 영구적으로 고정된 것일 수 있다.
희귀 분자의 분석을 위해 사용되는 방법에 의존하여, 하기 본원에서 보다 상세하게 논의된 시약은 희귀 세포 및 무세포 샘플로부터 분자의 추출 동안에, 추출 전 또는 추출 후 샘플을 처리하기 위해 사용될 수 있거나 사용되지 않을 수 있다.
키트 내 다양한 시약의 상대적 양은 본 발명의 방법 동안에 일어날 필요가 있는 반응을 실질적으로 최적화하고 추가로 상기 방법의 민감성을 최적화하는 시약의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 다양할 수 있다. 적당한 상황 하에서, 키트 내 하나 이상의 시약은 용해시 본원에 기재된 원칙에 따른 방법을 수행하기 위해 적당한농도를 갖는 시약 용액을 제공할, 부형제를 포함하는 일반적으로 동결건조된 무수 분말로서 제공될 수 있다. 키트는 추가로 본원에 기재된 원칙에 따른 시약을 사용하는 방법의 서면 기재를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “적어도”는 특정 용어의 수가 인용된 수와 동일하거나 이를 초과할 수 있음을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 “약”은 인용된 수가 + 또는 - 10%로 상이할 수 있고; 예를 들어, “약 5”는 4.5 내지 5.5의 범위를 의미한다.
분무 용매는 전기분무 질량 분광측정기에서 사용되는 임의의 분무 용매일 수 있다. 일부 예에서, 전기분무 이온화를 위한 용매는 예를 들어, 알콜 (예를 들어, 메탄올, 에탄올 및 프로판올), 아세토니트릴, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 테트라하이드로푸란, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 및 니트로메탄; 비-극성 유기 화합물, 예를 들어, 헥산, 톨루엔, 사이클로헥산; 및 물, 예를 들어, 또는 이의 2개의 이상의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 임의로, 상기 용매는 개질제, 예를 들어, 휘발성 염 및 완충액, 예를 들어, 암모늄 아세테이트, 중탄산암모늄, 휘발성 산, 예를 들어, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 나트륨 도데실 설페이트, 에틸렌디아민 테트라아세트산, 및 비-휘발성 염 또는 완충액, 예를 들어, 클로라이드 및 나트륨 및 칼륨의 포스페이트로서 산 또는 염기 중 하나 이상을 함유할 수 있다.
많은 예에서, 상기 언급된 분무 용매는, 유일하게 물일 수 있거나 예를 들어, 용적을 기준으로 약 0.1% 내지 약 50%, 또는 약 1% 내지 약 50%, 또는 약 5% 내지 약 50%, 또는 약 1% 내지 약 40%, 또는 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 20%, 또는 약 1% 내지 약 10%, 또는 약 5% 내지 약 40%, 또는 약 5% 내지 약 30%, 또는 약 5% 내지 약 20%, 또는 약 5 % 내지약 10%의 양으로, 극성 비양성자성 용매, 극성 양성자성 용매, 예를 들어, 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 아세토니트릴, 유기산 또는 알콜, 및 수혼화성 비극성 용매, 예를 들어, 디옥산과 같은 유기 용매를 함유할 수 있는 수성 매질과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 예에서, 수성 매질에 대한 pH는 약 4 내지 약 9 범위의 중간 pH이다. 다양한 완충액을 사용하여 목적하는 pH를 성취하고 임의의 배양 기간 동안에 pH를 유지할 수 있다. 예시적인 완충액은 보레이트, 포스페이트(예를 들어, 포스페이트 완충 식염수), 카보네이트, TRIS, 바비탈, PIPES, HEPES, MES, ACES, MOPS, 및 BICINE를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
세포 용해 시약은 용해제를 사용한 세포막의 통합성의 붕괴에 관여하여 세포의 세포내 내용물을 방출시키는 것들이다. 다수의 용해제는 당업계에 공지되어 있다. 사용될 수 있는 용해제는 물리적 및/또는 화학적 제제일 수 있다. 물리적 용해제는 예를 들어, 블렌딩, 분쇄 및 초음파 처리 및 이의 2개 이상의 조합을 포함한다. 화학적 용해제는 예를 들어, 비-이온 세제, 음이온성 세제, 양쪽성 세제, 낮은 이온 강도의 수용액(저장성 용액), 세균 제제, 및 보체 의존성 용해를 유발하는 항체, 및 이의 2개 이상의 조합, 및 상기 2개 이상의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용해제로서 사용될 수 있는 비이온성 세제는 합성 세제 및 천연 세제 둘다를 포함한다.
사용되는 용해제의 특성 및 양 또는 농도는 예를 들어, 세포의 특성, 세포 내용물의 특성, 수행될 분석의 특성 및 용해제의 특성에 의존한다. 용해제의 양은 적어도 세포의 내용물을 방출하기 위해 세포를 용해시키기에 충분하다. 일부 예에서, 용해제의 양은 예를 들어, (퍼센트는 중량을 기준으로 한다) 약 0.0001% 내지 약 0.5%, 약 0.001% 내지 약 0.4%, 약 0.01% 내지 약 0.3%, 약 0.01% 내지 약 0.2%, 약 0.1% 내지 약 0.3%, 약 0.2% 내지 약 0.5%, 약 0.1% 내지 약 0.2%이다.
지질의 제거는 예시적이고 제한되지 않게 세제, 계면활성제, 용매 및 결합제, 및 상기 2개 이상의 조합을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이 용해제로서 계면활성제 또는 세제의 사용은 세포 용해 및 지질의 제거 둘다를 성취한다. 지질을 제거하기 위한 제제의 양은 적어도, 세포 막으로부터 지질의 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%를 제거하기 위해 충분하다. 일부 예에서, 용해제의 양은 예를 들어, (퍼센트는 중량을 기준으로 한다) 약 0.0001% 내지 약 0.5%, 약 0.001% 내지 약 0.4%, 약 0.01% 내지 약 0.3%, 약 0.01% 내지 약 0.2%, 약 0.1% 내지 약 0.3%, 약 0.2% 내지 약 0.5%, 약 0.1% 내지 약 0.2%이다.
일부 예에서, 세포로부터 단백질을 제거하거나 변성시키는 것이 요구될 수 있고, 이는 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 프로테아제, 열, 산, 페놀 및 구아니디늄 염, 및 이의 2개 이상의 조합과 같은 단백질 용해제를 사용하여 성취될 수 있다. 단백질 용해제의 양은 적어도, 세포에서 단백질의 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%를 분해하기 위해 적어도 충분하다. 일부 예에서, 용해제의 양은 예를 들어, (퍼센트는 중량을 기준으로 한다) 약 0.0001% 내지 약 0.5%, 약 0.001% 내지 약 0.4%, 약 0.01% 내지 약 0.3%, 약 0.01% 내지 약 0.2%, 약 0.1% 내지 약 0.3%, 약 0.2% 내지 약 0.5%, 약 0.1% 내지 약 0.2%이다.
일부 예에서, 샘플은 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 컵, 백, 병, 모세관 또는 바늘과 같은 적합한 컨테이너에서 대상체의 신체로부터 수거한다. 혈액 샘플은 예를 들어, vacutainer® 컨테이너에 수거할 수 있다. 상기 컨테이너는 샘플이 전달되는 수거 매질을 함유할 수 있다. 수거 매질은 무수 또는 액체일 수 있고, 혈액 샘플과 혼합되는 경우 혈액 샘플 중에서 혈소판의 불활성화를 성취하기에 효과적인 혈소판 불활성화 제제의 양을 포함할 수 있다.
이에 제한되지 않지만, 킬레이팅 제제, 예를 들어, 트리아세트산 모이어티 또는 이의 염, 테트라아세트산 모이어티 또는 이의 염, 펜타아세트산 모이어티 또는 이의 염, 또는 헥사아세트산 모이어티 또는 이의 염을 포함하는 킬레이팅 제제와 같은 혈소판 불활성화 제제를 샘플에 첨가할 수 있다. 일부 예에서, 킬레이팅 제제는 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA) 및 이의 염 또는 에틸렌 글리콜 테트라아세테이트 (EGTA) 및 이의 염이다. 혈소판 불활성화제의 유효량은 예를 들어, 혈소판 불활성화제의 특성, 혈액 샘플의 특성, 혈소판 활성화 및 이온 강도의 수준에 의존한다. 일부 예에서, 항-혈소판 제제로서 EDTA에 대해, 컨테이너 내 무수 EDTA의 양은 혈액의 약 1.0 내지 약 2.0 mg/mL, 또는 혈액의 약 1.5 mg/mL의 농도를 생성하는 양이다. 혈소판 불활성화제의 양은 혈소판 불활성화의 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%를 성취하기에 충분한 양이다. 적정 온도가 정상적으로 사용되고, 이는 예를 들어, 약 5℃ 내지 약 70℃ 또는 약 15℃ 내지 약 70℃ 또는 약 20℃ 내지 약 45℃의 범위일 수 있다. 항온처리 기간의 시기는 예를 들어, 약 0.2 초 내지 약 6 시간, 또는 약 2 초 내지 약 1 시간, 또는 약 1 내지 약 5분이다.
많은 예에서, 상기 조합은 수성 매질로 제공되고, 이는 유일하게 물이거나 또한 용적을 기준으로 약 0.1% 내지 약 50%, 또는 약 1% 내지 약 50%, 또는 약 5% 내지 약 50%, 또는 약 1% 내지 약 40%, 또는 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 20%, 또는 약 1% 내지 약 10%, 또는 약 5% 내지 약 40%, 또는 약 5% 내지 약 30%, 또는 약 5% 내지 약 20%, 또는 약 5 % 내지 약 10%의 양으로, 예를 들어, 극성 비양성자성 또는 양성자성 용매, 예를 들어, 디메틸설폭사이드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 아세토니트릴, 유기산, 또는 알콜 및 수혼화성 비-극성 용매, 예를 들어, 디옥산과 같은 유기 용매를 함유할 수 있다.
사용되는 수성 매질의 양은 이에 제한되지 않지만, 예를 들어, 샘플의 특성 및 양, 시약의 특성 및 양, 희귀 세포의 안정성 및 희귀 분자의 안정성과 같은 다수의 인자에 의존한다. 일부 예에서, 본원에 기재된 원칙에 따라, 샘플 10mL 당 수성 매질의 양은 예를 들어, 약 5 mL 내지 약 100 mL, 또는 약 5 mL 내지 약 80 mL, 또는 약 5 mL 내지 약 60 mL, 또는 약 5 mL 내지 약 50 mL, 또는 약 5 mL 내지 약 30 mL, 또는 약 5 mL 내지 약 20 mL, 또는 약 5 mL 내지 약 10 mL, 또는 약 10 mL 내지 약 100 mL, 또는 약 10 mL 내지 약 80 mL, 또는 약 10 mL 내지 약 60 mL, 또는 약 10 mL 내지 약 50 mL, 또는 약 10 mL 내지 약 30 mL, 또는 약 10 mL 내지 약 20 mL, 또는 약 20 mL 내지 약 100 mL, 또는 약 20 mL 내지 약 80 mL, 또는 약 20 mL 내지 약 60 mL, 또는 약 20 mL 내지 약 50 mL, 또는 약 20 mL 내지 약 30 mL이다.
희귀 분자의 하나 이상이 세포의 일부인 경우, 수성 매질은 또한 세포의 용해를 위해 용해제를 포함할 수 있다. 용해제는 세포의 매트릭스의 통합성을 붕괴시켜 세포의 세포내 내용물을 방출시키는 화합물 또는 화합물의 혼합물이다. 용해제의 예는 예를 들어, 비-이온성 세제, 음이온성 세제, 양쪽성 세제, 낮은 이온 강도 수용액(저장성 용액), 세균 제제, 지방족 알데하이드, 및 보체 의존성 용해를 유발하는 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다양한 부수적 재료는 희석 매질에 존재할 수 있다. 수성 매질 중 모든 재료는 목적하는 효과 또는 기능을 성취하기에 충분한 농도 또는 양으로 존재한다.
일부 예에서, 샘플의 단백질, 펩타이드, 핵산 또는 세포를 고정시키는 것이 바람직할 수 있다. 고정은 단백질, 펩타이드 및 핵산의 구조를 고정화시키고 보존하며 세포를 생체내 유사 조건에서 밀접하게 유사한 조건 및 관심 대상의 항원이 특이적 친화성 제제에 의해 인지될 수 있는 조건하에서 세포를 유지한다. 사용되는 고정제의 양은 핵산 또는 세포를 보존하지만 후속 검정에서 오류 결과를 유도하지 않는 양이다. 고정제의 양은 예를 들어, 고정제의 특성 및 세포의 특성 중 하나 이상에 의존한다. 일부 예에서, 고정제의 양은 예를 들어, 약 0.05중량% 내지 약 0.15중량% 또는 약 0.05중량% 내지 약 0.10중량%, 또는 약 0.10중량% 내지 약 0.15중량%이다. 세포의 고정을 수행하기 위한 제제는 예를 들어, 알데하이드 시약 (예를 들어, 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 및 파라포름알데하이드와 같은)과 같은 가교 결합제; 알콜 (예를 들어, 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올과 같은 C1-C5 알콜과 같은); 케톤(아세톤과 같은 C3-C5 케톤)과 같은 가교결합제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 명칭 C1-C5 또는 C3-C5는 알콜 또는 케톤 중에 탄소 원자의 수를 언급한다. 하나 이상의 세척 단계는 완충 수성 배지를 사용하여 고정된 세포 상에서 수행할 수 있다.
고정이 사용되는 예에서, 핵산의 추출은 증폭 전 탈-고정을 위한 과정을 포함할 수 있다. 탈-고정은 예를 들어, 예시적이고 이에 제한되지 않게, 열 또는 가교-결합을 역전시킬 수 있는 화학물질 또는 둘다의 조합을 사용하여 성취될 수 있다.
기술을 사용한 일부 예에서, 희귀 세포를 투과시킬 필요가 있을 수 있다. 투과는 세포 막을 통한 접근을 관심 대상의 핵산에 제공한다. 사용되는 투과 제제의 양은 세포 막을 붕괴시키고 핵산으로의 접근을 가능하게 하는 양이다. 투과 제제의 양은 예를 들어, 투과 제제의 특성 및 희귀 세포의 특성 및 양 중 하나 이상에 의존한다. 일부 예에서, 중량을 기준으로 하는 투과 제제의 양은 약 0.1% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.1% 내지 약 0.4%, 또는 약 0.1% 내지 약 0.3%, 또는 약 0.1% 내지 약 0.2%, 또는 약 0.2% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.2% 내지 약 0.4%, 또는 약 0.2% 내지 약 0.3%이다. 희귀 세포의 투과를 수행하기 위한 제제는 알콜 (예를 들어, 메탄올 및 에탄올과 같은 C1-C5 알콜과 같은); 케톤(예를 들어, 아세톤과 같은 C3-C5 케톤); 세제(예를 들어, 사포닌, Triton® X-100, 및 Tween®-20)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 세척 단계는 완충 수성 배지를 사용하여 투과된 세포 상에서 수행할 수 있다.
하기의 실시예는 예시를 위한 본 발명의 특정 구현예를 기재하고 본 발명을 제한 없이 기재하고자 하는 것이고 이의 범위를 제한하는 것이 아니다. 본원에 기재된 부 및 퍼센트는 달리 지적되지 않는 경우 용적을 기준으로 한다.
실시예
모든 화학물질은 달리 주지되지 ?는 경우 제조사(Sigma-Aldrich Company (St. Louis MO))로부터 구입할 수 있다.
약어:
WBC = 백혈구 세포
DAPI = 4',6-디아미노-2-페닐인돌
DMSO = 디메틸설폭사이드(ThermoFisher Scientific)
min = 분(들)
μm = 마이크론(들)
mL = 밀리리터 (들)
mg = 밀리그램(들)
μg = 마이크로그램(들)
PBS = 포스페이트 완충 식염수(3.2 mM Na2HPO4, 0.5 mM KH2PO4, 1.3 mM KCl, 135 mM NaCl, pH 7.4)
K3EDTA = 에틸렌디아민테트라아세테이트의 칼륨 염
mBar = 밀리바
w/w = 중량 대 중량
RT = 실온
hr = 시간(들)
QS = 충분한 양
ACN = 아세토니트릴
TFA = 트리플루오로아세트산
TCEP = 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(Sigma-Aldrich)
SPDP = N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트)
SH-뉴트라비딘 = 설프하이드릴-변형된 뉴트라비딘 뉴트라비딘= 비오틴에 대한 친화성 제제
Ab = 항체
mAb = 모노클로날 항체
vol = 용적
MW = 분자량
wt. = 중량
분석물 세포 = SKBR3 사람 유방암 세포 (ATCC)
Her2nue = 사람 상피 성장 인자 수용체 2
분석물의 변종 = 용해된 SKBR3 사람 유방암 세포 (ATCC)로부터 수득된 Her2nue
Her2nue에 대한 친화성 제제= 모노클로날 항 Her2nue 항체 (NB3 클론) (ATCC)
표지 입자 = 프로필아민-관능성화된 실리카 나노-입자 80nm,
유리 슬라이드= FISHERBRAND™ SUPERFROST™ 플러스 현미경 슬라이드 (ThermoFisher Scientific Inc.)
차단제 = 카시엔(Casien), 차단 용액(Candor Biosience GmbH, Allgau Germany)
포획 입자 = 입자로의 직접적인 접합에 의해 제조된 항 Her2nue 항체 (ATCC로부터 NB3 클론)와 함께 스트렙타비딘 (Bangs Lab Inc.)을 갖는 BioMag® 하이드록실 실리카 마이크로 입자(46.2 mg/mL, 1.5 μm) .
자기= 다이날 (Dynal) 자기 입자 농축기
다공성 매트릭스 = WHATMAN® NUCLEOPORETM 트랙 Etch 매트릭스, 25 mm 직경 및 8.0 및 1.0 μM 공극 크기
MS = Thermo LTQ (선형 이온 포집) 질량 분광측정기 (제조원: Thermo Electron North America LLC)상에서 나노 전기분무 이온화에 의한 질량 분광측정 분석.
하기의 실시예는 본원에 기재된 원칙에 따르고, 이는 또한 X-Y 결합에 의해 분석학적 표지에 부착된, X-Y 결합에 의해 입자에 부착된 친화성 제제를 통해 입자에 변종을 결합시키고, 상기 입자를 샘플로부터 분리하고 이어서 입자로부터 분석학적 표지를 제거하고 이어서 분석학적 표지에 대한 X-Y 결합을 절단하는 조건에 의해 방출시킨 후 분석학적 표지를 측정함에 의해 분석물 분자를 측정함에 의한 샘플 중 분석물 분자의 변종을 단리하는 방법이다.
실시예 1
X-Y 결합에 의한 분석학적 표지 및 친화성 제제의 입자 부착
X-Y 결합에 의한 친화성 제제 및 분석학적 표지의 부착은 -S-S- 결합 (디설파이드)을 사용하는 하기의 실시예에 나타낸다. 본 실시예에서, 아민화된 실리카 나노입자들 (표지 입자들)은 20mg/ml의 최종 농도로 DMSO 중에 현탁시켰다. SPDP는 별도의 튜브에서 20 nmole/μL의 최종 농도로 DMSO 중에 용해시켰다. SPDP 스톡 용액은 약하게 와동시키면서 DMSO 중에 20mg/ml의 아민화된 실리카 나노입자에 적가하였다. 혼합물은 일정하게 혼합하면서 RT에서 적어도 60분 동안 반응하도록 방치하였다. 반응 시간 후, 반응 혼합물을 원심분리하고, 상등액을 제거하여 버리고 입자는 DMSO 중에 재현탁시켰다. 상기 세척 과정은 추가로 3회 반복하였고 이후 SPDP 반응된 나노입자는 초음파처리함에 의해 3.3mg/mL의 최종 농도로 재현탁시켰다.
유리된 SH (분석학적 표지)를 포함하는 펩타이드는 PBS-EDTA 중에 용해시켰다. 뉴트라비딘 당 평균 하나의 유리된 티올 (트라우트(Traut) 시약과의 접합을 통해)을 함유하도록 이전에 변형된 뉴트라비딘은 분석학적 표지를 함유하는 용액에 첨가하였다. 분석학적 표지 및 뉴트라비딘의 최종 농도는 각각 대략 1 mM 및 20 μM이었다. SH-펩타이드/SH-뉴트라비딘의 용액에 DMSO 중에 SPDP 변형된 나노입자의 현탁액을 첨가하고 상기 반응물은 밤새 교반과 함께 실온에서 항온처리 되도록 방치하였다. 반응 후, 상기 입자는 PBS로 3회 세척하고 1 mL PBS 중에 재현탁시켰다.
X가 Ni, Co, Fe 또는 Cu와 같은 금속인 경우에 대한 X-Y 결합을 만들기 위해, 실리카 아민 나노입자는 금속의 결합을 가능하게 하기 위해 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 등과 같은 킬레이팅제와 접합될 수 있다. X가 Pd, Ag 또는 Au와 같은 금속인 경우 X-Y 결합을 만들기 위해, 실리카 아민 나노입자는 금속의 결합을 가능하게 하기 위해 킬레이팅제로서 설프하이드릴(-SH) 그룹과 접합된다. 실리카 아민 표지에 접합된 금속은 친화성 제제, 또는 설파이드, 에테르, 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 케탈, 티오아미드, N-옥사이드, 질소-질소, 또는 티오에테르인 결합 형성에 의해 S, O, C, P, N, B, Si인 Y를 통한 것을 사용하여 친화성 제제 또는 분석학적 표지에 부착시킨다. 이들 결합은 금속 결합과의 결합을 형성하기 위해 O, C, P, N 또는 B와 같은 표준 킬레이트 금속유기화학에 의해 형성될 수 있다. X가 O, C, P, N, 또는 B와 같은 유기 원자인 경우에 대해 X-Y 결합을 만들기 위해, 실리카 아민 나노입자는 연결 제제에 접합시키고, 여기서, X 그룹은 카복실산에 부착되고 Y 그룹은 아민 그룹에 부착된다. 카복실산은 실리카 아민 나노입자에 부착시키고 아민 그룹은 친화성 제제 및 분석학적 표지에 부착시켰다. X-Y 결합은 이어서 -S-S-설파이드,-C-O-에테르, -[C=O]-O-C-에스테르, -[C=O]-S-C-티오에스테르, -[C=O]-N-C 아미드, (-C-O-)2 케탈, [C=O]-N-S 티오아미드, -N-O-N-옥사이드, -N-N-질소-질소, 또는 - S-O-티오에테르를 포함하도록 다양화할 수 있다.
실시예 2
실시예 1로부터의 입자를 사용한 분석물 분자의 변종의 단리
친화성 제제를 통한 입자에 변종을 결합시킴에 의한 분석물 분자의 변종의 단리는 샘플 중에 분석물 분자의 변종의 하나의 예로서 사람 상피 성장 인자 수용체 2 (Her2nue)를 사용하는 하기의 실시예에 나타낸다. Her2nue 단백질은 도 1에 나타낸 기전에 의해 절단되고 많은 변종으로 전환되는 것으로 밝혀졌다. 상기 단리는 비오틴 (친화성 태그)에 접합된 Her2nue에 대한 친화성 제제를 통해 입자에 변종을 결합시킴에 의해 입증된다.
상기 실시예에서, 뉴트라비딘은 비오틴에 대한 친화성 제제로서 사용되고 X-Y 결합, 본 실시예에서 S-S-결합에 의해 입자에 결합된다. 표지 입자는 또한 동일한 S-S 결합에 의해 분석학적 표지에 의해 부착시켰다. 본 실시예에서, 상기 샘플로부터의 입자의 분리는 2개의 수단에서 입증된다. 제1의 경우에, 입자는 세포, 즉, SKBR3 세포 상의 Her2nue 변종에 결합되고, 상기 결합된 입자는 크기-배제 여과를 통해 세포와 함께 분리된다. 제2 경우에, 상기 입자는 세포가 부재인, 즉 용해된 SKBR 세포로부터 Her2nue 결합 변종에 결합되고, 입자에 결합된 Her2nue는 Her2nue에 대한 제2 친화성 제제를 갖는 포획 입자와 함께 분리된다. 포획 입자는 자기력에 의해 입자에 결합된 Her2nue와 함께 제거된다.
Her2nue 단백질은 대략적으로 2x105 암 세포 (SKBR3) 세포/mL을 함유하는 500 μL의 용액을 원심분리함에 의해 세포 형태로 제조되었다. 약 1 mL의 PBS는 혼합하기 위해 상기 튜브를 수회 뒤집고 3분 동안 2000의 상대적 원심분리력으로 다시 원심분리하고 세척액을 제거함에 의해 세포 펠렛을 세척하기 위해 첨가하였다. 세포는 PBS 중에 1mL의 0.2% Triton-X을 첨가함에 의해 투과성이 되도록 하고, 튜브를 수회 뒤집고 7분 동안 항온처리함에 이어서 세척하였다. 상기 세포는 1mL의 단편화된 카제인 완충액을 첨가함에 의해 비-특이적 결합을 감소시키기 위해 차단하고 상기 혼합물은 혼합되도록 약하게 와동시켰다. 혼합물은 다시 원심분리하고, 액체를 제거하고 상기 단계를 1회 이상 반복하였다. 세포 혼합물은 PBS를 사용하여 1mL로 희석시키고 10 μL 샘플은 현미경하에 조사하여 세포 수를 결정하였다. Her2nue 단백질은 세포를 용해시킴에 의해 무세포 형태로 제조하였다. 시험을 위한 샘플은 건강한 공여자로부터 혈액을 채취 (공여자 당 9mL)함에 의해 제조하고 최대 5일 동안 Transfix 튜브에 저장하였다. 혈액 샘플은 스톡을 사용하여 SKBR3 사람 유방암 세포 (ATCC) 세포인 Her2nue 변종으로 스파이킹하여 ~1000 세포/0.5 mL을 수득하였다. 제2 혈액 샘플은 또한 0.5mL의 혈액으로 약 ~1000 용해된 SKBR3 세포로 스파이킹하여 분석물 분자의 무세포 변종을 수득하였다.
무세포 Her2nue 분자의 변종의 단리를 위해, 용해된 SKBR 세포를 사용한 샘플은 먼저 50μL의 포획 입자를 1 mL의 샘플에 첨가함에 의해 포획 입자 (항 Her2nue 항체로 접합된 자기 비드) 상에 포획하였다. 샘플은 뒤집음에 의해 혼합하고, 혼합물은 RT에서 15분동안 항온처리하여 입자가 무세포 Her2nue 분자의 변종을 포획하도록 하였다. 이어서 추가의 Her2neu 친화성 제제와 함께 표지 입자를 첨가하였다. 포획 입자는 3분 동안 1700g에서 튜브를 원심분리 (또는 1 μm 공극을 갖는 다공성 막 상의 여과 또는 자기를 갖는 바이엘의 벽에 포획된)함에 의해 단리하였고 상등액을 제거하였다. 자기 비드는 250 μL의 PBS로 희석시켜 비드의 펠렛을 현탁시켰다. 상기 입자는 PBS로 5회 세척하였다.
세포 Her2nue 분자의 변종 단리를 위해, SKBR3 세포는 먼저 진공을 사용하여 다공성 매트릭스 상에 포획시켜 이전의 공개된 방법에 따른 동유체력(hydrodynamic force)을 제공하였다(문헌참조: Pugia el al, A Novel Strategy for Detection and Enumeration of Circulating Analyte Cell Populations in Metastatic Cancer Patients Using Automated Fluidic Filtration and Multiplex Immunoassay PLoS ONE 014166 (2015)). 온전한 SKBR3 세포 및 WBC를 갖는 전혈을 PBS 중에 희석시키고 이전에 기재된 바와 같이 여과 공정에 통과시켜 여과하였다. 상기 공정에 대한 유일한 변화는 다공성 매트릭스가 피팅된 표준 ELISA 플레이트에 대해 진공 여과 유닛 (Biotek Inc)을 사용하는 것이었다. 샘플은 8.0 m 공극을 갖는 막을 통해 여과하였다. 여과 동안에, 다공성 매트릭스 상의 샘플은 부압, 즉 대기압으로부터 약 -100 mBar 초과의 감소에 적용하였다. 적용된 진공은 여과 동안에 -10에서 -100 mBar로 다양하였다. 희석된 샘플은 혼합 없이 여과 스테이션에 위치시키고 희석된 샘플은 다공성 매트릭스를 통해 여과하였다. SKBR3 세포의 회수는 각각의 샘플에 대해 >60%이었다.
단리된 SKBR3 세포는 이어서 이전의 공개된 방법 및 입자에 따라 수행되는 친화성 반응에 의해 표지 입자와 반응시켰다. 요약하면, 여과 후, 다공성 매트릭스는 PBS로 세척하고 상기 샘플은 포름알데하이드로 고정시키고, PBS로 세척하고, PBS 중에 0.2% TRITON® X100을 사용한 투과화에 적용하고 다시 PBS로 세척하였다. 차단 단계를 사용하고 여기서, PBS 중에 10% 카제인의 차단 완충액은 매트릭스 상에 분배하였다. 5분의 항온처리 기간 후, 매트릭스는 PBS로 세척하여 매트릭스로의 비-특이적 결합을 차단하였다. 차단 단계 및 투과화 단계는 제1 친화성 반응을 위해 수행하였고 제2 및 제3 친화성 반응에 대해 반복하지 않았다. 5회 PBS TWEEN® 계면활성제 세척은 각각의 친화성 반응 후 수행하였다. 희귀 세포는 이어서 친화성 반응 및 CK8/18에 대한 항체에 부착된 형광성 표지와 함께 면역세포화학 (ICC)을 사용하여 측정하였다. Her2nue에 대한 mAb는 SBKR 세포에 결합하였고 SBKR3 세포에서만 Dy550의 존재를 보여주는 현미경에 의해 입증된 바와 같이 WBC에는 결합하지 않았다.
둘다의 경우에, 샘플은 백혈구 (WBC) 및 적혈구 (RBC)와 같이 비-희귀 분자로 오염되었다. 세포 경우에, WBC에서 SBKR의 순도는 0.1 내지 0.01%이었다. 높은 퍼센트의 Her2nue 분자 변종 (>80%)이 포획 입자를 사용하거나 SBKR3 세포에서든 관심 대상의 단편에 결합하지만 오염 WBC 또는 RBC에는 결합하지 않는 항체로 포획되었다. 상기 방법은 보다 많은 Her2nue 친화성 제제(TA1 또는 NB3 클론)가 동일한 입자에 부착되는지 및 상이한 친화성 제게 및 특유의 분석학적 표지와 함께 상이한 입자에 부착되는 경우이든 작용하였다.
실시예 3
입자로부터 X-Y 결합을 절단함에 의한 분석학적 표지의 제거
단리된 세포 또는 입자는 처음에 시약으로 처리하여 X-Y 결합을 절단하고 표지 입자로부터 분석학적 표지를 방출시킨다. -S-S-의 X-Y 결합의 경우에, 샘플을 10 μL의 방출 용액(10 mM TCEP, 10mM 암모늄 아세테이트 완충액 중 5 nM 내부 표준물, pH 4.5)으로 처리하여 분석학적 표지를 방출시켰다. 질량 분광측정기 (MS)에 의한 분석은 >90% 포획 및 방출 효율을 입증하였다. 일련의 실험을 수행하여 전혈 샘플 중에 세포 및 무세포 Her2nue 분자 변종을 검출하기 위한 분석학적 민감성을 계산하였다. 관찰된 분석학적 민감성은 전혈에 부가된 0, 50, 100, 200, 500, 및 1000개의 온전하거나 용해된 SKBR3 세포를 갖는 샘플의 측정에 의해 결정하였다. 이의 방법 한계는 현미경 기술에 의한 세포 포획의 수를 광학적으로 계수함에 의해 확인하여 제로 수준 신호의 10배로서 결정하였다. 다중 유형의 분석학적 표지, 현미경 광학, 질량 분광측정, 화학발광, 전기화학 및 현미경 형광 판독을 사용하였고 검출 한계는 필적할 수 있고 검출의 전형적인 한계는 표 1에서 보고된다. 추가로, 검출의 세포 및 무세포 한계는 필적할 수 있고 검출의 전형적인 한계는 표 1에서 보고된다.
Figure pct00001
검출 한계는 표 1에서의 데이터, 예를 들어, 예시 2, 4, 5 및 6으로 나타내고 이는 본원에 기재된 원칙에 따르고 분석학적 표지를 갖는 입자에 분석물의 모든 변종을 결합시킴에 의해 샘플 중에 분석물의 변종을 단리하는 방법에 대한 것이고; 여기서, 다중 동일한 친화성 제제는 X-Y 결합에 의해 입자에 부착되지만 X-Y 결합을 절단하는 조건에 의해 방출되지 않는다. 예시 1에서, 절단할 수 없는 X-Y 결합을 사용하는 경우, 상기 방법은 X-Y 결합이 절단될 수 있는 예시 2와 비교하여 훨씬 덜 민감하고 ~100-400의 SKBR3 세포를 검출할 수 없다. 놀랍게도, 입자 상의 친화성 제제가 예시 3에서와 같이 친화성 태그로 대체된 경우, 상기 방법은 예시 2의 ~100-400을 검출할 수 없다. 예상된 바와 같이, 예시 5에서와 같이 다수의 친화성 제제가 입자 상에 사용되는 경우, 또는 상이한 친화성 제제를 갖는 다중 입자가 본 발명에 따라 사용되는 경우, 상기 방법은 예시 2의 ~100-400 보다도 세포를 덜 검출할 수 있다. 추가로, 친화성 제제로의 X-Y 결합이 절단되지 않는 경우, 검출되는 세포의 수는 예시 2에서와 같이 동일하다. 총체적으로 이것은 분석학적 표지를 갖는 본 발명의 이득을 입증하고 친화성 제제는 X-Y 결합에 의해 입자에 부착된다.
특허, 출원 및 공보에서 모든 인용된 참고문헌을 포함하는 본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 각각의 개별 특허, 특허 출원 또는 공보가 개별적으로 주지되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 이들의 전문이 참조로 인용된다.
본 발명의 많은 구현예가 상기되어 있고 현재 바람직한 구현예를 포함하지만, 많은 다른 구현예 및 변화는 본원의 개시내용의 범위 및 후속되는 특허청구범위에서 가능하다. 따라서, 제공된 바람직한 구현예 및 실시예의 세부 사항은 제한하는 것으로서 해석되지 말아야 한다. 본원에 사용된 용어는 제한하는 것 보다는 단지 기재하는 것이고 다양한 변화, 다양한 등가물이 청구된 발명의 취지 또는 범위로부터 벗어나는 것 없이 만들어 질 수 있는 것으로 이해되어야만 한다.
참고문헌
Figure pct00002
Figure pct00003
상기 문헌 모두는 본원에 참조로 인용된다.
<110> Pugia, Mike Joseph Baird, Zane Cao, Zehui <120> METHOD FOR COMPLETE AND FRAGMENTED MARKERS <130> IBRI004PCT <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Ala Leu Leu Ala Leu Trp Gly Pro Asp 1 5 <210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu 1 5 10 15 Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 30 Thr Arg <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 1 5 10 15 Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 20 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 1 5 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly 1 5 10 15 Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu 20 25 30 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu 1 5 10 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly 1 5 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu 1 5 10 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 20 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly 1 5 10 15 Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro 20 25 30 Gln Gly Gln Arg Glu Pro 35 <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 Gly Val Met Pro Arg Glu Glu Thr Asp Ser Lys Thr Ala Ser Pro Trp 1 5 10 15 Lys Ser Ala Arg 20 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Glu 1 5 10 15

Claims (19)

  1. 분석물 샘플 중에 변종을 단리하고 측정하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) 변종을 갖는 상기 분석물 샘플을, 부착된 분석학적 표지를 갖는 입자에 결합시키고;
    (b) 상기 수득한 입자를 상기 샘플로부터 분리하고;
    (c) 상기 분석학적 표지를 상기 입자로부터 제거하고;
    (d) 상기 측정 분석학적 표지에 의해 상기 분석물 분자를 측정함을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분석학적 표지가 X-Y 결합에 의해 상기 입자에 부착되고 X-Y 결합을 절단함에 의해 방출되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 분석물 중의 변종이 하나 이상의 친화성 제제에 의해 상기 입자에 결합되는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 친화성 제제가 X-Y 결합에 의해 부착되고 X-Y 결합을 절단함에 의해 방출되는, 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 분석학적 표지를 부착시키기 위해 사용되는 상기 X-Y 결합이 설파이드, 에테르, 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 케탈, 티오아미드, N-옥사이드, 질소-질소, 또는 티오에테르인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 친화성 제제를 부착사키기 위해 사용되는 상기 X-Y 결합이 설파이드, 에테르, 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 케탈, 티오아미드, N-옥사이드, 질소-질소, 또는 티오에테르인, 방법.
  7. 제2항에 있어서, X-Y가 S, O, C, P, N, B, Si, Ni, Pd, Fe, Co, Ag, Cu, 또는 Au로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제4항에 있어서, X-Y가 S, O, C, P, N, B, Si, Ni, Pd, Fe, Co, Ag, Cu, 또는 Au로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 X-Y 결합이 친화성 제제 또는 분석학적 표지와 표지 입자 간의 공간을 유발하는 긴 링커 그룹의 일부일 수 있는, 방법.
  10. 제3항에 있어서, 분석물 중의 다중 변종에 대한 상기 친화성 제제가 동일한 입자에 부착되는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 다중 입자가 상이한 친화성 제제를 사용하여 변종에 결합하고 상기 입자에 부착된 분석학적 표지를 갖는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 분석물 중의 변종이 인조이거나 천연 기원일 수 있는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 분석물 중의 변종이 생활성이거나 비-생활성 분자일 수 있는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 분석물 중의 변종이 세포성 또는 무세포성일 수 있는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 분석물 중의 변종이 변종 억제를 유발하는 다른 분자의 측정일 수 있는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 분석물 중의 변종이 의도적일 수 있거나 단편화, 첨가 또는 결합에 의해 생성될 수 있는, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 분석물 중의 변종이 대사물, 보조-인자, 기질, 아미노산, 금속, 비타민, 지방산, 생분자, 펩타이드, 탄수화물 등, 및 당접합체, 지질, 핵산, 폴리펩타이드, 수용체, 효소, 단백질과 같은 거대 분자, 및 세포성 구조물, 퍼옥시좀, 소포체, 엔도좀, 엑소좀, 리소좀, 미토콘드리아, 세포골격, 막, 핵, 세포외 매트릭스 또는 전형적으로 측정된 다른 분자를 포함하는 세포 및 조직일 수 있는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 분석물 중의 변종에 결합하는 입자가 다공성 매트릭스, 포획 입자, 세포 또는 자기 입자 또는 이의 조합에 의해 제거되는, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 분석학적 표지가 질량 분광법, 형광, 화학발광 또는 광학적 표지 또는 이의 조합에 의해 검출되는, 방법.
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